WO2006088154A1 - 細胞分離方法及び装置 - Google Patents

細胞分離方法及び装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2006088154A1
WO2006088154A1 PCT/JP2006/302872 JP2006302872W WO2006088154A1 WO 2006088154 A1 WO2006088154 A1 WO 2006088154A1 JP 2006302872 W JP2006302872 W JP 2006302872W WO 2006088154 A1 WO2006088154 A1 WO 2006088154A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
cells
target
group
target cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/302872
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hideo Niwa
Akira Kobayashi
Setsuya Sato
Yoshitaka Matsumoto
Isamu Oh
Original Assignee
Absize Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Absize Inc. filed Critical Absize Inc.
Priority to CA002599043A priority Critical patent/CA2599043A1/en
Priority to EP06714013A priority patent/EP1849861A4/en
Priority to JP2007503756A priority patent/JPWO2006088154A1/ja
Publication of WO2006088154A1 publication Critical patent/WO2006088154A1/ja
Priority to IL185207A priority patent/IL185207A0/en
Priority to US11/893,372 priority patent/US20080057558A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/0088—Inverse microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes

Definitions

  • the present invention relates to a cell comprising a target cell or a target cell, wherein a single cell or a group of cells having two or more cell forces is arranged at a specific position on a substrate, and depending on the shape, size or cell marker of the cell Group and a non-target cell or a cell group containing a non-target cell, and the non-target cell or a cell group containing the non-target cell is irradiated with a laser beam to selectively kill or dysfunction the non-target cell.
  • the present invention relates to a method and an apparatus for separating target cells.
  • a cell sorter has been widely used as an apparatus for selectively separating cells.
  • these devices have the feature of being capable of mass and high-speed processing.
  • these devices are capable of chemical or biochemical treatment of cells, or treatment under conditions that are undesirable for cells.
  • There are problems such as necessity.
  • a cell separation method using magnetic beads to which an antibody that selectively binds to a specific cell is bound has been devised. This separation method is intended for analysis, diagnosis, and treatment with extremely low cell recovery. It is not preferable as a cell separation method.
  • a system that has been devised to selectively kill cells by irradiating specific cells in a cell group with laser light (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • Patent Literature l WO0lZ40454, Method and Apparatus for selectivly tarting ting specific cells within a cell population
  • Non-patent literature l Niemz M. H. Laser— tissue interaction: Fundamentals and applications. Springer— Verlag, 1996
  • the present invention distinguishes target cells and non-target cells from cell populations consisting of different types of cells by the shape, size, or cell-specific label of individual cells or cell groups contained in the cell population.
  • the present invention provides a cell separation method and apparatus for separating target cells by selectively irradiating non-target cells with physical energy to kill or damage non-target cells.
  • a cell population composed of a target cell and a non-target cell is defined as a single cell or a group of cells composed of two or more cells, and is used at a specific position or region using a substrate on which cell attachment regions are arranged.
  • the target cell is killed or induced to have a dysfunction.
  • the inventors have found that cells can be separated with high efficiency, and have completed the present invention.
  • a single cell or a cell group having two or more cell forces is arranged at a specific position on the substrate, and the shape, size or cell of the cell constituting the single cell or cell group is determined.
  • the marker distinguishes the target cell or a group of cells including the target cell from the non-target cell or a group of cells including the non-target cell, and places the non-target cell or the cell group including the non-target cell at the position or region where the cell is disposed.
  • the present invention also relates to a cell separation method in which non-target cells are selectively killed or impaired by irradiating a laser beam.
  • the present invention arranges a single cell or a group of cells having two or more cell forces at a specific position on a substrate, and the shape, size or cell strength of the cells constituting the single cell or cell group.
  • the target cell or a group of cells containing the target cell and the non-target cell or non-target cell The cells are identified from the cell group including the vesicle, and the non-target cell or the cell group including the non-target cell is irradiated with a laser beam to selectively kill or dysfunction the non-target cell.
  • the present invention relates to a cell separation method for culturing only target cells.
  • the present invention provides a mechanism for arranging a single cell or a group of cells having two or more cell forces at a specific position on a substrate, and shapes the arranged single cell or cells constituting the cell group.
  • a mechanism for discriminating between a target cell or a cell group containing a target cell and a cell group containing a non-target cell or a non-target cell according to size or a cell marker, and a cell group including a non-target cell or a non-target cell The present invention relates to a cell separation device having a mechanism for irradiating a position or region with laser light.
  • the method and apparatus of the present invention that is, the target cell and the non-target cell force are removed from the cell population by killing or dysfunctional non-target cell using laser light, and only the target cell is efficiently removed.
  • the method and apparatus for separating them will be described in detail below.
  • a cell contained in a cell population in which a target cell and a non-target cell are mixed is defined as a single cell or a cell group having two or more cell forces. Place it at a specific position on the material.
  • a cell group including a non-target cell or a non-target cell is identified by the shape, size, or cell marker of the cell included in the arranged single cell or cell group, and selective to the identified position or region.
  • the target cells are selectively separated by selectively killing or dying the non-target cells by irradiating them with laser light.
  • a method for obtaining a target cell by culturing a cell group in which a non-target cell is killed or dysfunctional under conditions suitable for the target cell as necessary forms part of the present invention. Is.
  • the target cell is not particularly limited, and examples thereof include chondrocytes derived from a cell population containing mesenchymal stem cells by TGF- ⁇ (transforming growth factor
  • the non-target cell is not particularly limited.
  • the non-target cell can be divided into a target cell (ie, chondrocyte) in the above-described cell division induction system from a cell population containing mesenchymal stem cells. Examples thereof include cells that have not been transformed, cells that have been separated into cells other than the target cells, and the like.
  • a target cell ie, chondrocyte
  • Examples thereof include cells that have not been transformed, cells that have been separated into cells other than the target cells, and the like.
  • a cell adhesion surface by a cell adhesion substance is patterned on a substrate having a cell non-adhesion surface.
  • a method of forming a cell non-adherent surface with a cell non-adherent substance so that the cell adhesive surface is exposed in a pattern on a substrate having a cell adhesive surface can be mentioned.
  • the base material having a non-cell-adhesive surface is not particularly limited as long as cells do not adhere to or adhere to it, but examples of the material include glass, silicon compounds, and non-cell-adhesive properties. It is preferable that a polymer (for example, a resin such as polystyrene) is also configured. Further, the surface of the base material may be a surface film having a hydrophilic polymer force or a modified one. Examples of the hydrophilic polymer include polybutyl alcohol, polyethylene glycol, polyacrylamide, polydimethylacrylamide, polyhydroxyethyl methacrylate, and a copolymer of monomers constituting these, cellulose, and the like. The powers listed are not limited to these. Examples of the non-cell-adhesive substance include the same materials as those used for the base material having the non-cell-adhesive surface.
  • the material of the cell-adhesive substance and the base material having a cell-adhesive surface is not particularly limited as long as the cell adheres and adheres thereto.
  • Examples thereof include adhesive proteins and derivatives thereof, temperature-sensitive polymers, photocurable rosins, and other cell-adhesive polymers (for example, polysaccharides).
  • a method for fixing a cell-adhesive polymer described in JP-A-7-308186 and a method described in JP-A-2002-355026 are described. Examples thereof include, but are not limited to, a method of imparting a cell-adhesive polymer pattern to the substrate surface by an inkjet method.
  • the substrate is When reactive functional groups such as glass or hydroxyl groups, amino groups, and thiol groups are present on the surface, alcohol, halogenated alkyls, and organic silane compounds are applied to the substrate surface by a method such as stamping to make them hydrophobic. A method of adding a substituent can also be used.
  • a method for forming a cell-adhesive surface on a substrate having a non-cell-adhesive surface includes physical vapor deposition methods such as vacuum deposition, sputtering, chemical vapor deposition methods, and electrochemical coating production methods such as plating.
  • a method of modifying the surface with the metal oxide to be formed can be used.
  • the metal oxide is preferably titanium oxide but is not particularly limited.
  • cell adhesion proteins represented by gelatin, collagen, fibronectin, laminin or derivatives of fragments of these proteins are adsorbed or immobilized on the cell adhesion surface, and then used for lj.
  • a temperature typified by poly (N-isopropylacrylamide) described in JP-A-4-094679 is disclosed.
  • a pattern forming method using a sensitive polymer can also be used.
  • the cell-adhesive surface formed by the present polymer is reduced to a non-cell-adherent surface as a result of a decrease in the hydrophobicity of the polymer layer coated at a certain temperature or lower.
  • the present invention collects target cells that are non-killed or dysfunctional after the treatment, and cultures the target cells under suitable conditions.
  • the formation of a cell-adhesive surface with a temperature-sensitive polymer is a particularly preferred form in that it does not require the use of trypsin or the like in the recovery of the substrate material.
  • a method for forming a non-cell-adhesive surface on a substrate having a cell-adhesive surface so that the cell-adhesive surface is exposed in a pattern on the substrate having a cell-adhesive surface a method disclosed in A method for fixing a cell non-adhesive polymer described in JP-A No. 7-308186, a cell non-adhesive surface comprising a silicon compound on a cell adhesive substrate described in JP-A No. 11-151086 Examples thereof include a method of fixing, a method of forming a microwell having a cell-adhesive surface base material produced by a photocurable resin as a bottom surface, and the like.
  • the photocurable resin used in the production of the microwell is not particularly limited as long as it has low cell adhesion and has cell compatibility after curing with light.
  • Examples thereof include a photocurable resin in which a cationic photopolymerization initiator is contained in a compound having an oxetane ring and an epoxy group-containing compound described in JP-A-10-168165.
  • the size is preferably 20 m 2 — 400 m 2, and when a cell group consisting of two or more cells is placed.
  • the size is preferably 200 ⁇ m 2 — 1000 ⁇ m 2 ⁇ .
  • Examples of the shape of the cell adhesion surface include a circle and a rectangle.
  • the sealed cell culture apparatus includes a structure and apparatus for circulating the culture solution.
  • a cell group including a non-target cell or a non-target cell is identified from a single cell or a group of cells arranged at a specific position on the substrate, and the non-target cell or the non-target cell is included.
  • a method for selectively irradiating a position or region of a cell group with laser light to separate target cells will be described.
  • a cell group including a non-target cell or a non-target cell is identified by the shape, size or cell marker of the cell, and these non-target cells Alternatively, the position of the cell group including the non-target cell is identified.
  • Identification by cell shape, size or cell marker is performed by microscopic observation or fluorescent microscopic observation of cells with fluorescent labeling.
  • the shape of the cell is discriminated into a spherical shape, a spindle shape, a stone paving shape, a dendritic shape or the like based on a microscope observation image or a fluorescence microscope observation image obtained by fluorescently labeling the cells.
  • the cell size is identified by the short diameter, the long diameter, or a combination of both based on a microscopic observation image or a fluorescent microscopic observation image obtained by fluorescently labeling the cell.
  • Methods for identifying by cell markers include direct or indirect fluorescence labeling using antibodies, peptides, lectins, sugar chains, etc. that selectively bind to marker molecules present in non-target cells, and non-target cell membrane selective binding dyes. Etc. are used.
  • a step of causing a marker molecule to recognize a cell is required for identification by a cell marker, it is preferable to identify by a cell shape and size.
  • identifying by cell shape and size more accurate quantification is possible using image analysis software.
  • An observation image of a single cell or a group of cells is captured by a CCD camera, transmitted to an image processing device such as a personal computer, and a single cell existing at this position with reference to the cell placement position of the used base material.
  • an image processing device such as a personal computer
  • the observation image is captured and the image information is stored in the image processing device. Repeat the transfer and scan the entire area of the substrate on which the cells are arranged. This repetition is performed by moving the stage on which the base material is installed in the XY direction, moving an image observation apparatus such as a CCD camera in the XY direction, or a combination thereof.
  • a halogen lamp light source an LED light source or an LD light source is used as a light source for image observation using transmitted light
  • a halogen lamp light source or an LED light source is used as a light source for fluorescent image observation.
  • an LD light source is used, and in acquiring a fluorescence observation image, an absorption filter or a spectroscope is used in order to cut out diffused excitation light other than the observation fluorescence wavelength.
  • a laser beam is selectively irradiated to a non-target cell or a group of cells containing the non-target cell, Death or cell dysfunction.
  • laser light irradiation there are spot irradiations to areas where non-target cells or cell groups containing non-target cells exist, or there are cell groups containing non-target cells or non-target cells.
  • a laser beam irradiation with a pattern according to the pattern of the region to be used is used.
  • the laser light is transmitted to an image processing device such as a personal computer through a lens system or transferred to a storage device as necessary, and irradiated to a non-target cell or a non-target cell arrangement position.
  • the entire adherent surface of the cell or cell group is irradiated with laser light by a combination of lens systems, depending on the cells of the substrate or the adherent surface of the cell group used. Adjust the spot diameter so that
  • an electric motor represented by a galvano mirror Laser scanning with a mirror, or a combination of both.
  • laser irradiation can be performed more efficiently by combining methods using electric mirrors (galvanomirrors) described in JP-A-4-334544.
  • a motorized mirror such as a Carpano mirror
  • a scanning lens such as an f ⁇ lens
  • Patterned laser light irradiation can simultaneously irradiate a plurality of non-target cells or areas where non-target cells exist, and includes non-target cells or non-target cells with high efficiency. Laser irradiation to the cell group becomes possible. In addition, even with this patterned laser irradiation, a combination of a galvano mirror and a ⁇ lens enables a wide range of cell treatments without moving the stage on which the substrate is placed. Embodiment.
  • an element in which a plurality of mirrors that can be changed independently such as a digital mirror device (DMD), is arranged, and the light intensity is controlled by controlling the phase of light.
  • DMD digital mirror device
  • a light modulation element or a liquid crystal filter is used.
  • the laser irradiated to the non-target cell or the cell group containing the non-target cell has sufficient energy intensity to kill the cell or induce dysfunction, and the adjacent target cell.
  • the strength is adjusted so as not to affect the target cell group.
  • the laser light source to be used is not particularly limited as long as it has a necessary laser intensity, such as an excimer laser, a solid state laser, a semiconductor laser, etc., but multi-photon absorption due to nonlinear optical effects is induced by laser irradiation, and is induced in cells.
  • the laser light source has a high repetition rate.
  • the upper limit of the pulse width of the laser light to be irradiated is preferably lOnsec or less, more preferably 5 nsec or less, still more preferably lnsec or less, and the lower limit is preferably 50 fsec or more. More preferably, it is lOOf sec or more.
  • the repetition frequency of the pulse laser light source is preferably a high repetition laser light source in order to increase the processing efficiency.
  • the laser has an output of 1 to 20 W, a pulse width of 100 fsec to 10 nsec, and a repetition of 20 to 50 kHz.
  • the energy applied to the cells or cell groups is adjusted by the laser irradiation time and the laser output.
  • the irradiation time of the laser beam is more preferably controlled by a shutter.
  • the acousto-optic modulator can process at a high speed of about 35 to 50 MHz, which is faster than the laser repetition frequency. For this reason, the processing speed for killing or dysfunctional cells depends on the repetition frequency of the laser light source.
  • the wavelength of the laser beam used is not particularly limited, but a wavelength of 30 Onm to 1 lOOnm is preferred!
  • a wavelength of 30 Onm to 1 lOOnm is preferred.
  • more effective cell death or dysfunction can be realized by adding a compound such as a dye that absorbs light of the same wavelength to the cell culture medium.
  • the power exemplified by the Alla red additive when using 532 nm laser light is not limited to this.
  • the intensity of the irradiated laser beam can be adjusted by an optical element.
  • an optical element Concrete Specifically, there are a method using an ND filter; a method using a 1Z2 ⁇ wave plate and a polarizing beam splitter; and a method using an acousto-optic modulator ( ⁇ ).
  • the method using the ND filter is made of a material that absorbs a certain amount of light or a material that reflects, and an ND filter that does not change the light for components other than the light intensity is used as a laser optical axis. Install it on top to reduce light.
  • the polarization direction of the laser light linearly polarized by the 1Z2 ⁇ wavelength plate is changed, and the light transmitted and reflected by the polarized beam splitter is reflected.
  • the intensity of the laser beam is changed by changing the ratio of the laser beam.
  • the modulation signal (ultrasonic wave) given to the element is used.
  • non-target cells can be selectively killed or impaired, and target cells can be isolated.
  • the target cell can be obtained by culturing a cell group in which the non-target cell is killed or dysfunctional under suitable conditions for the target cell.
  • the cell separation device of the present invention has a mechanism for arranging a single cell or a group of two or more cell forces at a specific position on a substrate, and forms a single cell or a cell constituting the cell group.
  • a mechanism for discriminating between a target cell or a cell group containing a target cell and a cell group containing a non-target cell or a non-target cell by size or a cell marker, and a cell group including a non-target cell or a non-target cell It is an apparatus comprising a mechanism for irradiating a position or region with laser light.
  • the mechanism which controls each said mechanism collectively can be provided as needed.
  • the cell separation device emits laser light in accordance with a pattern in which the identified cells or cell groups are arranged at the positions where the identified non-target cells or cell groups including the non-target cells are arranged.
  • the cell separation device has a mechanism for irradiating a laser beam at a position where the identified non-target cell or a cell group including the non-target cell is arranged according to the pattern in which the cell or the cell group is arranged.
  • a mechanism that also has an element force that deflects the patterned laser beam, and a scan for imaging the deflected laser beam to a position where a cell or a group of cells is arranged It is preferable that a mechanism including a lens is provided.
  • FIG. 1 is one embodiment of the cell separation device of the present invention.
  • the cell separation apparatus also has four system forces: (1) cell observation system, (2) laser light source and optical system, (3) cell manipulation system, and (4) control system.
  • the mechanism for arranging the cells, the mechanism for identifying the cells, and the mechanism for irradiating the laser beam are as follows: (3) Cell manipulation system, (1) Cell observation system, (2) Laser light source and optical system, respectively. Corresponding.
  • the cell observation system of (1) is equipped with a microscope for observing cells, and the microscope is equipped with a CCD camera for capturing a microscopic observation image.
  • a fluorescent light source for observing cells labeled with a fluorescent dye is attached.
  • the observation image of the cell is taken into the personal computer through the CCD camera, and the target cell and the non-target cell are discriminated and their location or area is specified.
  • the cell observation system is equipped with a base stage that can be electrically controlled so that cells can be observed over the entire area of the substrate on which the cells are arranged.
  • the laser light source and the optical system of (2) are equipped with a laser light source having a sufficient output for killing cells or dysfunction by laser irradiation.
  • This laser beam is provided with a shutter on the optical axis to irradiate as necessary.
  • the laser beam to irradiate was recognized in the microscope field of view and was recognized! It was introduced into the microscope through a galvano mirror, which is an electric mirror, so that it can be focused even at the position of the deviation. The As a result, the focused irradiation position of the laser light can be scanned in XY, but the image of the microscope field of view is formed.
  • the laser condensing position and condensing diameter at the position are adjusted by a lens outside the microscope.
  • cells are seeded in a culture vessel in which a cell adhesion surface formed in a pattern on a cell non-adhesion surface is arranged, and the cells are arranged on the pattern.
  • a motorized stage is installed to move the culture vessel in the XY direction.
  • a pump for supplying, collecting or circulating a cell seeding solution, a culture solution, a cell recovery solution, and the like is connected to the culture container in which the cells are arranged.
  • control system of (4) an image of the observed cell is taken in, and the presence of the target cell and the non-target cell is recognized for each patterned region.
  • the angle of the galvanometer mirror and the lens position outside the microscope are adjusted so that a single laser beam is emitted to the area where non-target cells are present.
  • control system performs shutter control, light source intensity control, and the like.
  • FIG. 2 shows another embodiment of the cell separation device of the present invention.
  • the cell separation apparatus also has four system forces: (1) cell observation system, (2) laser light source and optical system, (3) cell manipulation system, and (4) control system.
  • the cell observation system of (1) there is a CCD camera for observing cells and a fluorescent light source for recognizing the cells.
  • the culture vessel is observed through a scanning lens f ⁇ lens and a galvanometer mirror.
  • the state of the cell inside can be recognized.
  • scanning the galvanometer mirror it is possible to observe a wide range without moving the stage.
  • the laser light source and optical system of (2) after the laser beam from the laser light source is magnified by a lens so as to have a uniform intensity distribution, it is made parallel light by another lens.
  • the system is combined.
  • the expanded uniform beam is shaped using a DMD element or phase modulation element according to the recognized patterned area.
  • beam irradiation is performed at once on all recognized specific areas within the patterned area being observed.
  • the beam deflected by the galnon mirror can pass through the f0 lens, and the laser beam can be imaged on the plane where the cells exist.
  • a shutter is installed on the optical axis.
  • cells are seeded in a culture vessel in which a cell adhesion surface formed in a pattern on a cell non-adhesion surface is arranged, and the cells are arranged on the pattern.
  • a motorized stage is installed to move the culture vessel in the XY direction.
  • a pump for supplying, collecting or circulating a cell seeding solution, a culture solution, a cell recovery solution, and the like is connected to the culture container in which the cells are arranged. In such a cell manipulation system, culture, observation, and laser treatment are performed simultaneously.
  • Example 1 In the control system of (4), as in Example 1 described later, an image of the cell being observed is captured, and the presence of target cells and non-target cells is recognized for each patterned region. The recognition result is analyzed, and the shape of the beam to be shaped is calculated so that all areas where non-target cells are recognized are irradiated simultaneously. This calculation result is sent to the element that forms the beam and adjusted so that the beam is irradiated in an arbitrary shape. In order to observe the entire observation area, the area that can be recognized in one field of view is sequentially scanned by the galvanometer mirror. This allows observation and laser irradiation without changing the state of the cells.
  • non-target cells are selectively removed from a cell population in which different types of cells are mixed, thereby subjecting the target cells to chemical or physical treatment. It is possible to separate target cells in a highly efficient manner.
  • the cells or cell groups separated by this method and apparatus are suitable for cell function 'gene analysis, function analysis of substances using cells, or use in the medical field using cells.
  • Mesenchymal cells were separated from bone marrow cells as follows.
  • the fluorescent dye phycoerythrin (PE) -labeled anti-CD34 antibody was added to the microwell, and fluorescence was observed to identify CD34 positive cells.
  • PE phycoerythrin
  • These wels were irradiated with 355 nm laser light.
  • the laser irradiation intensity was 155 WZcm 2 and irradiation was performed over the entire area in the microwell for 10 seconds.
  • non-target cells are selectively removed from a cell population in which different types of cells are mixed, thereby subjecting the target cells to chemical or physical treatment. It is possible to separate target cells in a highly efficient manner.
  • the cells or cell groups separated by this method and apparatus are suitable for cell function 'gene analysis, function analysis of substances using cells, or use in the medical field using cells.
  • FIG. 1 shows an example of the configuration of the cell separation device of the present invention.
  • FIG. 2 shows an example of the configuration of the cell separation device of the present invention.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本発明の目的は、異なる種類の細胞が混在する細胞集団から、非目的細胞を選択的に除去し、目的細胞を選択的に分離する方法、及び、細胞分離装置を提供することである。 本発明は、異なる種類の細胞からなる細胞集団を単一細胞又は２個以上の細胞からなる細胞群として、特定の２次座標上に配置し、配置させた単一細胞あるいは細胞群に含まれる細胞を形状、サイズ又は細胞マーカーにより識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に、レーザー光に代表される物理的エネルギーを照射することにより、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させることにより、目的細胞を選択的に分離する方法、及びその装置に関する。

Description

明 細 書
細胞分離方法及び装置
技術分野
[0001] 本発明は、単一細胞もしくは 2個以上の細胞力 なる細胞群を基材上の特定の位置 に配置し、細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を 含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別し、非目的細胞 又は非目的細胞を含む細胞群に対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的 に死滅又は機能障害させ、目的細胞を分離する方法及びその装置に関するもので ある。
背景技術
[0002] 異なる細胞が混在する細胞集団から、特定の細胞を選択的に分離することは、細胞 の機能'遺伝子の解析、細胞を利用した分析、診断、治療分野では極めて重要な技 術である。特に、近年の細胞を使用した細胞 ·再生医療分野においては、治療効果 が高ぐまた、安全性の高い治療用細胞を他の細胞の混入を最小限にして調整する 技術の開発に対する期待は高い。
従来、細胞を選択的に分離する装置としては、セルソータが広く使用されている。し かし、これらの装置は、大量高速処理が可能であるとの特徴を有する力 その反面、 細胞の化学的又は生物化学的処理、又は、細胞に対しては好ましくない条件での処 理を必要とする等の問題点が存在する。また、特定細胞に選択的に結合する抗体を 結合させた磁気ビーズを使用した細胞分離方法が考案されているが、本分離方法は 、細胞回収率が極めて低ぐ解析、診断、治療を目的とする細胞分離方法としては好 ましいものではない。また、選択的に細胞を分離することを目的とし、細胞群に存在 する特定細胞にレーザー光を照射し殺傷するシステム (特許文献 1、非特許文献 1参 照）が考案されている力 本システムでは、細胞集団に含まれるレーザー光照射を行 なうターゲット細胞の特定と、レーザー光を照射するプロセスを除去した 、細胞数に 応じて実施する必要があり、分離効率は十分なものとは言えない。また、本システム においては、細胞のサイズ、形態の違いにより細胞に対して十分なレーザー光照射 が行われず、分離効率が低下する等の問題が指摘されている。
特許文献 l :WO0lZ40454、 Method and Apparatus for selectivly targe ting specific cells within a cell population
非特許文献 l :Niemz M. H. Laser— tissue interaction： Fundamentals and applications. Springer― Verlag , 1996
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明は、異なる種類の細胞カゝらなる細胞集団から、細胞集団に含まれる個々の細 胞又は細胞群の形状、サイズ又は細胞特異的ラベルにより目的細胞と非目的細胞を 識別し、非目的細胞へ選択的に物理的エネルギーを照射し、非目的細胞を殺傷又 は障害を与えることにより、目的細胞を分離する細胞分離方法及び装置を提供する ものである。
課題を解決するための手段
[0004] 目的細胞と非目的細胞から構成される細胞集団を単一細胞又は 2つ以上の細胞か らなる細胞群として、細胞付着領域が配列された基材を用いて特定の位置又は領域 に配置し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の存在する位置又は領域に対 して選択的にレーザー光を照射することにより、非目的細胞を死滅又は機能障害を 誘導することにより、目的細胞を高効率に分離することが可能であることを見いだし、 本発明を完成させた。
[0005] 即ち、本発明は、単一細胞もしくは 2個以上の細胞力もなる細胞群を基材上の特定 の位置に配置し、単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞の形状、サイズ又は細胞 マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的 細胞を含む細胞群とを識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置さ れた位置又は領域に対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は 機能障害させる細胞分離方法に関する。
また、本発明は、単一細胞もしくは 2個以上の細胞力 なる細胞群を基材上の特定の 位置に配置し、単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞の形状、サイズ又は細胞マ 一力一により、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細 胞を含む細胞群とを識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置され た位置又は領域に対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は機 能障害させた後、目的細胞のみを培養する細胞分離方法に関する。
[0006] さらに、本発明は、単一細胞もしくは 2個以上の細胞力 なる細胞群を基材上の特定 の位置に配置する機構、配置された単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞を形状 、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と非目的細 胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別する機構、非目的細胞又は非目的細胞を 含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射する機構を備え てなる細胞分離装置に関する。
[0007] 上記本発明の方法及び装置、つまり、目的細胞と非目的細胞力 なる細胞集団より、 レーザー光を用いて非目的細胞を死滅又は機能障害させることにより除去し、目的 細胞のみを効率的に分離する方法及び装置について、以下に詳細に説明する。
[0008] 本発明の細胞分離方法にぉ 、ては、まず、目的細胞と非目的細胞が混在する細胞 集団中に含まれる細胞を単一細胞又は 2つ以上の細胞力 なる細胞群として、基材 上の特定の位置に配置させる。次に、配置された単一細胞又は細胞群に含まれる細 胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞 群を識別し、識別された位置又は領域に選択的にレーザー光を照射することにより、 選択的に非目的細胞を死滅又は機能障害させることにより、目的細胞を選択的に分 離する。
また、必要に応じて、非目的細胞が死滅又は機能障害された細胞群を、目的細胞に 好適な条件下で培養することにより、目的細胞を取得する方法も、本発明の一部をな すものである。
目的細胞としては、特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞を含む細胞集団か ら TGF— β (トランスフォーミング増殖因子 |8 )等によって分ィ匕誘導された軟骨細胞 等が挙げられる。
非目的細胞としては、特に限定されないが、例えば、前記の間葉系幹細胞を含む細 胞集団からの軟骨細胞への分ィ匕誘導系にお 、て、目的の細胞 (即ち軟骨細胞）に分 化しなかった細胞や、目的の細胞以外の細胞に分ィ匕した細胞等が挙げられる。 [0009] まず、単一細胞もしくは細胞群を基材上の特定の位置に配置する方法としては、単 一細胞もしくは細胞群を、細胞非付着性表面を有する基材上にパターン状に配列さ れた細胞付着性表面に配置する方法が使用される。
このように単一細胞もしくは細胞群を基材上の特定の位置に配置することにより、識 別された非目的細胞の位置の認識が容易になり、より確実かつ安全にレーザー光に より非目的細胞を死滅又は機能障害させることが可能となり、好ましい。
[0010] 細胞非付着性表面上に細胞付着性表面をパターン状に配列する方法としては、細 胞非付着性表面を有する基材上に、細胞付着性物質による細胞付着性表面をバタ ーン状に形成する方法;細胞付着性表面を有する基材上に、細胞付着性表面がパ ターン状に露呈されるように、細胞非付着性物質により細胞非付着性表面を形成す る方法等が挙げられる。
[0011] 細胞非付着性表面を有する基材としては、細胞が付着、接着しないものであれば特 に限定されるものではないが、その材質としては、ガラス、シリコン系化合物、細胞非 付着性の高分子 (例えば、ポリスチレン等の榭脂)等力も構成されるものが好ま 、。 また、これら基材表面が、親水性高分子力 なる表面皮膜又は改質されたものでもよ い。該親水性高分子としては、例えばポリビュルアルコール、ポリエチレングリコール 、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシェチルメタタリレート、さ らにはこれらを構成する単量体の共重合体、セルロース等が挙げられる力 これらに 限定されるものではない。また、細胞非付着性物質としては、上記細胞非付着性表 面を有する基材に用いられる材質と同じもの等が挙げられる。
細胞付着性物質、及び、細胞付着性表面を有する基材の材質としては、細胞が付着 、接着するものであれば特に限定されるものではないが、例えば後述のような、金属 酸化物、細胞接着性蛋白質とその誘導体、温度感受性ポリマー、光硬化性榭脂、そ の他細胞接着性の高分子 (例えば、多糖類等)等が挙げられる。
[0012] 細胞付着性表面を形成する方法としては、特開平 7— 308186号公報に記載される 細胞接着性を有する高分子を固定ィ匕する方法、特開 2002— 355026号公報に記 載される細胞接着性を有する高分子のパターンをインクジェット法により基材表面に 付与する方法等の利用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。基材が、 ガラス、又は水酸基、アミノ基、チオール基等の反応性官能基を表面に有する場合 には、アルコール、ハロゲン化アルキル、有機シラン化合物を、スタンプ等の方法に より基材表面に付与し、疎水性置換基を付加する方法も利用可能である。
[0013] 細胞非付着性表面を有する基材上に細胞付着性表面を形成する方法としては、真 空蒸着、スパッタリング等の物理蒸着方法、化学蒸着方法、めっき等の電気化学的 被覆生成方法により形成する金属酸化物により表面改質する方法等が使用できる。 本金属酸ィ匕物としては、酸ィ匕チタンが好ましいが、特に限定されるものではない。ま た、本細胞付着性表面に、ゼラチン、コラーゲン、フイブロネクチン、ラミニンに代表さ れる細胞接着性蛋白質又はこれら蛋白質の断片の誘導体を、吸着又は固定化した ちのち禾 lj用でさる。
[0014] また、細胞非付着性表面を有する基材上に細胞付着性表面を形成する方法として は、特開平 4— 094679号公報に記載されるポリ（N—イソプロピルアクリルアミド）に 代表される温度感受性ポリマーによるパターン形成方法等も使用できる。特に、本ポ リマーにより形成された細胞付着性表面は、一定の温度以下で被膜されたポリマー 層の疎水性が減少し、結果、細胞非付着性表面へと変化する。
本発明は、レーザー光による非目的細胞の選択的な死滅又は機能障害に加え、同 処理後の非死滅又は機能障害されて 、な ヽ目的細胞を回収し、本目的細胞を好適 な条件において培養する方法を含んでおり、基材カもの回収において、トリプシン等 を使用する必要がない等の点において、温度感受性ポリマーによる細胞付着性表面 の形成は、特に好ましい形態である。
[0015] 細胞付着性表面を有する基材上に細胞付着性表面がパターン状に露呈されるよう に、細胞付着性表面を有する基材に細胞非付着性表面を形成する方法としては、特 開平 7— 308186号公報に記載される細胞非付着性の高分子を固定ィ匕する方法、 特開平 11— 151086号公報に記載される細胞接着性基板にシリコン系化合物から なる細胞非付着性表面を固定する方法、光硬化性榭脂により製造される細胞付着性 表面基材を底面とするマイクロウェルを形成させる方法等が挙げられる。
前記マイクロウェルの製造に使用される光硬化性榭脂としては、光による硬化後、細 胞付着性が低ぐまた細胞適合性を有するものであれば特定に限定されるものでは ないが、特開平 10— 168165号公報に記載されるォキセタン環を有する化合物及 びエポキシ基含有ィ匕合物にカチオン系光重合開始剤が含まれた光硬化性榭脂等が 挙げられる。
[0016] 細胞非付着性表面を有する基材上に形成される細胞付着性表面、及び細胞付着性 表面を有する基材上にパターン状に露呈される細胞付着性表面の、形状及びサイズ については、特に限定されるものではないが、単一細胞を配置する場合には、その サイズは 20 m2— 400 m2が好ましぐまた、 2個以上の細胞からなる細胞群を配 置する場合には、そのサイズは 200 μ m2— 1000 μ m2が好まし ヽ。細胞付着性表面 の形状については、例えば、円形及び矩形等が挙げられる。
[0017] 本発明に使用される細胞を配置するために使用する基材の形態としては、シャーレ、 培養フラスコ、密封型細胞培養装置等が利用できるが、細胞のバイアビリティーの維 持又は外部力 のコンタミネーシヨンの防止等の観点から、密封型細胞培養装置が 好ましい。なお、本密封型細胞培養装置には、培養液の循環のための構造、装置を 有しているのも含まれる。
[0018] 次に、基材上の特定の位置に配置された単一細胞又は細胞群から、非目的細胞又 は非目的細胞を含む細胞群を識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の 配置された位置又は領域に選択的にレーザー光を照射し、目的細胞を分離する方 法について説明する。
[0019] 基材上に配置された単一細胞又は細胞群から、細胞の形状、サイズ又は細胞マーカ 一により、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群を識別するとともに、これら非目 的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置を識別する。
細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーによる識別は、顕微鏡観察又は細胞を蛍光ラ ベルした蛍光顕微鏡観察により実施される。
細胞の形状又はサイズにより識別する方法としては、顕微鏡観察像又は細胞を蛍光 ラベルした蛍光顕微鏡観察像により、細胞の形状を球状、紡錘形、石敷状、樹枝状 等の形状に識別する。細胞のサイズ識別は、顕微鏡観察像又は細胞を蛍光ラベルし た蛍光顕微鏡観察像により、細胞の短径、長径又はその両者の組合せにより識別す る。 細胞マーカーにより識別する方法としては、非目的細胞に存在するマーカー分子に 選択的に結合する抗体、ペプチド、レクチン、糖鎖等を用いた直接又は間接的蛍光 ラベリングや、非目的細胞膜選択的結合色素等が使用される。
なお、細胞マーカーによる識別ではマーカー分子に細胞を認識させる工程が必要と なるので、細胞の形状、サイズにより識別するのが好ましい。細胞の形状、サイズによ り識別する場合、画像解析ソフト等を用いて、より正確な定量が可能である。
[0020] 単一細胞又は細胞群の観察画像は、 CCDカメラにより取り込み、パソコン等の画像 処理デバイスに伝送され、使用した基材の細胞配置可能位置を参照とし、本位置に 存在する単一細胞又は細胞群が非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群である かを認識し、本情報をレーザー照射装置に直接転送又は記憶装置に転送する。本 CCDカメラによる画像の取り込みでは、使用する CCD素子の一視野の認識可能範 囲ならびに細胞が配置されている基材のサイズに応じて、観察画像の取り込み、画 像処理デバイスへの画像情報の転送を繰り返し実施し、細胞を配列させた基材の全 領域を走査する。本繰り返しにおいては、基材が設置されたステージの XY方向への 移動、 CCDカメラ等カゝら構成される画像観察装置の XY方向への移動、又はこれら の組み合わせにより行われる。
[0021] 本発明において、透過光による画像観察のための光源としては、ハロゲンランプ光源 、 LED光源又は LD光源が使用され、また、蛍光画像観察のための光源としては、ハ ロゲンランプ光源、 LED光源又は LD光源が使用され、また、蛍光観察画像の取得 に際しては、観察蛍光波長以外の拡散した励起光をカットするために、吸収フィルタ 一又は分光器が使用される。
[0022] 次に、このようにして得られた基材上の細胞観察画像情報をもとに、非目的細胞又は 非目的細胞を含む細胞群に選択的にレーザー光を照射し、当該細胞を死滅又は細 胞機能障害させる。
[0023] レーザー光の照射にお!、ては、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が存在す る領域へのスポット照射、又は、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が存在す る領域のパターンに応じたパターンィ匕したレーザー光の照射、の 、ずれかの方法が 使用される。 レーザー光は、レンズ系を通じて、パソコン等の画像処理デバイスに伝送され又は必 要に応じて記憶装置に転送され、非目的細胞又は非目的細胞の配置位置に照射さ れる。
[0024] レーザー光のスポット照射では、使用する基材の細胞又は細胞群の付着性表面の 細胞に応じて、レンズ系の組み合わせにより、細胞又は細胞群の付着性表面全体に レーザー光が照射されるように、スポット径を調整する。
基材上に存在する非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の全てにレーザーを 照射するには、細胞が配置された基材が配置された XYステージの移動、ガルバノミ ラーに代表される電動ミラーによるレーザー光走査、又は、両者の組み合わせにより 行われる。電動ミラーによるレーザー光走査においては、特開平 4— 334544号公報 等に記載される電動ミラー (ガルバノミラー）を用いる方法を組み合わせることにより、 より高効率にレーザー照射を行なえる。カルパノミラーに代表される電動制御ミラーと f Θレンズに代表される走査レンズを組み合わせることにより、より広範囲のレーザー 走査が可能となり、基材が設置されたステージを移動することなく又は移動を最小限 にすることができ、好ましい実施形態である。
[0025] パターンィ匕したレーザー光の照射は、同時に複数の非目的細胞又は非目的細胞の 存在領域にレーザー光を照射することが可能であり、高効率に非目的細胞又は非目 的細胞を含む細胞群へのレーザー照射が可能となる。また、本パターンィ匕したレー ザ一照射においても、ガルバノミラー、更には ί θレンズとの組み合わせにより、基材 が配置された ΧΥステージを移動することなく広範囲の細胞処理が可能となり、より好 ましい実施形態である。
本発明におけるレーザーのパターン化においては、デジタルミラーデバイス（DMD) に代表される独立した角度の変更が可能なミラーを複数並べた素子、光の位相を制 御して光の濃淡を制御する空間光変調素子、もしくは液晶フィルタ一等が使用される
[0026] 本発明にお 、て非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群に照射されるレーザーは 、細胞を死滅又は機能障害を誘導するに十分なエネルギー強度を有し、かつ隣接 する目的細胞又は目的細胞群に影響を与えない強度に調整される。 使用するレーザー光源としては、エキシマーレーザー、固体レーザー、半導体レーザ 一等、必要なレーザー強度を有するものであれば特に限定されないが、レーザー照 射によって非線形光学効果による多光子吸収が誘起され、細胞に対して局所的な光 反応が生じることにより細胞を破壊し、死滅又は機能障害へと至らせる効果が増すこ とが予想されるノ ルスレーザーであることが好ましい。また、処理効率を上げるために 、高繰り返しのレーザー光源であることが好ましい。
[0027] このような多光子吸収過程が誘起されるには、光エネルギーが分子の熱エネルギー へと変換される時間スケールよりも短い必要があるとされ、その時間スケールが数十 n sec〜数百 psec程度と考えられて 、ることから、照射するレーザー光のパルス幅は、 上限は好ましくは lOnsec以下、より好ましくは 5nsec以下、さらに好ましくは lnsec以 下であり、下限は好ましくは 50f sec以上、より好ましくは lOOf sec以上である。
また、パルスレーザー光源の繰り返し周波数は、処理効率を上げるために高繰り返し のレーザー光源であることが好ましいが、高繰り返し化によりレーザーパルス毎のピ ークパワーが低下するため、 20〜50kHzの繰り返しが望ましい。
それらの条件として、 1〜20Wの出力であり、パルス幅が 100fsec〜10nsec、 20〜 50kHzの繰り返しを有するレーザーであることが望ましい。
[0028] 細胞又は細胞群に照射するエネルギーは、レーザー照射時間、レーザー出力により 調整される。レーザー光の照射時間は、シャッターにて時間を制御することがより好ま しい。
音響光学変調素子 (AOM)は、レーザーの繰り返し周波数よりも速ぐ最大で 35〜5 0MHz程度と高速な処理が可能となる。このため、細胞を死滅又は機能障害させる 処理速度は、レーザー光源の繰り返し周波数に依存する。
[0029] また、使用されるレーザー光の波長については、特に限定されるものではないが、 30 Onmから 1 lOOnmの波長が好まし!/、。 400nm以上の波長を有するレーザー光を使 用する場合には、同波長光を吸収する色素等の化合物を細胞培養液に添加するこ とにより、より効果的な細胞死滅又は機能障害を実現でき、例えば 532nmレーザー 光使用時のアルラレッドの添カ卩が例示される力 これに限定されるものではない。
[0030] また、照射するレーザー光の強度は、光学素子によって調整することができる。具体 的には、 NDフィルターを用いる方法； 1Z2 λ波長板と偏光ビームスプリツターを組 み合わせる方法；音響光学変調素子 (ΑΟΜ)を用 V、る方法がある。
[0031] NDフィルターを用いる方法は、一定量の光量を吸収する素材、もしくは反射する素 材からなり、光強度以外の成分については光に変化を与えない NDフィルターを、レ 一ザ一光軸上に設置することで光を減光させる。
1/2 λ波長板と偏光ビームスプリツターを組み合わせる方法では、 1Z2 λ波長板に より直線偏光したレーザー光の偏光方向を変化させて、偏光ビームスプリツターによ り透過する光と反射される光に分割される割合を変えることで、レーザー光強度を変 化させる。
音響光学変調素子 (ΑΟΜ)を用いる方法では、素子に与えられた変調信号 (超音波
)に応じて、素子内で屈折率の疎密波を生じる。この疎密波を回折格子として用い、 超音波の強度変調によって生じる回折光の強度を変化させることができる。この素子 にレーザー光を透過させ、回折された光を取り出すことで、光強度を調整されたレー ザ一光を得ることができる。
[0032] 上記のようにして、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させ、目的細胞を分離 することができる。
また、必要に応じて、非目的細胞が死滅又は機能障害された細胞群を、目的細胞の 好適な条件で培養することにより、目的細胞を取得することができる。
[0033] 次に、本発明の細胞分離装置について説明する。
本発明の細胞分離装置は、単一細胞もしくは 2個以上の細胞力 なる細胞群を基材 上の特定の位置に配置する機構、配置された単一細胞もしくは細胞群を構成する細 胞を形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と 非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群とを識別する機構、非目的細胞又は非目 的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に対してレーザー光を照射する機 構を備えてなる装置である。
また、必要に応じて、上記各機構をまとめて制御する機構も備えることができる。
[0034] 当該細胞分離装置は、識別された非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が配 置された位置に、その細胞又は細胞群が配置されたパターンに応じてレーザー光を 照射するため、レーザー光を配置パターンに応じてパターン化し、複数の非目的細 胞又は非目的細胞を含む細胞群に同時にレーザー光を照射できる機構を備えてい ることが好ましい。
また、当該細胞分離装置は、識別された非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群 が配置された位置に、その細胞又は細胞群が配置されたパターンに応じてレーザー 光を照射するための機構として、レーザー光のパターンを形成する素子とそのパター ン化されたレーザー光を偏向させる素子力もなる機構、及び偏向させたレーザー光 が細胞又は細胞群が配置された位置へ結像するための走査レンズからなる機構を 備えていることが好ましい。
[0035] 図 1は、本発明の細胞分離装置の一つの実施形態である。
当該細胞分離装置は、（1)細胞観察系、（2)レーザー光源と光学系、（3)細胞操作 系、（4)制御系の 4つの系力も構成されている。
なお、上述の細胞を配置する機構、細胞を識別する機構、レーザー光を照射する機 構は、それぞれ、（3)細胞操作系、（1)細胞観察系、（2)レーザー光源と光学系に対 応するものである。
[0036] (1)の細胞観察系では、細胞を観察するための顕微鏡が装備され、該顕微鏡には顕 微鏡観察像を取り込むための CCDカメラが装備されている。また、透過光源に加え、 蛍光色素ラベルした細胞を観察するための蛍光光源を取り付けてある。細胞の観察 像は CCDカメラを通じてパソコンに取り込まれ、目的細胞と非目的細胞を識別すると ともに、その存在位置又は領域を特定する。細胞観察系には、細胞が配置された基 材の全ての領域に渡って細胞を観察できるように、電動制御可能な基材ステージが 備え付けられている。
[0037] (2)のレーザー光源と光学系では、レーザー照射によって細胞を死滅又は機能障害 させるために十分な出力を持つレーザー光源が備え付けられている。このレーザー 光は、必要に応じて照射を行なうためにシャッターを光軸上に設置する。照射するレ 一ザ一光が顕微鏡視野内にお!ヽて、認識された!ヽずれの位置にお 、ても集光照射 可能となるように、電動ミラーであるガルバノミラーを通して顕微鏡に導入される。これ により、レーザー光の集光照射位置は、 XY走査が可能となるが、顕微鏡視野の結像 位置におけるレーザー集光位置及び集光径については、顕微鏡外部のレンズにより 調整される。
[0038] (3)の細胞操作系では、細胞非付着性表面にパターン状に形成された細胞付着性 表面を配置した培養容器に細胞を播種し、細胞をパターン上に配列させる。細胞を パターン化配列した培養容器の全領域にレーザー照射を行なうために、培養容器を XY移動するための電動ステージを設置する。細胞が配置された培養容器には、細 胞播種溶液、培養液、細胞回収液等を供給、回収又は循環するためのポンプが連 結される。
[0039] (4)の制御系では、観察して!/、る細胞の画像を取り込み、パターン化された領域毎で 、目的細胞、非目的細胞の存在を認識する。非目的細胞の存在する領域へレーザ 一光が照射されるように、ガルバノミラーの角度、顕微鏡外部のレンズ位置が調整さ れる。制御系は、この他、シャッターの制御や、光源の強度制御等を行なう。
[0040] また、図 2は、本発明の細胞分離装置の他の一つの実施形態である。
当該細胞分離装置は、（1)細胞観察系、（2)レーザー光源と光学系、（3)細胞操作 系、（4)制御系の 4つの系力も構成されている。
[0041] (1)の細胞観察系では、細胞を観察するための CCDカメラと、細胞を認識するため の蛍光光源があり、走査レンズである f Θレンズとガルバノミラーを通して、観察される 培養容器内の細胞の様子を認識することが出来る。ガルバノミラーを走査することで 、ステージを動力さなくても広範囲な観察が可能となる。
[0042] (2)のレーザー光源と光学系では、レーザー光源からのレーザービームが均一な強 度分布となるようにレンズで拡大された後、もう一つのレンズで平行光となるようにし、 レンズ系を組み合わせている。拡大された均一なビームは、 DMD素子や位相変調 素子を用いて、認識したパターン化された領域に応じてビーム形状を成形する。この 成形されたビームをガルバノミラーと f Θレンズを通すことで、観察しているパターンィ匕 された領域の内、認識した特定の領域全てに対し、一度にビーム照射を行なう。ガル ノ ノミラーで偏向されたビームは、 f 0レンズを通すことで、レーザービームを細胞の 存在する平面で結像させることが出来る。レーザービームは必要に応じて照射を行 なうために、シャッターを光軸上に設置している。 [0043] (3)の細胞操作系では、細胞非付着性表面にパターン状に形成された細胞付着性 表面を配置した培養容器に細胞を播種し、細胞をパターン上に配列させる。細胞を パターン化配列した培養容器の全領域にレーザー照射を行なうために、培養容器を XY移動するための電動ステージを設置する。細胞が配置された培養容器には、細 胞播種溶液、培養液、細胞回収液等を供給、回収又は循環するためのポンプが連 結される。このような細胞操作系において、培養と観察、レーザー処理を同時に行な
[0044] (4)の制御系では、後述の実施例 1と同様に、観察している細胞の画像を取り込み、 パターン化された領域毎で目的細胞、非目的細胞の存在を認識する。この認識した 結果を解析して、非目的細胞を認識した全ての領域に対して同時に照射されるよう に、成形するビームの形状を計算する。この計算結果を、ビームを形成する素子に送 り、任意の形状にてビームが照射されるように調整する。全観察領域を観察するため に、一つの視野で認識できる領域はガルバノミラーによって順に走査される。これに より、細胞の状態に変化を与えず、観察とレーザー照射を行なう。
発明の効果
[0045] 本発明の方法及び装置を用いることによって、異なる種類の細胞が混在する細胞集 団から、非目的細胞を選択的に除去することにより、目的細胞に化学的又は物理的 処理を施すことなぐ目的細胞を高効率に分離することが可能である。また、本方法 及び装置により分離された細胞又は細胞群は、細胞の機能'遺伝子解析、細胞を利 用した物質の機能解析、又は細胞を用いた医療分野への使用に適する。
発明を実施するための最良の形態
[0046] 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され るものではない。
[0047] (実施例 1)
以下のようにして、骨髄細胞より間葉系細胞を分離した。
1)日本白色兎の上腕骨頭力 骨髄穿針により骨髄液を採取し、等量の luZmLの 濃度のへノ リンナトリウム (清水製薬)を含む生理食塩水 (大塚製薬)を添加し、 1200 rpmで 10分間の遠心分離により、血球画分を分離した。 2)分離血球画分を、 15%ゥシ胎児血清 (インヴィトロジェン 10099— 141)及び抗 生物質—抗真菌剤（インヴィトロジェン 15240— 062)を添加した a MEM培地 (ィ ンヴィト口ジェン 12571— 063)【こ人った T 75フラス =3 (IWAKI 3110— 075)【こ 加え、 2日間培養し、付着性細胞のみを分離した。
[0048] 3)本付着性細胞を前記 ex MEM培地に分散し、これを、ガラス基盤状に光硬化性榭 脂（ディーメック SCR950)により調整した直径 100 μ mのマイクロウェルが配置され た基材上に加え、 12時間培養した。
4)マイクロウェル外の非付着性細胞を洗浄除去した後、蛍光色素のフィコエリスリン（ PE)標識抗 CD34抗体をマイクロウェル内に加えた後、蛍光観察により CD34陽性 細胞が存在するゥエルを同定し、これらゥエルに対して 355nmレーザー光を照射し た。レーザー照射強度は、 155WZcm2で、 10秒間、マイクロウェル内全領域にわた つて照射を行った。照射後にトリパンブルー染色により細胞の生死を確認したところ、 レーザーを照射したゥエル内全領域にわたって細胞が死滅したことが確認された。
[0049] 5)レーザー照射後、基材を PBSバッファー（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄し、死 滅細胞由来のデブリスを除去し、更にトリプシン処理によりレーザー非照射細胞を基 材より回収した。回収した細胞を、再び 15%ゥシ胎児血清 (インヴィトロジェン 1009 9— 141)及び抗生物質—抗真菌剤 (インヴィトロジェン 15240— 062)を添加した α MEM培地（インヴィトロジェン 12571— 063)に入った T— 75フラスコ（IWAKI 31 10 - 075)に加え、 2日間培養し、軟骨再生に有用な間葉系幹細胞を取得した。 産業上の利用可能性
[0050] 本発明の方法及び装置を用いることによって、異なる種類の細胞が混在する細胞集 団から、非目的細胞を選択的に除去することにより、目的細胞に化学的又は物理的 処理を施すことなぐ目的細胞を高効率に分離することが可能である。また、本方法 及び装置により分離された細胞又は細胞群は、細胞の機能'遺伝子解析、細胞を利 用した物質の機能解析、又は細胞を用いた医療分野への使用に適する。
図面の簡単な説明
[0051] [図 1]本発明の細胞分離装置の構成の一例を示す。
[図 2]本発明の細胞分離装置の構成の一例を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 単一細胞もしくは 2個以上の細胞力 なる細胞群を基材上の特定の位置に配置し、 単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目 的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群と を識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に 対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させる細胞 分離方法。
[2] 単一細胞もしくは 2個以上の細胞力 なる細胞群を基材上の特定の位置に配置し、 単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞の形状、サイズ又は細胞マーカーにより、目 的細胞又は目的細胞を含む細胞群と、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群と を識別し、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配置された位置又は領域に 対してレーザー光を照射し、非目的細胞を選択的に死滅又は機能障害させた後、目 的細胞のみを培養する細胞分離方法。
[3] 単一細胞もしくは 2個以上の細胞力 なる細胞群を基材上の特定の位置に配置する 機構、配置された単一細胞もしくは細胞群を構成する細胞を形状、サイズ又は細胞 マーカーにより、目的細胞又は目的細胞を含む細胞群と非目的細胞又は非目的細 胞を含む細胞群とを識別する機構、非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群の配 置された位置又は領域に対してレーザー光を照射する機構を備えてなる細胞分離 装置。
[4] 単一細胞もしくは 2個以上の細胞からなる細胞群が、基材上の細胞非付着性表面に パターン状に配列された細胞付着性表面に配置されることを特徴とする請求項 1又 は 2記載の細胞分離方法又は請求項 3記載の細胞分離装置。
[5] 単一細胞もしくは 2個以上の細胞力 なる細胞群が、細胞付着性表面が露呈された マイクロウェルに配置されることを特徴とする請求項 1又は 2記載の細胞分離方法又 は請求項 3記載の細胞分離装置。
[6] 識別された非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が配置された位置に、その細 胞又は細胞群が配置されたパターンに応じてレーザー光を照射するため、レーザー 光を配置パターンに応じてパターンィ匕し、複数の非目的細胞又は非目的細胞を含む 細胞群に同時にレーザー光を照射できる機構を備えていることを特徴とする請求項 3 記載の細胞分離装置。
[7] 識別された非目的細胞又は非目的細胞を含む細胞群が配置された位置に、その細 胞又は細胞群が配置されたパターンに応じてレーザー光を照射するための機構とし て、レーザー光のパターンを形成する素子とそのパターン化されたレーザー光を偏 向させる素子からなる機構、及び偏向させたレーザー光が細胞又は細胞群が配置さ れた位置へ結像するための走査レンズからなる機構を備えていることを特徴とする請 求項 3又は 6記載の細胞分離装置。
[8] 細胞に照射するためのレーザー光力 パルスレーザーであることを特徴とする請求項 1又は 2記載の細胞分離方法又は請求項 3記載の細胞分離装置。
PCT/JP2006/302872 2005-02-18 2006-02-17 細胞分離方法及び装置 WO2006088154A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002599043A CA2599043A1 (en) 2005-02-18 2006-02-17 Method and apparatus for separating cells
EP06714013A EP1849861A4 (en) 2005-02-18 2006-02-17 METHOD AND APPARATUS FOR SEPARATING CELLS
JP2007503756A JPWO2006088154A1 (ja) 2005-02-18 2006-02-17 細胞分離方法及び装置
IL185207A IL185207A0 (en) 2005-02-18 2007-08-12 Method and apparatus for separating cells
US11/893,372 US20080057558A1 (en) 2005-02-18 2007-08-15 Method and apparatus for separating cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005042378 2005-02-18
JP2005-042378 2005-02-18

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/893,372 Continuation US20080057558A1 (en) 2005-02-18 2007-08-15 Method and apparatus for separating cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006088154A1 true WO2006088154A1 (ja) 2006-08-24

Family

ID=36916551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/302872 WO2006088154A1 (ja) 2005-02-18 2006-02-17 細胞分離方法及び装置

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20080057558A1 (ja)
EP (1) EP1849861A4 (ja)
JP (1) JPWO2006088154A1 (ja)
CN (1) CN101208426A (ja)
CA (1) CA2599043A1 (ja)
IL (1) IL185207A0 (ja)
WO (1) WO2006088154A1 (ja)
ZA (1) ZA200706641B (ja)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010022226A (ja) * 2008-07-16 2010-02-04 Olympus Corp 超音波ダイセクション装置および超音波ダイセクション方法
JP2010081884A (ja) * 2008-09-30 2010-04-15 Sony Corp サンプリング装置及びサンプリング方法
CN101881751A (zh) * 2010-06-08 2010-11-10 南昌大学 一种筛选鉴定粘附蛋白的方法
WO2011125615A1 (ja) * 2010-04-02 2011-10-13 独立行政法人産業技術総合研究所 細胞分別方法、細胞培養基材、および細胞分別装置
JP2013514868A (ja) * 2009-12-21 2013-05-02 コルゲート・パーモリブ・カンパニー 口腔用光照射装置を用いた微生物によって引き起こされる状態の治療および／または予防方法
JP6033980B1 (ja) * 2016-06-01 2016-11-30 株式会社片岡製作所 細胞処理システム
WO2018146855A1 (ja) * 2017-02-13 2018-08-16 株式会社片岡製作所 細胞処理装置および対象物の処理方法
WO2018146854A1 (ja) * 2017-02-13 2018-08-16 株式会社片岡製作所 細胞処理装置
JP2019146586A (ja) * 2017-02-13 2019-09-05 株式会社片岡製作所 細胞処理装置
JP2019187425A (ja) * 2017-02-13 2019-10-31 株式会社片岡製作所 細胞処理装置および対象物の処理方法
WO2020003883A1 (ja) * 2018-06-29 2020-01-02 株式会社片岡製作所 細胞処理装置および細胞のレーザ処理方法
WO2020003884A1 (ja) * 2018-06-29 2020-01-02 株式会社片岡製作所 細胞処理装置
US11028358B2 (en) 2019-02-27 2021-06-08 Synthego Corporation Cell culture laser photoablation

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102009060490A1 (de) 2009-12-22 2011-06-30 Carl Zeiss Microlmaging GmbH, 07745 Hochauflösendes Mikroskop und Bildteileranordnung
JP5734588B2 (ja) * 2010-07-15 2015-06-17 オリンパス株式会社 細胞観察装置および観察方法
US20130052725A1 (en) * 2011-08-30 2013-02-28 General Electric Company System for optical based delivery of exogenous molecules to cells
US8778682B2 (en) 2011-08-30 2014-07-15 General Electric Company Optical based delivery of exogenous molecules to cells
US10876086B2 (en) * 2015-06-01 2020-12-29 Kataoka Corporation Cell treatment method, laser processing machine, and cell culture vessel
JP6680479B2 (ja) 2015-06-29 2020-04-15 株式会社片岡製作所 細胞処理方法、レーザ加工機
JP7343119B2 (ja) 2019-04-26 2023-09-12 株式会社片岡製作所 細胞培養基材、細胞培養容器、細胞の培養方法、細胞の製造方法、細胞培養基材の製造方法、および細胞培養容器の製造方法
CN115551997A (zh) * 2020-01-21 2022-12-30 辛瑟高公司 用于转染和用于产生细胞的克隆群体的装置和方法
JP2021129555A (ja) * 2020-02-18 2021-09-09 株式会社島津製作所 細胞精製装置および細胞精製方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002511843A (ja) * 1997-03-27 2002-04-16 バーナード オー ポールソン 細胞集団から腫瘍細胞を除去する標的装置

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4624915A (en) * 1982-07-29 1986-11-25 Board Of Trustees Of Michigan State University Positive selection sorting of cells
EP2281879B1 (en) * 1999-11-30 2016-01-27 Intrexon Corporation Apparatus for determining a morphological or physiological characteristic of individual cells in a biological specimen
US20040077073A1 (en) * 2002-10-18 2004-04-22 Melvin Schindler Methods and apparatus for interactive micromanipulation of biological materials

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002511843A (ja) * 1997-03-27 2002-04-16 バーナード オー ポールソン 細胞集団から腫瘍細胞を除去する標的装置

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOSOKAWA Y. ET AL.: "Laser Manipulation o Riyoshita Shinki Microchip no Sakusei to Oyo (1)-Konchu Yurai no Takakutai Tanpakushitsu Kessho o Mochiita Protein Chip", DAI 63 KAI OYO BUTSURIGAKU KANKEI RENGO KOENKAI KOEN YOKOSHU (24P-W-7), 24 September 2002 (2002-09-24), pages 1141, XP003000768 *
MIYAMOTO Y. ET AL.: "The effect of high-intensity laser pulses for cell death in photodynamic therapy", JOURNAL OF JAPAN SOCIETY FOR LASER SURGERY AND MEDICINE, vol. 20, no. 1, 28 March 1999 (1999-03-28), pages 1 - 8, XP003000769 *
OKOSHI M. ET AL.: "Excimer Laser ni yoru Fluorosis Jushi no Hyomen Kaishitsu", REZA KAGAKU KENKYU, no. 13, 31 August 1991 (1991-08-31), pages 107 - 110, XP003000767 *
SATO S. ET AL.: "Saibo Kogaku no Tameno Hi Sesshoku Hi Hakai na Fukusu Beam Laser-ko Trapping-ho no Kenkyu", RESEARCH PAPERS OF THE SUZUKEN MEMORIAL FOUNDATION, 21 December 1991 (1991-12-21), pages 50 - 56, XP003000766 *
See also references of EP1849861A4 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010022226A (ja) * 2008-07-16 2010-02-04 Olympus Corp 超音波ダイセクション装置および超音波ダイセクション方法
JP2010081884A (ja) * 2008-09-30 2010-04-15 Sony Corp サンプリング装置及びサンプリング方法
JP2013514868A (ja) * 2009-12-21 2013-05-02 コルゲート・パーモリブ・カンパニー 口腔用光照射装置を用いた微生物によって引き起こされる状態の治療および／または予防方法
WO2011125615A1 (ja) * 2010-04-02 2011-10-13 独立行政法人産業技術総合研究所 細胞分別方法、細胞培養基材、および細胞分別装置
US9434936B2 (en) 2010-04-02 2016-09-06 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Method for removing cells
CN101881751A (zh) * 2010-06-08 2010-11-10 南昌大学 一种筛选鉴定粘附蛋白的方法
JP6033980B1 (ja) * 2016-06-01 2016-11-30 株式会社片岡製作所 細胞処理システム
JP2018130039A (ja) * 2017-02-13 2018-08-23 株式会社片岡製作所 細胞処理装置および対象物の処理方法
US11499133B2 (en) 2017-02-13 2022-11-15 Kataoka Corporation Cell treatment apparatus and method for treating object to be treated
JP2018130038A (ja) * 2017-02-13 2018-08-23 株式会社片岡製作所 細胞処理装置
WO2018146855A1 (ja) * 2017-02-13 2018-08-16 株式会社片岡製作所 細胞処理装置および対象物の処理方法
JP2019146586A (ja) * 2017-02-13 2019-09-05 株式会社片岡製作所 細胞処理装置
JP2019187425A (ja) * 2017-02-13 2019-10-31 株式会社片岡製作所 細胞処理装置および対象物の処理方法
US11499129B2 (en) 2017-02-13 2022-11-15 Kataoka Corporation Cell treatment apparatus
WO2018146854A1 (ja) * 2017-02-13 2018-08-16 株式会社片岡製作所 細胞処理装置
WO2020003884A1 (ja) * 2018-06-29 2020-01-02 株式会社片岡製作所 細胞処理装置
JP2020000169A (ja) * 2018-06-29 2020-01-09 株式会社片岡製作所 細胞処理装置および細胞のレーザ処理方法
JP2020000165A (ja) * 2018-06-29 2020-01-09 株式会社片岡製作所 細胞処理装置
WO2020003883A1 (ja) * 2018-06-29 2020-01-02 株式会社片岡製作所 細胞処理装置および細胞のレーザ処理方法
US11560540B2 (en) 2018-06-29 2023-01-24 Kataoka Corporation Cell treatment apparatus and method for treating cells with lasers
US11603514B2 (en) 2018-06-29 2023-03-14 Kataoka Corporation Cell treatment apparatus
US11028358B2 (en) 2019-02-27 2021-06-08 Synthego Corporation Cell culture laser photoablation
US11970685B2 (en) 2019-02-27 2024-04-30 Synthego Corporation Cell culture laser photoablation

Also Published As

Publication number Publication date
EP1849861A1 (en) 2007-10-31
EP1849861A4 (en) 2009-02-18
IL185207A0 (en) 2008-01-06
CN101208426A (zh) 2008-06-25
CA2599043A1 (en) 2006-08-24
ZA200706641B (en) 2008-06-25
US20080057558A1 (en) 2008-03-06
JPWO2006088154A1 (ja) 2008-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006088154A1 (ja) 細胞分離方法及び装置
WO2011058721A1 (ja) 細胞接着性光制御基材，細胞の解析分別方法及び細胞の解析分別装置
AU2002232892B2 (en) Method and device for selectively targeting cells within a three -dimensional specimen
KR100476273B1 (ko) 단세포 장기배양 현미경 관찰장치
US20140099695A1 (en) Cell-adhering light-controllable substrate
KR20050062522A (ko) 홀로그래피광트랩들로 재료들을 제조, 분류 및 통합하는장치 및 방법
WO2012132551A1 (ja) 細胞接着性光制御基材
US20040077073A1 (en) Methods and apparatus for interactive micromanipulation of biological materials
Hakobyan et al. Laser-assisted bioprinting for bone repair
WO2020213674A1 (en) Microfluidic system, microfluidic chip, and operating method
JPWO2006104048A1 (ja) 微小粒子の配置方法
WO2004018665A1 (ja) 核酸回収チップと核酸回収装置
WO2021117680A1 (ja) 生体物質固定化材料
JP2020156518A (ja) 細胞培養器具および細胞培養器具の製造方法
JP6374187B2 (ja) 細胞内への外来物質の導入方法
JP2005102612A (ja) 細胞着床方法及び細胞組織作製方法
EP3497445B1 (en) Methods for micropatterning and micropatterned devices
JP2023077272A (ja) 細胞特性の評価方法
WO2018105748A1 (ja) レーザーを用いた細胞内への外来物質の導入方法
Schikorski Functional nanoscale imaging of synaptic vesicle cycling with superfast fixation
CN117015710A (zh) 生物粒子分析方法及用于生物粒子分析的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200680011626.6

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007503756

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007/06641

Country of ref document: ZA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 185207

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 6293/DELNP/2007

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11893372

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2599043

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006714013

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006714013

Country of ref document: EP