KR102066663B1 - 유전성 말초 신경질환 진단용 마커 및 그의 용도 - Google Patents

유전성 말초 신경질환 진단용 마커 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 조성물, 및 그를 포함하는 키트를 제공한다. 또한, 이를 이용한 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 진단은 유전자 검사를 통하여 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 정확하게 조기에 진단하여, 치료 효과를 극대화할 수 있다.

Description

유전성 말초 신경질환 진단용 마커 및 그의 용도 {Marker for diagnosing inherited peripheral neuropathy and use thereof}
유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 그의 용도에 관한 것이다.
유전성 말초 신경질환 (inherited peripheral neuropathy : IPN)은 가족력을 가지며 유전자의 돌연변이에 의해 운동 및 감각 신경 계통의 기능 이상을 나타내는 선천성 질환이다. 이는 크게 유전성 운동 감각 신경질환 (hereditary motor and sensory neuropathy : HMSN), 유전성 운동 신경질환 (hereditary motor neuropathy : HMN), 유전성 감각 신경질환 (hereditary sensory neuropathy : HSN)으로 나뉜다. 이 중 HMSN이 대부분을 차지하며, 이는 샤르코-마리-투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease : CMT)으로 알려져 있다. 구체적으로는, 유전성 감각 자율신경질환 (Hereditary sensory and autonomic neuropathy : HSAN), 원위부 유전성 운동 신경질환 (Distal hereditary motor neuropathy : dHMN), 압박 마비 유전성 신경질환 (hereditary neuropathy with liability to pressure palsies : HNPP), 데제린 소타스병 (Dejerine-Sottas disease, Dejerine-Sottas syndrome : DSS) 및 선천적 수초 형성 저하 신경질환 (congenital hypomyelination neuropathy : CH) 등이 유전성 말초 신경질환에 포함된다. 이들은 유전적으로 이질적인 요인들에 의해 발병되며, 유전성 신경질환 중 가장 높은 출현 빈도를 보이는 CMT는 유럽인에서 대략 1:2,500의 발병율을 보이며, HNPP는 10만명 당 16명의 출현 빈도를 보인다.
CMT 질환은 주로 하지 비골 근육에서 서서히 진행되는 근력 약화와 위축을 특징으로 하며, 무반사증 (areflexia), 말단 감각 소실 (distal sensory loss), 발모양의 기형화 (pes cavus), 청력장애 (deafness)를 나타내기도 한다. 발병은 10대 전후에 주로 일어나지만 드물게 30대 이후에도 일어난다. 그러나, CMT 질환의 임상적 표현형과 발병 연령은 매우 이질적이며 확진을 위한 신경 조직검사 (nerve biopsy)도 용이하지 않으므로 정확한 진단과 치료를 어렵게 한다 (Berger P., Young P., Suter U. Neurogenet. 4: 1-15 (2002)).
HSAN 질환은 운동 신경의 침범은 일어나지 않고, 감각신경 및 자율신경의 기능이 소실되어 나타나는 질환이다. 임상적으로나 유전적으로 다양한 원인 및 증상을 가지는 질환으로 신경의 위축 및 손실에 의해 감각 신경 및 자율 신경 손상이 현저하게 나타난다. 자율 신경의 양상은 아형에 따라 다르며, 원위부 근육 무력증과 근육 소실이 있을 수 있는데 어떤 경우에는 HMSN과 구분하기 어려울 정도로 그 정도가 심하다. HSAN는 5형으로 분류되는데, 제1형은 우성형태, 제2형은 선천성, 제3형은 패밀리성 자율 신경 기능 장애 (Familial dysautonomia), 제4형은 통증에 무감각한 선천성, 제5형은 선택적 소직경 수초성 신경 섬유를 동반하는 것이다.
dHMN 질환은 말초 유전성 운동 신경질환이라고도 하며, 감각에는 증상이 없고, 점진적으로 진행되며, 성대 마비로 인해 혼흡 곤란을 일으키는 질환이다.
최근 인간의 유전체 연구와 바이오 정보학의 발달로 유전병의 원인 유전자를 분리하고 분자 생물학적 기전을 밝히는 연구가 세계적으로 매우 활발하게 진행되고 있다. 환경적 요인보다는 유전적 요인에 의해 발병하는 것으로 알려진 유전성 말초 신경질환에 대한 유전적 원인 분석도 상당히 수행되었는데, 지금까지 17p11.2-p12 1.4 내지 1.5Mb의 중복/결실을 제외하고는 대부분의 돌연변이가 SNP 및 짧은 염기서열의 중복/결실에 의한 것으로 밝혀졌다.
유전성 말초 신경질환의 정확한 유전적 진단에 따라 발병의 억제 및 유전적 원인에 적합한 맞춤 치료가 가능하게 되었으나, 아직까지 효율적인 유전성 말초 신경질환의 진단 방법 개발은 미흡한 실정이다. 유전적으로 매우 이질적인 특성을 가진 유전성 말초 신경질환의 맞춤 치료를 위하여 먼저 정확한 유전적 진단법의 확립이 요구되고 있다. 이에 본 발명자들은 유전성 말초 신경질환의 발병 원인을 규명하고자 예의 연구 노력한 결과, 기존에 보고되지 않은 신규한 변이 유전자를 규명하였으며, 상기 변이 유전자가 유전성 말초 신경질환의 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 조성물, 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 양상은 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1 내지 5의 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치를 포함하고 상기 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 SNP 위치는, 서열번호 1의 경우 서열번호 1의 5` 말단으로부터 47번째 뉴클레오티드, 서열번호 2의 경우 서열번호 2의 5` 말단으로부터 929번째 및 3272번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 경우 서열번호 3의 5` 말단으로부터 154번째 뉴클레오티드, 서열번호 3의 경우 서열번호 3의 5` 말단으로부터 262번째 뉴클레오티드, 서열번호 4의 경우 서열번호 4의 5` 말단으로부터 435번째 뉴클레오티드, 서열번호 5의 경우 서열번호 5의 5` 말단으로부터 1019번째 뉴클레오티드인 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
"유전성 말초 신경질환 (inherited peripheral neuropathy : IPN)"은 가족력을 가지며 유전자의 돌연변이에 의해 운동 및 감각 신경 계통의 기능 이상을 나타내는 선천성 질환으로서, 통상의 기술자에게 알려진 의미로 사용될 수 있다. 이는 크게 유전성 운동 감각 신경질환 (hereditary motor and sensory neuropathy : HMSN), 유전성 운동 신경질환 (hereditary motor neuropathy : HMN), 유전성 감각 신경질환 (hereditary sensory neuropathy : HSN)로 나뉜다. 상기 유전성 말초 신경질환은 샤르코-마리-투스병 (Charcot-Marie-Tooth disease : CMT, 이하 CMT라고 함), 유전성 감각 자율신경질환 (Hereditary sensory and autonomic neuropathy : HSAN, 이하 HSAN이라고 함), 원위부 유전성 운동 신경질환 (Distal hereditary motor neuropathy : dHMN, 이하 dHMN이라고 함), 또는 이들의 조합일 수 있다.
CMT는 감각 기능의 손실을 동반한 원위성 근육 약화의 증상을 나타내는 질환으로, 표현형 또는 유전형에 따라, CMT1, CMT2, CMT4, IntCMT 또는 CMTX로 분류될 수 있다. CMT1은 CMT 질환 중 상염색체 우성 유전을 하며 신경 전도 검사 속도가 느린 탈수초성 신경질환을 의미하며, CMT1A, CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1E, CMT1F 또는 CMT1X일 수 있다. CMT2는 상염색체 우성으로 유전되는 축삭형 신경질환으로 CMT1 보다 장애 정도나 발병 연령층이 다양하며 신경 전도 속도는 정상이거나 약간의 저하된 신경질환을 의미하며, CMT2A1, CMT2A2, CMT2B, CMT2C, CMT2D, CMT2E, CMT2F, CMT2G, CMT2I, CMT2J, CMT2K, CMT2L, CMT2M, CMT2N, CMT2O, CMT2P, CMT2Q, CMT2R, CMT2S, CMT2T, CMT2U, CMT2V, 또는 CMT2 with giant axons 일 수 있다. CMT4는 상염색체 열성 유전을 하며 상염색체 열성 탈수초화를 가지는 말초 감각운동 다발 신경질환을 의미하며, CMT4A, CMT4B1, CMT4B2, CMT4B3, CMT4C, CMT4D, CMT4E, CMT4F, CMT4G, CMT4H, CMT4J, CMT4K 또는 CMT4X일 수 있다. IntCMT는 축삭형 및/또는 탈수초성 특징을 보이는 신경질환을 의미한다. CMTX는 X 염색체와 관련되며, 천천히 점진적으로 진행되고, 발, 다리, 손과 관련된 사지 근육이 약화 및 위축되는 말초 감각운동 다발 신경질환을 의미하며, CMTX1, CMTX2, CMTX3, CMTX4, CMTX5 또는 CMTX6일 수 있다.
HSAN은 운동 신경의 침범은 일어나지 않고, 감각신경 및 자율신경의 기능이 소실되어 나타나는 질환을 의미하며, HSAN1A, HSAN1B, HSAN1C, HSAN1D, HSAN1E, HSAN2, HSAN3, HSAN4, HSAN5, HSAN6 또는 HSAN7일 수 있다.
dHMN는 감각에는 증상이 없고, 점진적으로 진행되며, 성대 마비로 인해 호흡 곤란을 일으키며, 손과 관련된 근육이 위축되는 질환을 의미하며, dHMN1, dHMN2, dHMN3, dHMN4, dHMN5, dHMN5B, dHMN6, dHMN7,dHMN7B 또는 dHMNJ일 수 있다.
"유전성 말초 신경질환 발병 위험"은 유전성 말초 신경질환 발병 위험의 상대적인 위험일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 발병의 확률이 건강한 정상인 군에 비하여 증가되어 있는지, 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 위험은 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체가 다른 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체에 비하여 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 증가되어 있는지 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다.
상기 개체는 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 또는 인간 (Homo sapiens)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 한국인일 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 단일가닥 또는 이중가닥 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합에 의하여 혼성화될 수 있는 성질을 갖는 것이면, 천연 뉴클레오티드로 구성된 것뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990)).
상기 폴리뉴클레오티드는 SNP 위치에서 단일 뉴클레오티드 다형을 나타내는 것이다. 따라서, 하나의 단일가닥 폴리뉴클레오티드가 유전성 말초 신경질환의 발병 위험과 연관되어 있는 경우, 상기 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 당연히 유전성 말초 신경질환 발병 위험과 연관되어 있는 것을 판단될 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은, 하나의 특정한 서열을 가진 유전성 말초 신경질환의 발병 위험과 연관되어 있는 단일가닥 폴리뉴클레오티드 및 그에 상보적인 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
예를 들면, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드는 47번째 (SNP 위치) 뉴클레오티드가 "T 또는 G"이다. 이 경우, 상기 조성물은 47번째 (SNP 위치)의 "T 또는 G" 뉴클레오티드를 포함하고 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 47번째 (SNP 위치)에 대응되는 위치에 "A 또는 C" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 즉 상기 조성물은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치인 상기 서열번호 1의 5` 말단으로부터 47번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서 c.47T > G 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 2의 폴리뉴클레오티드는 929번째 및 3272번째 (SNP 위치) 뉴클레오티드가 "G 및 G" 또는 "A 및 T"이다. 이 경우, 상기 조성물은 929번째 및 3272번째 (SNP 위치)의 "G 및 G" 또는 "A 및 T" 뉴클레오티드를 포함하고 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 929번째 및 3272번째 (SNP 위치)에 대응되는 위치에 "C 및 C" 또는 "T 및 A" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 즉 상기 조성물은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치인 상기 서열번호 2의 5` 말단으로부터 929번째 및 3272번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에서 c.929G > A + c.3272G > T 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 3의 폴리뉴클레오티드는 154번째 (SNP 위치) 뉴클레오티드가 "T 또는 G"이다. 이 경우, 상기 조성물은 154번째 (SNP 위치)의 "T 또는 G" 뉴클레오티드를 포함하고 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 154번째 (SNP 위치)에 대응되는 위치에 "A 또는 C" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 즉 상기 조성물은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치인 상기 서열번호 3의 5` 말단으로부터 154번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드에서 c.154T > G 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 3의 폴리뉴클레오티드는 262 번째 (SNP 위치) 뉴클레오티드가 "T 또는 C"이다. 이 경우, 상기 조성물은 262번째 (SNP 위치)의 "T 또는 C" 뉴클레오티드를 포함하고 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 262번째 (SNP 위치)에 대응되는 위치에 "A 또는 G" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 즉 상기 조성물은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치인 상기 서열번호 3의 5` 말단으로부터 262번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드에서 c.262T > C 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 4의 폴리뉴클레오티드는 435 번째 (SNP 위치) 뉴클레오티드가 "G 또는 T"이다. 이 경우, 상기 조성물은 435번째 (SNP 위치)의 "G 또는 T" 뉴클레오티드를 포함하고 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 435번째 (SNP 위치)에 대응되는 위치에 "C 또는 A" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 즉 상기 조성물은 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치인 상기 서열번호 4의 5` 말단으로부터 435번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드에서 c.435G > T 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 5의 폴리뉴클레오티드는 1019 번째 (SNP 위치) 뉴클레오티드가 "A 또는 G"이다. 이 경우, 상기 조성물은 1019번째 (SNP 위치)의 "A 또는 G" 뉴클레오티드를 포함하고 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 10개 이상의 연속된 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 1019번째 (SNP 위치)에 대응되는 위치에 "T 또는 C" 뉴클레오티드를 갖는 상보적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 즉 상기 조성물은 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치인 상기 서열번호 5의 5` 말단으로부터 1019번째 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드에서 c.1019A > G 변이를 검출할 수 있다.
상기 서열번호 1 내지 5의 뉴클레오티드 서열의 SNP 위치의 뉴클레오티드는 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 진단 또는 예측하기 위한 마커로 사용될 수 있다.
단일 뉴클레오티드 다형성 (single nucleotide polymorphism : SNP, 이하 SNP라고 함)은 당해 기술분야에 통상적으로 알려진 의미로 사용된다. SNP는 집단 내의 게놈에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형을 나타낼 수 있다. SNP는 SNP 위치에서의 유전형 (genotype)인 것일 수 있다. 상기 SNP는 집단 내의 SNP의 소수 대립인자의 빈도가 1% 이상인 것일 수 있다. SNP는 단일 염기 변이 또는 단일 뉴클레오티드 변이 (single nucleotide variant: SNV, 이하 SNV라고 함)와 혼용될 수 있다.
염기 A는 아데닌, 염기 G는 구아닌, 염기 C는 시토신, 염기 T는 티민을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 내지 200 뉴클레오티드 (nucleotide : nt)인 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 길이가 10 내지 150 nt, 10 내지 100 nt, 또는 15 내지 100 nt인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 단수개 또는 복수개, 또는 1쌍 또는 복수의 쌍일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산일 수 있다. "프라이머"란 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소의 존재) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들면, 온도와 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 15 내지 30nt인 것일 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 상기 프라이머는 상기한 폴리뉴클레오티드 자체 뿐만 아니라, 상기한 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 서열로서 중합반응에서 개시점으로 작용할 수 있는 것도 포함된다. 예를 들면, 서열번호 1 내지 5의 폴리뉴클레오티드에 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 상보성을 갖는 서열일 수 있다. 프라이머의 설계는 주어진 증폭하고자 하는 표적 핵산의 서열을 참조하여 통상의 기술자에 의해 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램을 사용하여 설계할 수 있다. 상기 상업적으로 구입가능한 프라이머 설계용 프로그램의 예는 PRIMER 3 프로그램이 포함된다.
상기 폴리뉴클레오티드가 PCR 프라이머로서 사용되는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드에 더하여, 그의 상보적 가닥에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함할 수 있다.
"프로브"란 특정 표적 서열에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한, 상보적 뉴클레오티드에 수소 결합에 의하여 혼성화될 수 있는 성질을 갖는 것이면, 천연 뉴클레오티드로 구성된 것뿐만 아니라, 천연 뉴클레오티드, 천연 뉴클레오티드의 유사체, 천연 뉴클레오티드의 당, 염기 또는 인산 부위가 변형되어 있는 뉴클레오티드 및 이들 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 프로브는 길이가 5 내지 100nt, 10 내지 90nt, 15 내지 80nt, 20 내지 70nt, 또는 30 내지 50nt인 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 PNA를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 분석 반응에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그가 결합되어 있는 복합체의 검출의 편이를 위하여, 검출 가능한 표지 (예, Cy3, Cy5 형광성 물질)가 부착, 예를 들면, 3' 말단 또는 5' 말단에 부착되어 있는 것일 수 있다.
상기 프로브는, SNP 위치를 포함하는 표적 서열에 완전하게 상보적인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 또한, 상기 프로브는, SNP 위치를 포함하는 표적 서열에 대한 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 프로브는, SNP 위치를 포함하는 표적 서열에 대한 특이적 혼성화를 손상하지 않는 범위 내에서, 변형된 뉴클레오티드를 갖는 것일 수 있다. 상기 프로브의 예는, SNP 위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 완전 상보적인 서열로 이루어진 완전 매치 프로브 (perfect match probe) 및 SNP 위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대하여, 상기 SNP 위치를 제외한 모든 서열에 대하여 완전 상보적인 서열을 갖는 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
"안티센스 핵산"은 표적 서열에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지고 있어, 그와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미한다. 상기 안티센스 핵산은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편, 또는 이들에 상보적인 것일 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 길이가 10nt 이상, 보다 구체적으로 10 내지 200nt, 10 내지 150nt, 또는 10 내지 100nt인 것일 수 있으나, 검출 특이성을 증가시키기 위하여 적절한 길이를 선택할 수 있다.
상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산을 사용하여 SNP 위치에 특정한 대립인자를 가진 뉴클레오티드 서열을 증폭하거나 그 존재를 확인할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 검출 가능한 표지로 표지된 것인 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 검출 가능한 표지는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로서, 형광물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 핵산의 혼성화 결과를 확인할 수 있다.
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 PMP22 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. PMP22 (peripheral myelin protein 22) 유전자는 말초신경계에서 수초 (myelin)의 주요 구성 요소를 암호화하는 유전자로서, NCBI Accession number NM_000304.3로 등록된 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 PMP22 단백질은 인간의 경우 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 NCBI Accession number NP_000295.1로 등록된 단백질 일 수 있다.
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 SH3TC2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. SH3TC2 (SH3 domain and tetratricopeptide repeats 2) 유전자는 신경 주위 슈반 세포 (Schwann cell)에서 발현되는 단백질을 암호화하는 유전자로서, NCBI Accession number NM_024577.3로 등록된 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 SH3TC2 단백질은 인간의 경우 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 NCBI Accession number NP_078853.2로 등록된 단백질 일 수 있다.
서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 MPZ 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. MPZ (myelin protein zero) 유전자는 수초를 구성하는 당단백질을 암호화하는 유전자로서, NCBI Accession number NM_000530.7로 등록된 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 MPZ 단백질은 인간의 경우 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 NCBI Accession number NP_000521.2로 등록된 단백질 일 수 있다.
서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 SPTLC2 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. SPTLC2 (serine palmitoyltransferase long chain base subunit 2) 유전자는 세린 팔미토일트랜스퍼라제 (serine palmitoyltransferase : SPT) 효소의 서브 유닛이고, 스핑고지질 (sphingolipids)의 드 노보 생합성에 중요한 요소를 암호화하는 유전자로서 (Ernst et al., 2015; Rotthier et al., 2010), NCBI Accession number NM_004863.3로 등록된 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 SPTLC2 단백질은 인간의 경우 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 NCBI Accession number NP_004854.1로 등록된 단백질 일 수 있다.
서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DCTN1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. DCTN1 (dynactin subunit 1) 유전자는 진핵 세포에서 존재하고, 디낵틴 1 (dynactin 1)의 서브 유닛을 암호화하는데, 이는 소포 및 세포 소기관의 역행 축삭 수송 (retrograde axonal transport)에서 중요한 유전자로서, NCBI Accession number NM_004082.4로 등록된 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 DCTN1 단백질은 인간의 경우 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 NCBI Accession number NP_004073.2로 등록된 단백질 일 수 있다.
통상의 기술자라면 상기 등록 번호를 이용하여 변이의 위치, 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. UCSC genome browser 또는 진뱅크 (GenBank)에 등록되어 있는 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 다소 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
상기 조성물은 고상 조성물 또는 액상 조성물일 수 있다. 상기 액상 조성물은 상기 폴리뉴클레오티드를 적절한 액체 매질 중에 포함할 수 있다. 상기 액상 매질은 당해 기술분야에서 폴리뉴클레오티드의 액상 매질로 사용되는 임의의 것일 수 있다. 또한, 상기 액상 매질은 상기 조성물을 사용하고자 하는 목적에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 액상 매질은 물, PCR 버퍼 및 혼성화 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
다른 양상은, 상기 조성물을 포함하는 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 마이크로 어레이를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드, 조성물, 개체 및 유전성 말초 신경질환에 대하여는, 상기한 바와 같다. "마이크로어레이"란 기판 표면의 구분된 영역에 상기 폴리뉴클레오티드가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것을 의미한다. 상기 마이크로어레이는, 상기 영역이 예를 들면 400/cm2 이상, 103/cm2, 또는 104/cm2의 밀도로 기판 상에 배열되어 있는 것일 수 있다.
다른 양상은, 상기 조성물을 포함하는 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드, 조성물, 개체 및 유전성 말초 신경질환에 대하여는, 상기한 바와 같다.
상기 키트는 표적 서열을 특이적으로 증폭하고, 증폭 산물의 존재 유무를 통하여, 개체의 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 진단하기 위한 키트일 수 있다. 이 경우, 상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드를 프라이머로서 포함하는 동시에, 증폭에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 상기 증폭 시약은 예를 들면, dNTP, 폴리머라제, 및 적절한 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 예를 들면, SNP 위치에 해당하는 뉴클레오티드 서열이 프라이머의 3' 말단 뉴클레오티드를 형성하고, 상기 3' 말단 뉴클레오티드는 상기 SNP 위치의 뉴클레오티드에 상보적이거나 (특이적 프라이머) 상보적이지 않은 것 (비특이적 프라이머)으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 비특이적 프라이머는 상기 3' 말단 뉴클레오티드뿐만 아니라 다른 부위에도 상보적이지 않은 서열을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 사용 설명서를 포함할 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 서열이 증폭되고, 상기 비특이적 프라이머를 사용한 증폭 반응에서 표적 서열이 증폭되지 않는 경우, 증폭에 사용된 시료 중에서 유전성 말초 신경질환과 연관된 표적 서열이 존재하는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 개체의 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 결정하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함할 수 있다.
상기 키트는, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그로부터 유래된 프로브를 시료 중의 핵산과 혼성화시키고, 그 혼성화 결과로부터 개체의 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 진단하기 위한 키트일 수 있다. 이 경우, 상기 키트는, 상기 프로브 및 혼성화에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 혼성화에 필요한 시약이란 예를 들면, 혼성화 버퍼가 포함될 수 있다. 상기 핵산은 증폭 또는 증폭되지 않은 것일 수 있다. 따라서, 상기 키트는 핵산의 증폭에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산은 검출 가능한 표지로 표지될 수 있다. 상기 키트는, 상기 표적 서열에 완전 상보적인 프로브 (perferct match probe) 또는 상기 표적 서열에 있어서, SNP 위치를 제외한 모든 부위에서 상보적인 미스매치 프로브 (mismatch probe)를 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 사용 설명서를 포함할 수 있다. 상기 사용 설명서는 예를 들면, 상기 완전 상보적인 프로브를 사용한 혼성화 반응에서 표적 서열이 검출되고, 상기 미스매치 프로브를 사용한 혼성화 반응에서 표적 서열이 검출되지 않는 경우, 시료 중에서 유전성 말초 신경질환과 연관된 서열이 존재하는 것으로 결정하고, 그 결과로부터 개체의 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 결정하는 것에 대한 설명을 포함한, 결과 판정에 대한 설명을 포함할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 6 내지 10의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드에 있어서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 치환 위치를 포함하는 폴리펩티드를 특이적으로 검출하기 위한 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 치환 위치는, 서열번호 6의 경우 서열번호 6의 N 말단으로부터 16번째 아미노산, 서열번호 7의 경우 서열번호 7의 N 말단으로부터 310번째 및 1091번째 아미노산, 서열번호 8의 경우 서열번호 8의 N 말단으로부터 52번째 아미노산, 서열번호 8의 경우 서열번호 8의 N 말단으로부터 88번째 아미노산, 서열번호 9의 경우 서열번호 9의 N 말단으로부터 145번째 아미노산, 서열번호 10의 경우 서열번호 10의 N 말단으로부터 340번째 아미노산인 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 폴리펩티드는 상기 SNP 위치에서 단일 뉴클레오티드 다형을 나타내어 아미노산 치환을 나타내는 것이다.
예를 들면, 서열번호 6의 폴리펩티드는 16번째 (아미노산 치환 위치) 아미노산이 "L 또는 R"이다. 즉 상기 조성물은 서열번호 6의 폴리펩티드에서 아미노산 치환 위치인 상기 서열번호 6의 N 말단으로부터 16번째 아미노산을 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 서열번호 6의 폴리펩티드에서 p.L16R 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 7의 폴리펩티드는 310번째 및 1091번째 (아미노산 치환 위치) 아미노산이 "G 및 G" 또는 "E 및 V"이다. 즉 상기 조성물은 서열번호 7의 폴리펩티드에서 아미노산 치환 위치인 상기 서열번호 7의 N 말단으로부터 310번째 및 1091번째 아미노산을 검출할 수 있다. 또는 상기 조성물은 서열번호 7의 폴리펩티드에서 p.G310E + p.G1091V 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 8의 폴리펩티드는 52번째 (아미노산 치환 위치) 아미노산이 "F 또는 V"이다. 즉 상기 조성물은 서열번호 8의 폴리펩티드에서 아미노산 치환 위치인 상기 서열번호 8의 N 말단으로부터 52번째 아미노산을 검출할 수 있다. 상기 조성물은 서열번호 8의 폴리펩티드에서 p.F52V 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 8의 폴리펩티드는 88번째 (아미노산 치환 위치) 아미노산이 "Y 또는 H"이다. 즉 상기 조성물은 서열번호 8의 폴리펩티드에서 아미노산 치환 위치인 상기 서열번호 8의 N 말단으로부터 88번째 아미노산을 검출할 수 있다. 상기 조성물은 서열번호 8의 폴리펩티드에서 p.Y88H 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 9의 폴리펩티드는 145번째 (아미노산 치환 위치) 아미노산이 "R 또는 S"이다. 즉 상기 조성물은 서열번호 9의 폴리펩티드에서 아미노산 치환 위치인 상기 서열번호 9의 N 말단으로부터 145번째 아미노산을 검출할 수 있다. 상기 조성물은 서열번호 9의 폴리펩티드에서 p.R145S 변이를 검출할 수 있다.
서열번호 10의 폴리펩티드는 340번째 (아미노산 치환 위치) 아미노산이 "E 또는 G"이다. 즉 상기 조성물은 서열번호 10의 폴리펩티드에서 아미노산 치환 위치인 상기 서열번호 10의 N 말단으로부터 340번째 아미노산을 검출할 수 있다. 상기 조성물은 서열번호 10의 폴리펩티드에서 p.E340G 변이를 검출할 수 있다.
상기 서열번호 6 내지 10의 아미노산 서열의 아미노산 치환 위치의 아미노산은 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 진단 또는 예측하기 위한 마커로 사용될 수 있다.
아미노산 치환은 하나 이상의 뉴클레오티드의 변경에 의하여 아미노산 서열이 변경된 것을 의미한다. 아미노산 치환은, 미스센스 변이 (missense mutation, 과오 변이), 잠재성 변이 (silent mutation), 넌센스 변이 (nonsense mutation), 중립 변이 (neutral mutation), 인트론에서 일어나는 변이, 격자이동 변이 (Frame shift mutation, 프레임 쉬프트) 등을 포함할 수 있다. 미스센스 변이는 뉴클레오티드가 바뀌어 다른 아미노산이 암호화되는 변경을 의미한다. 잠재성 변이는 뉴클레오티드가 바뀌었지만, 암호화되는 아미노산이 같은 변이를 의미한다. 넌센스 변이는 뉴클레오티드가 바뀌어 종결코돈이 됨으로써, 아미노산을 더이상 생성하지 않는 변경을 의미한다. 중립 변이는 뉴클레오티드가 바뀌어 다른 아미노산이 암호화되었으나, 본래 지정된 아미노산과 성질이 같은 변경을 의미한다. 인트론에서 일어나는 변이는 암호화하지 않는 인트론 영역에서 일어나는 변경을 의미한다. 격자이동 변이는 뉴클레오티드의, 치환, 삽입, 결실 등에 의하여, 유전자를 암호화하는 해독틀이 이동하여 번역되는 아미노산이 달라지는 변경을 의미한다. 따라서, 상기 아미노산 치환에 따라, 단백질의 기능에 변화가 없거나, 내성을 갖거나, 양성을 갖거나, 해롭거나, 손상을 주거나, 또는 질환이 유발될 수 있다.
상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편인 것일 수 있고, 단수개 또는 복수개일 수 있다.
"폴리펩티드를 특이적으로 검출"은 개체의 시료 내에서 상기 폴리펩티드를 특이적으로 확인하는 것을 의미한다.
"항체"는 당해 기술분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 항체는 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미한다.
"항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조 또는 항체 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들면, scFv 단편, (scFv)2 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 등을 포함할 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고, 예를 들면, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 조성물은 검출 대상이 되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 항원-항체 결합으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 검출 대상이 되는 폴리펩티드에 약 1×107M-1, 약 1×108M-1, 약 1×109M-1, 약 1×1010M-1, 또는 약 1×1011M-1의 친화도 상수 (KA)를 가지면서 결합하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법 (radioimmunoassays), 효소결합면역법 (ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯 (immunoblotting), 파아르 분석법 (Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법 등을 이용한 방법에 이용될 수 있다. 즉 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법에 이용될 수 있다.
아미노산 G는 글리신, 아미노산 A는 알라닌, 아미노산 V는 발린, 아미노산 L은 류신, 아미노산 I는 이소류신, 아미노산 M은 메티오닌, 아미노산 F는 페닐알라닌, 아미노산 W는 트립토판, 아미노산 P는 프롤린, 아미노산 S는 세린, 아미노산 T는 트레오닌, 아미노산 C는 시스테인, 아미노산 Y는 타이로신, 아미노산 N는 아스파라긴, 아미노산 Q는 글루타민, 아미노산 D는 아스파르테이트, 아미노산 E는 글루타메이트, 아미노산 K는 리신, 아미노산 R은 알지닌, 아미노산 H는 히스티딘을 의미한다.
상기 조성물은 고상 조성물 또는 액상 조성물일 수 있다. 상기 액상 조성물은 상기 폴리펩티드를 적절한 액체 매질 중에 포함할 수 있다. 상기 액상 매질은 당해 기술분야에서 폴리펩티드의 액상 매질로 사용되는 임의의 것일 수 있다. 또한, 상기 액상 매질은 상기 조성물를 사용하고자 하는 목적에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 액상 매질은 물 또는 버퍼일 수 있다.
다른 양상은, 상기 조성물을 포함하는 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 상기 폴리펩티드, 조성물, 개체 및 유전성 말초 신경질환에 대하여는, 상기한 바와 같다. 상기 키트는 상기 폴리펩티드의 존재 유무를 통하여, 개체의 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 진단하기 위한 키트일 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩 키트는 항원과 항체의 결합을 검출 또는 측정하기 위하여, 기재, 적당한 완충 버퍼, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소로는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광 물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질로는 ABTS (2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), TMB (테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
다른 양상은, 분리된 생물학적 시료에서 상기 정의된 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계를 포함하는 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 분리된 생물학적 시료를 제공하는 단계를 포함한다. 개체로부터 핵산을 분리하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 DNA를 직접적으로 분리하거나 PCR과 같은 핵산 증폭 방법에 의하여 특정한 영역을 증폭함으로써 분리될 수 있다. 상기 분리된 핵산 시료에는 순수하게 분리된 핵산뿐만 아니라 조 분리된 핵산, 예를 들면, 핵산을 포함하는 세포 파쇄물도 포함한다. 상기 핵산 증폭 방법에는 PCR, 리가제 연쇄반응 (LCR), 전사 증폭 (transcription amplification), 자기 유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)가 포함된다. 상기 분리된 핵산은, DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 DNA에는 게놈 DNA, cDNA 또는 재조합 DNA일 수 있다. 상기 RNA는 mRNA 일 수 있다.
상기 방법은 또한 상기한 폴리뉴클레오티드의 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계를 포함한다. SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 것은 알려져 있다. 예를 들면, 알려진 핵산의 뉴클레오티드 시퀀싱 방법 (sequencing method)에 의하여 SNP 위치의 뉴클레오티드를 직접적으로 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 결정 방법에는 생거 (또는 디데옥시) 시퀀싱 방법 또는 막삼-길버트 (화학 절단) 방법이 포함될 수 있다. 또한, SNP 위치의 서열을 포함하는 프로브를 대상 폴리뉴클레오티드와 혼성화시키고, 혼성화 결과를 분석함으로써, SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정할 수 있다. 혼성화 정도는 예를 들면, 검출 가능한 표지를 대상 핵산에 표지하고, 혼성화된 대상 핵산을 검출함으로써 확인되거나, 전기적 방법 등에 의하여 확인될 수 있다. 또한, 단일염기 연장 (single base primer extension: SBE) 방법이 이용될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 SNP 위치의 폴리뉴클레오티드를 결정하는 단계는 상기 폴리뉴클레오티드가 고정화되어 있는 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 방법은 상기 SNP 위치의 뉴클레오티드를 결정한 결과 위험 대립인자가 존재하는 경우, 상기 개체를 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
"위험 대립인자 (risk allele)"란 기준 대립인자를 소수 대립인자 a로 하여 질병군에서의 a의 빈도가 정상군에서의 a의 빈도보다 큰 경우 또는 질병군에서의 a가 다수 대립인자인 경우에는 a를 위험 대립인자로 할 수 있다. 개체가 위험 대립인자를 많이 가질수록 유전성 말초 신경질환의 발병 가능성이 높을 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 내지 5의 SNP 위치에서 소수 대립인자 a가 존재하는 경우, 상기 대상을 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정할 수 있다. 대립인자 a에 대하여는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다. 예를 들면, 결정된 SNP 위치의 뉴클레오티드가, 서열번호 1의 경우 서열번호 1의 서열번호 1의 5` 말단으로부터 47번째 뉴클레오티드가 G, 서열번호 2의 경우 서열번호 2의 5` 말단으로부터 929번째 뉴클레오티드가 A 및 3272번째 뉴클레오티드가 T, 서열번호 3의 경우 서열번호 3의 5` 말단으로부터 154번째 뉴클레오티드가 G, 서열번호 3의 경우 서열번호 3의 5` 말단으로부터 262번째 뉴클레오티드가 C, 서열번호 4의 경우 서열번호 4의 5` 말단으로부터 435번째 뉴클레오티드가 T, 서열번호 5의 경우 서열번호 5의 5` 말단으로부터 1019번째 뉴클레오티드가 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드인 경우, 상기 개체를 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 또는 인간 (Homo sapiens)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 한국인일 수 있다.
또한, 상기 방법은 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다. 상기 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 것은, 유전성 말초 신경질환의 발병의 상대적인 위험을 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 참조 유전체 서열을 갖고 있는 군 또는 정상인 군에 비하여 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 증가되어 있는지를 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다. 상기 SNP 위치에서 변이의 수가, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상인 경우, 유전성 말초 신경질환의 발병 위험이 높다고 판단할 수 있으며, 예측 또는 진단에 대한 정확도 및 신뢰도가 높아질 수 있다.
다른 양상은, 분리된 생물학적 시료에서 상기 정의된 아미노산 치환 위치의 아미노산을 결정하는 단계를 포함하는 아미노산 치환 위치의 아미노산을 결정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 분리된 생물학적 시료를 제공하는 단계를 포함한다. 개체로부터 시료를 분리하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들면, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 또한 상기한 폴리펩티드의 아미노산 치환 위치의 아미노산을 결정하는 단계를 포함한다. 아미노산 위치의 아미노산을 결정하는 것은 알려져 있다. 예를 들면, 펩티드 서열분석기 또는 단백질 서열분석기를 이용하여 아미노산 치환 위치의 아미노산을 직접적으로 결정할 수 있다. 또한, 항원과 항체의 결합을 측정하면서 아미노산 치환 위치의 아미노산을 검출할 수 있는, 단백질 칩, 효소결합면역법 등을 이용하여 아미노산 서열을 결정할 수 있다.
결정된 아미노산 치환 위치의 아미노산이, 서열번호 6의 경우 서열번호 6의 N 말단으로부터 16번째 아미노산은 R, 서열번호 7의 경우 서열번호 7의 N 말단으로부터 310번째 아미노산은 E 및 1091번째 아미노산은 V, 서열번호 8의 경우 서열번호 8의 N 말단으로부터 52번째 아미노산은 V, 서열번호 8의 경우 서열번호 8의 N 말단으로부터 88번째 아미노산은 H, 서열번호 9의 경우 서열번호 9의 N 말단으로부터 145번째 아미노산은 S, 서열번호 10의 경우 서열번호 10의 N 말단으로부터 340번째 아미노산은 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산인 경우, 상기 개체를 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 예측하기 위한 대상을 의미한다. 상기 개체는 척추동물, 포유동물, 또는 인간 (Homo sapiens)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간은 한국인일 수 있다.
또한, 상기 방법은 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다. 상기 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 것은, 유전성 말초 신경질환의 발병의 상대적인 위험을 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 참조 유전체 서열을 갖고 있는 군 또는 정상인 군에 비하여 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 증가되어 있는지를 예측 또는 진단하기 위한 것일 수 있다. 상기 아미노산 변이 위치에서 변이의 수가, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개인 경우, 유전성 말초 신경질환의 발병 위험이 높다고 판단할 수 있으며, 예측 또는 진단에 대한 정확도 및 신뢰도가 높아질 수 있다.
상기 조성물 및 키트는 유전성 말초 신경질환의 발병 위험을 신속하고, 효율적으로 진단하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법에 따르면, 개체가 유전성 말초 신경질환 발병의 위험도를 갖는지 여부를 효율적으로 확인할 수 있다.
도 1은 병인성 또는 병인가능성 변이를 가지는 유전성 말초 신경질환 환자를 포함하는 가족의 가계도를 나타낸다. A는 PMP22의 c.47T > G 변이를 갖는 FC541 가족, B는 SH3TC2의 c.929G > A 및 c.3272G > T 변이를 갖는 FC703 가족, C는 MPZ의 c.154T > G 변이를 갖는 FC156 가족, D는 MPZ의 c.262T > C 변이를 갖는 FC141 가족, E는 DCTN1의 c.1019A > G 변이를 갖는 FC180 가족, F는 GJB1의 c.286G > C 변이를 갖는 FC725 가족, 및 G는 SPTLC2의 c.435G > T 변이를 갖는 FC459 가족의 가계도이다. 여기서, 흰 표지는 질환의 영향을 받지 않은 개체이며, 검정 표지는 질환의 영향을 받은 개체, 회색 표지는 이용가능한 임상 정보가 없는 개체를 의미한다. 변이의 유전형은 개체의 아래에 표시하였다 (변이 대립인자 : 굵은 글씨의 밑줄).
도 2는 신규한 병인성 변이의 시퀀싱 크로마토그램 (chromatogram) 및 서열 보존 여부를 분석한 결과이다. A는 생거 시퀀싱 방법을 사용하여, 변이 위치에서의 서열 및 병인성 변이 여부를 확인한 결과이다. B는 일부 척추동물 종에서의 변이 위치 및 주변 영역의 아미노산 서열을 배열하여, 서열 보존 여부를 확인한 결과이다. 상기 척추동물 종은 인간 (Homo sapiens), 소 (Bos taurus), 래트 (Rattus norvegicus), 쥐 (Mus musculus), 닭 (Gallus gallus), 아프리카발톱개구리 (Xenopus laevis), 및 제브라피시 (Danio rerio)이다. 아미노산 서열은 NCBI로부터 얻었으며, 단백질 서열의 보존 분석은 MEGA6, version 6.0 (http://www.megasoftware.net/)을 사용하여 수행하였다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 환자군과 정상군에서 SNP 위치의 대립인자 분석을 통한 유전성 말초 신경질환과 연관된 SNP 마커의 선별
본 실시예에서는 유전성 말초 신경질환 환자와 정상인의 게놈에 있어서, SNP 위치의 대립인자를 분석하고, 그 결과로부터 유전성 말초 신경질환과 연관된 SNP 마커를 선발하였다.
(1) 실험 대상 선정
한국 사람 가운데, 유전성 말초 신경질환 (inherited peripheral neuropathy : IPN)의 가족력을 가지는 78 가족에서, 총 135명 (질환의 영향을 받은 89명 및 질환의 영향을 받지 않은 46명)을 선별하였다. 상기 유전성 말초 신경질환은 CMT1, CMT2, IntCMT, dHMN 및 HSAN의 다양한 서브 타입을 포함한다. 상기 유전성 말초 신경질환 환자를 포함하는 78 가족 중에, 17p12 (PMP22) 중복 (duplication)을 갖는 것으로 진단된 15의 CMT1A (MIM 118220) 환자를 포함하는 가족을 포함시켰다. 또한, 300명의 건강한 한국 사람을 대조군으로 본 연구에 포함시켰다. 본 연구에 모든 참가자는 성균관 대학교, 삼성 서울 병원에 임상 시험 심의위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 서면으로 동의하였다 (#SMC2013-10-066). 하기 표 1은 표적 시퀀싱과 관련된 유전성 말초 신경질환 환자를 포함하는 가족 및 개체의 수를 나타낸 것이다.
타입 가족의 수 개체의 수 유전적으로 질환으로 진단된 가족
질환의 영향을 받음 질환의 영향을
받지 않음		 총 수
CMT1 16 17 6 23 1
CMT2 30 32 23 55 4
CMT4 1 1 3 4 1
CMTX 12 19 8 27 9
dHMN 2 2 1 3 1
HSAN 2 3 0 3 1
CMT1A 15 15 5 20 -
총 수 78 89 46 135 17
CMT1 : 상염색체 우성 탈수초화 (autosomal dominant demyelination)를 갖는 샤르코-마리-투스 제1형
CMT2 : 축삭 결손을 갖는 CMT 제2형
CMT4 : 상염색체 우성 탈수초화를 갖는 CMT 제4형
dHMN : 원위부 유전성 운동 신경질환 (distal hereditary motor neuropathy)
HSAN : 유전성 감각 자율신경질환 (hereditary sensory autonomous neuropathy)
CMT1A : 17p12 중복을 갖는 CMT 제1형
(2) 임상 평가
임상 정보는, 운동 및 감각 장애, 심부 힘줄 반사 (deep tendon reflexes), 근위축 (muscle atrophy)을 포함한다. 질환이 발병된 연령은 말단 근육 약화, 발 기형, 또는 감각 변화 등의 증상이 처음 나타난 연령으로 결정하였다. 신체 장애는 기능 장애 척도 (functional disability scale : FDS) 및 CMT 신경 병증 수치 (CMT neuropathy score : CMTNS)로 측정하였다. 운동 및 감각 전도 속도를 포함한 신경 전도는 정중 (median), 척골 (ulnar), 비골 (peroneal), 경골 (tibial) 및 비복 (sural) 신경에서 측정하였다.
(3) DNA 정제 및 17p12 중복의 전 스크리닝 (prescreening)
(1)의 개체로부터 수득된 게놈 DNA (genomic DNA)를 QIAamp 혈액 DNA 정제 키트 (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제하였다. 환자 가족 시료에서 17p12 (PMP22) 중복 여부를 헥사플렉스 미세위성 (hexapelx microsatellite) 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction : PCR)을 이용하여 스크리닝하였다 (Choi et al.,2007).
(4) 유전자 패널의 설계 및 제작
문헌과 데이터베이스를 토대로 73종의 표적 유전자를 선별하였다. 총 1669 영역을 6298개의 프로브를 이용하여 99.5%의 커버리지로 판독하였다. 상기 프로브는 Suredesign 웹사이트 (https://earray.chem.agilent.com/suredesign)를 통해서 설계하였다. DNA 시료는 SureSelect DNA 시료 제조 시스템 (Agilent Technologies, USA)을 사용하여 제작하였다. 제작된 라이브러리를 마크로젠 (Macrogen, Inc. Korea)을 통하여 품질 관리 (Quality control)하고 정량하였다.
(5) 시퀀싱 및 원인 변이의 판별 방법
HiSeq 2000 게놈 분석기 (Illumina, USA)를 사용하여 상기 라이브러리의 시퀀싱을 수행하였다. 이 때, UCSC assembly hg19 (GRCh37)를 참조 게놈 (http://genome.ucsc.edu)으로 사용하였다. 기능적으로 중요한 변이, 즉 미스센스 (missense), 넌센스 (nonsense), 엑손의 삽입-결실 (exonic insertion/deletion : indel) 및 스플라이싱 (splicing) 위치 변이를 선별하였다. 그 후, dbSNP144 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), 1000 게놈 프로젝트 (1000 Genomes Project : 1000G) (http://www.1000genomes.org/), 엑솜 변이 프로젝트 (Exome Variant Project : ESP) (http://evs.gs.washington.edu/EVS/), 및 엑솜 집합 컨소시엄 (Exome Aggregation Consortium : ExAC) (http://exac.broadinstitute.org/)과 같은, 이용 가능한 인간 게놈 변이 데이터베이스를 검색 및 참고하여, 신규한 변이 (novel variant) 또는 드물게 발생하는 변이 (uncommon variant), 예를 들면 소수 대립인자 빈도 (minor allele frequency : MAF)가 0.01 이하인 변이를 추가로 선별하였다. 생거 시퀀싱 방법으로 유전적 분석기 ABI3130XL (Life Technologies, USA)를 이용하고, 가족 구성 개체를 확장하여, 변이 후보들의 염기 서열을 확인하였다. 최종적으로 선별된 병인성 또는 병인 가능성이 있는 변이에 대하여, 게놈 진화 속도 프로파일링 (the genomic evolutionary rate profiling : GERP) 수치를 GERP++ 프로그램 (http://mendel.stanford. edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)을 이용하여 측정하였다. 단백질 변이체의 인실리코 (in silico) 분석을 예측 알고리즘, SIFT (http://sift.jcvi.org), MUpro (http://www.ics.uci.edu/~baldig/mutation), 및 PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/를 이용하여 수행하였다.
(6) 병인성 또는 병인 가능성이 있는 변이 판별
유전자 패널은 276kb의 표적 크기를 가지는 하나의 대조군 유전자 및 73종의 유전성 말초 신경질환과 관련된 유전자를 포함한다. 74 종의 유전자 검사를 수행하였다. 그 결과, 평균 리드 뎁스 (mean read depth)는 194.8X이고, 10X 이상의 리드 뎁스를 가지는 표적 커버리지는 약 98.9%이었다. SNP 및 indel을 포함하는 총 SNV의 수는, 325개 (FC290-1 가족) 내지 434개 (FC678-4 가족)로, TEKT3를 제외한 73 종의 표적 유전자에서 평균 377개이었다. 73종의 유전자 중, 25개 (FC182-1 가족) 내지 45개 (FC693-1 가족)로부터, 기능적으로 유의한 SNV를 확인하였다. 상기 유의한 SNV를 각각의 가족 내에서 동일 분리 분석 (co-segregation analysis) 및 글로벌 인간 게놈 변이 데이터베이스 (global human genome variant databases, dbSNP144, 1000G, ESP, 및 ExAC)를 통해 필터링하여 추가 선별하였다.
(7) 병인성 변이의 규명
후보 변이를 추가 선별한 후, 17 가족에서 15개의 병인성 (pathogenic) 또는 병인가능성 (likely pathogenic)이 있는 변이를 확인하였다. 그 결과, X-linked CMTX1 (MIM 302800) 환자가 포함된 9 가족에서 6개의 GJB1 (MIM 304040) 변이, CMT2I (MIM 607677) 환자에서 2개의 MPZ (MIM 159440) 변이, CMT4C (MIM 601596) 환자가 포함된 가족에서 SH3TC2 (MIM 608206)의 한쌍의 복합 이형접합체 (a pair of compound heterozygote) 변이, CMT1E (MIM 118300) 환자에서 PMP22 (MIM 601097) 변이, CMT2U (MIM 616280) 환자에서 MARS (MIM156560) 변이, CMT2A (MIM 609260) 환자에서 MFN2 (MIM 608507) 변이, HSAN1C (MIM 613640) 환자에서 SPTLC2 (MIM 605713) 변이, dHMN7B (MIM 607641) 환자에서 DCTN1 (MIM 601143) 변이를 확인하였다. SH3TC2의 한쌍의 복합 이형접합체 변이를 갖는 CMT4C 환자를 포함하는 가족 (FC703 가족)을 제외하고, 대부분의 가족은 신경질환의 표현형에 있어서 우성 유전 (dominant inheritance)을 보였다.
그 중 8개의 변이는 신규한 병인성 변이로서, 상기 신규한 변이를 각 가족에서 질환의 영향을 받은 환자(들)로 동일 분리 분석하였다. 도 1은 병인성 또는 병인가능성 변이를 가지는 유전성 말초 신경질환 환자를 포함하는 가족의 가계도를 나타낸다. 상기 변이 위치에서의 염기를 생거 시퀀싱 방법으로 확인하였고, 그 결과 300개의 대조군 시료에서는 변이가 일어나지 않았다. 또한, 상기 변이는 dbSNP144, 1000G, ESP 및 ExAC와 같은 인간 게놈 데이터베이스에서 보고된 바 없는 신규한 변이임을 확인하였다. 유전자 패널 시퀀싱으로부터 병인성 또는 병인가능성이 있는 변이를 판별하여 하기 표 2에 나타내었다.
타입 유전자 변이 가족 유전 발병
(나이)		 중증 정도
뉴클레오티드
(nt)		 아미노산
(AA)		 CMTNS FDS
CMT1E PMP22 c.47T > G p.L16R* FC541 AD 드 노보 (de novo) 1 24 6
CMT4C SH3TC2 c.929G > A+
c.3272G > T		 p.G310E*+
p.G1091V*		 FC703 AR 5 15 3
CMT2A MFN2 c.839G > A p.R280H FC527 AD 45 10 3
CMT2I MPZ c.154T > G
c.262T > C		 p.F52V*
p.Y88H*		 FC156
FC141		 AD
AD 드 노보		 25
20		 16
17		 3
3
CMT2U MARS c.2398C > A p.P800T FC495 AD 5 5 1
CMTX1 GJB1 c.20A > G
c.43C > T
c.283G > A


c.286G > C
c.490C > T
c.491G > A
 p.Y7C
p.R15W
p.V95M


p.A96P*
p.R164W
p.R164Q
 FC718
FC751
FC565
FC687
FC698
FC725
FC714
FC254
FC722		 XD
XD
XD
XD
XD
XD
XD
XD
XD		 15
49
48
8
40
11
30
15
8		 12
5
9
4
11
12
15
11
20		 2
1
2
1
2
2
4
2
3
HSAN1C SPTLC2 c.435G > T p.R145S* FC459 AD 17 15 3
dHMN7B DCTN1 c.1019A > G p.E340G* FC180 AD 10 12 3
AD : 상염색체 우성 (autosomal dominant)
AR : 상염색체 열성 (autosomal recessive)
CMTNS : CMT 수치 (Charcot-Marie-Tooth disease neuropathy score)
FDS : 기능 장애 척도 (functional disability scale)
XD : X 염색체 연관 우성 (X-linked dominant)
aMutations with *: 병인 가능성 (likely pathogenic)
bCMTNS: 경등도 (mild): ≤10, 중등도 (moderate): 11-20, 및 중증 (severe): ≥21;
FDS: 0: 정상, 1: 정상이지만 경련과 피로도 있음, 2: 달리기 어려움, 3: 걷기 어려우나 다른 사람의 도움 없이 가능, 4: 지팡이 (cane)를 이용하여 걸음, 5: 목발 (crutches)을 이용하여 걸음, 6: 워커 (walker)를 이용하여 걸음, 및 7: 휠체어 의지, 및 8: 누워있음.
GJB1의 c.283G > A (p.V95M) 변이는 3 가족에서 나타났으며, 발병 나이는 8 내지 48세로 광범위하여, 유전형-표현형의 연관성이 낮을 것을 알 수 있다. MPZ의 변이는 가장 빈번한 타입의 탈수초성 (demyelinating) CMT1B를 나타내는 유전성 말초 신경질환과 연관되어 있다. 그러나, 두 경우에서 MPZ 변이는 축삭 결손 (axonal defect)이 덜 빈번한 CMT2I를 나타내었다. MFN2의 p.R280H 변이는 간헐적으로 불완전한 침투 (incomplete penetrance)을 보여왔다 (Choi et al., 2015). 그러나, 본 연구에서는 FC527 가족 내에서 완전한 침투를 보였다.
드 노보 (de novo) 변이로, PMP22의 p.L16R 변이는 FC541 가족에서 나타났으며, MPZ의 p.Y88H 변이는 FC141 가족에서 나타났다. 하기 표 3은 신규한 병인성 변이의 특징을 나타낸 것이다. rs 번호는 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, national center [0040] for biotechnology information) 진뱅크 (GENEBANK)에 등록된 SNP의 번호이다. 통상의 기술자라면, rs 번호를 참조하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있다.
유전자 변이 인간 게놈 데이터베이스 GERP 인실리코 분석
dbSNP144 1000G ESP ExAC SIFT PP2 MUpro
PMP22 p.L16R - - - - 3.36 0.00* 0.760* -0.375*
SH3TC2 p.G310E rs763949764 - - < 0.001 4.88 0.00* 1.000* -0.288*
p.G1091V rs761592620 - - < 0.001 5.76 0.00* 1.000* -1.000*
MPZ p.F52V - - - - 5.29 0.00* 1.000* -0.542*
p.Y88H - - - - 4.70 0.00* 0.997* 0.034
GJB1 p.A96P - - - - 4.67 0.00* 1.000* -0.694*
SPTLC2 p.R145S rs749262868 - - < 0.001 5.23 0.01* 0.004 -1.000*
DCTN1 p.E340G - - - - 4.32 0.00* 1.000* -0.917*
인간 게놈 데이터 베이스: 진뱅크 등록 번호 (dbSNP144), 1000 게놈 프로젝트에서 변이 대립인자 (1000G: Nov, 2014), 엑솜 시퀀싱 프로젝트 (ESP: Nov, 2014), 및 엑솜 집합 컨소시엄 (ExAC: ver. 0.3)
GERP : 게놈 진화 속도 프로파일링 수치
인 실리코 분석 : SIFT (http://sift.jcvi.org), PP2 (PolyPhen2: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), 및 MUpro (http://www.ics.uci.edu/~baldig/mutation) 프로그램
* 은 병인성이 예측되는 것을 표시함
(8) 변이 위치에서 보존적 영역 분석
상기 변이 위치의 서열이 종간에 보존되어 있는지 확인하였다.
도 2는 신규 병인성 변이의 시퀀싱 크로마토그램 및 서열 보존 여부를 분석한 결과이다. 생거 시퀀싱 방법을 사용하여, 변이 위치에서의 염기 서열을 확인하고, 참조 서열과 대조하여 염기가 치환되어 있음을 확인하였다. 또한, 척추동물 각각에서 변이 위치 및 주변 영역의 아미노산 서열을 배열하여, 척추동물 간에 서열이 보존되는지 여부를 확인하였다. 상기 척추동물 종은 인간 (Homo sapiens), 소 (Bos taurus), 래트 (Rattus norvegicus), 쥐 (Mus musculus), 닭 (Gallus gallus), 아프리카발톱개구리 (Xenopus laevis), 및 제브라피시 (Danio rerio)이다. 아미노산 서열은 NCBI로부터 얻었으며, 각 서열의 Accession number는 다음과 같다. PMP22에 대하여, 인간: NP_000295.1, 소: NP_001094626.1, 래트: NP_058733.1, 쥐: NP_032911.1, 닭: NP_001264000.1, 아프리카발톱개구리: NP_001087002.1로 등록된 유전자를 이용하였다. SPTLC2에 대하여, 인간: NP_004554.1, 소: NP_001092551.1, 래트: NP_001032174.1, 쥐: NP_035609.1, 닭: NP_001006483.1, 아프리카발톱개구리: NP_001085763.1로 등록된 유전자를 이용하였다. DCTN1에 대하여, 인간: NM_004082.4, 쥐: NP_001185796.1, 소: NP_001092404.1, 닭: NP_001026538.1, 아프리카발톱개구리: XP_002936330.2로 등록된 유전자를 이용하였다. SH3TC2에 대하여, 인간: NP_078853.1, 소: XP_015327805.1, Rattus norvegicus: XP_006254880.1, 쥐: NP_766216.2, 제브라피시: XP_005173352.1로 등록된 유전자를 이용하였다. MPZ에 대하여, 인간: NP_000521.2, 소: NP_001072975.1, 래트: NP_001300997.1, 쥐: NP_001302428.1, 제브라피시: NP_919342.1로 등록된 유전자를 이용하였다.
아미노산 서열의 보존 분석은 MEGA6, version 6.0(http://www.megasoftware.net/)을 사용하여 수행하였다. 상기 변이 위치는 척추동물의 종 사이에 높은 수준으로 보존된 영역에 위치하고 있음을 알 수 있다. GERP 수치는 대부분의 변이 위치에서 3.36 내지 5.76로 높았다.
(9) 염색체 17p12 영역의 중복 판별
유전자 패널이 17p12 영역에서 1.4Mb의 중복을 검출하는데 효율적인지 확인하였다.
15명의 CMT1A 중복를 가지는 환자로부터 시료를 수득하였다. 중복 영역 (17p12)에 위치하는 PMP22 및 TEKT3 유전자의 리드 뎁스를 각각 표적 시퀀싱 데이터의 총 표적의 평균 리드 뎁스와 비교하였다. CMT1A 환자로부터 수득된 리드 뎁스와 중복이 없는 5개의 대조군으로부터 수득된 리드 뎁스와 비교한 결과, CMT1A 환자는 PMP22에 대하여 1.496 ± 0.098 및 TEKT3에 대하여 1.472 ± 0.119를 나타내어, PMP22 및 TEKT3 유전자에서 유의하게 높은 리드 뎁스를 나타내었다. 이러한 수치는 이론적 수치의 약 1.5배에 근접하여, 상기 유전자 패널은 CMT1A 환자의 1.4 Mb 중복을 검출하는데 충분한 것으로 판단된다.
표 4는 17p12 영역에 대하여 카피 넘버 변이 (copy number variation : CNV, 이하 CNV라고 함)를 판별한 결과이다. 표 4에서, 리드 뎁스 비는 각각 PMP22 및 TEKT3 유전자에서 대조군 시료 (n=5)의 평균 리드 뎁스와 비교하여 결정하였다. 대조군은 1.000으로 표시하였다.
시료 리드 뎁스 비 평균
PMP22 TEKT3
대조군 (n=6) 1.000 ± 0.060 1.000 ± 0.082 1.000 ± 0.069
FC425-1 1.081 1.046 1.064 ± 0.025
FC453-1 0.989 0.962 0.976 ± 0.019
FC565-1 1.064 1.079 1.072 ± 0.011
FC703-1 0.872 0.935 0.904 ± 0.045
FC707-1 0.993 0.977 0.985 ± 0.011
CMT1A 환자 (n = 15) 1.496 ± 0.098 1.472 ± 0.119 1.484 ± 0.105
FC045-12 1.435 1.440 1.438 ± 0.003
FC144-1 1.468 1.439 1.453 ± 0.020
FC168-1 1.615 1.630 1.623 ± 0.010
FC175-1 1.468 1.459 1.463 ± 0.006
FC179-1 1.518 1.568 1.543 ± 0.035
FC214-3 1.678 1.705 1.692 ± 0.018
FC215-2 1.395 1.381 1.388 ± 0.009
FC226-1 1.548 1.528 1.538 ± 0.014
FC287-1 1.578 1.418 1.498 ± 0.113
FC339-1 1.623 1.649 1.636 ± 0.018
FC498-1 1.328 1.303 1.315 ± 0.017
FC511-1 1.414 1.348 1.381 ± 0.047
FC512-1 1.414 1.422 1.418 ± 0.005
FC561-1 1.504 1.436 1.470 ± 0.048
FC589-1 1.449 1.356 1.402 ± 0.065
(10) 유전성 말초 신경질환 환자의 임상적 특징 분석
가족 내에서 발단자 (proband)의 질환 발병 나이는 약 1 내지 49세이었다. PMP22, SH3TC2 및 MARS의 변이를 가지는 환자들에서 질환 발병 나이는 5세 미만이었다. PMP22를 가진 FC541 가족에서만 FDS (수치 6 또는 7)가 높았으며, 다른 환자들에서는 FDS (3 이하)가 상대적으로 낮은, 경등도 또는 중등도의 증상을 보였다. 상기 표적 유전자 패널을 통하여, 매우 드문 SPTLC2, DCTN1, 및 MARS의 변이를 확인하였다.
SPTLC2의 p.R145S 변이를 여성 HSAN1C 환자 (FC395 가족)에서 규명하였다. 상기 환자는 20대에 HSAN1C가 발병하였고, 진행성 감각 이상 (progressive sensory impairment)을 보였으며, 궤양이 발생하여 절단 수술을 하였다. 상기 환자는 감각 손실이 원위부에 장갑과 양말 (glove 및 stocking) 분포로 발생하였으며, 진동 (vibration) 지각에 비하여 바늘 지각 (pinprick perception)에 더 크게 영향을 받았다. 상기 환자는 양 손에 고통스러운 따끔거리는 통각을 보였다. 궤양 및 사고로 얻은 화상을 포함하여, 감각 합병증이 발생하였다.
DCTN1의 p.E340G 변이를 12세의 남성 (FC180 가족)에서 규명하였다. 상기 변이는 dHMN7B를 유발하였다. 상기 환자는 10세에 걸음걸이의 어려움을 겪고, 손 근육이 약화되었다. 또한 상기 환자는 대화시에 혼흡 곤란을 겪었으며, 상부 및 하부 사지에서의 말단이 약화되었다. 환자의 손에서, 손바닥 (thenar) 근육 및 손등쪽뼈사이 (dorsal interosseous) 근육의 약화, 및 근위축증이 나타났다. 그러나 소지구 (hypothenar) 근육의 용량 (bulk) 및 강도 (strength)는 비교적 보존 및 유지되었다. 상기 환자의 신경 정도 (nerve conduction) 및 근전도 (electromyogram) 결과는 순 운동 신경질환 (pure motor neuropathy)에서와 일치하였다.
MARS의 p.P800T 변이를 CMT2U 환자를 포함하는 가족 (FC495 가족)에서 규명하였다. 상기 질환은 50 내지 60세에 발병하는 것으로 보고된 바 있다. 그러나 상기 환자는 보고된 바에 비하여 상대적으로 적은 연령인 5 내지 16세에 발병이 진행되었다. 이러한 결과는 CMT2U 질환의 발병 연령이 다양해진 것을 의미한다.
<110> Samsung Life Public Welfare Foundation KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Marker for diagnosing inherited peripheral neuropathies and use thereof <130> PN115853 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 483 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgctcctcc tgttgctgag tatcatcgtc ctccacgtcg cggtgctggt gctgctgttc 60 gtctccacga tcgtcagcca atggatcgtg ggcaatggac acgcaactga tctctggcag 120 aactgtagca cctcttcctc aggaaatgtc caccactgtt tctcatcatc accaaacgaa 180 tggctgcagt ctgtccaggc caccatgatc ctgtcgatca tcttcagcat tctgtctctg 240 ttcctgttct tctgccaact cttcaccctc accaaggggg gcaggtttta catcactgga 300 atcttccaaa ttcttgctgg tctgtgcgtg atgagtgctg cggccatcta cacggtgagg 360 cacccggagt ggcatctcaa ctcggattac tcctacggtt tcgcctacat cctggcctgg 420 gtggccttcc ccctggccct tctcagcggt gtcatctatg tgatcttgcg gaaacgcgaa 480 tga 483 <210> 2 <211> 3867 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgggtggct gcttctgcat ccccagggag cggagtctga cccggggccc aggtaaagaa 60 actccttcca 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gttcattgga aagtcgacaa gttcaggaca agtgggcttt 960 gtccccacca ggaacataga tcctgattct tattccccaa tgagcaggaa ctctgccttt 1020 ctcagtgatg aggagagatg ctccctgttg gccctgggaa gtgataagca gactgagtgt 1080 tccagcttcc tccacactct tgctcgcact gacatcacat ctgtctaccg gctcagtggg 1140 tttgaatcca tccagaatcc tccaaatgat ctgagtgcat cccagcctga aggtttcaag 1200 gaggtcaggc ctggcagagc ctgggaggag catcaggccg tggggtccag acagtccagc 1260 agctctgagg actccagcct ggaggaggag ctcctctcgg ccacctcaga cagctatcgc 1320 ctgccggagc ctgatgacct tgatgacccg gaactgctca tggacctaag cactggtcag 1380 gaggaggagg ctgagaactt cgcccccata ttggcttttc tggatcatga gggttatgct 1440 gaccacttta agagtctcta tgacttctcc ttctctttcc tcacttcttc cttttatagc 1500 ttctctgagg aggatgagtt tgtggcctac ctggaggcat caagaaagtg ggccaagaag 1560 agccacatga cctgggccca tgcccgtctc tgcttcctcc tgggccggct gagcatcagg 1620 aaggtcaaac tctctcaggc cagggtgtac ttcgaggagg ccatccacat tctcaatgga 1680 gcatttgagg acctatcctt ggtggccact ctgtacatca atttggctgc catctacctg 1740 aaacagaggc tgagacataa 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ccagggtgga catcatggag agacagtctc atgattataa ctggtccttc 480 aagtatacag ggaatataat aaagggtgtt ataaacatgg gttcctacaa ctatcttgga 540 tttgcacgga atactggatc atgtcaagaa gcagccgcca aagtccttga ggagtatgga 600 gctggagtgt gcagtactcg gcaggaaatt ggaaacctgg acaagcatga agaactagag 660 gagcttgtag caaggttctt aggagtagaa gctgctatgg cgtatggcat gggatttgca 720 acgaattcaa tgaacattcc tgctcttgtt ggcaaaggtt gcctgattct gagtgatgaa 780 ctgaatcatg catcactggt tctgggagcc agactgtcag gagcaaccat tagaatcttc 840 aaacacaaca atatgcaaag cctagagaag ctattgaaag atgccattgt ttatggtcag 900 cctcggacac gaaggccctg gaagaaaatt ctcatccttg tggaaggaat atatagcatg 960 gagggatcta ttgttcgtct tcctgaagtg attgccctca agaagaaata caaggcatac 1020 ttgtatctgg atgaggctca cagcattggc gccctgggcc ccacaggccg gggtgtggtg 1080 gagtactttg gcctggatcc cgaggatgtg gatgttatga tgggaacgtt cacaaagagt 1140 tttggtgctt ctggaggata tattggaggc aagaaggagc tgatagacta cctgcgaaca 1200 cattctcata gtgcagtgta tgccacgtca ttgtcacctc ctgtagtgga gcagatcatc 1260 acctccatga agtgcatcat ggggcaggat ggcaccagcc ttggtaaaga gtgtgtacaa 1320 cagttagctg aaaacaccag gtatttcagg agacgcctga aagagatggg cttcatcatc 1380 tatggaaatg aagactctcc agtagtgcct ttgatgctct acatgcctgc caaaattggc 1440 gcctttggac gggagatgct gaagcggaac atcggtgtcg ttgtggttgg atttcctgcc 1500 accccaatta ttgagtccag agccaggttt tgcctgtcag cagctcatac caaagaaata 1560 cttgatactg ctttaaagga gatagatgaa gttggggacc tattgcagct gaagtattcc 1620 cgtcatcggt tggtacctct actggacagg ccctttgacg agacgacgta tgaagaaaca 1680 gaagactga 1689 <210> 5 <211> 3837 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggcacaga gcaagaggca cgtgtacagc cggacgccca gcggcagcag gatgagtgcg 60 gaggcaagcg cccggcctct gcgggtgggc tcccgtgtag aggtgattgg aaaaggccac 120 cgaggcactg tggcctatgt tggagccaca ctgtttgcca ctggcaaatg ggtaggcgtg 180 attctggatg aagcaaaggg caaaaatgat ggaactgttc aaggcaggaa gtacttcact 240 tgtgatgaag ggcatggcat ctttgtgcgc cagtcccaga tccaggtatt tgaagatgga 300 gcagatacta cttccccaga gacacctgat tcttctgctt caaaagtcct caaaagagag 360 ggaactgata caactgcaaa gactagcaaa 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aggagctaag ccaggcagag 1260 agcaccattg atgagctcaa ggagcaggtg gatgctgctc tgggtgctga ggagatggtg 1320 gagatgctga cagatcggaa cctgaatctg gaagagaaag tgcgcgagtt gagggagact 1380 gtgggagact tggaagcgat gaatgagatg aacgatgagc tgcaggagaa tgcacgtgag 1440 acagaactgg agctgcggga gcagctggac atggcaggcg cgcgggttcg tgaggcccag 1500 aagcgtgtgg aggcagccca ggagacggtt gcagactacc agcagaccat caagaagtac 1560 cgccagctga ccgcccatct acaggatgtg aatcgggaac tgacaaacca gcaggaagca 1620 tctgtggaga ggcaacagca gccacctcca gagacctttg acttcaaaat caagtttgct 1680 gagactaagg cccatgccaa ggcaattgag atggaattga ggcagatgga ggtggcccag 1740 gccaatcgac acatgtccct gctgacagcc ttcatgcctg acagcttcct tcggccaggt 1800 ggggaccatg actgcgttct ggtgctgttg ctcatgcctc gtctcatttg caaggcagag 1860 ctgatccgga agcaggccca ggagaagttt gaactaagtg agaactgttc agagcggcct 1920 gggctgcgag gagctgctgg ggagcaactc agctttgctg ctggactggt gtactcgctg 1980 agcctgctgc aggccacgct acaccgctat gagcatgccc tctctcagtg cagtgtggat 2040 gtgtataaga aagtgggcag cctgtaccct gagatgagtg 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1000 1005 Glu Lys Glu Phe Glu Glu Thr Met Asp Ala Leu Gln Ala Asp Ile Asp 1010 1015 1020 Gln Leu Glu Ala Glu Lys Ala Glu Leu Lys Gln Arg Leu Asn Ser Gln 1025 1030 1035 1040 Ser Lys Arg Thr Ile Glu Gly Leu Arg Gly Pro Pro Pro Ser Gly Ile 1045 1050 1055 Ala Thr Leu Val Ser Gly Ile Ala Gly Glu Glu Gln Gln Arg Gly Ala 1060 1065 1070 Ile Pro Gly Gln Ala Pro Gly Ser Val Pro Gly Pro Gly Leu Val Lys 1075 1080 1085 Asp Ser Pro Leu Leu Leu Gln Gln Ile Ser Ala Met Arg Leu His Ile 1090 1095 1100 Ser Gln Leu Gln His Glu Asn Ser Ile Leu Lys Gly Ala Gln Met Lys 1105 1110 1115 1120 Ala Ser Leu Ala Ser Leu Pro Pro Leu His Val Ala Lys Leu Ser His 1125 1130 1135 Glu Gly Pro Gly Ser Glu Leu Pro Ala Gly Ala Leu Tyr Arg Lys Thr 1140 1145 1150 Ser Gln Leu Leu Glu Thr Leu Asn Gln Leu Ser Thr His Thr His Val 1155 1160 1165 Val Asp Ile Thr Arg Thr Ser Pro Ala Ala Lys Ser Pro Ser Ala Gln 1170 1175 1180 Leu Met Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Ser Leu Ser Asp Thr Val Glu 1185 1190 1195 1200 Lys Leu Lys Asp Glu Val Leu Lys Glu Thr Val Ser Gln Arg Pro Gly 1205 1210 1215 Ala Thr Val Pro Thr Asp Phe Ala Thr Phe Pro Ser Ser Ala Phe Leu 1220 1225 1230 Arg Ala Lys Glu Glu Gln Gln Asp Asp Thr Val Tyr Met Gly Lys Val 1235 1240 1245 Thr Phe Ser Cys Ala Ala Gly Phe Gly Gln Arg His Arg Leu Val Leu 1250 1255 1260 Thr Gln Glu Gln Leu His Gln Leu His Ser Arg Leu Ile Ser 1265 1270 1275

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 47번째 뉴클레오티드가 G인 SNP 위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하기 위한 제제를 포함하는 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 929번째 뉴클레오티드가 A 및 3272번째 뉴클레오티드가 T, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 154번째 뉴클레오티드가 G, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 262번째 뉴클레오티드가 C, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 435번째 뉴클레오티드가 T, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 1019번째 뉴클레오티드가 G, 또는 이들의 조합인 SNP 위치를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출하기 위한 제제를 더 포함하는 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 특이적으로 검출하기 위한 제제는 길이가 10 내지 200 뉴클레오티드인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 특이적으로 검출하기 위한 제제는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 핵산인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 특이적으로 검출하기 위한 제제는 검출 가능한 표지로 표지된 것인 조성물.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2의 조성물을 포함하는 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 키트.
  7. 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 16번째 아미노산이 R인 아미노산 치환 위치를 포함하는 폴리펩티드를 특이적으로 검출하기 위한 제제를 포함하는 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 310번째 아미노산은 E 및 1091번째 아미노산은 V, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 52번째 아미노산은 V, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 88번째 아미노산은 H, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 145번째 아미노산은 S, 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 340번째 아미노산은 G, 또는 이들의 조합인 아미노산 치환 위치를 포함하는 폴리펩티드를 특이적으로 검출하기 위한 제제를 더 포함하는 것인 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 특이적으로 검출하기 위한 제제는 항체 또는 항원 결합 단편인 것인 조성물.
  10. 청구항 7 또는 청구항 8의 조성물을 포함하는 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 진단하기 위한 키트.
  11. 하기 단계를 포함하는 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 방법으로서,
    분리된 생물학적 시료에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 47번째 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계; 및
    상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 47번째 뉴클레오티드가 G인 경우 상기 개체를 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계;를 포함하는 것인 방법.
  12. 삭제
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 방법은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 929번째 및 3272번째, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 154번째, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 262번째, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 435번째, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 1019번째, 또는 이들의 조합인 위치의 뉴클레오티드를 결정하는 단계; 및
    상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 929번째 뉴클레오티드가 A 및 3272번째 뉴클레오티드가 T, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 154번째 뉴클레오티드가 G, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 262번째 뉴클레오티드가 C, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 435번째 뉴클레오티드가 T, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 5` 말단으로부터 1019번째 뉴클레오티드가 G인 경우 상기 개체를 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 하기 단계를 포함하는 개체의 유전성 말초 신경질환 발병 위험을 예측하기 위한 정보를 제공하기 위한 방법으로서,
    분리된 생물학적 시료에서 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 16번째 위치의 아미노산을 결정하는 단계; 및
    상기 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 16번째 아미노산이 R인 경우 상기 개체를 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계;를 포함하는 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 방법은 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 310번째 및 1091번째, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 52번째, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 88번째, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 145번째, 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 340번째, 또는 이들의 조합인 위치의 아미노산을 결정하는 단계; 및
    상기 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 310번째 아미노산이 E 및 1091번째 아미노산이 V, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 52번째 아미노산이 V, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 88번째 아미노산이 H, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 145번째 아미노산이 S, 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 N 말단으로부터 340번째 아미노산이 G인 경우 상기 개체를 유전성 말초 신경질환 발병의 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 결정하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
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