WO2006054666A1

WO2006054666A1 - ニワトリｌｉｆタンパク質およびその利用

Info

Publication number: WO2006054666A1
Application number: PCT/JP2005/021165
Authority: WO
Inventors: Haruo Matsuda; Shuichi Furusawa; Hiroyuki Horiuchi; Mari Ogawa
Original assignee: National University Of Corporation Hiroshima University; Hiroshima Industrial Promotion Organization
Priority date: 2004-11-19
Filing date: 2005-11-17
Publication date: 2006-05-26
Also published as: JP2008031043A

Abstract

　トランスジェニックニワトリを作出するために必須であるニワトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化阻害因子を供給するため、ニワトリＬＩＦタンパク質を安定に発現する細胞株を取得して、当該タンパク質を首尾よく単離および精製し、さらに当該タンパク質を大量生産する。

Description

明細書

ニヮトリ LIFタンパク質およびその利用

技術分野

[0001] 本発明は、 -ヮトリ LIFタンパク質を恒常的に得るための原核生物株または真核生物細胞株、ならびに当該細胞株によって産生される-ヮトリ LIFタンパク質およびその利用に関するものである。

背景技術

[0002] 近年、生物固有の遺伝子の機能解析は、特定の遺伝子が導入された動物、または特定の遺伝子がノックアウトされた動物を作出することによって、飛躍的に進歩した。このような動物、すなわち、トランスジニック動物は、医学生物学だけでなく広範な研究領域において使用されており、各領域における研究開発に大きな進歩をもたらしている。

[0003] ニヮトリは、有用な産業動物であり、（1)飼育コストが低い、（2)産子数が多い、（3) 卵生であるために胚操作が簡便である、などの理由によって、ゥシ、ブタ、ヒッジに代わるトランスジエニック動物の有力な候補として注目されている。トランスジエニック- ヮトリの作出が可能になれば、有用物質を生産するために、トランスジニック-ヮトリを動物工場として用いることができ、応用分野のさらなる広がりが期待できる。

[0004] トランスジニック動物の作出方法としては、受精卵に外来遺伝子を直接導入するトランスジニック法、および、胚性幹細胞 (ES細胞)を介する遺伝子導入法が挙げられる。 ES細胞は、ジーンターゲッティング法によってゲノムの特定の位置に目的の遺伝子を導入したり、ノックアウトすることができることから、現在広く応用されている細胞である。 ES細胞法は、内因性の遺伝子をターゲテイングするための強力なツールとして使用されており、 ES細胞法を用いて種々のテーゲティングマウスが作出されている。また、生殖系列によって高頻度に分ィ匕する胚性生殖細胞 (EG細胞)法は、 ES細胞法とともに有効な手段であると考えられている。

[0005] ES細胞を用いる場合、遺伝子操作中に細胞分ィ匕を抑制することが重要である。 E S細胞を培養する際、フィーダ一 (feeder)細胞を用いる力、または分ィ匕を抑制するための因子としての LIF (白血病阻止因子（Leukemia Inhibitory Factor) )を使用する必要がある。

[0006] 白血病阻害因子（LIF)は、 IL— 6ファミリーサイト力インの 1つである。 LIFは、マウス骨髄性白血病細胞株 M 1をマクロファージへと分化させる因子として同定された（例えば、非特許文献 1を参照のこと)。しかし、現在では、マウス ES細胞を未分化状態で維持するために必須のサイト力インであることが知られており（例えば、非特許文献 2を参照のこと）、マウス ES細胞培養の簡便化またはトランスジエニックマウスの作出において利用されている。また、 E. coli発現系を用いて作製されたマウスまたはヒト由来のリコンビナント LIFタンパク質が市販されている。

[0007] マウス以外では、メダカ、ゥサギ、ブタ、サルおよびヒトの ES細胞または EG細胞がこれまでに単離されている。しかし、導入遺伝子を首尾よく生殖系へ導入し得るのはマウスおよび-ヮトリだけである。また、 -ヮトリでは ES細胞または EG細胞を首尾よく培養することができず、細胞の安定な系が未だ確立されていない。これまで、マウス LIF リコンビナントタンパク質 (rmLIF)またはヒト LIFリコンビナントタンパク質 (rhLIF)を種々のサイト力インと組合わせて使用して-ヮトリの ES細胞または EG細胞の安定な細胞株を確立しようと試みられて、るが、未だ達成されて、な、。

[0008] 鳥類では、 LIFだけでなく他の IL— 6ファミリーサイト力インに関しても解析が進んでいない。 IL— 1、 IL— 2、 IL— 6、 IL— 8、 IL— 15、 IL— 16、 IL— 17および IL— 18の相同遺伝子が-ヮトリにお、て見出されて、るが、これらは哺乳動物におけるホモ口グとアミノ酸レベルで 20〜40%程度の相同性しか有さない。また、哺乳動物由来の I L—1および IL— 2は、その固有の効果を-ヮトリ細胞に対して発揮することができない (例えば、非特許文献 3および 4を参照のこと)。

[0009] -ヮトリ ES細胞の培養系を確立することを目的として、本発明者らは、 -ヮトリの LIF 遺伝子をクローユングし、原核生物宿主を用いて当該遺伝子がコードするタンパク質を組換え発現させた (例えば、特許文献 1および非特許文献 5を参照のこと)。

[0010] 具体的には、本発明者らは、 LPSで刺激した-ヮトリ単球系白血病細胞株 (IN24) を用いたサブトラクシヨン法によって、 -ヮトリ LIF遺伝子断片を得、この断片の塩基配列から RACE法によって完全長の-ヮトリ LIF遺伝子をクローユングした。 [0011] 配列決定した-ヮトリ LIF cDNAは 789bpであり、推定 211アミノ酸からなる LIFタンパク質をコードする。 -ヮトリ LIFは、マウス LIFおよびヒト LIFと比較した場合、ァミノ酸レベルでの相同性は 39〜43%とかなり低いものであった力 6箇所のシスティン残基の位置は完全に保存されていた。また、種々の-ヮトリ細胞および組織における mRNAの発現解析の結果、 -ヮトリ LIF遺伝子は、全ての細胞および組織において発現していた。

[0012] また、種々の-ヮトリ細胞および組織における-ヮトリ LIF遺伝子の発現を確認した。さらに大腸菌を用いて作製した-ヮトリ LIFリコンビナントタンパク質力 -ヮトリの ES 細胞または EG細胞の分ィ匕を抑制することを確認した。

〔特許文献 1〕

特開 2003— 9869公報（平成 15年 1月 14日公開）

〔非特許文献 1〕

Tomida, Mら、 Biol. Chem. 259, 10978— 10982 (1984)

〔非特許文献 2〕

Smith A.ら、 Nature, 336, 688-690 (1988)

〔非特許文献 3〕

Klasing, K. C.ら、 Dev. Comp. Immuno. 11, 385- 394 (1987) 〔非特許文献 4〕

Schauenstein, K.ら、 Dev. Comp. Immuno. 12, 823-831 (1988) 〔非特許文献 5〕

Horiuchiら、 J. Biol. Chem. 279 (23) , 24514— 24520 (2004)

これまでマウスおよび Zまたは-ヮトリの ES細胞の培養には、大腸菌発現系を用いた原核型 rmLIFが利用されて、る。原核型 rmLIFは比較的簡便に生産することができるので大量生産されているが、原核型 rchLIFは、大腸菌発現系では封入体 (ィンクルージョンボディー）を形成してしまうので、タンパク質の精製効率が非常に低ぐ大量生産することは非常に困難であった。すなわち、 -ヮトリ LIFタンパク質を巿場に供給するためには大量生産する必要があるが、大腸菌発現系ではそれが不可能でめつに。 [0013] また、大腸菌によって大量生産を行った場合、 LPSなどのエンドトキシンが混入する危険性が高いので、精製タンパク質の質に致命的な影響を与え、 -ヮトリ LIFタンノ^質を胚性幹細胞の培養液中に直接投与して作用させることができなくなる。そのため、大腸菌等の原核生物細胞を宿主細胞として産生させたタンパク質は、非常に厳密で高度な精製を必要とする。

[0014] さらに、原核生物細胞を用いて組換え発現させたタンパク質 (原核型のリコンビナントタンパク質）においては、翻訳後修飾が起こらない。また、原核型のタンパク質は、正確な立体構造をとらない場合が多い。そのため、翻訳後修飾を必要とする真核生物由来のタンパク質において、その生物活性が制限されていることが多い。また、二ヮトリ LIFタンパク質にお、て、サイト力インとしての活性発現には糖鎖が重要であると考えられる。

[0015] このように、ニヮトリの ES細胞または EG細胞の培養系を確立するためには、巿場に容易に供給することができる程度の rchLIFを得ること、および所望の生物活性を有する rchLIFを得ることが必要である。

[0016] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、正しい立体構造を取りかつ糖鎖付加型である真核型 rchLIFを安定して取得すること、さらに、真核型 rchLIFを用いて-ヮトリ ES細胞または EG細胞の細胞株を確立し、トランスジェ- ックニヮトリを作出することにある。

発明の開示

[0017] 本発明者らは、公知の大腸菌発現系において独自の創意工夫を重ねることによつて、真核型の-ヮトリ LIFリコンビナントタンパク質 (rchLIF)を取得することができ、よつて本発明を完成するに至った。

[0018] すなわち、本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分ィ匕を阻害するポリペプチドであって：

(a)配列番号 6に示されるアミノ酸配列；または

(b)配列番号 6に示されるアミノ酸配列において、 1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列

力なり、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。

[0019] 本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：

(a)配列番号 5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または

(b)配列番号 5に示される塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド

によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴としている。

[0020] 本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：

(b)配列番号 5に示される塩基配列と相補的な塩基配列力なるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド

[0021] 本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害するポリペプチドであって：

(b)配列番号 5に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも 80%同一である塩基配列力なるポリヌクレオチド

[0022] 本発明に係るポリペプチドは、糖鎖が付加されて、ることが好ま、。

[0023] 本発明に係るポリペプチドにお、て、上記糖鎖がハイマンノース型 N結合、バイセクティング GlcNAc、シアル酸、または j8結合ガラクトースであることが好ましい。

[0024] 本発明において、上記真核生物宿主が CHO— K7細胞または CHCC— OU2細胞であることが好ましい。

[0025] 本発明に係るベクターは、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。

[0026] 本発明に係る細胞は、上記のポリペプチドを安定して産生することを特徴としている

[0027] 本発明に係る馴化培地は、上記の細胞を培養することによって得られることを特徴としている。

[0028] 本発明に係るポリペプチド生産方法は、上記の細胞を用いることを特徴として、る。

[0029] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記のポリペプチドを含むことを特徴として、る。

[0030] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記の細胞を含むことを特徴として、る。

[0031] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物は、上記の馴化培地を含むことを特徴として、る。

[0032] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記のポリペプチドを備えることを特徴として、る。

[0033] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記の細胞を備えることを特徴として、る。

[0034] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キットは、上記の馴化培地を備えることを特徴として、る。

[0035] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記のポリペプチドを用いることを特徴として、る。

[0036] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記の細胞を用いることを特徴として、る。

[0037] 本発明に係る胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法は、上記の馴化培地を用いることを特徴として、る。

[0038] 本発明に係るトランスジエニック-ヮトリ作出キットは、上記のポリペプチドを備えることを特徴としている。

[0039] 本発明に係るトランスジエニック-ヮトリ作出キットは、上記の細胞を備えることを特徴としている。 [0040] 本発明に係るトランスジエニック-ヮトリ作出キットは、上記の馴化培地を備えることを特徴としている。

[0041] 本発明に係るトランスジエニック-ヮトリ作出方法は、上記のポリペプチドとともに- ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。

[0042] 本発明に係るトランスジエニック-ヮトリ作出方法は、上記の細胞とともに-ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。

[0043] 本発明に係るトランスジエニック-ヮトリ作出方法は、上記の馴化培地とともに-ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴としている。

[0044] 本発明に係る抗体は、上記のポリペプチドに特異的に結合することを特徴としている。

[0045] 本発明に係る抗体は、配列番号 11〜13のいずれか 1つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合することを特徴としている。

[0046] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

図面の簡単な説明

[0047] [図 1]図 1は、 -ヮトリ LIF遺伝子の塩基配列および-ヮトリ LIFタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。

[図 2(A)]図 2 (A)は、 LIFタンパク質のアミノ酸配列を、マウス、ヒトおよび-ヮトリ間で比較したアラインメントを示す図である。

[図 2(B)]図 2 (B)は、マウス、ヒトおよび-ヮトリ間での LIFタンパク質のアミノ酸配列の同一性を示す図である。

[図 3]図 3は、 E. coli発現系カゝら精製した rchLIFを電気泳動した後 CBB染色した S DS PAGEゲルを示す図である。

[図 4]図 4は、真核生物細胞用の発現構築物を示す図である。

[図 5]図 5は、真核生物細胞用のベクターに挿入したニヮトリ LIF遺伝子の塩基配列およびコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。

[図 6]図 6は、真核型 rchLIFを安定に発現する-ヮトリ CHCC— OU2細胞を示す写真である。

[図 7]図 7は、真核型 rchLIFを電気泳動した後銀染色した SDS— PAGEゲルを示す図である。

[図 8]図 8は、抗-ヮトリ LIF抗体を用いたィムノブロッテイング法により検出した真核型 rchLIFを示す写真である。

[図 9]図 9は、真核型 rchLIFを電気泳動した後レクチン染色した結果を示す写真である。

[図 10]図 10は、 -ヮトリ胚盤葉細胞の培養系に真核型 rchLIFを添加した際の、嚢胞性胚葉体の形成および細胞未分化状態の維持を示す写真である。

[図 11]図 11は、熱処理およびアルカリ処理を施した原核型 rchLIFまたは真核型 rch

LIFを電気泳動した後銀染色した SDS - PAGEゲルを示す図である。

[図 12]図 12は、ニヮトリ胚盤葉細胞の培養系に原核型 rchLIFまたは真核型 rchLIF を添加した際の、嚢胞性胚葉体の形成を示す写真である。

発明を実施するための最良の形態

[0048] 上述したように、本発明者らは、独自の創意工夫を重ねることによって、真核型の- ヮトリ LIFリコンビナントタンパク質 (rchLIF)を取得することができ、よって本発明を完成するに至った。

[0049] 以下、本発明に係るポリペプチド、およびその利用につ、て詳述する。

[0050] (1)ポリペプチド

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリべプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え的に生成されてもよい。

[0051] 用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

[0052] 本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、および真核生物宿主 (例えば、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む)から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシルイ匕され得る。さらに、本発明に係るポリぺプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチォ二ン残基を含み得る。

[0053] 1つの局面において、本発明は、 LIF活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「LIF活性」は、初期胚由来の細胞の未分化状態を維持する活性、特に、 ES細胞または EG細胞の分ィ匕を阻害する活性が意図される。本発明に係るポリペプチドは、特に、 -ヮトリの ES細胞または EG細胞の分ィ匕を阻害することが好ましい。マウスまたはヒト由来の LIFタンパク質は、 -ヮトリ胚由来の細胞に対して実用的な LIF活性を有さな、。

[0054] 一実施形態にお!、て、本発明に係るポリペプチドは、配列番号 6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好まし！/、。

[0055] 別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号 6に示されるァミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつ LIF活性を有するポリペプチドが好ましい。

[0056] 本明細書中で使用される場合、「配列番号 2に示されるアミノ酸配列力なるポリべプチド」は、配列番号 1に示される塩基配列の 75〜707位カもなるポリヌクレオチドによってコードされ、シグナル配列（配列番号 1に示される塩基配列の 75位〜 146位によってコードされる配列番号 2に示されるアミノ酸配列のアミノ酸 1〜24位）を含む。 LI F活性を有する成熟型のポリペプチドは、当該シグナル配列が切断された形態 (配列番号 6に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド)であるが、本明細書中で使用される場合、「配列番号 2に示されるアミノ酸配列力なるポリペプチド」に包含される。

[0057] このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換 (例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。

[0058] ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸力このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではぐ天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

[0059] 好ま、変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドの LIF活性を変化させない。

[0060] 代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸 Ala、 Val、 Leu,および lieの中での 1つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基 Serおよび Thrの交換、酸性残基 Aspおよび Gluの交換、アミド残基 Asnおよび Ginの間の置換、塩基性残基 Lysおよび Argの交換、ならびに芳香族残基 Phe、 Tyrの間の置換である。

[0061] 上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそう力 (すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、 Bowie, J. U.り「Deciphering the Message in Protein Se quences： Tolerance to Amino Acid SubstitutionsJ , Science 247 : 13 06 - 1310 (1990) (本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。

[0062] 当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において 1または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法 (変異誘発法）に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の LIF活性を有するか否かを容易に決定し得る。

[0063] 1つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、 LIF活性を有するポリべプチドであって、 (a)配列番号 6に示されるアミノ酸配列；または

力もなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなぐ天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。

[0064] 他の局面にぉ、て、本実施形態に係るポリペプチドは、 LIF活性を有するポリぺプチドであって、

によってコードされることが好まし!/、。

[0065] 別の局面にぉ、て、本実施形態に係るポリペプチドは、 LIF活性を有するポリぺプチドであって、

によってコードされることが好まし!/、。

[0066] ノヽイブリダィゼーシヨンは、 Sambrookら、 Molecular Cloning, A Laboratory

Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジエンシーは高くなり（ノヽイブリダィズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダィゼーシヨン温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸 6個をコードする 18塩基力もなる DNAフラグメントをプローブとして用いる場合、 50°C以下の温度が好ましい。

[0067] 本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件」は、ハイブリダィゼーシヨン溶液（50%ホルムアミド、 5 X SSC (150mMのNaCl、 1 5mMのクェン酸三ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7. 6)、 5 Xデンハート液、 10%硫酸デキストラン、および 20 /z gZmlの変性剪断サケ精子 DNAを含む）中にて 42°Cでー晚インキュベーションした後、約 65°Cにて 0. 1 X SSC中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダィズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約 15ヌクレオチド (nt)、そしてより好ましくは少なくとも約 20nt、さらにより好ましくは少なくとも約 30nt、そしてさらにより好ましくは約 30ntより長いポリヌクレオチドにハイブリダィズするポリヌクレオチド（ DNAまたは RNAのいずれ力）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダィズするポリヌクレオチド (オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。

[0068] さらに別の局面において、本実施形態に係るポリペプチドは、 LIF活性を有するポリペプチドであって、

(b)配列番号 5に示される塩基配列と相補的な塩基配列と少なくとも 80%同一、より好ましくは少なくとも 85%、 90%、 92%、 95%、 96%、 97%、 98%または 99% 同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド

によってコードされることが好まし!/、。

[0069] 例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（QUERY )塩基配列に少なくとも 95%同一の塩基配列力なるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の 100ヌクレオチチド (塩基）あたり 5つまでの不一致 (mismatch)を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも 95%同一の塩基配列力もなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の 5%まで力欠失され得る力または別の塩基で置換され得る力、あるいは参照配列における全塩基の 5%までの多くの塩基力参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の 5'または 3'末端位置または参照配列における塩基中で個々に力または参照配列内の 1以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。この参照配列は、本明細書中で記載されるように、配列番号 6に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、改変体、誘導体またはアナログであり得る。

[0070] 任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号 1に示される塩基配列に対して、少なくとも 80%、 85%、 90%、 92%、 95%、 96%、 97%、 98%、または 99%同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、 Bestfit program (Wisco nsm Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix (登商標) , Gen etics Computer Group, University Research Park, 575 Science Driv e, Madison, WI 53711)を使用して決定され得る。 Bestfitは、 Smithおよび Wat ermanの局所的相同性アルゴリズムを用いて、 2つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（Advances in Applied Mathematics 2 :482〜489 (1981) ) o Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、 95%同一である力否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の 5%までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。

[0071] 特定の実施形態では、参照 (QUERY)配列 (本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、 Brutlagらのアルゴリズム（Comp. App. Biosci. 6 : 237〜245 (1990) )に基づく FASTDBコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、 DNA配列の FASTDB整列において使用される好ましいパラメータ一は： Matrix = Unitary, k— tuple=4、 Mis match Penalty = 1 ^ Joining Penalty = d0^ Randomization Group Length =0、 Cutoff Score = 1, Gap Penalty = 5, Gap Size Penalty =0. 05, Win dow Size = 500または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、 5'または 3'欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく） QUERY配列よりも短い場合、 FASTDBプログラム力同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の 5 '短縮化および 3 '短縮化を考慮しな!ヽとヽぅ事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。 QUERY配列と比較して 5'末端または 3' 末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致 Z整列していない、対象配列の 5'および 3'である QUERY配列の塩基数を、 QUERY配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致 Z整列している力否かの決定は、 FASTDB配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記の FASTDBプログラムによつて計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコア力本実施形態の目的で使用されるものである。 QUERY配列と一致 Z整列してヽな、対象配列の 5 '塩基および 3，塩基の外側の塩基のみが、 FASTDB整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、 90塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために 100塩基の QUERY配列と整列される。その欠失は、対象配列の 5 '末端で生じ、従って FASTDB整列は、 5'末端の最初の 10塩基の一致 Z整列を示さない。 10個の不対合塩基は、配列の 10% (整合していない 5'末端および 3'末端での塩基の数 ZQUERY配列中の塩基の総数）を表し、そのため 10%が、 FASTDBプログラムによって計算される同一性パーセントのスコア力差し引かれる。残りの 90残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは 90%である。別の例において、 90残基の対象配列が、 100塩基の QUERY配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのため QUERY配列と整合 Z整列しない対象配列の 5' 末端または 3'末端の塩基は存在しない。この場合、 FASTDBによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、 QUERY配列と整合 Z整列しない対象配列の 5'末端および 3'末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。

[0072] さらなる実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、糖鎖が付加されていることが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドは、特定の糖鎖が付加されていることによって、物理ィ匕学的に安定でありかつ生物活性が高い。好ましい糖鎖としては、ハィマンノース型 N結合、バイセクティング GlcNAc、シアル酸、または β結合ガラクトースが挙げられる。

[0073] 特定の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、受託番号 [FERM BP

- 10199] (受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一、あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8 566)、受託日：平成 17年 1月 5日）によって示される細胞によって産生されることを特徴としている。本実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、上記細胞より分泌された成熟形態の rchLIFである。成熟形態 rchLIFは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号 6に示されるアミノ酸配列からなる（対応する cDNA配列は配列番号 5に示される塩基配列からなる）。本実施形態において、本発明に係るポリぺプチドは、受託番号 [FERM BP— 10199]によって示される細胞によって産生されることによって、常に一定条件で、均質なタンパク質として精製することができる。

[0074] 本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合して、るポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなぐポリペプチド以外の構造を含む複合ポリべプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができる力特に限定されない。

[0075] また、本発明に係るポリペプチドは、付カ卩的なポリペプチドを含むものであってもよい。付カ卩的なポリペプチドとしては、例えば、 His, Myc、 Flag等のェピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。

[0076] また、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織など力も単離精製されてもよい。

[0077] 他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドの N 末端または C末端に付加され得る。

[0078] 本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識 (タグ配列またはマーカー配列）に N 末端または C末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、へキサ一ヒスチジンペプチド（例えば、 pQEベクター（Qiagen, Inc. )において提供されるタグ)であり、他の中では、それらの多くは公的および Zまたは商業的に入手可能である。例えば、 Gentzら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 821 -824 (1989) (本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、へキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルェンザ赤血球凝集素 (HA)タンパク質由来のェピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、 Wilsonら、 Cell 37 : 767 (1984) (本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、 N または C末端にて Fcに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。

[0079] 別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されてもよい。

[0080] 組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。

[0081] 下記に詳細に記載するように、本発明に係るポリペプチドは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物、培養キットまたは培養方法にぉヽて有用である。

[0082] このように、本発明に係るポリペプチドは、 -ヮトリ胚細胞の未分化状態を維持することができるポリペプチドであって、少なくとも、配列番号 6に示されるアミノ酸配列からなるかまたはその活性を保持した変異体であればよいといえる。すなわち、上記ポリペプチドと特定の機能 (例えば、タグ)を有する任意のアミノ酸配列とが連結されたポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、上記ポリペプチドと特定の機能 (例えば、タグ)を有する任意のアミノ酸配列とは、それぞれの機能を阻害しな、ように適切なリンカ一ペプチドで連結されて、てもよ、。

[0083] つまり、本発明の目的は、 LIF活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される LIF活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

[0084] (2)ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド 1つの局面において、本発明は、 LIF活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デォキシリボヌクレオチド (A、 G、 Cおよび Tと省略される）の配列として示される。また、「配列番号 1に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号 1の各デォキシヌクレオチド A、 G、 Cおよび Zまたは Tによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。

[0085] 本発明に係るポリヌクレオチドは、 RNA (例えば、 mRNA)の形態、または DNAの形態（例えば、 cDNAまたはゲノム DNA)で存在し得る。 DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖 DNAまたは RNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得る力または、非コード鎖 (アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

[0086] また本発明に係るポリヌクレオチドは、その 5 '側または 3 '側で上述のタグ標識 (タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに融合され得る。

[0087] 本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個な V、し数十個（または数百個以上)結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）と、われ、長、ものは 30マーまたは 100マーと!/、うように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、合成されてもよい。

[0088] 本発明に係るオリゴヌクレオチドは、少なくとも 12nt (ヌクレオチド）、好ましくは約 15 nt、そしてより好ましくは少なくとも約 20nt、なおより好ましくは少なくとも約 30nt、そしてさらにより好ましくは少なくとも約 40ntの長さのフラグメントが意図される。少なくとも 20ntの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号 1に示される塩基配列からの 20以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号 1に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号 1に基づく DN Aフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）力 Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Li ncoln Center Dr. , Foster City, CA 94404) 392型シンセサイザーなどによつて合成される。

[0089] 別の局面において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体にハイブリダィズすることが好ましい。「変異体」は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の 1つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。

[0090] 別の局面において、本発明は、配列番号 1に示される塩基配列からなるポリヌクレォチドまたはその変異体のフラグメントまたはその相補配列力もなるオリゴヌクレオチドを提供する。

[0091] 本発明に係るオリゴヌクレオチド力活性を有するポリペプチドをコードしな、場合でさえ、当業者は、本発明に係るポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。本発明に係るポリペプチドをコードしな！、本発明に係るオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（l) cDNAライブラリ一中の vhd遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（2) vhd遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダィゼーシヨン（例えば、「FISH」）（Vermaら， Human Chromosomes : A Man ual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)に己載される）；および（3)特定の組織における vhdの mRNA発現を検出するためのノーザンブロット分析。

[0092] 本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、 2本鎖 DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖と、つた 1本鎖の DNAまたは RNA を包含する。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンス RNAメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンス RNA技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域 (U TR)の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであつてもよい。

[0093] 本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む DNA断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダィズするプローブを調製して、ゲノム DNAライブラリーまたは cDNAライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダィズするポリヌクレオチド (オリゴヌクレオチド)であればょ、。このようなハイブリダイゼーシヨンによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。

[0094] 本発明に係るポリヌクレオチドを取得する別の方法として、 PCRを用いる方法が挙げられる。この PCR増幅方法は、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの cDNAの 5 '側および Zまたは 3 '側の配列 (またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノム DNA (または cDNA)等をテンプレートにして PCR増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを含む DNA断片を大量に取得することができる。

[0095] 本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されな!ヽ力 IN24 (ニヮトリ単核球白血病細胞株）、肝臓、または胸腺のような生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル (生物体力ゝら得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。

[0096] 本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いれば、ハイブリダィズするポリヌクレオチドを検出することによって、 LIF活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。

[0097] 本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、 LIF活性を有するポリべプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダィゼーシヨンプローブまたは LIF活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、 LIF活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその糸且織もしくは細胞における LIF活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。

[0098] つまり、本発明の目的は、 LIF活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダィズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される LIF活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

[0099] (3)本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用

(A)ベクター

本発明は、 LIF活性を有するポリペプチドを産生するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されないが、 pGEX、 pSecTag2などが好ましい。例えば、 LIF活性を有するポリペプチド (シグナル配列を含んでも含まなくてもょヽ）をコードするポリヌクレオチドの cDNAが挿入された組換え発現べクタ一などが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。

[0100] ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。 [0101] 本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域 (例えば、プロモーター、ターミネータ一、および Zまたは複製起点等)を含有する。酵母用プロモーターとしては、例えば、ダリセルアルデヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、 PH05プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、 trpC等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウィルス性プロモーター（例えば、 SV40初期プロモーター、 SV40後期プロモ一ター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および Zまたはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。

[0102] 上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物など力慣用的な手法 (例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。

[0103] 発現ベクターは、少なくとも 1つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマ一力一としては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、またはネォマイシン、 Zeocin、ジエネティシン、ブラストシジン S、ハイグロマイシン Bなどの薬剤耐性遺伝子、および E. coliおよび他の細菌における培養については、カナマイシン、 Zeocin、ァクチノマイシン D、セフォタキシム、ストレプトマイシン、力ノレべ-シリン、ピューロマイシン、テトラサイクリンまたはアンピシリンなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。 -ヮトリ由来の細胞を用いる場合は、ジエネティシンまたはネオマイシンは適しておらず、 Zeocinが好ましい。

[0104] 上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよぐ例えば、ォワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチド GFP (Green Fluorescent Pr otein)をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドを GFP融合ポリペプチドとして発現させてちょい。

[0105] 上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなぐ従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、酵母（出芽酵母 Saccharomyces cerevi siae、分裂酵母 Schizosaccharomyces pombeノ、虫 (Caenorhabditis eiega ns)、アフリカッメガエル (Xenopus laevis)の卵母細胞、動物細胞（例えば、 -ヮトリ由来の培養細胞（CHCC— OU2細胞、 LMH細胞）、 CHO細胞、 COS細胞、および Bowes黒色腫細胞）などを挙げることができる力 CHCC— OU2細胞が好まし!/ヽ

[0106] 上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなぐ電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウィルスを用いた発現系を用いればよい。

[0107] 本発明に係るベクターを使用して上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中に LIF活性を有するポリペプチドを発現させることができる。

[0108] このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む真核細胞発現用ベクターであればよ!、と、える。

[0109] つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する真核細胞発現用ベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびべクタ一作製方法を用いて取得した真核細胞発現用ベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。

[0110] (B)形質転換体

本発明は、上述した LIF活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなぐ生物個体をも含むことが意図される。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなぐ上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。 [0111] 本発明に係る形質転換体は、上述した LIF活性を有するポリペプチドが発現されることを特徴とする。本発明に係る形質転換体は、 LIF活性を有するポリペプチドが安定的に発現することが好ま、。

[0112] 一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るベクターを、ポリペプチドが発現され得るように真核生物中に導入することによって取得される。好ましくは、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリペプチドを安定して発現する細胞である。最も好ましくは、本発明に係る形質転換体は、受託番号 [FERM BP— 1 0199]によって示される細胞である。受託番号 [FERM BP— 10199]によって示される細胞より分泌された rchLIFは成熟形態である。成熟形態 rchLIFは、シグナルペプチドが切断されており、配列番号 6に示されるアミノ酸配列力なる（対応する cD NA配列は配列番号 5に示される塩基配列からなる)。本発明に係るポリペプチドを安定的に発現する細胞は、 ES細胞または EG細胞を培養する際のフィーダ一細胞として使用することができる。

[0113] (C)ポリペプチドの生産方法

本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、 LIF活性を有するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明に係るポリぺプチドの生産方法を用いれば、 LIF活性を有するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。

[0114] 一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るベクタ一を用いることを特徴とする。

[0115] 本実施形態の 1つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、真核生物宿主を用いる組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリべプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよぐ宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。

[0116] このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを^ aみ込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なる力タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。

[0117] 別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然または糸且換え的に発現する細胞または糸且織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本発明に係るポリペプチドは、成熟形態で細胞から分泌されるので、本発明に係るポリペプチドを天然または組換え的に発現する細胞の培養上清から回収することができる。好ましい細胞としては、受託番号 [FERM BP — 10199]によって示される細胞が挙げられる。このような細胞を用いる場合、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、培養上清を回収する工程を包含する。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含してもよい。

[0118] 本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液力当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法 (例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法)で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液力周知の方法 (例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」 )が精製のために用いられる。

[0119] つまり、本発明の目的は、真核生物宿主を用いて LIF活性を有するポリペプチドを生産する方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。 [0120] (D)培養組成物、培養キットまたは培養方法

本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を含む培養組成物を提供する。本発明に係る培養組成物は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞力培養培地中に含まれる形態であっても、必要に応じて培養培地に添カロされる形態であってもよヽ。本発明に係る培養組成物に含まれるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。本明細書中で使用される場合、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地自体もまた培養組成物に包含される。

[0121] 本発明に係るポリペプチドを含む培養組成物は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、 -ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ま、。

[0122] 本発明はまた、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を備える培養キットを提供する。本発明に係る培養キットは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係る培養キットに備えられるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従つて産生されたポリペプチドであることが好ましい。

[0123] 本発明に係るポリペプチドを備える培養キットは、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、 -ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ま、。本発明に係る培養キットは、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を備えてもよい。

[0124] 本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を用いる培養方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る培養方法は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を培養培地中に添加する工程を包含する。本発明に係る培養方法にぉ、て使用されるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。

[0125] 本発明に係るポリペプチドを用いる培養方法は、胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、特に、 -ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するために、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好ま、。本発明に係る培養方法は、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を用いてもよい。

[0126] (E)トランスジヱニック-ヮトリを作出するためのキットおよび方法

本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を備えるトランスジェニック-ヮトリを作出するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を単独で備えても、必要に応じて他の試薬をさらに備えてもよい。本発明に係るキットに備えられるポリペプチドは、上述したポリべプチドの生産方法に従って産生されたポリペプチドであることが好ましい。

[0127] 本発明に係るキットは、トランスジエニック-ヮトリを作出する際に、 -ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の未分化状態を維持するために、本発明に係るポリべプチドまたは本発明に係る細胞を使用することが好まヽ。本発明に係るトランスジェ-ックニヮトリを作出するためのキットは、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を備えてもよい。

[0128] 本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞を用いてトランスジエニック-ヮトリを作出するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る培養方法は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞とともに二ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含する。本発明に係る培養方法において使用されるポリペプチドは、上述したポリペプチドの生産方法に従つて産生されたポリペプチドであることが好ましい。

[0129] 本発明に係るトランスジエニック-ヮトリ作出方法は、トランスジエニック-ヮトリを作出する際に、 -ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る細胞とともに培養してこれらの細胞の未分ィ匕状態を維持することが好ましい。本発明に係るトランスジエニック-ヮトリを作出するための方法は、本発明に係る細胞を培養して得た馴化培地を用いてもょ、。

[0130] トランスジエニック-ヮトリを作出するためには、 -ヮトリの胚性幹細胞 (ES細胞)または胚性生殖細胞 (EG細胞）を首尾よく継代培養しなければならな、。 -ヮトリ ES様細胞および EG様細胞について、従来の培養方法は、トランスジエニック-ヮトリを作製するには大きな問題点を有する。具体的には、 ES様細胞および EG様細胞について、公知の、ずれの培養方法を用いて培養しても全能性 (生殖系列 (精子または卵子）に分化する能力）を維持しているのは初代培養時のみであり、継代培養後は全能性を消失している。このことは、 ES様細胞および EG様細胞へ遺伝子を導入した後、継代培養を経てトランスジエニック-ヮトリを作出することが不可能であることを示す。

[0131] ニヮトリ ES様細胞を培養する方法を以下に示す。

[0132] 4. 5gZLの Dulbecco' s modified Eagle medium (DMEM) high glucos e (Invitrogen)を基本培地とし、 2mM L グルタミン、 lOOUZmLペニシリン、 10 0 μ gZmLストレプトマイシン、 10%ゥシ胎仔血清、 2%-ヮトリ血清、 ImMピルビン酸ナトリウム、 1%非必須アミノ酸、の各ヌクレオチド (アデノシン、グアノシン、シチジン、ゥリジン、チミジン）、 0. 16mM β メルカプトエタノールとともに、サイト力インを添カ卩した培地を用いる。添加するサイト力インとしては、従来、 FGF2 ( lngZm L)、ヒト IGF— l (l〜5ngZmL)、ヒト IL— l l (lngZmL)、ヒト SCFまたはマウス SC F (lngZmL)、マウス LIF (lOngZmL) (必要に応じてさらに哺乳類由来の IL 6 ファミリーサイト力イン数種、可溶型 IL— 6受容体など）が用いられている力これらの代わりに、またはこれらにカ卩えて、本発明に係るポリペプチド (すなわち、 rchLIFタンノク質)を用い、以下の手順に従って培養を行う：

1.放卵直後の受精卵から濃厚卵白を取り除き、胚を上向きに置く。

2.胚が中央に位置するように濾紙で作製したリングをかぶせ、リングの外枠に沿ってはさみで胚をカットする。

3.濾紙リングに張り付いた胚をピンセットで取り出し、卵黄のついた方を上にして PB S中に置き、卵黄を丁寧に取り除く。

4.胚の明領域（中心部分)を直径 2〜3mmのピペット等で抜き、抜いた細胞塊を回収する。

5.低濃度のトリプシン等で細胞塊をばらばらにする。

6. 10⁵ X細胞 Zcm²の割合で上記培養液中に細胞を播き、 5. 0%CO条件下にて

2

37°Cで培養する。

7.細胞の状態を確認しながら 3〜6日毎に培地交換を行う。 8. SSEA— 1もしくは EMA— 1の抗原が発現維持されているか否力、またはアル力リフォスファターゼ活性によって、胚の未分化状態が維持されて!ヽるカゝ否かを判断する。

[0133] ニヮトリ EG様細胞を培養する方法を以下に示す。

[0134] 4. 5gZLの Dulbecco' s modified Eagle medium (DMEM) high glucos eを基本培地とし、 2mM L—グルタミン、 lOOUZmLペニシリン、 100 /z gZmLストレプトマイシン、 10%ゥシ胎仔血清、 2%-ヮトリ血清、 ImMピルビン酸ナトリウム、 1 %非必須アミノ酸、 1 μ Μの各ヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ゥリジン、チミジン）、 0. 16mM β—メルカプトエタノール、 20 μ g/mL conalbuminとともに、サイト力インを添加した培地を用いる。添加するサイト力インとしては、従来、 F GF2 (10ngZmL)、ヒト IGF— l (lOngZmL)、ヒト IL— 11 (0. 04ngZmL)、ヒト S CFまたはマウス SCF (5ngZmL)、マウス LIF (5〜： LOunitsZmL)が用いられている力これらの代わりに、またはこれらにカ卩えて、本発明に係るポリペプチド (すなわち、 rchLIFタンパク質）を用いて培養を行う。

[0135] -ヮトリ EG様細胞の培養には孵卵 2. 5日ごろに胚血液中に存在する循環始原生殖細胞 (cPGC)または孵卵 5〜5. 5日ごろに生殖原基に到達した生殖腺始原生殖細胞 (gPGC)の利用が行われている力培養が可能と報告されているのは gPGCである。以下にその手順を述べる：

1.孵卵 5日ごろの受精卵から生殖原基に相当する部分を取り出す。

2. 0. 25%トリプシン— EDTA溶液中で生殖原基をばらばらにし、 5%CO条件下、

2 上記培地中にて 37°Cで 7〜10日間培養する。

3.緩やかなピペッティング操作で EG様細胞のコロニーを回収し、先に培養しておいた-ヮトリ胚線維芽細胞 (CEF)上にて、上記培地中、 5%CO条件下にて 37°Cで 7

2

〜 10日間培養する。

4. SSEA— 1もしくは EMA— 1の抗原が発現維持されているか否力、または PAS染色陽性であるか否かによって、胚の未分化状態が維持されてヽるカゝ否かを判断する

[0136] トランスジエニック-ヮトリを作出するためには、遺伝子を導入した後少なくとも 4〜5 代の継代が可能な-ヮトリ ES様細胞および EG様細胞を得る必要がある。本発明に係る真核型の-ヮトリ LIFポリペプチド（rchLIF)は、マウス LIFタンパク質 (rmLIF)よりも効果が明らかに高い。このような rchLIFを用いることによって、添加サイト力インを減らすことが可能であり、真核型-ヮトリ LIFをベースにした全能性維持および生殖系列への分ィ匕能維持を実現することができる培地および培養方法を開発することができる。また、このような培地および培養方法を用いる、有用遺伝子を導入した後の -ヮトリ ES様細胞および EG様細胞の継代培養時にぉ、て、組み込まれた遺伝子が相同遺伝子組み換えで導入されてヽることを確認し、選抜された ES細胞または EG 細胞を-ヮトリ胚に戻して、キメラを作出する。さらに、戻し交配を行えば、トランスジェニックニヮトリを得ることができる。

[0137] (F)抗体

本発明は、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。より詳細には、本発明に係る抗体は、 -ヮトリ LIFタンパク質には結合するがマウス LIFタンパク質には結合しない。

[0138] 一実施形態にお!、て、本発明に係る抗体は、 LIFタンパク質依存的な STAT3活性ィ匕を阻害することができる。すなわち、本実施形態に係る抗体は、 LIF活性を阻害することができる。好ましくは、本実施形態に係る抗体は、配列番号 11〜13のいずれカ 1つに示されるアミノ酸配列力もなるポリペプチドと結合する。好ましくは、本実施形態に係る抗体は、モノクローナル抗体である。

[0139] 本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明される力これに限定されるべきではない。

[0140] 〔実施例〕

〔実施例 1 : E. coliにおける-ヮトリ LIFタンパク質の発現〕

本発明者らは、非特許文献 5に記載の方法に従って、原核型の rchLIFを精製した。原核型の LIFは、図 1に示すような塩基配列およびアミノ酸配列を有する。図 2 (A) および図 2 (B)には、 -ヮトリ LIFアミノ酸配列をヒトまたはマウスの LIFアミノ酸配列と比較した。

[0141] 原核型の rchLIFを、電気泳動によって分離した後、ゲルを CBB染色によって可視化した（図 3)。その結果、原核型 rchLIFは、純度が 90%以上であり、 SDS— PAGE 上で約 19kDaのおおよその分子量を有することがわかった（lmL培養から 1〜5 μ g

) o

[0142] 〔実施例 2 : CHO細胞における-ヮトリ LIFタンパク質の発現〕

使用した真核生物細胞用発現ベクター pSecTag2A (Invitrogen)を図 4に示す。このベクターは分泌シグナルとして Ig κ鎖リーダー配列と、検出精製用タンパクとして C末には mycェピトープおよびポリヒスチジン Tagとが付加されている。なお、本実施形態において、真核型 rchLIFの発現実験に pSecTag2Aを利用した力他のベクタ一も利用可能であることを当業者は容易に理解する。

[0143] LPSで刺激した IN24細胞力も抽出した総 RNAをテンプレートとして、 5 '末端に Hi ndlll部位を有するプライマー（CCAAGCTTGCGGGCGCTGCTGGGGACGA G：配列番号 7)および Xhol部位を有するプライマー（CCCTCGAGCCGCGGGG CTGAGGTGAGGTA :配列番号 8)を用いる RT— PCRを行ヽ、シグナルペプチドを有さない成熟型の-ヮトリ LIF cDNAをクローユングした。この cDNAは、シグナルペプチドをコードする領域を含んでいない。この cDNAを、 pSecTag2Aベクターのマルチクロー-ングサイト（MCS)の Hindlll/Xhol部位に挿入して、ベクター（p SecTag2A-LIFmh)を作製した。このベクターを CHO— K1細胞にリポフエクション法を用いて導入した。リポフエクシヨン法は、 PolyFect Transfection Reagent (QIAGEN)を用いて定法に従って行った。ベクターを導入した細胞を、 Zeocin含有培地中で培養することによって、 Zeocin耐性遺伝子を安定して保有する細胞 (すなわち、導入遺伝子を安定して保有する細胞)を選択して、所望の細胞をクローニングした。クローユングした細胞を数ケ月間 Zeocin添加培地中で培養することによって真核型 rchLIFを安定して発現する細胞株を得た。

[0144] 真核型 rchLIFを安定して発現する細胞株を Zeocin含有培地中で生育させた後、培養上清を回収し、フィルターろ過（ φ 22nm)によって培養上清中の不溶性の不純物を除去した。 His— Tagタンパク質の精製には ProBond (Invitrogen)を用いた。 1 mLのレジンに対して 40mLの培養上清を吸着させ、レジンの 4倍量の洗浄液で 8回洗浄した後、溶出した (レジンと等量の溶出液 X 10回)。溶出画分を SDS— PAGE に供した後、ゲルの銀染色および抗 LIF抗体 (HUL2) (または抗 tag抗体)を用いたィムノブロッテイング解析に供して、目的のバンドの溶出されている画分を回収した。抗 LIF抗体 (HUL2)については、以下の実施例 7で詳述する。

[0145] 回収したタンパク質を PBSで透析した。タンパク質量を定量した後、液体窒素で急冷して— 80°Cで凍結保存した。また、精製した真核型 rchLIFを SDS— PAGEに供した後、銀染色した（図 7)。真核型 rchLIFを安定に発現する CHO—K1細胞株は、 lmL培養上清中 0. 5 μ gの真核型 rchLIFを産生した。

[0146] 〔実施例 3 : -ヮトリ細胞における-ヮトリ LIFタンパク質の発現〕

ニヮトリ細胞を用いて取得した rchLIFは、 CHO産生真核型 rchLIFより活性が強ヽことが期待されるので、ニヮトリ細胞株に真核型 rchLIFを産生させることを試みた。

[0147] pSecTag2A (Invitrogen)における Ig κ鎖リーダー配列、 mycェピトープおよびポリヒスチジン Tagの部分を全て配列番号 3および図 5に示した塩基配列に置き換えて挿入したベクターを構築した (pSecTag2A— cLIFh)。この塩基配列から翻訳される真核型 rchLIFのアミノ酸配列を配列番号 4および図 5に示す。配列番号 3および図 5 に示した塩基配列は、ニヮトリ細胞株に真核型 rchLIFを発現させ、分泌された真核型 rchLIFの精製が簡便であるように、開始コドンおよびリーダー配列を含む-ヮトリ L IF遺伝子の塩基配列全長の終始コドンの直前に 6 Xヒスチジンタグの塩基配列を付カロしている。図 5に示すように、このアミノ酸配列中のリーダー部分（図中下線部）は- ヮトリ細胞中の翻訳後修飾により切断され、リーダー部分が除かれた形態で真核型 rc hLIFが細胞外に分泌される。配列中には原核型にはない糖鎖が付加されることが予想される領域を示す。

[0148] ニヮトリ細胞株としては、 LMH細胞力組換え発現系によく使用されている。 LMH 細胞は市販されており、増殖力が強いため培養が容易であり、遺伝子導入効率も高いので、タンパク質の強制発現などによく使われている（エストロジェンレセプター強制発現 LMH株は ATCCより市販されており、ホルモン応答研究などで広く使われている）。 LMH細胞を用いて rchLIFを取得することを試みた力 -ヮトリ LIF発現べクターを導入して rchLIFを強制発現させると LMH細胞の死滅が生じ、どのような工夫を重ねても rchLIFを安定的に産生する細胞株を得ることができな力つた。 [0149] LMH細胞以外に-ヮトリ由来の接着系細胞株として CHCC— OU2細胞が知られている。しかし、 CHCC— OU2細胞は市販されておらず、増殖力が弱ぐ細胞培養が難しぐ遺伝子導入効率が低いという欠点を有する。遺伝子導入効率が低く増殖力も弱い細胞は組換え発現には適さないことは当業者には明らかであり、実際、 CH CC— OU2細胞を用いてタンパク質を強制発現させた報告は皆無であった。よって、 -ヮトリ LIF組換えタンパク質を-ヮトリ由来の細胞力取得することは一見不可能でめつに。

[0150] 本発明者らは、 LMH細胞の死滅の原因が rchLIFの生物活性（すなわち、文化抑制作用）に起因すると考え、 LMHなど分ィ匕程度の高い細胞の利用は難しいが、ニヮトリ初期胚線維芽細胞由来である CHCC— OU2細胞は、培養条件を首尾よく設定すれば、 LIF発現依存的な細胞の死滅が生じることなぐ LIF強制発現下でも正常に増殖するのではないかと考えた。そこで、本発明者らは、 CHCC— OU2細胞を用いて rchLIFの取得を試みた。 CHCC— OU2は、 LMH細胞など他の-ヮトリ培養細胞株よりも増殖力および遺伝子導入効率がはるかに劣るため、培養およびクローユングを行なうために試行錯誤を重ねた。しかし、本発明者らは、培養条件等工夫を重ねることによって rchLIFを安定に発現する CHCC— OU2株を得ることに成功した（図 6)

[0151] 具体的には、 LPSで刺激した IN24細胞力も抽出した総 RNAをテンプレートとして、 5，末端に Nhel部位を有するプライマー（GCGCTAGCCATGAGGCTCATCC CC：配列番号 9)および EcoRI部位を有するプライマー（CGGAATTCACGCGG GGCTGAGGTAG：配列番号 10)を用いる RT—PCRを行、、シグナルペプチドを有する-ヮトリ LIF cDNAをクローユングした。この cDNAは、シグナルペプチドをコードする領域を含んでいる。この cDNAを、 pSecTag2Aベクターのマルチクロー- ングサイト（MCS)周辺の Nhel/EcoRI部位に挿入して、ベクター（pSecTag2A— cLIFh)を作製した。このベクターを CHCC— OU2細胞にリポフエクシヨン法を用いて導入した。リポフエクシヨン法は、 PolyFect Transfection Reagent (QIAGEN )を用いて定法に従って行った。ベクターを導入した細胞を、 Zeocin含有培地中で培養することによって、 Zeocin耐性遺伝子を安定して保有する細胞 (すなわち、導入遺伝子を安定して保有する細胞）を選択して、所望の細胞をクローユングした。クローユングした細胞を数ケ月間 Zeocin添加培地中で培養することによって真核型 rchLI Fを安定して発現する細胞株を得た。

[0152] その結果、上述した培養条件下では、 CHCC— OU2細胞は、 rchLIFを強制発現させても死滅しな力つた。

[0153] 具体的には、上述した pSecTag2A— cLIFhを-ヮトリ CHCC— OU2細胞株にリポフエクシヨン法により導入した。導入後に細胞を Zeocin含有培地を用いて培養することによって、 Zeocin耐性遺伝子を安定に保有する細胞 (ベクターを安定に保有する）を選択した。その際、一過性の発現が終了した細胞の死滅が起こり、生細胞の密度は著しく低下し、最終的には、単独の細胞がディッシュに点在する程度となる。通常このような低密度での CHCC— OU2細胞の培養は困難であり、次第に分裂能を失い死滅する。そこで、 90%馴化培地による培地交換を週一回程度行い、継代は月一度程度にまで控えた。継代の際のトリプシン処理はできるだけ短時間（3分程度）とし、細胞回収のための遠心分離も lOOOrpmで 3分間程度と、できるだけ細胞にダメージが加わらないようにした。このようにして数ケ月間 Zeocin添加培地中で培養することによって真核型 rchLIFを安定して発現する細胞株 (すなわち、導入遺伝子を安定に保有する細胞）を選択し、コロニークロー-ングによってクロー-ングした。榭立した真核型 rchLIF産生細胞株を、常法に従って 80°Cで凍結保存した。

[0154] タンパク質に付加した His— Tagを利用して、ニッケルカラムによりタンパク質を精製した。具体的には、真核型 rchLIFを安定して発現する細胞株を Zeocin含有培地中で生育させた後、培養上清を回収し、フィルターろ過（ φ 22nm)によって培養上清中の不溶性の不純物を除去した。 His—Tagタンパク質の精製には ProBond (Invitro gen)を用いた。 lmLのレジンに対して 40mLの培養上清を吸着させ、レジンの 4倍量の洗浄液で 8回洗浄した後、溶出した (レジンと等量の溶出液 X 10回)。溶出画分を SDS— PAGEに供した後、ゲルの銀染色および抗 LIF抗体 (HUL2) (または抗 ta g抗体)を用いたィムノブロッテイング解析に供して、目的のバンドの溶出されて!/、る画分を回収した。

[0155] 回収したタンパク質を PBSで透析した。タンパク質量を定量後、液体窒素で急冷して— 80°Cで凍結保存した。また、精製した真核型 rchLIFを SDS— PAGEに供した後、銀染色した（図 7)。真核型 rchLIFを安定に発現する CHCC— OU2細胞株は、増殖速度は遅いが、真核型 rchLIFの大量調製が可能となった（lmL培養上清から 5 g

[0156] 図 7に示すように、真核型 rchLIFは、 CHO産生または CHCC— OU2産生のいずれもが原核型 rchLIFよりも泳動度が遅ぐ複数のバンドとして検出された。

[0157] 次に、抗 LIF抗体 (HUL2)を用いたウェスタンブロッテイング法により、 rchLIFを検出した。具体的には、 lOOngZレーンのタンパク質を、 12. 5%ポリアクリルアミドゲルを用、た SDS— PAGEによって分離した後、 180mVで 3時間の条件下で Immun -Blot PVDF Membrane (BIO— RAD)に転写した。このメンブレンを、 5%脱脂粉乳中にて室温で 1時間ブロッキングした後、一次抗体 (上述した抗 LIF抗体 (HUL 2) )とともに 4°Cで一晩インキュベートした。メンブレンを洗浄した後、二次抗体 (HRP 標識ィ匕抗マウス Ig抗体）とともに室温で 1時間インキュベートした。メンブレンを洗浄した後、 ECL Plus (アマシャム）を用いて目的のバンドを検出した。その結果、図 8に示したように、 CHO産生真核型 rchLIFは 20〜37kDaの間に、 -ヮトリ細胞株産生真核型 rchLIFは 19〜30kDaの間に、いずれも数本のバンドとして検出された。これは、糖鎖の付加の状況が異なることに起因して異なる分子量の真核型 rchLIFが産生されていることを示す。

[0158] 〔実施例 4 :真核型-ヮトリ LIFタンパク質における糖鎖付加〕

lOOngZレーンのタンパク質を 12. 5%ポリアクリルアミドゲルを用いた SDS— PA GEによって分離した後、 180mVで 3時間の条件下で Immun— Blot PVDF Me mbrane (BIO-RAD)に転写した。このメンブレンをメタノールで処理した後、 TBS で洗浄した。次いで、 TBS中 5%の BSAを用いて、このメンブレンを室温で 1時間ブロッキングし、 TBS中 1%のレクチン液とともに室温で 1時間インキュベートした。レクテンとしては、 Biotinylated Lectin Kit I (Vector Laboratories Inc. )を用いた。 TBS— Tで洗浄した後、 VECTASTAIN Elite ABC Kit (Vector Labo ratories Inc. )を用いて、レクチンが特異的に結合したバンドを検出した。

[0159] レクチン（ConA、 RCA、 WGA)染色を行った結果を図 9に示す。図 9に示したように真核型 rchLIFが特異的に染色された。

[0160] この結果より、全ての真核型 rchLIFはハイマンノース型 N結合の糖鎖、バイセクテイング GlcNAcおよびシアル酸を有すること（ConA、および WGA)、-ヮトリ細胞株産生真核型 rchLIFは /3結合ガラクトースを有すること (RCA)が示された。以上の結果から、真核型 rchLIFは、糖鎖付カ卩において、 CHO産生系とニヮトリ細胞産生系との間で異なることがわかった。

[0161] 〔実施例 5 :種々の rchLIFの生物活性〕

rchLIFの生物活性は-ヮトリ ES細胞 (ニヮトリ胚盤葉細胞)の未分化状態を維持する活性として測定することができる。

[0162] 精製した真核型 rchLIF (20ng/ml)を-ヮトリ ES細胞の培養系に添加して 8日間培養した。 LIF非添加の条件下では、 -ヮトリ ES細胞は嚢胞性胚葉体を形成し未分化状態が維持されない（図 10—パネル 1)。原核型 rchLIFを添加した条件下では、 -ヮトリ ES細胞は未分ィ匕状態を 7日間維持したが、培養 8日目には嚢胞性胚葉体が出現した（図 10—パネル 2)。 CHO産生真核型 rchLIF添カ卩の条件下では、小型の嚢胞性胚葉体が多数検出され、未分化状態が維持されていない（図 10—パネル 3) 。これらに対して、 -ヮトリ細胞株産生真核型 rchLIF添加の条件下では、 -ヮトリ ES 細胞が 8日間の培養後も未分化状態を維持し、かつ嚢胞性胚葉体がほとんど形成されてヽな、ことがわかった（図 10—パネル 4)。

[0163] 以上の結果は、 -ヮトリ ES細胞の培養には rchLIFであれば効果 (未分ィ匕状態の維持)を奏するが、原核型 rchLIFよりも真核型 rchLIFの方がより好ましぐ特に-ヮトリ細胞が産生する真核型 rchLIFが最も効果が高いことを示す。また、原核型 rchLI Fよりも真核型 rchLIFの方が-ヮトリ ES細胞の未分ィ匕状態を長く維持することがわかつた o

[0164] 〔実施例 6 :種々の rchLIFの安定性〕

これまでの結果力 -ヮトリ ES細胞の培養系に-ヮトリ細胞株が産生した真核型 rc hLIFの効果が高いことがわ力つた。そこで次に糖鎖付カ卩によるタンパク質の安定性の試験を行った。原核型 rchLIFおよび真核型 rchLIFを高温（50°Cまたは 80°C)で 6時間保温した場合、さらに、酸性 (_PH2. 8)またはアルカリ性 (ρΗΙΟ. 6)で 6時間室温インキュベートして、リコンビナントタンパク質分解の程度を SDS— PAGEを用いて解析した。また各処理条件による生物活性の変化を-ヮトリ ES細胞培養系へ添カロして調べた。

[0165] その結果、図 11に示したように原核型 rchLIFでは 80°Cの熱処理とアルカリ処理でバンドの減少が確認された。また真核型 rchLIFでは 80°C処理により低分子のバンドの減少が認められたがそれ以外にバンドの減少は認められず、種々の処理に対して真核型 rchLIFは極めて安定であることがわかつた。

[0166] 次に、原核型 rchLIFまたは真核型 rchLIFを-ヮトリ ES細胞の培養系に 20ngZm 1の濃度で添加して嚢胞性胚葉体の出現を指標に LIFの生物活性を測定した。

[0167] その結果、図 12に示したように、原核型 rchLIFを使用した場合には多数の嚢胞性胚葉体の出現が認められたが、真核型 rchLIFを使用した場合に-ヮトリ ES細胞は、円形のコロニーを形成したまま嚢胞性胚葉体の出現は全く認められな力つた。以上の結果は、真核型 rchLIFはその生物活性においても種々の処理に対して極めて安定であることを示している。

[0168] 〔実施例 7： -ヮトリ LIFタンパクに対する抗体〕

原核型-ヮトリ LIFタンパク質全長を免疫原として抗 LIF抗体を作製した。免疫原はフロイントアジュバンドと等量で混合し、マウスに腹腔内注射により免疫した。追加免疫を初回免疫後 2週間おきに行い、四次免疫まで行った。四次免疫を細胞融合の 3 日前に行ない、尾静脈注射による免疫を行った。

[0169] マウスより採血して得られたポリクローナル抗体を用いて、結合特異性を調べたところ、得られた抗体は、マウス LIFタンパク質と-ヮトリ LIFタンパク質との間の交差反応を示さなかった。

[0170] 上述の実施例で示したように、胚盤葉細胞に対する生物活性および Zまたは STA T3のリン酸化において、 rchLIFと rmLIFとの間で違いがあることが明らかである。この違いは、両者間のアミノ酸配列が大きく異なることに起因し、その結果、リガンドブレセプター相互作用が異なっていることが考えられる。そこで、 LIFにおけるリガンド Zレセプター相互作用に関連する領域を解析することを目的として、 rchLIFとレセプターとの結合に関与することが予想される領域 (すなわち、 rchLIFの親水性領域）に対する抗体を作製した。

[0171] 具体的には、シグナルペプチドを除いた成熟型-ヮトリ LIFタンパク質のアミノ酸第

23〜35位（EQTRRQVALLNAT:配列番号 11)、第 96〜： L 11位（GNITRDQEE LNPMAKE：配列番号 12)、または第 148〜164位（GLISNLTCLLCKHYNIF：配列番号 13)からなる合成ペプチドとキャリアータンパク質（keyhole limpet hem ocyanin(KLH, Imject (登録商標） Maleimide Activated mcKLH, PIERC E)との複合体を免疫原とした。免疫原は水酸ィ匕アルミニウムゲルアジュバンドと等量で混合し、マウスに腹腔内注射により免疫した。追加免疫を初回免疫後 2週間おきに行い、四次免疫まで行った。四次免疫を細胞融合の 3日前に行い、尾静脈注射による免疫を行った。

[0172] マウスより採血して得られたポリクローナル抗体を用いて、結合特異性を調べたところ、いずれの抗体においてもマウス LIFタンパク質と-ヮトリ LIFタンパク質との間の交差反応は検出されな力つた。さら〖こ、これらの抗体は、 rchLIF依存的な STAT3のリン酸ィ匕を阻害した。

[0173] さらに、 -ヮトリ LIFタンパク質全長に対するモノクローナル抗体および上記べプチドに対するモノクローナル抗体を作製した。四次免疫を行った後、血清中の抗体価が十分上昇したことを確認したマウス力脾臓を摘出し、脾細胞を回収した。脾細胞は融合用親株細胞（SP2Z0— Agl4)と融合させ、 HAT(hypoxanthin aminopter in thymidinem Invitrogen)選択培地中で、融合細胞を選択した。 rchLIFを抗原とした ELISA法およびウェスタンブロット法 (WB)を用いて、抗-ヮトリ LIF抗体を産生するハイプリドーマを選抜し、限界希釈法によりクローユングを行い、 -ヮトリ LIF タンパク質全長に対するマウス抗-ヮトリ LIFモノクローナル抗体 (HUL1)および成熟型-ヮトリ LIFタンパク質のアミノ酸第 148〜 164位 (配列番号 13)を特異的に認識するマウス抗-ヮトリ LIFモノクローナル抗体（HUL2)を得た。さらに、 Mouse mon oclonal antibody isolation kit (Amersham)を用いてこれらの f几体のサブクラスを調べたところ、 HUL1は IgG2b、 HUL2は IgAであることが確認された。

[0174] 得られたモノクローナル抗体はいずれも、ウェスタンブロッテイング解析の結果、原核型-ヮトリ LIFタンパク質および真核型-ヮトリ LIFタンパク質の両方を強く認識することがわ力つた。特に、 HUL2は、 rchLIF依存的な胚盤葉細胞の STAT3のリン酸化を阻害した。

[0175] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。産業上の利用の可能性

[0176] 本発明を用いれば、物理ィ匕学的に安定な-ヮトリ LIFタンパク質を安定して供給することができる。また、本発明を用いれば、これまで困難であった-ヮトリの胚性幹細胞 (ES細胞)または胚性生殖細胞 (EG細胞)の未分化状態をより効率よく維持させて、安定な細胞株を榭立することができる。さらに本発明を用いれば、トランスジエニック -ヮトリを作出することができる。

[0177] -ヮトリ LIFタンパク質 (rchLIF)は、 -ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分化を阻害して未分化状態を維持させるために有効である。特に、真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生された真核型 rchLIFは、物理化学的に安定であり、かつ生物活性が非常に高い。本発明者らは、このような真核型 rchLIFを安定に供給することができる細胞を得ることによって、トランスジエニック-ヮトリの作出に不可欠な-ヮトリ LIFタンパク質を大量生産することを可能にした。このような真核型 rchLI Fを用いれば、所望のトランスジエニック-ヮトリを容易に作出することができ、所望の動物工場として活用することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分ィ匕を阻害するポリペプチドであって：

(a)配列番号 6に示されるアミノ酸配列；または

力なり、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。

[2] 胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分ィ匕を阻害するポリペプチドであって：

によってコードされ、かつ真核生物宿主を用いる組換え発現系によって産生されることを特徴とするポリペプチド。

[3] 胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分ィ匕を阻害するポリペプチドであって：

[4] 胚性幹細胞または胚性生殖細胞の分ィ匕を阻害するポリペプチドであって：

[5] 上記真核生物宿主力 CHO— K1細胞または CHCC— OU2細胞であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれ力 1項に記載のポリペプチド。

[6] 請求項 1〜5のいずれ力 1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする真核生物宿主に用いる発現ベクター。

[7] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のポリペプチドを安定して産生することを特徴とする細胞。

[8] 請求項 7に記載の細胞を培養することによって得られる馴化培地。

[9] 請求項 7に記載の細胞を用いることを特徴とするポリペプチド生産方法。

[10] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。

[11] 請求項 7に記載の細胞を含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。

[12] 請求項 8に記載の馴化培地を含むことを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養組成物。

[13] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のポリペプチドを備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。

[14] 請求項 7に記載の細胞を備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。

[15] 請求項 8に記載の馴化培地を備えることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養キット。

[16] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。

[17] 請求項 7に記載の細胞を用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。

[18] 請求項 8に記載の馴化培地を用いることを特徴とする胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養するための培養方法。

[19] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のポリペプチドを備えることを特徴とするトランスジェニック-ヮトリ作出キット。

[20] 請求項 7に記載の細胞を備えることを特徴とするトランスジエニック-ヮトリ作出キット

[21] 請求項 8に記載の馴化培地を備えることを特徴とするトランスジヱニック-ヮトリ作出キット。

[22] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のポリペプチドとともに-ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジエニック-ヮトリ作出方法。

[23] 請求項 7記載の細胞とともに-ヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジエニック-ヮトリ作出方法。

[24] 請求項 8に記載の馴化培地とともにニヮトリの胚性幹細胞または胚性生殖細胞を培養する工程を包含することを特徴とするトランスジエニック-ヮトリ作出方法。

[25] 請求項 1〜5のいずれか 1項に記載のポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。

[26] 配列番号 11〜 13の、ずれか 1つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合することを特徴とする抗体。