WO2006068239A1 - 炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents

炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006068239A1
WO2006068239A1 PCT/JP2005/023634 JP2005023634W WO2006068239A1 WO 2006068239 A1 WO2006068239 A1 WO 2006068239A1 JP 2005023634 W JP2005023634 W JP 2005023634W WO 2006068239 A1 WO2006068239 A1 WO 2006068239A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
galectin
gene
base
inflammatory disease
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/023634
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihiro Tanaka
Koichi Ozaki
Aritoshi Iida
Masatsugu Hori
Yozo Ohnishi
Yusuke Nakamura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN
Original Assignee
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN filed Critical RIKEN
Priority to US11/793,716 priority Critical patent/US8048625B2/en
Priority to JP2006549065A priority patent/JP4801596B2/ja
Publication of WO2006068239A1 publication Critical patent/WO2006068239A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for inflammatory diseases such as myocardial infarction and a screening method for therapeutic agents for inflammatory diseases.
  • Non-Patent Document 1 or 2 In recent years, with changes in lifestyle, the risk of death from inflammatory diseases, particularly coronary artery diseases such as myocardial infarction, has increased (see Non-Patent Document 1 or 2). Therefore, it is desirable to develop a method for determining the onset risk at an early stage for these diseases.
  • Coronary artery diseases such as myocardial infarction have been proposed to develop due to genetic predisposition, and several methods for determining myocardial infarction based on the presence or absence of a gene mutation are known.
  • a method for determining the risk of developing myocardial infarction by analyzing a polymorphism of the prostacyclin synthase gene is known (see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a method for determining the risk of developing myocardial infarction by analyzing a polymorphism of the prostacyclin synthase gene is known (see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a method for determining the risk of developing myocardial infarction by analyzing a polymorphism of the prostacyclin synthase gene is known (see Patent Document 1).
  • Patent Document 1 in order to make more accurate judgments, further development of judgment methods was required.
  • the levtin receptor is a single-transmembrane receptor that mediates the signal transduction of levtin involved in regulation of food intake and energy consumption (see Non-Patent Document 3).
  • polymorphisms at several sites are known to be related to metabolic diseases such as obesity (polymorphisms that replace Q at 223 with R, non-patent literature) 4)
  • metabolic diseases such as obesity (polymorphisms that replace Q at 223 with R, non-patent literature) 4
  • myocardial infarction has not been known.
  • Galectin is a protein having a binding property to galactose S, and in mammals, 10 types of galectins are currently known. Among them, galectin-12 is known to form a non-covalent homodimer consisting of a 14 kDa subunit, and self-aggregates and loses activity in the absence of a reducing agent. In addition, it is known that galectin-2 expression is often observed in epithelial cells mainly in the lower small intestine in normal adult tissues, but its detailed physiological function is known. (See Non-Patent Document 5).
  • Patent Document 1 JP 2002-136291 A Non-Patent Document 1: Nature Medicine, 1997, vol.3, p600_601
  • Non-Patent Document 2 New England Journal of Medicine, 1997, vol.337, pl360_1369
  • Non-Patent Document 3 Cell, 1995, vol.83, pl263-1271
  • Non-Patent Document 4 Hum Genet., 2001, vol.108 (3), p233-236
  • Non-Patent Document 5 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, vol.9, No.45, p8 7-93
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, it was found that a single nucleotide polymorphism of the leptin receptor gene is associated with myocardial infarction. Furthermore, since the lebutin receptor shows a specific interaction with galectin 2, it was found that screening for substances that change the interaction between the two can provide a therapeutic agent for inflammatory diseases such as myocardial infarction, The present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • a probe for inflammatory disease testing comprising a sequence of 10 bases or more including the 164th base of the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a complementary sequence thereof.
  • a step of adding a drug candidate substance to a screening system containing levtin receptor and galectin 2, a step of measuring the interaction between levtin receptor and galectin 2, and a step of selecting a substance that changes the interaction A method for screening an inflammatory disease therapeutic agent, comprising:
  • FIG. 1 is a diagram (photograph) showing the results of immunoprecipitation using anti-Myc antibody or anti-FLAG antibody.
  • the test method of the present invention is a method for analyzing a single nucleotide polymorphism associated with an inflammatory disease present on a levtin receptor gene and detecting an inflammatory disease based on the analysis.
  • Inflammatory diseases are not particularly limited as long as they are induced to induce cell adhesion factors and cytoforce-in that are known to correlate with inflammation.
  • rheumatoid arthritis systemic erythematosus
  • inflammatory bowel disease And various allergic diseases, bacterial shock, or coronary artery diseases such as myocardial infarction and stroke, and particularly myocardial infarction.
  • the “test” includes a test for the onset risk of an inflammatory disease and a test for the presence or absence of the onset.
  • the human leptin receptor gene is preferred as the levtin receptor gene, for example, a gene having a sequence registered in NT_032977 in the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • this gene is not limited to the gene of the above sequence because there is a possibility that substitutions or deletions may exist in bases other than those related to inflammatory diseases due to differences in race.
  • the single nucleotide polymorphism of the levtin receptor gene associated with inflammatory diseases is not particularly limited, and preferably a polymorphism at the 978th base in the promoter region.
  • the 978th is a number counted from the transfer start point. Examples of the sequence containing the 978th base include the sequence of SEQ ID NO: 1, and the 978th base corresponds to the 164th base of SEQ ID NO: 1.
  • this base is either A (adenine) or G
  • A adenine
  • G a polymorphism that becomes (guanine).
  • corresponding means a corresponding base in the region having the above sequence on the human leptin receptor gene. Even if the above sequence is slightly changed at a position other than SNP due to differences in race, etc. This includes analyzing the corresponding base in it. In addition, analysis of nucleotide polymorphisms in the gene in the vicinity of the lebutin receptor gene includes nucleotide polymorphisms in the gene that are in a linkage disequilibrium relationship with the polymorphism.
  • the leptin receptor gene sequence may be analyzed for the sense strand or the antisense strand.
  • the sample used for the analysis of the single nucleotide polymorphism of the leptin receptor gene is not particularly limited as long as it is a sample containing chromosomal DNA, but for example, body fluid samples such as blood and urine, mucous cells, etc. Cell and body hair such as hair.
  • body fluid samples such as blood and urine, mucous cells, etc.
  • Cell and body hair such as hair.
  • ability to directly use these samples for analysis of single nucleotide polymorphisms It is preferable to isolate chromosomal DNA from these samples by a conventional method and analyze them.
  • the single nucleotide polymorphism analysis of the levtin receptor gene can be performed by a usual single nucleotide polymorphism analysis method. Examples include, but are not limited to, sequence analysis, PCR, hybridization, and the like.
  • the sequence can be performed by a usual method. Specifically, a sequence reaction is performed using a primer set at a position of several tens of bases on the 5 ′ side of a base that indicates a polymorphism, and based on the result of analysis, the force of which type of base the corresponding position is. Can be determined. In addition, when performing a sequence, it is preferable to amplify a fragment containing a polymorphism in advance by PCR or the like.
  • the analysis can be performed by examining the presence or absence of amplification by PCR.
  • a primer having a sequence corresponding to a region containing a polymorphic base and corresponding to each polymorphism is prepared.
  • PCR can be performed using each primer, and the type of polymorphism can be determined by the presence or absence of amplification products.
  • PCR-SSCP single-strand conformation polymorphism
  • a base showing a polymorphism when contained in a restriction enzyme recognition sequence, it can be analyzed by the presence or absence of cleavage by a restriction enzyme (RFLP method).
  • RFLP method restriction enzyme
  • the DNA sample is first cleaved with a restriction enzyme.
  • the DNA fragments can then be separated and the type of polymorphic force determined by the size of the detected DNA fragment can be determined.
  • an inflammatory disease is examined. For example, when judging based on the polymorphism of the base at position 978, if the base is A, it is judged that there is a high risk of developing an inflammatory disease or a high possibility of suffering from an inflammatory disease. can do.
  • allele polymorphisms may be considered. For example, when the genotype is an AA allele, the risk of developing an inflammatory disease is higher than that of a GG allele. It can be determined that the property is high.
  • polymorphisms of other genes are analyzed in addition to the polymorphisms of the lebutin receptor gene, and an inflammatory disease is determined based on the combination of the polymorphisms of those genes.
  • Other genes include the galectin 2 gene.
  • Examples of the galectin 2 gene sequence include the sequences registered in NCBI under NT_011520, and examples of the galectin 2 gene polymorphism include the polymorphism at the 3279th base of intron 1. This base corresponds to the 377th base of SEQ ID NO: 2.
  • human galectin-2 gene there exists a polymorphism that becomes the basic force SAZT.
  • the risk of inflammatory disease is higher in the case of TT than in the case where the genotype at this position is AA. Therefore, for example, when the polymorphism at position 978 of the leptin receptor gene is AA and the polymorphism of the galectin-2 gene is TT, the risk of developing an inflammatory disease is particularly high, and inflammation It can be determined that there is a high possibility of having a sexually transmitted disease.
  • lymphotokis known to be associated with myocardial infarction are known to be associated with myocardial infarction.
  • Sin ⁇ gene polymorphism (Nat Genet. 2002 Dec; 32 (4): 650_4. 2002: WO2004 / 0151
  • the present invention also provides a test reagent such as a primer or a probe for detecting an inflammatory disease.
  • a probe include a probe having a sequence containing the 164th base of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof.
  • a primer a primer capable of discriminating the polymorphism of the 164th base of the base sequence of SEQ ID NO: 1, for example, a DNA having a sequence containing the 164th base of the base sequence of SEQ ID NO: 1 is used.
  • primers that can be amplified The length of such a primer or probe is not particularly limited. For example, an oligonucleotide having 10 to 100 bases is preferred, and an oligonucleotide having 15 to 50 bases is more preferable.
  • a primer having a 5 ′ region of the base preferably 30 to 100 bases upstream, or a 3 ′ region of the base, preferably 30 to 100
  • examples include primers having a sequence complementary to the region downstream of the base.
  • Primers used to determine polymorphism based on the presence or absence of amplification by PCR have a sequence containing the above base, a primer containing the above base on the 3 ′ side, or a complementary sequence of the sequence containing the above base.
  • Examples include primers containing a base complementary to the above 3 'side.
  • test reagent of the present invention may contain a polymerase for PCR in addition to these primers and probes.
  • the test reagent of the present invention may further comprise a primer or a probe for analyzing a polymorphism of the galectin 2 gene.
  • a probe include a sequence containing the 377th base of the base sequence of SEQ ID NO: 2 or a probe having a complementary sequence thereof, and the primer includes the 377th base of the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the screening method of the present invention comprises a step of adding a drug candidate substance to a screening system comprising a leptin receptor and galectin-12, and a phase between the levtin receptor and galectin-2.
  • a screening method for a therapeutic agent for an inflammatory disease comprising a step of measuring an interaction and a step of selecting a substance that changes the interaction.
  • the polymorphisms of the genes are related to inflammatory diseases such as myocardial infarction, and these proteins interact specifically in vivo. Therefore, substances that change these interactions can be drug candidates for inflammatory diseases.
  • the drug candidate substance is not particularly limited, and may be, for example, a low-molecular synthetic compound or a compound contained in a natural product. It can also be a peptide. Individual test substances may be used for screening, but one compound library containing these substances may be used. By selecting a candidate substance that changes the interaction between the leptin receptor and galectin-2, a therapeutic drug for inflammatory diseases can be obtained.
  • “change” includes inhibiting interaction and enhancing interaction.
  • the screening system containing leptin receptor and galectin 2 means a screening system containing both of these proteins, and may be an in vitro system or a cell system.
  • the above screening system may be a system in which these proteins are added directly, or may be a system in which these proteins are included by translating mRNA transcribed from the gene. .
  • Specific examples of the in vitro screening system include a detection method using a surface plasmon resonance phenomenon using pull-down assay using leptin receptor protein and galectin 2 protein as described below.
  • the leptin receptor protein and galactin_2 protein used in the in vitro screening system may be a recombinant protein or a naturally derived protein. Further, it may be chemically synthesized. Proteins derived from eukaryotes including human rabbits and other animals that are not restricted by the origin of the protein can be used, but preferably, proteins derived from humans are used. Examples of human-derived leptin receptor proteins include those having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Moreover, as long as the binding property to galectin-12 is maintained, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may have a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added.
  • human-derived Galek Examples of the tin-2 protein include those having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Further, as long as the binding property to the leptin receptor is maintained, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 may have a sequence in which a position or several amino acids are substituted / deleted / added. In addition, the above-mentioned several are preferably 2 to 50, more preferably 2 to 20, and particularly preferably 2 to 10.
  • a partial peptide containing a binding site may be used. Since the levulin receptor has a large molecular weight and is not always easy to express, the extracellular domain involved in binding to galectin-2 (SEQ ID NO: 4864 ⁇ : 1165th) may be used. Alternatively, a fusion protein with another peptide may be used. Examples of peptides to be fused include peptide tags such as GST, His tag, and S tag that can be used for purification in pull-down assay.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (leptin receptor) or SEQ ID NO: 5 (galectin 2) is introduced into Escherichia coli or animal cells to recombine. It can be obtained by expressing a protein and purifying the protein. Note that it is not always necessary to use purified protein, and crudely purified products or cell extracts can be used to detect interactions.
  • vectors for introducing the above DNA into E. coli include pET vectors (Novagen) and pGEX vectors (Amersham Pharmacia).
  • vectors for introducing animal cells include pcDNA vectors (Invitrogen). Is mentioned.
  • pull-down assay When pull-down assay is performed as an in vitro system, leptin receptor protein and galectin 2 protein are incubated in vitro, and an antibody against one protein, or if this protein is a fusion protein, fuse. After recovering the complex with an antibody against the peptide tag, affinity column, or the like, the interaction between the two proteins can be evaluated by detecting the other protein that binds to the protein. Screening can be performed by adding a test substance to this system and selecting a substance that affects the interaction. In the pull-down assay, one of the proteins may be labeled with a radioisotope or a labeling substance such as piotin and then detected.
  • Biosensors using the surface plasmon resonance phenomenon can observe the interaction between proteins in real time as a surface plasmon resonance signal using a small amount of protein sample and without labeling (for example, manufactured by BIAcore, Pharmacia). ). Therefore, it is possible to evaluate the binding of the leptin receptor and galectin-12 by using a biosensor such as BIAcore.
  • the screening of the present invention can be performed by high-throughput screening (Science 1996, 273 p458-64, Nature 1996, 384 pl-13) using combinatorial chemistry.
  • a system that detects by fluorescence can be used (Fluorescence Resonance Energy Transfer (RE ⁇ )).
  • RE ⁇ Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • Screening can also be performed in a cell system.
  • a method using immunoprecipitation In other words, after culturing cells expressing levtin receptor and galectin-2 and recovering the cells, the complex was recovered with an antibody against one of the proteins, and then the other protein was detected using an antibody against that protein. By doing so, the interaction of both proteins can be detected, and the influence of the test substance on the interaction can be evaluated.
  • both proteins may be proteins endogenously expressed by the cell, but either force or both proteins can be expressed exogenously in the cell.
  • the cell to be used is not limited to those which can include CHO cells and COS cells.
  • a gene encoding the levtin receptor and / or galectin-12 as described above is used for expression of a foreign gene such as pSV2neo (Clontech) or pcDNA I (Invitrogen).
  • the gene can be expressed by inserting into this vector.
  • proteins may be expressed as fusion proteins with peptide tags such as Myc tag and Flag tag.
  • yeast or animal cells were further used as a screening system using cells.
  • either the leptin receptor or galectin-2 A vector expressing a fusion protein in which one of the proteins or a partial peptide thereof is fused with a GAL4 DNA binding region, etc., and the other protein or a partial peptide thereof is fused with a transcriptional activation region such as VP16 or GAL4 Construct a vector that expresses the fusion protein, introduce it into the yeast along with the vector encoding the reporter gene, and perform compound assembly using the reporter activity as an indicator in the presence of the sample containing the test substance .
  • Reporter gene expression is induced by the interaction between the leptin receptor protein and galectin-12 protein, but when the test compound inhibits the interaction of both proteins, the expression of the reporter gene is suppressed.
  • the reporter gene include, but are not limited to, the HIS 3 gene, Ade2 gene, LacZ gene, CAT gene, luciferase gene, and GFP gene. Screening by the two-hybrid method can be performed using yeast or mammalian cells.
  • Single nucleotide polymorphisms of the lebutin receptor gene were analyzed in each of myocardial infarction patients and non-myocardial infarction patients (control). Specifically, the chromosomal DNA isolated from the blood of the subject was used as a saddle, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 8, and the resulting amplified product was subjected to SEQ ID NO: 9. Sequence analysis of polymorphic sites was performed using primers. For sequence analysis, ABI3700 Cabili- ty Theater Sensor from Applied Biosystems was used. Analyzed patients with myocardial infarction (i) have a history of chest compression, pain, chest pain, etc.
  • the galectin-2 gene was amplified using the primers of SEQ ID NOs: 10 and 11, and the primer of SEQ ID NO: 12 was used using the obtained amplification product.
  • CZT polymorphism existed at 3279th in intron 1, and it was found that CC type was significantly more common in patients with myocardial infarction.
  • Table 2 summarizes the percentages of galectin-12 polymorphism and levulin receptor gene polymorphism in patients with myocardial infarction and non-myocardial infarction (control).
  • Oligonucleotides (sense strand: SEQ ID NO: 13, antisense strand: SEQ ID NO: 14) having nucleotide sequences encoding TEV protease cleavage sites and restriction enzyme cleavage sequences of Mlul and Seal were synthesized and annealed.
  • the pET40b vector was treated with Mlul, Seal restriction enzyme (Takara Bio), purified on an agarose gel, and the double-stranded DNA annealed as described above was ligated. This operation linked His tag-TEV site-S tag.
  • the His tag-TEV site-S tag sequence in pET40b incorporated by the above operation was PCR amplified by PCR primers (SEQ ID NOs: 15 and 16) to which the restriction enzyme Sail and Kpnl sequences were added.
  • the amplified fragment was treated with Sail and Kpnl, and then ligated to the pCMV-Myc vector treated with Sail and Kpnl in the same manner to construct a Myc-His-TEV-TAP expression vector.
  • Galectin-2 was amplified by PCR using galectin-2 amplification primers (SEQ ID NO: 17 or 18) with Sfil and Sail sites, respectively, and human Tsukiichi cDNA (Clontech) as a template.
  • Myc tag-galectin-2-His tag-TEVsite-Stag expression vector was constructed by inserting the amplified fragment into Sfil, Sail treated and similarly Sfil, Sail treated Myc_His_TE V-TAP expression vector (Hereinafter also referred to as galectin-TAP vector).
  • This galectin- ⁇ vector or TAP alone was transiently transfected into HeLa cells in 150 mm dishes using Fugene reagent (Roche). After that, protein extraction reagent containing complete protease inhibitor tablet (Roche) (1 piece / 20mL) and 5 ⁇ gZ mL of MG_132 (and albiochem) diluted 10 times with S-protein bind / wash buffer (Novagen) Cells were lysed on ice using (Clontech). Extract 4 Ink with S-protein agarose (Novagen) for 12-18 hours in C The S-tag binding protein was purified.
  • TAP fusion protein (galectin-12) was cleaved by incubating with 100 U TEV protease (Invitrogen) at 17 ° C for a time.
  • the protein was dialyzed against PBS and further purified using the TALON affinity purification system (Clontech). The obtained protein complex was subjected to SDS-PAGE and stained with simply blue (Invitrogen).
  • the amino acid sequence of the protein band was determined by MALDI / TOF mass spectrometry (APRO Life Science) 0
  • PCR was performed using primers specific to the leptin receptor intracellular domain (LLID) to which the Sail and Kpnl site sequences were added, respectively, and human liver cDNA (Clontech) as a template.
  • the amplified fragment was treated with Sail and Kpnl and ligated to Sail and Kpnl-treated pFLAG_CMV5a vector (SIGMA) to obtain a FLAG-tagged peptide receptor intracellular domain expression vector.
  • PCR was performed using primers specific to galectin-2 (SEQ ID NOs: 21 and 22) to which EcoRI and Xhol sites were added, respectively, and human liver cDNA (Clontech) as a template.
  • the amplified fragment was treated with EcoRI and Xhol and ligated to EcoRI and Xhol treated pCMV-Mycvector (Clontech) to obtain a Myc-tagged galectin-12 expression vector.
  • the galectin_2_FLAG expression vector and the LRID_Myc expression vector were transiently transfected into COS7 cells (Health Science Research Resources Bank; JCRB9127) using Fugene. After 24 hours, the cells were lysed for 1 hour or more using lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCL, 0.1% Nonidet P-40) to the extent that insoluble debris does not precipitate.
  • lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCL, 0.1% Nonidet P-40) to the extent that insoluble debris does not precipitate.
  • Use anti-FLAG tag M2 agarose (Sigma) at 4 ° C for 12-18 hours Immunoprecipitation was performed. The precipitate was washed with lysis buffer and then visualized using anti-Myc antibody (Santa Cruz) or anti-Myc antibody peroxidase conjugate (Sigma).
  • an inflammatory disease such as myocardial infarction can be detected at an early stage, which is useful in the diagnostic field and the like. Further, according to the screening method of the present invention, a new drug for inflammatory diseases such as myocardial infarction can be obtained, which is useful in the pharmaceutical field and the like.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

　レプチン受容体遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて炎症性疾患を検査する。また、レプチン受容体とガレクチン－２の相互作用を変化させる物質を選択することにより炎症性疾患の治療薬のスクリーニングを行う。

Description

明 細 書
炎症性疾患の検查方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法 技術分野
[0001] 本発明は心筋梗塞などの炎症性疾患の検查方法及び炎症性疾患治療薬のスクリ 一二ング方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、ライフスタイルの変化に伴って、炎症性疾患、特に心筋梗塞などの冠動脈疾 患の死亡リスクが増加している（非特許文献 1又は 2参照）。したがって、これらの疾患 につレ、て早期に発症リスクを判定する方法の開発が望まれてレ、る。
[0003] 心筋梗塞などの冠動脈疾患は遺伝的素因によって発症する可能性が提唱され、遺 伝子変異の有無によって、心筋梗塞を判定する方法がいくつか知られている。例え ば、プロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の発症リスクを判 定する方法が知られている（特許文献 1参照）。し力しながら、より正確に判定するた めには、さらなる判定法の開発が求められていた。
[0004] レブチン受容体は、摂食量やエネルギー消費量の調節等に関与するレブチンのシ グナル伝達を媒介する一回膜貫通型受容体である（非特許文献 3参照）。レブチン 受容体をコードする遺伝子のレ、くつかの部位における多型が肥満などの代謝疾患に 関連することが知られてレ、た（223番目の Qを Rに置換する多型、非特許文献 4参照） 。し力、しながら、レブチン受容体遺伝子の多型と心筋梗塞等の炎症性疾患との関連 については知られていなかった。
[0005] ガレクチンはガラクトースに結合性を示すタンパク質である力 S、哺乳類では現在、 1 0種類のガレクチンが知られている。その中で、ガレクチン一 2は 14kDaのサブュニッ トからなる非共有結合性のホモダイマーを形成し、還元剤非存在下では自己凝集し 活性を失うことが知られている。また、ガレクチン— 2の発現は正常成人組織中では 下部小腸を主とした上皮細胞に多く認められることが知られているが、その詳細な生 理機能にっレ、ては知られてレ、なかった（非特許文献 5参照）。
特許文献 1 :特開 2002— 136291号公報 非特許文献 1 : Nature Medicine, 1997, vol.3, p600_601
非特許文献 2 : New England Journal of Medicine, 1997, vol.337, pl360_1369 非特許文献 3 : Cell, 1995， vol.83, pl263- 1271
非特許文献 4 : Hum Genet., 2001, vol.108(3), p233- 236
非特許文献 5 : Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, vol.9, No.45, p8 7-93
発明の開示
[0006] 本発明は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症リスクや発症の有無を正確に検査する 方法を提供することを課題とする。本発明はまた、心筋梗塞等の炎症性疾患の治療 薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、レプチ ン受容体遺伝子の一塩基多型が心筋梗塞に関連することを見出した。さらに、レブ チン受容体がガレクチン 2と特異的な相互作用を示すことから、両者の相互作用を 変化させる物質をスクリーニングすることで心筋梗塞等の炎症性疾患の治療薬が得 られることを見出し、本発明を完成するに至った。
[0008] すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)レブチン受容体遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づ レ、て炎症性疾患を検査する方法。
(2)レブチン受容体遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号 1の 164番目の 塩基に相当する塩基の多型である、（1)の方法。
(3) さらにガレクチン— 2遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果 を合わせて検査する、（1)の方法。
(4)ガレクチン— 2遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号 2の 377番目の塩 基の多型である、（3)の方法。
(5) 炎症性疾患が心筋梗塞である（1)〜（4)のいずれかの方法。
(6) 配列番号 1の塩基配列の 164番目の塩基を含む 10塩基以上の配列、又はそ の相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
(7) 配列番号 1の塩基配列の 164番目の塩基を含む配列を有する DNAを増幅す ることのできる炎症性疾患検査用プライマー。
(8) レブチン受容体およびガレクチン 2を含むスクリーニング系に医薬候補物質 を添加する工程、レブチン受容体とガレクチン 2との相互作用を測定する工程、及 び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患治療薬のス クリーニング方法。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]抗 Myc抗体又は抗 FLAG抗体を用いた免疫沈降の結果を示す図（写真)。
発明を実施するための最良の形態
[0010] < 1 >本発明の検査方法
本発明の検査方法は、レブチン受容体遺伝子上に存在する炎症性疾患に関連す る一塩基多型を分析し、該分析に基づいて炎症性疾患を検查する方法である。炎症 性疾患としては、炎症との相関が知られている細胞接着因子やサイト力インの誘導が 認められる疾患であれば特に限定されないが、例えば、慢性関節リウマチ、全身性ェ リマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー疾患、細菌性ショック、または心筋梗塞 や脳卒中などの冠動脈疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。なお、 本発明において、「検査」とは炎症性疾患の発症リスクの検查ゃ発症の有無の検查 を含む。
[0011] レブチン受容体遺伝子としては、ヒトレプチン受容体遺伝子が好ましぐ例えば、 Na tional Center for Biotechnology Information (NCBI)に NT_032977に登録された配列 を有する遺伝子を挙げることができる。ただし、該遺伝子は人種の違いなどによって 炎症性疾患に関連する塩基以外の塩基において置換や欠失等が存在する可能性 があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
[0012] 炎症性疾患に関連するレブチン受容体遺伝子の一塩基多型は特に制限されない 、好ましくはプロモーター領域の 978番目の塩基の多型が挙げられる。なお、 978番目とは転写開始点から数えた番号である。 978番目の塩基を含む配列とし ては、例えば、配列番号 1の配列が挙げられ、—978番目の塩基は、配列番号 1の 1 64番目の塩基に相当する。
ヒト染色体上のレブチン受容体遺伝子においては、この塩基が A (アデニン)又は G (グァニン）となる多型が存在する。このような塩基の多型を解析することにより、炎症 性疾患を検査することができる。
ここで、「相当する」とは、ヒトレプチン受容体遺伝子上の上記配列を有する領域中 の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列が SNP以外の位置で 若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。また、レブチン受容 体遺伝子近傍あるレ、は該遺伝子内の、上記多型と連鎖不平衡の関係にある塩基多 型を解析することも含む。
なお、レプチン受容体遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス 鎖を解析してもよい。
[0013] レプチン受容体遺伝子の一塩基多型の解析に用いる試料としては、染色体 DNA を含む試料であれば特に制限されなレ、が、例えば、血液、尿等の体液サンプル、粘 膜細胞などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれら の試料を直接使用することもできる力 これらの試料から染色体 DNAを常法により単 離し、これを用いて解析することが好ましい。
[0014] レブチン受容体遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によ つて行うことができる。例えば、シークェンス解析、 PCR、ハイブリダィゼーシヨンなど が挙げられるが、これらに限定されない。
[0015] シークェンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の 5'側数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークェンス反応を行い、そ の解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基である力を決定することができる。 なお、シークェンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片を PCRなどによって増幅し ておくことが好ましい。
[0016] また、 PCRによる増幅の有無を調べることによって解析することができる。例えば、多 型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマ 一をそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用して PCRを行レ、、増幅産物の 有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
[0017] また、多型を含む DNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違い によってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、 例えば、 PCR-SSCP (single― strand conformation polymorphism)法 (Geno mics. 1992 Jan 1 ; 12 (1) : 139— 146· )が挙げられる。具体的には、まず、 レプチン受容体遺伝子の多型部位を含む DNAを増幅し、増幅した DNAを一本鎖 D NAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離し、分離 した一本鎖 DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決 定すること力 Sできる。
[0018] さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による 切断の有無によって解析することもできる（RFLP法)。この場合、まず、 DNA試料を 制限酵素により切断する。次いで、 DNA断片を分離し、検出された DNA断片の大 きさによってどのタイプの多型である力、を決定することができる。
[0019] 次に、上記のような方法によって解析した多型に基いて、炎症性疾患について検 查を行う。例えば、 _ 978位の塩基の多型に基いて判定する場合は、該塩基が Aの 場合、炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いな どと判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよぐ例えば 、遺伝子型が AAアレルの場合に、 GGアレルと比べて炎症性疾患の発症リスクが高い 、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。
[0020] 本発明の判定法においては、レブチン受容体遺伝子の多型に加え、他の遺伝子 の多型を解析し、それらの遺伝子の多型の組合わせに基いて炎症性疾患の判定を 行ってもよレ、。他の遺伝子としては、ガレクチン 2遺伝子が挙げられる。ガレクチン 2遺伝子の配列としては、 NCBIに NT_011520に登録されている配列を挙げることが でき、ガレクチン 2遺伝子の多型としては、イントロン 1の 3279番目の塩基の多型 を挙げることができる。この塩基は、配列番号 2の 377番目の塩基に相当する。ヒトガ レクチン— 2遺伝子では該塩基力 SAZTとなる多型が存在する。そして、この位置の 遺伝子型が AAの場合に比べて、 TTの場合に炎症性疾患のリスクが高レ、。したがつ て、例えば、レプチン受容体遺伝子の— 978位の多型が AAであり、ガレクチン— 2遺 伝子の多型が TTの場合に特に炎症性疾患の発症リスクが高レ、、炎症性疾患に罹患 している可能性が高いなどと判定することができる。
さらに、本発明の検查方法においては心筋梗塞との関連が知られているリンホトキ シン α遺伝子の多型（Nat Genet. 2002 Dec;32 (4):650_4. 2002 : WO2004/0151
00)を組合わせて検査することもできる。
[0021] < 2 >本発明の検査用試薬
本発明はまた、炎症性疾患を検查するためのプライマーやプローブなどの検查試 薬を提供する。このようなプローブとしては、配列番号 1の塩基配列の 164番目の塩 基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブが挙げられる。また、プライマー としては、配列番号 1の塩基配列の 164番目の塩基の多型を判別することのできるプ ライマー、例えば、配列番号 1の塩基配列の 164番目の塩基を含む配列を有する DN Aを増幅することのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーやプローブの 長さは特に制限されないが、例えば、 10〜100塩基のオリゴヌクレオチドが好ましぐ 15〜50塩基のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
上記多型部位をシークェンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の 5 '側 領域、好ましくは 30〜 100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の 3 '側 領域、好ましくは 30〜 100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例 示される。 PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては 、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を 3 '側に含むプライマーや、上記塩基を含 む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を 3 '側に含むプライマーなどが例 示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、 PCR用のポ リメラーゼゃバッファーを含むものであってもよレ、。
[0022] また、本発明の検査用試薬は、ガレクチン 2遺伝子の多型を解析するためのブラ イマ一やプローブをさらに含むものであってもよレ、。このようなプローブとしては、配列 番号 2の塩基配列の 377番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプロ ーブが挙げられ、プライマーとしては、配列番号 2の塩基配列の 377番目の塩基を含 む配列を有する DNAを増幅することのできるプライマーが挙げられる。
[0023] < 3 >スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、レプチン受容体およびガレクチン一 2を含むスクリ 一ユング系に医薬候補物質を添加する工程、レブチン受容体とガレクチン— 2との相 互作用を測定する工程、及び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含 む、炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法である。
[0024] レブチン受容体及びガレクチン 2は、いずれもその遺伝子上の多型が心筋梗塞 などの炎症性疾患に関連を示し、かつ、これらのタンパク質は生体内で特異的に相 互作用しているため、これらの相互作用を変化させる物質は炎症性疾患に対する医 薬の候補物質になりうる。
[0025] 医薬候補物質としては特に制限はなぐ例えば、低分子合成化合物であってもよい し、天然物に含まれる化合物であってもよレ、。また、ペプチドであってもよレ、。スクリー ユングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリ 一を用いてもょレ、。候補物質の中からレプチン受容体とガレクチン— 2の相互作用を 変化させるものを選択することにより、炎症性疾患の治療薬を得ることができる。ここ で、「変化」とは相互作用を阻害すること、および相互作用を強化することを含む。
[0026] レプチン受容体およびガレクチン 2を含むスクリーニング系とは、これらの両タン パク質を含むスクリーニング系を意味し、インビトロの系であってもよいし、細胞系であ つてもよレ、。上記スクリーニング系はこれらのタンパク質が直接添加される系であって もよレ、し、遺伝子から転写された mRNAが翻訳されることによりこれらのタンパク質が 含まれるようになった系であってもよい。
[0027] インビトロのスクリーニング系として具体的には、以下に示すような、レプチン受容体 タンパク質およびガレクチン 2タンパク質を用いたプルダウンアツセィゃ表面プラズ モン共鳴現象を利用した検出法などが挙げられる。
[0028] インビトロのスクリーニング系に用いられるレプチン受容体タンパク質およびガレク チン _ 2タンパク質は組換えタンパク質であっても、天然由来の蛋白質であってもよ レ、。さらに、化学合成したものであってもよい。タンパク質の由来に制限はなぐヒトぉ よび他の動物を含む真核生物由来の蛋白質を用いることができるが、好ましくは、ヒト 由来のタンパク質が用いられる。ヒト由来のレプチン受容体タンパク質としては、配列 番号 4のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、ガレクチン一 2との結合性を 保持する限りにおいて、配列番号 4のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸 が置換 ·欠失.付加された配列を有するものであってもよレ、。一方、ヒト由来のガレク チン— 2タンパク質としては、配列番号 6のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ま た、レプチン受容体との結合性を保持する限りにおいて、配列番号 6のアミノ酸配列 において位置または数個のアミノ酸が置換 ·欠失'付加された配列を有するものであ つてもよレヽ。なお、上記数個とは、好ましくは 2〜50個、より好ましくは 2〜20個、特に 好ましくは 2〜： 10個である。
[0029] また、タンパク質は結合部位を含む部分ペプチドを使用してもよい。レブチン受容 体は分子量が大きく発現が必ずしも容易でないため、ガレクチン— 2との結合に関与 する細胞外ドメイン（配列番号 4の 864〜： 1165番目）を用いてもよレ、。または他のぺ プチドとの融合タンパク質を用いてもよい。融合させるペプチドとしては、例えば、プ ルダウンアツセィゃ精製に使用できる GST、 Hisタグ、 Sタグなどのペプチドタグが挙げ られる。
[0030] 組換えによりタンパク質を得るためには、例えば、配列番号 3 (レプチン受容体）や 配列番号 5 (ガレクチン 2)の塩基配列を有する DNAを大腸菌や動物細胞などに導 入して組換えタンパク質を発現させ、該タンパク質を精製することによって得ることが できる。なお、必ずしも精製されたタンパク質を用いる必要はなぐ粗精製物や細胞 抽出物を相互作用の検出に使用してもょレ、。上記 DNAを大腸菌に導入するための ベクターとしては pETベクター（Novagen社）や pGEXベクター（Amersham Pharmacia社 )などが挙げられ、動物細胞に導入するためのベクターとしては、 pcDNAベクター（Inv itrogen社）などが挙げられる。
[0031] インビトロの系として、プルダウンアツセィを行う場合は、レプチン受容体タンパク質 とガレクチン 2タンパク質とをインビトロでインキュベートし、一方のタンパク質に対 する抗体、またはこのタンパク質が融合タンパク質の場合、融合するペプチドタグに 対する抗体やァフィ二ティカラム等で複合体を回収したのち、該タンパク質に結合す る他方のタンパク質を検出することにより、両タンパク質の相互作用を評価することが できる。この系に被検物質を添加し、相互作用に影響を与える物質を選択することに よってスクリーニングを行うことができる。プルダウンアツセィにおいては、一方のタン パク質を放射性同位体やピオチン等の標識物質で標識し、それを利用して検出して あよい。 [0032] さらに、インビトロのスクリーニング系として、表面プラス、モン共鳴現象を利用したバ ィォセンサーを使用する系を挙げることもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用し たバイオセンサーは、タンパク質間の相互作用を微量の蛋白質試料を用いてかつ 標識することなぐ表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが 可能である（例えば BIAcore、 Pharmacia製）。したがって、 BIAcore等のバイオセ ンサーを用いることによりレプチン受容体およびガレクチン一 2の結合を評価すること が可能である。さらに、コンビナトリアルケミストリーを利用したハイスループットスクリー ユング（Science 1996, 273 p458— 64、 Nature 1996, 384 pl l— 13)など により本発明のスクリーニングを行うことも可能である。
さらに、その他のスクリーニング系として、蛍光によって検出する系を用いることもで きる (Fluorescence Resonance Energy Transfer ( RE Γ) )。
[0033] また、細胞系でスクリーニングを行うこともできる。例えば、免疫沈降を用いる方法を 挙げること力 Sできる。すなわち、レブチン受容体とガレクチン 2とを発現する細胞を 培養し、細胞を回収後、一方のタンパク質に対する抗体等で複合体を回収したのち 、他方のタンパク質を、そのタンパク質に対する抗体等を用いて検出することにより、 両者のタンパク質の相互作用を検出でき、また、該相互作用に与える被検物質の影 響を評価することができる。この場合において、両タンパク質は細胞が内因的に発現 するタンパク質であってもよいが、どちら力または両方のタンパク質を外来的に細胞 で発現させることもできる。用いる細胞としては、 CHO細胞や COS細胞などを挙げるこ とができる力 これらに限定されない。
動物細胞内で蛋白質を外来的に発現させる場合、例えば、上述したようなレブチン 受容体および/またはガレクチン一 2をコードする遺伝子を、 pSV2neo (Clontech) , pcDNA I (Invitrogen)などの外来遺伝子発現用のベクターに揷入することで当該 遺伝子を発現させることができる。なお、これらのタンパク質は Mycタグや Flagタグな どのペプチドタグとの融合タンパク質として発現させてもよい。
[0034] 細胞を用いたスクリーニング系としては、さらに、酵母または動物細胞などを用いた
2ハイブリッド法が挙げられる。
酵母 2 _ハイブリッド法においては、レプチン受容体またはガレクチン一 2のどちら か一方のタンパク質またはその部分ペプチドを、 GAL4 DNA結合領域等と融合さ せた融合タンパク質を発現するベクター、そして他方のタンパク質またはその部分べ プチドを VP16または GAL4等の転写活性化領域と融合させた融合タンパク質を発 現するベクターを構築し、これらを、レポーター遺伝子をコードするベクターと共に酵 母細胞に導入して、被検物質を含む試料の存在下でレポーター活性を指標に化合 物のアツセィを行う。レプチン受容体タンパク質とガレクチン一 2タンパク質との相互 作用によりレポーター遺伝子の発現が誘導されるが、被検化合物により両者のタンパ ク質の相互作用が阻害されると、レポーター遺伝子の発現が抑制される。レポーター 遺伝子としては、例えば、 HIS 3遺伝子の他、 Ade2遺伝子、 LacZ遺伝子、 CAT遺 伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、 GFP遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない 。 2ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行う ことちできる。
2ハイブリッド法によるスクリーニングは例えば、「MATCHMARKER Two— Hy brid SystemJ , 「Mammalian MATCHMAKER Two— Hybrid Assay Kit 」， 「MATCHMAKER One -Hybrid System」（いずれもクロンテック社製）、「 HybriZAP Two -Hybrid Vector System」（ストラタジーン社製））などを使用 して行うことができる。
実施例
[0035] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実 施例に限定されない。
[0036] ( 1 )一塩基多型の解析
心筋梗塞患者及び非心筋梗塞患者（コントロール)それぞれにつレ、て、レブチン受 容体遺伝子の一塩基多型を解析した。具体的には、被検者の血液から単離した染 色体 DNAを錡型に、配列番号 7および 8のプライマーを使用して PCRを行レ、、得られ た増幅産物について配列番号 9のプライマーを用いて多型部位のシークェンス解析 を行った。シークェンス解析には、 Applied Biosystems社の ABI3700キヤビラリーシー タエンサーを用いた。なお、解析された心筋梗塞患者は、 （i) 30分以上の胸部圧迫 感、痛み、胸苦しさなどの病歴を持つ、（ii)少なくとも 1の標準誘導又は 2の胸部誘導 において O. lmVより大きい STセグメントの上昇を示す、 （iii)血清クレアチンキナーゼ 濃度が標準値の 2倍以上に上昇する、の 3つの条件（Nat Genet. 2002 Dec;32 (4):65 0-4. 2002)のうち 2つ以上を満たすことによって心筋梗塞であると診断された平均年 齢 63歳の 2638人であり、非心筋梗塞患者は心筋梗塞と診断されなかった平均年齢 51歳の 2499人であった。解析結果を表 1に示す。
[表 1]
表 _! [P value] (Odds ratio) <95%CI>
' i -W^ . アレル^^ AA vs Others GG vs Others
—遗 型 ― 心筋鶴患者 3ン卜ロール _ _
レブチン受容 ロモ" ^一
-978A>G*
ΑΔ 1650(75.6%) 1732 (70.6%) 14.7 14.1 14.7 1.35
AG 488 (22.4%) 659(26.9%) [0.00063] [0.00018] [0.00013] [0.25]
GG 44 (2.0%) 62(2.5%) (1.25) (1.29) (0.79)
Total 2182(100%) 2453(100%) <1.11-1.40> <1.13-1.47> <0.54-1.17>
[0038] その結果、レプチン受容体遺伝子のプロモーター領域 -978番目に A/Gの多型 が存在し、心筋梗塞患者では Major homozygote (AA allele)が有意に多い（c2=8.4, P =0.0039; odds ratio=l.18)ことがわかった (Table. 1)。すなわち、 AAアレルを持つヒトで は、 1. 2倍心筋梗塞になりやすぐこれは統計学的に 1000回テストを行っても、 4回誤 りがあるかなレ、かに等しいほどの有意差であった。
[0039] 次に、上記の心筋梗塞患者及び非心筋梗塞患者について、配列番号 10および 1 1のプライマーを用いてガレクチン— 2遺伝子を増幅し、得られた増幅産物を用いて 配列番号 12のプライマーによりガレクチン— 2遺伝子上の一塩基多型を解析した。 その結果、イントロン 1の 3279番目に CZTの多型が存在し、心筋梗塞患者で CC型 が有意に多いことがわかった。心筋梗塞患者及び非心筋梗塞患者（コントロール）の ガレクチン一 2遺伝子の多型とレブチン受容体遺伝子の多型の割合について表 2に まとめた。
[0040] [表 2]
表 2
レブチン受容体遺伝子の- 978A>Gの遺伝子型
心筋梗塞恿
者 コントロール
AA AG GG AA AG GG
ガレクチン一 2遗伝
子のイントロン 1の CC 759 233 26 745 270 30
32790Tの遗伝子 CT 743 213 13 780 290 22 型 TT 148 42 5 227 99 10
[0041] その結果、レプチン受容体遺伝子内プロモーター領域 -978番目 A>G SNPの Majo r homozygote (AA allele)が心筋梗塞患者で有意に多い（％2=8.4， P=0.0039; odds ra tio=1.18)ことを見出した（表 1)。
この表に基いて、ガレクチン 2遺伝子の多型とレブチン受容体遺伝子の多型を組 合わせて心筋梗塞との相関を算出した。その結果、ガレクチン 2遺伝子の遺伝子 型が TTであり、レブチン受容体遺伝子の遺伝子型力 SAGまたは GGである場合に、そ れ以外の場合に比べて有意に心筋梗塞患者が多いことがわかった（Odds ratio=1.89 (95% c. i =1.38-2.60), p=0.000069) 0 [0042] (2)タンデムァフィ二ティクロマトグラフィー（Nature Biotechnology, 1999, 17， 1030-1 032)によるガレクチン 2と相互作用するタンパク質の単離
2 - 1. Myc-His-TEV-TAP発現ベクターの構築
(i) pET40b vector (Novagen)への TEVプロテアーゼ切断部位の揷入
TEVプロテアーゼ切断部位をコードする塩基配列および Mlul， Sealの制限酵素切 断配列を有するオリゴヌクレオチド（センス鎖：配列番号 13, アンチセンス鎖：配列番 号 14)を合成し，アニーリングさせた。次に、 pET40b vectorを Mlul, Seal制限酵素（タ カラバイオ）にて処理し，ァガロースゲルにて精製し，上記でアニーリングさせた 2本 鎖 DNAを連結した。この操作によって His tag-TEV site-S tagが連結された。
[0043] (ii) His tag-TEV site-S tagの pCMV_Myc vector (Clontech)への揷入
上記操作により組み込まれた pET40b内の His tag-TEV site-S tag配列を、制限酵 素 Sail, Kpnl配列を付加した PCR primer (配列番号 15及び 16)により PCR増幅した。 増幅されたフラグメントを Sail, Kpnl処理した後，同様に Sail, Kpnl処理した pCMV-My c vectorに連結することにより Myc-His-TEV-TAP発現ベクターを構築した。
[0044] (iii)ガレクチン- 2の Myc-His-TEV-TAP発現ベクターへの挿入
それぞれ Sfil, Sail siteが付加されたガレクチン 2増幅用 primer (配列番号 17また は 18)を用い，ヒト月市 cDNA (Clontech)をテンプレートとして，ガレクチン- 2を PCR増幅 した。増幅されたフラグメントを Sfil, Sail処理し、同様に Sfil, Sail処理した Myc_His_TE V-TAP発現ベクターに挿入することにより、 Myc tag-galectin-2-His tag-TEVsite-S t ag発現ベクターを構築した（以下、 galectin—TAPベクターとも呼ぶ）。
[0045] 2 - 2. galectin— TAPベクターの細胞への導入とガレクチンー2結合タンパク質の 同定
この galectin—ΤΑΡベクターまたは TAPのみ（ネガティブコントローノレ）を、 Fugen e試薬（ロシュ）を用いて、 150mmディッシュ中の HeLa細胞に一過的にトランスフエ クシヨンした。その後、 complete protease inhibitor tablet (ロシュ）（1個 /20mL)及び 5 μ gZ mLの MG _ 132 (し albiochem)を含み、 S— protein bind/wash buffer (Novagen )で 10倍に希釈した protein extraction reagent (Clontech)を用いて、細胞を氷上で 溶解した。抽出物を 4。Cで 12— 18時間、 S- protein agarose (Novagen)とともにインキ ュペートして S-tag結合タンパク質の精製を行った。
次に、 agaroseを S— protein bind/wash bufferで 3回、 TEV protease cleavage buffer ( 1 OmM Tris-HCl pH8.0, 150mM NaCl, 0.1% Nonidet P— 40, 0.5mM EDTA, ImM DTT) で 1回洗浄した。その後、 100Uの TEVプロテアーゼ（Invitrogen)と 17°Cで時間イン キュベートすることにより、 TAP 融合タンパク質 (ガレクチン一 2)を切断した。タンパ ク質は PBSで透析し、 TALON affinity purification system (Clontech)を用いてさらに 精製を行った。得られたタンパク質複合体について SDS— PAGEを行レ、、 simply blu e (Invitrogen)で染色した。タンパク質のバンドについて、 MALDI/TOF mass spectro metryによってアミノ酸配列を決定した（APRO Life Science) 0
[0046] その結果、レプチン受容体の細胞外ドメインの配列を同定することができた。これに より、レプチン受容体がガレクチン一 2に結合することがわかった。
[0047] (3)レプチン受容体とガレクチン一 2の相互作用の確認
3 - 1. FLAGタグ融合レプチン受容体細胞内ドメイン（LRID— FLAG)の構築
Sail, Kpnl site配列がそれぞれ付加されたレプチンレセプター細胞内ドメイン（LRI D)に特異的な primer (配列番号 19および 20)を用い、ヒト肝臓 cDNA (Clontech)をテン プレートとして、 PCRを行った。増幅されたフラグメントを Sail, Kpnl処理し，同様に Sail ， Kpnl処理した pFLAG_CMV5a vector (SIGMA)に連結して、 FLAGタグ融合レプチ ン受容体細胞内ドメイン発現ベクターを得た。
[0048] 3 - 2. Mycタグ融合ガレクチン 2 (galectin—Myc)の構築
EcoRI, Xhol siteがそれぞれ付加された galectin-2に特異的な primer (配列番号 21 及び 22)を用レ、、ヒト肝臓 cDNA (Clontech)をテンプレートとし， PCRを行った。増幅さ れたフラグメントを EcoRI, Xhol処理し，同様に EcoRI, Xhol処理した pCMV-Myc vecto r (Clontech)に連結して、 Mycタグ融合ガレクチン一 2発現ベクターを得た。
[0049] galectin_ 2 _ FLAG発現ベクター及び LRID_Myc発現ベクターを Fugeneを用 いて COS7細胞（Health Science Research Resources Bank; JCRB9127)に一過的に トランスフエクシヨンした。 24時間後、細胞を lysis buffer (20mM Tris-HCl pH7.5, 1 50mM NaCL , 0.1% Nonidet P-40)を用いて不溶性の debrisが沈殿しない程度に 1時 間以上溶解した。抗 FLAGタグ M2ァガロース（Sigma)を用レ、て 4°Cで 12 _ 18時間 免疫沈降を行った。沈降物を lysis bufferで洗浄した後、抗 Myc抗体（Santa Cruz) 又は抗 Myc抗体ペルォキシダーゼコンジュゲート（Sigma)を用いて可視化した。なお 、対照としてガレクチン 1を用いた実験も行った。結果を図 1に示す。 FLAG抗体を 用いて免疫沈降（IP)を行い、得られた沈降物について myc抗体でウェスタンブロット (WB)を行った結果、ガレクチン— 1—FLAGでは LRID_mycを共沈降できなかつ たのに対し、ガレクチン一 2— FLAGによって LRID_Mycを共沈降することができ た。これにより、レブチン受容体とガレクチン一 2が特異的に相互作用していることが 明らかになった。
産業上の利用の可能性
本発明の判定方法によれば心筋梗塞等の炎症性疾患を早期に発見することがで き、診断分野等において有用である。また、本発明のスクリーニング方法によれば、 心筋梗塞等の炎症性疾患に対する新規医薬を得ることができ、医薬分野等において 有用である。

Claims

請求の範囲
[1] レブチン受容体遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づレ、て 炎症性疾患を検査する方法。
[2] レブチン受容体遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号 1の 164番目の塩基の 多型である、請求項 1に記載の方法。
[3] さらにガレクチン— 2遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果を合わ せて検査する、請求項 1に記載の方法。
[4] ガレクチン 2遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号 2の 377番目の塩基の 多型である、請求項 3に記載の方法。
[5] 炎症性疾患が心筋梗塞である請求項 1〜4のいずれか一項に記載の方法。
[6] 配列番号 1の塩基配列の 164番目の塩基を含む 10塩基以上の配歹 lj、又はその相補 配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
[7] 配列番号 1の塩基配列の 164番目の塩基を含む配列を有する DNAを増幅することの できる炎症性疾患検査用プライマー。
[8] レブチン受容体およびガレクチン 2を含むスクリーニング系に医薬候補物質を添カロ する工程、レブチン受容体とガレクチン一 2との相互作用を測定する工程、及び前記 相互作用を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患治療薬のスクリー二 ング方法。
PCT/JP2005/023634 2004-12-24 2005-12-22 炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法 Ceased WO2006068239A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/793,716 US8048625B2 (en) 2004-12-24 2005-12-22 Method of examining inflammatory disease and method of screening remedy for inflammatory disease
JP2006549065A JP4801596B2 (ja) 2004-12-24 2005-12-22 炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004374156 2004-12-24
JP2004-374156 2004-12-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006068239A1 true WO2006068239A1 (ja) 2006-06-29

Family

ID=36601836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/023634 Ceased WO2006068239A1 (ja) 2004-12-24 2005-12-22 炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8048625B2 (ja)
JP (1) JP4801596B2 (ja)
WO (1) WO2006068239A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019518787A (ja) * 2016-05-13 2019-07-04 ユニベルシテ ド ロレーヌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄｅ Ｌｏｒｒａｉｎｅ ガレクチンのｃｒｄのレクチン活性に基づく組換えタンパク質のアフィニティー精製のための方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4111481B2 (ja) 2000-11-02 2008-07-02 学校法人日本大学 心筋梗塞の遺伝的要因を判定するための方法及びこれに使用されるオリゴヌクレオチド
AU2003254895A1 (en) * 2002-08-08 2004-02-25 Masatsugu Hori Method of judging inflammatory disease
JP4668792B2 (ja) * 2003-08-18 2011-04-13 独立行政法人理化学研究所 ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子内一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU Y.-J. ET AL.: "Tests of linkage and/or association of the LEPR gene polymorphisms with obesity phenotypes in Caucasian nuclear families", PHYSIOL. GENOMICS, vol. 17, no. 2, April 2004 (2004-04-01), pages 101 - 106, XP002997538 *
OZAKI K. ET AL.: "Functional variation in LGALS2 confers risk of myocardial infarction and regulates lymphotoxin-alpha secretion in vitro", NATURE, vol. 429, no. 6987, May 2004 (2004-05-01), pages 72 - 75, XP002309271 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019518787A (ja) * 2016-05-13 2019-07-04 ユニベルシテ ド ロレーヌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄｅ Ｌｏｒｒａｉｎｅ ガレクチンのｃｒｄのレクチン活性に基づく組換えタンパク質のアフィニティー精製のための方法
JP7105761B2 (ja) 2016-05-13 2022-07-25 ユニベルシテ ド ロレーヌ ガレクチンのｃｒｄのレクチン活性に基づく組換えタンパク質のアフィニティー精製のための方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20100323346A1 (en) 2010-12-23
JP4801596B2 (ja) 2011-10-26
US8048625B2 (en) 2011-11-01
JPWO2006068239A1 (ja) 2008-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Windpassinger et al. An X-linked myopathy with postural muscle atrophy and generalized hypertrophy, termed XMPMA, is caused by mutations in FHL1
US12012636B2 (en) Pulmonary hypertension biomarker
CN109837340B (zh) 用于肺癌无创诊断的外周血基因标记物
WO2015108180A1 (ja) 痛風発症関連分子、並びに、尿酸関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法及び評価キット、検査体及び薬
JPWO2015108180A6 (ja) 痛風発症関連分子、並びに、尿酸関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法及び評価キット、検査体及び薬
Ianzano et al. Identification of a novel protein interacting with laforin, the EPM2a progressive myoclonus epilepsy gene product
JP5034086B2 (ja) 炎症性疾患の検査法および炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法
JP2010539891A (ja) 心臓血管及び血栓性の危険性の決定のためのｃｌｅｃ１ｂの使用
JP4801596B2 (ja) 炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法
JP4908402B2 (ja) ＵＲＬＣ８のｔＲＮＡ−ジヒドロウリジンシンターゼ活性によって非小細胞肺癌を診断する方法
JPWO2005017200A1 (ja) ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子内一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法
KR102066663B1 (ko) 유전성 말초 신경질환 진단용 마커 및 그의 용도
JP5644009B2 (ja) 一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法
KR102387354B1 (ko) 샤르코-마리-투스병 진단용 마커 및 그의 용도
KR20120028748A (ko) Ｍｃｍ７ 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커
JP4421889B2 (ja) 慢性関節リウマチの発症危険度を予測する方法
JP4960951B2 (ja) Ｍｇｃ４５０４の使用
KR20230138820A (ko) Mpz 유전자의 돌연변이를 포함하는, 신규한 샤르코-마리-투스병 진단용 바이오마커 및 이의 용도
WO2006126706A1 (ja) 双極性感情障害、統合失調症等の精神病性障害の予防・治療剤、そのスクリーニング方法、及び該疾患の発症リスクの判定方法
JPWO2004065633A1 (ja) ペプチジルアルギニン・デイミナーゼ・タイプｉｖの利用方法
HK1147523A (en) Use of clec1b for the determination of cardiovascular and thrombotic risk
HK1118901A (en) Use of mgc4504
JP2009207448A (ja) 自己免疫疾患の検査方法及び自己免疫疾患の予防又は治療薬のスクリーニング方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006549065

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05819772

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 5819772

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11793716

Country of ref document: US