WO2006095846A1 - 病態の状態をリアルタイムで観察可能なモデル動物とそれを可能にする遺伝子構築物及びその使用 - Google Patents

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Masahiro Hiraoka
Shu-Ichi Yamada
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Definitions

  • a model animal capable of observing the state of a disease state in real time, and a genetic construct and its use
  • the present invention relates to a gene construct, and more particularly to a gene construct capable of observing changes in animal pathology in real time.
  • the present invention also relates to an expression vector containing the gene construct, a mammalian cell, a transgenic non-human mammal, use of the non-human mammal for observing changes in animal pathology in real time, and Regarding screening methods for drugs, genes and proteins
  • Tumor cells in which the partial pressure of oxygen in a solid tumor is not uniform are exposed to various oxygen environments. This is due to the limited distance that oxygen molecules can diffuse into vascular force tumor tissue.
  • a target gene such as a therapeutic gene or a reporter gene can be induced in a hypoxic environment by using a hypoxia response enhancer such as HRE.
  • this gene expression system has a problem that the gene is expressed slightly even under aerobic conditions. Also, due to the stability of the reporter gene, it was difficult to respond in real time to the oxygen environment in which the cells were placed. In other words, the current system was able to detect hypoxic stimulation, but because there was no reporter to detect subsequent aerobic stimulation (reoxygenation) in a short time, cells were placed. I was able to reflect the oxygen environment in real time.
  • hypoxia responsive promoter is known to be activated in cells in abnormal states that occur directly or indirectly in a hypoxic environment, not just in a hypoxic environment, Therefore, it is considered that various pathological conditions that occur directly or indirectly associated with a low-oxygen environment can be detected, and development of a gene expression system that is highly responsive to an environment that is deeply involved in the pathological condition is desired. It was.
  • Patent Document 1 and Patent Document 2 disclose a combination of a reporter gene and a hypoxia-inducible promoter (HRE), but describe ODD! .
  • HRE hypoxia-inducible promoter
  • Patent Document 3 discloses a combination of a reporter gene and NLS-ODD, but does not describe a hypoxia-inducible promoter (HRE)! /.
  • HRE hypoxia-inducible promoter
  • Patent Document 1 Heisei Table 11 11 506302
  • Patent Document 2 Special Table 2004—509635
  • Patent Document 3 WO2002Z099104
  • An object of the present invention is to provide a technique for observing a pathological condition in an animal tissue in particular in real time without damaging the animal.
  • the present invention includes the following gene construct, expression vector containing the gene construct, mammalian cell, transgenic non-human mammal, use of the non-human mammal for observing changes in animal pathology in real time And a method for screening candidate compounds or genes.
  • a reporter gene is incorporated under the control of a hypoxia-responsive promoter, and an ODD domain (oxygen dependent degradation domain) is linked to the repo ⁇ ta ' ⁇ remain izs child and in frame (codon matches) A gene construct.
  • ODD domain oxygen dependent degradation domain
  • hypoxia-responsive promoter has a HIF-1 binding domain (HRE: hypoxia responsive element).
  • a transgenic non-human mammal obtained by incorporating the gene construct according to any one of Items 1 to 6 into a non-human mammal.
  • Transgenic which is obtained by mating a transgenic non-human mammal according to Item 8 or 9 with another non-human mammal having an optional pathological condition, and which can analyze the characteristics of the pathological condition in real time Non-human mammals.
  • a screening method for a candidate compound or gene, wherein the candidate compound or gene that affects the expression or activity of a reporter gene is evaluated using the gene construct according to any one of Items 1 to 6.
  • FIG. 11 shows that 1.0 ⁇ 10 4 luciferase luminescent tumor cells can be detected.
  • the actual tumor size has a minimum of 4 ⁇ 10 5 tumor cells in a 1 mm tumor, it is clear that the present invention allows observation of tumors much smaller than lmm in vivo. Therefore, when a solid cancer is formed in a transgenic non-human mammal obtained by introducing the gene construct of the present invention, the pathological imaging of the cancer can be accurately performed.
  • the present invention can suitably perform basic research on an intra-tumor hypoxic environment that is resistant to radiation therapy and anticancer agents, and an evaluation of the efficacy of drugs that affect the intra-tumor oxygen environment.
  • the present invention is particularly useful for pathological imaging and development of ischemic diseases, and pathological imaging in spontaneously developing cancer model mice.
  • ischemic diseases such as angina pectoris, myocardial infarction, cerebral infarction, peripheral circulatory disturbance of diabetic complications or diabetic nephropathy, diseases related to arteriosclerosis, blood vessel ligation or tissue compression, etc. It is possible to image pathological conditions related to ischemia such as artificial ischemia or blood flow reduction.
  • pathological conditions related to ischemia such as artificial ischemia or blood flow reduction.
  • gastric ulcers, duodenal ulcers, chronic inflammatory models of the respiratory system for example, can be caused by forced inhalation of tobacco, diesel, or gasoline exhaust), or inflammatory substances are administered to various organs and tissues It may be possible to image a wide range of pathological conditions such as inflammatory pathologies and trauma
  • the present invention is very useful for the development of various treatment methods including administration schedules of a plurality of drugs.
  • FIG. 1 Identification of regions essential for enzyme-dependent protein stability control The following experiment was conducted to verify whether there is a difference in the efficiency of oxygen-dependent proteolysis by fusion of ODD domains. went.
  • the pGL3 promoter vector was digested with Bglll, treated with T4 DNA polymerase, and further treated with DNA ligase to construct a plasmid PGL3 ⁇ Bgl in which a mutation was introduced into the Bglll recognition sequence of the pGL3 promoter vector.
  • a pCH / 3- ⁇ plasmid (Harada et al. 2002. Cancer Res.) Is used as a cage, NLS-Nco-sense primer; 5, AAC CAT GGC GXX TAA GAA GAA GAG GAA G-3, and Using 5'-AAC CAT GGT CTG CTG GAA TAC TGT AAC TG-3, the DNA fragment of NLS-ODD (DNA fragment encoding NLS-ODD548-603) is amplified by PCR.
  • Plasmid pGL3 A bgl A Nco / 3-0 introduced with a mutation at the N col recognition site at the 5 'end of the NLS-ODD-Luciferase fusion gene expressed by pGL3 A Bgl / 3-0, It was constructed by the directed muta genesis method.
  • this plasmid is referred to as pGL3 / 3-0.
  • RNA of human cervical cancer-derived cell line HeLa was extracted using ISOGENE (-Tubon Gene).
  • the human HIF-1 ⁇ gene cDNA was obtained by reverse transcription using AMV reverse transcriptase XL. This cDNA was used as a saddle and the 10 primers shown in Table 1 (ODD-Bg FO, -Fl, -F2, -F3, -F4, and ODD-Nco-R0, -Rl, -R2, -R3, -PCR was carried out by combining -R and -R of R4) to obtain a DNA fragment encoding the systematically deleted ODD region.
  • HeLa cells were seeded in a 24-well culture dish (10000 cells / well), cultured for 16 hours, and then introduced with the above-mentioned plasmid (0.4 g / well) with Polyfect Transfection Reagent (QIAGEN).
  • plasmid pRL / CMV which constantly expresses Renilla luciferase
  • plasmid pRL / CMV which constantly expresses Renilla luciferase
  • the medium was changed after 24 hours, and then cultured for 18 hours under aerobic or hypoxic conditions (oxygen concentration: 0.02%). After the medium was aspirated, the cell extract was collected with 100 ml of Passive Lysis Buffer (Promega), and dual luciferase assay was performed according to the attached instructions.
  • 5HRE-Luc-introduced cells are shown in the graph (top) for the duration of aerobic (mouth) or hypoxia (country
  • the figure below shows the results of Western blot analysis of HIF-1a protein in the cells cultured in hypoxia as described above. Considering that the ODD-mediated degradation mechanism occurs in the same way as the HIF-1a protein shown in western blots, the use of 5HRE can enhance reporter gene expression in aerobic tissues. It is thought that it can be suppressed. Furthermore, the induction of expression in hypoxic tissues is expected to increase more than 100 times as time goes on (by chronicling), and imaging is expected to increase accordingly (in fact in vivo). Figure 6) shows a figure enhanced by imaging.
  • FIG. 3 Comparison with existing reporters (Hypoxic Z aerobic ratio of luciferase activity and buckled rounds) The expression of the reporter gene when using only the 5HRE promoter and when combining ODD with 5HRE was compared. In particular, the induction ratio (hypoxia / aerobic) (upper graph) was compared with the aerobic expression (background) (lower graph). As a result, it was found that the reporter combining ODD with 5HRE has a smaller knock ground, and as a result, the induction ratio is significantly improved.
  • HeLa / 5HRE-Luc and HeLa / 5HRE-ODD-Luc cells were seeded (1 X 10 4 cells / well) in a 24-well culture dish, cultured for 16 hours, and then treated with hypoxia for 18 hours It was. Immediately after removal of the cells from the hypoxic chamber, the medium was changed to a medium containing cyclohexamide, and the cells were reoxygenated by culturing in a 5% C02 incubator for 0, 10, 30, 60 minutes. The medium was then aspirated, Passive Lysis Buffer (Promega Co.) was added at a ratio of 101 / well, frozen at ⁇ 80 ° C., and then thawed to collect the cell extract. Luciferase assay (Promega) was performed using 20 1 cell extracts.
  • Luciferase activity was measured 0, 10, 30, and 60 minutes after reoxygenation, and the ratio of luciferase activity at each measurement time to luciferase activity at 0 minutes was calculated as Relative Luciferase Activity. As a result, it was found that when ODD was combined with 5HRE, the reporter decreased more rapidly, and changes in the environment could be captured in real time.
  • FIG.5 Monitoring of hypoxic cancer cells in solid tumor (transplantation) 5HRE-mp-N LS-ODD- for the purpose of investigating how sensitively cells in a hypoxic environment can be monitored
  • Human cancer cells stably incorporating the Luciferase gene construct were transplanted subcutaneously into the lower leg of nude mice to monitor the release by luciferase. 1 ⁇ 10 6 human cancer cells were implanted subcutaneously into the right leg (circle) of nude mice. Immediately after transplantation, it is invisible under an aerobic environment (left figure). The image is already visible on the next day, and after 3 days it is not observed as a tumor, but the image is very clearly observed. Captures luciferase luminescence in hypoxic cancer cells in solid tumors (right)
  • FIG.6 Enhancement of luciferase luminescence by ischemia treatment
  • a tumor made of cells containing a reporter gene containing only the 5HRE promoter and 5HRE combined with ODD We compared the induction of expression in tumors made of cells incorporating the reporter gene when hypoxia was created by worsening blood flow by ligation.
  • HeLa / EF—Luc was subcutaneously implanted into the left lower leg, and HeLa / 5HRE-Luc (upper a-d) or HeLa / 5HR E-ODD-Luc (lower eh) was implanted subcutaneously into the right lower part.
  • Luciferase luminescence was measured at 0, 2, 4, and 8 hours after ligation of the right lower leg. As a result, it was found that there was no significant difference in the speed of expression induction in any of the gene constructs for the expression induction of the reporter gene. In addition, when tumor cells were transplanted into both feet and blood flow in the right foot was worsened, only the tied one showed an enhancement of the image.
  • FIG. 7 Changes in luciferase luminescence during reoxygenation after ischemia treatment
  • the blood flow was reduced by ligation and hypoxia
  • HeLa / EF-Luc (internal control) cells were transplanted into the left lower leg, and HeLa / 5HRE-Luc (upper right) or HeLa / 5HRE-ODD-Luc (lower right) cells were transplanted into the right lower leg. After ligating the right leg for 18 hours, luciferin was administered iv. After anaesthesia, the ligation was released and luciferase luminescence was measured at 0, 5, 15, 25, and 35 minutes.
  • FIG. 8 Transgenic mice In Fig. 7, the experiment was conducted using cells stably incorporating 5HRE-mp-NLS-ODD-Luciferase, but the above-described gene construct was stably incorporated into cells throughout the body. In order to investigate whether the same phenomenon is observed in nick mice, we conducted experiments using transgenic mice.
  • FIG. 9 shows one preferred embodiment of pathological imaging using a transgenic mouse.
  • the concentration of the protein fused with the membrane permeation domain (PTD) that allows the protein to freely pass through the cell membrane into the cell is changed / 3-
  • a protein having galactosidase activity was added to the medium and cultured for 24 hours in an aerobic state (20%) and a hypoxic state (1%). Then fix the cells in formalin, wash 3 times with PBS, and react the cells with a solution containing the substrate of j8-galactosidase, so that the activity of the j8-galactosi dase protein (that is, the remaining amount of 13-galactosidase protein in the cell) Were compared in aerobic and hypoxic conditions.
  • FIG. 11 A: 100 ⁇ 1 of cell suspension containing the number of HeLa / EF-Luc cells shown in the figure and 50 ⁇ 1 of luciferin solution (0.1 mg / ml) were mixed in each well. . Immediately thereafter, chemiluminescence was imaged on the IVIS-200 system (Xenogen). As a result, it became clear that luciferase-expressing cells of the order of 10 3 can be visualized. B: Based on the experimental results in (A), the chemiluminescence of each well was quantified using Igor Pro 4.09A (Xenogen).
  • Fig. 12 Human HIF-1a gene cDNA was obtained by reverse transcription using AMV reverse transcriptase XL with the total RNA of the human cervical cancer-derived cell line HeLa as a saddle type. Using this cDNA as a saddle, the primers shown in Table 1 are ODD-Bg F3 and A588-Nco-anti, OD D—Bg ⁇ F3 and A593—Nco—anti ⁇ ODD—Bg F3 and T598—Nco—anti ⁇ Q553 — Perform PCR with a combination of Bg sense and A588-Nco-anti, L557- Bg ⁇ sense and A588- Nco-anti, and digest these DNA fragments with Bglll and Ncol to obtain 5 'end and 3' The ends were digested with Bgl II and Ncol, respectively, and incorporated into a plasmid vector prepared by treating pGL3 / 3-0 with Bglll and Ncol.
  • the plasmid DNA used was pGL3 promoter vector, pGL3 / 3-0, pGL3 / 3-4, pGL3 / 54 8-588, pGL3 / 548-593, pGL3 / 548-598, pGL3 / 553-588, pGL3 / 557
  • they are indicated as pGL3, 548-603 (3-0), 548-583 (3-4), 548-588, 548-593, 548-598, 553-588, 557-588, respectively.
  • all the fusion proteins in this figure, which fused ODD with luciferase are subject to oxygen concentration-dependent stability control.
  • a feature of the present invention is the imaging of hypoxia or diseased tissue at a very early stage. It is possible to elucidate the pathological condition or to screen for therapeutic agents for diseases very efficiently.
  • FIG. 5 shows that the cancer can be imaged one day after transplanting only 1 ⁇ 10 6 cancer cells into nude mice, and the tumor cannot be observed 3 days later. It is shown that it can perform proper imaging.
  • FIG. 11 shows that only 1 ⁇ 10 4 cancer cells can be detected.
  • the transgenic mouse of the present invention mated with a disease state model animal can image the disease state, specify the onset time, specify the onset site, observe the lesion site over time, treat Effective in developing methods and observing therapeutic effects over time.
  • the transgenic mouse of the present invention is used as another pathological mouse.
  • ischemic treatment for example, a cancer-onset modified mouse or an ischemic disease-onset mouse
  • carcinogenic stimulation imaging of a disease state can be performed.
  • ODD domain HIF-1 binding domain-containing HIF-1 binding domain (HRE: hypoxia responsive element), minimum promoter (mp), Nuclear localization signals (NLS) are used to mean the polynucleotides that encode them.
  • HRE hypoxia responsive element
  • mp minimum promoter
  • NLS Nuclear localization signals
  • pathological condition broadly includes an initial inconvenient state that leads only to a disease state.
  • the pathology of cancer includes the case where cancer cells that can be imaged according to the present invention are present in a population of about several tens of populations.
  • Bloody “pathological conditions” include not only a state where blood vessels are clogged, but also a state where blood flow is reduced systemically or locally due to arteriosclerosis or thickening of vascular endothelial cells.
  • reporter genes include j8-galactosidase gene, luciferase gene (blue, red, orange, green, etc.), (green, yellow, cyan, red, blue) fluorescent protein gene (GFP YFP, CFP, BFP, DsRed, DsRed2), alkaline phosphatase gene, horse radish peroxidase gene, or chloramphenic Examples thereof include a lucetyltransferase gene, and luciferase is particularly preferable in terms of sensitivity. Luciferase is preferable because it is easy to confirm light emission in the deep part of the luciferase having a long light emission such as orange or red.
  • luciferase examples include luminescent organisms such as fireflies and lightning worms, luminescent earthworms, lacia, hydshevi, iriomote fireflies, sea urchins, sea urchins, railroad insects, dinoflagellates, and Ewan jellyfish. .
  • the hypoxia-responsive promoter includes both an element (enhancer) whose expression is induced during hypoxia and an element that promotes transcription by binding RNA polymerase.
  • the element that induces transcriptional activity during hypoxia is not particularly limited, and includes, for example, a HIF1 responsive element (an enzyme).
  • HRE hyperoxia responsive element having a HIF1-binding domain is preferably exemplified.
  • HRE prefers to use multiple HREs in tandem. Examples of the number of HREs connected to the tandem include 2-5.
  • Fig. 2 shows that when hypoxia is induced in an element in which five HREs are linked in tandem (5HRE), the expression increases rapidly after 2 hours (especially after 4 hours).
  • RNA polymerase binds and promotes transcription
  • known elements are widely used, and examples thereof include CMVmp (cytomegalovirus minimal promoter).
  • the ODD domain (oxygen dependent degradation domain) can include a polynucleotide encoding the region 401 to 603 of the amino acid sequence of human HIF-la of SEQ ID NO: 1.
  • ODD domain oxygen dependent degradation domain
  • a polynucleotide encoding the region from 557 to 574 is particularly desirable.
  • polynucleotides encoding the 553-556th and 575-588th regions are included.
  • Polynucleotides encoding regions 548 to 552 and 589 to 603 may be included.
  • a polynucleotide encoding the 401st to 547th regions may be included, but is preferably not included.
  • ODD domain derived from human HIF-1a of SEQ ID NO: 1 human HIF-2a, HIF-3 ⁇ , etc., and homologs of HIF-1 ⁇ from non-human organisms such as mice and rats
  • ODD domain derived from can also be used.
  • any polypeptide that is actively degraded under aerobic conditions and under the control of stabilizing under hypoxic conditions can be used instead of ODD derived from HIF-1a.
  • a hypoxia-inducible promoter for example, a promoter comprising 5X HRE and cytomegalosulfuryl-mamm promoter (CMPmp)
  • CMPmp cytomegalosulfuryl-mamm promoter
  • Patent documents 1 and 2 disclose a combination of a reporter gene product and a hypoxia-inducible promoter (HRE). In the case of confirming hypoxia, it has been conventionally performed to combine HRE and a reporter gene so that the expression level during hypoxia is as high as possible. When the ODD is combined here, the reporter gene is partially decomposed and the expression level decreases, but the induction ratio increases, and as a result, the present inventor has found that imaging of a clear pathological condition becomes possible. .
  • HRE hypoxia-inducible promoter
  • hypoxia-inducible promoter such as HRE
  • ODD that decreases the expression level of the reporter gene
  • the genetic construct of the present invention further comprises a nuclear localization signal (NLS).
  • NLS nuclear localization signal
  • NLS refers to an amino acid sequence necessary for a protein to be localized in the nucleus in a eukaryotic cell having a nuclear membrane structure in the cell, and is not particularly limited as long as it has an activity to localize the protein in the nucleus.
  • NLS derived from SV40 large-T antigen (polynucleotide encoding the region of amino acids 126-13 of the large-T antigen; Pro Natl. Acad. Sci. (1989) 86:93 27-9331),
  • a preferred example is HLS-1a NLS.
  • the gene construct of the present invention preferably has the following structure:
  • polynucleotides of the HIF-1 binding domain, mp, NLS, ODD domain, and reporter gene may be linked via an appropriate nucleotide sequence that may be directly linked.
  • the gene construct of the present invention can be introduced into a mammalian cell to obtain a transformed cell.
  • Introduction of the gene construct of the present invention into animal cells, particularly mammalian cells, can be performed, for example, by the calcium phosphate method (Chen and Okayama method: Mol Cell Biol. 1987 Aug; 7 (8): 2745-52.). it can.
  • Hosts into which the gene construct of the present invention is introduced include mammals (human, monkey, inu, ushi, horse, hidge, pig, usagi, mouse, rat, guinea pig, hamster, etc.), insects, Examples include birds (such as chickens), reptiles (such as force elves), animal cells such as fish, eukaryotic cells such as yeast, and mammalian cells are preferred.
  • the transformant of the present invention can image intracellular hypoxia and is useful for screening drug candidate compounds having a protective effect against low oxygen.
  • “candidate compounds” include low molecular weight compounds, proteins, nucleotides (oligomers and polymers), peptides (oligomers and polymers), sugars (monosaccharides, disaccharides, A wide range of natural or synthetic substances (including monomers, oligomers and polymers) such as polysaccharides), glycolipids and glycoproteins.
  • Transgenic non-human mammals are routinely used in the production of transgenic animals (for example, the latest animal cell experiment manual, L.I. 361 to 408, see 1990).
  • transgenic animals for example, the latest animal cell experiment manual, L.I. 361 to 408, see 1990.
  • mouse embryonic stem cells ES cells
  • the transformed ES cells are microinjected into fertilized eggs (alveolar vesicles) obtained from another mouse to obtain founder mice, which include other mice (for example, BALB / c, but are not limited thereto). 2) can be backcrossed twice to obtain a transgenic mouse of the present invention (heterotype, ie, a mouse having the gene construct of the present invention on only one chromosome). If this heterozygous transgenic mouse is further mated, homotransgenic mice can be obtained.
  • heterotype ie, a mouse having the gene construct of the present invention on only one chromosome
  • a transgenic mouse capable of detecting a hypoxic site and a site having a functional disorder in real time is obtained. be able to.
  • mice used in the process of producing transgenic mice, or hetero- or homotransgenic mice pathological model mice and genetically modified mice (other Transgenic mice, knockout mice; mice that spontaneously develop pathological conditions such as ischemic cerebrovascular disorder, ischemic heart disease, ischemic arteriosclerosis, solid cancer, etc.) can be observed in real time The right mouse.
  • Other Transgenic mice, knockout mice mice that spontaneously develop pathological conditions such as ischemic cerebrovascular disorder, ischemic heart disease, ischemic arteriosclerosis, solid cancer, etc.
  • the non-human mammal of the present invention can be obtained in the same manner as in the case of a non-human mammal other than the force mouse, which exemplifies a method for producing a transgenic mouse.
  • Luciferase When luciferase is used as the reporter gene of the present invention, luminescence at hypoxia or pathological site can be confirmed by administering luciferin to a non-human mammal. Luciferin can be suitably administered by injection such as intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, etc., and can be achieved by releasing luciferin continuously by a drug delivery system.
  • the luminescence of the luciferin luciferase system is obtained by accommodating the non-human mammal of the present invention having the luciferase gene as a reporter gene in a box capable of detecting the characteristic wavelength of the luciferin luciferase system and observing the luminescence.
  • hypoxia or pathological site can be confirmed.
  • Fluorescent proteins such as GFP, YFP, CFP, BFP, DsRed, and DsRed2 can be confirmed in the same manner as luciferase.
  • the change in the fluorescence wavelength due to the substrate phosphate in the case of horseradish peroxidase, the fluorescence due to the luminol reaction, other enzymes (j8-galactosidase or chloramphee-cholasecetyl) (Transferase) attaches a luminescent label to the substrate protein, and modifies the enzyme reaction so that the fluorescence wavelength changes when each enzyme reaction (for example, the substrate is cleaved). Imaging is possible by the phenomenon of light emission.
  • the reporter gene is particularly preferred from the viewpoint of sensitivity of luciferase imaging.
  • the screening method of the present invention is carried out by administering various compounds to the transformed cell (transformant) or the transgenic non-human mammal of the present invention and observing changes in the expression of the reporter gene. can do.
  • a compound particularly a drug candidate compound
  • a transgenic non-human mammal having a disease state e.g., a transgenic non-human mammal having a disease state
  • the effect of the compound can be observed. It can be examined precisely.
  • the compounds to be administered include proteins (including a wide range of hormones, antibodies, enzymes, receptors, etc.), nucleic acids (DNA, RNA), or substances that interact with these and a physiologically active substance (low molecular weight). Including high and high molecular weight compounds), including the confirmation of toxic effects,
  • the reporter gene may incorporate only one species, or two, three, four or more genes may be incorporated simultaneously.
  • the expression vector containing the recombinant DNA possessed by the transgenic mouse of the present invention was constructed by the following procedure.
  • pLS / 3- ⁇ plasmid (Harada et al. 2002. Cancer Res.) is used as a cage, NLS— Nco— sense primer; 5, — AAC CAT GGC GCC TAA GAA GAA GA G GAA G—3, and ODD— Nco-anti primer; 5'-AAC CAT GGT CTG CTG GAA TAC TGT AAC TG-3 was used to amplify the NLS-ODD DNA fragment (DNA fragment encoding NLS-ODD548-603) by PCR.
  • a plasmid vector that constitutively expresses a luciferase protein was constructed by the following procedure. PGL3 promoter using Luc- Bam-sense primer 5 '-AAG GAT CCA CCA TGG AAG ACG CCA AA-3, and Luc-RV-anti primer 5,-TTG ATA TCT TAC ACG GCG AT C TTT CC-3 By performing PCR using vectors as saddles Thus, cDNA of the luciferase gene was obtained.
  • Human cervical cancer-derived HeLa cells were obtained from ATCC and Dulbecco's Modified Eagle Medium: D—MEM supplemented with penicillin 100 unit / ml, streptomycin 100 ⁇ g / ml, and 10% Fetal Bovin Serum. Cultured.
  • PEF / Luc, pEF / 5HRE-Luc, and pEF / 5 HRE-ODD-Luc were introduced into HeLa cells by a modified calcium phosphate method.
  • the cells were cultured in a selective medium containing 400 mg / ml G418 for 10 days from the day after gene introduction, and the formed colonies were isolated.
  • a clone HeLa / EF-Luc that constantly expresses luciferase was used in the experiment.
  • clones obtained by introducing PEF / 5HRE-Luc or PEF / 5HRE-ODD-Luc into HeLa cells clones with high luciferase inducing ability by hypoxia treatment (HeLa / 5HRE-Luc, and HeLa / 5HRE-ODD-Luc) was used in the experiment.
  • HeLa / 5HRE-Luc cells were seeded in a 24-well culture dish (1 ⁇ 10 * cells / well) and cultured for 16 hours. Then aerobic (20% O) or hypoxic (1% 0 or less)
  • cells prepared by the method described above are cultured under hypoxic conditions, and after 0, 1, 2, 4, 8 and 16 hours, the cells are directly placed in a hypoxic chamber at 1 X loading of 100 1 Dissolve in buffer, 20 ⁇ l of which was developed by electrophoresis using 7.5% SDS-polyacrylamide gel, and applied to PVDF membrane (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
  • plasmid pRL / CMV which constantly expresses Renilla luciferase
  • an internal control 0.04 / z g / well.
  • the medium was changed after 24 hours, and then cultured for 18 hours under aerobic or hypoxic conditions (oxygen concentration: 0.02%). After aspirating the medium, the cell extract was collected with 100 ml of Passive Lysis Buffer (Promega), and dual luciferase assay was performed according to the attached instructions. The results are shown in Figure 3.
  • the Promega dual-access system was used only in the experiments of Figs. This is because, in order to temporarily express the gene encoding each construct, a certain amount of the gene encoding renilla luciferase was introduced at the same time in order to correct the difference due to the efficiency of gene transfer. This is because the activity of luciferase (firefly luciferase and Renilla luciferase) is measured and the ratio is evaluated.
  • FIG. 3 top “ratio of firefly luciferase activity to renilla luciferase activity” under aerobic and hypoxic conditions was determined. Furthermore, the ratio of the calculated value in the hypoxic condition to the calculated value in the aerobic condition is obtained, and this is set as 7 low oxygen a ⁇ 3 ⁇ 4H3 ⁇ 4 (Induction Ratio: Hypo / Aero).
  • FIG. 3 bottom the activity of firefly luciferase under aerobic conditions was defined as the background (Net Count under Aero) under aerobic conditions.
  • Human cancer cell lines stably carrying pGL3 / 5HRE-Luc or pGL3 / 5HREp-NLS-ODD-Luciferase HeLa / 5HRE-Luc and HeLa / 5HRE-ODD-Luc cells are used as reporters.
  • HeLa / 5HRE-Luc and HeLa / 5HRE-ODD-Luc cells were seeded in a 24-well culture dish (1 X 10 4 cells / well), cultured for 16 hours, and then treated with hypoxia for 18 hours It was. Immediately after removal of the cells from the hypoxic chamber, the medium was changed to a medium containing cyclohexamide, and the cells were reoxygenated by culturing in a 5% C02 incubator for 0, 10, 30, 60 minutes. The medium was then aspirated, Passive Lysis Buffer (Promega Co.) was added at a ratio of 101 / well, frozen at ⁇ 80 ° C., and then thawed to collect the cell extract.
  • Passive Lysis Buffer Promega Co.
  • the firefly luciferase activity was examined using 201 cell extracts using the Luciferase Assay Kit (Promega). The ratio of luciferase activity at each measurement time to luciferase activity at 0 minutes was calculated and used as Relative Luciferase Activity.
  • the cells were treated with trypsin, washed with cold PBS, and suspended in PBS to a concentration of (1 ⁇ 10 6 cells / 100 ⁇ 1). This cell suspension was transplanted subcutaneously into the lower thigh of 6-week-old female BALB / c nu / nu mice.
  • Fig. 5 shows the results of imaging of the obtained model mouse.
  • HeLa / EF-Luc was implanted subcutaneously in the left lower leg and HeLa / 5HRE-Luc or HeLa / 5HRE-ODD-Luc was implanted subcutaneously in the right lower leg.
  • the right lower leg was ligated, and immediately after that, the mouse was placed in an anesthesia apparatus (Xenogen Co) filled with isoflurane gas.
  • luciferin was administered at 50 mg / kg iv, and chemiluminescence by luciferase was detected using the IVIS-100 system (Xenogen Co.).
  • the obtained images were analyzed using IGOR Pro, V4.0.6.1 (Wavemetrics, Lake Oswego, OR).
  • luciferin was administered at 50 mg / kg iv. Administration After 12 minutes, the mouse was placed in an anesthesia device (Xenogen Co) filled with isoflurane gas. Three minutes later, the ligation was solved, and chemiluminescence was detected at 0, 5, 15, 25, and 35 minutes thereafter.
  • the right lower leg of a transgenic mouse was ligated for 16 hours. Anesthesia was performed with isoflurane gas from 11 minutes after luciferin administration, and imaging was performed at 13 minutes. 15 minutes after luciferin administration, the ligation was released and the right lower leg was reoxygenated. Images were taken at 2, 5, 8, 10, 12, and 15 minutes with the reoxidation time as the reference (0 min). Reporter The luminescence of one protein decreased with time and disappeared. Then, in order to confirm that the image observed so far is not a false positive image due to bleeding, etc., immediately add additional luciferin and image at 17, 20, 23, 26 and 30 minutes. did. The reporter protein, once reoxygenated and disappeared, was unable to be confirmed again.
  • fertilized eggs B6C3F2 obtained by natural mating of female B6C3F1 X male B6C3F1 were used. 0.6% agarose gel after electrophoresis of the gene fragment (Xhol-Sail fragment of pGL3 / 5HREp- NLS- ODD- Luciferase, approx. 1.7 kbp; 5HRE-CMVmp- NLS- ODD (548-603)-(Firefly Luciferas e gene)) After collection and purification, it was dissolved in Tris 10 mM, ED TA 0.1 mM (TE) solution at a concentration of 500 copy / pl.
  • Tris 10 mM, ED TA 0.1 mM (TE) solution at a concentration of 500 copy / pl.
  • the equivalent of 1000 copies was injected by the microinjection method (reference book Methods in Enzymolizy Vol. 225 Guode to Techniques in Mouse Development), and fertilized eggs that had been confirmed to survive were the oviducts of the pseudo-pregnant 0.5 dpc ICR strain foster mother. On the 19th day after transplantation, a pup was obtained by cesarean section. As a result of PCR gene analysis of the resulting litter, the gene was positive.
  • the transgenic mice of the present invention were established by making a line based on the gene-positive individuals.
  • Neoplasia • Shibata T, uiaccia AJ, Brown JM (2002). Hypoxia- inauciole regulation of a prodr ug—activating enzyme for tumor-specific gene therapy. Neoplasia. 4: 40—48.

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Abstract

　本発明は、動物の組織における病態或いは病態までに至る前段階の機能的に不都合な状態を、動物を傷つけることなく、特にリアルタイムで観察する技術を提供することを課題とする。この課題は、レポーター遺伝子を低酸素応答性プロモーターの制御下に組み込んでなり、かつレポーター遺伝子の上流側にＯＤＤドメイン(oxygen dependent degradation domain)を有する遺伝子構築物により達成される。

Description

明 細 書
病態の状態をリアルタイムで観察可能なモデル動物とそれを可能にする 遺伝子構築物及びその使用
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子構築物に関し、詳しくは動物の病態の変化をリアルタイムで観察 可能な遺伝子構築物に関する。
[0002] また、本発明は、該遺伝子構築物を含む、発現ベクター、哺乳動物細胞、トランス ジェニック非ヒト哺乳動物、動物の病態の変化をリアルタイムで観察するための該非ヒ ト哺乳動物の使用、並びに薬物、遺伝子、タンパク質のスクリーニング方法に関する
背景技術
[0003] 固形腫瘍内の酸素分圧は均一ではなぐ腫瘍細胞はさまざまな酸素環境にさらさ れている。これは、血管力 腫瘍組織へ酸素分子が拡散する距離が限られていること に起因する。
[0004] HRE等の低酸素応答ェンハンサーを利用することによって、治療用遺伝子やレポ 一ター遺伝子等、目的の遺伝子の発現を低酸素環境下で誘導できることが知られて いた。
[0005] し力しながら、この遺伝子発現系には、有酸素条件化においても僅かながら遺伝子 が発現してしまうという問題点があった。また、レポーター遺伝子の安定性に起因して 、細胞が置かれた酸素環境にリアルタイムに応答することが困難であった。すなわち 現行のシステムでは低酸素刺激を感知する事は可能であっても、その後の有酸素刺 激 (再酸素化）を短時間で感知するレポーターが存在しな力つたため、細胞の置かれ た酸素環境をリアルタイムに反映することが出来な力つた。最後に、当該低酸素応答 プロモーターは、低酸素環境のみでなぐ低酸素環境に直接的または間接的に付随 して起こる異常な状態にある細胞内で活性ィ匕されることが知られており、従って低酸 素環境に直接的または間接的に付随して起こる様々な病態を感知することができる と考えられ、病態に深く関与する環境に応答性の高い遺伝子発現系の開発が望まれ ていた。
[0006] 特許文献 1と特許文献 2は、レポーター遺伝子と低酸素誘導性プロモータ（HRE)の 組み合わせを開示して 、るが、 ODDにつ!/ヽては記載して!/ヽな!、。
[0007] 特許文献 3は、レポーター遺伝子と NLS-ODDの組み合わせを開示して 、るが、低 酸素誘導性プロモータ（HRE)につ 、ての記載はな!/、。
特許文献 1：特表平 11 506302
特許文献 2：特表 2004— 509635
特許文献 3 :WO2002Z099104
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、動物の組織における病態を、動物を傷つけることなぐ特にリアルタイム で観察する技術を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明は、以下の遺伝子構築物、該遺伝子構築物を含む発現ベクター、哺乳動物 細胞、トランスジ ニック非ヒト哺乳動物、動物の病態の変化をリアルタイムで観察す るための該非ヒト哺乳動物の使用、並びに候補ィ匕合物または遺伝子のスクリーニング 方法に関する。
1. レポーター遺伝子を低酸素応答性プロモーターの制御下に組み込んでなり、か つ ODDドメイン (oxygen dependent degradation domain)をレポ ~~タ' ~~遺 izs子とインフ レームで (codonが合って)連結してなる遺伝子構築物。
2. 低酸素応答性プロモーターが、 HIF- 1結合ドメイン (HRE: hypoxia responsive ele ment)を有する項 1に記載の遺伝子構築物。
3. 低酸素応答性プロモーターが、ミニマムプロモーター (mp)を有する項 1に記載の 遺伝子構築物。
4. レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である項 1〜3のいずれかに記載の 遺伝子構築物。
5. 核局在シグナル (NLS)をさらに含む、項 1〜4のいずれかに記載の遺伝子構築 物。 6. (HIF- 1結合ドメイン）一 （mp)—（NLS)—（ODDドメイン）一（レポーター遺伝子） の構造を有する項 5に記載の遺伝子構築物。
7. 項 1〜6のいずれかに記載の遺伝子構築物を宿主細胞に導入してなる形質転 換体。
8. 項 1〜6のいずれかに記載の遺伝子構築物を非ヒト哺乳動物に組み込んでなる トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
9. 非ヒト哺乳動物がマウスである項 8に記載の非ヒト哺乳動物。
10. 項 8または 9に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物と任意の病態の特徴を 有する他の非ヒト哺乳動物を交配させてなる、前記病態の特徴をリアルタイムで解析 可能なトランスジヱニック非ヒト哺乳動物。
11. 病態をリアルタイムでモニターするための、項 8〜10のいずれかに記載の非ヒ ト哺乳動物の使用。
12. 項 1〜6のいずれかに記載の遺伝子構築物を利用して、レポーター遺伝子の 発現または活性に影響を及ぼす候補化合物または遺伝子を評価する、候補化合物 または遺伝子のスクリーニング方法。
13. 項 8〜10のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物を利用して、病態に影響を及ぼ す候補化合物または遺伝子を評価または探索する方法。
発明の効果
本発明の遺伝子構築物は、動物細胞に導入することにより、酸素濃度のみならず、 病態を初期の段階力 重症に至るまでの過程をその重篤度に応じてリアルタイムで 観察することができる。例えば、図 11では、 1.0 X 104個のルシフェラーゼ発光腫瘍細 胞が検出可能であることを明らかにした。実際の腫瘍サイズでは、 1mmの腫瘍に最小 でも 4 X 105個の腫瘍細胞があることを考えると、本発明により lmmよりもかなり小さい 腫瘍まで in vivoで観察可能であることが明らかである。したがって、本発明の遺伝子 構築物を導入することにより得られたトランスジエニック非ヒト哺乳動物に固形がんが 形成された場合、癌の病態イメージングを的確に行うことができる。また、この癌の動 物モデルに抗癌剤の候補となる化合物を投与して癌の状態を観察することにより、癌 に対する有効性を判定することが出来、薬物のスクリーニング系や物理的治療法 (例 えば、手術、放射線療法、温熱療法)の評価系としても有用である。
[0011] 本発明は、放射線治療ゃ抗癌剤に耐性を示す腫瘍内低酸素環境の基礎研究、腫 瘍内の酸素環境に影響を及ぼす薬剤の薬効評価を好適に行うことができる。
[0012] 例えば、本発明は、虚血性疾患の病態イメージングおよび治療法の開発、自然発 生癌のモデルマウスでの病態イメージングに特に有用である。
また、癌以外に、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患、糖尿病の合併症の 末梢循環障害或いは糖尿病性腎症、動脈硬化に関連する疾患、血管の結紮或いは 組織の圧迫などによる人工的な虚血或いは血流の低下などの虚血に関与する病態 のイメージングが可能である。また、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、呼吸器系の慢性炎症モ デル (例えば、タバコ或いはディーゼル、ガソリンの排気ガスの強制吸入により引き起 こすことができる）、或いは各種臓器、組織に対し起炎物質を投与することによる炎症 性の病態、外傷などの広範な病態のイメージングができる可能性もあると考えられる
[0013] 本発明の遺伝子構築物を組み込むことで、臓器な 、し組織の病態の変化を、動物 に侵襲を与えることなく評価できる。従って、本発明は複数の薬物の投与スケジユー ルなどを含めた種々の治療法の開発に非常に有用である。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]酵素依存的タンパク質安定性制御に必須な領域の同定 ODDドメインの融合 による酸素依存的タンパク質分解の効率に違いがあるか否かを検証する目的で、以 下の実験を行った。
[0015] pGL3プロモーターベクターを Bglll消化後、 T4 DNAポリメラーゼで処理し、さらに D NAリガーゼで処理することによって、 pGL3プロモーターベクターの Bglll認識配列に 変異を導入したプラスミド PGL3 Δ Bglを構築した。
[0016] pCH/3-Οプラスミド（Harada et al. 2002. Cancer Res.)を铸型とし、 NLS-Nco- sense primer; 5，— AAC CAT GGC GXX TAA GAA GAA GAG GAA G— 3，、および ODD— N co-anti primer; 5' -AAC CAT GGT CTG CTG GAA TAC TGT AAC TG— 3，を用い て NLS- ODD の DNA断片（NLS- ODD548- 603をコードする DNA断片）を PCR法で増
3-0
幅した。この DNA断片を Ncol消化後 pGL3 Δ Bglの Ncol部位に挿入し、 pGL3 Δ Bgl/3- oを構築した。
[0017] pGL3 A Bgl/3-0が発現する NLS-ODD-Luciferase融合遺伝子の 5'端に存在する N col認識部位に変異を導入したプラスミド pGL3 A bgl A Nco/3- 0を、 site- directed muta genesis法によって構築した。以降、このプラスミドを pGL3/3-0と記述する。
[0018] ヒト子宮頸癌由来細胞株 HeLaの total RNAを、 ISOGENE (-ツボンジーン）を用いて 抽出した。これを铸型とし AMV reverse transcriptase XLを用いて逆転写反応を行う ことによってヒト HIF-1 α遺伝子の cDNAを獲得した。この cDNAを铸型とし、表 1に示 す 10種のプライマー（ODD- Bg FO, - Fl, - F2, - F3，- F4、および ODD- Nco- R0, - Rl, -R2, -R3, - R4)の- Fと- Rを組み合わせて PCRを行い、系統的に欠失させた ODD領 域をコードする DNA断片を獲得した。
[0019] これらの DNA断片を Bglll及び Ncolで消化することによって 5'末端および 3'末端を それぞれ Bglll及び Ncol消化末端にし、 pGL3/3-0を Bglll及び Ncol処理して調製した プラスミドベクターに組込んだ。本遺伝子組換えによって、 ODD領域の各種欠失 DN A断片（0-0、 0-1、 0-2、 0-3、 0-4、 1-0、 1-2、 1-3、 1-4、 2-0、 2-3、 2-4、 3-0、 3-4、 4-0 )と、 NLS、及びルシフェラーゼが融合した遺伝子を発現するプラスミド (それぞれ pGL 3/0—0、 pGL3/0— 1、 pGL3/0— 2、 pGL3/0— 3、 pGL3/0— 4、 pGL3/l— 0、 pGL3/l— 2、 pGL 3/1-3、 pGL3/l- 4、 pGL3/2- 0、 pGL3/2- 3、 pGL3/2- 4、 pGL3/3- 0、 pGL3/3- 4、 pGL 3/4-0)を構築した。
[0020] 24穴培養ディッシュに HeLa細胞をまき（10000 cells/well)、 16時間培養した後に上 記プラズミド (0.4 g/well)をそれぞれ Polyfect Transfection Reagent (QIAGEN)にて導 入した。この時ゥミシィタケルシフェラーゼを恒常的に発現するプラスミド pRL/CMV ( Promega)もインターナルコントロールとして同時に導入した（0.04 g/well)。遺伝子導 入力も 24時間後に培地を交換し、その後さらに 18時間にわたって有酸素、または低 酸素条件化 (酸素濃度く 0.02%)にて培養した。培地を吸引後、 100 mlの Passive Lysis Buffer (Promega)にて細胞抽出液を収集し、付属の説明書に従ってデュアルルシフ エラーゼアツセィを行った。
[0021] 実験の結果、 ODD/3-0ドメイン配列を融合した時に、最大の酸素濃度依存的タン ノ ク質分解効率が得られることがわ力つた。 [図 2]5HREプロモーター活性の低酸素応答性制御 低酸素特異的なプロモーターを 用いることで、図 10に示したような ODDを介した分解系の限界を十分解決することが できる。
5HRE-Lucを導入した細胞をグラフ（上）に示した時間有酸素（口）または低酸素（國
)で培養した後、細胞内で発現したルシフェラーゼの活性を測定した。データは 3回 の実験の結果を平均と SDで示した。下の図は、上述の低酸素で培養した細胞内で の HIF-1 aのタンパク質をウェスタンブロット法で調べた結果である。 ODDを介する分 解機構が、 western blotで示した HIF-1 aのタンパク質と同様に起こるということを考え ると、 5HREを用いることにより、有酸素状態の組織でのレポーター遺伝子の発現を 力なり押さえることができると考えられる。更に、低酸素状態の組織での発現誘導は、 時間が長くなるにつれて (慢性ィ匕することにより） 100倍以上に増加し、イメージングも それにつれて増強されていくことが期待される（実際 in vivoイメージングで増強されて いる図が図 6)。
[図 3]既存レポーターとの比較 (ルシフェラーゼ活性の低酸素 Z有酸素比とバックダラ ゥンド） 5HREプロモーターだけを用いた時と 5HREに ODDを組み合わせた時のレポ 一ター遺伝子の発現を比較した。特に誘導比 (低酸素/有酸素）（上グラフ）と有酸素 での発現 (バックグラウンド）（下グラフ）の比較を行った。その結果、 5HREに ODDを 組み合わせたレポーターの方が、ノ ックグラウンドが小さくなり、その結果誘導比が著 しく向上する事がわかった。上段； PGL3/5HRE- Lucもしくは pGL3/5HREp- NLS- OD D-Luciferase (pGL3/5HRE- ODD- Luc)を、 pRL-CMVとともに HeLa細胞に導入し、低 酸素/有酸素条件化で培養した後に、デュアルルシフ ラーゼアツセィを行った。低 酸素条件化および有酸素条件化における「ゥミシィタケルシフ ラーゼの活性に対す る蛍ルシフェラーゼの活性の比」をそれぞれ算出し、次に有酸素条件化における比 に対する低酸素条件化での比を算出し、 Induction Ratioとした。下段；上記処理後の 有酸素条件化におけるホタルルシフ ラーゼの活性 (実測値)をグラフにした。細胞 抽出液の代わりに Passive Lysis Bufferを用いてルシフェラーゼアツセィを実施し、 Bac kgroundを測定した。
[図 4]低酸素処理後の再酸素化によるルシフェラーゼ活性の推移 5HREプロモータ 一だけを用いた時と 5HREに ODDを組み合わせた時のレポーター遺伝子の発現を比 較した。低酸素状態力 有酸素状態に環境が変化したときのレポーターの変化を調 ベた。
[0023] 24穴培養ディッシュに HeLa/5HRE- Luc、および HeLa/5HRE- ODD- Luc細胞を播 種（1 X 104 cells/well)し 16時間培養した後、 18時間にわたって低酸素処理を行った。 細胞を低酸素チャンバ一力 取り出した直後にシクロへキサミド含有培地に培地交 換し、 0、 10、 30、 60分間にわたって 5% C02インキュベーターで培養をすることによつ て再酸素処理をした。その後培地を吸引し、 Passive Lysis Buffer (Promega Co.)を 10 0 1/well添加して- 80 °Cにて凍結した後、融解することによって細胞抽出液を収集 した。 20 1の細胞抽出液を用いルシフェラーゼアツセィ (Promega)を行った。
[0024] 再酸素化から 0、 10、 30、 60分後にルシフェラーゼ活性を測定し、 0分におけるルシ フェラーゼ活性に対する各測定時間におけるルシフェラーゼ活性の比を算出して Rel ative Luciferase Activityとした。その結果、 5HREに ODDを組み合わせた時の方が、 レポーターの減少が速やかで、よりリアルタイムに環境の変化を捕らえることができる ことがわかった。
[図 5]固形腫瘍内低酸素がん細胞のモニタリング (移植） 低酸素環境下におかれた 細胞をどれくらい感度良くモニターすることができるかを調べる目的で、 5HRE-mp-N LS-ODD-Luciferase遺伝子構築物を安定に組み込んだヒトがん細胞をヌードマウス の下腿部の皮下に移植してルシフェラーゼによる発行をモニターした。 1 X 106ヒトが ん細胞をヌードマウスの右足（circle)に皮下移植した。移植直後は有酸素環境下に あるため見えない (左図）。次の日には既にイメージが見えており、 3日後には腫瘍と しては観察されないものの、イメージは非常にはっきり観察される。固形腫瘍内の低 酸素がん細胞内のルシフェラーゼ発光を捕らえている (右図）
[図 6]虚血処理によるルシフェラーゼ発光の増強 低酸素によるレポーター遺伝子の 発現誘導を比較する目的で、 5HREプロモーターだけのレポーター遺伝子を組み込 んだ細胞で作った腫瘍と、 5HREに ODDを組み合わせたレポーター遺伝子を組み込 んだ細胞で作った腫瘍で、結紮により血流を悪くして低酸素状態を作ったときの発現 誘導を比較した。 [0025] HeLa/EF— Lucを左下腿部皮下に、 HeLa/5HRE- Luc (上段 a- d)または HeLa/5HR E-ODD-Luc (下段 e-h)を右下退部皮下に移植した。右下腿を結紮後、 0、 2、 4、 8時 間後にルシフェラーゼ発光量を測定した。その結果、レポーター遺伝子の発現誘導 にはいずれの遺伝子構築物でも発現誘導の早さに大きな差が無いことがわ力つた。 また、両足に腫瘍細胞を移植し、右足だけの血流を悪くすると、縛った方だけィメー ジの増強がみられた。
[図 7]虚血処理後再酸素化のルシフェラーゼ発光の推移 次に再酸素化によるレポ 一ターの発現変化を比較する目的で、図 6と同様に結紮により血流を悪くして低酸素 状態を作った腫瘍の結紮を解き、血流を回復した後のレポーターの発現変化を比較 した。
[0026] 左下腿に HeLa/EF-Luc (internal control),右下腿に HeLa/5HRE- Luc (右上段）ま たは HeLa/5HRE-ODD- Luc (右下段）の細胞を移植した。右下腿を 18時間にわたつ て結紮した後ルシフェリンを iv投与した。麻酔後に結紮を解き、その 0、 5、 15、 25、 35 分後にルシフ ラーゼ発光量を測定した。
[0027] 各測定時間における左下腿のルシフェラーゼの発光量に対する右下腿の発光量 の比を算出し、さらに 0分の値に対する各測定時間の値の比を算出して Relative Luci ferase Activityとした。その結果、培養細胞を用いた実験（図 4)と同様に、 ODD力 S無 い場合は、再酸素化されてもイメージは変わらないが、 in vivoでも 5HREに ODDを組 み合わせた時の方が、レポーターの減少が速やかで、よりリアルタイムに環境の変化 を捕らえることができることがわ力 た。
[図 8]トランスジエニックマウス 図 7では、 5HRE- mp- NLS- ODD- Luciferaseを安定に 組み込んだ細胞を用いて実験を行ったが、上記遺伝子構築物を全身の細胞に安定 に組み込んだトランスジエニックマウスでも、同様な現象が観察されるか否かを調べる 目的で、トランスジエニックマウスを用いた実験を行った。
[0028] トランスジエニックマウスの右下腿を 16時間に渡って結紮した。ルシフェリン投与後 1 1分経過した時点からイソフルランガスにて麻酔し、 13分の時点で撮像した (-2 min)。 ルシフェリン投与後 15分で結紮を解き、右下腿を再酸素化 (reoxygenation)した。再 酸素化した時点を基準 (0 min)として、以降 2、 5、 8、 10、 12、 15分で撮像した。その後 直ちにルシフェリンを追加投与し、さらに 17、 20、 23、 26、 30分の時点で撮像した。そ の結果、縛った足でのみルシフェリンの発光が観察され、発光は結紮を解除後、経 時的に速やかに消失し、その後のルシフェリンの再投与でも発光は観察されなかつ た。トランスジエニックで低酸素状態がモニターできた事を示して 、る。
[図 9]トランスジエニックマウスによる病態イメージングの好ましい実施形態の 1つを示 す。
[図 10]細胞内に導入されたタンパク質量と ODDドメインを介した酸素濃度依存的タ ンパク質分解効率の関連を調べる目的で、 NLS- ODD - β -galactosidaseタンパク質
3-0
に細胞膜を通過して細胞内に自由に蛋白を入れることが出来る膜透過ドメイン (PTD) を融合させたタンパク質を濃度を変えて細胞培養液に表示して 、るユニット数に相当 する /3 -galactosidase活性をもつタンパク質を培地に添加して、有酸素状態（20%)と 低酸素状態（1 %)で 24時間培養した。その後、細胞をホルマリン固定し、 PBSで 3回 洗い、 j8 -galactosidaseの基質を含んだ溶液に細胞を反応させることで、 j8 - galactosi daseタンパク質の活性（つまり 13 -galactosidaseタンパク質の細胞内残存量）を有酸素 と低酸素状態で比較した。 1.25 unit/mlまでのタンパク質を添加した時は、明らかに 低酸素状態の細胞でのみ安定ィ匕したタンパク質が確認できるが、それ以上濃度があ がると有酸素状態でもタンパク質の安定ィ匕がみられ、ある一定量以上のタンパク質が 細胞内に存在すると ODDを介した分解機構の限界を超えて、もはやタンパク質を分 解することが出来ないことを示している。このことは、恒常的なプロモータ一- NLS-OD D-レポーターという遺伝子構築物を使っても、レポーター遺伝子が沢山発現する組 織ではレポーターが残存して低酸素に起因する病態イメージングを正確に行えない ことを示唆している。
[図 11]A :図に示した数の HeLa/EF- Luc細胞を含む細胞懸濁液 100 μ 1と、 50 μ 1のル シフェリン溶液 (0.1mg/ml)とを各ゥエルにて混合した。その後直ちに IVIS-200システ ム（Xenogen)に化学発光をイメージングした。その結果、 103個オーダーのルシフェラ ーゼ発現細胞を可視化できることが明らかになった。 B： (A)の実験結果を元に、各ゥ エルの化学発光量を Igor Pro 4.09A (Xenogen)を用いて定量した。その結果、 7.8 X 1 02個の細胞から生じる化学発光量力 ¾.9 X 102個の細胞からの化学発光量と比較して 有意に大きいことが明らかになった（p〈0.05)。この結果は IVIS-200システムによって 1 02個オーダーの細胞が生じるルシフェラーゼの発光を検出できることを示して 、る。 （ 平均士 SD； n=2) C :ヌードマウス背部皮下に 1.0 X 105個（左）、 1.0 X 104個（右）の HeL a/EF-Luc細胞を移植し、翌日に IVIS-200システムを用いて化学発光を検出した。 In vivoにおいて、少なくとも 1.0 X 104個のルシフェラーゼ発光細胞を検出できることが明 らかになつた。
[図 12]ヒト子宮頸癌由来細胞株 HeLaの total RNAを铸型とし AMV reverse transcripta se XLを用いて逆転写反応を行うことによってヒト HIF-1 a遺伝子の cDNAを獲得した 。この cDNAを铸型とし、表 1に示すプライマーを ODD- Bg F3と A588- Nco- anti、 OD D— Bg卜 F3と A593— Nco— antiゝ ODD— Bgト F3と T598— Nco— antiゝ Q553— Bgト senseと A588 - Nco- anti、 L557- Bg卜 senseと A588- Nco- antiの組み合わせで PCRを行 ヽ、これらの D NA断片を Bglll及び Ncolで消化することによって 5 '末端および 3 '末端をそれぞれ Bgl II及び Ncol消化末端にし、 pGL3/3-0を Bglll及び Ncol処理して調製したプラスミドべク ターに組込んだ。本遺伝子組み換えによって、 ODD領域の各種欠失 DNA断片（HIF -1 aのアミノ酸番号で 548- 588、 548-593、 548-598、 553-588、 557-588)と、 NLS、及 びルシフェラーゼが融合した遺伝子を発現するプラスミド (それぞれ PGL3/548-588、 PGL3/548- 593、 pGL3/548- 598、 pGL3/553- 588、 pGL3/557- 588)を構築した。これ らのプラスミドを用いて、図 1と同じアツセィ法でルシフェラーゼ活性を測定した。使用 したプラスミド DNAは、 pGL3プロモーターベクター、 pGL3/3- 0、 pGL3/3- 4、 pGL3/54 8-588、 pGL3/548-593、 pGL3/548-598、 pGL3/553-588、 pGL3/557-588であり、図 中ではそれぞれ pGL3、 548-603 (3-0)、 548-583 (3-4)、 548-588、 548-593、 548-598 、 553-588、 557-588と表記した。結果として、 ODDをルシフェラーゼと融合させた本 図中の全ての融合タンパク質は酸素濃度依存的な安定性制御を受けることが明らか になった。中でも、 ODD553-588の領域をルシフェラーゼと融合させることによって、 0 DD3-0(548-603)を融合させた場合と同等の強い酸素濃度依存性を獲得出来ること が明らかになった。
発明を実施するための最良の形態
本発明の特徴は、低酸素或いは病態組織を非常に初期の段階でイメージングするこ とができ、病態の解明或いは病気の治療薬を非常に効率的にスクリーニングできる にある。
[0030] 例えば図 5は、僅か 1 X 106個のガン細胞をヌードマウスに移植後 1日で癌をィメー ジングすることができ、 3日後の腫瘍の観察が不可能な段階において非常に鮮明な イメージングを行えることを示している。同様に図 11は僅か 1 X 104個のガン細胞を 検出することが出来ることを示している。
また、本発明の遺伝子構築物を使用すると、病態の重症度 (例えば酸素濃度、ガン 細胞の数）に応じて適切なイメージングが行われる（図 6〜8)。
[0031] さらに、病態モデル動物と交配させた本発明のトランスジエニックマウスは、当該病 態のイメージングを行うことができ、発症時期の特定、発症部位の特定、病変部位の 経時的観察、治療方法の開発、治療効果の経時的観察などに威力を発揮する。
[0032] 本発明の図 9に示されるように、本発明のトランスジ ニックマウスを他の病態マウス
(例えば癌発症改変マウスあるいは虚血性疾患発症マウス）と交配させる力、虚血性 処置もしくは発ガン刺激を行うことにより、病態のイメージングを行うことができる。
[0033] 本明細書及び特許請求の範囲にお!、て、特に断らない限り、 ODDドメイン (oxygen dependent degradation domain入 HIF- 1結合トメイン (HRE: hypoxia responsive eleme nt)、ミニマムプロモーター (mp)、核局在シグナル (NLS)は、各々これらをコードするポ リヌクレオチドの意味で使用される。
[0034] 本明細書及び特許請求の範囲において、「病態」とは、疾患の状態だけでなぐそ れに至る初期の不都合な状態を広く含む。例えば癌の病態としては、本発明によりィ メージングが可能なガン細胞が数十個程度の集団で存在する場合を包含し、狭心症 、心筋梗塞、脳梗塞、虚血再灌流障害などの虚血性の「病態」では、血管が詰まった 状態のみならず、動脈硬化あるいは血管内皮細胞の肥厚などにより全身的或いは局 所的に血流が低下した状態も広く「病態」に含まれる。
[0035] 本発明にお 、て、レポーター遺伝子としては、 j8—ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフ エラーゼ遺伝子 (青色、赤色、橙色、緑色など）、（グリーン、イェロー、シアン、レッド、 ブルー）蛍光タンパク質遺伝子 (GFP,YFP,CFP, BFP, DsRed, DsRed2)、アルカリホス ファターゼ遺伝子、西洋ヮサビペルォキシダーゼ遺伝子、またはクロラムフエニコー ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられ、ルシフェラーゼが感度の点で 特に好ましい。ルシフェラーゼは、橙色或いは赤色のような波長の長い発光を有する ルシフェラーゼ力 深部の発光を確認しやすいので好ましい。ルシフェラーゼの由来 としては、例えばホタル、ヒカリコメツキなどの発光昆虫、発光ミミズ、ラチア、ヒォドシ ェビ、イリォモテホタル、ゥミボタル、ゥミシィタケ、鉄道虫、渦鞭毛藻、ォワンクラゲ (ェ クオリン)などの発光生物が挙げられる。
[0036] 低酸素応答性プロモーターとは、低酸素時に発現が誘導されるエレメント（ェンハン サー）と RNAポリメラーゼが結合して転写を促進するエレメントの両方を含むものであ る。
[0037] 低酸素時に転写活性を誘導するエレメントとしては、特に限定されないが、例えば H IF1応答性エレメント（ェンノヽンサ一）が挙げられる。具体的には、 HIF1結合ドメインを 有する HRE (hypoxia responsive element )が好ましく例示される。 HREはタンデムに 複数の HREを連結して使用するのが好ま U、。タンデムに連結される HREの数として は、例えば 2〜5個が挙げられる。
[0038] 例えば、 HREを 5個タンデムに連結したエレメント (5HRE)において低酸素誘導する と、 2時間以降 (特に 4時間以降）に発現が急速に増加することが図 2に示されている
[0039] RNAポリメラーゼが結合して転写を促進するエレメントとしては、公知のエレメントが 広く使用され、例えば CMVmp (サイトメガロウィルス最小プロモーター）が例示される
[0040] ODDドメイン (oxygen dependent degradation domain)としては、配列番号 1のヒト HI F- l aのアミノ酸配列の 401〜603番目の領域をコードするポリヌクレオチドを含む ことができる。 ODDドメインの必須の部分を解明するために、種々の長さの ODDドメイ ンについてルシフェラーゼ活性を測定した結果を図 1及び図 12に示す。
[0041] 但し、 ODDドメインにおいて：
(0 557〜574番目の領域をコードするポリヌクレオチドが特に望ましぐ
(ii) 553〜556番目及び 575〜588番目の領域をコードするポリヌクレオチドは含ま れるのがより好ましぐ (iii) 548〜552番目及び 589〜603番目の領域をコードするポリヌクレオチドは含ま れていてもよぐ
(iv) 401〜547番目の領域をコードするポリヌクレオチドは含まれていてもよいが、含 まれない方が望ましい。
[0042] また、配列番号 1のヒト HIF- 1 aに由来する ODDドメインの他、ヒト HIF- 2 aや HIF- 3 α等またマウスやラット等、ヒト以外の生物の HIF-1 αのホモログに由来する ODDドメ インを利用することも出来る。また、有酸素条件下において積極的に分解され、逆に 低酸素条件下において安定ィ匕する制御を受けるポリペプチドであれば、 HIF-1 aに 由来する ODDの代わりに利用することができる。
[0043] 本発明において、 ODDドメインと低酸素誘導性プロモーターを組み合わせることは 非常に重要である。
[0044] 図 3に示されるように、単に低酸素誘導性プロモーター（例えば 5 X HREとサイトメガ ロウイスルミ-マムプロモーター（CMPmp)を糸且み合わせたプロモーター）だけである と、有酸素時にもわずかながら遺伝子発現があるため、低酸素時の発現量を有酸素 時の発現量で割った誘導比は 300倍程度となる。一方、これに ODDドメイン (好ましく はさらに NLS)をさらに組み合わせることで、発現したレポータータンパク質が数分以 内に速やかに分解されるため、有酸素時にはレポーター遺伝子がほとんど発現され ない (バックグラウンドと同レベル)遺伝子構築物を得ることができる。そのため、約 12 00倍近い誘導比を得ることができる。これにより、低酸素部位に対する特異性を高め ることが出来、低酸素に起因する病態部位を明確に（例えばイメージングにより）モ- ターすることがでさる。
[0045] ODDドメインのポリペプチドをもたないレポータータンパク質力 有酸素条件でも安 定に存在し続けるのに対し、 ODDドメインのポリペプチド（好ましくはさらに NLSのポリ ペプチド)をさらに組み合わたレポータータンパク質は、有酸素状態に移された後数 分以内に速やかに分解される。この現象は、細胞レベル（図 4)でも個体レベル（図 7) でち観察される。
[0046] 図 3によると、 ODDがない場合、低酸素時の発現量を有酸素時の発現量で割った 誘導比は 1200倍から 300倍程度にまで減少し、病態部位のイメージングの鮮明さが 大きく低下する。特許文献 1と 2は、レポーター遺伝子産物と低酸素誘導性プロモー タ（HRE)の組み合わせを開示する。低酸素状態を確認する場合、 HREとレポーター 遺伝子を組み合わせて低酸素時の発現量をできるだけ高くすることが従来行われて きた。ここに ODDを組み合わせると、レポーター遺伝子が一部分解して発現量が低 下するが、誘導比が大きくなるため、結果として鮮明な病態部位のイメージングが可 能になることを本発明者は見出した。低酸素時において、レポーター遺伝子の発現 量を増加させるエレメントである低酸素誘導性プロモータ（例えば HRE)とレポーター 遺伝子の発現量を低下させる ODDを組み合わせて、病態部位のイメージング効率を 向上させ得ることは、本発明で初めて明らかにされた。
[0047] 本発明の遺伝子構築物は核局在シグナル (NLS)をさらに含むのが好ま 、。
NLSは、細胞内に核膜構造を持つ真核細胞でタンパク質が核に局在するために必 要なアミノ酸配列を指し、タンパク質を核に局在させる活性を有する限り特に限定さ れないが、例えば、 SV40 large- T antigenに由来する NLS (large- T antigenの 126〜 13 2番目のアミノ酸の領域をコードするポリヌクレオチド； Pro Natl.Acad.Sci.(1989)86:93 27-9331)、 HIF- 1 aの NLSなどを好ましく例示できる。
[0048] 本発明の遺伝子構築物は、好ましくは以下の構造を有する：
(HIF-1結合ドメイン) - (mp)-(NLS)- (ODDドメイン)- (レポーター遺伝子）
なお、 HIF- 1結合ドメイン、 mp、 NLS、 ODDドメイン、レポーター遺伝子の各々のポリ ヌクレオチド間は直接結合されても良ぐ適当なヌクレオチド配列を介して連結されて も良い。
[0049] 本発明の遺伝子構築物は哺乳類細胞に導入されて、形質転換細胞を得ることがで きる。動物細胞、特に哺乳類細胞への本発明の遺伝子構築物の導入は、例えばリン 酸カルシウム法（Chen and Okayama法： Mol Cell Biol. 1987 Aug;7(8):2745- 52.)など により行うことができる。
[0050] 本発明の遺伝子構築物が導入される宿主としては、哺乳動物 (ヒト、サル、ィヌ、ゥ シ、ゥマ、ヒッジ、ブタ、ゥサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、昆虫、鳥 類 (ニヮトリなど）、爬虫類 (例えば力エルなど）、魚類などの動物細胞、酵母などの真 核細胞が例示され、哺乳動物細胞が好まし 、。 [0051] 本発明の形質転換体は、細胞内の低酸素状態をイメージングすることができ、低酸 素に対する保護効果を有する薬物候補化合物のスクリーニングに有用である。
なお、本明細書において、「候補ィ匕合物」としては、低分子化合物の他に、タンパク 質、ヌクレオチド (オリゴマー及びポリマー）、ペプチド (オリゴマー及びポリマー）、糖 類 (単糖、二糖、多糖など)、糖脂質、糖蛋白などの天然或いは合成の物質 (モノマ 一、オリゴマー及びポリマーを広く含む）を広く包含する。
[0052] トランスジエニック非ヒト哺乳動物は、トランスジエニック動物の製造において通常使 用されるような常法 (例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル ·アイ《シ一発行、 第 7章、第 361〜第 408頁、 1990年を参照）に従って作製することができる。例えば トランスジェニックマウスの場合には、マウス胚性幹細胞 (ES細胞）を、本発明の遺伝 子構築物を含む発現ベクターで形質転換する。該形質転換 ES細胞を別のマウスか ら取得した受精卵 (肺盤胞）にマイクロインジェクションしてフアウンダーマウスを得、こ れを他のマウス（例えば BALB/cが挙げられるがこれに限定されない）と 2回戻し交配 させ、本発明のトランスジヱニックマウス（ヘテロ型、すなわち一方のみの染色体に本 発明の遺伝子構築物を有するマウス）を得ることができる。このへテロ型のトランスジ エニックマウス同士をさらに交配させれば、ホモトランスジェニックマウスを得ることもで きる。
[0053] なお、（5 X HRE )- (CMVmp)- (NLS)- ( 548〜603番目の ODDドメイン)- (ホタルルシフ エラーゼ遺伝子)の遺伝子構築物を組み込んだトランスジエニックマウスは、 2005年 3 月 8日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに「受託番 号 FERM P-20451」で国内寄託され、その後、 2006年 2月 22日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに「受領番号 FERM ABP-10537」で国 際寄託された。
[0054] トランスジヱニックマウスを作製する過程で使用した他のマウスとして正常マウスを用 V、れば、低酸素部位及び機能障害を有する部位がリアルタイムに検出可能なトラン スジエニックマウスを得ることができる。
[0055] また、トランスジエニックマウスを作製する過程で使用した他のマウス、或いはへテロ もしくはホモトランスジエニックマウスと病態モデルマウスや遺伝子改変マウス（他のト ランスジェニックマウス、ノックアウトマウス;例えば虚血性脳血管障害、虚血性心疾患 、虚血性動脈硬化症、固形がんなどの病態を自然発症するマウス)を交配させること で、該病態をリアルタイムに観察可能なマウスを得ることができる。
[0056] 上記では、トランスジエニックマウスの作製法を例示した力 マウス以外の他の非ヒト 哺乳動物においてもマウスと同様にして本発明の非ヒト哺乳動物を得ることができる。
[0057] 本発明のレポーター遺伝子としてルシフェラーゼを使用した場合、非ヒト哺乳動物 にルシフェリンを投与することで、低酸素或 、は病態の部位における発光を確認する ことができる。ルシフェリンは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下などの注射により好適 に投与することができ、ドラッグデリバリーシステムによりルシフェリンを持続的に放出 させることちでさる。
[0058] ルシフェリンールシフェラーゼ系の発光は、ルシフェリンールシフェラーゼ系の特有 の波長を検出できるようなボックスに、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子 を有する本発明の非ヒト哺乳動物を収容し、発光を観察することで、低酸素ないし病 態部位を確認することができる。 GFP, YFP, CFP, BFP, DsRed, DsRed2などの蛍光 蛋白質もルシフェラーゼと同様にして確認できる。
[0059] このようなボックスとしては、具体的には、 IVIS-100, IVIS- 200システム（Xenogen Co.
)、フォトイメージヤー (BIOSPACE社)などを使用できる。
[0060] アルカリホスファターゼの場合は、基質のリン酸ィ匕による蛍光波長の変化、西洋ヮサ ビペルォキシダーゼの場合はルミノール反応による蛍光、その他の酵素（j8—ガラク トシダーゼまたはクロラムフエ-コールァセチルトランスフェラーゼ）は基質となるタン パク質に発光標識をつけて、各々の酵素反応を受ける (たとえば基質が切断される 等の変化を受ける）と蛍光波長が変化する様に修飾する事により酵素反応を発光と いう現象でイメージングすることが可能になる。
[0061] レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼカ イメージングの感度の点で特に好ま しい。
[0062] 本発明のスクリーニング方法は、本発明の形質転換細胞 (形質転換体)或 ヽはトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に種々の化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現の 変化を観察することで実施することができる。 例えば病態を有するトランスジ ニック非ヒト哺乳動物に化合物、特に薬物候補ィ匕合 物を投与し、その病態がどのように変化するのかを、好ましくはリアルタイムで観察す ることで、該化合物の効果を精密に調べることができる。
[0063] 投与される化合物は、タンパク質 (ホルモン、抗体、酵素、受容体などを広く含む)、 核酸 (DNA、 RNA)或 ゝはこれらと作用する物質や生理活性物質を広く含む (低分 子量及び高分子量の化合物を包含する)ものであり、毒物の効果を確認することも包 含される、
[0064] なお、レポーター遺伝子は、 1種のみを組み込んでも良ぐ 2種、 3種、 4種或いはそ れ以上の遺伝子を同時に組み込むこともできる。
実施例
[0065] 以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
(1) 組み換え DNA (5HRE- mp- NLS- ODD- Luciferase)の構築
本発明のトランスジエニックマウスが有する組み換え DNAを含む発現ベクターは、 次のような手順で構築された。 pCH/3-Οプラスミド（Harada et al. 2002. Cancer Res.) を铸型とし、 NLS— Nco— sense primer; 5，— AAC CAT GGC GCC TAA GAA GAA GA G GAA G— 3，、および ODD— Nco— anti primer; 5' -AAC CAT GGT CTG CTG GAA TAC TGT AAC TG- 3，を用いて NLS- ODDの DNA断片（NLS- ODD548- 603をコード する DNA断片）を PCR法で増幅した。これを Ncolで消化後、 5HRE-hCMVmp-Lucプ ラスミド（Shibata et al. 2000. Gene Ther.；以降 pGL3/5HRE- Luc)の Ncol部位に挿入 することによって、 5HREプロモーターの制御下で NLS- ODD- Luciferase融合タンパク 質を発現するプラスミド pGL3/5HREp-NLS- ODD- Luciferaseを構築した。このプラスミ ドおよび PGL3/5HRE- Lucプラスミドの Kpnl- Xbal断片を、 pEF/myc cyto (Invitrogen) の Kpnl- Xbal部位に挿入することによってそれぞれ pEF/5HREp- ODD- Luc、 pEF/5H RE-Lucを構築した。
[0066] 恒常的にルシフェラーゼタンパク質を発現するプラスミドベクターは、次のような手 順で構築された。 Luc- Bam- sense primer 5' -AAG GAT CCA CCA TGG AAG ACG CCA AA - 3，、および Luc- RV- anti primer 5，- TTG ATA TCT TAC ACG GCG AT C TTT CC— 3，を用い、 pGL3プロモーターベクターを铸型として PCRを行うことによつ て、ルシフェラーゼ遺伝子の cDNAを獲得した。これを BamHIおよび EcoRVで消化後 、 pEF6/Myc-His B (Invitrogen)プラスミドの BamHI- EcoRV部位に挿入し、恒常的に ルシフェラーゼを発現するプラスミド pEF/Lucを構築した。
(2)細胞培養
ヒト子宮頸癌由来 HeLa細胞を ATCCより入手し、ペニシリン 100 unit/ml,ストレプト マイシン 100 μ g/ml,及び 10% Fetal Bovin Serumを添カ卩した Dulbecco ' s Modified E agle Medium : D— MEMで培養した。
(3)レポーター遺伝子導入細胞の単離
リン酸カルシウム変法によって HeLa細胞に pEF/Luc、 pEF/5HRE- Lucおよび pEF/5 HRE-ODD- Lucを導入した。各プラスミドがゲノム DNAに安定に組み込まれた細胞株 を獲得する目的で、遺伝子導入翌日から 10日間に渡って 400 mg/mlの G418を含む 選択培地で培養し、形成したコロニーを単離した。 pEF/Lucを導入して単離したクロ ーンのうち恒常的にルシフェラーゼを発現するクローン（HeLa/EF-Luc)を実験で使 用した。一方、 HeLa細胞に PEF/5HRE- Lucまたは PEF/5HRE-ODD- Lucを導入して 得たそれぞれのクローンのうち、低酸素処理によるルシフェラーゼの誘導能が高いク ローン（HeLa/5HRE- Luc、および HeLa/5HRE- ODD- Luc)を実験で使用した。
(4)ルシフェラーゼ活性の測定
5HREを含む HIF-1依存性プロモーターの低酸素応答性を確認するために以下の ような実験を行った。 24穴培養ディッシュに HeLa/5HRE- Luc細胞を播種し（1 X 10* ce lls/well) 16時間培養した。その後有酸素条件 (20%O )または低酸素条件（1%0以下
2 2
)で 0, 1 , 2, 4, 8および 16時間培養した。その後、細胞を Phosphate Buffered Saline ( PBS)で洗净後、 100 1 Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, Wisconsin)で溶解 し、 10 μ 1のノレシフェラーゼ活'性を luciferase assay kit (Promega)で測定し、 net count を図 2のグラフに示した。各々の細胞内で発現している HIF-1 aの蛋白を western bl ot法で確認した（図 2の下)。具体的には、上述した方法で調整した細胞を低酸素条 件で培養し、 0, 1 , 2, 4, 8および 16時間後、細胞を低酸素チャンバ一内で直接 100 1の 1 X loading bufferに溶解し、そのうち 20 μ 1を 7.5% SDS-polyacrylamide gel を用いて電気泳動法で展開し、 PVDF膜（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)に 転写し、膜上の HIF- laタンパク質を monoclonal anti- HIF- la antibody (BD Bioscie nce Pharmingen, San Diego, CA)と anti mouse IgG horseradish peroxidase linked wh ole antibody (Amersham Bioscience)を用いて標識し、 ECL— PLUS system (Amersham Bioscience)を用いて標識タンパク質を確認した。結果は、図 2に示した。
[0067] レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼのみの時と、 NLS-ODDを融合させたホタ ルルシフェラーゼの低酸素応答性を比較する目的で以下の実験を行った。 24穴培 養ディッシュに HeLa細胞をまき（10000 cells/well)、 16時間培養した後に pGL3、 pGL 3/5HRE- Lucゝまたは pGL3/5HREp- NLS- ODD- Luciferase (0.4 g/well)を Polyfect Transfection Reagent (QIAGEN)にて導入した。この時ゥミシィタケルシフェラーゼを 恒常的に発現するプラスミド pRL/CMV (Promega)もインターナルコントロールとして同 時に導入した（0.04 /z g/well)。遺伝子導入力も 24時間後に培地を交換し、その後さら に 18時間にわたって有酸素、または低酸素条件化 (酸素濃度く 0.02%)にて培養した。 培地を吸引後、 100 mlの Passive Lysis Buffer (Promega)にて細胞抽出液を収集し、 付属の説明書に従ってデュアルルシフェラーゼアツセィを行った。結果は、図 3に示 した。
[0068] プロメガのデュアルアツセィシステムは、図 1, 3の実験のみ使用した。これは、各々 の構築物をコードする遺伝子を一時的に発現させるために、遺伝子の導入効率によ る差を補正するためにゥミシィタケルシフェラーゼをコードする遺伝子を一定量同時 に導入し、両方のルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼとゥミシィタケルシフェラーゼ )活性を測定して、その比で活性を評価するためである。
[0069] その他の実験では、単にホタルルシフェラーゼ (Firefly Luciferase)の発現量を活性 で測定して評価した。
[0070] 図 3上段:有酸素条件化、および低酸素条件化における「ゥミシィタケルシフェラー ゼの活性に対するホタルルシフェラーゼの活性の比」を求めた。さらに有酸素条件化 における算出値に対する低酸素条件化における算出値の比を求め、これを低酸素 a§¾H¾ (Induction Ratio: Hypo/Aero)とし 7こ。
[0071] 図 3下段:有酸素条件化におけるホタルルシフェラーゼの活性を有酸素でのバック グラウンド（Net Count under Aero)とした。 [0072] pGL3/5HRE- Lucまたは pGL3/5HREp- NLS- ODD- Luciferaseを安定に保有するヒト がん細胞株 HeLa/5HRE- Luc、および HeLa/5HRE- ODD- Luc細胞を用いて、レポ一 ター遺伝子であるホタルルシフ ラーゼの活性が酸素濃度の変化 (低酸素力 有酸 素になる）に応じてどう変化するかを調べた。
[0073] 24穴培養ディッシュに HeLa/5HRE- Luc、および HeLa/5HRE- ODD- Luc細胞を播 種（1 X 104 cells/well)し 16時間培養した後、 18時間にわたって低酸素処理を行った。 細胞を低酸素チャンバ一力 取り出した直後にシクロへキサミド含有培地に培地交 換し、 0、 10、 30、 60分間にわたって 5% C02インキュベーターで培養をすることによつ て再酸素処理をした。その後培地を吸引し、 Passive Lysis Buffer (Promega Co.)を 10 0 1/well添加して- 80 °Cにて凍結した後、融解することによって細胞抽出液を収集 した。 20 1の細胞抽出液を用いホタルルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアツセ ィキット (Promega)で調べた。 0分におけるルシフェラーゼ活性に対する、各測定時間 におけるルシフェラーゼ活性の比を算出し、 Relative Luciferase Activityとした。
[0074] 結果を図 4に示す。
(5)腫瘍モデルの作成
細胞をトリプシン処理後、冷 PBSで洗浄し、 PBSにより（1 X 106 cells/ 100 μ 1)の濃度 に懸濁した。この細胞懸濁液を 6週齢、雌の BALB/c nu/nuマウスの下腿皮下に移植 した。
[0075] 得られたモデルマウスのイメージングの結果を図 5に示す。
(0ノ in vivo imaging
HeLa/EF- Lucを左下腿部、 HeLa/5HRE- Lucまたは HeLa/5HRE- ODD- Lucを右下 腿部に皮下移植した。移植 10日後に右下腿を結紮し、その直後にイソフルランガスを 充填した麻酔装置 (Xenogen Co)にマウスを入れた。麻酔から 0、 2、 4、 8時間後にル シフェリンを 50 mg/kg ivにて投与し IVIS-100システム（Xenogen Co.)を用いてルシフ エラーゼによる化学発光を検出した。得られた画像を IGOR Pro,V4.0.6.1(Wavemetric s, LakeOswego,OR)を用いて解析した。
[0076] 結果を図 6に示す。
[0077] 右下腿部を結紮してから 18時間後にルシフェリンを 50 mg/kg ivにて投与した。投与 力 12分経過した時点でイソフルランガスを充填した麻酔装置 (Xenogen Co)にマウ スを入れた。その 3分後に結紮を解き、以後 0、 5、 15、 25、 35分の時点で化学発光を 検出した。
[0078] 結果を図 7に示す。
[0079] 5HRE- mp- NLS- ODD- Luciferaseのトランスジエニックマウスを用いた in vivo imaging に関しては以下の様に実施した。
[0080] まずトランスジエニックマウスの右下腿を 16時間に渡って結紮した。ルシフェリン投 与後 11分経過した時点からイソフルランガスにて麻酔し、 13分の時点で撮像した。ル シフェリン投与後 15分で結紮を解き、右下腿を再酸素化 (reoxygenation)した。再酸 素化した時点を基準（0 min)として、以降 2、 5、 8、 10、 12、 15分で撮像した。レポータ 一タンパク質の発光は経時的に小さくなり消失した。その後これまでに観察されたィメ ージが出血等による擬陽性のイメージで無いことを確認するために、直ちにルシフエ リンを追加投与し、さらに 17、 20、 23、 26、 30分の時点で撮像した。一度再酸素化され て消えてしまったレポータータンパク質は再度確認することができな力つた。
[0081] 結果を図 8に示す。
(7)遺伝子操作動物作製
遺伝子改変動物作製には、雌 B6C3F1 X雄 B6C3F1の自然交配によって得られた 受精卵 B6C3F2を使用した。当該遺伝子断片（pGL3/5HREp- NLS- ODD- Luciferase の Xhol- Sail断片、約 1.7 kbp； 5HRE-CMVmp- NLS- ODD(548- 603)- (Firefly Luciferas e gene))を電気泳動後に 0.6%ァガロースゲルでから回収'精製後にトリス 10mM、 ED TA0.1mM (T E )溶液に 500copy/pl濃度で溶解した。マウス前核期受精卵 1個当た
10 0.1
り 1000コピー相当量をマイクロインジェクション法（参考図書 Methods in Enzymolizy Vol. 225 Guode to Techniques in Mouse Development)で注入し、生存の確認でき た受精卵を偽妊娠 0.5dpcの ICR系統仮腹親の卵管に移植後 19日に、帝王切開で産 仔 (フアウンダートランスジエニック）を得た。得られた産仔の PCR遺伝子解析の結果、 当該遺伝子が陽性であった。該遺伝子陽性の個体を基にライン化して、本発明のト ランスジェニックマウスを榭立した。
[0082] フアウンダートランスジエニック（B6C3F2)に BALB/cを掛け合わせ得られたトランス ジーンがヘテロの交雑種 Nl雄個体とワイルド（C57BL/6J)の雌を用いて体外受精に より受精卵を作製した。得られた受精卵の融解'移植後に得られる個体は、トランスジ ーン (導入遺伝子)保有と非保有が 1： 1になる。得られたトランスジエニックマウス (HO L-A)の受精卵は、 2005年 3月 8日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許 生物寄託センターに「受託番号 FERM P-20451」で国内寄託され、その後、 2006年 2月 22日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに「受領 番号 FERM ABP-10537Jで国際寄託された。
[0083] 参考文献
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[0084] [表 1]
プライマー名 配列
ODD-Bgl-F0 5'- AAAGAT CTG CCC CAG CCG CTG GAG -3'
ODD-Bgl-Fl 5'- AAA GAT CTT TGG CAA TGT CTC CAT -3'
ODD Bgl-F2 5'- AAA GAT CTC CTA GTC CTT CCGATG -3'
ODD-Bgl-F3 5'- AAA GAT CTAACC CAT TTT CTA CTC -3'
ODD-Bgl-F4 5'- AAA GAT CTC AGT TGT CAC CAT TA -3'
ODD Nco-RO 5'- AAC CAT GGT CTG GAATAC TGTAAC -3'
ODD-Nco-Rl 5'- AAC CAT GGT ATT TAT ATT CTG TAA -3'
ODD-Nco-R2 5'. AAC CAT GGT TGT CTGATC CTGAAT C -3'
ODD-Nco-R3 5'- AAC CAT GGT CTT TGC TTC TGT GTC -3'
ODD-Nco R4 5'- AAC CAT GGT TAA TGG TGA CAA CTG -3'
A588-Nco-anti 5'- AAC CAT GGT TGC GGAACT GCT TTC TAA - 3'
A593-Nco-anti 5'- AAC CAT GGT TGC GCT TTC AGG GCT TGC ■3，
T598-Nco-anti 5'- AAC CAT GGT TGT GCT TTG AGG ACT TGC ■3'
Q553-Bgl-sense 5'- AAA GAT CTC AGG ACA CAG ATT TAG AC -3'
L557-Bgl-sense 5'- AAA GAT CTT TAG ACT TGG AGA TGT TAG -3， P06-22 23
PCT
Figure imgf000025_0001
1 下記の表示は発明の詳細な説明中に記載
された微生物又は生物材料に関連している
1-1 段落番号 0053, 0082
1-3 寄托の表示
1-3-1 寄託機関の名称 I P0D (独)産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 （閥）
1-3-2 寄託機関のあて名 日本国 〒305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6
1-3-3 寄託の日付 2005年 03月 08日 (08. 03. 2005)
1-3-4 受託番号 I P0D FERM ABP-10537
1-5 この表示を行うための指定国 すべての指定国 受理官庁記入欄
0-4 この用紙は国際出願とともに受理した
(はい/いいえ)
0-4-1 権限のある職員 国際事務局記入欄
0-5 この用紙が国際事務局に受理された日
0-5-1 権限のある職員
差替え周紙 （規則 26)

Claims

請求の範囲
[I] レポーター遺伝子を低酸素応答性プロモーターの制御下に組み込んでなり、かつ o
DDトメイン (oxygen dependent degradation domain,をレ 一ター遺 1 子とインフレ一 ムで連結してなる遺伝子構築物。
[2] 低酸素応答性プロモーターが、 HIF-1結合ドメイン (HRE: hypoxia responsive element
)を有する請求項 1に記載の遺伝子構築物。
[3] 低酸素応答性プロモーターが、ミニマムプロモータ一 (mp)を有する請求項 1に記載の 遺伝子構築物。
[4] レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項 1〜3のいずれかに記載の 遺伝子構築物。
[5] 核局在シグナル (NLS)をさらに含む、請求項:!〜 4のいずれかに記載の遺伝子構築 物。
[6] (HIF- 1結合ドメイン） - (mp)― (NLS) - (ODDドメイン） - (レポ一ター遺伝子）の構 造を有する請求項 5に記載の遺伝子構築物。
[7] 請求項 1〜6のいずれかに記載の遺伝子構築物を宿主細胞に導入してなる形質転 換体。
[8] 請求項：!〜 6のいずれかに記載の遺伝子構築物を非ヒト哺乳動物に組み込んでなる トランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[9] 非ヒト哺乳動物がマウスである請求項 8に記載の非ヒト哺乳動物。
[10] 請求項 8または 9に記載のトランスジ ニック非ヒト哺乳動物と任意の病態の特徴を有 する他の非ヒト哺乳動物を交配させてなる、前記病態の特徴をリアルタイムで解析可 能なトランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[II] 病態をリアルタイムでモニターするための、請求項 8〜： 10のいずれかに記載の非ヒト 哺乳動物の使用。
[12] 請求項 1〜6のいずれかに記載の遺伝子構築物を利用して、レポーター遺伝子の発 現または活性に影響を及ぼす候補化合物または遺伝子を評価する、候補化合物ま たは遺伝子のスクリーニング方法。
[13] 請求項 8〜10のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物を利用して、病態に影響を及ぼす 候補化合物または遺伝子を評価または探索する方法。 差替え用紙（規則 26) 候補化合物または遺伝子を評価または探索する方法。
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