WO2006085476A1

WO2006085476A1 - 膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブｄｎａを作成する方法、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法、及びプローブｄｎａ固定化担体

Info

Publication number: WO2006085476A1
Application number: PCT/JP2006/301805
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Okamura; Kouichi Hirayama; Masaharu Seno
Original assignee: Okayama University NUC; Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Okayama University NUC; Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2005-02-08
Filing date: 2006-02-02
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2007-08-08
Also published as: JP2006217821A

Abstract

　本発明は、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を迅速かつ網羅的に検出する方法を提供することを目的とする。膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の５％以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードするエキソン配列からなり、かつシトシンおよびグアニンを合計で４０～６０％の割合で含有する該部分領域を選択し、該部分領域の塩基配列または該部分領域に相補的な塩基配列からなるＤＮＡを作成することを含む、膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブＤＮＡを作成する方法。

Description

明細書

膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブ DNAを作成する方法、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法、及びプローブ DNA固定化担体

技術分野

[0001] 本発明は、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出するためのプローブ DN Aを作成する方法、該プローブ DNAを用いて該遺伝子の発現を検出する方法、該プローブ DNAが固定ィ匕された担体ならびに該担体を用いて該遺伝子の発現を検出する方法に関する。

背景技術

[0002] 膜タンパク質は、真核細胞の全タンパク質の約 30%にも及ぶ種類があり、レセプタ一、イオンチャンネル、トランスポーターなどとして、細胞膜を介する情報伝達や物質輸送において重要な機能を担っている。膜タンパク質は、その構造から大きく 2種類に分けられる。一つは細胞膜表面に結合した表在性膜タンパク質であり、他方は細胞膜の脂質二重層に埋め込まれた内在性膜タンパク質である。内在性膜タンパク質の構造は、細胞外領域、細胞内領域および膜貫通領域から構成される。膜貫通領域は疎水性アミノ酸に富み、膜内においては α—ヘリックスを形成すると考えられる。膜貫通領域を複数個有するタンパク質の場合、このドメインは、膜タンパク質が生合成される際、その C末端側に続く新生ペプチド鎖の膜透過を開始させるシグナル配列、またはその透過を停止させるストップトランスファー配列として機能する。多くの場合、それぞれの機能を持ったドメインが交互に配置されており、このドメインを介して細胞外領域と細胞内領域が交互に並んでいる。

[0003] ある種の膜タンパク質は癌細胞で特異的に発現しているものがあり、これらは腫瘍抗原として各種診断薬や抗癌剤を開発するうえで有用であると考えられている。そして、様々な病気や疾患の治療に使われる薬剤のターゲットの 70%は、膜タンパク質であると言われており、膜タンパク質の発現パターンを解析することで、組織特異的な治療薬の標的を明らかにすることが期待される。 [0004] 膜タンパク質の発現を解析する方法として、膜タンパク質自体を解析する方法が考えられる。しかし、膜タンパク質は、疎水性が高いため精製が困難であるとともに、細胞膜の脂質二重層に存在するという特殊な環境下にあるため立体構造が複雑で、細胞内に存在する水溶性タンパク質に比べその発現解析が非常に困難である。 RT— PCR法やノーザンプロット法により解析する方法は、網羅的解析には不向きで、上記のように極めて多様な膜タンパク質の発現解析には不十分である。また、 cDNAマイクロアレイを用いる方法は、 cDNAの単離に時間と手間が力かるとともに、固定化する DNA量が不安定になると!/、う問題がある。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を迅速かつ網羅的に検出する方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードするェキソン配列の少なくとも一部を含み、かつシトシンおよびグァニンを一定量含む部分領域からなる DNA、または該部分領域に相補的な DNAをプローブとして用いることにより、膜タンパク質をコードする核酸を特異的に検出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

[0007] すなわち、本発明は以下の発明を包含する。

(1)膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の 5%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードする部分を含むェキソン中の配列からなり、かつシトシンおよびグァニンを合計で 40〜60%の割合で含有する該部分領域を選択し、該部分領域からなる DNAまたは該部分領域に相補的な塩基配列からなる DNAを作成することを含む、膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブ DNAを作成する方法。

(2) (1)記載の方法によって作成されたプローブ DNAと試料由来の核酸とをノ、イブリダィズさせることによって、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法 (3)膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の 5%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードする部分を含むェキソン中の配列からなり、かつシトシンおよびグァニンを合計で 40〜60%の割合で含有する該部分領域からなる DNA及び該部分領域に相補的な塩基配列からなる DNAから選択されるプローブ DNAが固定化されてなる担体。

(4)以下の (a)〜(e)の DNAからなる群力選択されるプローブ DNAが固定化されてなるプローブ DNA固定化担体：

(a)配列番号 1〜： L015のいずれかで表される塩基配列からなる DNA

(b)配列番号 1〜1015のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列力もなる DNA

(c)配列番号 1〜： L015のいずれかで表される塩基配列力もなる DNAの一部を含む 1 0〜5000塩基の DNA

(d)配列番号 1〜1015のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列力もなる DNAの一部を含む 10〜5000塩基の DNA

(e) (a)〜( の DNAと相同性を有する塩基配列からなり、対応する膜タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダィズする DNA。

(5)担体が、基板上にプローブ DNAと共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体である、 (3)または (4)記載のプローブ DNA固定化担体。

(6) (3)〜（5)のいずれかに記載のプローブ DNA固定化担体を用いて、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法。

(7) 以下の (a)〜(e)の DNAからなる群から選択されるプローブ DNA:

(c)配列番号 1〜： L015のいずれかで表される塩基配列力もなる DNAの一部を含む 1 0〜5000塩基の DNA (d)配列番号 1〜1015のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列力もなる DNAの一部を含む 10〜5000塩基の DNA

発明を実施するための最良の形態

[0008] プローブ DNAの作成：

本発明の一態様において、プローブ DNAは、膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の通常 5%以上、好ましくは 60%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードするェキソン配列力なり、かつシトシンおよびグァニンを合計で通常 40〜60%、好ましくは 45〜55%の割合で含有する該部分領域からなる DNAである。本発明においては、該 DNAに相補的な DNAもプローブ DNAとして使用される。

[0009] 本発明において、膜タンパク質とは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわち、生体膜を構成しているタンパク質を意味する。膜タンパク質としては、生体膜の表面に付着している膜表在性タンパク質、内部に埋もれている膜内在性タンパク質があり、例えば、受容体、輸送体、膜結合性酵素、サイト力イン受容体ファミリ一、イオンチャネル、細胞外マトリックスタンパク質、細胞接着因子、膜結合性細胞増殖因子、より具体的には、チロシンキナーゼ型増殖因子受容体、扁平上皮細胞癌抗原（SCCA1)、 CD34、 EGFファミリー、 EGF受容体ファミリー、 I型及び II型 TGF ι8受容体ファ

ミリ一、インターロイキン受容体ファミリー、 TNF受容体ファミリー、 Notchファミリー、 EGF— CFCファミリーなどが挙げられる。本発明では、好ましくは、上記のタンパク質の中でも細胞の表面の性質を特徴付ける膜タンパク質、すなわち対象となる細胞の細胞膜において発現量の多い膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブを作成する。

[0010] 本発明において膜タンパク質は、好ましくは、下記の表 1に記載される膜タンパク質力も選択される。各膜タンパク質をコードする DNAの塩基配列は、表 1に記載の Acc ession番号で、 GenBankに登録されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

[0011] 膜結合に必須の領域とは、膜タンパク質における、該膜タンパク質と細胞膜との結合を担う領域を意味する。そのような領域としては、通常疎水性のアミノ酸で構成される膜貫通領域や、脂質を介して膜に結合する GPIアンカーが結合するアミノ酸を含む領域等が含まれるがこれらに限定されるものではない。

[0012] 膜タンパク質における膜貫通領域および GPIアンカーが結合するアミノ酸を含む領域については、既に公開されている情報力も特定することができ、あるいは公知の情報が得られない場合は、公知の予測プログラム等を用いて検索することができる。

[0013] 本発明のプローブ DNAの塩基長は、膜タンパク質をコードする核酸とハイブリダィズ可能な長さであり、通常 10〜5000塩基、好ましくは 15〜500塩基、より好ましくは

20〜： L00塩基、さらに好ましくは 40〜70塩基である。

[0014] 本発明のプローブ DNAは、好ましくは、以下の (a)〜(e)の DNAからなる群から選択される：

(c)配列番号 1〜： L015のいずれかで表される塩基配列力もなる DNAの一部を含む 1 0〜5000塩基の DNA、より好ましくは 20〜： LOO塩基の DNA

(d)配列番号 1〜1015のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列力もなる DNAの一部を含む 10〜5000塩基の DNA、より好ましくは 20〜： LOO塩基の DNA

[0015] ここで DNAの一部とは、配列番号 1〜： L015のいずれかで表される塩基配列力もなる DNAにおける、少なくとも 15塩基長、より好ましくは少なくとも 20塩基長、最も好ましくは 30〜60塩基長の連続した塩基配列力もなる部分を意味する。

[0016] DNAと相同性を有する塩基配列とは、通常約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同性または同一性を有する塩基配列力もなり、対応する膜タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダィズする塩基配列を意味する。膜タンパク質をコードする核酸には、 DNAおよび RN Aの双方が含まれ、好ましくは cDNAである。

[0017] 特異的にハイブリダィズするとは、ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下で、膜タンパク質をコードする核酸とハイブリダィズした状態を保てることを意味する。ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件とは、例えば、ナトリウム濃度が 15〜40m M、好ましくは 15〜20mMで、温度が 50〜70°C、好ましくは 60〜65°Cの条件を示す。特に、ナトリウム濃度が 16〜17mMで温度が 65°Cの場合が最も好ましい。

[0018] プローブ DNA固定化担体：

本発明はまた、上記プローブ DNAが固定ィ匕されてなる担体に関する。当該プロ一ブ DNA固定ィ匕担体は、膜タンパク質の発現の検出において有用である。

[0019] プローブ DNAの担体への固定化は、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。固定化するプローブ DNAやその PCR産物（DNAを PCR法によって増幅させた DNA断片）を溶媒に溶解または分散して、スポッティング溶液を調製する。このスポッティング溶液を、担体上にスポッティングした後インキュベートすることにより、プローブ DNAを担体上に固定化することができる。プローブ DNAを溶解または分散する溶媒としては、例えば、蒸留水、 SSC (saline- sodium citrate)、 PBS (phosphate b uffered saline),重曹（NaHCO )など、極性有機溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド

3

、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、トリフルォロ酢酸、トリエチルァミン、 1—メチル— 2—ピロリドン、ジォキサン、酢酸ェチルなど力も選ばれる 1以上の溶媒を使用できる。本発明においては、 PBSを使用するのが好ましい。

[0020] プローブ DNAの固定化には、 DNAチップ作成装置に備えられたスポッター装置を用いて、ポリ陽イオン (ポリリシン、ポリエチレンイミン等)で表面処理した担体表面にスポッティングして、 DNAの荷電を利用して担体上に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用される。この場合には、ァミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。

[0021] 反応活性基を導入したプローブ DNAを合成し、表面処理した担体表面に該 DNA をスポッティグし、共有結合させることもできる。例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、 PDC (p—フエ-レンジイソチオシァネート）存在下、アミノ基導入 DNAを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入 DNAを反応させる方法などがある。

[0022] スポッティングは、プローブ DNAを含むスポッティング溶液を、 96穴または 384穴等のプラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポット装置等を用いて担体上に滴下することによって行う。スポット装置としては通常は、ピンに試料溶液を保持させ、そのピンを担体表面に接触させ、そして溶液を担体表面に移行させてスポットを形成する

ピン方式による装置が用いられる。ピンの先端の形状には、ソリッドピンタイプ (特に、溝が切られて、な、もの）、タイルピンタイプ（万年筆のように溝が切られて、るもの）など様々なタイプがあり、いずれであっても使用することができる。好ましくは、タイルピンタイプである。また、ピン方式以外にも、インクジェットプリンタの原理を利用したィンクジェット方式や、毛細管によるキヤビラリ方式などを利用したスポット装置も用いることができる。

[0023] スポット当たりのスポッティング溶液のスポッティング量は、当業者であれば適宜決定することができるが、通常、 lpL〜l μ Lの範囲にあり、好ましくは lOOpL〜： LOOnL の範囲にある。スポットの大きさは、通常、直径が 50〜300 /ζ πιの範囲にある。そして、スポット間の距離は、通常、 0〜1. 5mmの範囲にあり、好ましくは 100〜700 μ m の範囲にある。スポッティング後、通常、室温〜 100°C、好ましくは 70〜80°Cにて、通常、 3時間以下、好ましくは 0. 5〜1. 5時間インキュベートとすることが好ましい。

[0024] プローブ DNAを担体に固定化した後、固定化されていない DNA等を除去するため、担体を洗浄する。洗浄液としては、当技術分野で通常用いられているものを使用することができ、例えば、 2 X SSC、 0. 2%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）を含む水溶液を使用することができる。このようにして、数百〜数万個のスポットを有する担体を得ることができる。

[0025] 本発明のプローブ DNA固定ィ匕担体は、通常少なくとも 10種、好ましくは少なくとも 50種、より好ましくは少なくとも 100種、さらに好ましくは少なくとも 500種、最も好ましくは少なくとも 1000種のプローブ DNAが固定化されている。また、本発明のプロ一ブ DNA固定化担体は、通常、少なくとも 10スポット以上、好ましくは 50〜： L000スポット、より好ましくは 1000〜2000スポットのプローブ DNAが固定化されている。 1種類のプローブ DNAについて、通常 1〜10スポット、好ましくは 3〜5スポットをスポッテイングする。

[0026] プローブ DNAを固定化するための担体：

プローブ DNAを固定ィ匕する担体としては、当技術分野で通常用いられるものを使用できる。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラフアイト、カーボンファイバーに代表される炭素などの導電体材料;単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケィ素、酸化ケィ素、窒化ケィ素などに代表される半導体材料、 SOI (シリコン'オン'インシユレータ)などに代表されるこれら半導体材料の複合素材;ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミタス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料;ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素榭脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩ィ匕ビユリデン、ポリ酢酸ビュル、ポリビュルアルコール、ポリビュルァセタール、アクリル榭脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ァセタール榭脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール榭脂、ユリア榭脂、エポキシ榭脂、メラミン榭脂、スチレン'アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル 'ブタジエンスチレン共重合体、ポリフエ-レンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。

[0027] 本発明においては、プローブ DNAを固定ィ匕する担体として、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物力選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体を用いるのが好ましい。

[0028] 上記固体支持体に用いられる基板の材料としては、例えば、シリコーン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック (例えば、ポリエステル榭脂、ポリエチレン榭脂、ポリプロピレン榭脂、 ABS榭脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene榭脂）、ナィロン、アクリル榭脂、フッ素榭脂、ポリカーボネート榭脂、ポリウレタン榭脂、メチルぺンテン樹脂、フエノール榭脂、メラミン榭脂、エポキシ榭脂、塩ィ匕ビニル榭脂)、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド (例えば、ダィャモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属;前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記榭脂をバインダ一として混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられる。

[0029] 本発明の固体支持体は、基板上に表面層を有する。この表面層により、核酸と共有結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定ィ匕することができる。

[0030] 表面層は、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種カゝら形成される。ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物としては、例えば、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラフアイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたもの、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコユウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を挙げることができる。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC : Diamond Like Carbon)等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。本発明においては、軟ダイヤモンドを用いるのが好まし、。

[0031] 基板が、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の材料で形成されている場合は、基板上に新たに表面層を形成させる必要はないが、基板がそれ以外の材料で形成されている場合は、表面処理を施すことによりダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の材料で形成される表面層を形成させる。

[0032] 表面処理を施した基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス 0〜9 9体積％、残りメタンガス 100〜1体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ま、。

表面処理によって形成される表面層の厚みは、 Inn！〜 100 μ mであることが好ましい。

[0033] 基板への表面層の形成は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマ CVD (Chemi cal Vapor Deposit)法、 ECRCVD (Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor D eposit)法、 ICP (Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、 ECR(Electri c Cyclotron Resonance)スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレ一ティング法、 EB (Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、ァーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。

[0034] また、前記の基板材料の積層体や複合体 (例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば 2相体)）を形成することにより、表面層としてもよい。

[0035] 基板の形状およびサイズは特に限定されないが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅 0. 1~ 100mm,長さ 0. 1~ 100mm,厚み 0. 01〜： LOmm程度である。

[0036] また、基板の表面または裏面に、反射層として Ti、 Au、 Pt、 Nb、 Cr、 TiC、 TiN等の単層またはこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは 10nm以上、更に好ましくは lOOnm以上である。

[0037] 基板としてガラスを用いる場合、その表面は、 Ra (jIS B 0601)で lnm〜1000nm の範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のプローブ DNAを高密度で固定化できる点で好都合である

[0038] 本発明の固体支持体には、核酸を静電的に引き寄せるために静電層が設けられていてもよい。

[0039] 静電層としては、核酸を静電的に引き寄せ、核酸の固定ィ匕量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。

[0040] 前記アミノ基含有ィ匕合物としては、非置換のアミノ基（一 NH )、または炭素数 1〜6

2

のアルキル基等で一置換されたァミノ基（一 NHR;Rは置換基)を有する化合物、例えばエチレンジァミン、へキサメチレンジァミン、 n—プロピルァミン、モノメチルァミン、ジメチルァミン、モノェチルァミン、ジェチルァミン、ァリルァミン、アミノアゾベンゼン、ァミノアルコール (例えば、エタノールァミン）、アタリノール、ァミノ安息香酸、ァミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、了ラニン、ノリン、ロイシン、セリン、トレオ-ン、システィン、メチォニン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、ァスパラギン酸、グルタミン、ァスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン )、ァ-リン、またはこれらの重合体 (例えば、ポリアリルァミン、ポリリシン)や共重合体 ;4, 4，， 4，，—卜リアミノ卜リフエ-ルメタン、卜リアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価ァミン）が挙げられる。

[0041] 静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。また、静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と表面層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物および炭素化合物を蒸着させた後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はな、が、例えば常温で気体であるメタン、ェタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましぐイオンィ匕蒸着法の条件としては、作動圧が 0. l〜50Pa、そして加速電圧が 2 00〜1000Vの範囲であることが好ましい。

[0042] 静電層を表面層と共有結合させて形成する場合には、例えば、表面層を有する基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有ィ匕合物のうち、例えば、ポリアリルァミン、ポリリシン、 4, 4，， 4"—トリアミノトリフエ-ルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。

[0043] また、静電層が施された基板に核酸と共有結合しうる官能基を導入する反応 (例えば、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸潰した後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、 N—メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。

[0044] 静電層が施された基板に、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予め N—ヒドロキシスクシンイミドおよび Zまたはカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応を N—ヒドロキシスクシンイミドおよび Zまたはカルポジイミド類の存在下に行うことが好ましい。

[0045] 基板を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸の固定ィ匕量がより向上する。

静電層の厚みは、 Inn！〜 500 μ mであることが好ましい。

[0046] 本発明における固体支持体は、核酸と共有結合しうる官能基を有する。該官能基は、基板表面に化学修飾を施すことにより形成することができる。

[0047] 前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、硫酸基、シァノ基、ニトロ基、チオール基、ァミノ基が挙げられる。

[0048] 官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式: X—R— COOH (式中、 Xはハロゲン原子、 R¹は炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロ口酢酸、フルォロ酢酸、ブロモ酢酸、ョード酢酸、 2—クロ口プロピ才ン酸、 3—クロ口プロピ才ン酸、 3—クロロアクリノレ酸、 4—クロ口安息香酸;式: HOOC— R²— COOH (式中、 R²は単結合または炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシユウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式: R³— CO— R⁴—C OOH (式中、 R³は水素原子または炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基、 R⁴は炭素数 1〜 12の 2価の炭化水素基を表す。 )で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式: X— O C— R⁵— COOH (式中、 Xはハロゲン原子、 R⁵は単結合または炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シユウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。 [0049] 前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドゃカルポジイミド (例えば、 1— [3— (ジメチルァミノ)プロピル]— 3—ェチルカルポジイミド)などの脱水縮合剤と N—ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステルイ匕することができる。

[0050] 官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式: X— OC— R⁶— CO— X(式中、 Xはハロゲン原子、 R⁶は単結合または炭素数 1〜 12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジノ、ライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。

[0051] 官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式: HO — R⁷— COOH (式中、 R⁷は炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸またはフエノール酸が挙げられる。

[0052] 官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。

[0053] 前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラ力ルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。

[0054] 担体として上記のような固体支持体を用いることにより、プローブ DNAを強固に固定ィ匕することができるため、検出感度と信頼性の高い診断が可能になる。

[0055] 膜タンパク質をコードする遺伝子の発現検出：

本発明の膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法は、本発明のプローブ DNAと膜タンパク質をコードする核酸とのハイブリダィゼーシヨンに基づくものであれば特に制限されず、当技術分野において公知の方法を使用できる。例えば、ノーザンブロッテイング、 RNaseプロテクションアツセィ、 cDNAクローニングにおけるサザンブロッテイングやコロニー Zプラークハイブリダィゼーシヨン、マイクロアレイなどが挙げられる。

[0056] 本発明の検出方法の一実施形態では、担体上に固定ィヒされた上記プローブ DNA と、試料由来の mRNAを逆転写することにより得られる試料 cDNAとを接触させ、プローブ DNAとハイブリダィズする試料 cDNAを検出することによって、試料中の対応する膜タンパク質をコードする mRNAレベルを測定し、それによつて膜タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを検出する。 [0057] 本発明において膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出するとは、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現の有無を検出すること、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルの変化を検出すること、および膜タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを定量することの、ずれも包含する。

[0058] 試料 cDNAは、当技術分野で公知の方法によって調製できる。例えば、試料から単離された全 RNAを RTプライマーおよび適当なバッファーを含む反応混合物中に添カロする。プライマーアニーリングのためのインキュベート後、 RTバッファー、 dNTP 、 DTT、アミノアリル dUTP、 RNaseインヒビターおよび逆転写酵素をさらに添加する。 RNAの逆転写が完了するようにインキュベーション後、 RT産物を反応性標識試薬と反応させる。別法では、プライマーを標識せずに、標識ィヒ dNTPを PCR反応混合物中でインキュベートしてもよい。 PCR増幅は、従来の技術に従って、 DNAサーマルサイクラ一中で行うことができる。

[0059] 標識としては、核酸に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Cy3および Cy5などの CyDye、 FITC、 RITC、ローダミン、テキサスレッド、 TET、 TAMRA、 FAM、 HEX, ROXなど）、放射能標識（ α— 32P、 y - 32P、 35Sなど）などが挙げられる。

[0060] 試料溶液は、溶液中の核酸濃度が通常 0. 01〜： LOO /z g、好ましくは 1〜50 gとなるようにバッファーに溶解することによって調製する。この溶液を、上記で調製したプローブ DNAが固定化された担体上に滴下し、インキュベーションを行うことによりハイブリダィズさせる。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法またはそれに準じる方法、例は、 Molecular Cloning 2 (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Pre ss, 1989)に記載の方法などに従って行うことができる。

[0061] 本発明の検出方法において、インキュベーションは、通常 50〜70°C、好ましくは 5 5〜65°Cで、通常 1〜20時間、好ましくは 5〜16時間で行う。最後に、担体を洗浄し、乾燥後、ハイブリダィズした核酸に由来する標識を読みとることによりハイブリダィゼーシヨンを検出することができる。

[0062] 本発明のプローブ DNA固定ィ匕担体は、試料由来の核酸とハイブリダィズさせた後、担体を洗浄することにより、一度ハイブリダィズした核酸を解離させることができ、さらに、再度核酸をハイブリダィズさせることができる。基板上に DNAと共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体を担体として用いることにより、核酸の解離およびノヽイブリダィゼーシヨン反応の再現性を向上させることができる。

[0063] ハイブリダィズした核酸の解離は、通常、室温〜 100°C、好ましくは 90〜100°C、より好ましくは 95〜100°Cのナトリウム濃度が l〜15mMの溶液で、通常 10〜60分、好ましくは 10〜40分、より好ましくは 30〜35分洗浄することにより実施できる。洗浄のための水性溶液としては、超純水、炭酸水素ナトリウム溶液、 SSC溶液、 PBS溶液等を使用することができる。本発明においては 95〜100°Cの超純水を用いて、 10〜 30分洗浄を実施するのが好ま、。

実施例

[0064] (実施例 1)プローブ DNA固定化担体の作成

3mm角のシリコン基板にダイヤモンドライクカーボン層をコ一ティングし、アンモ- ァプラズマ処理によりアミノ基を導入し、カルボキシル基で修飾後、 N—ヒドロキシスクシンイミドで活性エステルイ匕し、プローブ DNA固定化用の担体を作成した。この担体に、マイクロアレイ用スポッター SPBIO2000 (日立ソフト）を使用して、 5pmol/ μ L に調整した 1015種の 5'末端をァミノ化した 60merの DNAをプローブ DNAとしてスポットした。最終濃度 20% PEG (ポリエチレングリコール)溶液に

DNA断片を 5 Mの濃度で溶解し、スポッティング溶液とした。

[0065] 担体上に固定化した 1015種のプローブ DNAについて、以下の表 1に示す。表 1 において SEQ ID NO.と記載された列の番号力配列表に示した各プローブ DNAの配列番号に相当する。遺伝子名と記載した列は、その遺伝子がコードするタンパク質の一般的名称であり、遺伝子データベースに遺伝子配列と共に登録された名称、あるいはタンパク質配列データーベースにそのアミノ酸配列とともに登録されている名称である。一番右の「作成方法」と記載した列に示す A〜Dの記号は、プローブ DNA の作成方法を示しており、各記号が示す意味は以下のとおりである。

[0066] A:各膜タンパク質をコードする遺伝子における膜貫通領域をコードする領域力もシトシンおよびグァニンの含有率力 0〜60%の領域を選択して作成したもの B :各膜タンパク質をコードする遺伝子における膜貫通領域をコードする領域およびその周辺の領域からシトシンおよびグァニンの含有率力 0〜60%の領域を選択して作成したもの

C :各膜タンパク質をコードする遺伝子における膜貫通領域をコードする領域を、膜貫通領域予測プログラム（TMpred, (K. Hoftnann & W. Stoffel (1993) Biol. Chem. Ho ppe-Seyler 374, 166) )で検索し、得られた領域からシトシンおよびグァニンの含有率力 S40〜60%の領域を選択して作成したもの

D：各膜タンパク質における GPIアンカーが結合するアミノ酸を含む領域をコードする領域力シトシンおよびグァニンの含有率力 0〜60%の領域を選択して作成したもの：ポシティブコントローノレ

また、これらプローブ DNAにおける CG含量を％で示す。

[表 1]

87 OM1290A 刚— 007568 12223 Q05928 betaceilulin, epidermal 48.333 A growth factor family

member

88 NM_021316 57754 Q9JKC6 BM88 antigen 55.000 A

Q9DBA0

89 N _026505 68010 Q9D0し 6 BMP and activin 55.000 A

Q91XS6 membrane-bound

inhibitor, homolog

(Xenopus laevis)

90 OM1486 NM— 009フ 66 12209 054798 bombesin - like receptor 51.667 A

088790 3

91 O 0423B 刚— 009763 12182 Q64277 bone marrow stromal 51.667 D cell antigen 1

92 M319 D 16250 12166 P36895 bone morphogenetic 46.667 A protein receptor, type

93 OM0988 X78438 12062 P32299 bradykinin receptor, 58.333 A beta 2

94 N J 75642 210933 Q80ZF8 brain-specific 41.667 A angiogenesis inhibitor 3

95 O 1602 NM_013483 12231 Q62556 butyrophilin, subfamily 41.667 A

P97392 1， member A1

96 MC459 X06340 12560 P10287 cadherin 3 58.333 A

Q61465

97 OM1542A NM 009866 12552 P55288 cadherin 1 1 53.333 A

98 OM4660 NM 019707 12554 Q9WTR5 cadherin 13 58.333 D

99 O 1350 N .007663 12556 088338 cadherin 16 55.000 A

Q9JLZ5

100 OM4705 NM 0 9753 12557 Q9R100 cadherin 17 41.667 A

101 NM 174988 104010 Q9WTP5 cadherin 22 53.333 A

102 NM— 023370 22295 Q99PF4 cadherin 23 55.000 A

Q99NH1 (otocadhermj

Q9D4N9

103 O 1550 NM— 009886 12614 035161 cadherin EGF LAG 53.333 A seven-pass G-type

receptor 1

104 NM— 017392 53883 cadherin EGF LAG 55.000 A seven-pass G-type

receptor 2

105 N .080437 107934 Q912I0 cadherin EGF LAG 58.333 A

Q9ESD0 seven-pass G - type

receptor 3

106 NM 198656 381409 P59862 cadherin - like 26 56.667 A

107 N .018782 54598 Q9R1W5 calcitonin receptor-like 41.667 A

Q9QXH8

Q9WUP2

108 O 1296A NM— 007578 12286 P97445 calcium channel, 43.333 A voltage-dependent, P/Q

type, alpha 1 A subunit

109 O 1495 N _009781 12288 Q01815 calcium channel, 45.000 A

Q04476 voltage - dependent, L

Q61242 type, alpha 1 C subunit

Q99242

1 10 O 1496 NM— 009782 12290 Q61290 calcium channel, 45.000 A voltage-dependent, R

type, alpha 1 E subunit

1 1 1 OM1298A NM_007582 12299 070578 calcium channel, 58.333 A voltage-dependent,

gamma subunit 1

N .025771 66797 Q9CPW0 contact! n associated 53.333 A protein—like 2

OM3937 NM 016869 53419 Q9Z319 corin 58.333 A

NM.009988 13052 coxsackievirus and 58.333 A adenovirus receptor

OM1386 N .007724 12789 Q62398 cyclic nucleotide gated 51.667 A channel alpha 2

NM.021 76 58861 Q99JA4 cysteinyi leukotriene 41.667 A

Q9JJ71 receptor 1

Q9JK47

NM— 133720 70086 Q920A1 cysteinyi leukotriene 43.333 A receptor 2

NM.021050 12638 P26361 cystic fibrosis 46.667 A

Q63893 transmembrane

Q63894 conductance regulator

Q9JKQ6 homolog

O 2162 NM_007807 13058 Q61093 cytochrome b - 245， beta 46.667 A polypeptide

M720 X0571 12477 P09793 cytotoxic T- 45.000 A

Q o σ o9QZZ7 lymphocyte— associated

O O

O 1384 NM— 007721 59289 0 o08707 D6 beta-chemokine 58.333 A

O oo c to ωo' m σ> o receptor

o t

NM一 007827 13137 Q6147 c σ σ6o>> decay accelerating 41.667 B factor 2

M29 U83628 13135 defender against cell 53.333 A death 1

OM2187 NM_007853 13244 009005 degenerative 51.667 A spermatocyte homolog

(Drosophila)

M227 X85788 13176 P7021 1 deleted in colorectal 48.333 A carcinoma

B222 D 16847 13386 Q09163 delta - like 1 homolog 58.333 A

Q07645 (Drosophila)

Q62208

MB220 Y1 1895 13389 delta-like 3 (Drosophila) 58.333 B

N .007882 13507 desmocollin 3 46.667 A

NM— 007883 1351 1 desmoglein 2 58.333 A

V241 U8601 6 1351 2 035902 desmoglein 3 53.333 A

OM2203 NM 007876 13479 P31428 dipeptidase 1 (renal) 53.333 D

OM0208 L07264 1 5200 Q061 86 diphtheria toxin 53.333 A

O 4954 NM— 00フ 584 12305 Q03146 discoidin domain 58.333 A receptor family, member

OM41 79 NM_008746 18214 Q62371 discoidin domain 48.333 A receptor family, member

NM— 025705 66686 Q9D4J3 discoidin, CUB and 51 .667 A

Q8R327 LCCL domain containing

Q9D696 1

NM.028523 フ 3379 Q91 ZV3 discoidin, CUB and 58.333 A

Q8BKI4 LCCL domain containing

242 MC215 Y10007 14089 P97321 Fibroblast activation 46.667 A protein

243 MB242 X51893 14182 P16092 Fibroblast growth factor 51.667 A

Q01736 receptor 1

Q61562

244 MB248 X78568 14254 FMS-like tyrosine 56.667 A kinase 1

245 B250 U29875 14256 P49772 FMS-like tyrosine 58.333 B

Q64085 kinase 3 ligand

246 O 2303 N 008034 14275 P35846 folate receptor 1 (adult) 58.333 D

247 OM2304 NM 008035 14276 Q05685 folate receptor 2 (fetal) 48.333 D

248 OM2538 NM 013521 14293 P33766 forrnyl peptide receptor 46.667 A

249 NMJ321457 14362 frizzled homolog 1 46.667 A

(Drosophila)

250 NM— 020510 57265 frizzled homolog 2 51.667 A

(Drosophila)

251 NM一 021458 14365 Q61086 frizzled homolog 3 41.667 A

O O o o o

o < (Drosophila)

o

252 NM— 008055 14366 Q61 O ton088 frizzled homolog 4 41.667 A

(Drosophila)

253 N .022721 14367 Q9EQD0 frizzled homolog 5 53.333 A

008975 (Drosophila)

254 NM— 008056 14368 Q61089 frizzled homolog 6 50.000 A

(Drosophila)

255 OM0686 NM— 008057 14369 Q61090 frizzled homolog 7 50.000 A

(Drosophila)

256 NM— 008058 14370 Q61091 frizzled homolog 8 53.333 A

(Drosophila)

257 NM— 016893 53618 Q9 TS2 Fucosyltransferase 8 43.333 A

Q921 U1

258 NM_019503 56188 Q9Z239 FXYD domain- 56.667 A containing ion transport

259 OM1253 NM.007503 1 1936 Q04646 FXYD domain- 58.333 A

Q923I2 containing ion transport

Q923I3 regulator 2

Q923I4

260 MC253 X93038 17178 Q61835 FXYD domain- 53.333 A containing ion transport

261 NM— 033648 108017 Q9D2W0 FXYD domain- 55.000 A containing ion transport

262 NM.022004 59095 FXYD domain- 55.000 A containing ion transport

regulator 6

263 NM_022007 57780 P59648 FXYD domain- 58.333 A

Q8BTD2 containing ion transport

264 O 3028 NM— 008154 14748 P35413 G - protein coupled 50.000 A receptor

265 U 23807 14769 P49681 G protein-coupled 56.667 A receptor 7

266 OM3027 NM— 008151 14738 P35412 G - protein coupled 50.000 A receptor 12

267 NM— 145440 217369 Q8VIH9 G protein— coupled 53.333 A receptor 14

268 O 0698 U46923 14760 Q61 121 G protein-coupled 51.667 A receptor 19

269 NM— 145132 20791 1 Q8JZL2 G protein coupled 51.667 A receptor 24 270 N _173410 233919 Q8BZA7 G protein-coupled 56.667 A Q80T55 receptor 26

Q8BXZ5

271 O 3030 N .008158 14761 054897 G protein-coupled 58.333 A receptor 27

272 NM_008159 14762 088416 G protein-coupled 41.667 A receptor 33

273 O 3456 NM_01 1823 23890 Q9R1 K6 G protein-coupled 43.333 A receptor 34

274 N _022320 64095 Q9ES90 G protein-coupled 48.333 A receptor 35

275 OM3217 NM_009962 14764 Q9Z2J6 G protein-coupled 55.000 A receptor 44

276 NM_053107 93690 Q9EQQ4 G protein-coupled 51.667 A receptor 45

277 O 2471 N _010195 14160 Q9Z1 P4 G protein-coupled 45.000 A receptor 49

278 N .018882 14766 Q8K209 G protein-coupled 46.667 A

Q90ZT2 receptor 56

279 NM.030733 81006 Q9EQQ3 G protein-coupled 48.333 A receptor 63

280 NMJ 78712 237175 Q8CJ12 G protein-coupled 50.000 A

Q8BL10 receptor 64

Q8CJ08

Q8CJ09

Q8CJ10

281 OM0676 N .008152 14744 Q61038 G— protein coupled 50.000 A

Q921 N3 receptor 65

282 N .010341 14767 055040 G protein-coupled 53.333 C receptor 66

283 NM_175493 238377 Q8BFQ3 G protein-coupled 51.667 A

Q80T34 receptor 68

284 NM— 021381 58182 Q9JKL1 G protein-coupled 50.000 A receptor 73

285 N J 44944 246313 Q8K458 G protein-coupled 46.667 A

Q80XQ0 receptor 73_like 1

Q8BIR4

286 NMJ 33192 104443 Q924H0 G protein-coupled 51.667 A

Q8BKR6 receptor 74

287 NMJ 75520 243270 Q8C131 G protein-coupted 50.000 A receptor 81

288 OM3218A NM— 010287 1460& P30731 G protein-coupfed 46.667 A receptor 83

289 NMJ 45066 64450 P60894 G protein-coupled 55.000 A

Q9JHI6 receptor 85

Q9NPD1

290 NM— 028808 74191 Q9D8I2 G protein - coupled 41.667 A

Q8C412 receptor 86

Q8CAL2

291 NM— 032399 841 1 1 Q99 T7 G protein-coupled 41.667 A

Q8C4Y7 receptor 87

292 NM— 032400 841 12 Q99MT6 G protein-coupled 48.333 A receptor 91

293 NMJ 73036 54672 Q8R0T6 G protein— coupled 45.000 A receptor 97

294 NM— 181817 242093 Q7TQP4 G protein-coupled 55.000 A

Q80UD6 receptor 100

295 AY255576 245424 Q80T62 G protein-coupled 46.667 A receptor 101

392 AF027865 14960 P 14434 H-2 class II 46.667 B 0781 95 histocompatibility

antigen, A— B alpha

393 K01923 14960 P04228 H-2 class H 45.000 B histocompatibility

antigen, A-D alpha

394 K00008 14961 P01921 H-2 class II 58.333 A

019458 histocompatibility

Q31 138 antigen, A—D beta chain

Q31 139

395 K01 924 14960 P 14435 H-2 class II 46.667 B histocompatibility

antigen, A_F alpha chain

396 M1 3541 14961 P06346 H-2 class 11 58.333 A histocompatibility

antigen, A-F beta chain

397 21 931 14960 P01910 H-2 class II 45.000 B histocompatibility

antigen, A- K alpha

398 M13538 14961 P06343 H-2 class II 58.333 A

Histocompatibility

antigen, A - K beta chain

399 KOI 925 14960 P04227 H-2 class II 45.000 B histocompatibility

antigen, A-Q alpha

400 MI 3537 14961 P06342 H-2 class II 58.333 A histocompatibility

antigen, A-Q beta chain

401 M1 1356 14960 P 14436 H-2 class II 45.000 B histocompatibility

antigen, A - R alpha

402 1 1358 14960 P 14437 H-2 class II 46.667 B histocompatibility

antigen, A - S alpha

403 Ml 3540 14961 P06345 H-2 class II 58.333 A histocompatibility

antigen, A - S beta chain

404 K01926 14960 P 14438 H-2 class I 46.667 B histocompatibility

antigen, A - U alpha

405 M36940 14969 P04230 H-2 class II 53.333 A histocompatibility

antigen, E-B beta chain

406 M35682 14969 P20040 H-2 class II 53.333 A histocompatibility

antigen, E-Q beta chain

407 M1 1355 14969 P04231 H-2 class II 53.333 A histocompatibility

antigen, E_S beta chain

408 M12818 14968 P14439 H-2 class II 51.667 A histocompatibility

antigen, E_U alpha chain

409 X52643 14960 P231 50 H-2 class II 58.333 A histocompatibility

antigen, E alpha chain

410 X52642 14969 P 18469 H-2 class II 58.333 A histocompatibility

antigen, I-E beta chain

41 1 OM3053 N _008202 14977 Q31 1 25 H2-K region expressed 58.333 A

Q9Z1W1 gene 4

538 N .030699 80883 Q8R4G0 netrin G1 58.333 B Q8R4F3

Q8R4F4

Q8R4F5

Q8R4F6

Q8R4F7

Q8R4F8

Q8R4F9

Q9ESR3

Q9ESR4

Q9ESR5

Q9ESR6

Q9ESR7

Q9ESR8

539 NMJ 33500 171 171 netrtn G2 58.333 B

540 NM_010875 17967 P13594 neural cell adhesion 56.667 D

Q61950 molecule 1

541 X07200 17967 P13595 neural cell adhesion 56.667 A

Q61949 molecule 1 , 180 kDa

isoform

542 OM4160 NM一 008721 18146 Q64322 neural proliferation, 58.333 A differentiation and

control gene 1

543 X 486093 21 1323 Q6DR98 neuregulin 1 51.667 C

544 AW476657 109645 P56974 neuregulin 2 56.66フ A

545 O 4169 NM 008734 18183 035181 neuregulin 3 43.333 A

546 NM 032002 83961 Q9WTX4 neuregulin 4 58.333 A

547 NM 020252 18189 Q80Y87 neurexin I 58.333 C

548 NMJ 82716 2691 16 Q810U3 neurofascin 53.333 A

549 NM 138666 192167 Q99K10 neuroligin 1 55.000 A

550 NMJ 72932 245537 Q8BYM5 neurohgin 3 58.333 A

Q8BXR4

551 NMJ 76930 319504 Q810U4 neuronal cell adhesion 43.333 A

Q80U33 molecule

Q8BLG8

Q8BX92

Q8BYJ8

552 NMJ53581 234267 P35802 Neuronal membrane 50.000 A glycoprotein 6-a

553 NM_023122 14758 P35803 Neuronal membrane 55.000 A

Q8R3J6 glycoprotein M6 - b

Q99L14

Q9D4F5

Q9JHG9

Q9JHI1

Q9JHK2

Q9JI62

Q9JI63

Q9JI64

Q9JI65

554 NM 018766 18216 088319 neurotensin receptor 45.000 A

555 NM 172290 235106 Q99PJ0 neurotrimin 55.000 D

556 MA301 33385 18212 P15209 neurotrophic tyrosine 56.667 A

Q91 XJ9 kinase, receptor, type 2

614 OM3345A N .0 0606 16522 potassium inwardly- 48.333 A rectifying channel,

subfamily J, member 6

615 OM3183A NM.008428 16523 P97794 potassium inwardly- 48.333 A rectirying channel,

subfamily J， member 8

616 O 3184 NM_008429 16524 P48543 potassium inwardly— 58.333 A

Q9WUE1 rectifying channel,

subfamily J， member 9

617 OM4922 NM.020269 16513 Q9JM63 potassium inwardly- 48.333 A rectifying channel,

subfamily J, member 10

618 OM4622 NM_019664 16516 088932 potassium inwardly- 45.000 A

Q9J 34 rectifying channel,

Oooooooco subfamily J, member 15

619 O 0459 U09383 16531 Q084t»6- 0 potassium large 53.333 A

Q64703 conductance calcium- Q8VHF1 activated channel,

Q9R196 subfamily M, alpha

member 1

620 OM0042 AF02071 1 16533 potassium large 53.333 A conductance calcium- activated channel,

subfamily M, beta

member 1

621 OM3187 NM— 008432 16532 054982 potassium large 41.667 C conductance pH—

sensitive channel,

subfamily M， alpha

member 3

622 OM3178A N _008421 16502 P15388 potassium voltage gated 58.333 A channel, Shaw-related

subfamily, member 1

623 O 3179A NM— 008422 16504 Q63959 potassium voltage gated 58.333 A

Q62088 channel, Shaw— related

subfamily, member 3

624 O 3338 NM_010595 16485 P16388 potassium voltage- 58.333 A gated channel, shaker- related subfamily,

625 O 3175 N .008417 16490 P15386 potassium voltage - 48.333 A

Q02010 gated channel, shaker- related subfamily,

626 OM3176 NM— 008418 16491 P16390 potassium voltage - 51.667 A gated channel, shaker- related subfamily,

627 O 3177 N .008419 16493 Q61762 potassium voltage- 58.333 A gated channel, shaker- related subfamily,

628 OM3180A NM_008423 16506 Q03719 potassium voltage- 51.667 A

Q8CC68 gated channel, Sha

related family, member

664 NM 0231 15 1 1994 Q99PJ1 protocadherin 15 51.667 A

665 NM_178685 219257 protocadherin 20 46.667 A

666 NM— 1751 16 67168 Q8BMC0 purinergic receptor 46.667 A

(family A group 5)

667 OM0639A U22829 18441 P49650 purinergic receptor P2Y, 48.333 A

G - protein coupled 1

668 NM— 027571 70839 Q9CPV9 purinergic receptor P2Y, 46.667 A

G - protein coupled 12

669 NM— 147010 259012 Q8VGR8 putative olfactory 41.667 A receptor 1 72-1

670 NM_146573 258566 Q8VFK2 Putative otfactory 46.667 A receptor 175—2

671 N _146572 258565 Q8VFK1 Putative olfactory 48.333 A receptor 175 - 3

672 NM— 146436 258428 Q8VF76 Putative olfactory 41.667 A receptor 175 - 5

673 NM J 46592 258585 Q8VFL9 Putative olfactory 43.333 A receptor 179 - 2

674 NM.207154 228228 Q8VES2 Putative olfactory 46.667 A receptor 179 - 4

675 NM— 146365 258362 Q8VF13 Putative otfactory 46.667 A receptor 179-7

676 NM 147015 25901フ Q8VGS3 Putative olfactory 43.333 A receptor 180-1

677 NM— 147013 259015 Q8VGS1 Putative olfactory 45.000 A receptor 185 - 3

678 NMJ4701 1 259013 Q8VGR9 Putative olfactory 41.667 A receptor 185-4

679 NMJ 46588 258581 Q8VFL5 Putative olfactory 48.333 A receptor 196 - 2

680 N _146581 258574 Q8VFK8 Putative olfactory 45.000 A receptor 201 - 1

681 NMJ 46580 258573 Q8VFK7 Putative olfactory 45.000 A receptor 201—2

682 NMJ46702 258697 Q8VFX2 Putative olfactory 41.667 A receptor 202-4

683 NMJ 46926 258928 Q8VGI6 Putative olfactory 45.000 A receptor 204-1

684 NMJ 46925 258927 Q8VGI5 Putative olfactory 51.667 A receptor 204-2

685 AY073164 258926 Q8VGI4 Putative olfactory 43.333 A receptor 204 - 3

686 NMJ 46775 258771 Q8VG44 Putative olfactory 41.667 A receptor 204-4

687 NMJ 46774 258770 Q8VG43 Putative olfactory 55.000 A receptor 204-5

688 NMJ 46773 258769 Q8VG42 Putative olfactory 45.000 A receptor 204 - 6

689 NMJ 46743 258738 Q8VG13 Putative olfactory 43.333 A receptor 204—7

690 NMJ 46739 258734 Q8VG09 Putative olfactory 50.000 A receptor 204 - 8

691 NMJ 46738 258733 Q8VG08 Putative olfactory 46.667 A receptor 204 - 9

692 NM— 146737 258732 Q8VG0フ Putative olfactory 48.333 A receptor 204-10

693 NMJ 46736 258731 Q8VG06 Putative olfactory 46.667 A receptor 204- 1 1

721 OM5015 NM_009017 19369 008603 retinoic acid early 51.667 D transcript beta

722 OM4896 NM— 020030 56554 Q9JI58 retinoic acid early 45.000 D transcript delta

723 圖— 009018 19370 008604 retinoic acid early 50.000 D transcript gamma

724 ΝΜ.02Ί 557 17252 Q9QYF1 retinol dehydrogenase 48.333 A

Q9D0U5 1 1

725 OM3849 N .016678 53614 Q9Z0J1 reversion—inducing - 58.333 D cysteine— rich protein

with kazal motifs

726 N J 77740 244058 Q6PCX7 RGM domain family, 56.667 B

Q7TQ34 member A

Q8CIH6

727 NMJ 78615 68799 Q7TQ33 RGM domain family, 58.333 D

Q8BNR6 member 6

Q8CBM7

728 NM_027126 69585 Q7TQ32 RGM domain family, 51.667 D

Q8CEU7 member C

Q8K1D4

フ 29 N 145383 212541 P 15409 rhodopsin 48.333 A

730 NMJ 39228 246104 P588 ω73 rhomboid, veinlet-tike 4 46.667 A

731 N .019413 19876 08902二6 roundabout homolo 1 53.333 A

(Drosophila)

732 NMJ 75549 268902 Q7TPD3 roundabout homolog 2 48.333 A

Q8BJ59 (Drosophila)

733 N _01 1248 19649 Q9Z2I4 roundabout homolog 3 58.333 B

(Drosophila)

734 NM— 021340 5781 1 Q9Z2B3 RPE-retinal G protein- 51.667 A coupled receptor

735 O 1833 NM.009161 20391 sarcoglycan, alpha 51.667 A

(dystrophin— associated

glycoprotein)

736 OM351 1 NM— 01 1390 24051 P82349 sarcoglycan, beta 46.667 A

(dystrophin-associated

glycoprotein)

737 O 3512 N .011891 24052 P82347 sarcoglycan, delta 41.667 A

(dystrophin-associated

glycoprotein)

738 O 2032 NM 01 1360 20392 070258 sarcoglycan, epsilon 55.000 A

739 OM3513 NM— 01 1892 24053 P82348 sarcoglycan, gamma 48.333 A

(dystrophin- associated

glycoprotein)

740 NMJ 53790 224024 P59222 scavenger receptor 58.333 B class F, member 2

741 NM.O26907 58210 Q9JL59 secreted and 43.333 A transmembrane protein

742 OM1829 NM— 009149 20340 Q61543 selectin, endothelial cell, 50.000 A

Q9QZ40 iigand

743 N .01 1350 20355 Q92123 sema domain, 53.333 A

Q9R1Y1 immunoglobulin domain

(Ig), TM domain, and

short cytoplasmic

744 OM3577 NM— 01 1976 26456 Q9WUH7 sema domain, 50.000 A immunoglobulin domain

(Ig), transmembrane

domain (TM) and short

cytoplasmic domain,

(Eemaphorin) 4G

766 OM4693 NM_019741 56485 Q9WV38 solute carrier family 2 41.667 A

(facilitated glucose

transporter), member 5

767 NMJ319488 56017 Q9JIF3 solute carrier family 2 ( 58.333 A

Q9JJP4 facilitated glucose

Q9JJZ0 transporter), member 8

768 MM— 145559 1 17591 Q99JJ2 solute carrier family 2 45.000 C

(facilitated glucose

transporter), member 9

769 N _130451 170441 Q8VHD6 solute carrier family 2 53.333 C

(facilitated glucose

transporter), member 10

770 OM1864 NM.009205 20532 055093 solute carrier family 3， 55.000 C member 1

771 OM2060 NM.01 1 03 20533 P04919 solute carrier family 4 56.667 A

(anion exchanger),

member 1

772 OM1865 MM— 009207 20535 P13808 solute carrier family 4 58.333 A

Q9ES09 (anion exchanger),

Q9ES10 member 2

Q9ES1 1

Q9ES12

Q9ES13

773 O 1866A NM一 009208 20536 P16283 solute carrier family 4 55.000 A

(anion exchanger),

member 3

774 O 4754 NM.019810 20537 Q9QXX5 solute carrier family 5 45.000 A

(sodium/glucose

cotransporter), member

775 O 3998 NM— 017391 53881 Q9JKZ2 solute carrier family 5 41.667 A

(inositol transporters),

member 3

776 OM0795 U76306 20538 055192 solute carrier family 6 55.000 A

(neurotransmitter

transporter,

noradrenalin), member 2

777 O 2394 NM— 010020 13162 Q9R1 I2 solute carrier family 6 53.333 A

Q60719 (neurotransmitter

Q9R1 I2 transporter, dopamine),

member 3

778 OM0035 AF013604 15567 Q60857 solute carrier family 6 43.333 A

035241 (neurotransmitter

transporter, serotonin),

member 4

779 O 2625 NM.009320 21366 035316 solute carrier family 6 58.333 A

P31642 (neurotransmitter

Q91WI2 transporter, taurine),

member 6

780 O 0945 X67056 14664 P28571 solute carrier family 6 43.333 A

(neurotrsnsmitter

transporter, glycine),

member 9

781 OM4908 NM.020049 56774 Q9R183 solute carrier family 6 41.667 A

Q9J A9 (neu rotra n smitte r

Q91Y60 transporter), member 14

Q9D317

782 OM1263 NM— 007513 1 1987 Q09143 solute carrier family 7 50.000 A

P30824 (cationic amino acid

transporter, y+ system),

member 1

800 OM0063 AF058055 20501 P53986 solute carrier family 16 53.333 A

(monocarboxylic acid

transporters), member 1

801 O 1859 NM—009197 20502 070324 solute carrier family 6 53.333 A

(monocarboxylic acid

transporters), member 2

802 OM2052 NM,01 1391 20503 070451 solute carrier family 16 46.667 A

(monocarboxylic acid

transporters), member 7

803 OM1860 NM,009198 20504 Q61983 solute carrier family 17 43.333 A

(sodium phosphate),

member 1

804 NM—031 196 20509 P41438 solute carrier family 19 50.000 A

Q62450 ( folate transporter 1 ),

Q62451 member 1

805 OM2102 NM一 015747 20515 Q61609 solute carrier family 20, 50.000 A member 1

806 O 3715 NM—013797 28248 Q9QXZ6 solute carrier family 21 53.333 A

(organic anion

transporter), member 1

807 NM_033314 24059 Q9EPT5 solute carrier family 21 51.667 A member 2

808 O 1862 NM— 009203 20521 054778 solute carrier family 22 56.667 A

(organic anion/cation

transporter), member 12

809 OM1861 NM_009202 20517 008966 solute carrier family 22 51.667 C

(organic cation

transporter), member 1

810 OM4192 NM— 008767 18400 054959 solute carrier family 22 55.000 C

(organic cation

transporter), member 18

81 1 OM2094 NM_013667 20518 070577 solute carrier family 22 53.333 C

(organic cation

transporter), member 2

812 OM2054A NM— 01 1395 20519 Q9 TW5 solute carrier family 22 55.000 A

Q9R209 (organic cation

transporter), member 3

813 OM4641 N _019687 30805 Q92306 solute carrier family 22 45 000 A

(organic cation

transporter), member 4

814 O 2055 NM_01 1396 20520 Q920E8 solute carrier family 22 46,667 A

(organic cation

transporter), member 5

815 OM4676 NM— 019723 56517 Q9WTN6 solute carrier family 22 50.000 A

(organic cation

transporter), member 9

816 OM2056A NM— 01 1397 20522 Q922J0 solute carrier family 23 50.000 A

Q8C3 2 (nucleobase

Q91WR7 transporters), member 1

817 NM— 021353 13487 Q9WVC8 solute carrier family 26 48.333 A

(chloride anion

exchanger), member 3

818 O 2209A NM.007885 13521 Q62273 solute carrier family 26 46.667 A

(sulfate transporter),

member 2

819 O 3491 NM— 011867 23985 Q9R155 solute carrier family 26, 56.667 A member 4

873 OM2641 NM 009348 21684 008524 ； ectorin beta 56.667 D

874 N _010330 13723 P21995 Teratocardnoma 56.667 A glycoprotein GP - 70

875 NM— 020487 57256 Q9JHJ7 testis in 56.667 D

Q9DA14

876 MB310 J04060 21824 P15306 thrombomodulin 58.333 A

877 0匪 67 NM— 016715 57914 Q9JMD5 thymic stroma卜 derived 58.333 B

Q8CII9 ymphopoietin, receptor

Q9CRJ6

Q9JEE7

Q9JIQ7

Q9JJH8

878 OM2692A NM.009417 22018 P35419 thyroid peroxidase 56.667 A

Q8C8B1

879 NM— 009403 21949 P32972 TNFSF8 or CD30LG or 55.000 A

CD30し

880 O 3526A NM^01 1905 24088 Q9QUN7 tolhiike receptor 2 58.333 A

Q9DBC4

881 O 3980 NM 016928 53791 Q9Jし F7 toll-like receptor 5 48.333 A

882 O 2848 NM— 011604 21899 Q9WTQ4 toll-like receptor 6 58.333 A

Q9EPW9

883 NM 053205 1 1 1 174 Q923Y8 trace amine receptor 1 45.000 A

884 O 1 131 M29618 22042 Q6235 ¾ O O D1 transferrin receptor 43.333 A

Q61560

885 OM3822 NM— 015799 50765 Q9JKX3 transferrin receptor 2 56.667 A

Q920I6

Q99 Q9

Q9CPT2

886 MA270 D32072 21813 Q62312 transforming growth 58.333 A

Q63947 factor, beta receptor EI

887 NM— 009443 22134 Q6Z313 trans-golgi network 43.333 A protein

888 NM— 009444 22135 Q62314 trans-golgi network 46.667 A protein 2

889 O 2874 NM— 01 1643 22063 Q61056 transient receptor 45細 A

035722 potential cation channel,

subfamily C, member 1

890 OM2875 NM一 011644 22064 Q9R244 transient receptor 41.667 A

Q9ES59 potential cation channel

Q9ES60 subfamily C， member 2

Q9R243

891 OM4542 NM— 019510 22065 Q9QZC1 transient receptor 41.667 A

Q61058 potential cation channel

subfamily C， member J

892 OM3006 NM— 016984 22066 transient receptor 43.333 A potential cation channel

subfamily C， member 4

893 OM2699 NM— 009428 22067 Q9QX29 transient receptor 48.333 A

Q61059 potential cation channel

Q9QWT1 subfamily G, member 5

Q9R0D4

894 OM2987 NMJ)13838 22068 Q61 143 transient receptor 41.667 A

Q9Z2J1 potential cation channel

subfamily C, member 6

895 OM3622 NM一 012035 26946 Q9WVC5 transient receptor 43.333 A potential cation channel

subfamily C, member 7

990 01 1925 26364 CD97 antigen 51.667 A

991 NM.010684 16783 P1 1438 lysosomal membrane 58.333 A

Q62020 glycoprotein KCD107A)

992 O 2026 NM.011352 20361 Q9QUR8 sema domain, 58.333 B

088371 immunoglobulin domain

(Ig), and GPi membrane

anchor, (semaphorin;

7A(CD108 antigen)

993 MB 195 NM_O07779 Ϊ 2978 P09581 colony stimulating 56.667 A

Q9DBH9 factor 1

994 M85 NM.207624 1 1421 P09470 angiotensin converting 58.333 B enzyme(CD143)

995 OM0514A Y16256 12215 Basigin(CD147 antigen) 58.333 A

996 OM3665 NM_013730 27218 Q9QU 4 signaling lymphocyte 43.333 A o o Q σ σσ σο οοοσσσασ οσσσ ο oσ α o a.9QXZ3 activation

0.

molecule(CD150)

5 =

997 NM 018767 54215 08 oo88 O

O r75 CD 160 antigen 53.333 D

998 NM_009655 1 1658 O CO CD166 antigen 56.667 A

M o o

999 OM0406 NM— 00991 1 12767 chemokine (G - X_C 56.667 A motif) receptor

4(CD184)

1000 OM4322A NM_010818 17470 CD200 antigen 41.667 A

1001 NM— 021325 57781 Q9ES57 CD 200 cell surface 41.667 B glycoprotein receptor

1002 NM一 013825 17076 Q60767 lymphocyte antigen 56.667 A

Q8C7T3 75(CD205antigen)

Q91 XL8

Q9QUZ6

1003 NM 144943 246278 Q8R442 CD 207 antigen 58.333 C

1004 NMJ 33238 170786 Q912X1 CD209a antigen 55 000 A

Q91ZW5

1005 NM— 026972 69165 CD209b antigen 56.667 A

1006 NMJ 30904 170779 Q91ZW8 CD209d antigen 51.667 A

Q8VIK4

1007 NM 130905 170780 Q91 ZW7 Cd209e antigen 53.333 A

産業上の利用可能性

本発明により、膜タンパク質をコードする核酸を特異的に検出することができ、従つて膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を迅速かつ網羅的に検出することができる

Claims

請求の範囲

[1] 膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の 5%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードする部分を含むェキソン中の配列からなり、かつシトシンおよびグァニンを合計で 40〜60%の割合で含有する該部分領域を選択し、該部分領域からなる DNAまたは該部分領域に相補的な塩基配列カゝらなる DNAを作成することを含む、膜タンパク質をコードする核酸に対するプロ一ブ DNAを作成する方法。

[2] 請求項 1記載の方法によって作成されたプローブ DNAと試料由来の核酸とをノ、ィブリダィズさせることによって、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法。

[3] 膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の 5%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードする部分を含むェキソン中の配列からなり、かつシトシンおよびグァニンを合計で 40〜60%の割合で含有する該部分領域からなる DNA及び該部分領域に相補的な塩基配列からなる DNAから選択されるプローブ DNAが固定化されてなる担体。

[4] 以下の (a)〜(e)の DNAからなる群力選択されるプローブ DNAが固定化されてなるプローブ DNA固定化担体：

[5] 担体が、基板上にプローブ DNAと共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物力選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体である、請求項 3または 4記載のプローブ DNA固定ィ匕担体。

[6] 請求項 3〜5のいずれ力 1項記載のプローブ DNA固定化担体を用いて、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法。

[7] 以下の (a)〜(e)の DNAからなる群から選択されるプローブ DNA: