JPH08509863A

JPH08509863A - ヒトｃ／ｅｂｐ遺伝子およびその発現のためのベクター

Info

Publication number: JPH08509863A
Application number: JP6520208A
Authority: JP
Inventors: ダーリントン、グレッチェン・ジェイ; ウイルソン、デボラ; ウィルデ、マーガレット
Original assignee: ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン
Priority date: 1993-03-04
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 1996-10-22
Also published as: CA2157589A1; WO1994020113A1; AU6550094A; US5545563A; AU690905B2

Abstract

(57)【要約】ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合性タンパク（「Ｃ／ＥＢＰ」をコードするをコードする遺伝子配列、および該Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の発現を媒介することができる組み換えベクターが開示される。この遺伝子配列およびベクターは、癌およびその他の疾患を治療するための遺伝子治療法において使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称：ヒトＣ／ＥＢＰ遺伝子およびその発現のためのベクター発明の分野：この発明は、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合タンパク（“Ｃ／ＥＢＰ”）をコードする遺伝子配列、およびＣ／ＥＢＰ遺伝子の発現に介在し得る組換えベクターに関する。この発明は、さらに、ヒトもしくは動物に前記ベクターを投与することを包含する遺伝子治療方法にも関する。この発明は、合衆国政府基金（ＮＩＨ認可ＧＭ 31111-09）により支援された。合衆国政府は、この発明において一定の権利を有する。関連出願との相互参照：この出願は、米国特許出願第08／029,325（1993年5月4日出願）の一部継続出願である。発明の背景：Ｉ．エンハンサ配列およびエンハンサ結合タンパク高次真核生物の発生は、特定遺伝子の差別的、かつ組織特異的発現によって特徴付けられる。このような組織特異的発現を制御する因子の中に、それ自身組織特異的な様式で産生される、拡散性陽性転写因子［diffusible positive transc riptional factors］がある。これらの転写因子のあるものは、“エンハンサ配列”もしくは“エンハンサ”として知られる特定のＤＡＮ配列に結合することによって、遺伝子転写を増大させる（Descombes，P．et al.，Genes Devel．4:154 1-1551（1990）；また、Ptashne，M，Nature 335:683-689（1988）も参照）。このように、エンハンサ配列は、動物および動物ウイルスのＤＮＡ中に見出される転写制御配列である（Khoury，G．et al.，Cell 33:313-314（1983）；Scha ffner，W．et al.，Trends Genet．1:224-230（1985））。エンハンサは、それらがイン・キス［in cis］で作用して、同じＤＮＡ分子上に位置する遺伝子配列の転写を調節するという点においてプロモータと類似する。それらは、それらの機能が、転写が増強される遺伝子に対するエンヘンサの位置に依存しないという点でプロモータとは異なる。エンヘンサは、いずれかの方向の、（数千塩基対までの）かなりの距離にわたる転写に介在することができる。エンヘンサ配列に結合する転写因子は、“エンヘンサ結合タンパク”（“ＥＢＰ”）と呼ばれている。特定細胞の遺伝子発現に介在するエンヘンサの能力は、当該細胞における適切なＥＢＰの発現に依存する。このため、各々のエンヘンサは、それに結合し得るＥＢＰを発現する組織型においてのみ、優先的もしくは排他的に転写増強に介在することができる。ＣＣＡＡＴ／エンヘンサ結合タンパク（“Ｃ／ＥＢＰ”）は、そのメンバーが（トランスフェリンおよびＡｐｏＢ遺伝子に見出されるような）ＣＣＡＡＴ配列モチーフ、エンヘンサ各配列モチーフ、または幾つかのウイルスプロモーターのエンヘンサ領域を優先的に認識し、かつ結合することが可能であるＥＢＰのクラスを包含する（Landschultz，W.H．et al.，Genes Dev．2:7 86-800，（1989）；Brunel，F，et al.，J．Biol．Chem．263:10180-10185，（1 988）；Metzger，S．et al.，J，Biol．Chem．265:9978-9983（1990））。ヒトＣ／ＥＢＰの重要性は、ラットおよびネズミＣ／ＥＢＰ類似体を調べることによって明らかになっている。Ｃ／ＥＢＰのラット類似体は、最初、肝細胞から熱安定性タンパクとして単離される（Graves，B．et al.，Cell 44:565-576（ 1986）；Johnson，P.F．et al.，Genes Dev．1:133-146（1987））。続いて、Ｃ／ＥＢＰの高レベルの発現が、エネルギー代謝、特にグリコーゲンおよび脂肪の合成および代謝において中心的な役割を果たす、脂肪細胞［adipocyte］および肝細胞のような最終分化細胞型に限られることが見出された（Christy，R.J．et al.，Genes Dev．3:1323-1335（1989）、Friedman，A.D．et al.，Genes Dev． 3:1314-1322（1989）、McNight，S.L．et al.，Genes Dev．3:2021-2024（1989 ））。例えば、成体マウスでは、Ｃ／ＥＢＰは肝臓の実質細胞および脂肪組織において最も豊富に存在する。したがって、Ｃ／ＥＢＰが、脂質の合成および代謝がそれらの生理の重要な部分を占める組織において発現する遺伝子の転写を調節するのであろうことが提案されている（Birkenmeier，E．H．Genes Devel．3:11 46-1156（1989））。Ｃ／ＥＢＰのラットおよびマウス類似体をコードするｃＤＮＡはクローニングされ（Landschultz，Genes Devel．2:786-800（1988）；Xanthopoulos K.G．et al.，Proc．Natl．Ac ad．Sci.，（U.S.A.））、組織培養細胞中で発現している（Friedman，A.D．et al.，Genes Devel．3:1314-1322（1989））。２種のＣ／ＥＢＰ類似体の椎定タンパク構造は、実質的な相同を示す。Ｃ／ＥＢＰは、マウスゲノム中に単一のコピーとして存在し、介在配列は含まない（Birkenmeier，E．H，Genes Devel．3: 1146-1156（1989））。ラットＣ／ＥＢＰ類似体は42ｋＤであり、359アミノ酸からなる（Johnson，P. F．et al.，Genes Dev．1:133-146（1987），Landschultz，W.H．et al.，Genes Devel．2:786-800（1988））。ＤＮＡ結合ドメインは、カルボキシ末端80残基内に位置する（Friedman，A.D．et al.，Genes Devel．3:1314-1322（1989））。示されているように、Ｃ／ＥＢＰ類は、Landschultz，W.H．et al（Genes Dev el．2:786-800（1988））によって特徴付けられたＣ／ＥＢＰに加えて、“Ｄ− 結合タンパク”（ＤＢＰ）（Mueller C.R．et al.，Cell 61:279-291（1990））、および“肝富化転写アクチベータタンパク［liver-enriched transcriptional activator protein］”（“ＬＡＰ”）（Descombes，P．et al.，Genes Devei ．4:1541-1551（1990））を含む関連分子系統群を包含する。ＣＲＰ1、ＣＲＰ2 およびＣＲＰ3と呼ばれるＣ／ＥＢＰ群のさらなるメンバーは、Ｃ／ＥＢＰの結合ドメインをコードするＤＮＡでマウスおよびラットゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより単離された（Williams，S.C．et al.，Genes Devel.5 :1553-1567（1991））。Ｃ／ＥＢＰ群のメンバーの同定において大きな進歩がなされてはいるが、疾患の治療におけるこれらの分子、またはそれらをコードする遺伝子配列の使用は報告されていない。これらの分子の治療用途を同定し、そのような治療を要する細胞および組織に向けてＣ／ＥＢＰ分子を送り込む手段を開発することが望ましい。この発明は、そのような用途および送達（ターゲッティング）手段を提供する。発明の要約：この発明は、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合タンパク（“Ｃ／ＥＢＰ”）をコードする遺伝子配列を提供する。加えて、Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の発現に、特に腫瘍特異的プロモータの制御下において、介在することが可能な組換えベクターを提供する。この発明は、さらに、このベクターをヒトもしくは動物に投与することを包含する遺伝子治療方法、およびガンおよび他の疾患の治療におけるそれらの使用に関する。詳しく述べると、この発明は、実施的に天然の汚染がない、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合タンパク、特にＣ／ＥＢＰαをコードするＤＮＡ分子（特にベクター）を提供する。また、この発明は、哺乳動物細胞（特に肝細胞）中において発現し、および／または増殖することが可能なベクターを提供する。この発明はまた、Ｃ／ＥＢＰ αを発現することが可能なＣ／ＥＢＰαエンコーディングベクターに関する。また、この発明は、実質的に天然の汚染がない、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合タンパク、特にはＣ／ＥＢＰα、をコードするＤＮＡ分子に相補的な核酸分子、特には検出可能に標識された核酸分子に関する。加えて、この発明は、実質的に天然の汚染がない、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合タンパク、特にＣ／ＥＢＰαに関する。また、この発明は、Ｃ／ＥＢＰαを発現し得るベクターを細胞に供給し、ベクターにＣ／ＥＢＰαを発現させることを包含する、腫瘍細胞（特には肝臓腫瘍細胞）の増殖を阻害する方法を提供する。この発明はまた、Ｃ／ＥＢＰαのアンタゴニストを発現し得るベクターを細胞に供給し、ベクターにアンタゴニストを発現させることを包含する、肝細胞の増殖を誘発する方法を提供する。特には、Ｃ／ＥＢＰαアンチセンス転写物であるＣ／ＥＢＰαアンタゴニストに関する。また、この発明は、組織サンプルにおけるヘパトーマ細胞の存在を診断する方法であって：検出可能に標識されたＣ／ＥＢＰαアンチセンス分子の存在下、この分子がサンプル中に存在するＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な条件で、組織サンプルもしくはそれらの抽出物をインキュベートし；およびサンプル、もしくはそれらの抽出物のｍＲＮＡが前記分子と結合し得るかどうかを決定する、ことを包含する方法を提供する。この発明はまた、化学物質の発癌能力を決定する方法であつて：（Ａ）少なくともＣ／ＥＢＰα対立遺伝子をコードする染色体対立遺伝子に突然変異を各々含む細胞を有するトランスジェニックマウス、または該トランスジェニックマウスに由来する細胞系に、該化学物質を供給し；および（Ｂ）化学物質がマウスに対して肺瘍原性［tumorigenic］であるかどうか、あるいは細胞系の細胞に悪影響を及ぼすかどうかを決定する、ことを包含する方法を提供する。また、この発明は、細胞の過剰増殖［hyperproliferation］で特徴付けられる疾患の治療方法であって、細胞にＣ／ＥＢＰαを発現し得るベクターを供給し、ベクターにＣ／ＥＢＰαを発現させることを包含する方法を提供する。さらに、この発明は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の少なくとも１つの染色体対立遺伝子に突然変異を有するネズミ細胞を提供する。この発明はまた、マウス染色体Ｃ／ＥＢＰα対立遺伝子の少なくとも１つに突然変異を含む細胞を有するキメラマウスを包含する。さらに、この発明は、少なくともＣ／ＥＢＰαをコードする染色体対立遺伝子に突然変異を各々含む細胞を有するトランスジェニックマウスを提供する。図面の簡単な説明図１は、ヒトＣ／ＥＢＰα遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。図２は、Ｃ／ＥＢＰαタンパクのアミノ酸配列を提供する。図３は、Ｃ／ＥＢＰαプラスミドであるｐＣＭＶｈＣ／ＥＢＰαの模式図を提供する。図４は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の成長阻害ドメインのマッピングに用いられる発現ベクターの比較を提供する。図５Ａおよび５Ｂは、Ｃ／ＥＢＰα欠失変異体の成長阻害効果を示す。図５ＡはＨｅｐ3Ｂ2細胞を用いて得られた結果を示す；図５ＢはＳＡＯＳ-2細胞を用いて得られた結果を示す。図５Ａおよび５Ｂにおける各々のベクターについて、カテゴリー内のコロニーの数は、記録されたコロニーの総数の百分率として示されている。データは、３回の別々の実験の平均±標準偏差として提示されている。図６は、ヒトおよびラットＣ／ＥＢＰαの成長阻害能の比較を提供する。図７は、内在性Ｃ／ＥＢＰα対立遺伝子を各トランスジェニック動物の作製に用いられるターゲッティング戦略を記述する。好ましい態様の説明：Ｉ．Ｃ／ＥＢＰおよび急性期応答急性期応答は、脅迫的もしくは圧迫的状態（バクテリアおよびウイルス感染、炎症、創傷に関連付けられる精神的外傷（トラウマ）、火傷もしくは手術、異常増殖）の列に対する統合された応答を表わす。急性期応答は、（トラウマもしくは外傷部位での）局在化した応答に加えて、内分泌性、代謝系および神経学上の変化を含む全体的成分を有している。この全体的成分には、血清タンパク質（“急性期反応体”）の発現を誘発するステロイド類およびペプチドホルモン類（例えばサイトキン類）の増大した合成および分泌が含まれる（ Kushner，I．Ann．N.Y．Acad Sci．389:39-48（1982）；Koj，A.，In：“外傷および感染に対する急性期応答［The Acute-Phase Response to Injury and Infec tion］”，（Gordon，A.H．et al,，Eds.）Elsevier Science Publishers，Amst erdam（1985）；Fey，G,H．et al.，Mol．Biol．& Med．4:323-338（1987）；Fe y，G.H．et al.，In：“肝疾患における進歩［Progress in Liver Disease］” （Popper，H．et al.，Eds.）W.B．Saunders & Co.，Philadeiphia（1990）；Al am，T．et al.，J．Biol．Chem．267:5021-5024（1992））。複数の組織（脳、腎臓、胎盤等）が急性期反応体の合成に関わってはいるが、これらの反応体合成の主要な部位は肝臓である（Schreiber，G.，The Plasma Pr oteins 5:293-363（1987），Thomas，T．et al.，J．Biol．Chem．264:5784-579 0（1989））。急性期応答における肝臓の刺激には、サイトカイン類の放出、主としてインターロイキン-6が介在する。これらは、種々の腫瘍型の他に、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、肥満細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞によって産生される（Koj，A.，In：“外傷および感染に対する急性期応答”（Gordon，A.H， et al.，Eds.）Elsevier Science Publishers，Amsterdam（1985）；Fey，G.H． et al.，Mol．Biol．& Med，4:323-338（1987）；Darlington，G.J．et al.，J ．Cell ．Biol．103:787-793（1986））。最近の研究は、急性期反応体遺伝子の調節におけるサイトカインの役割が、トランス活性化因子、特にＣ／ＥＢＰβの活性を調節するそれらの能力に基づくことを明らかにしている。Ｃ／ＥＢＰの少なくとも４種の異なる類似形態［isofor m］（Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰγおよびＣ／ＥＢＰδ）が同定されている。これらの類似形態は交差二量体化し、同等の特異性でＤＮＡに結合することが見出されている（Akira，S．et al.，EMBO J．9:1897-1906（1990）；Poli，V．et al.，Cell 63:643-653（1990）；Descombes，P.et al.，Genes D evel．4:1541-1551（1990）；Cao，Z．et al.，Genes Devel．5:1538-1552（199 1））。マウスにおいては、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβおよびＣ／ＥＢＰγは、異なる染色体上に位置する別々の遺伝子によってコードされる（Cao，Z．et a l.，Genes Devel．5:1538-1552（1991））。Ｃ／ＥＢＰα類似形態の発現がラットにおいて研究されている。この類似形態は主に肝臓で発現する（McKnight，S．L．et al.，Genes Devel 3:2021-2024（1 989））。成長せずに活発に代謝する肝臓において、Ｃ／ＥＢＰαは高度に発現する（Birkenmeier, E．H．Genes Devel．3:1146-1156（1989））。反対に、肝臓ガン細胞においては、Ｃ／ＥＢＰα発現は減少する（Friedman，A,D．et al. ，Genes Dev 3:1314-1322（1989））。これらの知見は、Ｃ／ＥＢＰαの発現が成長抑制因子であり、その発現が細胞の増殖状態とは逆に関連し（Mischoulon， D．et al．Mol．Cell．Biol．12:2553-2560（199 2））、Ｃ／ＥＢＰαが、特化した細胞の増殖および組織特異的遺伝子を発現するそれらの能力を調節することにより、特化した細胞の高度に分化した状態を維持する（Umek．R.M．et al.，Science 251：288-292（1991））ことを示唆している。この発明は、部分的には、ヒトＣ／ＥＢＰα類似形態（図１；配列番号１）を含み、かつコードするＤＮＡ配列のクローニングに由来する。この発明に照らすと、類似形態をコードする配列は、様々な方法のいずれを用いて単離してもよい。ヒトＣ／ＥＢＰα遺伝子は介在配列を欠いているので、ゲノムＣ／ＥＢＰα− エンコーディングＤＮＡを原核生物中で発現させることが可能である。このため、Ｃ／ＥＢＰαを発現する細胞を用いる必要はなく、Ｃ／ＥＢＰαｃＤＮＡを形成する必要もない。したがって、ヒトＤＮＡライブラリーはいかなるヒト細胞からも得ることができる。しかしながら、細胞源は、最も好ましくは肝臓ガン細胞、もしくはＣ／ＥＢＰα類似形態を活発に発現する他の細胞であろう。ＤＮＡ分子を適切な原核生物もしくは真核生物ベクターにクローン化し、次いでこのベクターを、その配列が配列番号１のものと同じであるか、もしくは相補的であるプローブを用いてスクリーニングする。このようなハイブリダイゼーションスクリーニングを行なうための方法の他に、適切なベクターが、例えば、Sambrook，J ，et al．によって「分子クローニング研究所マニュアル［Molecular Cloning A Laboratory Manual］、第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，Col d Spring Harbor，NY（1989）、参照することによりここに組み込まれる）に記述されている。認識されるであろうように、完全Ｃ／ＥＢＰαエンコーディング配列と同じサイズのプローブを用いる必要はない。プローブは、反応条件の下でＤＮＡと安定にハイブリダイズし得るに十分な長さ（15以上のヌクレオチド）であればよい。オリゴヌクレオチドプローブを用いることができる反応条件の例は、Haymes，B. D.，et al.によって「核酸ハイブリダイゼーション、実用アプローチ［Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach］、IRL Press，Washington，DC（1 985））またはSzostak，J.W．E ai.，Met Enzymol 68:419-428（1979）に記述されている。このようなハイブリダイゼーションアッセイを行なうさらなる方法が、Dattagupta et al.，（米国特許4,737,454）およびPollard-Knight，D．（Tec hnique 2:113-132（1990））によって記述されており、これらの文献は参照することによりこの発明に組み込まれる。同様に、配列番号１に示される配列の全てもしくは一部の厳正な配列を有するプローブを用いる必要もない。配列が開示された配列から逸脱しているプローブも、配列の逸脱が配列番号１の配列を有するＤＮＡ分子、もしくはその相補物とハイブリダイズするプローブの能力を妨げるほど大きなものでないのであれば、用いることができる。あるいは、Ｃ／ＥＢＰαエンコーディングＤＮＡの単離を容易にするために、ＰＣＲのような増幅手段（Mullis，K．et al.，Cold Spring Harbor Symp．Quan t．Biol．51:263-27 3（1986），Erlich H．et al.，EP 50,424；EP84,796，EP 258,017，EP 237,362 ；Mullis，K.，EP 201,184，Mullis K.et al.，US 4,683,202；Erlich H.，4,58 2,788；およびSaiki R．et al.，US 4,683,194）を用いることができる。ＰＣＲ法は、Love et al．によって評価されている（Neuropath．Appl．Neurobiol．18 ：95-111（1992））。さらに別の代替法では、合成化学法を分子の合成に用いることができる。したがって、例えば、周知のホスホジエステルもしくはホスホトリエステル法を用いることができる。 II．Ｃ／ＥＢＰ遺伝子および腫瘍の抑制この発明の一面は、Ｃ／ＥＢＰ遺伝子、特にはＣ／ＥＢＰα遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であるという認識に関わる。発ガンの機構の一つは、化学的もしくは放射エネルギー（紫外線、Ｘ線等）のいずれかの発ガン物質に細胞を暴露することである。このような暴露は、動物細胞のゲノム中に存在する重要な遺伝子のＤＮＡ配列に損傷を与える。この損傷が、遺伝子の発現もしくは変異遺伝子産生物の生成のいずれかの減少に至ると、細胞の増殖が進行し、最終的には腫瘍を形成する結果となる。そのような重要な遺伝子のクラスの１つは“オンコジーン”と呼ばれている（ Green，M．R.，Cell 56:1-3（1989））。オンコジーンは、自然な状態では“不活性”状態にあるものの、ＤＮＡ損傷の効果によって腫瘍原性［tumorigenesis ］（すなわち、腫瘍形成）を誘発し得る“活性”状態に変換される遺伝子である。オンコジーンは、ヒト腫瘍の15-20％で同定されている。変異オンコジーンの創出は、腫瘍形成に必要な要求の１つにすぎない；腫瘍原性は、重要な遺伝子の第２のクラス：“抗オンコジーン”もしくは“腫瘍抑制遺伝子”、のさらなる不活性化を求めているように思える。それらの自然な状態においては、これらの遺伝子は細胞の増殖を抑制する作用をしている。このような遺伝子の損傷は、この抑制の損失につながり、それにより腫瘍原性が生じる結果となる（Klein G，Science 238:1539-1545（1987）；Weinberg R.A.，Scientifi c Amer．Sept．1988，pp 44-51）。ｐ53遺伝子（Green，M,R.，Cell 56:1-3（1989）；Mowat et al.，Nature 314 :633-636（1985）；Lane，P.D．et al.，Genes Devel．4:1-8（1990））は、よく特徴付けられた腫瘍抑制遺伝子の例である。ｐ53遺伝子が、乳ガンおよび肺ガン（Mackay，J．et al.，Lancet ii：1384（1988）；James，C.D．et al.，Canc ．Res．48:5546（1988）；Yakota，J．et al．Proc．Nat'l，Acad．Sci．（U.S. A.）84:9252（1987）；Toguchida et al.，Canc．Res．48:3939（1988））、並びに結腸直腸ガン（Baker，S．J．et al.，Science 244:217-221（1898）、参照することにより全てがここに組み込まれる）を含む多くのガンにおいて役割を有することから、ｐ53遺伝子の不活性化が巻き込まれた。ｒｂ遺伝子は、第２のよく特徴付けられた腫瘍抑制遺伝子である（Weinberg， R.A.，Scientific Amer.Sept．1988，pp44-51；Hansen M.F．et al.，Trends Ge net 4:125-128；Le e，W.-H.，“ヒト網膜芽細胞腫遺伝子の分子生物学”In；Tumor Suppressor Gen es，Klein，G，（ed.），Marcel Dekker,Inc.，pp 169-200（1990））。ＲＢ対立遺伝子の１つに損傷を受けて生まれた個人は、幼年期に網膜芽細胞腫が発病する傾向にある（Vogel，F.，Human Genetics 52:1-54（1979））。これらの敏感な個人の体細胞の１つにおける第２のＲＢ対立遺伝子の不活性化もしくは突然変異は、腫瘍形成に至る分子の事象であるように思われる（Cavenee，W.K，et al. ，Nature 305:779-784（1983））。骨肉腫のような多くのヒト腫瘍において、Ｒｂ突然変異が見出されている（Lee，E.Y.-H.，″Diverse Mutations Lead to In activation of the Retinoblastoma Gene,″In：The Molecular Biology of the Retina：Basic and Clinically Relevant Studies，Wiley-Liss，Inc.，pp．22 1-240（1991）を参照、これは参照することによりここに組み込まれる）。Ｃ／ＥＢＰα発現のレベルは、細胞の腫瘍原性の強さと反対に関係する。このような関係は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子が腫瘍抑制囚子である可能性を支持している。 III．哺乳動物ベクター一態様において、この発明はＣ／ＥＢＰαエンコーディング配列を発現（すなわち、転写および翻訳）させる。これは、Ｃ／ＥＢＰαエンコーディング配列を “天然の汚染が実質的にない”形態で単離することにより、部分的には達成される。ここで用いられる場合、分子が組換え、もしくは合成により生成され、あるいは分子が、その自然な環境においてその物質と共に典型的に見出されるところの物質から精製されたものである場合には、分子は“天然の汚染が実質的にない”ものと言われる。このような配列は、好ましくは、“ベクター”分子に組み込まれる。ここで用いられる場合には、“ベクター”という用語は、原核生物または真核生物細胞に（形質転換、エレクトロポレーション、形質導入等により）導入され、および／または増殖する（すなわち、複製される）ことが可能なウイルスもしくはプラスミド分子を表わすことを意図している。抗体の単離を可能にするに十分な量での、あるいはイン・ビトロ変異生成もしくは特徴付けを容易にするに十分な量でのＣ／ＥＢＰαの単離のような、幾つかの目的のために、原核動物ベクターを用いて原核動物宿主、特にバクテリアにおいて、Ｃ／ＥＢＰαを発現させることが望ましい。好ましい原核生物ベクターには、大腸菌内で複製可能なようなプラスミド、例えばｐＢＲ322、ＣｏｌＥ1、ｐＳＣ101、ｐＡＣＹＣ184、πＶＸが含まれる。そのようなプラスミドは、例えば、Sambrook，J．et al．（In；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY（1989））によって開示されている。バシルス・プラスミドには、ｐＣ194、ｐＣ221、ｐＴ127等が含まれる。このようなプラスミドは、Gryczan，T．によって開示されている（In ：The Molecular Biology of the Bacilli，Academic Press，NY（1982），pp． 307-329）。適切なストレプトマイシス・プラスミドにはｐＩＪ101（Kendal l，K.J.，et al.，J．Bacteriol．169:4177-4183（1987））およびφＣ31（Chat er，K.F.，et al.，In：Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology，AkademiaiKaido，Budapest，Hungary（1986），pp．45-54）のようなストレプトマイセス・バクテリオファージが含まれる。シュードモナス・プラスミドは、John J.F.，et al．によって評価されている（Rev．Infect．Dis，8：6 93-704（1986）、およびIzaki，K．（Jpn．J．Bacteriol．33：729-742（1978））。所望であれば、酵母および真菌ベクターを用いることもできる。適切な酵母ベクターの例には、2ミクロン円の酵母、発現プラスミドＹＥＰ13、ＹＣＰおよびＹＲＰ等、またはそれらの誘導体が含まれる。このようなプラスミドは、当該技術分野において周知である（Botstein，D.，et al.，Miami Wntr．Symp．19:265 -274（1982）；Broach，J.R.，In：The Molecular Biology of the Yeast Sacch aromyces：Life Cycle and Inheritance，Cold Spring Harbor Laboratory，Col d Spring Harbor，NY，p．445-470（1981）；Broach，J.R.，Cell 28:203-204（ 1982））。最も好ましくは、Ｃ／ＥＢＰαエンコーディング配列は、原核生物ベクター（特に、原核ウイルスもしくはレトロウイルスベクター）を用いて、哺乳動物細胞中で発現させる。典型的には、そのようなベクターは、バクテリア細胞中でのベクターの増殖を容易に達成することが出切るように、原核生物レプリコンおよび選択可能マーカーを含むように設計される。しかしながら、哺乳動物細胞中で増殖するために、これらのベクターは、ウイルスレプリコン、例えば、エプシュタイン−バールウイルス、ウシパピローマウイルス、パルボウイルス、アデノウイルスもしくはパボウイルス（すなわち、ＳＶ40もしくはポリオーマウイルス）のレプリコンをも含むであろう。パボウイルスレプリコンを用いるプラスミドベクターは、最後にはそれらの宿主細胞を殺してしまう。このため、これらのベクターは、一過性の発現の研究に好ましい。利用可能なＳＶ40ベースのベクターには、ｐＭＳＧ（Pharmacia）、ｐＳＶＴ7、ｐＭＴ2（Kaufman，R,J．In：Genetic Engineering：Principles an d Methods Vol.9（Setlow，J.K.，Ed,）Plenum Publishing，NY（1987））が含まれる。反対に、エプシュタイン−バールもしくはウシパピローマウイルスのレプリコンを用いるベクターは、一般に、細胞の死を招くことがなく、したがって、長期の増殖に適している。そのようなベクターの例には、ＢＰＶ-1、ｐＢＶ-1ＭＴＨＡ、ｐＨＥＢｏ、ｐ205（Shimuzu，Y．et al.，Mol．Cell．Biol．6:1074（1986 ）；Kioussis，D．et al.，EMBO J．6:355（1987）；Sambrook，J．et al.，EMB O J．4:91（1985））。参照することによってここに組み込まれているSambrook，J．et al．は、哺乳動物ベクターの特性の評価を提供している（In：Molecular Cloning，A Laborat ory Manual，2nd Ed,，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY（1 989））。最も好ましいベクターは、ＣＭＶプロモータ／エンハンサ部位を有するように変性されているｐＵＣ19の誘導体である。ＣＭＶプロモータは、Ｃ／ＥＢＰαエンコーディング配列に作働可能に連結されており、したがって、Ｃ／ＥＢＰαエンコーディング配列の転写を指令する。このベクターは、さらに、３´ポリアデニル部位を有している。Ｃ／ＥＢＰαは直接発現しても、あるいは他のタンパク質との融合体として発現してもよい。直接発現することが最も好ましい。発現の媒介には、いかなる適切な哺乳動物プロモータも用いることができるが、腫瘍特異的プロモータ（すなわち、非腫瘍細胞中よりも腫瘍細胞中でより活性の高いプロモータ）を用いることが好ましい。そのようなプロモータの好ましい例には、α−フェトタンパクプロモータ、アミラーゼプロモータ（特に、ネズミアミラーゼプロモータ）、カテプシンＥプロモータ、Ｍ1ムスカリ作働性受容体プロモータ、γ−グルタミルトランスフェラーゼプロモータ等、および特にＣＭＶプロモータが含まれる。適切なＣＭＶプロモータ配列は、ＣＭＶ促進β−ガラクトシダーゼ発現ベクター、ＣＭＢβから得ることができる（MacGregor，G,R．et al.，Nucleic Acids Res．17:2365（1989））。適切なα−フェトタンパクプロモータ配列は、ベクターＰＳＶＡＦ0.4ＣＡＴ^AおよびＰＡＦ5.1（δ2-ＣＡＴ）内に存在する（Watan abe et al.，J．Biol．Chem．262:4812-4818（1987））。ＰＳＶＡＦ0.4ＣＡＴ^Aベクターは、-1.0と-3.0の間に約2ｋｂの欠失がある5ｋｂのフランキングＤＮＡを有している。ＰＡＦ5.1（δ2-ＣＡＴ）ベクターは、ＰＳＣ1 ＣＡＴベクターにおけるＳＶ40プロモータに結合し、-3.7ｋｂと-3.3ｋｂの間に横たわる、約400塩基対のα−フェトタンパク５´フランキング配列を含む。適切なアミラーゼプロモータ、特にネズミアミラーゼプロモータ配列は、Wu et al．によって記述されている（Molec．Cell．Biol．11:4423-4430（1991））。適切なカテプシンＥプロモータ配列は、Azuma et al.によって記述されている（J．Biol．C hem．267:1609-1614（1992））。適切なＭ1ムスカリン作働性受容体プロモータ配列は、Fraser et al．（Molec．Pharmacol．36:840-847（1989））およびBonn er（Trends Neurosci．12:148-151（1989））によって記述されている。適切な γ−グルタミルトランスフェラーゼプロモータ配列を有するベクターは、Rajago palan，S．et al.，J．Biol，Chem．265:11721-11752（1990）に記述されている。 IV．発明の使用Ａ．Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の変更された染色体対立遺伝子を有する遺伝子導入動物の作製この発明はまた、染色体Ｃ／ＥＢＰ遺伝子に予め定められた突然変異および対立遺伝子を有する遺伝子導入動物、特にトランスジェニックマウスを提供する。このような動物は、Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の生理学的意義の研究に用いることができる。この動物はまた、Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の発現を模倣し、阻害し、または刺激することが可能な作用物質を同定するために用いることもできる。Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の２つの対立遺伝子の少なくとも１つの配列中に予め定められた突然変異を有するキメラもしくは遺伝子導入動物の作製は、置換もしくは挿入ベクターのいずれかを用いることによりなしとげることができる。挿入ベクターの使用は、レシピエントの染色体にベクター配列を導入する結果となる；置換ベクターの使用は、宿主配列をベクターが持ち込む配列で交換する結果となる。置換配列は、遺伝子配列を欠落させるために用いることができる。いずれのベクターも、Ｃ／ＥＢＰ分子である環状遺伝子の単一対立遺伝子のいずれか、もしくは両対立遺伝子に変異を生成させることができる；このような二重の変異生成イベントは容易に同定することができる（例えば、ＰＣＲ（Mullis ，K．et al.，Cold Spring Harbor Symp．Q uant．Biol．51:263-273（1986）； Erlich H．et al.，EP 50,424；EP 84,796；EP 258,017；EP 237,362；Mullis， K.，EP 201,184；Mullis，K．et al.，US 4,683,202；Erlichh，H.，US 4,582,7 88；およびSaiki，R，et al.，US 4,683,194）または他の方法により）。このような二重変異生成イベントの頻度は単一変異生成の頻度の二乗なので、両染色体Ｃ／ＥＢＰ対立遺伝子に突然変異を有する細胞は突然変異を有する細胞の総ポピュレーションの非常にわずかな割合を占めるにすぎない。したがって、ホモ接合動物を得るためには、古典的な異種交配の利用が好ましい。最も好ましくは、置換ベクターは、この発明の細胞およびキメラもしくは遺伝子導入動物の作製に用いられる。置換（もしくは挿入）ベクターは、一本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖であるＤＮＡ分子である。このＤＮＡ分子は、逆転写酵素もしくは他の手段によってＤＮＡに変換し得る１以上のＲＮＡ分子として細胞内に導入することができる。好ましくは、ＤＮＡ分子は二本鎖直鎖分子である。発明のこの態様を実施するための最良の様式では、このような分子は、閉鎖した共有結合環状分子を開裂させて直鎖分子を形成させることにより得られる。好ましくは、このようなベクターは、変更しようとする所望のＣ／ＥＢＰ対立遺伝子との相同性を有する領域の近傍に、少なくとも一方の側部、好ましくは両側部の横に並ぶ選択可能なマーカー遺伝子配列を有する。このようなベクターを用いる結果、染色体対立遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子の配列で置き換えられる。最も好ましくは、レシピエント細胞に導入されるベクター分子は、変異が形成されるＣ／ＥＢＰ遺伝子をコードする遺伝子の領域と相同性を有する領域を含んでいる。好ましい態様においては、ＤＮＡ分子は、細胞のＣ／ＥＢＰ対立遺伝子との相同性を有する領域を２つ有している。これらの相同領域は、好ましくは、染色体対立遺伝子への組み込みが望まれる正しい配列の横に並ぶ。最も好ましくは、置換ベクターはまた、“陽性選択”の他に“陰性選択”が可能なフランキング遺伝子配列、例えば、チミジンキナーゼをコードするｔｋ遺伝子、またはヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｈｐｒｔ遺伝子、を有する。活性チミジンキナーゼを発現する細胞は、ＨＡＴＧを含有する培地中では成長することができるが、5-アザシチジンのようなヌクレオチド類似体を含有する培地中では成長することができない（Gi phart-Gassler，M.et al.，Mutat．Res．214:223-232（1989）。活性ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有する細胞は、ガンシクロビール〔gancyclovir〕または類似の作用物質の存在下では成長することができない（Giphart-Gassler，M．et al.，Muta t．Res．214:223-232（1989）。活性ＨＰＲＴ酵素を発現する細胞は、特定のヌクレオチド類似体（6-チオグアニン、8-アザプリン等）の存在下では成長することができないが、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）で補足した培地中では成長可能である。反対に、活性ＨＰＲＴ酵素を発現することができなかった細胞はＨＡＴＧを含有する培地中では成長することができないが、6-チオグアニン等のような類似体に対して耐性である（Littlefield，J.W. ，Science 145:709-710（1964））。この目的に好ましい遺伝子は、ｈｐｒｔ遺伝子である。好ましい態様において、このベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子配列を有する（もっとも、以下に記述するように、そのような配列は、第２のベクターもしくは核酸分子を用いてレシピエント細胞に与えられるのではあるが）。このような検出可能な遺伝子配列の例には、ｈｐｒｔ遺伝子、ｔｋ遺伝子（特に、ヘルペス単純ウイルスのｔｋ遺伝子）、ｎｐｔｌｌ遺伝子（Thomas，K,R．et al .，Cell 51:503-512（1987），Mansour，S.L．et al.，Nature 336:348-352（19 8 8）、両文献は参照することによりここに組み込まれる）、あるいはアミノ酸もしくはヌクレオチド類似体、または抗生物剤等に対する耐性を付与する池の遺伝子が含まれる。検出可能なマーカー遺伝子は、認識し得る細胞の欠陥を補い得るものであればいかなる遺伝子でもよい。ｎｐｔｌｌ遺伝子（Southern，P.J.，et al,，J．Molec.Appl，Genet．1:327- 341（1982）：Smithies，O．et al.，Nature 317:230-234（1985）、これらの文献は参照することによりここに組み込まれる）が最も好ましい検出可能なマーカー遺伝子配列である。Ｎｐｔｌｌ遺伝子（もしくはｈｐｒｔ遺伝子）またはｔｋ遺伝子のいずれかを含む構築体が特に好ましい。このように、置換ベクターを用いる一方法においては、ベクターは直鎖状にされ、多能性レシピエント細胞（好ましくは、胚幹（“ＥＳ”）細胞）、または同等物に導入される（Robertson，E.J.，In：Current Communications in Molecul ar Biology，Capecchi，M.R．（ed.），Cold Spring Harbor Press，Cold Sprin g Harbor，NY（1989），pp．39-44、この文献は参照することによりここに組み込まれる）。形質導入された多能性細胞は、当該技術分野において公知の方法（ Evans，M.J．et al.，Nature 292:154-156（1981））で、イン・ビボにて培養し、キメラもしくは遺伝子導入動物を形成させることができる。ＥＳ細胞は正常な核形を有している（Evans，M.J．et al.，Nature 292:154156（1981）；Martin ，G.R．et al.，Proc．Natl．Acad，Sci，（U.S,A.）78:7634-7638 （1981））。この発明に従って、いかなるＥＳ細胞も用いることができる。しかしながら、ＥＳ細胞の一次単離体〔primary isolate〕を用いることが好ましい。このような単離体は、Robertson，E.J.（In：Current Communications in Molecular Bio logy，Capecchi，M.R．（ed.），Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb or，NY（1989），pp．39-44）によって記述されたＣＣＥ細胞系のような胚から、またはＣＣＥ細胞系のＥＳ細胞のクローン単離体（Schwartzberg，P.A．et al.，Science 246:799-803（1989）、この文献は参照することによりここに組み込まれる）から直接得ることができる。このようなクローン単離は、E．I．Robe rtsonの方法（In：Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach，（E.J．Robertson，Ed.），IRL Press，Oxford，1987）に従って行なうことができる。この文献と方法は参照することによりここに組み込まれる。このようなクローン増殖の目的は、動物への分化においてより高い効率を有するＥＳ細胞を得ることである。クローン選択されたＥＳ細胞は、先祖細胞系ＣＣＥよりも、遺伝子導入動物の作製において約10倍以上有効である。この発明の組換え法のためには、クローン選択はいかなる利点も与えてくれない。胚からクローン的に誘導されたＥＳ細胞の例は、ＥＳ細胞系、ＡＢ1（ｈｐｒｔ⁺）またはＡＢ2. 1（ｈｐｒｔ^-）である。所望の遺伝子配列を有するＤＮＡ分子は、導入された分子がその相同領域で組換えを受けることが可能な方法によって、多能性細胞に導入することができる。直接マイクロインジェクション、またはリン酸カルシウム形質転換のような幾つかの方法は、組込みの際に、導入分子のコンカテマー形成を生じることがある。これらのコンカテマーは、それ自身分解して、非コンカテマー統合構造〔non-concatemeric integration structur〕を形成する。ベクターがコーディング配列を有する場合にはコンカテマーの存在は望ましいものではないので、コンカテマーを生成する方法は一般に好ましくはない。好ましい態様において、ＤＮＡはエレクトロポレーション（Toneguzzo，F．et al.，Nucieic Acids Res．16:5515-5532（1988）；Quillet，A．el al.，J，Im munol．141:17-20（1988）；Machy，P．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（U.S .A.）85:8027-8031（1988）；これらの文献の全ては参照することによってここに組み込まれる）によって導入される。エレクトロポレーションの後、ＥＳ細胞を、検出可能なマーカー遺伝子配列を受け、これを組込んだ形質導入体を選別する培地で培養する。次いで、培養条件を、陰性選択遺伝子を得たレシピエント細胞を選択するように変更する。この発明の好ましい態様において、そのような陽性および陰性選別は、選択可能なマーカー遺伝子を選択するが、陰性選択遺伝子の存在に対して選別する条件下で細胞を培養することにより同時に行なわれる。これらの配列の全てが同じ標的ベクター分子上に存在するため、このような二重選別は組換え的なイベントの発生を必要とする。次に、このような二重選別の生き残りを、染色体対立遺伝子の機能について、またはより好ましくは、サザーンブロット解析による、本来存在する染色体対立遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子で置換されているクローンについてのいずれかでスクリーニングを行なう。所望のＤＮＡ分子が組込まれた細胞を（例えば、検出可能なマーカー遺伝子配列が発現可能なｎｐｔｌｌ遺伝子配列である場合、Ｇ418耐性細胞についての選別により）選別した後、細胞を培養し、導入されたＤＮＡ分子の存在を前記の通りにして確認する。所望の組換えイベントを受けている細胞の同定には、様々な方法のいかなるものをも用いることができる。クローンの直接スクリーニング、ＰＣＲの利用、ハイブリダイゼーションプローブの利用等の全てを、このために用いることができる。組換えを受けたＥＳ細胞を、キメラおよび遺伝子導入動物の作製に用いることができる。キメラ動物は、動物の細胞のいくつかのみが変性Ｃ／ＥＢＰ遺伝子を有するものである。反対に、遺伝子導入動物は、変性Ｃ／ＥＢＰ構築体が全ての細胞中に存在する動物である。ＥＳ細胞は、E.J．Robertson（In：Teratocarcinomas and Embryonic Stem Ce lls：A Practical Approach，（E.J．Robertson，Ed.），IRL Press，Oxford，1 987，pp 71-1 12）（この文献は参照することによってここに組込まれる）によって記述されるように、好ましくは、間質細胞（ＳＴＯ細胞（特にＳＮＣ4 ＳＴＯ細胞）等）および／または一次胚線維芽細胞上で培養される。キメラマウスの作製および解析方法は、Bradley，A．によって開示されている（In：Teratocarcinomas and Embryon ic Stem Cells：A Practical Approach，（E.J．Robertson，Ed.），IRL Press ，Oxford，1987，pp113-151）（この文献は参照することによりここに組込まれる）。間質（もしくは線維芽）細胞は、異常ＥＳ細胞のクローン性過剰成長を除去する働きをする。最も好ましくは、これらの細胞を、白血球阻害因子（“ｌｉｆ”）の存在下で培養する（Gough，N.M．et al.，Reprod．Fertil．Dev．1:281 -288（1989），Yamamori，Y，et al.，Science 246:1412-1416（1989）、これら両文献は参照することによりここに組込まれる）。ｌｉｆをコードする遺伝子はクローン化されている（Gough，N.M．et al.，Reprod．Fertil．Dev. 1:281-288 （1989））ので、この遺伝子を用いて、当該技術分野において公知の方法で間質を形質転換し、次いで、ｌｉｆを培養培地中に分泌する形質転換された間質細胞上でＥＳ細胞を培養する。このように、この発明は、内在性染色体Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の本来の配列を、この遺伝子に“所望の遺伝子配列”を導入することにより変更する方法を提供する。この“所望の遺伝子配列”は、いかなる長さのものでも、いかなるヌクレオチド配列を有するものであってよい。完全なタンパク質をコードする遺伝子配列、そのような遺伝子配列の断片、調節配列等の１以上を有していてもよい。重要なことには、所望の遺伝子配列は、レシピエント細胞の未変性遺伝子とほんのわずかに異なっているだけでもよい（例えば、未変性遺伝子に対して単一もしくは複数の塩基の変更、挿入または欠失を有していてもよい）。このような所望の遺伝子配列を用いることにより、レシピエント細胞の染色体対立遺伝子に微妙かつ正確な変更を創出することが可能である。このように、この発明は、Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の発現および調節を操作し、かつ調整する手段を提供する。特に、この発明は、本来存在する遺伝子配列を“選択不可能な〔non-selectab le〕”“所望の遺伝子配列”で置き換えることにより、Ｃ／ＥＢＰ分子をコードする遺伝子の発現およびタンパク構造を操作し、かつ調整する手段を提供する。遺伝子配列が、レシビエント細胞におけるその存在もしくは発現が、用いられる培養条件の下で、細胞に生存利益〔survival advantage〕を与えないのであれば、その遺伝子配列は選択不可能である。非機能的Ｃ／ＥＢＰ対立遺伝子をコードする配列は、そのような配列の例である。反対に、“優性”遺伝子配列は、特定の環境下において、レシピエント細胞に生存利益を付与するものである。ｎｐｔｌｌ遺伝子によって付与されるネオマイシン耐性は、ネオマイシンＧ418の存在下で培養される細胞に対する生存利益である。したがって、ｎｐｔｌｌ遺伝子は、選択不可能な遺伝子配列というよりも優性遺伝子配列である。特に、この発明は、レシピエント細胞に本来存在する遺伝子配列を、“Ｃ／ＥＢＰ類似体分子〔analog C/EBP molecule〕”を発現することが可能な“類似体 ”配列で置き換えることを可能にする。ここで用いられる場合には、“Ｃ／ＥＢＰ類似体分子”は、天然のＣ／ＥＢＰ分子と同等もしくは類似の方法で作用し得る分子である。２つの配列が、実質的には類似しているが他方に対して単一の塩基置換、欠失、もしくは挿入に相当する小さな変化がある場合、またはそれらが “マイナーな”複数塩基の変更を有している場合には、一方の配列は他方の配列の“類似体”であると言われる。Ｃ／ＥＢＰαタンパクが腫瘍抑制因子の特性を発現するため、この発明の遺伝子導入動物は、ガンに対して予め処置されている。したがって、このような動物は、化学物質および他の作用因子の発癌能力のスクリーニングおよび評価に用いることができる。このため、この発明の動物は、外的に付加された活性オンコジーン配列を有する細胞を含む、Leder，P．et al. （米国特許4,736,866）によって記述される動物の代わりを提供する。Leder，P ，et al.の動物が発癌物質のアッセイに有用であると記述されているとしても、動物に付与されたオンコジーン配列の正確な位置および構造は不明であり、実験的に制御することはできない。このため、この動物の発癌モデルとしての価値は大きく損なわれる。この発明の動物は、Donehower，L.A．et al.によって記述されたＰ53欠損動物（Nature 356:215-221（1992）；ＰＣＴ出願US 92/00295）およびBradley，A．et al．のｒｂ欠損動物（ＰＣＴ出願US/93/05584）を補う。以下に論じるように、ホモ接合Ｃ／ＥＢＰ欠損動物は、新生児低血糖および糖原病を発病する。したがって、このような動物は、ヒトおよび動物におけるこれらの疾患を処置し得る作用因子を同定するイン・ビボモデルとして用いることが可能である。このようなトランスジェニックマウス（もしくはそれらの胚幹細胞先祖）に由来する細胞系は、化学物質および他の作用因子の発癌能力のアッセイに用いることができる。このようなアッセイは、Ｃ／ＥＢＰ欠損細胞の形態学、増殖特性等に対する作用因子の効果を評価する。したがって、Ｃ／ＥＢＰ発現の疑わしいアフェクター〔affector〕の存在下で細胞をインキュベートして、化合物がＣ／ＥＢＰαの発現に影響を及ぼし得るかどうかを決定することができる。特には、このようなアッセイは、“急性期反応体”の発現を誘発するステロイドおよびペプチドホルモン（例えば、サイトカインルイ）、または反応体自身の発現における変化を評価することができる。Ｂ．肝機能の診断における使用この発明は、肝臓または他の組織におけるＣ／ＥＢＰα発現の存在と程度を決定することを可能にする。前に示されるように、Ｃ／ＥＢＰα発現のレベルは、細胞の腫瘍形成能力とは逆の関係にある。このような関係は、Ｃ／ＥＢＰαの発現が腫瘍形成に影響を及ぼし、あるいは妨げさえする可能性を支持している。一態様においては、この発明のＣ／ＥＢＰα配列は、発現してＣ／ＥＢＰαを生じ得る。この物質は、イムノアッセイフォーマットにおいてＣ／ＥＢＰα発現のレベルおよび程度の定量に用いることが可能な抗Ｃ／ＥＢＰα抗体の誘導に用いられている。適切なイムノアッセイフォーマットは、例えば、Fackrell（J．Clin．Immunoassay8:213219（1985））、Yolk en，R.H．（Rev．Infect．Dis．4:35（1982））、Collins，W.P．（In：Alterna tive Immunoassays，John Wiley & Sons，NY（1985））、Ngo，T.T．et al．（I n：Enzyme Mediated Immunoassay，Plenum Press，NY（1985））、およびIn：EL ISA and Other Solid Phase Immunoassays（Kemeny，D.M．et al,，Eds.）、Joh n Wiley & Sons，NY（1988）によって記述されている。このように、この発明は、抗Ｃ／ＥＢＰα抗体を用いてサンプル中のＣ／ＥＢＰαのレベルおよび濃度を検出および／または定量するイムノアッセイフォーマットを提供する。好ましい態様においては、このイムノアッセイは、例えば組織もしくは生検サンプル等を用いて、その場で行なうことができる。あるいは、組織サンプルから得られた未精製の、一部精製した、または精製した調製物に対してアッセイを行なうことができる。別の態様においては、Ｃ／ＥＢＰαｍＲＮＡの配列とハイブリダイズし得るＣ／ＥＢＰ特異的核酸プローブ（ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか）を用いて、サンプル中のＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡの存在を検出することが可能である。好ましくは、このプローブは、約10ないし30ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約約 15-24ヌクレオチドの長さである。この分子はまた、好ましくは、検出可能なラベルで標識されている。これに関しては、いかなる検出可能なラベル（すなわち、酵素、放射性同位体、蛍光等）も用いることができる。正常肝臓の生検組織において、Ｃ／ＥＢＰ特異的プローブと結合可能なｍＲＮＡを生成することができない肝細胞が存在することは、肝癌の存在の特徴をなす。好ましい方法においては、“アンチセンス分子”がＣ／ＥＢＰα発現のアッセイに用いられる。このようなアッセイは、肝組織を用いて、イン・ビボ、もしくは組織培養の際の半ビボのいずれかで行なうことができる。一般に、Ｃ／ＥＢＰα“アンチセンス分子”は、ｍＲＮＡ分子（もしくは遺伝子）と結合し、あるいはハイブリダイズし、それにより遺伝子産生物へのｍＲＮＡの翻訳を損なう（すなわち、弱める、もしくは妨げる）ことが可能なように、その配列がＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡ分子（もしくはその対応遺伝子）の配列に相補的である核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか）である。このような分子には、Ｃ／ＥＢＰα配列との特異的なハイブリゼーションを可能ならしめるのに十分な長さの“アンチセンスオリゴヌクレオチド”の他に、好ましくは100-500ヌクレオチドの長さの“アンチセンストランスクリプト”が含まれる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約10-30ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは、約15-24ヌクレオチドの長さである。あるいは、生理学的なイン・ビボ条件下ではＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡに安定にハイブリダイズし得るには長さが短かいアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることもできる。このようなオリゴヌクレオチドは、約6-10ヌクレオチド以上の長さであればよい。この発明に従って用いるためには、このようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは、Ｃ／ＥＢＰα−エンコーディングｍＲＮＡの翻訳領域の遺伝子座に結合し得るように変性される。このような変性分子には、一本鎖Ｃ／ＥＢＰαｍＲＮＡに結合し得る、抗体（もしくは抗体断片）、または（二価架橋剤、例えば、トリメチルプソラリン、8-メトキシプロラリンのような）他のリガンドに結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。（プソラリン（例えば、トリメチルプソラリン、もしくは8-メトキシプソラリン）のような）二価架橋剤の反応性基の１つに結合した抗Ｃ／ＥＢＰαアンチセンスオリゴヌクレオチド付加物は、350-420ｎｍのＵＶ光で活性化する際に、Ｃ／ＥＢＰαｍＲＮＡと架橋し得る。したがって、この光の強度を（ＵＶランプのワット数を変化させる、細胞とランプとの距離を増大させる、等によって）調節することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドと細胞のＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡとの結合の程度を制御することが可能となる。これは、裏を返すと、レシピエント細胞におけるＣ／ＥＢＰα遺伝子発現の衰退の程度の制御を可能にする。この発明に従って、400-500ｂｐのＣ／ＥＢＰαアンチセンストランスクリプトが形成され、Ｃ／ＥＢＰα活性を阻害し得ることが見出された。この実験の成功は、より小さな“アンチセンスオリゴヌクレオチド”をＣ／ＥＢＰα発現の阻害に代わりに用いることができることを示している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、欧州特許出願263,740；335,451および329,882、並びにＰＣＴ公開WO 90/00624に開示されており、これらの文献は全て参照することによりここに組み込まれる。一般に、アンチセンストランスクリプトまたはオリゴマーは、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のヌクレオチド配列に従って調製される。アンチセンストランスクリプトまたはオリゴヌクレオチドの配列は、得られるトランスクリプトまたはオリゴヌクレオチドがＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡの全配列もしくはそれらの所望の断片と結合し、あるいはハイブリダイズすることが可能であるならば、１以上のヌクレオチドの１以上の挿入、置換、もしくは欠失を含んでいてもよい。当該技術分野において周知のいかなる方法も、この発明のアンチセンストランスクリプトもしくはオリゴヌクレオチド、または前記プローブの合成に用いることができる（Zamechik et al,，Proc．Natl．Acad．Sci．（U.S.A.）83:4143（1 986）；Goodchild et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（U.S.A.）85:5507（1988 ），Wickstrom et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（U.S.A.）85:1028；Holt，J ．T．et al.，Mol，Cell．Biol．８:963（1988）；Gerwirtz，A．M．et al.，Sc ience 242:1303（1988），Anfossi，G.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（U. S.A.）86:3379（1988）；Becker，D,，et al.，EMBO J．8:3679（1989）；全ての文献は参照することによってここに組込まれる）。このために、自動核酸シンセサイザーを用いることができる。加えて、所望の配列のヌクレオチドを、カスタム分子の販売者から得ることもできる。最も好ましくは、この発明のアンチセンストランスクリプト、オリゴヌクレオチドまたはプローブを、固相“ホスホラミダイト［phosphor amidite］合成”を用いて調製することができる。この合成は、トランスクリプトまたはオリゴヌクレオチドの３´末端であるヌクレオチドを用いることで作製された固体支持体に付着するヌクレオチド鎖を成長させることで行なう。この方法は、５´−ヒドロキシル基が（好ましくは５´−ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）基で）ブロックされ、アミノ基がベンゾイル基（シトシンおよびアデノシンのアミノ基）もしくはイソブチル基（グアノシンの保護）のいずれかでブロックされているモノマー単位を用いる、ＤＮＡの循環合成［cyclical synthesis］に関与する。このような誘導体の製造方法は、当該技術分野において公知である。あるいは、Ｃ／ＥＢＰαのネガティブ鎖をクローン化し、組換え法を用いてアンチセンス分子を調製することができる。Ｃ．肝臓ガンおよび他のガンの治療における使用この発明は、その発病または持続が、Ｃ／ＥＢＰαの細胞性発現の減少に依存することを特徴とする、肝臓ガンおよび他のガンの治療手段を提供する。特には、この発明は、“ガン細胞の増殖を阻害する方法”を提供する。ここで用いられる場合には、ガン細胞の増殖は、その増殖の速度もしくは程度が未処置のガン細胞と比較して減少する場合に、“阻害された”と言う。この発明は、肝臓細胞もしくは腫瘍細胞のＣ／ＥＢＰαの発現を増大させることにより治療を行なう。このような発現の増大を誘発する２つの手段が特に好ましい。一態様においては、ガンの“遺伝子治療”を提供するために、ヒトもしくは動物（特に哺乳動物）の腫瘍細胞に形質導入することが可能なベクターに、機能的Ｃ／ＥＢＰα遺伝子、この遺伝子の変種、もしくはＣ／ＥＢＰα遺伝子の活性に影響を及ぼす他の遺伝子のいずれかをコードするＤＮＡが導入される。最も好ましくは、ウイルスもしくはレトロウイルスベクターがこの目的で用いられる。適切なベクターの例は、前に同定されたものに加えて、Fletcher，F，A．et al．（J．Exper．Med．174:837-845（1991））、Makela，T．P．et al．（Gene118:2 93-294（1992））、Porgador，A．et al．（Canc．Res．52:3679-3686（1992））、Yoshimura，K．et al．（Nucl．Acid Res．20:3233-3240（1992））、Lim， B．et al．（Proc．Natl．Acad．Sci．（U.S.A,）86:8892-8896（1989））、Ohi ，S，et al．（Gene89:279-282（1990））、およびRussel，S．J．et al.（J．V irol．66:2821-2828（1992））によって論じられている。特に好ましい態様においては、遺伝子配列は、転写されるだけのプロモーターから、もしくは少なくとも優先的に、腫瘍細胞に転写される。このようなプロモーターの例には、α−フェトタンパク、癌胎児抗原、アミラーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ等の腫瘍特異的抗原を指向するものが含まれる。遺伝子治療の原理は、Oldham，R，K．（In：Principles of Biotherapy，Rave n Press，NY，1987）および類似のテキストによって開示されている。遺伝子治療の方法および用途は、Boggs，S．S．（Int．J．Cell Clon．8:80-96（1990））；Karson，E．M，（Biol．Reprod．42 :39-49（1990））；Ledley，F．D．（In； Biotechnology，A Comprehensive Tr eatise，volume 7B，Gene Technology，VCH Publishers，Inc，NY，pp399-458（ 1989））によって開示されており、これらの文献は全て参照することによりここに組み込まれる）。遺伝子治療は、既存の状態を治療する（すなわち抑制し、または弱める）ために、あるいは遺伝した遺伝子突然変異、または体細胞突然変異のために遺伝子の発現が減少した（例えば、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子のただ１つの機能的な対立遺伝子）細胞を有する個人に予防的な遺伝子治療を施すために、レシピエントに施すことができる。特に好ましい態様においては、Ｃ／ＥＢＰαエンコーディング配列を肝臓に送達させるために、アデノウイルスベクターが（このベクターをレシピエントの門脈に直接注入することにより）用いられる。肝臓へ向かう血流の性格から、門脈を介して配送されるベクターは肝細胞および肝臓の腫瘍内に留まるであろうが、この臓器の外部の他の組織に拡がることはないであろう。要するに、ベクターは、身体のフィルターとして機能する肝組織におそらくトラップされるであろう。第２の態様においては、初期Ｃ／ＥＢＰαの有効濃度もしくは活性を増幅するために、続いて腫瘍細胞に与えられるＣ／ＥＢＰα、それらの変種、もしくは共力剤の同定にＣ／ＥＢＰαエンコーディング配列が用いられる。ここで用いられる場合には、前記共力剤には、Ｃ／ＥＢＰαの標的配列への結合を容易にし、またはＣ／ＥＢＰαもしくはＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡを分解もしくは不活性に対して安定にし、またはＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡの転写もしくは翻訳の速度を増加するように作用する、タンパクもしくは非タンパクの囚子が含まれる。このような分子は、候補作用因子を、Ｃ／ＥＢＰαの濃度、安定性、または活性を高めるそれらの能力についてスクリーニングすることにより容易に同定することができる。したがって、例えば、Ｃ／ＥＢＰαアンチセンストランスクリプトもしくはオリゴヌクレオチドと推定された共力剤との両者の存在下において、正常肝細胞をインキュベートすることができる。この化合物が、Ｃ／ＥＢＰαアンチセンストランスクリプトもしくはオリゴヌクレオチドによって生じるＣ／ＥＢＰα発現の阻害を改善することができるかどうかを決定するために、細胞をモニターする。反対に、椎定されたアンタゴニスト化合物の存在下で細胞をインキュベートすることができる。この化合物がＣ／ＥＢＰαの発現を低下させることができるかどうかを決定するために細胞をモニターする。このように、この発明は、Ｃ／ＥＢＰαのアンタゴニストまたは共力剤のいずれかを同定するこどが可能な“スクリーニングアッセイ”を包含する。特に、このアッセイは、“急性期反応体”の発現を誘発するステロイドもしくはペプチドホルモン（例えば、サイトキン類）の発現、または反応体それ自身の発現における変化を評価することができる。Ｄ．肝機能障害または肝臓再生の治療における使用前に示されるように、この発明は、Ｃ／ＥＢＰαの発現もしくは活性のレベルもしくは程度を特異的に減少させることが可能なＣ／ＥＢＰαアンタゴニスト（アンチセンストランスクリプトもしくはオリゴヌクレオチドのようなタンパク様および非タンパク様の両者）の同定を可能にする。このような分子は、肝機能障害の治療、あるいは肝臓の再生もしくは肥大の促進に有用である。Ｃ／ＥＢＰαアンチセンストランスクリプトもしくはオリゴヌクレオチドがこれらの目標を達成する１つの方法は、Ｃ／ＥＢＰαｍＲＮＡの翻訳開始領域の配列に相補的であり、かつＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡトランスクリプトとハイブリダイズし得るに十分な長さの配列を有することによる。この発明のアンチセンストランスクリプト、オリゴヌクレオチドおよび他のＣ／ＥＢＰαアンタゴニストは、他の方法では一時的な増殖生育期間しか持たないであろう大切な細胞型（一次肝組織、細胞等）の不死化に用いることができる。したがって、それらを研究に用いることができ、あるいは臓器もしくは組織移植片もしくは移植体としての多数の細胞の蓄積を可能にし、または容易にすることができる。したがって、一態様において、この発明の作用因子を臓器もしくは組織培養の方法と一緒に用いて、これらの方法を容易にすることができる。使用は、それが生理学的な状態を変更する場合に、治療的であると言われる。この発明の作用因子は、所望の治療目的について、局所的もしくは全大敵に用いることができる。これらは、例えば、好ましくは適当な溶媒中に溶解された、アンチセンストランスクリプトもしくはオリゴヌクレオチド、またはいずれかの同等物、および親脂性担体もしくはアジュバントを含有し得る、薬剤等に用いることができる。そのような溶媒は、例えば、水−エタノール混合液（10％ないし30％v／v以上のエタノールを含有する）であればよい。このような調製物は、000.1％ないし1.0％のアンチセンス分子を含むことができる。適切な担体、アジュバントおよび溶媒は、Remington's Pharmaceutical Sciences （16th ed.，Osol，A.，Ed.，Mack，Easton PA（1980）に記述されており、この文献は参照することによりここに組み込まれる。この発明のアンチセンス分子および他のＣ／ＥＢＰαアンタゴニストが肝細胞の増殖を刺激することが可能であるため、それらを火傷もしくは手術の後の回復の促進、または萎縮した組織の復元等に用いることが可能である。そのような態様に対して、局所もしくは全体投与のために、これらの作用因子を抗生物剤、抗真菌剤などと共に処方することができる。Ｅ．研究および薬剤開発における使用この発明の遺伝子配列およびベクターは、それらの治療もしくは診断用途からは全く離れて、ヒトおよび動物における遺伝子の調節、発現および組織の調査に用いることができる。この発明の方法は、Ｃ／ＥＢＰαをコードする遺伝子の調節領域内における変更の生成に用いることが可能である。このような調節配列は、様々な方法で得ることができる。好ましい方法の１つにおいて、Ｃ／ＥＢＰαをコードする配列を、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子に対して５´に位置するＣ／ＥＢＰαプロモーター配列を有する構成要素のゲノムライブラリーの探索に用いることができる。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の適切な配列は、図１および２、並びに例２に記載されるＡＴＣＣ寄託75412に記述されている。したがって、この発明は、このような遺伝子の転写もしくは翻訳の性質もしくは制御を変更する手段、並びにこのような遺伝子を変更する手段を提供する。例えば、この発明は、遺伝子の発現を増大もしくは減少させる結果となる突然変異の導入を可能にする。同様に、本来の対立遺伝子の転写能力を、その発現を減少もしくは増大させるために、低下もしくは増大させることができる。このように、この発明は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の操作および解体を可能とし、したがって、Ｃ／ＥＢＰα変種、アンタゴニストおよび共力剤の同定を可能とする。この発明の分子および動物は、疾患もしくは組織変質の動物モデルの創出および／または研究における利用に特に適している。この発明のスクリーニングアッセイおよび動物は、Ｃ／ＥＢＰαで調節された遺伝子の同定の他に、Ｃ／ＥＢＰαと相互作用し得る新規治療剤の開発を容易にするために用いることができる。したがって、このようなアッセイおよび動物は、Ｃ／ＥＢＰα発現の損失を補い、もしくは回避する分子の能力を評価することができる。このような分子は、Ｃ／ＥＢＰαの機能的類似体である。このような類似体には、“古典的類似体” および“疑似類似体”の両者が含まれる。Ｃ／ＥＢＰαの古典的類似体は、類似の生物学的活性を有し、Ｃ／ＥＢＰαと化学的に関連する分子である。説明として、Ｃ／ＥＢＰα活性を有する非天然変異体タンパクは、タンパクＣ／ＥＢＰα 分子の古典的類似体を含む。同様に、変異生成Ｃ／ＥＢＰα核酸分枝は、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子配列の古典的類似体の例を含む。反対に、Ｃ／ＥＢＰα分子の“疑似類似体”は、分子の生物学的活性は保持するが、典型的には、化学的には関連しない。その構造がＣ／ＥＢＰαタンパクの活性部位を模倣する有機分子は、そのタンバクの“疑似類似体”を含む。同様に、Ｃ／ＥＢＰαの核酸結合部位に結合することができ、もしくはＣ／ＥＢＰαによって認識される非核酸分枝は、その分子の疑似類似体である。したがって、機能的類似体は、作用因子が全Ｃ／ＥＢＰα核酸分子、またはそれらのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはそのような分子もしくは断片によってコードされたタンパクもしくはポリペプチドのいずれかの機能を模倣するのであれは、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、（グリコシル化および非グルコシル化タンパクを含む）タンパク様化合物もしくは（ステロイド、当脂質のような）非タンパク様化合物のいずれかであり得る。好ましい古典的類似体には、その配列に、Ｃ／ＥＢＰαタンパクの活性触媒部位もしくは結合部位、またはＣ／ＥＢＰα活性を抑制し、もしくは誘発することのいずれかが可能な核酸Ｃ／ＥＢＰα分子のオリゴヌクレオチド断片を有する（線形ペプチドの他に環状ペプチドを含む）ポリペプチドが含まれる。好ましい疑似類似体には、Ｃ／ＥＢＰαタンパクの断片もしくはそれらの変異体ではないが、それにもかかわらず、Ｃ／ＥＢＰα様の方式で作用する能力、またはＣ／ＥＢＰαアンタゴニストの方式で細胞増殖を誘発する能力を発現するポリペブチドが含まれる。古典的類似体は、以下に記述するように合理的に、または突然変異生成の確立された方法（例えば、Watson，J．D．et al.，Molecular Biology of the Gene ，Forth Edition，Benhamin/Cummings，Menlo Park，CA（1987）を参照）のいずれかによって同定することができる。重要なことには、ランダム変異生成アプローチは、変異を生成させようとする遺伝子配列についての先験的な情報を必要としない。このアプローチは、その機能に基づいて特定の突然変異の望ましさを評価する利点を有し、そのため、得られた変異タンパクがいかにして、あるいは何故に特定の構造に適合するのかを理解する必要がない。実際、標的遺伝子配列のランダム変異生成は、所望の特性を有する変異タンパクを得るために用いられている１つのアプローチである（Leatherbarrow，R．J．Prot．Eng．1:7-16（1986 ），Knowles，J．R.，Science236:1252-1258（1987）；Shaw，W．V,，Biochem． J．246:1-17（1987）；G erit，J．A．Chem．Rev．87:1079-1105（1987））。あるいは、特定の配列変更が望まれる場合には、部位指向変異生成の方法を用いることができる。このため、そのような方法は、重要であると信じられるタンパク質のアミノ酸のみを選択的に変更するために用いることができる（Craik，C．S.，Science 228:291-297 （1985）；Cronin，C．S．et al.，Biochem．27:4572-4579（1988），Wilks，H ，M．et al.，Science242:1541-1544（1988））。このような変異体の分析は、ファージ・ディスプレイ・プロテイン・リガンド・スクリーニングシステム［ph age display protein ligand screening system］を利用することにより容易にすることもできる（Lowman，H．B．et al.，Biochem．30:10832-10838（1991）；Markland，W，et al.，Gene109:13-19（1991），Roberts，B．L．et al.，Pro c．Natl．Acad．Sci．（U.S.A.）89:2429-2433（1992）；Smith．G．P.，Scienc e 228:1315-1317（1985）；Smith，R，P．et al.，Science248:1126-1128（1990 ）、全て参照することによりここに組み込まれる）。一般に、この方法には、所望のタンパクリガンドが（Ｍ13遺伝子III外皮タンパクもしくはラムダ外皮タンパクのような）ウイルス外皮タンパクのＣ末端に融合している融合タンパクの発現が関与する。Ｃ／ＥＢＰαの疑似類似体は、通常の、もしくは合理的な薬剤設計の原理を用いて得ることができる（Andrews，P．R，et al.，In：Proceedings of the Alfr ed Benzon Symposium，volume 28，pp．145-165，Munksgaard，Copenhagen（199 0）；McPherson，A．Eur．J．Biochem．189:１-24（1990）；Ho l，W．G．J．et al.，In：Molecular Recognition：Chemical and Biochemical Problems，Roberts，S．M．（ed.）；Royal Society of Chemistry；pp．84-93 （1989），Hol，W．G．J.，Arzneim-Forsch．39:1016-1018（1989），Hol，W．G ．J,，Agnew．Chem．Int．Ed．Engl．25:767-778（1986）、全て参照することによりここに組み込まれる）。通常の薬剤設計の方法に従い、その構造が、“未変性の”Ｃ／ＥＢＰα分子、またはＣ／ＥＢＰα分子と相互作用する分子、の構造と同様の特性を有する分子を無作為に試験することにより、所望の疑似分子が得られる。結合分子の特定の基における変化の結果として生じる量的な寄与は、未変性のＣ／ＥＢＰα分子と推定疑似体との間の競合性もしくは協力性の能力を測定することにより決定することができる。合理的な薬剤設計の一態様において、疑似体は、Ｃ／ＥＢＰα分子の最も安定な３次元構造の特性を共有するように設計される。このため、Ｃ／ＥＢＰα分子の疑似類似体は、Ｃ／ＥＢＰα分子によって表わされるのと同様に、イオン性、親水性、もしくはファンデルワールス相互作用を引き起こすに十分な方法で方向付けられた化学基を有するように設計することができる。合理的設計の第２の方法においては、Ｃ／ＥＢＰαのコンホメーション的“ブリージング［breathing ］”を受ける能力が利用される。このような“ブリージング”（異なる分子コンホメーションの一時的かつ逆転可能な仮説）は、広く認められた現象であり、温度、熱力学的因子、および分子の触媒活性から結果として生じるものである。Ｃ／ＥＢＰαの３次元構造の知見は、そのような評価を容易にする。Ｃ／ＥＢＰα分子の自然なコンホメーションの変化の評価は、潜在的なヒンジ部位、分子のブリージング等によって水素結合、イオン結合、もしくはファンデルワールス結合が形成され、もしくは排除される潜在的な部位の認識を容易にする。このような認識は、Ｃ／ＥＢＰαが仮定することができるさらなるコンホメーションの同定を可能とし、そのようなコンホメーションを共有する疑似類似体の合理的な設計と生成を可能にする。合理的な疑似体設計を行なうための好ましい方法は、RIBBON（Priestle，J.， J．Mol．Graphics21:572（1988））、QUANTA（Polygen）、InSite（Biosyn）、またはNanovision（American Chemical Society）を用いて得られるような、Ｃ／ＥＢＰαの３次元構造の像を形成することが可能なコンピュータシステムを用いる。そのような分析は、Hol，W．G．J．et al，（In：Molecular Recognition ：Chemical and Biochemical Problems，Roberis，S．M．（ed.），Royal Socie ty of Chemistry；pp．84-93（1989））、Hol，W．G．J．（Arzneim-Forsch．39 ：1016-1018（1989））、およびHol，W．G，J.，Agnew．Chem．Int．Ed．Engl． 25:767-778（1986））によって例示されている。このような推定類似体の直接比較評価の代わりに、スクリーニングアッセイをこのような分子の同定に用いることができる。このようなアッセイは、好ましくは、腫瘍形成能に影響を与える類似体の能力を利用する。あるいは、変異生成Ｃ／ＥＢＰα分子を推定アンタゴニスト化合物と共に投与することができる。この場合、この化合物が腫瘍形成能の阻害を再確立することができるかどうかを決定するために、細胞をモニターする。このアッセイは、Ｃ／ＥＢＰαまたはその分子の類似体のペプチドもしくはオリゴヌクレオチド断片の同定に特に有用である。したがって、例えば、オリゴヌクレオチドもしくはペプチド類似体（もしくは断片）のいずれか、および推定類似体化合物の存在下において、細胞をインキュベートすることができる。この化合物が、Ｃ／ＥＢＰαオリゴヌクレオチドのＤＮＡ合成を阻害する能力を低下させることができるかどうかを決定するために、細胞をモニターする。前に示されるように、カラム競合アッセイを代わりに行なうこともできる。このように、所望のＣ／ＥＢＰαの古典的もしくは疑似的類似体は、様々な手段で同定することができる。以上、この発明を一般的に記述したが、この発明は以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。以下の実施例は、説明として与えられたものであり、指定しない限りは、この発明を限定することを意図するものではない。例１：Ｃ／ＥＢＰαイソフォーム（isoform）のクローニングＣ／ＥＢＰα遺伝子配列が、λＧＴ１０ライブラリー（ヒト・ヘパトーマ・セルラインＨｅｐ３Ｂ２から得られたゲノムＤＮＡから作成された）をスクリーニングすることにより単離された。そのライブラリーをラットＣ／ＥＢＰα配列でプロービングすることにより、ヒトＣ／ＥＢＰα全体をコードする領域を含むクローンが単離された。ゲノムクローンは、約２．２ｋｂの５´フランキング配列を含んでいた。クローン化された暗号領域の試験から、ゲノム配列には介在配列（イントロン）が欠けていることが判った。ヘパトーマ・セルラインの代わりに、いずれのヒト細胞もゲノム配列のソースに用いることができた。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の遺伝暗号配列（coding sequence）が図１に示される（配列番号１）。Ｃ／ＥＢＰαのアミノ酸配列が図２に示される（配列番号２）。ここに示される配列番号１は、幾つかの点で米国出願出願番号第０８／０２９，３２５号（１９９３年３月４日出願）の記載と異なる。ここで最も注目すべきことは、先行出願におけるヌクレオチド残基５５６−５５７の間に、６５残基長のＮｏｔＩ−ＮｏｔＩオリゴヌクレオチド（配列番号１、残基５５８−６２２）が存在することである。ここに示される配列番号２もまた、米国出願出願番号第０８／０２９，３２５号（１９９３年３月４日出願）の記載と異なる。これについて最も注目すべきことは、先行出願におけるヌクレオチド残基１３４−１３５の間に、配列番号２の１３７−１５６残基が存在することである。ここに示される改訂された配列は、ｃ／ＥＢＰαベクター（ＡＴＣＣ７５４１２）のｃ／ＥＢＰα遺伝子の再配列決定により得られた。このベクターは、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルの、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにブダペスト条約が取り決める微生物寄託の条項に基づいて寄託された。寄託は、米国出願出願番号第０８／０２９，３２５号の出願日に先だって、１９９３年２月２日になされた。例２：Ｃ／ＥＢＰαの発現上記の、単離されたＣ／ＥＢＰαをコードする配列は、ＣＭＶがプロモートするガラクトシダーゼ発現ベクターのＣＭＶβを用いて発現された（MacGregor,G. R．et al.,Nucleic Acids Res. 17:2365（1989））。この目的のために、ＣＭＶβベクターをＮｏｔＩで消化し、これによって、β−ガラクトシダーゼ配列を欠失させた。プラスミドｐＵＣｈＣ／ＥＢＰαにクローン化されているヒトＣ／ＥＢＰα配列は、ＮｒｕＩおよびＸｈｏＩで消化された。Ｃ／ＥＢＰαをコードする配列に加えて５´および３´の非翻訳領域の部分を含んでいる１．２ｋＢのＮｒｕＩ−ＸｈｏＩ断片が、１％低融点（low melting）アガロースゲルでの電気泳動による分離によって単離された。ＤＮＡは、ゲルのフェノール抽出により回収された。Ｃ／ＥＢＰα断片のＸｈｏＩ末端およびベクターのＮｏｔＩ末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて平滑末端化された。次いで、この二つのＤＮＡ断片を一緒に連結してベクターをつくった。このベクターをｐＣＭＶｈＣ／ＥＢＰαと称する。このベクターでは、Ｃ／ＥＢＰαは、ＣＭＶプロモーターの制御の下で発現する（図３）。ｐＣＭＶｈＣ／ＥＢＰαベクターは、アンピシリン耐性である。ｐＣＭＶｈＣ／ＥＢＰαベクターは、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルの、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、１９９３年２月２日、「ブダペスト条約」が取り決める微生物寄託の条項に基づいて寄託された。この寄託物には、ＡＴＣＣ受付番号（accession number）７５４１２が与えられた。上記のベクターを正常に増殖した２倍体の繊維芽細胞またはヘパトーマ細胞にトランスフェクトさせると、細胞の生長の阻害が観察される。Ｃ／ＥＢＰαには、多くのセルタイプの細胞増殖物に対する広範な阻害効果があることが判った。そのようなセルタイプには、ヒト２倍体繊維芽細胞、ヒト・ヘパトーマ細胞、ヒーラ頸癌腫細胞（cervical carcinomacells）、骨肉腫（osteosarcoma）、および曩癌腫（bladder carcinoma）があり、細胞内で遺伝子が正常に発現するものはそれらにとどまらない。例３：Ｃ／ＥＢＰαの生長阻害能力上記の発現ベクターを様々のセルラインにトランスフェクトさせることにより、その成長阻害能力の範囲を確認した。発現ベクターは、ＳＡＯＳ−２（ｐ５３欠損およびｒｂ欠損ヒト骨肉腫系統）；６３９（ヒトＴ抗原形質転換株繊維芽細胞系統）；ＴＥ８５（ヒト骨肉腫）；ＩＥＣ−６（ラット腸上皮細胞系統）；Ｈｅｐ３Ｂ２（ヒト・ヘパトーマ系統）およびＭＪ（ヒト２倍体繊維芽細胞系統）に導入された。これらの細胞系統は、ＭＪおよびＩＥＣ−６を除いて、すべて形質転換株であり、且つ腫瘍に由来するものである。Ｃ／ＥＢＰαは、試験されたすべてのセルラインの生長を阻害し得ることが判明し、普遍的な阻害活性を有しているように思われた。例４：Ｃ／ＥＢＰαの成長阻害ドメインのマップ作成上記に示した通り、Ｃ／ＥＢＰαの重要な特徴は、その肝細胞およびその他のセルタイプの成長を阻害する能力である。そのような成長阻害の媒介に関連するＣ／ＥＢＰαタンパク質の領域を決定するために、Ｃ／ＥＢＰαをコードする遺伝子配列に一連の欠失が導入された。突然変異配列をクローン化して哺乳類ベクターに組み込み、形質転換によりヒト・ヘパトーマ系統およびヒト骨肉腫系統に導入した。発現ベクターは、ＮｏｔＩを用いてＣＭＶβ−ｇａｌベクターからβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を切除して調製される。この再連結したベクターをＣＭＶφと命名した。１．１ｋｂの完全な暗号領域、１１８塩基対の５´リーダー配列、およびヒトＣ／ＥＢＰα遺伝子の７７塩基対の非翻訳領域（すなわち、＋１から＋１２７４まで）を有している断片が、ＮｒｕＩおよびＸｈｏＩによって、３．７ｋｂベクターのｐＵＣＣ／ＥＢＰαから切り取られた；次いでこの断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて平滑末端化し、同様に平滑末端化されたＣＭＶΦのＮｏｔＩ切断部位にクローン化して、ＣＭＶαを作った。ＣＭＶａ３０Ｋｄは、平滑末端化され且つＣＭＶφ中にクローン化されたｐＵＣＣ／ＥＢＰαから、ＳｓｔＩＩ−ＸｈｏＩ断片（＋４５３から＋１２７４）を切り取って作られた。ｐＵＣＣ／ＥＢＰαから、ＥｃｏＲＩを用いて３．７ｋｂのＣ／ＥＢＰα断片が切り取られ、ｐブルースクリプトＫＳＩＩ−（ファーマシア社製）のＥｃｏＲＩ切断部位にクローン化された；次いでＮｏｔＩを用いて、上記遺伝子の３´部分を含んでいるＮｏｔＩ断片が、＋５８５およびＫＳＩＩポリリンカー中にあるＮｏｔＩ切断部位で切り取られた。この断片をＣＭＶφのＮｏｔＩ切断部位にクローン化し、ＣＭＶαＮ／Ｅと命名した。ＣＭＶαをＳｍａＩで消化して＋２１９から＋４７８までの断片を放出させ、平滑末端リンカー（ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ；ニューイングランドバイオラボ社製）をこのＳｍａＩ切断部位に連結して正しいリーディングフレームを回復させた；このベクターをＣＭＶαΔＡＤ１と命名した。ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０スプライス部位、および＋４６７ヌクレオチドまでのＣ／ＥＢＰαの５´部分を有するＣＭＶαの断片が、ＥｃｏＲＩ−ＮａｒＩを用いて切り出された。ＮａｒＩＩ切断部位（＋８９３）からポリリンカー中にあるＨｉｎｄＩＩＩ切断部位までの第２の断片（上記遺伝子の３´部分およびＳＶ４０ポリＡシグナルを有する）もまた、ＣＭＶαから切り出された。これら２つの断片は、ｐＵＣ１９（ＢＲＬ社製）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結された；そしてこのプラスミドは、ＣＭＶαΔＡＤ２として同定された。ＣＭＶαΔＡＤ１，２は、ナエル（Nael）断片（＋３７１から＋８５３）までを切り出し、且つ平滑末端リンカー（ＧＧＡＡＴＴＣＣ；ニューイングランドバイオラボ社製）を挿入して正しいリーディングフレームを回復させることにより作製された。上記の発現ベクターの欠失の比較例を図４に示す。図４には、Ｃ／ＥＢＰδ遺伝子（ＣＭＶδと命名する）の構造も示されている。これらのプラスミドは、ヒト・ヘパトーマ・セルライン（Ｈｅｐ３Ｂ２）および骨肉腫セルライン（ＳＡＯＳ−２）にトランスフェクトされた。この骨肉腫セルラインは、ｐ５３およびｒｂをともに欠損している。これらの細胞には、上記のＣ／ＥＢＰα欠失突然変異株の一つとＣＭＶβ−ｇａｌとを、５：１の比で一緒にトランスフェクトさせた。ＣＭＶβ−ｇａｌは被トランスフェクト細胞のマーカーとして用いた。１２０時間後に、β−ガラクトシダーゼ活性について細胞を染色し、青く染色されたコロニーの数を記録した。青の被染色細胞が、１細胞、２細胞または２より多くの細胞からなるコロニーが現れ、そのようなカテゴリーとして区分された（図５Ａ，Ｈｅｐ３Ｂ２細胞；図５Ｂ，ＳＡＯＳ−２細胞）。１のコロニーは、トランスフェクト後に分裂しなかった細胞を意味する。図５Ａおよび図５Ｂには、それぞれのベクターについて、一つのカテゴリーに含まれるコロニーの数が、記録されたコロニーの全数に対するパーセンテージとして示されている。データは、３つの異なる実験の平均±標準偏差として示されている。安定的にトランスフェクトされた細胞の成長を阻害するＣ／ＥＢＰα遺伝子の能力を評価するために、Ｇ４１８選別の２週間後に生じるコロニーの数を計測した。それらの細胞に、２０μｇのＣ／ＥＢＰαプラスミドまたは２０μｇのＣ／ＥＢＰα欠失株プラスミドおよび２μｇのＰＧＫＮｅｏ対照プラスミドにトランスフェクトさせた。これら２つの実験のコロニー数の平均値を表１に示す。この結果は、完全な遺伝子、並びに試験された欠失突然変異株のいくつか、およびＣ／ＥＢＰδ遺伝子が腫瘍細胞の成長を阻害できたことを示している。ヒトＣ／ＥＢＰα遺伝子の欠失突然変異株の研究はさらに、成長阻害のためには、該遺伝子の１部分だけが必要であることをあきらかにする。欠失構築物であるＣＭＶαＮ／Ｅは、３４６塩基対のトランス作用ドメイン（the transactivat ion domain）と同様に、塩基性ＤＮＡ結合領域（the basic DNA binding region ）およびロイシンジッパードメインを含み、これは成長阻害活性において完全に活性であることが判った。ＣＭＶαＮ／Ｅは、成長阻害活性を維持するものとしては、試験されたものの中では最小の構築物である。ＣＭＶＣαＮ／Ｅの成長阻害活性から、細胞の成長を阻害するＣ／ＥＢＰドメインは、遺伝子の６８９塩基対領域にコードされていることが判る。例５：ヒトおよびラットのＣ／ＥＢＰα遺伝子の阻害能力の比較ヒトおよびラットのＣ／ＥＢＰα相同体（homologs）の相対的な阻害能力を評価するために、上記のＣＭＶＣ／ＥＢＰ発現ベクターを、ＣＭＶβ−ｇａｌとともに５：１の比で、エレクトロポレーションにより細胞内に導入した。細胞の染色は、Ｘ−ｇａｌ基質（シグマケミカル社製）により行った。この基質はβ−ガラクトシダーゼ酵素の作用で青色生成物に変化するものであり、染色は、エレクトロポレーション後に２４、７２および１２０時間のインターバルで行った。細胞の成長については、各インターバルごとに、それぞれのコロニーに存在する青く染色された細胞、すなわちトランスフェクトされた１細胞を起源とする細胞のクローンの数を計測して評価した。トランスフェクトされた細胞で分裂があったものは、青い細胞のコロニーを形成した。これらは全て、起源細胞にトランスフェクトされたプラスミドを少量含んでいるものと考えられた。トランスフェクションの後に分裂しなかった細胞は、単独の青い細胞として残っていた。青色細胞を含むコロニーを次の２つのグループに分類した。すなわち、単独細胞のままのクローン、および２以上の細胞を有するクローンである。試験されたそれぞれのセルラインについて、２４時間後に染色を行い、５か所の顕微鏡視野での全細胞数に占める青色細胞の存在百分率を計算して、トランスフェクション効率を測定した。ラットまたはヒトＣ／ＥＢＰαの一時的な発現から、ラット遺伝子はトランスフェクト３日後に阻害活性が無くなることが示された。この時点で、対照細胞（Ｃ／ＥＢＰα配列を含んでいないプラスミドを受容したもの）の５１％は少なくとも１回の分裂をしており、ラットＣ／ＥＢＰαを受容した細胞の６１％は少なくとも１回分裂していた。それに対し、ヒトＣ／ＥＢＰα遺伝子を受容した細胞では、１４％だけが２回の分裂を完了していた。第２の実験では、対照プラスミドを受容した細胞の４２％が７２時間後までに少なくとも１回分裂した。ラットＣ／ＥＢＰα遺伝子を受容した細胞の３６％が分裂を行っていた。それに対し、ヒトＣ／ＥＢＰαをトランスフェクトした細胞では８％だけが成長した。例６：染色体のＣ／ＥＢＰα対立遺伝子に突然変異を有するトランスジェニック動物の作成Ｃ／ＥＢＰ遺伝子の生理学的な意味を、内因性の染色体Ｃ／ＥＢＰα対立遺伝子に「ノックアウト」突然変異を有するトランスジェニックマウスを構築することによって解析した。まず、ネズミＳＶ１２９ゲノムＤＮＡライブラリーを、ネズミのＣ／ＥＢＰα 遺伝子およびフランキングＤＮＡ配列を含むクローンを得るためにスクリーニングした。こうして１５ｋｂのＭｂｏＩ− ＨｉｎｃＩＩ断片を単離し、様々な断片をｐブルースクリプト（ファーマシア社製）ベクター中にサブクローン化した。ターゲティングベクターは、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子、Ｃ／ＥＢＰα遺伝子の５´側のＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩゲノム断片、ＰＧＫプロモーターに連結した選別性ネオマイシン耐性（ＮｐｔＩＩ）決定要素およびＣ／ＥＢＰα遺伝子の３´側のＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩゲノム断片を含んでいた（図７）。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子全体がネオマイシン耐性決定要素に置き換えられた。したがって、該置き換えベクターと染色体Ｃ／ＥＢＰ α遺伝子との組換えにより、染色体遺伝子配列の欠失が達成される。上記のベクターは、相同領域から外れたＢａｍＨＩ切断部位でリニアにされ、エレクトロポレーションによりマウスＡＢ２．１胚幹細胞に導入された。エレクトロポレーションを受けた細胞は、Ｇ４１８耐性についての選別され、ガンシクロビア（gancyclovir）への感受性評価を受けた。生残したクローンを、目的の組換えが起きたことの確認のために、サザン分析によるスクリーニングに掛けた。このスクリーニングは、組換え構築物を検出する６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶプローブを用い、また内因性ゲノム配列の８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩプローブを使用することにより達成された（図７）。３つの陽性クローンが同定され、これらのクローンが増幅された。それらの細胞をマイクロインジェクションにより発生中の胚盤胞中に注入し、次いで養母（a foster mother）に移植し、発生を継続させて出産させた。このようにして、キメラ動物を得た。次いで、それらを交尾させ、ヘテロ接合とホモ接合の両方の、Ｃ／ＥＢＰα欠損「ノックアウト」マウスを得た。ヘテロ接合トランスジェニック動物は、実質的に正常な表現型を有している。この動物は、妊娠可能で良く発育する。それに対し、ホモ接合トランスジェニック動物の表現型は、分娩前後に死亡する。この動物は肉眼解剖学的には正常なのであるが、生後６−８時間で死ぬ。ホモ接合動物は低血糖であり、グルコース注射により生存を３０−３５時間に延ばし得る。そのホモ接合動物の肝臓の組織学的特徴は、グリコーゲンを蓄積せず（正常マウスは蓄積する）、脂肪も含んでいないことであった。本発明は、上記に示された特定の態様に関連させて記載されているが、さらに改良または変形が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般に本発明の原理に従う発明のいかなる変形、利用、または適用をも包含し、また、当業者にとって公知でありまたは慣用されているような、並びにここに開示されまた添付の請求の範囲に記載された本質的な特徴に対して適用され得るような、上記の開示からの乖離をも含むことを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｈ 33/566 8310−2Ｊ 33/566 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ウィルデ、マーガレットアメリカ合衆国、テキサス州 77459、ミズーリー・シティー、ウエスト・バレー・ドライブ 3706

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合性タンパクをコードする、実質的に天然の不純物を含まないＤＮＡ分子。２．請求項１に記載のＤＮＡ分子であって、前記ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合性タンパクがＣ／ＥＢＰαであるＤＮＡ分子。３．請求項１に記載のＤＮＡ分子であって、前記分子が配列番号１の配列を有するＤＮＡ分子。４．ベクターである、請求項１に記載のＤＮＡ分子。５．請求項３に記載のベクターであって、前記ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合性タンパクを哺乳動物細胞中で発現させることができるベクター。６．請求項４に記載のベクターであって、前記細胞が肝細胞であるベクター。７．ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合性タンパクをコードするＤＮＡ分子に対して相補的な、実質的に天然の不純物を含まない核酸分子。８．請求項７に記載の核酸分子であって、前記ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合性タンパクがＣ／ＥＢＰαである核酸分子。９．請求項８に記載の核酸分子であって、配列番号１の配列に対して相補的である核酸分子。１０．検出可能にラベルされる、請求項７に記載の核酸分子。１１．実質的に天然の不純物を含まない、ヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合性タンパク。１２．Ｃ／ＥＢＰαである、請求項１１に記載のヒトＣＣＡＡＴ／エンハンサ結合性タンパク。１３．配列番号２の配列を有する、請求項１２に記載のＣ／ＥＢＰα。１４．腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、Ｃ／ＥＢＰαを発現することができるベクターを前記細胞に与えることと、該ベクターをして前記Ｃ／ＥＢＰ αを発現せしめることとを具備した方法。１５．請求項１４に記載の方法であって、前記細胞が肝細胞である方法。１６．請求項１５に記載の方法であって、前記ベクターがアデノウイルスベクターである方法。１７．肝細胞の増殖を誘導する方法であって、Ｃ／ＥＢＰαのアンタゴニストを発現することができるベクターを前記細胞に与えることと、該ベクターをして前記アンタゴニストを発現せしめることとを具備した方法。１８．請求項１７に記載の方法であって、前記ベクターがアデノウイルスベクターである方法。１９．請求項１８に記載の方法であって、前記アンタゴニストがＣ／ＥＢＰα アンチセンス分子である方法。２０．組織サンプルにおけるヘパトーマ細胞の存在を診断する方法であって、（Ａ）前記組織サンプルまたはその抽出物を、検出可能にラベルされたＣ／ＥＢＰαアンチセンス分子の存在下において、前記分子が前記サンプル中のＣ／ＥＢＰαｍＲＮＡとハイブリダイズするのに十分な条件下でインキュベートすることと、（Ｂ）前記サンプルまたはその抽出物のｍＲＮＡが、前記分子と結合できるか否かを決定することとを具備した方法。２１．化学物質の発癌性を決定する方法であって、（Ａ）少なくともＣ／ＥＢＰα対立遺伝子をコードする染色体対立遺伝子に突然変異を含んだ細胞を有するトランスジェニックマウス、または該トランスジェニックマウス由来の細胞ラインに対して、前記化学物質を与えることと、（Ｂ）前記化学物質が前記マウスに対して腫瘍形成性を有するか否か、または前記細胞ラインに対して悪影響を及ぼすか否かを決定することとを具備した方法。２２．細胞の過増殖に特徴付けられる疾病を治療する方法であって、Ｃ／ＥＢＰαを発現することができるベクターを前記細胞に与えることと、該ベクターをして前記Ｃ／ＥＢＰαを発現せしめることとを具備した方法。２４．前記マウスの染色体Ｃ／ＥＢＰα対立遺伝子のうちの少なくとも一つに突然変異をもった細胞を有するキメラマウス。２５．トランスジェニックマウスであって、該マウスは、少なくともＣ／ＥＢＰαをコードする染色体対立遺伝子における突然変異を含んだ細胞を有するトランスジェニックマウス。