CN108159126A - 瓜子金皂苷提取物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

瓜子金皂苷提取物在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了瓜子金皂苷提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。试验证明了瓜子金皂苷提取物能够明显抑制肿瘤细胞生长，从而发掘了瓜子金皂苷提取物新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

Description

瓜子金皂苷提取物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及瓜子金皂苷提取物的应用，尤其是涉及瓜子金皂苷提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
据美国癌症协会最新发布的报告可知，由于诊断及治疗手段的提高，1991年至今，癌症死亡率下降了23％，到2012年超过170万人免于死亡，但癌症依然是美国人主要死亡原因，预计2016年新增癌症患者4600例/天，死亡1600例/天。在我国，2012年全国恶性肿瘤发病率为264.85/10万，全国癌症死亡数218.7万例，白血病的发病率在各种肿瘤中占第九位。其中白血病新发人数与死亡人数约占到3％和4％，占儿童癌症的30％，已经成为儿童和青少年因癌死亡的主要原因之一。在世界各国中，欧洲和北美白血病的发病率最高，其死亡率为3.2-7.4/10万人口。亚洲和南美洲发病率较低，死亡率为2.8-4.5/10万人口，并以至少3-4万/年的速度增加。
瓜子金(PolygalajaponicaHoutt.)，又名辰砂草、来马回等，为远志科远志属植物。传统中医学理论中，瓜子金味苦；微辛；性平；归肺经。我国民间常用于治疗疟疾、百日咳、小儿惊风、小儿感冒、毒蛇咬伤、血栓炎等。瓜子金化学成分主要为皂苷、黄酮、占吨酮、多糖等。皂苷类化合物是瓜子金主要成分之一。到目前为止，国内外学者从远志属植物瓜子金中分离得到皂苷类化合物54个。这些皂苷类成分均为齐墩果烷型五环三萜皂苷，具有抗炎镇痛、抗抑郁等作用。国内文献中已经报道一些瓜子金皂苷的药理作用，但是，关于瓜子金皂苷的成分分析以及是否具有抗肿瘤作用却鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供瓜子金皂苷提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明涉及瓜子金皂苷提取物在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明涉及瓜子金皂苷提取物在制备抗肺癌药物中的应用。
本发明涉及瓜子金皂苷提取物在制备治疗白血病药物中的应用。
本发明涉及瓜子金皂苷提取物在制备抗宫颈癌药物中的应用。
本发明所述的瓜子金皂苷提取物中总皂苷含量为50.2％～60.6％。
本发明所述瓜子金皂苷提取物采用以下方法提取：取瓜子金药材粉碎后，加瓜子金药材5-7倍重量的50％乙醇，浸泡3-5h，回流提取1-2h，过滤，滤液备用，药渣再加入5-7倍重量的50％乙醇，回流提取1-2h，过滤，合并两次滤液，真空减压浓缩除去乙醇，所得提取液经HPD826大孔树脂柱分离纯化，干燥，得瓜子金皂苷提取物。
所述HPD826大孔树脂柱径高比为1:10。
所述分离纯化操作为：将提取液加水稀释至质量浓度为0.1g/mL后进行上样，上样速度为2.5-3.5BV/h，上样体积为1.5-2.5BV，然后用2.5-3.5BV离子水进行水洗，水洗流速为8.5-9.5BV/h，之后采用50％乙醇洗脱，洗脱用量为5.5-6.5BV，洗脱流速为8.5-9.5BV/h，收集洗脱液，获得纯化的瓜子金皂苷提取液。
本发明具有以下技术效果：
1.瓜子金皂苷提取物能够明显抑制肿瘤细胞生长，包括人肝癌细胞、人肺癌细胞、人白血病细胞、人宫颈癌细胞等。发掘了瓜子金皂苷提取物新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2.本发明提供的瓜子金皂苷提取物总皂苷含量高，为50.2％～60.6％，更能有效地发挥抑制肿瘤细胞生长的效果。
附图说明
图1为不同浓度的瓜子金皂苷提取物对人肝癌细胞HepG2存活率的影响。
图2为不同浓度的瓜子金皂苷提取物对人肺癌细胞A549存活率的影响。
图3为不同浓度的瓜子金皂苷提取物对人宫颈癌细胞Hela存活率的影响。
图4为不同浓度的瓜子金皂苷提取物对人白血病细胞Jurkat存活率的影响。
具体实施方案
下面结合具体实施方式，对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
以下使用试剂来源如下：DMEM细胞培养液(商品号：C11995500BT)、RPMI-1640细胞培养液(商品号：C11875500BT)、胎牛血清(商品号：10270-106)、双抗溶液：青链霉素(商品号：10378016)为美国Gibco公司产品；PBS溶液(商品号：SH30256.01)为Hyclone公司产品。
实施例1
取瓜子金10g，粉碎至过50目筛，加瓜子金药材6倍重量的50％乙醇，浸泡4h，回流提取1h，过滤，滤液备用。药渣再加入6倍重量的50％乙醇，回流提取1h，过滤，获得滤液。合并两次滤液，真空减压浓缩除去乙醇，得到瓜子金提取液。将瓜子金提取液加水稀释至质量浓度为0.1g/mL后上HPD826大孔树脂柱。HPD826大孔树脂柱径高比为1:10，上样速度为3BV/h，上样体积为2BV，然后采用3BV离子水进行水洗，水洗流速为9BV/h，之后采用50％乙醇洗脱，洗脱用量为6BV，洗脱流速为9BV/h，收集洗脱液，真空减压浓缩除去乙醇和水，冷冻干燥，得瓜子金皂苷提取物。
实施例2
取实施例1的瓜子金皂苷提取物以及冻存的人肝癌细胞HepG2，用DMEM细胞培养液，加入10％胎牛血清，以及0.2％双抗溶液配制成完全培养液进行培养。将冻存的人肝癌细胞HepG2细胞液于37℃水浴锅上复溶，1000rpm离心3min，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，将其加入培养瓶中。放进含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养一段时间。
待细胞贴壁生长达到细胞数目80％左右时，取出培养瓶，弃去上清液，加入PBS洗涤2-3遍，再加入1mL胰酶，消化至细胞变圆之后，加入2倍体积的完全培养液终止消化，并小心进行吹打。收集细胞液，离心，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，将其加入到培养瓶中。放进含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养一段时间。
待细胞贴壁生长达到细胞数目80％左右时，取出培养瓶，弃去上清液，加入PBS洗涤2-3遍，再加入1mL胰酶，消化至细胞变圆之后，加入2倍体积的完全培养液终止消化，并小心进行吹打。收集细胞液，离心，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，于计数板上计数。将细胞浓度调节至(1-10)×104个/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，放进培养箱中培养24h。
24h后，吸去每孔中的培养液，加入100μL瓜子金皂苷提取物溶液。瓜子金皂苷提取物溶液采用DMEM配制成不同浓度，每个浓度设置6个复孔。对照孔仅加DMEM。接着放进含5％CO2，温度为37℃的培养中培养24h。24h后，每孔加入10μLMTT溶液，摇匀，放进培养箱中培育4h。4h后，吸去每孔中的溶液，加入100μLDMSO溶解紫色晶体甲瓒，震荡10min后，放进酶标仪中，检测波长为570nm，测定每孔的吸光度值A。并按照如下公式计算抑制率。
存活率＝[(实验孔A-空白孔A)/(对照孔A-空白孔A)]100％
将细胞浓度及对应的抑制率输入到GraphPadPrism6软件中，计算得到IC50值为110.3μg/mL。下表为其吸光度值结果，下图为利用origin8软件，根据药物浓度对存活率作图，见图1。
实施例3
取实施例1的瓜子金皂苷提取物以及冻存的人肺癌细胞A549，用RPMI-1640细胞培养液，加入10％胎牛血清，以及0.2％双抗溶液配制成完全培养液进行培养。将人肺癌细胞A549细胞液于37℃水浴锅上复溶，1000rpm离心3min，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，将其加入到培养瓶中。放进含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养一段时间。
待细胞贴壁生长达到细胞数目80％左右时，取出培养瓶，弃去上清液，加入PBS洗涤2-3遍，再加入1mL胰酶，消化至细胞变圆之后，加入2倍体积的完全培养液终止消化，并小心进行吹打。收集细胞液，离心，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，将其加入到培养瓶中。放进含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养一段时间。
待细胞贴壁生长达到细胞数目80％左右时，取出培养瓶，弃去上清液，加入PBS洗涤2-3遍，再加入1mL胰酶，消化至细胞变圆之后，加入2倍体积的完全培养液终止消化，并小心进行吹打。收集细胞液，离心，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，于计数板上计数。将细胞浓度调节至(1-10)×104个/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，放进培养箱中培养24h。
24h后，吸去每孔中的培养液，加入100μL瓜子金皂苷提取物溶液。瓜子金皂苷提取物溶液采用RPMI-1640细胞培养液配制成不同浓度，每个浓度设置6个复孔。对照孔仅加RPMI-1640细胞培养液。接着放进含5％CO2，温度为37℃的培养中培养24h。24h后，每孔加入10μLMTT溶液，摇匀，放进培养箱中培育4h。4h后，吸去每孔中的溶液，加入100μLDMSO溶解紫色晶体甲瓒，震荡10min后，放进酶标仪中，检测波长为570nm，测定每孔的吸光度值A。并按照如下公式计算抑制率。
存活率＝[(实验孔A-空白孔A)/(对照孔A-空白孔A)]100％
将细胞浓度及对应的抑制率输入到GraphPadPrism6软件中，计算得到IC50值为71.05μg/mL。下表为其吸光度值结果，下图为利用origin8软件，根据药物浓度对存活率作图，见图2。
实施例4
取实施例1的瓜子金皂苷提取物以及冻存的人宫颈癌细胞Hela，用RPMI-1640细胞培养液，加入10％胎牛血清，以及0.2％双抗溶液配制成完全培养液进行培养。将人宫颈癌细胞Hela细胞液于37℃水浴锅上复溶，1000rpm离心3min，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，将其加入到培养瓶中。放进含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养一段时间。
待细胞贴壁生长达到细胞数目80％左右时，取出培养瓶，弃去上清液，加入PBS洗涤2-3遍，再加入1mL胰酶，消化至细胞变圆之后，加入2倍体积的完全培养液终止消化，并小心进行吹打。收集细胞液，离心，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，将其加入到培养瓶中。放进含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养一段时间。
待细胞贴壁生长达到细胞数目80％左右时，取出培养瓶，弃去上清液，加入PBS洗涤2-3遍，再加入1mL胰酶，消化至细胞变圆之后，加入2倍体积的完全培养液终止消化，并小心进行吹打。收集细胞液，离心，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，于计数板上计数。将细胞浓度调节至(1-10)×104个/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，放进培养箱中培养24h。
24h后，吸去每孔中的培养液，加入100μL瓜子金皂苷提取物溶液。瓜子金皂苷提取物溶液采用RPMI-1640细胞培养液配制成不同浓度，每个浓度设置6个复孔。对照孔仅加RPMI-1640细胞培养液。接着放进含5％CO2，温度为37℃的培养中培养24h。24h后，每孔加入10μLMTT溶液，摇匀，放进培养箱中培育4h。4h后，吸去每孔中的溶液，加入100μLDMSO溶解紫色晶体甲瓒，震荡10min后，放进酶标仪中，检测波长为570nm，测定每孔的吸光度值A。并按照如下公式计算抑制率。
存活率＝[(实验孔A-空白孔A)/(对照孔A-空白孔A)]100％
将细胞浓度及对应的抑制率输入到GraphPadPrism6软件中，计算得到IC50值为51.38μg/mL。下表为其吸光度值结果，下图为利用origin8软件，根据药物浓度对存活率作图，见图3。
实施例5
取实施例1的瓜子金皂苷提取物以及冻存的人白血病细胞Jurkat，用RPMI-1640细胞培养液，加入10％胎牛血清，以及1％双抗溶液配制成完全培养液进行培养。将人白血病细胞Jurkat细胞液于37℃水浴锅上复溶，1000rpm离心3min，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，将其加入到培养瓶中。放进含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养一段时间。
待细胞生长达到细胞数目80％左右时，取出培养瓶，收集细胞液，离心，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，将其加入到培养瓶中。放进含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养一段时间。
待细胞生长达到细胞数目80％左右时，取出培养瓶，收集细胞液，离心，弃去上清液，加入一定体积的完全培养液，吹打均匀，于计数板上计数。将细胞浓度调节至(5-10)×104个/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL，放进培养箱中培养24h。
24h后，每孔加入100μL瓜子金皂苷提取物溶液。瓜子金皂苷提取物溶液采用RPMI-1640细胞培养液配制成不同浓度，每个浓度设置6个复孔。对照孔仅加RPMI-1640细胞培养液。接着放进含5％CO2，温度为37℃的培养中培养24h。24h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，摇匀，放进培养箱中培育4h。4h后，取出96孔板，震荡10min后，放进酶标仪中，检测波长为450nm，测定每孔的吸光度值A。并按照如下公式计算抑制率。
存活率＝[(实验孔A-空白孔A)/(对照孔A-空白孔A)]100％
将细胞浓度及对应的抑制率输入到GraphPadPrism6软件中，计算得到IC50值为46.84μg/mL。下表为其吸光度值结果，下图为利用origin8软件，根据药物浓度对存活率作图，见图4。

Claims (9)

1.瓜子金皂苷提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.瓜子金皂苷提取物在制备抗肝癌药物中的应用。
3.瓜子金皂苷提取物在制备抗肺癌药物中的应用。
4.瓜子金皂苷提取物在制备治疗白血病药物中的应用。
5.瓜子金皂苷提取物在制备抗宫颈癌药物中的应用。
6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征是，所述瓜子金皂苷提取物中总皂苷含量为50.2％～60.6％。
7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征是，所述瓜子金皂苷提取物采用以下方法提取：取瓜子金药材粉碎后，加瓜子金药材5-7倍重量的50％乙醇，浸泡3-5h，回流提取1-2h，过滤，滤液备用，药渣再加入5-7倍重量的50％乙醇，回流提取1-2h，过滤，合并两次滤液，真空减压浓缩除去乙醇，所得提取液经HPD826大孔树脂柱分离纯化，干燥，得瓜子金皂苷提取物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述HPD826大孔树脂柱径高比为1:10。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述分离纯化操作为：所述提取液加水稀释至瓜子金质量浓度为0.1g/mL后进行上样，上样速度为2.5-3.5BV/h，上样体积为1.5-2.5BV，然后用2.5-3.5BV离子水进行水洗，水洗流速为8.5-9.5BV/h，之后采用50％乙醇洗脱，洗脱用量为5.5-6.5BV，洗脱流速为8.5-9.5BV/h，收集洗脱液，获得纯化的瓜子金皂苷提取液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2006046674A1 (ja) * 2004-10-25 2006-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ｃ型肝炎ウイルス感染症の予防および治療剤

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