WO2006069537A1 - Procede d'amplification optimale sur une reaction en chaine par polymerase - Google Patents

Procede d'amplification optimale sur une reaction en chaine par polymerase Download PDF

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Junhong Lv
Xiaodong Zhang
Jun Hu
Zhizhou Zhang
Chunbai Fan
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Definitions

  • the present invention is achieved by the following technical solutions (see FIG. 1).
  • the present invention adds an optimized medium material of any of the following elemental forms to a PCR system: elemental gold material, elemental titanium material, elemental nickel material, elemental bismuth material, Elemental bismuth materials, elemental selenium materials, elemental chrome materials, or mixtures containing the above optimized materials to optimize PCR amplification, as follows:
  • the effective amount of colloidal gold is 0.06 ⁇ 6.0 ⁇ , wherein the concentration of 5nm is 0.01%.
  • the effective addition amount of colloidal gold of HAuC14 is 0.06 ⁇ 0.5 ⁇ , preferably 0.08 ⁇ 0.16 L ; 10nm
  • the colloidal gold with a concentration of 0.01% HAuC14 is effectively added in an amount of 0.5 to 2.5 ⁇ M: preferably 0.5 to 1.6 L ; the concentration of 20 nm is 0.01%.
  • the effective amount of colloidal gold of HAuCW is 0.8 to 6. ( ⁇ L, preferably 0.8 to 3.5) L ; colloidal other elemental optimized dielectric materials are prepared or commercially available according to conventional literature reports. At conventional concentrations, the dosage is 0.5 ⁇ 4 ⁇ :.
  • the above optimized materials may be arbitrarily combined into a mixture, and the amount of each component in the mixture varies depending on the type of the material and the form of the material. .
  • a total amount of the powdered material mixture to 50 ⁇ ⁇ ⁇ 5000 ⁇ ⁇ ; a total amount of colloidal material mixture is 0.06 ⁇ 6.0 ⁇ :; powdery material and colloidal material when mixed, The total amount of colloidal material is 0.02 ⁇ 6.0 ⁇ , and the total amount of powdery material is 2( ⁇ g ⁇ 500( ⁇ g.
  • the optimized material metal gold is also suitable for the polymerase extension reaction similar to the PCR reaction principle and the optimization of other biochemical methods based on the PCR method.
  • the price of commercial colloidal gold is also cheaper than that of single-stranded binding proteins, and the reagents are once good, easy to store and accurately loaded.
  • the optimized PCR reaction system of the invention is not only suitable for a PCR instrument with precise temperature control, but also for a PCR instrument with poor temperature control performance.
  • Figure 11 is an optimized amplification effect of titanium wire on multiplex PCR reaction.
  • the template molecule was amplified by PCR, and the amplification conditions were the same as those in Example 1 ;
  • Amplification of template molecules by PCR using a rapid amplification procedure: 30 cycles, each cycle including 98 ° C for 1 second; 60 ° C annealing for 15 seconds, 30 cycles after 72 ° C Extend for 5 min.
  • the mixture corresponding to 3 lanes in each 25 ⁇ reaction system is titanium powder 20 ⁇ ⁇ chrome powder 1200 ⁇ ⁇ ; corresponding to 4 lanes is titanium powder 800 ⁇ ⁇ chrome powder 300 ⁇ ⁇ ; corresponding to lane 5 is titanium powder 20 ⁇ ⁇ chrome powder 300 ⁇ ⁇

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Description

核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法 技术领域
本发明涉及的是一种生物技术领域中的方法，特别是一种核酸聚合酶链式反应扩增的 优化方法。 背景技术
核酸聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种在体外模拟自然 DNA复 制的核酸扩增技术， 由 K. Mullis于 1985年发明， 能在一个试管内将所要研究的目的基因 或某一特异性 DNA片段于数小时内扩增至百万倍， 可从一根毛发、 一滴血、 甚至一个细 胞中扩增出足量的 DNA供分析研究和检测鉴定。尽管 PCR反应已发展成为一项成熟技术， 常规实验中失误率较小， 但实际操作中， 进行 PCR扩增始终存在一些需要改进的问题， 如特异性、 灵敏度、 反应速度等问题。 最突出的问题就是 PCR扩增存在不同程度的非特 异性， PCR作为一种体外模拟的生化反应， 机制非常复杂， 在链式反应过程中总是会发生 一定程度的干扰副反应， 如引物模板可能错配、 引物结合形成二聚体等引起的扩增等等。 这些副反应在常规 PCR扩增时对结果的影响不是很明显， 因为常规 PCR扩增的模板数量 大，通常超过 103以上，在指数级扩增的过程中模板扩增数远远大于副反应产物的扩增数， 非特异性扩增比例很低。但是在以下情况副反应产物的扩增则不能忽略， 如从高度复杂的 基因组模板中选择性地扩增特异性的极低拷贝数 DNA, 扩增单分子 DNA， 超长 DNA片 段， 多重 PCR扩增， 一次扩增不完美 （成功） 而再扩增， 以及快速 PCR扩增等。 这些副 反应轻则引起非特异性的扩增 （在后续电泳检测中表现为的弥散拖尾条带和非特异性条 带）， 导致扩增效率不高， 重则可能导致正常扩增反应失败。 提高 PCR扩增的特异性和反 应效率不仅取决于引物序列的优化设计， 很大程度上也依赖于反应体系和程序的优化。 多 年以来人们对 PCR的反应组分的优化已经做了大量的研究， 通过向反应体系中加入甲酰 胺、 甘油、 二甲基亚砜等， 可以在一定程度上改善非特异性扩增问题， 但在实际实验和应 用中， 有些效果并不很显著， 有些添加组分（比如二甲基亚砜）过多甚至抑制聚合酶的活 性。
经对现有技术文献的检索发现， 美国专利 US PATENT 5,646,019公开了 "一种利于 引发扩增核酸模板的制备方法"，该方法是在 PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白（SSB, single-stranded nucleic acid binding protein) ， SSB蛋白只结合单链 DNA， 但不结合双链 DNA， 通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增， 从而实现了 PCR扩增的优化。 由于提取纯化 SSB蛋白技术复杂， 试剂纯度也要求很高， 导致制备成本非常高， 商品化 试剂盒非常昂贵，价格是常规 PCR试剂的 6-7倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性， 要求严格贮存于一 20°C， 并且其生物活性有较短的时间期限。 发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种核酸聚合酶链式反应扩增的优化 方法。 使其具有优化扩增的效果显著， 制备简便， 成本低廉， 易于保存， 应用广泛， 优化 材料易于从体系中分离的优点， 扩增产物的特异性得到显著提髙， 在某些反应中产物的产 量也得到明显的提高， 并且能够实现快速 PCR扩增。
本发明是通过以下技术方案实现的 （见图 1 )， 本发明通过向 PCR体系中添加以下任 一种单质形态的优化介质材料： 单质金材料、 单质钛材料、 单质镍材料、 单质铋材料、 单 质锑材料、 单质硒材料、 单质铬材料， 或者包含以上优化材料的混合物来实现对 PCR扩 增的优化， 具体如下：
(1) 单质形态的优化介质材料制备， 是指：
①以上单质形态表现的各优化介质材料为丝状、 片状、 不规则形状、 粒状、 粉状或胶 体状。 其中丝状、 片状、 不规则形状、 粒状、 粉状优化介质材料釆用市购方式获得， 对粉 状材料的粒径没有限制， 从纳米级到微米级均可； 胶体状材料可釆用市购商品， 也可以按 照常规方法制得， 其粒径大小没有限制。
例如胶体金， 可以釆取白磷还原法、 柠檬酸纳还原法、 柠檬酸钠 -鞣酸还原法等多种 方法制取， 例如参照 Frens在 1973年创立的柠檬酸三钠还原法， 先将 0.01%的 HAuCl4溶 液加热至沸腾， 迅速加入一定量 1%柠檬酸三钠水溶液， 开始有些蓝色， 然后浅蓝、蓝色， 再加热出现红色，煮沸 7〜10min出现透明的橙红色即可，所有溶液采用灭菌后纯水配制。 市购胶体金例如可以从 Sigma公司购买得到 5nm， 10nm, 20nm的胶体金， 浓度为 0.01% HAuCl4。 使用前不需稀释。
②丝状材料、 片状材料、 不规则形状材料依次在无菌水、 无水乙醇中反复清洗， 晾 干备用； 粒状、 粉状材料依次在无菌水、 无水乙醇中清洗、 沉淀， 烘干备用； 胶体状材料 无需清洗处理。
(2)丝状、 片状、 不规则形状、 粒状或粉状材料使用前应用干法、 湿法或紫外线辐照 灭菌； 胶体状溶液使用前不再需要灭菌-。 PCR体系优化， 是指将适量的以上任一种材料或者包含以上优化材料的混合物加入 PCR反应体系当中进行 PCR扩增； 所述的适量是指在 25μί的 PCR反应体系当中加入的 优化材料的用量如下，若 PCR反应体系大于或小于 25μί，则优化材料的用量按比例调整。
将丝状、片状或不规则形状的单质优化介质材料剪成适当长度和形状， 使其能够加入 到盛有 25μί反应溶液的 PCR反应管中， 并使溶液浸没材料表面且液面不高于自 PCR管 底部起 0.6cm，超过这一高度则温度不能达到均匀性分布， 同时考虑到优化效果的显著性， 丝状、片状或不规则形状的单质金材料的最小加入量以总表面积达到 4mm2为限，而丝状、 片状或不规则形状的其它单质优化介质材料的最小加入量以总表面积达到 2mm2为限； 粒状材料依颗粒大小不同加入 1粒至数粒，加入到盛有 25 L反应溶液的 PCR反应管 中，并使溶液浸没材料表面且液面不高于自 PCR管底部起 0.6cm，并且材料最小加入量以 总表面积 2mm2为限， 表面积低于 2mm2优化效果不显著；
在最终的 25 LPCR反应体系中， 200-300目的钛粉的有效用量为 20μ§~1000μ§， 优选 用量为 50μδ~800μβ。 200 目的铬粉的有效用量为 450μβ~1500μβ， 优选用量为 600μ§~1200μ§; 其他粉状材料的有效用量为 50μ§~5000μ§， 其中金粉的有效用量以不少于 2mg为宜； 为了获得准确的加入量， 准确称取粉状材料适量， 加入适量灭菌水中， 完全混 悬后立即准确吸取适量混悬液加入到 PCR反应体系中， 最后采用纯水补齐 PCR反应体系 至 25μ 。
在最终的 25 LPCR反应体系中， 胶体金的有效用量为 0.06~6.0μΙ^， 其中 5nm的浓度 为 0.01% HAuC14的胶体金有效加入量为 0.06~0.5μί， .优选 0.08~0.16 L; 10nm的浓度为 0.01% HAuC14的胶体金有效加入量为 0.5~2.5μΐ:， 优选 0.5~1.6 L; 20nm的浓度为 0.01% HAuCW的胶体金有效加入量为 0.8~6.(^L， 优选 0.8~3.5 L; 胶体状的其他单质优化介质 材料依常规文献报道方法制备或市购， 在常规浓度下， 用量为 0.5~4μΐ:。
在最终的 25 LPCR反应体系中， 以上优化材料可以任意组合成为混合物， 混合物中 各组分的用量依材料的种类、材料的形态不同而不同。 以粉状材料和.胶体状材料为例， 粉 状材料混合物的总用量为 50μ§~5000μ§; 胶体状材料混合物的总用量为 0.06~6.0μΐ:; 粉状 材料和胶体状材料混用时， 胶体状材料的总用量为 0.02~6.0μΙ^， 同时粉状材料的总用量为 2(^g~ 500(^g。
所述的 PCR扩增依照常用的 PCR扩增程序， 设定如下：
首先 94°C预热 2分钟； 接着 30~45个循环， 每个循环包括： 94°C变性 30秒， 58 °C退火 1~3分钟， 72°C延伸 45秒〜 3分钟， 最后 72°C延伸 7〜10 min。其中循环次数、退 火时间、 延伸时间可以根据扩增目的、 待扩增对象和引物的不同而不同。
(4) PCR产物检测， 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳， 检查扩增条带， 与对 照体系进行比较。
(5) 优化材料从反应结束体系中的分离， 需要回收扩增得到的 : PCR产物， 则可从反 应结束体系中分离出优化材料。
所述的优化材料从反应结束体系中的分离， 对丝状材料、 片状材料、 不规则材料直接 吸取溶液即可达到分离目的；对粉状或粒状材料做低速离心，吸取上清液可达到分离目的； 对胶体状材料做 -20°C冷冻过夜， 解冻后高速离心， 吸取上清液可达到分离目的。
所述的 PCR扩增是指各种 PCR扩增， 包括常规 PCR、 高度复杂的基因组模板中选择 性地扩增特异性的极低拷贝数 DNA、 长片段 PCR、 多重 PCR、 单分子 PCR、 一次扩增不 完美 （成功） 而需要再扩增以及快速 PCR。
所述的优化材料金属金也适用于与 PCR 反应原理类似的聚合酶延仲反应以及基于 PCR方法基础的其他生化方法的优化。
所述的 PCR体系参见各种商业聚合酶说明书。 以 Takara公司 Ex Taq酶为例， PCR 体系的组成为：
Figure imgf000006_0001
所述的 PCR产物检测是指釆用常规技术对 PCR产物进行检测， 如对扩增后的 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测或对扩增后样品进行毛细管电泳检测。
所述的琼脂糖凝胶电泳依照已有技术， 包括以下步骤-
1 ) 制备 1.5 %的琼脂糖凝胶 （含染色剂溴乙锭)；
2) 吸取不同样本的 PCR产物上电泳槽点样， 同时点分子量标记作为参照；
3 ) 加以 4〜5V/cm的电压， 电泳；
4) 凝胶成像系统紫外检测分析结果。
本发明与已有方法相比， 本发明具有优化扩增的效果显著， 制备简便， 成本低廉， 易 于保存，应用广泛，优化材料易于从体系中分离的优点。扩增产物的特异性得到显著提高， 在某些反应中产物的产量也得到明显的提高。 单质金材料、 单质钛材料、 单质镍材料、 单 质铋材料、 单质锑材料、 单质硒材料、 单质铬材料不会对聚合酶产生抑制作用， 可以长期 保存在 4°C， 并且没有失去活性的担心。 例如商品化钛粉价格只有单链结合蛋白的 1/100， 而且无须特别制备。 商品化胶体金价格也比单链结合蛋白便宜， 试剂均一度好， 易于保存 和准确加样。 本发明优化后的 PCR反应体系不仅适用于控温精确的 PCR仪， 也适用于控 温性能较差的 PCR仪。本发明发展的 PCR扩增优化方法可以应用于各种 PCR扩增、聚合 酶延伸以及基于 PCR方法基础的其他生化方法， 尤其适用于一些较难扩增类型的 PCR方 法诸如： 低拷贝模板 DNA的 PCR、 单分子 PCR、 多重 PCR、 长片段 PCR、 以及一次扩增 不成功而需要再扩增等等， 也适用于縮短反应时间， 实现快速 PCR扩增。 本发明对基因 检测与克隆、 遗传分析、 临床诊断、 基因芯片以及新材料等领域有着潜在而巨大的应用价 值。 附图说明
图 1为本发明方法的流程示意图
图 2为金箔对常规 PCR反应的优化扩增效果图
图 3为镀金薄膜表面对倍比稀释低拷贝模板 PCR反应的优化扩增效果图
图 4为胶体金对单分子 PCR扩增的优化扩增效果图
图 5为胶体金对多重 PCR扩增的优化扩增效果图
图 6为胶体金对长片段 PCR扩增的优化扩增效果图
图 7为不同粒径胶体金对 PCR再扩增的优化扩增效果图
图 8 为胶体金对 PCR再扩增的优化扩增效果图
图 9 为钛粉对常规 PCR反应的优化扩增效果图
图 10 为钛粉对 PCR再扩增的优化扩增效果图
图 11为钛丝对多重 PCR反应的优化扩增效果图
图 12为单质镍材料、 单质铋材料、 单质锑材料、 单质硒材料、 单质络材料对 PCR再 扩增反应的优化扩增效果图.
图 13 为铬粉对 PCR再扩增的优化扩增效果图
图 14 为应用胶体金实现快速 PCR扩增效果图
图 15 为混合物对 PCR再扩增的优化扩增效果图 具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不限制本发明。 实施例 1 金箔对 PCR反应的优化
针对一些形成非特异性扩增的 PCR扩增的优化改进， 包括下列步骤:
1、 制备 PCR体系， 组成如下表-
Figure imgf000008_0001
其中， 模板为 λϋΝΑ, 购自华美生物工程公司， £ 1^酶购自丁&1^ 公司， 扩增片段 长 度 为 283bp 。 引 物 序 列 为 pi: 5'-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3' ； p2: 5'-CACCACCTGTTCAAACTCTGC-3'。
2、向以上 PCR体系中加入清洁及灭菌处理后的优化材料金箔，金箔剪为 2mmx2mm， 每个 25μί反应体系中加入至少 1片， 同时做不加优化介质的相应对照实验；
3、利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 扩增条件为： 94°C预热 2 分钟； 30个循环， 每个循环包括： 94Ό变性 30 秒， 58°C退火 1分钟， 72°C延伸 45秒；最后 72°C延伸 7 min。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图 2所示。 从左至右依次为 1 : 分子量标记 （Takara公司 DL2000, 分别 为 2000bp， lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp); 2, 3， 4： 加入优化材料金箔的体 系， 为三个平行样； 5， 6， 7： 常规 PCR体系， 也为三个平行样。 可以看出加入优化材料 金箔的体系 PCR扩增结果中非特异性扩增极少， 而相应的未加入金箔的常规 PCR体系扩 增结果显示严重的后续拖尾， 表明非特异性扩增严重。 该 PCR扩增结果显示了本发明的 优化方法效果显著。 实施例 2镀金薄膜表面对倍比稀释低拷贝模板 PCR反应的优化
针对倍比稀释低拷贝模板 PCR扩增的优化改进， 包括下列步骤- 1、 对质粒 pBR322 DNA分子 （购自华美生物工程公司） 进行倍比稀释， 得到一系列 拷贝数的模板， 模板数从 105拷贝至理论上接近单拷贝； 2、 制备 PCR体系， 组成如实施例 1， 不同之处在于模板改为不同稀释倍数的 pBR322 模板，扩增片段长度为 342bp。引物序列为： pi： 5'-CTAACGGATTCACCACTCCAAGAA-3'； p2: 5'-GACTTCCGCGTTTCCAGACTTTAC-3'。
3、 以上 PCR体系中模板数为 105、 104、 103、 102拷贝的体系中均不加优化材料， 各
1个样品， 作为对照； 而模板数理论上接近单拷贝的体系做 3个样品， 其中一个样品中不 加入优化材料， 作为对照， 另两个样品中加入清洗和灭菌处理过的优化材料镀金薄膜， 基 底为硅材料， 单面镀金， 镀金表面大小为 1.5mmx4mm， 每 25 L的体系中加入 1片。 '
4、 利用 PCR技术分别对模板分子进行扩增， 扩增条件为： 94°C预热 2 分钟； 45个 循环， 每个循环包括： 94°C变性 30 秒， 58°C退火 1分钟， 72Ό延伸 45秒；
最后 72°C延伸 7 min。
5、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。 扩增结果如图 3所示。 从左至右依次为， 1 : 分子量标记 （Takara公司 DL2000, 分别 为 2000bp， lOOObp, 750bp， 500bp, 250bp, lOObp); 2： 模板拷贝数为 105个的 PCR体 系； 3 : 模板拷贝数为 104个的 PCR体系； 4: 模板拷贝数为 103个的 PCR体系； 5： 模 板拷贝数为 102个的 PCR体系； 6： 模板拷贝数为 101个的 PCR体系； 7， 8， 9： 模板拷 贝数为接近 1个的 PCR体系； 10为空白阴性对照。 其中 2， 3， 4， 5， 6， 7中均未加优化 材料镀金薄膜， 8， 9和 10中加入优化材料镀金薄膜。 实验设计为模板较多的样品不加优 化材料， 作为对照， 而对极低拷贝数模板的样品加入优化材料。 从图中可以看出， 未加优 化材料的体系 2， 3, 4， 5， 6, 7均有较严重的拖尾现象， 而加入优化介质镀金薄膜的体 系即使是接近单拷贝的模板也可以消除非特异性扩增， 显示明显的单目标条带。 该 PCR 扩增结果显示了本发明的优化方法效果显著。 实施例 3 胶体金对单分子 PCR扩增的优化
对单分子 PCR扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、 对质粒 pBR322 DNA分子 （购自华美生物工程公司） 利用原子力显微镜操纵进行 单分子精确拾取， 拾取后的单分子制备为单拷贝模板溶液；
2、 制备 PCR体系， 组成如实施例 1， 不同之处在于模板改为单拷贝的模板溶液。 扩 增片段长度、 引物均与实施例 2相同。
3、 向以上 PCR体系中加入优化胶体金材料（购自 Sigma公司， 浓度为 0.01% HAuCl4 的 10nm胶体金溶液）， 每个 25 L的体系中胶体金溶液的用量为 L， 同时做不加优化材 料的相应对照实验； 4、 利用 PCR技术分别对模板分子进行扩增， 扩增条件为： 94°C预热 2分钟； 50个 循环， 分三步： 第一步 10个循环， 每个循环包括： 94°C变性 30秒， 65Ό退火 3分钟， 72°C延伸 45秒； 第二步 10个循环， 每个循环包括： 94°C变性 30秒， 65°C降落至 58 °C退火 1分钟， 72°C延伸 45秒； 第三步 30个循环， 94°C变性 30秒， 58°C退火 1分钟，
72。C延伸 45秒， 最后 72Ό延伸 7分钟。
5、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
.扩增结果如图 4所示。 从左至右依次为， 1 : 分子量标记（Takara公司 DL2000, 分别 为 2000bp， lOOObp, 750bp, 500bp， 250bp, lOObp ) ; 2, 3 , 4 ： 加入优化材料胶体金的 单分子 PCR扩增体系； 5：不加入优化材料胶体金的倍比稀释 10个分子的 PCR扩增体系； 6： 不加入优化材料胶体金的单分子 PCR扩增体系； 7， 8： 不加入优化材料的空白阴性对 照。 从图中可以看出， 未加优化材料的体系 5， 6均有较严重的拖尾现象， 而加入优化介 质胶体金的体系 2， 3， 4均消除了非特异性^广增， 显示明显的单目标条带。 该 PCR扩增 结果显示了本发明的优化方法效果显著。 实施例 4胶体金对多重 PCR扩增的优化
针对多重 PCR扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、制备 PCR体系， 组成如实施例 1， 不同之处在于釆用了 8对引物进行多重 PCR扩 增，分别扩增 长度为 159bp, 283bp, 485bp, 573bp, 660bp, 785bp, 942bp and 1240bp 的 DNA 分子。 共釆用 8对引物， 序列如下- 引物 1 : pi : 5'-GGATGACCCCTCCAGCG-3'; p2: 5'-CCGTAAACTCCACCCTTCG-3' 弓 1物 2： pi : 5'-GATGCTTGAACCCGCCTAT-3*； p2: 5'-GCCTGTCGTGGTCCGTC-3' 引物 3 : pi : 5'-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3'； p2: 5'-CACCACCTGTTCAAACTCTGC-3' 引物 4: pi : 5'-TGGAGCGTGAGGAATGGG-3'; p2: 5'-GCCGTGTTCGGGTAGCA-3' 引物 5: pi : 5'-CTCGCTCATAACAGACATTCACT-3'； p2: 5'-TCAACATCTTCTCGGGCATA-3' 引物 6: pl :5'-GCACAAGTCCGACAACCC-3'; p2:5'-GCTGAGGAGATAAATAATAAACGAG-3' 引物 Ί pl :5'-CAAAACTAAGGGCATAGACAATAA-3';
p2: 5'-TGGTTCAGAAGATAAATCGCTC-3'
弓 1物 8： pi : 5'-CGGAACATCTCGGTAACTGC-3'; p2:5'-CGTCGCTGTCTCGCCAC-3'
2、加入优化介质胶体金（购自 Sigma公司， 浓度为 0.01% HAuC 的 10nm胶体金溶 液），每个 25 L的体系中胶体金溶液的用量为 l L，同时做不加优化材料的相应对照实验；
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 扩增条件同实施例 1。 4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。 . 结果见附图 5。 从左至右 1， 2, 3为常规 PCR体系扩增结果， 是三个平行样； 4， 5，
6为加入优化材料胶体金的 PCR体系扩增结果， 也是三个平行样。 7为分子量标记 （从下 至上为 100bp、 200bp、 300bp、 400bp、 500bp、 600bp、 700bp、 800bp、 900bp、 1000bp、
1500bp) o 可以看出 1， 2， 3样本扩增结果中有多条带出现非特异性扩增或者产物拖尾等，
4， 5， 6样本条带清晰， 得到明显优化。 实施例 5 胶体金对长片段 PCR扩增的优化
针对长片段 PCR扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、制备 PCR体系， 组成如实施例 1， 扩增 长度为 4200bp的长片段。引物序列为 P1 :
5'-ACGCTCGTCGTTTGGTATGGC-3' ； P2: 5'-CCGGCTGGCTGGTTTATTGC-3'。
2、 加入处理过的优化介质胶体金 （购自 Sigma公司， 浓度为 0.01% HAuCl4的 10nm 胶体金溶液）， 每个 25 L的体系中胶体金溶液的用量为 L， 同时做不加优化材料的相应 对照实验；
3、利用 PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件为 40个循环， 95°C预热 2分钟， 94 °C变性 30 秒， 58Ό退火 1分钟， 72Ό延伸 3分钟， 最后 72Ό延伸 10分钟。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果见附图 6。 目的片段 4.2kb， 以上从左至右 1为分子量标记 DL15,000 (Takam公 司， DNA片段由上至下为 15,000 bp、 10,000 bp, 7,500 bp、 5,000 bp、 2,500 bp、 1,000 bp 以及 250 bp而构成） 2、 3、 4为普通反应体系结果， 5、 6为普通反应体系加入胶体金的 结果， 7为阴性空白对照。 以上反应条件相同， 可以看出 2， 3 , 4样本扩增条带出现较 宽的非特异性扩增产物弥散等， 5、 6样本只有单一的清晰条带， 明显改观。 实施例 6 不同粒径胶体金对 PCR再扩增的优化
根据实验要求， 有时需要扩大 PCR产量， 或者第一次扩增不成功而需要从扩增不太 好的杂带中纯化特定条带， 这就需要对前一批次的 PCR产物进行再扩增。 针对 PCR再扩 增的优化改进， 包括下列步骤：
1、制备 PCR体系，组成如实施例 1，不同之处在于模板为前一轮次的 PCR扩增产物， 扩增长度为 283bp的片段， 引物序列与实施例 1相同。
2、 加入优化介质购自 Sigma公司的 5nm， 10nm, 20nm的胶体金溶液 （该三种胶体 金溶液的浓度均为 0.01% HAuCl 每个 25 L的 PCR反应体系中分别针对不同粒径的胶 体金加入不同的梯度增加的量， 同时做不加优化材料的相应对照实验； 3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 每轮扩增条件同实施例 1。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果见附图 7。 其中 1， 13， 25为分子量标记 （Takara公司 DL2000, 分别为 2000bp， lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp); 2, 14， 26为不加优化材料的常规 PCR体系再 扩增结果， 为阳性对照； 12、 24、 36为阴性对照； 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11为加入 优化材料 5nm胶体金的再扩增体系，每 25μί反应体系中 5nm胶体金的用量对应于 3— 11 泳道依次为 0.03μί、 0.06μί、 0.08 L、 0.1 L、 0Λ2μΙ, 0.14μί、 0.16μΙ^、 0.25 L、 0.5μΙ·, 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23 为加入优化材料 10nm胶体金的再扩增体系， 每 25μΐ:反应体系中 10nm胶体金的用量对应于 15— 23泳道依次为 0.2 L、 0.5μΙ, 0.6 L、 0,8μΐ:、 1.0μί、 1.3 L、 1.6 L、 2·0μί、 2.5 L; 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35为 加入优化材料 20nm胶体金的再扩增体系， 每 25 L反应体系中 20nm胶体金的用量对应 于 27— 35泳道依次为 0.5 L、 0.8 L、 1.5μί、 2.0μΙ^、 2.5 L、 3.0 L、 3.5 L、 4.5 L、 6.0 L。 从图中可以看出加入优化材料胶体金对再扩增体系 PCR的结果产生了明显的优化作用， 而相应的未加入胶体金 PCR体系扩增结果显示严重的后续拖尾和非特异性杂带。 不同粒 径的胶体金产生优化作用所需的量不同， 5nm的有效用量在 0.06 L至 0.5μί，以 0.08 L M 0Λ6μΙ的优化效果佳； 10nm的有效用量在 0.5 L至 2.5 L， 以 0.5 L至 1.6 L的优化效 果佳； 20nm的有效用量在 0.8μί至 6.0μί， 以 0.8 L至 3.5 L的优化效果佳。 该结果显 示了本发明的优化方法效果显著。 实施例 7胶体金对 PCR再扩增的优化和目标产物产量测定
针对 PCR再扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、制备 PCR体系，组成如实施例 1，不同之处在于模板为前一轮次的 PCR扩增产物， 扩增长度为 283bp的片段， 引物序列与实施例 1相同。
2、 加入优化介质胶体金（购自 Sigma公司， 浓度为 0.01% HAuCl4的 10nm胶体金溶 液），每个 25 L的体系中胶体金溶液的用量为 ΙμΙ^,同时做不加优化材料的相应对照实验；
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 每轮扩增条件同实施例 1。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。 结果见附图 8。从左至右依次为 1： 分子量标记（Takara公司 DL2000,分别为 2000bp， lOOObp, 750bp， 500bp， 250bp, lOObp); 2, 3 , 4， 5： 常规 PCR体系再扩增， 为四个 平行样； 6， 7, 8， 9： 加入优化材料胶体金的再扩增体系， 也为四个平行样； 10: 阴性对 照。 可以看出加入优化材料胶体金的再扩增体系 PCR结果中非特异性扩增极少， 而相应 的未加入胶体金 PCR体系扩增结果显示严重的后续拖尾和非特异性杂带， 如 2和 3样本， 4， 5 样本甚至扩增不出目的条带， 表明非特异性扩增极其严重。 该结果显示了本发明的 优化方法效果显著。 经对图 8的电泳条带进行光密度分析， 相比泳道 2的目标产物的量而 言， 泳道 6、 7、 8、 9中目标产物量分别增加了 0.8、 0.5、 0.2、 0.2倍。 实施例 8 钛粉对常规 PCR反应的优化
针对一些形成非特异性扩增的 PCR扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、 制备 PCR体系， 组成如实施例 1， 其中， 模板为 λϋΝΑ, 购自华美生物工程公司， Ex Taq 酶购 自 Takara 公司 ， 扩增片段长度为 283bp。 引物序列为 pi: 5'-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3'; p2: 5'-CACCACCTGTTCAAACTCTGC-3';
2、 向以上 PCR体系中加入优化材料胶体金（购自 Sigma公司， 浓度为 0.01% HAuCl4 的 10nm胶体金溶液）或清洗和灭菌处理过的单质钛粉（购自上海化学试剂公司， 200-300 目）， 每个 25 L反应体系中分别加入 lOnm胶体金溶液各 1μ11， 为 3个平行样， 加入钛粉 分别为 100μ§、 400μ£和 800μ§， 同时做不加优化介质的相应对照实验；
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 扩增条件同实施例 1 ; .
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图 9所示。 从左至右依次为 1 : 分子量标记 （Takara公司 DL2000, 分 别为 2000bp， lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp); 2, 3， 4： 加入优化材料胶体金 各 l L的体系， 为三个平行样； 5， 6， 7： 常规 PCR体系， 也为三个平行样。 8， 9， 10： 分别加入 800μ§， 400μβ, 100μβ钛粉的 PCR体系。 可以看出加入优化材料钛粉和胶体金 的体系 PCR扩增结果中非特异性扩增极少， 而相应的未加入优化介质的常规 PCR体系扩 增结果显示严重的后续拖尾， 表明非特异性扩增严重。加入钛粉 800μ§时显示了一定的抑 制作用， 但条带单一， 而 100μ§及 400μ§均可达到很好的优化效果。 该 PCR扩增结果显 示了本发明的以胶体金或以钛粉为优化材料的优化方法效果显著。 实施例 9 钛粉对 PCR再扩增的优化
针对 PCR再扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、制备 PCR体系，组成如实施例 1，不同之处在于模板为前一轮次的 PCR扩增产物， 扩增长度为 283bp的片段， 引物序列与实施例 1相同。
2、 加入不同量的清洗和灭菌处理过的优化介质材料单质钛粉 （购自上海化学试剂公 司， 200-300目）， 每个 25μί反应体系中分别加入钛粉的质量为 20、 50、 100、 200、 300、
400、 600、 800μβ, 同时做不加优化材料的相应对照实验；
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 每轮扩增条件同实施例 1。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。。
结果见附图 10。从左至右依次为 1 : 分子量标记 (Takara公司 DL2000，分别为 2000bp， lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp); 2为不加优化材料的常规 PCR体系再扩增结果， 为阳性对照； 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10为加入优化材料钛粉的再扩增体系， 每 25 L反 应体系中钛粉的质量对应于 3— 10泳道依次为 20、 50、 100、 200、 300、 400、 800、 lOOC^g; 11为阴性对照。可以看出加入优化材料钛粉的再扩增体系 PCR结果中非特异性扩增极少， 钛粉的有效用量在 20 g至 1000 g， 以 50μ§至 800μ§的优化效果佳； 而相应的阳性对照 扩增结果显示严重的后续拖尾。 该结果显示了本发明的优化方法效果显著。 实施例 10 钛丝对多重 PCR扩增的优化
针对多重 PCR扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、 制备 PCR体系， 组成如实施例 1， 不同之处在于釆用了 8对引物进行多重 PCR 扩增， 分别扩增 长度为 159bp, 283bp, 485bp, 573bp, 660bp, 785bp, 942bp and 1240bp 的 DNA分子。 引物序列同实施例 4。
2、 加入清洗和灭菌处理过的优化介质材料钛丝， 直径为 0.5mm， 长度为 3mm， 同时 做不加优化介质的相应对照实验；
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 扩增条件同实施例 1。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。 结果见附图 11。 从左至右 1， 2, 3为加入优化介质材料钛丝的 PCR体系扩增结果， 是三个平行样； 4， 5， 6为不加任何优化介质的 PCR体系； 7为分子量标记 （从下至上为 100bp、 200bp、 300bp、 400bp、 500bp、 600bp、 700bp、 800bp、 900bp、 1000bp、 1500bp)。 可以看出 4， 5， 6样本扩增结果中有多条带出现非特异性扩增或者产物拖尾等， 1， 2, 3 样本条带清晰， 得到明显优化。 实施例 11 单质镍材料、单质铋材料、单质锑材料、单质硒材料、单质辂材料对 PCR 再扩增反应的优化
针对 PCR再扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、制备 PCR体系，组成如实施例 1，不同之处在于模板为前一轮次的： PCR扩增产物， 扩增长度为 283bp的片段， 引物序列与实施例 1相同。
2、 加入一定量的清洗和灭菌处理过的优化介质单质镍材料、 单质铋材料、 单质锑材 料、 单质硒材料、 单质铬材料， 同时做不加优化材料的相应对照实验；
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 每轮扩增条件同实施例 1。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。 结果见附图 12。 1为分子量标记， 2为不加任何优化介质的普通 PCR体系， 即阳性对 照， 3， 4加入镍丝， 每个体系中加入直径为 0.8mm， 长度为 3.2mm的镍丝； 5、 6—加入 铋颗粒， 每个体系中加入直径为 0.1-0.2mm的球形铋颗粒数粒， 质量 12mg; 7、 8—加入 锑颗粒， 每个体系中加入直径为 0.1-0.2mm的球形锑颗粒数粒， 质量 30mg; 9、 10—加入 硒粉， 每个体系中加入的质量为 400μ§ ; 11 , 12—加入铬粉， 每个体系中加入的质量为 800μ§; 13—阴性对照。 可以看出一定量的镍、 铋、 锑、 硒、 铬都有良好的优化作用， 而 普通 PCR体系有明显拖尾。 实施例 12 铬粉对 PCR再扩增的优化
针对 PCR再扩增的优化改进， 包括下列步骤：
1、制备 PCR体系，组成如实施例 1，不同之处在于模板为前一轮次的 PCR扩增产物， 扩增长度为 283bp的片段， 引物序列与实施例 1相同。
2、 加入不同量的清洗和灭菌处理过的优化介质单质铬粉 （200 目， 上海化学试剂公 司）， 每个 25μ11反应体系中分别加入铬粉的质量为 150、 300、 450、 600、 750、 900、 1000、 1200、 1500、 2000μβ, 同时做不加优化材料的相应对照实验。
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 每轮扩增条件同实施例 1。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。 结果见附图 13。 从左至右依次为： 1为不加优化材料的常规 PCR体系再扩增结果， 为阳性对照； 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 为加入优化材料铬粉的再扩增体系， 每 25 L反应体系中铬粉的质量对应于 2— 11泳道依次为 150、 300、 450、 600、 750、 900、 1000、 1200、 1500、 2000μβ; 12为阴性对照。 13为分子量标记 (Takara公司 DL2000, 分 别为 2000bp， lOOObp, 750bp, 500bp， 250bp， 100bp); 可以看出加入优化材料铬粉的再 扩增体系 PCR结果中非特异性扩增降低， 铬粉的有效用量在 450μ§至 1500μ§， 以 600μ§ 至 1200μ§的优化效果佳； 而相应的阳性对照扩增结果显示严重的后续拖尾。 该结果显示 了本发明的优化方法效果显著。 实施例 13 应用胶体金实现快速 PCR扩增
针对快速 PCR扩增， 包括下列步骤：
1、 制备 PCR体系， 组成如实施例 1， 其中， 模板为大肠杆菌 DNA, 购自博大泰克生 物工程公司， Ex Taq 酶购自 Takara 公司， 扩增片段长度为 997 bp。 引物序列为 pi: 5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3'; p2: 5'-ATCGGTTACCTTGTTACGACTTC-3'；
2、向以上 PCR体系中加入处理过的优化材料胶体金（购自 Sigma公司，浓度为 0.01% HAuCl4的 lOnm胶体金溶液），每个 25 L反应体系中分别加入 lOnm胶体金溶液各 0.5μί， 为 2个平行样， 同时做不加优化介质的相应对照实验， 也为 2个平行样；
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 釆用快速扩增程序： 30个循环， 每个循环包 括 98°C 1秒钟； 60°C退火 15秒钟， 30个循环结束后 72°C延伸 5 min。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
扩增结果如图 14所示。 从左至右依次为 1 : 分子量标记 （Takara公司 DL2000, 分 别为 2000bp， lOOObp, 750bp, 500bp， 250bp, lOObp); 2， 3常规 PCR体系， 两个平行 样； 4， 5加入优化材料胶体金各 0.5μί的体系， 也为两个平行样； 6为不加入模板的阴性 对照。 可以看出在快速 PCR程序中， 不加入优化材料的常规 Taq酶扩增体系在这种快速 扩增程序下不能得到目标条带， 而加入优化材料胶体金的体系 PCR扩增结果得到了较强 的目标条带。 该结果显示了本发明的以胶体金为优化材料的优化方法缩短了反应时间， 从 而实现了快速 PCR扩增， 并明显提高扩增的效率和产量。 实施例 14 混合物对 PCR再扩增的优化
针对 PCR再扩增的优化改进， 包括下列步骤-
1、制备 PCR体系，组成如实施例 1，不同之处在于模板为前一轮次的 PCR扩增产物， 扩增长度为 283bp的片段， 引物序列与实施例 1相同。
2、 加入不同量的优化介质混合物： 市购 200 目单质铬粉 （上海化学试剂公司） 和市 购 200~300目单质钕粉（上海化学试剂公司）混合物；市购 lOnm胶体金溶液（购自 Sigma 公司， 浓度为 0.01% HAuCl4) 和市购 200~300目单质钛粉 （上海化学试剂公司） 混合物； 同时做不加优化材料的相应对照实验；
3、 利用 PCR技术对模板分子进行扩增， 每轮扩增条件同实施例 1。
4、 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
结果见附图 15。从左至右依次为： 1为分子量标记 (Takara公司 DL2000,分别为 2000bp， lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp， lOObp); 2为不加优化材料的常规 PCR体系再扩增结果， 为阳性对照； 3、 4、 5、 6为加入优化材料铬粉和钛粉混合物的再扩增体系， 每 25^反应 体系中混合物对应于 3泳道为钛粉 20μ§铬粉 1200μ§ ； 对应于 4泳道为钛粉 800μ§铬粉 300μ§ ；对应于 5泳道为钛粉 20μ§铬粉 300μ§ ；对应于 6泳道为钛粉 80(^g铬粉 1200μ§ ； 7、 8、 9、 10为加入优化材料 10nm胶体金和钛粉混合物的再扩增体系， 每 25 L反应体系 中混合物对应于 7泳道为 10nm胶体金 0.3 L钛粉 800μ§; 对应于 8泳道为 10nm胶体金 Ι.όμΣ钛粉 2(^g;对应于 9泳道为 10nm胶体金 OJ L钛粉 2(^g;对应于 10泳道为 10nm 胶体金 1.6μί钛粉 800μ§ ; 11 为阴性对照。 可以看出加入优化材料混合物的再扩增体系 PCR结果中非特异性扩增降低，混合物中各材料的有效用量比单独使用时低即可达到优化 效果； 而相应的阳性对照扩增结果显示严重的后续拖尾。该结果显示了本发明的优化方法 效果显著。

Claims

权 利 要 求
1、 一种核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于通过向 PCR体系中添加以 下任一种单质形态的优化介质材料： 单质金材料、单质钛材料、单质镍材料、单质铋材料、 单质锑材料、 单质硒材料、 单质铬材料， 或者包含以上优化材料的混合物来实现对 PCR 扩增的优化， 具体如下-
(1) 单质形态的优化介质材料制备：
① 以上单质形态表现的各优化介质材料为丝状、 片状、 不规则形状、 粒状、 粉状或 胶体状；
② 丝状材料、 片状材料、 不规则形状材料依次在无菌水、 无水乙醇中反复清洗， 晾 干备用； 粒状、 粉状材料依次在无菌水、 无水乙醇中清洗、 沉淀， 烘干备用；
(2) 丝状、 片状、 不规则形状、 粒状、 粉状材料使用前用干法、 湿法或紫外线辐照灭 菌；
(3) PCR 体系优化： 将适量的以上任一种材料或者包含以上优化材料的混合物加入 PCR反应体系当中进行 PCR扩增；
(4) PCR产物检测： 对扩增后的 DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳， 检查扩增条带， 与对 照体系进行比较；
(5) 优化材料从反应结束体系中的分离： 当需要回收扩增得到的 PCR产物时， 则可从 反应结束体系中分离出优化材料。
2、 根据权利要求 1所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于步骤 (3) 中所述适量是指在 25 L的 PCR反应体系当中加入的优化材料的用量为： 丝状材料、片状 材料或不规则形状†才料剪成适当长度和形状， 使其能够加入到盛有 25μί反应溶液的 PCR 反应管中， 并使溶液浸没材料表面且液面不高于自 PCR管底部起 0. 6cm， 而且丝状材料、 片状材料或不规则形状的单质金材料的最小加入量以总表面积 4mm2为限， 丝状材料、 片 状材料、 不规则形状的其他单质优化介质材料最小加入量以总表面积 2mm2为限； 粒状 材料依颗粒大小不同加入 1粒至数粒， 加入到盛有 25μί反应溶液的 PCR反应管中， 并使 溶液浸没材料表面且液面不高于自 PCR管底部起 0.6cm，而且材料最小加入量以总表面积 2mm2为限； 在最终的 25 LPCR反应体系中， 200-300目的钛粉加入量为 2(^g~100(^g， 粉状的其他单质优化介质材料用量为 50μ§~5000μ§; 在最终的 25 LPCR反应体系中， 胶 体金的用量为 0.06~6.0μΙ^ 胶体状的其他单质优化介质材料的用量为 0.5~4μ 3、根据权利要求 2所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于 200-300 目的钛粉加入量为 50μ§~800μ§。
4、 根据权利要求 2所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于 200 目 的络粉加入量在 450μ§~1500μ§。
5、 根据权利要求 4所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于 200 目 的铬粉加入量为 60(^g~120(^g。
6、 根据权利要求 2所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于金粉加 入量大于等于 2mg。
7、 根据权利要求 2所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于 5nm的 浓度为 0.01% HAuCl4的胶体金加入量为 0.06~0.5 L， lOnm的浓度为 0.01% HAuCl4的胶 体金加入量为 0.5~5.0μΐ:， 20nm的浓度为 0.01% HAuCl4的胶体金加入量为 0.8~6.0μί。
S、 根据权利要求 7所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于 5nm的 浓度为 0.01% HAuCl4的胶体金加入量为 0.08~0.16 L， lOnm的浓度为 0.01% HAuCl4的胶 体金加入量为 0.8〜1.6 L， 20nm的浓度为 0.01% HAuCl4的胶体金加入量为 0.
8~3.5 L。
9、 根据权利要求 1所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于步骤 (3) 中所述适量是指在 25μί的 PCR反应体系当中加入的含所述的优化材料的混合物用量为： 以上优化材料可以任意组合成为混合物， 混合物中各组分的用量依材料的种类、材料的形 态不同而不同。 粉状材料混合物的总用量为 50 y g~5000 g; 胶体状材料混合物的总用量 为 0. 06-6. ΟμΙ-, 粉状材料和胶体状材料混用时， 胶体状材料的总用量为 0. 02-6. ΟμΙ, 同 时粉状材料的总用量为 20 μ g~5000 w g。
10、根据权利要求 1所述的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法， 其特征在于所述的 优化材料从反应结束体系中的分离， 对丝状材料、 片状材料、 不规则材料直接吸取溶液即 可达到分离目的； 对粉状或粒状材料做低速离心， 吸取上清液可达到分离目的； 对胶体状 材料做 -20°C冷冻过夜， 解冻后高速离心， 吸取上清液可达到分离目的。
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