WO2006046674A1

WO2006046674A1 - Ｃ型肝炎ウイルス感染症の予防および治療剤

Info

Publication number: WO2006046674A1
Application number: PCT/JP2005/019841
Authority: WO
Inventors: Tatsuya Ito; Masahiro Aoki; Masayuki Sudoh
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2004-10-25
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2006-05-04
Also published as: TW200618807A; JPWO2006046674A1

Abstract

ヒメハギ属の植物の抽出物を有効成分として含有する、Ｃ型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物が開示される。好ましくは、本発明の医薬組成物は、オンジ(Polygala Tenuifolia Willdenowの根部)の抽出物またはセネガ (Polygala senega Linneの根部)の抽出物を含む。好ましくは抽出物はサポニン、例えば、オンジサポニンまたはポリガラサポニンである。

Description

明細書

C型肝炎ウィルス感染症の予防および治療剤技術分野

本発明は、 C型肝炎ウィルス感染症を予防および治療するための医薬組成物に関する。背景技術

C型肝炎ウィルス (HCV)の感染者は世界中で約 1一 2億人、日本国内では 2 0 0万人以上と推測されている。これらの感染者の約 5 0 %が慢性肝炎に移行し、そのうち約 2 0 %が感染後 3 0年以上たつて肝硬変や肝癌を発症する。肝癌の原因の約 9 0 %は C型干炎であると言われている。日本国内では、毎年 2万人以上の患者が H C V感染に伴う肝癌により死亡している。

C型肝炎ウィルスは、 1本鎖 RNAウィルスであり、コア蛋白、エンベロープ蛋白および RNAで構成される直径 55〜65 nmの粒子である。この粒子は、ヒトの肝細胞に吸着、侵入したあと脱殻し、 RNAを放出する。肝細胞内で、ウイルス自身が持つ RNA依存性 RNAポリメラーゼによつて mRNAおよびウィルス遺伝子 RNAの複製が合成される。 mRNAの情報によって、ウィルスの構造蛋白やプロテアーゼ、ヘリ力一ゼ、 RNAポリメラーゼなどが作られ、ウィルス粒子が形成され、ゴルジ装置を通って細胞膜に達し、肝細胞外へ放出され、ウイルスは増殖していく。

H C Vは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した成人に感染した場合でも持続感染が成立することが多い。持続感染は、慢性肝炎、 fl干硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため、肝癌が再発する患者が多いことも知られている。現在、 H C V排除の唯一の有効な治療法としてィンターフェ口ン治療が知られている。しかし、インターフェロン治療が有効な患者は、全患者の 1 Z 3程度である。特に、 H C Vゲノタイプ 1 bに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。また、インターフェロンとリバビリンとの併用による C型肝炎の治療も行われているが、有効率は依然として低い。また、インターフェロンァゴニスト、イン夕一ロイキン— 1 2ァゴニスト等、患者の免疫力を増強させることによってウィルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見いだされていない。

したがって、当該技術分野においては、 H C Vを排除し C型肝炎を治療する有効な治療方法および治療薬の開発が求められている。

本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある： V. Lohmann et al, Science: 285, 110— 113， 1999； S. Sakuma and J. Shoji, Chem. Pharm. Bull: 29， 2431-2441, 1981； S. Sakuma and J. Shoji, Chem. Pharm. Bull: 30, 810-821, 1982； Y. Shimizu and S. W. Pelletier, J. Am. Chem. Soc, 88, 1544-

本発明は、 C型肝炎ウィルス感染症を予防および治療するのに有効な化合物ならびにこの化合物を含む医薬組成物を提供することを目的とする。発明の開示

本発明者は、広範な種類の植物および生薬について抗 H C V活性を調べた結果、ヒメハギ属の植物のエタノール抽出物が強力な抗 H C V活性を有することを見いだした。すなわち、本発明は、ヒメハギ属の植物の抽出物を有効成分として含有する、 C型肝炎ウィルス感染症を予防または治療するための医薬組成物を提供する。

本発明において、「C型肝炎ウィルス感染症」とは、 C型肝炎ウィルスの感染に関連する疾患を表し、例えば、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化および肝癌が挙げられる。 C型肝炎ウィルス感染症の予防および治療には、これらの疾患の症状を軽減または排除すること、感染患者中の C型肝炎ウィルスの増殖を阻害すること、ウィルスの活性を低下させること、およびウィルスを消滅もしくは減少させることが含まれる。

本発明において、「ヒメハギ属の植物」とは、ヒメハギ科 (Polygalaceae) のヒメハギ属（Polygala) に属する植物であり、その一部は従来より生薬として知られている。代表的なものとしては、オンジ (Polygala Tenuifolia Willdenowの根部）およびセネガ（Polygala senega Linneの根部)が挙げられる。

「抽出物」とは、ヒメハギ属の植物、例えばその茎、根、葉等を適当な溶媒で抽出し、必要に応じて濃縮 ·乾燥することにより得られる物質をいい、単離された化合物でもよく、複数の化合物の混合物でもよい。

本発明の 1つの好ましい態様においては、ヒメハギ属の植物の抽出物はサボ二ンである。サポニンは、ステロイドやトリテルぺノイドにオリゴ糖が結合した配糖体であり、植物界に広く分布する物質である。本発明において好ましいサボ二ンは、オンジサポニンまたはポリガラサポニンである。

別の観点においては、本発明は、オンジサポニン B、ポリガラサポニン

XLIV、ポリガラサポニン XXXIIおよびオンジサポニン Fからなる群より選択される化合物を有効成分として含有する、 C型肝炎ウィルス感染症を予防または治療するための医薬組成物を提供する。

別の観点においては、本発明は、以下の式（ I ) ：

[式中、

R ₂および R ₃は、それぞれ独立して、糖、糖鎖または水素であり；

R ₄、 R ₅および R ₆は、それぞれ独立して、一 H、一 OHまたは— O R ₇であり、ここで、 R ₇は C i _₆の直鎖または分枝鎖のアルキル基である]

の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含む、 C型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物を提供する。好ましくは、 R C ^sの直鎖または分枝鎖のアルキル基である。上記式中、糖とは単糖類を意味し、例えば、グルコース、ガラクトース、フルク！ス、キシロース、ァラビノース、ラムノース、ァピオース、フコースなどが挙げられる。これらの単糖類が、尺₂ぉょび!^ ₃、すなわち残基として結合する場合、結合手が存在する位置としては、 5単糖、 6単糖といった糖の種類にもよるが、例えば、糖における 1位（ァノメリックポジション）、 2位、 3位、 4位、 5位および 6位が挙げられる。中でも、 1位 (ァノメリックポジション）に結合手が存在するのが好ましい。糖鎖とは、複数の単糖類、好ましくは 2— 1 0個の単糖類、より好ましくは 2— 4個の単糖類がグリコシド結合により互いに結合した成分を意味する。

薬学的に許容しうる塩としては、薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のアルカリ金属またはァルカリ土類金属等の塩、ァンモニァゃ各種有機塩基等の塩類を挙げることができる。

特に好ましくは、式（I ) の化合物は、式：

で表される化合物（オンジサポニン F) である。

別の観点においては、本発明は、 C型肝炎ウィルスに感染した患者にヒメハギ属の植物の抽出物を投与することを含む、 C型肝炎ウィルス感染症を予防または治療する方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、オンジの LC-UV-MSクロマトグラムおよび微量分取フラクションの抗 HCVレプリコン活性および細胞毒性を示す。

図 2は、セネガの LC-UV-MSクロマトグラムおよび微量分取フラクシヨンの抗 HCVレブリコン活性および細胞毒性を示す。

図 3は、ポリガラサポニン XXXIIおよびオンジサポニン Fの構造を示す。図 4は、 Fr. 4 (オンジサポニン F) の 1H-NMR (500MHz) スぺクトルを示す。図 5は、オンジより精製された物質およびリバビリンの抗 HCVレプリコン活性および細胞毒性を示す。

図 6は、ウエスタンプロット解析によるオンジサポニンの HCVタンパク質合成阻害の測定結果を示す。

図 7は、ウエスタンブロット解析によるオンジサポニンの抗ウィルス効果を示す。

図 8は、ノザンブロット解析によるオンジサポニンの HCV RNA複製阻害の測定結果を示す。

図 9は、ノザンブロット解析によるオンジサポニンの抗ウィルス効果を示す。発明の詳細な説明

HCVレブリコンアツセィを用いて、市販の生薬のエタノール抽出物 280種についてスクリーニングしたところ、オンジ (S. Sakuma and J. Shoji，Chem.

Pharm. Bull: 29， 2431-2441, 1981； S. Sakuma and J. Shoji, Chem. Pharm.

Bull: 30， 810-821, 1982)およびセネガ (Y. Shimizu and S. W. Pelletier, J. Am.

Chem. Soc, 88, 1544- 1549, 1966) の抽出物が選択的かつ強い抗 HCV活性を有することが見いだされた。生薬オンジおよびセネガは、去痰薬の配合剤原料として用いられており、抽出物には気道分泌亢進および利尿作用が知られている。しかし、オンジまたはセネガ由来の製剤および抽出成分に抗 HCV活性あるいは肝炎に対する治療効果があることは全く知られていなかった。

下記の実施例に記載されるように、オンジおよびセネガの抽出物を LC/MSで分析、同時に微量分取して各ピーク成分の活性を測定したところ、両生薬に共通する類似のサポニンのピーク群に抗 HCV活性が認められた。そこで、オンジについて、この成分を明らかにすべく活性物質を精製 ·単離し、構造を同定したところ、オンジサポニン Fなどのプレセネゲニンおよび桂皮酸誘導体をァグリコンとするサポニンを活性成分として分離することができた。オンジサポニン F は、 0.17 Mで HCVレプリコン活性を 5 0 %阻害したが、 6 x Mでも細胞毒性は示さなかった。この活性は、サポニンを加水分解することにより消失した。有効成分の抽出方法

本発明の医薬組成物は、ヒメハギ属の植物の根、茎、葉または種子から有用成分を抽出することにより製造することができる。ヒメハギ属の植物としては、好ましくは、オンジ (Polygala Tenuifolia Willdenowの根部）およびセネガ

(Polygala senega Linneの根部)が用いられる。あるいは、これらを乾燥したものや粉末としたものを使用してもよい。

ヒメハギ属の植物の根、茎、葉または種子から抽出物を得るためには、これらの原料を細断し、 5〜1 0 0倍量の抽出溶媒を加えて数時間から数日間放置または撹拌する。抽出溶媒としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、プロパノール、ブ夕ノール、メチルェチルケトン、ジェチルエーテル等、またはこれらの混合物を用いることができる。抽出は、冷却または加熱しながら行ってもよく、加圧処理してもよい。

得られた根、茎、葉または種子からの抽出物は、必要に応じて、濾過により不溶性成分を除去した後に、抽出溶媒を除去して、本発明の抽出物を得る。この抽出物は、必要に応じて低温殺菌してもよく、さらに濃縮、乾燥してもよい。乾燥は慣用の噴霧乾燥または凍結乾燥などにより行うことができる。抽出物は室温、冷蔵または冷凍条件下で保存することができる。

このようにして分離された粗抽出物は、必要に応じて、さらに精製する工程に付することができる。精製は、生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、例えば、シリカゲル、化学修飾されたシリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂等の担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法、ゲルろ過法等により行うことができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロ口ホルム、酢酸ェチル、メタノール、水等を挙げることができ、これらは 2種類以上を併用することができる。化学修飾されたシリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、含水メタノール、含水ァセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができる。高速液体ク口マトグラフィ一法を採用する場合は、担体として、例えば、ォクタデシル基、ォクチル基、フエニル基などが結合した化学修飾されたシリカゲル；ポリスチレン系ポーラスポリマーゲル等を挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノール、含水ァセトニトリル等の水溶性有機溶媒の含水溶液等を使用することができる。ゲルろ過法においては、セフアデックス LH-20や G- 10等のゲルろ過担体等を用いることができ、移動相としては、メタノールや水、含水メタノール等を使用することができる。

さらに、ヒメハギ属の植物の根、茎、葉または種子から上述のようにして抽出された物質を、さらに化学的に改変または修飾してもよい。そのような改変および修飾は、化学合成の分野においてよく知られる方法を用いて容易に行うことができる。レブリコンアツセィ

本発明の医薬組成物の抗 H C V活性は、レブリコンアツセィを使用して測定することができる。レブリコンアツセィは、 C型肝炎ウィルス（HCV) のインビトロ RNA複製系であり、細胞レベルで HCVの増殖能を予測するアツセィ系である。 HCVはインビトロ細胞培養系が無いために、これまでは、抗 HCV薬の評価をするにあたり他の近縁ウィルスを用いた代替ウィルスアツセィ法を用いなければならなかった。近年、 Lohmannら (V. Lohmann et al, Science: 285, 110 - 113, 1999)により HCVの非構造領域部分を用いてィンビト口で HCVの複製を観測することが可能になったことにより、レブリコンアツセィ法によって抗 HCV薬の評価が容易となった。ォリジナルの方法は HCV— RNA数をポリメラ —ゼ連鎖反応法（PCR) で検出するものであるが、その代わりの方法として HCV遺伝子中にレポ一ター遺伝子を導入する方法が一般的であり、より効率的なアツセィ法として評価に利用されている。

レポ一夕一遺伝子としては、例えば、ホ夕ル由来のルシフェラ一ゼ遺伝子を導入したものを用いることができる。具体的には、 Kriegerら (N. Krieger et al., J. Virology: 75, 4614-24, 2001) の方法に従い、 HCV遺伝子の Internal

Ribosome Entry Site(IRES)の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラ一ゼ遺伝子を導入する。インビトロで当該 RNAを合成後、エレクト口ポレーシヨン法等により適当な細胞に導入して、ホタル ·ルシフェラ一ゼ HCV レブリコン細胞を得る。この細胞を 96穴プレートのゥエルに蒔き、希釈した被検物質を加えて数日間培養する。次に基質を加えて、プレートリーダーでルミネッセンスを測定する。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し弓、被検物質未添加の値を阻害 0 %として、被検物質の IC₅₀ (50%阻害濃度）を算出することができる。細胞毒性試験（WS "8)

本発明の医薬組成物の細胞毒性は、例えば、市販の Cell counting kit-8 (Dojindo cat. no. CK04) を用いて測定することができる。上述のホ夕ル ·ルシフェラ一ゼ HCVレブリコン細胞を 96穴プレートのゥエルに蒔き、希釈した被検物質を加えて数日間培養する。各ゥエルに Cell counting kit-8を添加し、吸光度を測定する。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、被検物質未添加の値を阻害 0 %として、被検物質の IC₅₀ (50%阻害濃度）を算出することができる。医薬製剤

本発明の医薬組成物は C型肝炎ウィルス感染症の予防および Zまたは治療に有用である。本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することができる。例えば、薬学的に許容しうる担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製剤化することができる。

経口投与用には、本発明の抽出物または化合物またはその塩を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体と混合することにより、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することができる。担体としては、当該技術分野において従来公知のものを広く使用することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケィ酸等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、力ルポキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリンカカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；第 4級アンモニゥム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケィ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の潤沢剤等を用いることができる。さらに錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠、あるいは二重錠、多層錠とすることができる。

非経口投与用には、本発明の抽出物または化合物またはその塩を当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうるべヒクルを用いて通常の製剤実施に従つて処方することができる。

注射剤用の水溶性べヒクルとしては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩ィ匕ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレンダリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート 80 (TM) 、 HCO-50 と併用してもよい。

油性べヒクルとしてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばべンジルアルコール、フエノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

本発明の医薬組成物の適当な投与経路には、限定されないが、経口、直腸内、経粘膜、または腸内投与、または筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が含まれる。投与経路および投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。

本発明の医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり 0.001〜： LOOOOOmg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2 0 0 4 - 3 0 9 1 9 6号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。実施例

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。実施例 1

オンジおよびセネガの抽出物の抗 H C V活性および細胞毒性のアツセィ

生薬：オンジ（Polygala Tenu olia Willdenowの根部）およびセネガ

(Polygala senega Linneの根部）は小西製薬から購入した。オンジまたはセネガを刻み、それぞれ 70% エタノール水を用いて抽出し、乾燥して被検試料とした。レプリコンアツセィ： Kriegerら (N. Krieger et al.、 J. Virology: 75、 4614 — 24、 2001) の方法に従い、 HCV遺伝子の Internal Ribosome Entry

Site(IRES)の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフエラ一ゼ遺伝子を導入した。インビトロで当該 RNAを合成後、エレクトロボレ一シヨン法で Huh7細胞に導入し G418耐性クロ一ンとして単離した。ホタル ·ルシフェラ一ゼ HCVレブリコン細胞（Huh7-3- 1) を 5 %ゥシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03) を含むダルベッコ MEM (Gibco cat. no. 10569-010) に懸濁し 96穴プレートに 5000細胞ウエルで蒔き、 5 % C0₂、 37 で一夜培養した。約 20時間後、希釈した化合物をゥエルあたり 10 L加え、さらに 3日間培養し

/し。

アツセィプレートは 2系統用意し、 1つは白色プレート、他はクリア一プレートでァッセィを行つた。培養終了後、白色プレー卜は Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega cat. no. E2520) に用いた。すなわち、ゥエルあたり 100 Lの試薬を入れ、 3〜4回ピペットで混ぜ、 5分間放置後に 1450

MicroBeta TRILUX (WALLAC)にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害 0 %として薬剤の IC₅₀ (50%阻害濃度）を算出した。

細胞毒性試験（WST-8)：細胞毒性の測定には Cell counting kit-8 (Dojindo cat. no. CK04) を用いた。すなわち、 10 Lの Cell counting kit'8を上述のクリア一プレートに添加し、 37°Cで 30〜60分間保温した。 96穴プレートリーダ —にて波長 450nm、対照波長 630nmで吸光度を測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害 0 %として薬剤の IC₅₀ (50%阻害濃度）を算出した。

LC/MS分析：送液モジュール (ポンプおよびォートサンプラー)にはウォー夕 —ズ社 2790、 UV検出器に同 996、 MS検出器に同 ZMD2000を用いた。カラムには、 Develosil Combi-RP5 (C30、 4.6 mmID x 50mm、 5 fi m, 野村化学)を用いた。送液は、 0.1%のギ酸を含むァセトニトリル—水グラジェント (ァセトニトリルの割合： 15— 98%、 16分間)を用い、 1.5 mL/分で送液した。微量フラクシヨンの分取には、フラクションコレクター FC-203(ギルソン社製）を用レ 0.4分間毎に 1フラクション、合計 40フラクションを得た。なお、コントロールとして、フラクションの 1番には、 HPLC分画前のサンプル、すなわちエタノール抽出物を置いた。フラクションを濃縮乾固した後、レブリコンおよび WS 8ァッセィに供した。 MSでの分析は、 Electro Spray Ionization(ESI)の Negativeモ一ド用レた。

LC MSによるオンジおよびセネガの分析と微量分取フラクションの活性：ォンジおよびセネガのエタノール抽出物を、 LC/MSで分析、同時に微量の分取フラクシヨンを調製、 HCVレブリコンおよび WS 8アツセィに供した。オンジの LC-UV-MSクロマトグラムと、微量分取フラクションの抗 HCVレブリコン活性および細胞毒性を図 1に、セネガの LC-UV-MSクロマトグラムと、微量分取フラクションの抗 HCVレブリコン活性および細胞毒性を図 2に示す。図中、クロマトグラムは UV 320 nmのものであり、フラクションは 0.4分間毎に 1フラクシヨンである。各フラクションの 500倍および 4500倍希釈物について、レプリコン (Rep)および細胞毒性 (WST)を測定し、その％阻害をグラフに示した。図 1右上のパネルは、保持時間 7.82分のピークの ESI—MSスペクトルを、図 2右上のパネルは、保持時間 7.92分のピークの UVスペクトルを、それぞれ示す。

その結果、オンジおよびセネガは類似のクロマトパターンを示し、ピークは、保持時間 3— 4分付近と 7— 9分付近のピーク群に別れ、抗 HCVレブリコン活性は、 7— 9分のピーク群に観察された。これら活性は、オンジ、セネガとも、 500倍希釈で細胞毒性を示さなかったが (WST^), 4500倍に希釈しても強い抗 HCV活性が観察された。

これら活性ピークは、 ESI+では明瞭なスペクトルを与えなかったが、 ESI— 分析においては、 m/z 1400〜1800の比較的大きな擬似分子イオンピークをあたえた。また、これら活性ピークは、 UV 320 nm付近に吸収極大を示す特徴的な UVスペクトルを有していた。これらより、オンジおよびセネガは、構造類似の活性成分を含むと考えられた。実施例 2

オンジサポニンの精製および構造解析オンジサポニンの精製： 100gのオンジ (刻み)より 1000 mLの 70%エタノール水を用いて抽出し、これを濃縮後、ブ夕ノールで抽出 ·乾固し、粗抽出物 20 gを得た。この一部を、分取 HPLCにより 5つの分画を得た (Fr. 1 〜 5)。

分取 HPLCは以下の条件で行った。 HPLCには、ギルソン社 306ポンプおよびアジレントテクノロジ一 1100 PDA検出器を、フラクションコレクターに 215 リキッドハンドラーを用い、ギルソン社ュニポイントシステムで制御した。カラムには、 Pegasil ODS (20 mmID X 250 mm、センシュ一科学)を用いた。

0.01%の TFA (トリフルォロ酢酸）を含むァセトニトリル一水グラジェント（ァセトニトリルの割合： 40— 50%、 17分間)により、 15 mL/分で送液し、 UV 320 nmの吸収を指標にピーク分取した。加水分解物の分取には、カラムに

Mightysil ODS (20 mmID x 50mm, 関東科学)を用い、 0.01%の TFA (トリフルォロ酢酸）を含むァセトニトリル—水グラジェント（ァセトニトリルの割合： 40%、 1分間； 40— 50%、 16分間； 50%、 3分間）により、 15 mL/分で送液し、フラクションを時間で分取した。

物質の構造解析は、 LC/MSによる解析に加えて、 NMR(A-500、日本電子)により行った。 Fr. 1は、 LC/MS ESI-スペクトルにおいて、 m/z 1571(Μ·Η)および 1617 (Μ-Η)を与え (混合物)、それぞれオンジサポニン Βとポリガラサポニン XLIVと推定された。 Fr. 2は、 ESI- m/z 1673 (Μ·Η)を与え、ポリガラサポニン ΧΧΧΙ 図 3a、分子量 1675.80、分子式〇₇₉ 1₈0₃₈)と推定された。 Fr. 3は、 ESI- m/z 1817 (M-H)を与えた。 Fr. 4は、 ESI- m/z 1587を与え、オンジサポ二ン F (図 3b、分子量 1589.71、分子式 C^H O^)と推定され、さらに · NMR (図 4)により確認された（1H-NMR (500MHz) スペクトル：測定溶媒は重メタノール）。 Fr. 5は、 ESI- m/z 1731を与えた。

実施例 1と同様にして、オンジより精製された Fr. 1〜5の抗レプリコン活性および細胞毒性 (WS^8および Thd)を測定した。結果を図 5および表 1に示す (図中、 1. Fr.l、 2. Fr.2、 3. Fr. 3、 4. Fr. 4、 5. Fr. 5、 6. リバビリン（陽性対照））。表 1. オンジより精製された物質の抗 HCV活性および細胞毒性

~ I C _{5 0} (μΜ)

画分物質名抗 H C V活細胞毒性

性

1 オンジサポニン Β +ポリガラサポニン X 0.24 >6.2

L I V

2 ポリガラサポニン XX X I I 0.013 >6.0

3 オンジサポニン（構造不明） 0.25 >5.5

4 オンジサポニン F 0.17 >6.3

5 オンジサポニン（構造不明） 0.52 >5.8

Fr. 1〜5の ICso値は、それぞれ、 0.38, 0.021、 0.45、 0.27および 0.90 g/mL (0.24 0.013、 0.25、 0.17および 0.52 M)であった。これに対して、細胞毒性の IC₅₀値は WS 8法にて 10 g/mL以上であつた。 Fr. 2 は、 50%以上の増殖阻害にはいたらないものの、弱い細胞毒性が比較的低濃度より観測された。実施例 3

ウェスタンブロット解析によるオンジサポニンの HCV夕ンパク質合成阻害の測定

ウエスタン解析は以下の方法でおこなった。実施例 2で得られたオンジサポ二ン F (Fr. 4) を ΙΟ ηΜから ΙΟΟΟηΜの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、 5 %CO₂存在下、 37 :にて培養した。 72時間後に培地を捨て、 PBS

(Phosphate buffered saline Sigma cat. no. P3813)を加え、ピぺッティングにより細胞をはがし、遠心により細胞を回収した。 6穴プレートの細胞当たり 200 Lの CelLyticTM-M (Sigma cat. no. C2978)と 2 Lのプロテア一ゼィンヒビ夕 —カクテル（Sigma cat. no. P8340)を加え、室温で 15分間振とうした。遠心分離（15000回転、 15分間）後、上清のタンパク定量を Dye Reagent (nacalai tesque cat. no. 074-27)にておこなった（ゥシァグロブリン標準液、 BIO-RAD cat. no. 500 0005) 。得られたタンパク質 5 gを 9— 11%グラジェントゲル

(第一化学薬品 cat. no. 317552) でトリス—グリシン一 SDS緩衝液（BIO- RAD cat. no. 161-0772) を用いて電気泳動した。分子量サイズマーカ一は Rainbow molecular weight markers (AmershamBioscience cat. no.

RPN756) を用いた。電気泳動したタンパク質をミニトランスプロットセル (BIO-RAD cat. no. 170-3930) にてメンブレン（ImmobiloirFL、ミリポア cat. no. IPFL00010) に転写した。以下、ォデッセィ（ァロカ）のプロトコ一ルに従い、一次抗体に HCV夕ンパク質由来の抗 NS3ゥサギ抗体 (Nature chemical biology, 16 October 2005； doi:10.1038/nchembio742)を用いてウェスタン解析を行った。内部標準として抗ァクチンゥサギ抗体 (Cell SignaUng Tbchnology cat. no. 7074) 、二次抗体に抗ゥサギ I g G (Alexa680: A21074) を用い、ォデッセィで検出した。その結果、オンジサポニンによる HCVタンパク質合成の阻害の濃度依存性が確認された（図 6 ) 。各バンドの強度を定量し、 HCVタンパク質の発現を 50%減少させる薬剤濃度（IC50)を計算したところ、 55.4nMであった (図 7 ) 。実施例 4

ノザンブロット解析によるオンジサポニンの HCV RNA複製阻害活性の測定実施例 2で得られたオンジサポニン F (Fr. 4) を 12nMから ΙΟΟΟηΜの範囲でレプリコン細胞 Huh-3-lに与え、 5 %C0₂存在下、 37°Cにて培養した。 72時間後に細胞を回収し、全 RNAを抽出した後で、 Ambion社のノザンマックスキッ卜の方法に従い、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとしてノザン解析を行つた。

ノザン解析は以下のものを用いた。すなわち、 NorthernMax transfer buffer (Ambion cat. no. 8672), 転写膜（ォデッセィ cat. no. 926 - 10000)、ろ紙

(Sigma cat. no. P-6664) 、 ULTRAhyb (Ambion cat. no. 8670)。プローブの標識は Biotin-16-2'-deoxy-uridin-5'-triphosphate (Roche cat. no. 11 093 070 910)を用レて PCR (Gene Amp Core Re agents , Applie d Biosystems cat. no. N808-0009)にて行つた。 High Stringency buffer (Amibion cat. no. 8674)、 Blocking buffer ( 1 %SDS、 Aloka cat. no. ODY-927-40000) 、 Alexa Fluor 680 conjugate Streptavidin (ァロカ cat. no. S21378) 。

1 %ァガロースゲルで 1 gの 1 タル RNAを泳動し、泳動後ェチジゥムブ口ミドで RNAを染色して写真をとり、脱色後 NorthernMax transfer bufferを用いて転写膜に 2時間転写した。湿ったままの状態で UVクロスリンカ一にて RNAを転写膜に固定化した。ハイプリローターを用いて、 ULTRAhybにて 42 、 30分間の回転前処理の後、前処理液を捨て、上記 PCR法にて作製したピオチン化ネオマイシン耐性遺伝子と 10mLの ULTRAhyb液を加えて 42 で一夜振とう処理した。

ULTRAhyb液を捨て、 50°Cに保温した High Stringency bufferを 15mL加え 50°Cで 30分間振とうした。同様の操作をもう一度繰り返した。以下、ォデッセィ（ァロカ)のプロトコールに従い、 RNAのバンドを検出した (図 8 ) 。その結果、オンジサポニンによる HCV RNA複製の阻害の濃度依存性が確認された。各バンドの強度を定量し、 HCV RNAの複製を 50%減少させる薬剤濃度（IC50) を計算したところ、 59.6ΠΜであった (図 9 ) 。産業上の利用性

本発明の医薬組成物は、 C型肝炎ウィルス感染症、例えば、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化および肝癌の予防および Zまたは治療に有用である。

Claims

請求の範囲

1. ヒメハギ属の植物の抽出物を有効成分として含有する、 C型肝炎ウィルス感染症を予防または治療するための医薬組成物。

2. ヒメハギ属の植物の抽出物がオンジの抽出物またはセネガの抽出物である、請求項 1記載の医薬組成物。

3. ヒメハギ属の植物の抽出物がサポニンである、請求項 1または 2に記載の医薬組成物。

4. サポニンが、オンジサポニンまたはポリガラサポニンである、請求項 3記載の医薬組成物。

5. オンジサポニン B、ポリガラサポニン XLIV、ポリガラサポニン XXXII およびオンジサポニン Fからなる群より選択される化合物を有効成分として含有する、 C型肝炎ウィルス感染症を予防または治療するための医薬組成物。

6. 以下の式（I) ：

ぼ中、

R₂および R₃は、それぞれ独立して、糖、糖鎖または水素であり；

R₄、 R₅および R₆は、それぞれ独立して、一 H、一 OHまたは一 OR₇であり、ここで、 R₇は Ci_₆の直鎖または分枝鎖のアルキル基である]

の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を有効成分として含む、 C型肝炎ウイルス感染症を予防または治療するための医薬組成物。

7. 式（ I ) の化合物が、式：

で表される化合物である、請求項 6記載の医薬組成物。

8. C型肝炎ウィルス感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化および肝癌からなる群より選択される、請求項 1一 7のいずれかに記載の医薬組成物。

9. C型肝炎ウィルスに感染した患者にヒメハギ属の植物の抽出物を投与することを含む、 C型肝炎ウィルス感染症を予防または治療する方法。

10. C型肝炎ウィルスに感染した患者に以下の式（I) ：

[式中、

R₄、 R₅および R₆は、それぞれ独立して、 _H、 —OHまたは一〇R₇であり、ここで、 R₇はの直鎖または分枝鎖のアルキル基である] を投与することを含む、 C型肝炎ウィルス感染症を予防または治療する方法。

1 1. 式（ I ) の化合物が、式：

で表される化合物である、請求項 10記載の方法。

12. C型肝炎ウィルス感染症が、 C型肝炎、肝硬変、肝繊維化および肝癌からなる群より選択される、請求項 9に記載の方法。