WO2006046661A1 - インターロイキン－６阻害剤 - Google Patents

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WO2006046661A1
WO2006046661A1 PCT/JP2005/019820 JP2005019820W WO2006046661A1 WO 2006046661 A1 WO2006046661 A1 WO 2006046661A1 JP 2005019820 W JP2005019820 W JP 2005019820W WO 2006046661 A1 WO2006046661 A1 WO 2006046661A1
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region
seq
modified antibody
vector
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PCT/JP2005/019820
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David T. Curiel
Alexander Pereboev
Yasuo Adachi
Tadamitsu Kishimoto
Norihiro Nishimoto
Original Assignee
Osaka University
Uab Research Foundation
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Publication date
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
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    • C07K16/248—IL-6
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    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to a modified antibody.
  • Interleukin-6 is a cyto force-in also called B cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon 2.
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a secretory factor involved in the activation of vaginal lymphoid cells (Non-patent Document 1), and it may subsequently be a multifunctional site force-in that affects the functions of various cells. It became clear (Non-Patent Document 2). IL-6 has been reported to induce maturation of vaginal lymphoid cells (Non-patent Document 3).
  • IL-6 transmits its biological activity via two proteins on cells.
  • One is IL-6 receptor, a ligand-binding protein having a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Non-patent Document 4, Non-Patent Document 5).
  • IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly composed of the extracellular region in addition to a membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane.
  • Patent Document 1 describes various forms of anti-IL-6R antibodies, such as humanized anti-IL-6R antibodies and chimeric anti-IL-6R antibodies.
  • Patent Document 2 describes a therapeutic agent for rheumatoid arthritis and a synovial cell proliferation inhibitor containing IL-6 antagonist such as anti-IL-6R antibody as active ingredients.
  • Patent Document 3 describes treatment of diseases caused by IL-6 production such as plasmacytosis, hyperimmunoglobulinemia, anemia, nephritis, cachexia, rheumatism, Castleman's disease, and mesangial proliferative nephritis. Is described.
  • Patent Document 4 describes a sensitized T cell-related disease comprising an anti-IL-6R antibody as an active ingredient, such as multiple sclerosis, uveitis, chronic thyroiditis, delayed hypersensitivity, contact dermatitis, It describes preventive and therapeutic agents for atopic dermatitis.
  • Patent Document 4 describes a therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising an anti-IL-6R antibody as an active ingredient.
  • Patent Document 5 describes a therapeutic agent for Crohn's disease containing an anti-IL-6R antibody as an active ingredient.
  • Patent Document 6 describes a therapeutic agent for splenitis comprising an anti-IL-6R antibody as an active ingredient.
  • Patent Document 7 describes the treatment of psoriasis containing an anti-IL-6R antibody as an active ingredient. Treatments are listed.
  • Patent Document 8 describes a therapeutic agent for pediatric chronic arthritis comprising an anti-IL-6R antibody as an active ingredient.
  • Patent Document 1 W092 / 19759
  • Patent Document 2 ⁇ ⁇ ⁇ 96 / 11020
  • Patent Document 3 WO96 / 12503
  • Patent Document 4 W098 / 42377
  • Patent Document 5 WO99 / 47170
  • Patent Document 6 WO00 / 10607
  • Patent Document 7 WO02 / 34292
  • Patent Document 8 WO02 / 080969
  • Non-patent literature l Hirano, T. et al, Nature (1986) 324, 73-76
  • Non-Patent Document 2 Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78
  • Non-Patent Document 3 Lotz, M. et al "J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258
  • Non-Patent Document 4 Taga, T. et al "J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
  • Non-Patent Document 5 Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
  • anti-IL-6 receptor antibodies are effective in the treatment of rheumatoid arthritis (chronic rheumatoid arthritis) and Castleman's disease.
  • the inventors of the present application have filed a patent application for a therapeutic agent for mesothelioma such as pleural mesothelioma containing anti-IL-6R antibody as an active ingredient (WO2005 / 037315).
  • the present inventors have filed a patent application for a therapeutic agent for vasculitis such as nodular polyarteritis, aortitis syndrome and vasculitis associated with immune abnormalities, which is an active ingredient of anti-IL-6R antibody.
  • WO2005 / 061000 since the therapeutic costs of antibody drugs are generally high, it is very important to develop a vector that efficiently expresses anti-IL-6 receptor antibody (IL-6 inhibitor). It becomes.
  • H chain and L chain of the antibody are encoded by two separate genes, even if the gene is introduced into the target cell by incorporating it into a virus vector or the like, It is considered difficult to express and secrete effective therapeutic agents. It is an object of the present invention to provide a modified antibody that enables efficient expression of an anti-IL-6 receptor antibody useful as an IL-6 inhibitor, a vector that expresses the antibody, a method for producing the same, and use thereof. To do.
  • the present inventors tried to modify the structure of an antibody in order to enable efficient expression of an anti-IL-6 receptor antibody.
  • a structure that has an inhibitory action on anti-IL-6 receptor and can be efficiently produced scFv containing the H chain V region and L chain V region of anti-IL 6 receptor antibody and human immunity
  • the present invention has been completed by finding that a structure in which a globulin IgG Fc portion is joined is useful. That is, the present invention provides the following modified antibodies, vectors that express them, and methods for producing them and uses.
  • CDR power consisting of the following amino acid sequences shown below: sc Fv containing the H chain V region and the L chain V region of an anti-IL 6 receptor antibody incorporated into the human immunoglobulin framework Modified antibody bound to the IgG Fc portion.
  • a method for producing a pharmaceutical composition comprising a step of blending the modified antibody according to any one of [1] to [7] with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • [17] A transformant capable of expressing the polynucleotide according to any one of [15] or a vector containing the polynucleotide.
  • a method for producing a modified antibody comprising a step of culturing the transformant according to [17] and recovering the modified antibody accumulated in the culture.
  • [21] [1] the modified antibody according to any one of [7], [10] one of the polynucleotide according to [15], [10] any of the polynucleotide according to [15] A vector that retains the expression of the antibody, and a step of administering any one component selected from the group consisting of a cell that produces the modified antibody according to any one of (1) and (7).
  • Method for inhibiting interleukin-6 receptor Method for inhibiting interleukin-6 receptor.
  • [22] [10] A gene therapy vector retaining the polynucleotide according to any one of [15] so that it can be expressed in human cells.
  • a method for treating a disease caused by the action of interleukin 6 comprising the following steps.
  • kits for treating a disease caused by the action of interleukin 6, comprising the following elements:
  • FIG. 1 shows a pShuttle plasmid incorporating SV40 late poly A signal.
  • FIG. 2 shows a subclone to the BamHI site of pBluescript II of human immunoglobulin IgG1.
  • FIG. 3 shows an IL-6 inhibitor (modified antibody) expression shuttle vector.
  • FIG. 4 shows IL-6 signal blocker candidates derived from humanized anti-IL-6 receptor antibodies.
  • FIG. 5 is a graph showing the affinity of the modified antibody of the present invention by comparison with a humanized anti-IL-6 receptor antibody.
  • the horizontal axis shows the concentrations of the modified antibody of the present invention, humanized anti-IL-6 receptor antibody, and control IgG reacted.
  • FIG. 6 is a graph showing the ability of the modified antibody of the present invention to inhibit receptor binding of IL-6.
  • the horizontal axis shows the concentration of the modified antibody of the present invention and the humanized anti-IL-6 receptor antibody reacted.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of inhibiting the growth of KT-3 cells by the modified antibody of the present invention.
  • the horizontal axis shows the concentrations of the modified antibody of the present invention, humanized anti-IL-6 receptor antibody, and control IgG reacted.
  • FIG. 8 is a graph showing the inhibitory effect of VEGF production enhancing action by IL-6 and SIL-6R stimulation in malignant pleural mesothelioma by the modified antibody of the present invention.
  • the vertical axis shows the concentration of VEGF.
  • FIG. 9 A diagram showing the arrangement of elements constituting the construct and the base sequence connecting the elements.
  • FIG. 10 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) of scFv encoded by SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 10. Italics indicate part of the linker.
  • the present invention provides an IL-6 inhibitor suitable for gene therapy by modifying an anti-IL-6 receptor antibody into a protein encoded by a single gene suitable for gene transfer using an adenovirus vector or the like. This is the issue.
  • the present invention provides a single gene-encoded anti-IL-6 capable of efficiently producing an anti-IL-6 receptor antibody by expressing the same amount of antibody H and L chains.
  • Receptor antibodies are provided. That is, the present invention relates to scFv and human immunoglobulin, each comprising the CDRs comprising the amino acid sequences shown below and comprising the H chain V region and the L chain V region of an anti-IL-6 receptor antibody incorporated into a human immunoglobulin framework.
  • the present invention relates to a modified antibody containing IgG Fc.
  • the modified antibody of the present invention is constructed by binding an s cFv containing an H chain V region and an L chain V region of an anti-IL-6 receptor antibody to a human immunoglobulin IgG Fc portion.
  • scFv is called single chain antibody (single chain variable fragments).
  • the scFv or scFv rod fragment contains the VH and VL regions of the antibody. These regions are present in a single polypeptide chain (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883).
  • the scFv polypeptide further comprises polypeptide polypeptide between the V and V regions.
  • scFv can form the structure required for antigen binding by a linker (for a review of scFv, see Pluckthun “The Pharmacology of Monoclonal Anti bodies” Vol.ll3 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 1994)).
  • the amino acid sequence of the linker constituting scFv is not limited as long as the binding characteristics as an antibody are maintained when the variable regions of the H chain and L chain are linked to a single chain.
  • linkers include (GS) (GGRASX GS) or (GS). Are known.
  • the order of linking the H chain V region and the L chain V region in scFv is not limited as long as the binding properties as an antibody are maintained. Specifically, scFv bound in the order of [H chain V region]-[linker]-[L chain V region] in the order of the N-terminal chain is preferred as the scFv of the present invention. That is, a preferred modified antibody in the present invention is constituted by a single-chain polypeptide having the following structure.
  • the Fc of IgG is not limited as long as it is Fc derived from human IgG. That is, any Fc of C ⁇ 1 to C ⁇ 4 can be used as the Fc constituting the modified antibody of the present invention.
  • the Fc region of human IgG is composed of approximately 330 amino acids on the C-terminal side of IgG.
  • the Fc constituting the modified antibody of the present invention can be accompanied by amino acid sequence substitution, deletion, insertion, or addition as long as the IL-6 receptor agonist activity of the modified antibody can be maintained.
  • a minibody containing CH3 as Fc can maintain the function of the Fc region (Hu, S. et al. Cancer Res 56: 3055-3061, 1996).
  • the minibody has a structure in which CH3 is linked to scFv. That is, an immunoglobulin molecule lacking CH1 and CH2 and consisting only of scFv and CH3 is included in the present invention.
  • the modified antibody of the present invention also includes an immunoglobulin having an essential structure of scFv and CH3, and optionally further containing any region selected from CH1, hinge, and CH2, or a partial sequence thereof. .
  • the present invention includes the following components (1) to (4), and a single-chain polypeptide in which these elements are arranged over the N-terminal force C-terminal, and a polynucleotide encoding the same. provide.
  • the H chain V region has anti-IL-6 receptor in which CDR1 to CDR3 consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 4 are incorporated in the framework of human immunoglobulin.
  • This is the H chain V region of the antibody.
  • the L chain V region is the L chain V region of an anti-IL-6 receptor antibody in which CDR1 to CDR3 consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 8 are incorporated in the framework of human immunoglobulin. is there.
  • the modified antibody of the present invention contains scFv and Fc.
  • any Fc derived from human immunoglobulin can be used.
  • Preferred Fc is Fc derived from human IgG. More specifically, for example, Fc of IgG1 can be used as Fc constituting the modified antibody of the present invention. Methods for isolating DNA encoding Fc are known. Alternatively, an already cloned Fc gene can also be used in the present invention.
  • the Fc portion of the H chain gene of the humanized anti-IL-6 receptor antibody described in Patent Document 1 pdCs-Fc-X expression vector (Protein Engineering vol.ll.pp495-500, 1998)
  • An Fc fusion type soluble protein gene can be used as the Fc gene in the present invention.
  • the modified antibody of the present invention is preferably a homodimer in which two molecules of a single-chain polypeptide are linked by an SS bond.
  • Natural immunoglobulins are usually composed of heterodimers in which the H and L chains are cross-linked by SS bonds. This heterodimer corresponds to the single-chain polypeptide constituting the above-described modified antibody of the present invention.
  • IgG has two of these structural units. Heterodimers are also cross-linked by SS bonds. Therefore, also in the modified antibody of the present invention, the structure of natural IgG can be simulated by cross-linking single-chain polypeptides, which are the structural units, by means of SS bonds and dimerizing them.
  • the SS bond for dimerization can be constituted by crosslinking any cysteine (C) of a single-chain polypeptide. Preferred for cross-linking! /, Or C located at the hinge. More specifically, a homodimer cross-linked between C located between CH1 and CH2 by an SS bond is preferable as the modified antibody of the present invention.
  • Polypeptides can be cross-linked by SS bonds when placed in acidic conditions. Alternatively, in the case of a modified antibody lacking a hinge, it can also be dimerized by a hydrophobic interaction between CH3.
  • the hinge region In natural IgG, it exists in the hinge region to form a heterodimer. Rustine (C) is used. However, in the present invention, the variable region is composed of a single-stranded s cFv and does not require a cysteine (C) for VL binding. Thus, the cysteine (C) located in the hinge can be replaced with another amino acid. For example, in the embodiment, the cysteine (C) force serine (S) in the hinge region is substituted.
  • variable region of the anti-IL 6 receptor antibody constituting scFv in the present invention constitutes the heavy chain (H chain) and light chain (L chain) of the mouse monoclonal antibody (PM-1) against IL 6 receptor. It has a structure in which the complementarity determining region (CDR) in the variable region (V region) is replaced with the corresponding CDR region of the human antibody V region.
  • CDR complementarity determining region
  • the amino acid sequence of CDR of the L chain V region of the mouse anti-IL-6 receptor antibody is shown in CDR1, CDR2 and CDR3 in the row of VPM-1 in Table 2 of Patent Document 1.
  • the binding property of an antibody to an antigen is determined by a complementarity-determining region (CDR). Therefore, the antigen-binding characteristics of the mouse monoclonal antibody PM-1 can be reconstructed by transplanting the CDR into an arbitrary framework.
  • CDRs from murine immunoglobulins can be transplanted into the human immunoglobulin framework.
  • Immunoglobulins reconstituted based on such a strategy are called reshaped human antibodies.
  • a reshaped human antibody is a modified antibody also referred to as a humanized antibody.
  • Reshaped human antibodies are constructed by grafting CDRs of antibodies from immunized animals onto CDRs of human immunoglobulins. The general gene recombination technique is also known.
  • CDR comprises a base sequence encoding the CDR of a mouse antibody and at its 3 'end
  • CDR can be replaced by using a primer containing a base sequence complementary to the framework region (FR) of a human antibody.
  • FR framework region
  • Each mouse CDR is used in a PCR method in combination with a primer that anneals to the FR adjacent to the synthetic primer linked to the base sequence of human FR.
  • PCR is carried out using such a primer set and a human variable region gene as a saddle type, a DNA having a mouse base sequence as a CDR and a human base FR base sequence linked is amplified. It is designed so that the end parts of the amplified products of each CDR overlap.
  • the framework of the human immunoglobulin in the present invention is not limited.
  • the framework region (FR) of the L chain V region of the humanized IL 6 receptor antibody is preferably derived from the human antibody REI.
  • the amino acid sequence of FR derived from human antibody REI is described in FR1, FR2, FR3 and FR4 in the REI row of Table 2 of Patent Document 1.
  • the framework region (FR) of the H chain V region of the humanized IL6 receptor antibody is preferably derived from the human antibody NEW.
  • the amino acid sequence of FR of human antibody NEW is described in FR1, FR2, FR3 and FR4 in the NEW row of Table 3 of Patent Document 1.
  • the FR region may be variously modified in order to improve antigen binding and neutralizing activity.
  • the framework regions of the variable region of an antibody can be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen binding site (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 0
  • the humanized IL 6 receptor antibody used in the present application is RV a (version a) in Table 2 of Patent Document 1,
  • RV a version a
  • RV f (version f) in Table 3 of Patent Document 1 is preferable.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be shown.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 can be shown.
  • a polynucleotide encoding a single-stranded polypeptide having such a structure for example, a polynucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 10 can be shown.
  • the amino acid sequence of scFv encoded by SEQ ID NO: 10 is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the linker moieties in SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 are positions 355-414 and 119-138, respectively. A portion of the linker is shown in italics in FIG. Therefore, the amino acid sequence powers corresponding to positions 1 to 18, position 119—138, and position 139 to position 246 in SEQ ID NO: 11 are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 2, respectively. is there.
  • the polynucleotide of the present invention can be used for expression of a modified antibody by using an appropriate expression vector.
  • a polynucleotide encoding a leader sequence secretion signal
  • the leader sequence is usually added to the N-terminus of [H chain V region].
  • the leader sequence of the HgG ⁇ chain shown in FIG. 9 can be used as the leader sequence.
  • the vector any vector capable of expressing an immunoglobulin or a variant thereof can be used.
  • the vector contains a leader sequence.
  • an expression vector that secretes the desired modified antibody in animal cells can be constructed by linking the polynucleotide of the present invention to the leader sequence of the vector.
  • animal cells for expressing immunoglobulin tumor cells such as COS cells, CHO cells, or malignant pleural mesothelioma cells can be used.
  • a promoter usually used for expression in animal cells can be used.
  • human cytomegalovirus immediat e early; HCMV human cytomegalovirus immediat e early
  • HCMV human cytomegalovirus immediat e early
  • Expression vectors containing HCMV promoter include HCMV-VH—HC y 1, HCMV—VL—HCK, HCMV—12h—g ⁇ 1, HCMV-12 ⁇ -g K, etc., derived from pSV2neo Can show.
  • HEF-1 ⁇ human 'erongation' factor 1a
  • Expression vectors containing this promoter include HEF-12h-g y 1 and HEF-12k-g ⁇ , and HEF-VH-1 and HEF-VL-g ⁇ .
  • the expression vector may further contain a dhfr gene.
  • dhfr gene examples include DHFR-AE-PMh-gy1, DHFR- ⁇ -RVh-PM1-f, and the like.
  • the present invention also provides a vector comprising the polynucleotide of the present invention.
  • the present invention relates to a transformant carrying the polynucleotide of the present invention or a vector containing the polynucleotide so that it can be expressed.
  • the modified antibody of the present invention can be produced by culturing the transformant based on the present invention and collecting the modified antibody of the present invention that accumulates in the culture.
  • the transformant of the present invention can be administered to a patient.
  • the host cell of the transformant is preferably a human cell. More preferably it is the patient's own cells to be administered.
  • peripheral blood lymphocytes can be used as the cells.
  • the mouse monoclonal antibody PM-1 has already been proved to be useful as a human IL 6 receptor inhibitor. Therefore, the modified antibody of the present invention having the antigen-binding property is effective as an IL 6 receptor inhibitor. It is also known that inhibitors of IL 6 receptor have therapeutic effects on various diseases. For example, any of the diseases shown below can be expected to have a therapeutic effect by inhibiting IL 6 receptor.
  • Patent Document 2 Rheumatoid arthritis
  • Plasmacytosis hyperimmunoglobulinemia, anemia, nephritis, cachexia, rheumatism, Castleman's disease, mesangial proliferative nephritis (Patent Document 3)
  • Sensitization T cell-related diseases such as multiple sclerosis, uveitis, chronic thyroiditis, delayed hypersensitivity, contact dermatitis, atopic dermatitis (Patent Document 4)
  • Sensitization T cell-related diseases such as multiple sclerosis, uveitis, chronic thyroiditis, delayed hypersensitivity, contact dermatitis, atopic dermatitis (Patent Document 4)
  • Systemic lupus erythematosus Patent Document 4
  • Patent Document 5 discloses a Crohn's disease
  • Patent Document 7 Psoriasis
  • Patent Document 8 Pediatric chronic arthritis
  • the modified antibody of the present invention is useful as a therapeutic agent for these diseases.
  • the modified antibody of the present invention can be made into a pharmaceutical composition by blending with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention relates to the production of a pharmaceutical composition comprising a step of blending these modified antibodies with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention further relates to the use of the modified antibodies of the invention in the manufacture of pharmaceutical compositions for treating these diseases.
  • the present invention is selected from the group consisting of the modified antibody of the present invention, a polynucleotide encoding the same, a vector retaining these polynucleotides so that they can be expressed, and a cell producing the modified antibody of the present invention.
  • an intermouth 6 receptor inhibitor containing any one of the ingredients as an active ingredient.
  • the present invention may be any one selected from the modified antibody of the present invention, the polynucleotide encoding the same, the vector retaining these polynucleotides so that they can be expressed, and the group power that produces the modified antibody of the present invention.
  • the present invention relates to a method for inhibiting interleukin-6 receptor, which comprises the step of administering these components to a patient.
  • the present invention has been selected from the group antibody consisting of the modified antibody of the present invention, a polynucleotide encoding the same, a vector capable of expressing these polynucleotides so that they can be expressed, and a cell producing the modified antibody of the present invention. It relates to the use of any component in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating these diseases.
  • the present invention provides a modified antibody of the present invention, a polynucleotide encoding the same, a vector capable of expressing these polynucleotides, and a cell force that produces the modified antibody of the present invention. The component relates to use in the treatment of these diseases.
  • a pharmaceutical composition containing the modified antibody of the present invention used as an active ingredient for therapeutic or prophylactic purposes, if necessary, is a suitable pharmaceutically acceptable carrier, medium, etc. that is inert to them. And can be formulated. For example, sterilized water, physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffers (phosphoric acid, citrate, other organic acids, etc.) , Preservatives, surfactants (PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • polypeptides such as serum albumin, gelatin and immune globulin, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine, saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides, mannitol and sorbitol Sugar alcohols such as In the case of an aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride sodium salt. It may be used in combination with a suitable solubilizer such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50), etc. .
  • solubilizer such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO
  • the modified antibody of the present invention may be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly (tylmethacrylic acid)) or colloidal drug delivery systems (ribosomes, albumin microspheres, Microemulsions, nanoparticles, nanocapsules, etc.) (see “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition”, Oslo Ed. (1980), etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the modified antibody of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 1 67-277 (1981) Langer, chem. Tech. 12: 98-105 (1982); US Patent 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983) ; EP 133, 988).
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly (t
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is determined appropriately depending on the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptom, degree of progression, etc. It is determined. In general, for adults, 0.1 to 2000 mg per day can be orally administered in 1 to several divided doses. More preferred is 1 to 1000 mgZ days, even more preferred is 50 to 500 mgZ days, and most preferred is 100 to 300 mgZ days. These doses vary depending on the patient's weight, age, administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select appropriate doses. The administration period is also preferably determined appropriately according to the patient's healing progress and the like.
  • the modified antibody Based on the present invention, the modified antibody, a polynucleotide encoding the same, a vector retaining these polynucleotides so that they can be expressed, and a cell producing the modified antibody of the present invention are selected.
  • a medicine containing a pharmaceutically acceptable carrier A pharmaceutical package is provided comprising a pharmaceutical composition and instructions describing that the pharmaceutical composition is used for the treatment of the disease.
  • the instructions can describe the applicable disease of the pharmaceutical composition, dosage, administration schedule, contraindications, storage conditions of the pharmaceutical composition, expiration date, and the like.
  • Gene therapy can also be performed by incorporating a gene encoding the modified antibody of the present invention into a gene therapy vector.
  • administration methods in addition to direct administration with naked plasmids, the ability to package into ribosomes, etc.
  • the antibody may be administered by any method as long as the antibody is expressed in vivo and can exert its action.
  • a suitable non-P route intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, adipose tissue, intramammary tissue, injection, infusion, or gas-inducible particles via inhalation or intramuscular route.
  • Sufficient doses are administered by the impact method (using an electron gun, etc., or via a mucosal route such as an nasal drug).
  • a gene encoding the modified antibody of the present invention may be administered.
  • the modified antibody of the present invention is advantageous particularly when applied to gene therapy.
  • antibody drugs including IgG are considered to be difficult to apply to gene therapy because they have multimeric structures. This is because it is difficult at present to make the expression product of a gene therapy vector into a multimeric structure similar to a natural antibody.
  • the modified antibody of the present invention can be expressed as a single-chain polypeptide. Therefore, even in the state of the art for gene therapy as currently attempted, the target protein (modified antibody) can be expressed in a state having activity as an antibody.
  • the dimer is Composed by modimers. Homodimers composed of the same molecules can be reproduced much more easily than when dimerization between different polypeptides, such as heavy and light chains, is achieved with genetically modified organisms. it can.
  • each subunit constituting the heterodimer is present in a necessary amount.
  • a subunit expressed more than the other cannot form a heterodimer without a partner subunit.
  • the expressed subunit can be almost completely a homodimer. Therefore, the target homodimer can be efficiently produced even under conditions where the expression level is not highly controlled.
  • the modified antibody of the present invention is suitable for gene therapy.
  • the present invention provides a gene therapy vector that retains a polynucleotide encoding the modified antibody of the present invention so that it can be expressed in human cells.
  • the vector for gene therapy of the present invention holds a polynucleotide encoding the modified antibody, and can express the modified antibody in a human cell by introduction into a human cell or infection.
  • Introduction of a gene therapy vector into a human cell includes introduction of the gene therapy vector into a human cell by an artificial transformation step.
  • the vector can be introduced into human cells using a transformation reagent such as lipofucamine.
  • gene therapy vectors that can autonomously establish human cell infection without the aid of a transformation reagent are also known.
  • a viral vector such as an adenovirus vector, an adeno-associated wineres vector, a retrowinores betater, an HIV vector, a vaccinia winores betater, or a Sendai virus (HVJ) vector is a vector capable of infecting human cells.
  • HVJ Sendai virus
  • an adenovirus vector such as pAdexlcw or a retrovirus vector such as pZIPneo is known.
  • a DNA encoding the modified antibody of the present invention into a vector can be incorporated into a viral vector by general genetic manipulation (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • an adenovirus vector expressing a modified antibody based on the present invention can be constructed by the following operation. Many of the adenoviral vectors currently produced are based on serotype 5 or serotype 2. Ad r virus El r egion is an essential site for replication growth, and non-replicating adenovirus can be produced by replacing it with the target gene.
  • the adenovirus vector is prepared using human kidney cell 293 or the like. In order to produce the target vector, it is necessary to produce 36 Kb of linear DNA.
  • the modified antibody In order to secrete the expressed modified antibody out of the cell, the modified antibody usually has a secretion signal.
  • Any promoter that has transcriptional activity in human cells can be used as the promoter that controls the expression of the gene encoding the modified antibody.
  • a controllable promoter such as tet
  • the expression level of the modified antibody can be controlled by administration of tetracycline.
  • an enhancer In order to maintain the expression level of the modified antibody, it is preferable to use an enhancer.
  • the gene therapy vector of the present invention can be administered to a human by any method.
  • cells into which a vector has been introduced in vitro can be administered to a patient (ex vivo). It is desirable that the cell is a cell collected by the patient himself. Cells collected from patients can also be cultured and expanded in vitro. Examples of cells that can be easily collected from patients include blood cells. Peripheral blood lymphocytes are preferred as cells for introducing gene therapy vectors, for example.
  • the gene therapy vector when a gene therapy vector has the ability to infect cells even in a living body, the gene therapy vector can be directly administered to a patient (in vivo). Specifically, subcutaneous, blood, intrathoracic, intraperitoneal, intrathecal, intramuscular, intraarticular, intranasal, or transdermal administration is possible.
  • kits for treating a disease caused by the action of interleukin 6, comprising the following elements.
  • a reagent for introducing a vector for example, lipofectin-lipofectamine (both are trade names of Invitrogen, registered trademark) can be used.
  • a reagent for separating peripheral blood lymphocytes an antibody that recognizes a marker for identifying lymphocytes can be used.
  • Antibodies can bind to fluorescent dyes or magnetic particles. CD34 and the like are known as lymphocyte markers.
  • the kit for gene therapy according to the present invention may further include instructions. It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • Human embryonic kidney 293 cells were purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). 293 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (D MEM) containing 10% ushi fetal serum (FCS). Rennel lymphoma-derived T cells (KT-3) (Shimizu S et al., Blood 19 88; 72: 1826-1828) were treated with 10% FCS and 4 ng / ml recombinant IL-6 (Ajinomoto Co., Inc. ., Kawasaki, Japan) was maintained in RPMI 1640 medium supplemented.
  • D MEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FCS ushi fetal serum
  • KT-3 Rennel lymphoma-derived T cells
  • 4 ng / ml recombinant IL-6 was maintained in RPMI 1640 medium supplemented.
  • sIL-6R Recombinant soluble IL-6R
  • Chugai Pharmaceutical Co., LTD Roche Group, Shizuoka, Japan
  • Other supplements and cell culture media were purchased from Mediatech-Cellgro (Kan sas City, MO). All restriction enzymes were purchased from New England Biolabs (Beverly, MA), T4 DNA ligase was purchased from Promega (Madison, Wis.), And Taq polymerase and PCR reagents were purchased from QIAGEN (Valencia, CA).
  • VH and VL nucleotide sequences were amplified by PCR from separate cDNAs encoding the heavy and light chains of humanized IL-6 receptor antibody (Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the first PCR primer for amplification was designed using the usual canonical Fv boundary definition.
  • VH and VL gene fragments Linked together by overlap extension PCR method, a 20 amino acid linker (GS) (G) (G)
  • a DNA segment encoding GRAS) (GS) was introduced.
  • GS GRAS
  • ⁇ bacterial expression vector (GS) was introduced.
  • the Nco I and Not I restriction enzyme sites are introduced correspondingly at the 5 'and 3' ends of the final DNA encoding scFv, and anti-IL-6 Receptor human antibody antibody ⁇ ⁇ / scFv was prepared.
  • scFv in a eukaryotic expression system, the DNA sequence encoding scFv is amplified by PCR with a c-Myc tag and 6 histidines (present in ⁇ ), and Sna BI was introduced at the 5 'end and Avr I was introduced into the 3' end and cloned into a pPIC9 yeast expression plasmid (Invitrogen, Carlsbad, CA) to produce the anti-IL-6 receptor humanized antibody pPIC9 / scFv. . Assembly of Fc / anti-IL-6 receptor humanized antibody coding DNA was performed as follows.
  • the human immunoglobulin gamma-1 gene hinge CH2 and CH3 domains are amplified by PCR from the humanized IL-6 receptor antibody heavy chain cDNA and subjected to cystine strength.
  • the amino acid substitution to serine was introduced at one position in the hinge region.
  • the cysteine residues usually form a disulfide bond with the light chain.
  • the Fc gene fragment was cloned into the pSecTag2a vector (Invitrogen) so as to be in frame with the mouse Ig kappa chain V-J2-C signal peptide sequence.
  • Anti-IL-6 receptor humanized antibody scFv gene is amplified by PCR and cloned in-frame with leader / Fc to produce anti-IL-6 receptor human antibody antibody pSecTag / Fc / scFv did.
  • FIG. IB An SV40 late polyA signal derived from pGL3basic Vector (Promega) was incorporated into a multiple cloning site of pShuttle plasmid (Stratagene, La Jola, CA).
  • FIG. 2A The C terminus was subcloned into the BamHI site of pBluescript II from the H chain hinge site of human immunoglobulin IgG1.
  • a restriction enzyme Spel site was provided at the N-terminus of the hinge.
  • cytomegalovirus at the KpnI to XhoI sites of pBluescript II The Shunhanser Z promoter region (CMV) was inserted.
  • FIG. 3A A CMV-multiple cloning site-hinge-Fc fragment was excised from the above plasmid and inserted into the KpnI to XbaI sites of the plasmid of FIG. 1B.
  • EcoRV and Spel sites are unique sites, and it is possible to create a fusion protein of the gene and Fc by incorporating other genes into the site.
  • the scFv part was excised from pShuttle / CMV / Fc / scFv of the above humanized anti-IL-6 receptor antibody and inserted into EcoR V to SpeI sites to complete an IL-6 inhibitor (modified antibody) expression shuttle vector. .
  • an AdEasy adenovirus vector system (Stratagene) was used according to the instructions.
  • the IL-6 inhibitor expression shuttle vector was co-transferred into E. coli BJ5183 together with the pAdEasy-1 plasmid to achieve homologous recombination.
  • Viral genomes were recovered from the cells and the presence of IL-6 inhibitor DNA was confirmed by restriction digestion and PCR with insert-specific primers.
  • Recombinant Ad virus genome was tranfected into 293 cells, and recombinant Ad5 / IL-6 inhibitor was rescued to produce a large amount and purified with cesium chloride.
  • Viral particle titer was determined by the method of Maizel et al. By spectroscopic altitude method using a conversion factor of 1.1 x 10 12 viral particles (vp) per absorbance unit at 260 nm.
  • Ad5 / IL-6 inhibitors were used as expression systems.
  • 293 cells were infected with Ad5 / IL-6 inhibitor at an infection efficiency (MOI) of 100 v.p./cell.
  • MOI infection efficiency
  • the medium was changed.
  • the culture supernatant was collected, and an equal amount of cold saturated ammonium sulfate was added to precipitate the protein.
  • the precipitate was collected by centrifugation, dissolved in 1/20 of the original culture volume in phosphate buffered saline (PBS), and dialyzed against PBS.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the modified antibody gene of the present invention was incorporated into a non-proliferating adenovirus, and a vector in which the modified antibody of the present invention was expressed under the cytomegalo promoter was prepared.
  • a vector in which the modified antibody of the present invention was expressed under the cytomegalo promoter was prepared.
  • Various human cells were infected with this modified antibody-expressing adenovirus (Ad CMV) of the present invention, the supernatant was collected, and the modified antibody of the present invention was purified using a protein A column.
  • the affinity of the modified antibody of the present invention for IL-6 receptor was examined.
  • a 96-well ELISA plate was first coated with MT-18 that recognizes the IL-6 receptor. It has been proved that the MT-6 receptor recognition site of MT-18 is different from the humanized anti-IL-6 receptor antibody and does not compete with the humanized anti-IL-6 receptor antibody.
  • the MT-18 coating concentration was 5 ⁇ g / ml of a solution of 100 1 per lwell. Thereafter, it was washed with Tris buffered saline (TBS) and blocked with 6% bovine serum albumin. After blocking, soluble IL-6 receptor (sIL-6R) was reacted and immobilized on an ELISA plate.
  • TBS Tris buffered saline
  • sIL-6R soluble IL-6 receptor
  • the concentration of SIL-6R was 100 1 reaction per lwell of a 100 ng / ml solution. Thereafter, various concentrations of the modified antibody of the present invention, humanized anti-IL-6 receptor antibody, and control IgG were reacted. Use HRP conjugated ant l—Fc fragment F (ab) 2 (Dako) as the secondary antibody. IiOPD peroxidase substrate (Sigma) was used for color development.
  • the horizontal axis represents the concentrations of the modified antibody of the present invention, humanized anti-IL-6 receptor antibody, and control IgG reacted. As is clear from this, the modified antibody of the present invention was not inferior in binding ability to the IL-6 receptor compared to the humanized anti-IL-6 receptor antibody.
  • IL-6 of the modified antibody of the present invention Receptor binding inhibition ability is humanized anti-IL-6 receptor It was comparable to body antibody.
  • FIG. 7 Using lymphoma KT-3 showing IL-6-dependent proliferation, it was examined whether the modified antibody of the present invention could actually block IL-6 stimulation in a cell biological manner.
  • the cell concentration of KT3 was 10,000 cells / well, and 96 wells were used.
  • Various concentrations of the modified antibody of the present invention, human anti-IL-6 receptor antibody or control Ig G were administered to KT-3 cultured at an IL-6 concentration of 500 pg / ml. After culturing for 5 days, MTS assembly was performed.
  • Figure 7 shows the results. The antiproliferative effect on KT-3 was comparable to that of the humanized anti-IL-6 receptor antibody.
  • FIG. 8 Malignant pleural mesothelioma H2052 has been shown to enhance VEGF production upon stimulation with IL-6 and SIL-6R. Using this H2052, the ability of the modified antibody of the present invention to suppress the induction of VEGF production by IL-6 stimulation was examined. In a 20 well plate, the culture of malignant mesothelioma cells H2052 was started at a cell concentration of 50,000 / well. -After standing still, the medium was changed to 5 nM of the modified antibody of the present invention, humanized anti-IL-6 receptor antibody, human IgG, and control.
  • the present invention provides modified antibodies useful as IL 6 inhibitors.
  • the modified antibody of the present invention can be expressed as a single-chain polypeptide. Therefore, the modified antibody of the present invention is particularly useful in gene therapy.
  • a polynucleotide encoding the modified antibody of the present invention can be introduced into a patient, and the modified antibody as an active ingredient can be expressed in the patient's living body. Since the modified antibody is a single-chain polypeptide, it can be expressed in vivo, and a homodimer that mimics the structure of natural IgG can be efficiently generated. It has been confirmed that the modified antibody actually produced based on the present invention has an anticancer activity equivalent to that of natural IgG, for example.

Abstract

　本発明により、scFvとFcを含む改変抗体が提供された。本発明の改変抗体は、L鎖とH鎖の可変領域がscFvとして1本鎖として発現される。本発明の改変抗体は、更にFc領域を含む1本鎖のポリペプチドとして発現される。シンプルな構成のベクターで、天然のＩｇＧを模倣した構造を再現することができる。本発明の改変抗体をコードするポリヌクレオチドは、特に、IL-6受容体阻害剤として有用な抗体分子を生体内において発現させるための遺伝子治療用のベクターとして利用することができる。

Description

明 細 書
インターロイキン一 6阻害剤
技術分野
[0001] 本発明は、改変された抗体に関する。
背景技術
[0002] インターロイキン 6(Interleukin- 6;IL- 6)は、 B細胞刺激因子 2 (BSF2)あるいはイン ターフェロン 2とも呼称されたサイト力インである。 IL-6は、 Βリンパ球系細胞の活性 化に関与する分ィ匕因子として発見され (非特許文献 1)、その後、種々の細胞の機能 に影響を及ぼす多機能サイト力インであることが明らかになった (非特許文献 2)。 IL- 6は、 Τリンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている（非特許文献 3)。
[0003] IL-6は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、 I L-6が結合する分子量約 80kDのリガンド結合性蛋白質の IL-6受容体である（非特許 文献 4,非特許文献 5)。 IL-6受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結 合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性 IL-6受容体としても存在する。
[0004] 特許文献 1には、抗 IL-6R抗体の種々の形態、例えばヒト化抗 IL-6R抗体、キメラ抗 I L-6R抗体、などが記載されている。特許文献 2には、抗 IL-6R抗体などの IL-6アンタ ゴニストを活性成分とする慢性関節リウマチ治療剤及び滑膜細胞増殖抑制剤が記載 されている。特許文献 3には、プラズマサイト一シス、高ィムノグロブリン血症、貧血、 腎炎、悪液質、リウマチ、キャッスルマン病、メサンギゥム増殖性腎炎、などの IL-6の 生産に起因する疾患の治療について記載されている。特許文献 4には、抗 IL-6R抗 体を有効成分とする、感作 T細胞関与疾患、たとえば多発性硬化症、ブドウ膜炎、慢 性甲状腺炎、遅延性過敏症、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎などの予防，治療剤 が記載されている。
[0005] 特許文献 4には、抗 IL-6R抗体を有効成分とする、全身性エリテマトーデス治療剤 が記載されている。特許文献 5には、抗 IL-6R抗体を有効成分とするクローン病の治 療剤が記載されている。特許文献 6には、抗 IL-6R抗体を有効成分とする脾炎の治 療剤が記載されている。特許文献 7には、抗 IL-6R抗体を有効成分とする乾癬の治 療剤が記載されている。特許文献 8には、抗 IL-6R抗体を有効成分とする小児慢性 関節炎の治療剤が記載されて 、る。
特許文献 1： W092/19759
特許文献2 :\^〇96/11020
特許文献 3： WO96/12503
特許文献 4： W098/42377
特許文献 5： WO99/47170
特許文献 6 :WO00/10607
特許文献 7： WO02/34292
特許文献 8： WO02/080969
非特許文献 l : Hirano, T. et al, Nature (1986) 324, 73-76
非特許文献 2 :Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78
非特許文献 3 : Lotz, M. et al" J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258
非特許文献 4:Taga, T. et al" J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
非特許文献 5 :Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 抗 IL-6受容体抗体は、関節リウマチ (慢性関節リウマチ)やキャッスルマン病の治療 に有効であることが臨床試験で明らかとなった。また、本願発明者らにより、抗 IL-6R 抗体を有効成分とする胸膜中皮腫などの中皮腫の治療剤について特許出願がなさ れている (WO2005/037315)。更に、本願発明者らにより、抗 IL-6R抗体有効成分とす る結節性多発性動脈炎、大動脈炎症候群及び免疫異常に伴う血管炎などの血管炎 の治療剤について特許出願がなされている (WO2005/061000)。ここで、一般的に抗 体医薬品の治療費は高額であるため、コスト削減の意味カも抗 IL- 6受容体抗体 (IL- 6阻害剤)を効率的に発現させるベクター開発が非常に重要となる。
[0007] し力しながら、抗体の H鎖と L鎖は二つの別々の遺伝子にコードされているため、そ のままの形でウィルスベクター等に組み込んで目的細胞に遺伝子を導入しても、効 果的な治療薬の発現分泌は困難と考えられる。 本発明は、 IL-6阻害剤として有用な抗 IL-6受容体抗体の効率的な発現を可能とす る改変抗体とそれを発現するベクター、ならびにそれらの製造方法と用途の提供を 課題とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、抗 IL- 6受容体抗体の効率的な発現を可能とするために、抗体の構 造の改変を試みた。そして、抗 IL-6受容体の阻害作用を有し、かつ効率的に製造す ることができる構造として、抗 IL 6受容体抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む scFvとヒト免疫グロブリン IgG Fc部分を接合した構造が有用であることを見出し、本発 明を完成した。すなわち本発明は、以下の改変抗体、それを発現するベクター、なら びにそれらの製造方法と用途を提供する。
[0009] 〔1〕それぞれ以下に示すアミノ酸配列からなる CDR力 ヒトイムノグロブリンのフレー ムワークに組み込まれた抗 IL 6受容体抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む sc Fvをヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合した改変抗体。
H鎖 V領域の CDR1： SDHAWS (配列番号： 3)
H鎖 V領域の CDR2： YISYSGITTYNPSLKS (配列番号： 4)
H鎖 V領域の CDR3： SLARTTAMDY (配列番号： 5)
L鎖 V領域の CDR1： RASQDISSYLN (配列番号： 6)
L鎖 V領域の CDR2： YTSRLHS (配列番号： 7)
L鎖 V領域の CDR3： QQGNTLPYT (配列番号： 8)
〔2〕!"1鎖¥領域カ アミノ酸配列 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSIT SDHA WS WVRQPPGRGLEWIG YIS- YSGITTYNPSLKS RVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTA ADTAVYYCAR SLARTTAMDY WGQGSLVTVS (配列番号： 1)からなる〔1〕に記載 の改変抗体。
〔3〕し鎖¥領域カ アミノ酸配列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDISSYLN W YQQKPGKAPKLLIY YTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQ GNTLPYT FGQGTKVEIKR (配列番号： 2)からなる〔1〕に記載の改変抗体。
〔4〕前記 scFvが、 L鎖 V領域の C末端においてヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合し た〔1〕に記載の改変抗体。 〔5〕前記 scFvが、 N末端カゝら H鎖 V領域、リンカ一及び L鎖 V領域の順に結合された〔4 〕に記載の改変抗体。
〔6〕リンカ一のアミノ酸配列力 GGGGSGGRASGGGGSGGGGS (配列番号： 9)である〔 5]に記載の改変抗体。
〔7〕改変抗体が SS結合によって連結された 2量体である〔1〕に記載の改変抗体。 〔8〕〔1〕 -〔7〕のいずれかに記載の改変抗体と、薬学的に許容される担体を含む、医 薬組成物。
〔9〕〔1〕 -〔7〕のいずれかに記載の改変抗体を、薬学的に許容される担体と配合す る工程を含む、医薬組成物の製造方法。
〔10〕それぞれ以下に示すアミノ酸配列力 なる CDR力 ヒトイムノグロブリンのフレー ムワークに組み込まれた抗 IL 6受容体抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む sc Fvをヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合した改変抗体をコードするポリヌクレオチド
H鎖 V領域の CDR1： SDHAWS (配列番号： 3)
H鎖 V領域の CDR2： YISYSGITTYNPSLKS (配列番号： 4)
H鎖 V領域の CDR3： SLARTTAMDY (配列番号： 5)
L鎖 V領域の CDR1： RASQDISSYLN (配列番号： 6)
L鎖 V領域の CDR2： YTSRLHS (配列番号： 7)
L鎖 V領域の CDR3： Q QGNTLPYT (配列番号： 8)
〔11〕!"1鎖¥領域カ アミノ酸配列 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSIT SDHA WS WVRQPPGRGLEWIG YIS- YSGITTYNPSLKS RVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTA ADTAVYYCAR SLARTTAMDY WGQGSLVTVS (配列番号： 1)からなる〔10〕に記載 のポリヌクレオチド。
〔12〕 L鎖 V領域が、アミノ酸配列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDISSYLN QGNTLPYT FGQGTKVEIKR (配列番号： 2)からなる〔10〕に記載のポリヌクレオチド 〔13〕前記 scFvが、 L鎖 V領域の C末端においてヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合 した〔10〕に記載のポリヌクレオチド。
〔14〕前記 scFvが、 N末端カゝら H鎖 V領域、リンカ一及び L鎖 V領域の順に結合された〔 13〕に記載のポリヌクレオチド。
〔15〕リンカ一のアミノ酸配列力 SGGGGSGGRASGGGGSGGGGS (配列番号： 9)である 〔14〕に記載のポリヌクレオチド。
〔16〕〔10〕一〔15〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔17〕〔10〕一〔15〕のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそれを含むベクター を発現可能に保持した形質転換体。
〔18〕ヒト細胞由来である〔17〕に記載の形質転換体。
〔19〕〔17〕に記載の形質転換体を培養し、培養物に蓄積された改変抗体を回収する 工程を含む、改変抗体の製造方法。
〔20〕〔1〕一〔7〕のいずれかに記載の改変抗体、〔10〕一〔15〕に記載のいずれかの ポリヌクレオチド、 〔10〕一 [15]に記載のいずれかのポリヌクレオチドを発現可能に保 持したベクター、および〔1〕一〔7〕のいずれかに記載の改変抗体を産生する細胞か らなる群から選択された!ヽずれかの成分を有効成分として含有する、インターロイキ ン 6受容体阻害剤。
〔21〕〔1〕一〔7〕のいずれかに記載の改変抗体、〔10〕一 [15]に記載のいずれかの ポリヌクレオチド、 〔10〕一 [15]に記載のいずれかのポリヌクレオチドを発現可能に保 持したベクター、および〔1〕一〔7〕のいずれかに記載の改変抗体を産生する細胞か らなる群から選択された!ヽずれかの成分を投与する工程を含む、インターロイキン 6 受容体の阻害方法。
[22]〔10〕一 [15]に記載のいずれかのポリヌクレオチドをヒト細胞中で発現可能に 保持した遺伝子治療用ベクター。
〔23〕次の工程を含む、インターロイキン 6の作用に起因する疾患の治療方法。
(1) 〔10〕一 [15]に記載のいずれかのポリヌクレオチドをヒト細胞中で発現可能に 保持したベクターを細胞に導入する工程、および
(2)前記ベクターを導入された細胞を患者に投与する工程
〔24〕細胞が、治療すべき患者力 採取された細胞である〔23〕に記載の方法。 〔25〕細胞が末梢血リンパ球である〔24〕に記載の方法。
〔26〕次の要素を含む、インターロイキン 6の作用に起因する疾患の治療用キット。
(1)〔10〕一 [15]に記載のいずれかのポリヌクレオチドをヒト細胞中で発現可能に 保持したベクター
(2)ベクター導入用試薬、および
(3)末梢血リンパ球の分離用試薬
図面の簡単な説明
[図 1]SV40 late poly A signalを組み込んだ、 pShuttleプラスミドを示す図である。
[図 2]ヒト免疫グロブリン IgGlの pBluescript IIの BamHI部位へのサブクローンを示す 図である。
[図 3]IL-6阻害剤（改変抗体)発現シャトルベクターを示す図である。
[図 4]ヒト化抗 -IL-6受容体抗体に由来する、 IL-6シグナルブロッカーの候補を示す図 である。
[図 5]ヒト化抗 -IL-6受容体抗体との比較による、本発明の改変抗体の親和性を示す グラフである。横軸は反応させた本発明の改変抗体、ヒト化抗 -IL-6受容体抗体、コン トロール IgGの濃度を示す。
[図 6]本発明の改変抗体による、 IL-6の受容体結合阻害能を示すグラフである。横軸 は反応させた本発明の改変抗体、ヒト化抗 -IL-6受容体抗体の濃度を示す。
[図 7]本発明の改変抗体による、 KT-3細胞の増殖抑制効果を示すグラフである。横 軸は反応させた本発明の改変抗体、ヒト化抗 -IL-6受容体抗体、コントロール IgGの 濃度を示す。
[図 8]本発明の改変抗体による、悪性胸膜中皮種における IL-6、及び SIL-6R刺激に よる VEGFの産生増強作用の抑制効果を示すグラフである。縦軸は VEGFの濃度を 示す。
[図 9]コンストラクトを構成する各 elementsの配置と、 elementsの間を連結している塩基 配列を示す図である。
[図 10]配列番号： 10、及び配列番号： 10によってコードされる scFvのアミノ酸配列（配 列番号： 11)を示す図である。斜体はリンカ一部分を示す。 発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、抗 IL-6受容体抗体をアデノウイルスベクター等による遺伝子導入に適 する単一遺伝子にコードされた蛋白に改変し、遺伝子治療に適した IL-6阻害剤を提 供することを課題とする。また、本発明は、抗体の H鎖および L鎖を同量で発現するこ とにより効率的な抗 IL-6受容体抗体の産生が可能な、単一遺伝子にコードされた抗 I L-6受容体抗体を提供する。すなわち本発明は、それぞれ以下に示すアミノ酸配列 からなる CDRが、ヒトイムノグロブリンのフレームワークに組み込まれた抗 IL— 6受容 体抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む scFvとヒト免疫グロブリン IgG Fcを含む 改変抗体に関する。
H鎖 V領域の CDR1： SDHAWS (配列番号： 3)
H鎖 V領域の CDR2： YISYSGITTYNPSLKS (配列番号： 4)
H鎖 V領域の CDR3： SLARTTAMDY (配列番号： 5)
L鎖 V領域の CDR1： RASQDISSYLN (配列番号： 6)
L鎖 V領域の CDR2： YTSRLHS (配列番号： 7)
L鎖 V領域の CDR3： QQGNTLPYT (配列番号： 8)
[0012] 本発明の改変抗体は、抗 IL— 6受容体抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む s cFvをヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合することによって構築される。 scFvは 1本 鎖抗体 ^single chain variable fragments)と ¾呼はれる。一般に、 scFvま 7こは scFv饥体 断片には、抗体の VHおよび VL領域が含まれる。これらの領域は単一のポリペプチド 鎖中に存在する (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879 -5883)。一般に、 scFvポリペプチドは、更に Vおよび V領域の間にポリペプチドリン
H L
カーを含む。 scFvは、リンカ一によつて抗原結合のために必要な構造を形成すること ができる（scFvの総説については、 Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Anti bodies』Vol.ll3 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269- 315, 1994)を参照)。
[0013] 本発明において、 scFvを構成するリンカ一のアミノ酸配列は、 H鎖と L鎖の可変領 域を 1本鎖に連結したときに、抗体としての結合特性が維持される限り限定されない。 このようなリンカ一としては、たとえば（ G S) (GGRASX G S)、あるいは（ G S) などが 知られている。
[0014] scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域の連結順序も、抗体としての結合特性が 維持される限り限定されない。具体的には、 N末端カゝら順に [H鎖 V領域]― [リンカ一 ]一 [L鎖 V領域]の順に結合された scFvは、本発明の scFvとして好ましい。すなわち 本発明における好ましい改変抗体は、以下の構造を有する 1本鎖のポリペプチドによ つて構成される。
H N- [H鎖 V領域]― [リンカ一] - [L鎖 V領域]― [Fc]- COOH
2
[0015] 本発明において、 IgGの Fcは、ヒト IgGの由来の Fcであれば限定されない。すなわ ち C γ 1〜C γ 4のいずれの Fcをも本発明の改変抗体を構成する Fcとして利用する ことができる。一般に、ヒト IgGの Fc領域は、 IgGの C末端側の約 330アミノ酸で構成 される。本発明の改変抗体を構成する Fcは、改変抗体の IL— 6受容体ァゴニスト活 性を維持できる範囲で、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、あるいは付加を伴うことが できる。
[0016] たとえば、 Fcとして CH3を含む minibodyは、 Fc領域の機能を維持できることが知られ ている（Hu, S. et al. Cancer Res 56: 3055-3061, 1996)。 minibodyは、 scFvに CH3を 連結した構造を有する。すなわち、 CH1と CH2を欠き、 scFvと CH3のみからなるィムノ グロブリン分子は、本発明に含まれる。あるいは、 scFvおよび CH3を必須構造とし、更 に付カ卩的に CH1、ヒンジ、および CH2から選択されるいずれかの領域またはその部分 配列を含むィムノグロブリンも、本発明における改変抗体に含まれる。
[0017] すなわち本発明は、下記の構成要素 (1)-(4)を含み、これらの要素が N末端力 C末 端にかけて配置された 1本鎖ポリペプチド、およびそれをコードするポリヌクレオチド を提供する。
闘 領域]
(2) [リンカ一]
(3) [L鎖 V領域]および
(4) [Fc]、または [CH3を構成するアミノ酸配列を含む Fcの断片]
ここで、 H鎖 V領域は、それぞれ配列番号： 3〜配列番号: 4のアミノ酸配列からなる CDR1〜CDR3が、ヒトイムノグロブリンのフレームワークに組み込まれた抗 IL— 6受 容体抗体の H鎖 V領域である。また L鎖 V領域は、それぞれ配列番号 : 6〜配列番号： 8のアミノ酸配列からなる CDR1〜CDR3が、ヒトイムノグロブリンのフレームワークに 組み込まれた抗 IL - 6受容体抗体の L鎖 V領域である。
[0018] 本発明の改変抗体は、 scFvと Fcとを含む。本発明において、ヒトイムノグロブリンに 由来する任意の Fcを利用することができる。好ましい Fcは、ヒト IgG由来の Fcである 。より具体的には、たとえば IgGlの Fcを本発明の改変抗体を構成する Fcとして利用 することができる。 Fcをコードする DNAを単離する方法は公知である。あるいは既に クローン化された Fc遺伝子を本発明に利用することもできる。具体的には、特許文献 1に記載のヒト化抗 IL— 6受容体抗体の H鎖遺伝子の Fc部分、 pdCs-Fc-X発現べク ター (Protein Engineering vol.ll.pp495-500, 1998)、 Fc融合型可溶性蛋白遺伝子 (Ca ncer Res. Vol 60: 2167-2177, 2000)などを、本発明における Fc遺伝子として利用す ることがでさる。
[0019] 本発明の改変抗体は、 2分子の 1本鎖のポリペプチドが SS結合によって結合された ホモ 2量体であることが望ましい。天然のィムノグロブリンは、通常、 H鎖と L鎖の間が SS結合によって架橋されたへテロダイマーを構成単位とする。このへテロダイマーが 、上記の本発明の改変抗体を構成する 1本鎖ポリペプチドに相当する。 IgGは、この 構成単位を 2つ持つ。ヘテロダイマーの間もまた、 SS結合によって架橋されている。 したがって、本発明の改変抗体においても、その構成単位である 1本鎖のポリべプチ ドどうしを SS結合によって架橋してダイマー化することによって、天然の IgGの構造を 模做することができる。
[0020] 本発明にお 、て、ダイマー化のための SS結合は、 1本鎖ポリペプチドの任意のシス ティン (C)を架橋することによって構成することができる。架橋のための好まし!/、 ま 、ヒンジ部分に位置する Cである。より具体的には、 CH1と CH2の間に位置する Cの 間を SS結合によって架橋されたホモダイマーは、本発明の改変抗体として好ま ヽ 。ポリペプチドは、酸ィ匕的条件に置くことで、 SS結合によって架橋することができる。 あるいはヒンジを欠く改変抗体の場合には、 CH3の間の疎水的相互作用 (hydrophob ic interaction)によってダイマーィ匕することもできる。
[0021] なお天然の IgGにおいては、ヘテロダイマーを構成するためにヒンジ領域に存在す るシスティン (C)が利用されている。しかし本発明においては、可変領域は 1本鎖の s cFvで構成され、 VLの結合のためのシスティン（C)を必要としない。したがって、ヒン ジに位置するシスティン (C)は、他のアミノ酸に置換することができる。たとえば実施 例においては、ヒンジ領域のシスティン (C)力 セリン（S)に置換されている。
[0022] 本発明において scFvを構成する抗 IL 6受容体抗体の可変領域は、 IL 6受容体 に対するマウスモノクローナル抗体 (PM— 1)の重鎖 (H鎖)及び軽鎖 (L鎖）を構成す る可変領域 (V領域）中の相補性決定領域 (CDR)を、ヒト抗体 V領域の対応する CDR 領域と置き換えた構造を有する。前記マウス抗 IL— 6受容体抗体の L鎖 V領域の CDR のアミノ酸配列は、特許文献 1の表 2の V PM-1の行の CDR1、 CDR2及び CDR3に記
L
載されている。また、前記マウス抗 IL— 6受容体抗体の H鎖 V領域の CDRのアミノ酸 配列は、特許文献 1の表 3の V PM-1の行の CDR1、 CDR2及び CDR3に記載されてい
H
る。
[0023] 一般に、抗体の抗原に対する結合特性は相補性決定領域 (complementarity- deter mining region; CDR)によって決定される。そのため、上記 CDRを任意のフレームヮー クに移植することによって、前記マウスモノクローナル抗体 PM-1の抗原結合特性を再 構成することができる。たとえば、マウスのィムノグロブリン由来の CDRを、ヒトイムノグ ロブリンのフレームワークに移植することができる。このようなストラテジーに基づいて 再構成されたィムノグロブリンは、再構成 (reshaped)ヒト抗体と呼ばれる。
[0024] E.A.Kabatら U 987 J sequences of Proteins of Immunological Interest, Forth Edition , U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office)【こ より定義される、ヒト V領域の異なるサブグループについてのコンセンサス配列との比 較によって、ィムノグロブリンの可変領域を構成するアミノ酸配列の中から、 CDRおよ び FRに相当する領域を特定することができる。
[0025] 再構成 (reshaped)ヒト抗体は、ヒト化抗体 (humanized antibody)とも称される改変抗体 である。再構成 (reshaped)ヒト抗体は、免疫動物由来の抗体の CDRを、ヒトイムノグロ ブリンの CDRへ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も 知られている。
[0026] 具体的には、マウス抗体の CDRをコードする塩基配列を含み、かつその 3 '末端に おいてヒト抗体のフレームワーク領域 (framework region ;FR)に相補的な塩基配列を 含むプライマーを利用して、 CDRを置換することができる。マウスの各 CDRのそれぞ れについて、ヒト FRの塩基配列を連結した合成プライマーカ 隣接する FRにァニー ルするプライマーと組み合わせて PCR法に用いられる。このようなプライマーセットで 、ヒト可変領域遺伝子を铸型として PCR法を行うと、 CDRとしてマウスの塩基配列を有 し、ヒト由来の FRの塩基配列が連結された DNAが増幅される。各 CDRの増幅産物の 末端部分がオーバーラップするようにデザインされる。最終的に 3つの CDRを含む各 増幅産物の全てを混合して PCRを行う。各増幅産物のオーバーラップした部分は、 互いにァニールしてプライマーとして機能する。その結果、 CDRがマウス由来の塩基 配列に置換された可変領域の全長配列を得ることができる。（欧州特許出願公開番 号 EP 239400、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照）。 CDRを介して連結され るヒト抗体の FRは、 CDRが良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。
[0027] 本発明におけるヒトイムノグロブリンのフレームワークは、限定されない。たとえば前 記ヒト化 IL 6受容体抗体の L鎖 V領域のフレームワーク領域 (FR)は、ヒト抗体 REI由 来のものが好ましい。ヒト抗体 REI由来の FRのアミノ酸配列は、特許文献 1の表 2の R EIの行の FR1、 FR2、 FR3及び FR4に記載されている。
[0028] また、前記ヒト化 IL 6受容体抗体の H鎖 V領域のフレームワーク領域 (FR)は、ヒト 抗体 NEW由来のものが好ましい。ヒト抗体 NEWの FRのアミノ酸配列は、特許文献 1 の表 3の NEWの行の FR1、 FR2、 FR3及び FR4に記載されている。
[0029] ヒト抗体の FRとマウス抗体の CDRから構成されるヒトイ匕 V鎖の内、 FR領域は、抗原結 合性や中和活性の改善のため、種々改変されていても良い。たとえば、再構成ヒト抗 体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域の フレームワーク領域のアミノ酸を置換できることが知られている（Sato, K.et al.， Cance r Res. (1993) 53, 851-856) 0本願で使用するヒト化 IL 6受容体抗体は、 L鎖 V領域 については、特許文献 1の表 2の RV a (バージョン a)、及び、 H鎖 V領域については、
L
特許文献 1の表 3の RV f (バージョン f)が好ましい。以下に、本発明における好ましい
H
ヒト化 V鎖のアミノ酸配列を示す。配列中、 CDR1、 CDR2、および CDR3をカツコ内 に記載し、下線を付けた。各下線部の両側の小文字で示した位置に FR1〜FR4が
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0Z86T0/S00Zdf/X3d ZY I999tO/900Z OAV ば配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を示すことができる。更に、好ましいリンカ一の アミノ酸配列としては、配列番号： 9のアミノ酸配列を示すことができる。このような構造 の 1本鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして、たとえば配列番号： 10に記 載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを示すことができる。また配列番号： 10によって コードされる scFvのアミノ酸配列を配列番号： 11に示した。配列番号： 10と配列番号 ： 11におけるリンカ一部分は、それぞれ 355— 414位および 119位— 138位である。 リンカ一部分は図 10中に斜体で示した。したがって、配列番号： 11における 1位 1 18位、 119位— 138位、そして 139位— 246位に相当するアミノ酸配列力 それぞ れ配列番号： 1、配列番号： 9、および配列番号： 2である。
[0034] 本発明のポリヌクレオチドは、適当な発現ベクターを利用することによって、改変抗 体の発現に利用することができる。ポリヌクレオチドの発現産物を細胞外に分泌させ るために、リーダー配列（分泌シグナル)をコードするポリヌクレオチドを付加すること もできる。リーダー配列は、通常、 [H鎖 V領域]の N末端に付加される。たとえば図 9 に示したヒ HgG κ鎖のリーダー配列をリーダー配列として利用することができる。ベタ ターには、ィムノグロブリンあるいはその改変体を発現することができる任意のベクタ 一を利用することができる。
[0035] ィムノグロブリンを動物細胞や微生物細胞を宿主として発現することができる種々の へクタ ~~力公知である、 Expression of engineered antibodies and antibody fragments in microorganisms. , Methods Enzymol. 1989 78:476- 9b.、 "Single chain antibody variable regions.", Trends Biotechnol. 1991 Apr;9(4): 132-7.)。公知のベクターの中 には、ベクターがリーダー配列を含んでいるものもある。このようなベクターを用いる 場合には、本発明のポリヌクレオチドをベクターのリーダー配列に連結することによつ て、動物細胞において、 目的とする改変抗体を分泌する発現ベクターを構築すること ができる。ィムノグロブリンを発現するための動物細胞としては、たとえば COS細胞、 CHO細胞、あるいは悪性胸膜中皮腫細胞などの腫瘍細胞を用いることができる。
[0036] これらの動物細胞における、本発明の改変抗体をコードするポリヌクレオチドの発 現のためには、動物細胞での発現のために通常用いられるプロモーターを利用する ことができる。例えば、ヒト ·サイトメガロウイノレス前期 (human cytomegalovirus immediat e early;HCMV)プロモーターを使用するのが好ましい。 HCMVプロモーターを含有す る発現ベクターとして、 HCMV- VH— HC y 1、 HCMV— VL— HCK、 HCMV— 12h— g γ 1、 HCMV-12 κ -g K等であって、 pSV2neoに由来するものを示すことができる。
[0037] その他に、本発明の改変抗体の動物細胞における発現に利用できるプロモーター として、ヒト 'ェロンゲーシヨン'ファクター 1 a (HEF-1 α )プロモーターを示すこともで きる。このプロモーターを含有する発現ベクターには、 HEF- 12h-g y 1及び HEF-12k - g κ、並びに HEF- VH- 1及び HEF- VL- g κが含まれる。
[0038] 宿主細胞系中での遺伝子増幅のため、発現ベクターはさらに dhfr遺伝子を含有す ることができる。 dhfr遺伝子を含有する発現ベクターは例えば DHFR- A E-PMh-g y 1 、 DHFR- Δ Ε- RVh— PM1— f等である。
[0039] また本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。あるいはまた 本発明は、本発明のポリヌクレオチド、またはそれを含むベクターを発現可能に保持 した形質転換体に関する。本発明に基づく形質転換体を培養し、培養物に蓄積する 本発明の改変抗体を回収することによって、本発明の改変抗体を製造することができ る。あるいは、本発明の形質転換体を患者に投与することもできる。患者への投与を 目的とする場合には、形質転換体の宿主細胞はヒト細胞であることが望ましい。より好 ましくは、投与される患者自身の細胞であることが望ましい。細胞としては、たとえば 末梢血リンパ球を用いることができる。
[0040] マウスモノクローナル抗体 PM— 1は、ヒトの IL 6受容体阻害剤として有用であるこ とが既に立証されている。したがって、その抗原結合特性を有する本発明の改変抗 体は、 IL 6受容体阻害剤として有効である。 IL 6受容体の阻害剤が種々の疾患 の治療効果を有することも公知である。たとえば、以下に示すような疾患は、いずれも IL 6受容体の阻害によって治療効果を期待できる。
慢性関節リウマチ (特許文献 2)
プラズマサイト一シス、高ィムノグロブリン血症、貧血、腎炎、悪液質、リウマチ、キヤッ スルマン病、メサンギゥム増殖性腎炎 (特許文献 3)
感作 T細胞関与疾患、たとえば多発性硬化症、ブドウ膜炎、慢性甲状腺炎、遅延性 過敏症、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎 (特許文献 4) 全身性エリテマトーデス (特許文献 4)
クローン病 (特許文献 5)
脾炎 (特許文献 6)
乾癬 (特許文献 7)
小児慢性関節炎 (特許文献 8)
[0041] したがって本発明の改変抗体は、これらの疾患の治療剤として有用である。本発明 の改変抗体は、薬学的に許容される担体と配合することによって医薬組成物とするこ とができる。あるいは本発明は、これら改変抗体を薬学的に許容される担体と配合す る工程を含む医薬組成物の製造に関する。更に本発明は、本発明の改変抗体の、こ れらの疾患を治療するための医薬組成物の製造における使用に関する。
[0042] 更に本発明は、本発明の改変抗体、それをコードするポリヌクレオチド、これらポリヌ クレオチドを発現可能に保持したベクター、および本発明の改変抗体を産生する細 胞からなる群から選択されたいずれかの成分を有効成分として含有する、インター口 ィキン 6受容体阻害剤を提供する。あるいは本発明は、本発明の改変抗体、それをコ ードするポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを発現可能に保持したベクター、お よび本発明の改変抗体を産生する細胞力 なる群力 選択されたいずれかの成分を 患者に投与する工程を含む、インターロイキン 6受容体の阻害方法に関する。
[0043] また本発明は、本発明の改変抗体、それをコードするポリヌクレオチド、これらポリヌ クレオチドを発現可能に保持したベクター、および本発明の改変抗体を産生する細 胞カ なる群力 選択されたいずれかの成分のこれらの疾患を治療するための医薬 組成物の製造における使用に関する。加えて本発明は、本発明の改変抗体、それを コードするポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを発現可能に保持したベクター、 および本発明の改変抗体を産生する細胞力 なる群力 選択されたいずれかの成 分のこれらの疾患の治療における使用に関する。
[0044] 治療または予防目的で使用される本発明の改変抗体を有効成分として含む医薬 組成物は、必要に応じて、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体 、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤 、賦形剤、酸化防止剤 (ァスコルビン酸等)、緩衝剤 (リン酸、クェン酸、他の有機酸等） 、防腐剤、界面活性剤 (PEG、 Tween等)、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げるこ とができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免 疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニン及びリシン 等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マン-トールやソルビトール等の 糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食 塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノ ース、 D-マン-トール、塩ィ匕ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコ ール (エタノール等)、ポリアルコール (プロピレングリコール、 PEG等)、非イオン性界面 活性剤 (ポリソルベート 80、 HCO- 50)等と併用してもよ ヽ。
[0045] また、必要に応じ本発明の改変抗体をマイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース 、ゼラチン、ポリ^チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッ グデリバリーシステム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ 粒子及びナノカプセル等)とすることもできる ("Remington's Pharmaceutical Science 1 6th edition", Oslo Ed. (1980)等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公 知であり、本発明の改変抗体に適用し得る (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 15: 1 67-277 (1981); Langer, chem.Tech. 12: 98-105 (1982);米国特許第 3, 773,919号;欧 州特許出願公開 (EP)第 58,481号； Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);EP 第 133, 988号)。
[0046] 本発明の医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、 患者の症状、進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定され る。一般に大人では、 1日当たり、 0.1〜2000mgを 1〜数回に分けて経口投与すること ができる。より好ましくは l〜1000mgZ日、更により好ましくは 50〜500mgZ日、最も好 ましくは 100〜300mgZ日である。これらの投与量は患者の体重や年齢、投与方法な どにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能であ る。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。
[0047] 本発明に基づ 、て、前記改変抗体、それをコードするポリヌクレオチド、これらポリヌ クレオチドを発現可能に保持したベクター、および本発明の改変抗体を産生する細 胞からなる群から選択されたいずれかの成分とう薬学的に許容される担体を含む医 薬組成物と、当該医薬組成物が前記疾患の治療に使用されることを記載した指示書 を含む、医薬パッケージが提供される。指示書とは、医薬組成物の適用疾患、投与 量、投与スケジュール、禁忌、医薬組成物の保存条件、あるいは有効期限などを記 載することができる。医薬パッケージとすることによって、本発明に基づく医薬組成物 を商業的〖こ流通させることができる。
[0048] また、本発明の改変抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、 遺伝子治療を行うこともできる。投与方法としては、 nakedプラスミドによる直接投与の 他、リボソーム等にパッケージングする力 レトロウイルスベクター、アデノウイルスべク ター、ワクシニアウィルスベクター、ボックスウィルスベクター、アデノウイルス関連べク ター、 HVJベクター等の各種ウィルスベクターとして形成するか (Adolph『ウィルスゲノ ム法』， CRC Press, Florid (1996)参照)、または、コロイド金粒子等のビーズ担体に被 覆 (WO93/17706等)して投与することができる。し力しながら、生体内において抗体が 発現され、その作用を発揮できる限りいかなる方法により投与してもよい。
[0049] 好ましくは、適当な非経 P経路 (静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺 組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃 法 (電子銃等による)、添鼻薬等粘膜経路を介する方法等)により十分な量が投与され る。 ex vivoにおいてリボソームトランスフエクシヨン、粒子衝撃法 (米国特許第 4,945,05 0号)、またはウィルス感染を利用して血液細胞及び骨髄由来細胞等に投与して、該 細胞を動物に再導入することにより本発明の改変抗体をコードする遺伝子を投与し てもよい。
[0050] 本発明の改変抗体は、特に遺伝子治療に応用した場合に有利である。一般に IgG をはじめとする抗体医薬は、多量体構造を有するために、遺伝子治療への応用が難 しいと考えられている。遺伝子治療用ベクターの発現産物を、天然の抗体と同じよう な多量体構造とすることは、現状では困難なためである。しかし本発明の改変抗体は 、 1本鎖のポリペプチドとして発現させることができる。そのため、現在試みられている ような遺伝子治療のための技術水準においても、抗体としての活性を有する状態で、 目的の蛋白質 (改変抗体)を発現させることができる。なお IgGの多量体構造を模倣 するためには、 2量体とすることが望ましい。本発明の改変抗体によれば、 2量体はホ モダイマーによって構成される。同じ分子間で構成されるホモダイマーは、 H鎖と L鎖 のような、異なるポリペプチド間の 2量体化を遺伝子組み換え体で実現することに比 ベれば、はるかに容易に再現することができる。
[0051] たとえばヘテロダイマーにおいては、ヘテロダイマーを構成する各サブユニットが、 それぞれの必要量存在していることが求められる。他方よりも多く発現したサブュ-ッ トは、パートナーとなるサブユニットが無ければヘテロダイマーを構成できない。一方 、ホモダイマーにおいては、発現したサブユニットはほぼ完全にホモダイマーとするこ とができる。したがって、発現レベルを高度に制御しない条件下でも、 目的とするホモ ダイマーを効率的に生成することができる。このような理由から、本発明の改変抗体 は、遺伝子治療に好適である。
[0052] すなわち本発明は、本発明の改変抗体をコードするポリヌクレオチドをヒト細胞中で 発現可能に保持した遺伝子治療用ベクターを提供する。本発明の遺伝子治療用べ クタ一は、前記改変抗体をコードするポリヌクレオチドを保持し、ヒト細胞への導入、あ るいは感染によって、ヒト細胞内で改変抗体を発現することができる。
[0053] 遺伝子治療用ベクターのヒト細胞への導入とは、人為的な形質転換工程によるヒト 細胞への遺伝子治療用ベクターの導入を含む。具体的には、リポフエクタミンなどの 形質転換用試薬により、ベクターをヒト細胞に導入することができる。あるいは、形質 転換用試薬の助けを借りず、 自律的にヒト細胞への感染を成立させることができる遺 伝子治療用ベクターも知られている。たとえばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ゥ イノレスベクター、レトロウイノレスベタター、 HIVベクター、ワクシニアウイノレスベタター、 あるいはセンダイウィルス (HVJ)ベクターなどのウィルスベクターは、ヒト細胞への感染 能を有するベクターである。具体的には、たとえば、 pAdexlcwなどのアデノウイルスべ クタ一、あるいは pZIPneoなどのレトロウイルスベクターが知られている。ベクターへの 本発明の改変抗体をコードする DNAは、一般的な遺伝子操作によってウィルスべク ターに組み込むことができる (Molecular Cloning ,5.61-5.63)。
[0054] たとえば、以下のような操作によって、本発明に基づく改変抗体を発現するアデノウ ィルスベクターを構築することができる。現在作製されて 、るアデノウイルスベクター の多くは、 serotype 5もしくは serotype 2型をベースにしている。アデノウイルスの El r egionは複製増殖に必須の部位であり、ここを目的とする遺伝子と置換することにより 非増殖型アデノウイルスを作製することができる。アデノウイルスベクターはヒト腎臓細 胞 293などを利用して作製される。目的とするベクターを作製するためには 36 Kbにも およぶ linear DNAを作製する必要がある。この巨大 DNA作製法として、直接宿主細 胞にシャトルベクターとアデノウイルスバックボーンベクターをトランスフエタトし、細胞 内で相同組み換えを起こさせる方法と、バクテリアを用いウィルス産生に必要な巨大 DNAを作製する方法がある。後者の例としては、 AdEasy Adenoviral Vector System ( Stratagene)を挙げることができる。
[0055] 発現された改変抗体を細胞の外に分泌するために、通常、改変抗体は分泌シグナ ルを有する。改変抗体をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターには、ヒト 細胞内で転写活性を有する任意のプロモーターを利用することができる。 tetなどの 制御可能なプロモーターを組み合わせれば、テトラサイクリンの投与によって改変抗 体の発現レベルを制御することができる。改変抗体の発現レベルを保っために、ェン ハンサ一の利用は好まし 、。
[0056] 本発明の遺伝子治療用ベクターは、任意の方法によってヒトに投与することができ る。たとえば、生体外においてベクターを導入した細胞を、患者に投与することができ る (ex vivo)。細胞は、患者自身力 採取された細胞であることが望ましい。患者から採 取された細胞は、生体外において培養して増殖させることもできる。患者から容易に 採取することができる細胞として、血液細胞を挙げることができる。たとえば末梢血リ ンパ球は、遺伝子治療用ベクターを導入するための細胞として好ま 、。
[0057] あるいは、遺伝子治療用ベクターが生体中においても細胞への感染能を有する場 合には、遺伝子治療用ベクターを直接患者に投与することもできる (in vivo)。具体的 には、皮下、血中、胸腔内、腹腔内、髄腔内、筋肉内、関節内、経鼻的、あるいは経 皮的な投与が可能である。
[0058] これらの本発明に基づく遺伝子治療用ベクターによる治療方法に必要な要素は、 予め組み合わせてキットとすることができる。すなわち本発明は、次の要素を含む、ィ ンターロイキン 6の作用に起因する疾患の治療用キットを提供する。
(1)本発明の改変抗体をコードするポリヌクレオチドをヒト細胞中で発現可能に保 持したベクター
(2)ベクター導入用試薬、および
(3)末梢血リンパ球の分離用試薬
ベクター導入用試薬としては、たとえばリポフエクチンゃリポフエクタミン (いずれも In vitrogen社の商品名。登録商標）などを利用することができる。また末梢血リンパ球の 分離用試薬としては、リンパ球を同定するためのマーカーを認識する抗体を利用す ることができる。抗体は蛍光色素や磁性粒子と結合することができる。リンパ球のマー カーとしては、 CD34などが公知である。本発明による遺伝子治療用のキットは、更に 付加的に指示書を含むことができる。なお本明細書において引用された全ての先行 技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例
[0059] く材料〉
ヒト胚性腎臓 293細胞を American Type Culture Collection (Manassas, VA)から購 入した。 293細胞は、 10%ゥシ胎児血清 (FCS)を含むダルベッコ変法イーグル培地 (D MEM)で培養した。レンネルトリンパ腫由来 T細胞（KT- 3) (Shimizu S et al.， Blood 19 88; 72:1826-1828)は、 10%FCSおよび 4 ng/mlの組換え IL- 6 (Ajinomoto Co., Inc., Kawasaki, Japan)を補充した RPMI 1640培地で維持した。組換え可溶性 IL- 6R (sIL- 6 R)は中外製薬株式会社（Chugai Pharmaceutical Co., LTD (Roche Group, Shizuoka, Japan) )より寄与された。他の補足物質および細胞培養液は Mediatech- Cellgro (Kan sas City, MO)から購入した。全ての制限酵素は New England Biolabs (Beverly, MA) から、 T4 DNAリガーゼは Promega (Madison, WI)から、 Taqポリメラーゼおよび PCR試 薬は QIAGEN (Valencia, CA)力 購入した。
[0060] 〔実施例 1〕
(図 1〜3) IL-6阻害剤 (改変抗体)の作製
ヒト化 IL-6受容体抗体（中外製薬株式会社)の重鎖および軽鎖をコードする別々の cDNAから、 VHヌクレオチド配列および VLヌクレオチド配列を PCRで増幅した。 1回目 の増幅用 PCRプライマーは、通常の Fv境界の定義（canonical Fv boundary definition )を用いてデザインした。 2回目では、 VH遺伝子フラグメントと VL遺伝子フラグメントを オーバーラップ伸長 PCR法によって共に連結させ、 20個のアミノ酸のリンカ一 (G S)(G
4
GRAS)(G S)をコードする DNAセグメントを導入した。加えて、 ρΟΡΕΙΟΙ細菌発現べク
4 2
ターへのクロー-ングを容易にするために、 scFvをコードする最終的な DNAの 5 '末端 および 3 '末端に Nco Iおよび Not I制限酵素部位を相応するように導入し、抗 IL-6受 容体ヒトイ匕抗体の ρΟΡΕΙΟΙ/scFvを作製した。
[0061] 真核生物の発現系において scFvを産生するために、 scFvをコードする DNA配列は 、 c-Mycタグおよび 6個のヒスチジン（ρΟΡΕΙΟΙ中に存在する）とともに PCRで増幅して 、 Sna BIを 5 '末端に Avr Iを 3 '末端に導入し、さらに pPIC9酵母発現プラスミド（Invitro gen, Carlsbad, CA)にクローユングして、抗 IL-6受容体ヒト化抗体の pPIC9/scFvを作 製した。 Fc/抗 IL-6受容体ヒト化抗体コーディング DNAのアセンブリを以下のように行 つた。ヒト免疫グロブリン γ -1遺伝子のヒンジである CH2および CH3ドメイン（Fcすなわ ち fragment constantと総称される）をヒト化 IL-6受容体抗体重鎖の cDNAより PCRで増 幅し、システィン力ゝらセリンへのアミノ酸置換をヒンジ領域に 1箇所導入した。システィ ン残基は通常、軽鎖とのジスルフイド結合を形成する。
[0062] Fc遺伝子フラグメントは、マウス Ig κ鎖 V-J2-Cシグナルペプチド配列とインフレーム になるように pSecTag2aベクター（Invitrogen)にクローユングした。抗 IL-6受容体ヒト化 抗体の scFv遺伝子を PCRで増幅し、リーダー/ Fcとインフレームになるようにクロー- ングし、抗 IL- 6受容体ヒトイ匕抗体の pSecTag/Fc/scFvを作製した。最後に、 CMVプロ モーターと BGHポリアデュル化シグナルとを含む発現カセット全体を pShuttleプラスミ ド（Stratagene, La Jola, CA)に再クローユングし、抗 IL- 6受容体ヒト化抗体の pShuttle /CMV/Fc/scFvを作製した。コンストラクトを構成する各 elementsの配置と、 elements の間を連結して 、る塩基配列を図 9に示した。
[0063] (図 IB) pShuttleプラスミド（Stratagene, La Jola, CA)のマルチプルクロー-ングサ イト (multiple cloning site)に pGL3basic Vector (Promega)由来の SV40 late poly A sig nalを組み込んだ。
(図 2A)ヒト免疫グロブリン IgGlの H鎖のヒンジ部位より C末を pBluescript IIの BamHI 部位にサブクローンした。ヒンジ部の N末に制限酵素 Spel部位を設けた。
(図 2B)上記のプラスミドで、 pBluescript IIの KpnI〜XhoI部位にサイトメガロウィル スェンハンサー Zプロモーター領域（CMV)を挿入した。
(図 3A)上記のプラスミドより CMV-マルチプルクロー-ングサイト（multiple cloning si te) -ヒンジ- Fcのフラグメントを切り出し、図 1Bのプラスミドの KpnI〜XbaI部位に挿入 した。このプラスミドで、 EcoRV, Spel部位はユニークサイトであり、同部位に他の遺伝 子を組み込むことにより、その遺伝子と Fcとの融合蛋白を作ることが可能である。上 記ヒト化抗- IL- 6受容体抗体の pShuttle/CMV/Fc/scFvより scFv部を切り出し、 EcoR V〜SpeI部位に挿入して IL-6阻害剤（改変抗体)発現シャトルベクターを完成した。
[0064] 組換えアデノウイルスゲノムを作製するために、 AdEasyアデノウイルスベクターシス テム（Stratagene)を取扱説明書に従って用いた。 IL-6阻害剤発現シャトルベクターを 、 pAdEasy-1プラスミドとともに大腸菌 BJ5183に共トランスフエタトし、相同組換えを達 成させた。ウィルスゲノムを細胞から回収し、 IL-6阻害剤 DNAの存在を制限消化およ びインサート特異的なプライマーによる PCRによって確認した。組換え Adウィルスゲノ ムを 293細胞にトランスフエタトし、組換え Ad5/IL-6阻害剤をレスキュー（rescue)して 大量に産生した後、塩ィ匕セシウムで精製した。ウィルス粒子力価の測定は、 Maizel et al.の方法により、 260nmでの 1吸光度単位あたり 1.1 X 1012ウィルス粒子（v.p.)の変換 係数を用いて分光高度法で行った。
[0065] IL-6阻害剤を大量に産生するために、組換え Ad5/IL-6阻害剤を発現システムとし て用いた。 10個の T75フラスコにおいて、感染効率（MOI) 100 v.p./細胞で Ad5/IL-6 阻害剤を 293細胞に感染させた。感染を 37°Cで 1時間実施した後、培地を交換した。 感染 3日後、培養上清を収集し、等量の冷飽和硫酸アンモ-ゥムを添加してタンパク 質を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により収集し、もとの培養液量の 1/20の量のリン 酸緩衝生理食塩水（PBS)に溶解し、さらに PBSに対して透析した。 Sigma (St. Louis, MO)から購入したプロテイン A抗体精製キット（Protein A Antibody Purification Kit) を製造元の説明書に従って使用してァフィユティークロマトグラフィーを行い、透析後 のタンパク質溶液力ゝら組換え IL-6阻害剤タンパク質を精製した。タンパク質濃度は Br adfordタンパク質アツセィ（Bio- Rad)によりゥシ γグロブリンを標準として測定した。
[0066] (図 4)本発明者らはまず、ヒト化抗 -IL-6受容体抗体の Η鎖と L鎖を用い single chain fragment variant (ヒトイ匕抗- IL- 6受容体抗体の scFv )を作製した。この scFvをヒト免疫 グロブリン IgG Fc部分と融合させ、二量体を作製し New receptor inhibitor for IL- 6 ( 本発明の改変抗体)を榭立した。
次に本発明の改変抗体遺伝子を非増殖型アデノウイルスに組み込み、サイトメガロ プロモーター下に本発明の改変抗体が発現するベクターを作製した。この本発明の 改変抗体発現アデノウイルス (Ad CMV)を種々の人細胞に感染させ、その上清を集 め、プロテイン Aカラムを用い本発明の改変抗体を精製した。
[0067] 〔実施例 2〕
(図 5) 結合アツセィ
本発明の改変抗体の IL-6受容体に対する親和性を検討した。 96穴 ELISAプレート にまず IL-6受容体を認識する MT-18をコーティングした。 MT-18の IL-6受容体認識 部位はヒト化抗 -IL-6受容体抗体と異なり、ヒト化抗 -IL-6受容体抗体と競合すること はないことが証明されている。 MT-18のコーティング濃度は、 5 μ g/mlの溶液を lwell 当り 100 1入れー晚静置した。その後トリス緩衝生理食塩水（TBS)で洗浄し、 6% bo vine serum albuminでブロッキングを行った。ブロッキング後可溶性 IL-6受容体（sIL- 6R)を反応させ、 ELISAプレートへ固定させた。 SIL-6Rの濃度は、 100 ng/mlの溶液を lwell当り 100 1反応させた。その後さまざまな濃度の本発明の改変抗体、ヒト化抗 -I L-6受容体抗体、コントロール IgGを反応させた。二次抗体として HRP conjugated ant l— Fc fragment F(ab )2 (Dako)を使用し 7こ。発色に iiOPD peroxidase substrate(Sigma )を使用した。図 4で、横軸は反応させた本発明の改変抗体、ヒト化抗 -IL-6受容体抗 体、コントロール IgGの濃度を示す。これから明らかなように、本発明の改変抗体はヒ ト化抗 -IL-6受容体抗体に比べ IL-6受容体に対する結合能は勝るとも劣らないもの であった。
[0068] 〔実施例 3〕
(図 6) 阻害アツセィ
次に IL-6の IL-6受容体への結合を本発明の改変抗体が競合的に阻害できる力検 討した。 SIL-6Rの ELISAプレートへの固定は前述の如く行った。 10 ng/ml濃度のピオ チン化 IL-6と種々の濃度の本発明の改変抗体もしくはヒト化抗 -IL-6受容体抗体を競 合させた結果、本発明の改変抗体の IL-6の受容体結合阻害能はヒト化抗 -IL-6受容 体抗体に匹敵するものであった。
[0069] (図 7) IL-6依存性増殖を示すリンパ腫 KT-3を用い、実際に本発明の改変抗体が 細胞生物学的に IL-6刺激をブロックできるか検討した。 KT 3の細胞濃度は 10,000 cells/wellとし、 96well使用した。 500 pg/mlの IL-6濃度で培養している KT-3に対し、 種々の濃度の本発明の改変抗体、ヒトイ匕抗 -IL-6受容体抗体もしくはコントロール Ig Gを投与した。 5日間培養した後、 MTSアツセィを行った。図 7に結果を示す。 KT-3 に対する増殖抑制効果もヒト化抗 -IL-6受容体抗体に匹敵した。
[0070] (図 8) 悪性胸膜中皮腫 H2052は IL-6および SIL-6R刺激により、 VEGFの産生増強 をきたすことが判明している。この H2052を用いて、本発明の改変抗体が IL-6刺激に よる VEGF産生誘導を抑制することができる力検討した。 20 well plateで、悪性中皮種 細胞 H2052を細胞濃度 50,000/wellで培養を開始した。ー晚静置した後、 5nMの本発 明の改変抗体、ヒト化抗 -IL-6受容体抗体、ヒト IgG、コントロールに培地を交換した。 無刺激、および IL- 6(10ng/ml)+sIL- 6R(100ng/ml)刺激を開始した。実験は triplicate(3 連)で行った。 48時間培養した後、上清中の VEGFの濃度を測定し、生産量を検討し た。図 8に結果を示す。この系においても、本発明の改変抗体はオリジナルヒト化抗 -I L-6受容体抗体に比べ同等の抑制能を示した。
産業上の利用可能性
[0071] 本発明は、 IL 6阻害剤として有用な改変抗体を提供した。本発明の改変抗体は 、 1本鎖ポリペプチドとして発現することができる。そのため、本発明の改変抗体は、 特に遺伝子治療において有用である。具体的には、本発明の改変抗体をコードする ポリヌクレオチドを患者に導入し、患者の生体内で、有効成分である改変抗体を発現 させることができる。改変抗体は 1本鎖のポリペプチドであるため、生体内で用意に発 現させることができ、更に、天然の IgGの構造を模倣したホモダイマーを効率的に生 成することができる。実際に本発明に基づいて生成された改変抗体は、たとえば、天 然の IgGと同等の抗癌作用を有していることが確認された。

Claims

請求の範囲
[1] それぞれ以下に示すアミノ酸配列からなる CDR力 ヒトイムノグロブリンのフレームヮ ークに組み込まれた抗 IL 6受容体抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む scFv をヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合した改変抗体。
H鎖 V領域の CDR1： SDHAWS (配列番号： 3)
H鎖 V領域の CDR2： YISYSGITTYNPSLKS (配列番号： 4)
H鎖 V領域の CDR3： SLARTTAMDY (配列番号： 5)
L鎖 V領域の CDR1： RASQDISSYLN (配列番号： 6)
L鎖 V領域の CDR2： YTSRLHS (配列番号： 7)
L鎖 V領域の CDR3： QQGNTLPYT (配列番号： 8)
[2] H鎖 V領域が、アミノ酸配列 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSIT SDHAWS WVRQPPGRGLEWIG YIS- YSGITTYNPSLKS RVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADT AVYYCAR SLARTTAMDY WGQGSLVTVS (配列番号： 1)カゝらなる請求項 1に記載 の改変抗体。
[3] L鎖 V領域力 アミノ酸配列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDISSYLN WYQQ KPGKAPKLLIY YTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQGNTL PYT FGQGTKVEIKR (配列番号： 2)力もなる請求項 1に記載の改変抗体。
[4] 前記 scFvが、 L鎖 V領域の C末端にぉ 、てヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合した 請求項 1に記載の改変抗体。
[5] 前記 scFvが、 N末端カゝら H鎖 V領域、リンカ一及び L鎖 V領域の順に結合された請求 項 4に記載の改変抗体
[6] リンカ一のアミノ酸配列力 GGGGSGGRASGGGGSGGGGS (配列番号： 9)である請求 項 5に記載の改変抗体。
[7] 改変抗体が SS結合によって連結された 2量体である請求項 1に記載の改変抗体。
[8] 請求項 1 7の 、ずれかに記載の改変抗体と、薬学的に許容される担体を含む、医 薬組成物。
[9] 請求項 1 7の 、ずれかに記載の改変抗体を、薬学的に許容される担体と配合する 工程を含む、医薬組成物の製造方法。
[10] それぞれ以下に示すアミノ酸配列からなる CDR力 ヒトイムノグロブリンのフレームヮ ークに組み込まれた抗 IL 6受容体抗体の H鎖 V領域および L鎖 V領域を含む scFv をヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合した改変抗体をコードするポリヌクレオチド。
H鎖 V領域の CDR1： SDHAWS (配列番号： 3)
H鎖 V領域の CDR2： YISYSGITTYNPSLKS (配列番号： 4)
H鎖 V領域の CDR3： SLARTTAMDY (配列番号： 5)
L鎖 V領域の CDR1： RASQDISSYLN (配列番号： 6)
L鎖 V領域の CDR2： YTSRLHS (配列番号： 7)
L鎖 V領域の CDR3： QQGNTLPYT (配列番号： 8)
[11] H鎖 V領域が、アミノ酸配列 QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSIT SDHAWS WVRQPPGRGLEWIG YIS- YSGITTYNPSLKS RVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADT AVYYCAR SLARTTAMDY WGQGSLVTVS (配列番号： 1)カゝらなる請求項 10に記載 のポリヌクレオチド。
[12] L鎖 V領域力 アミノ酸配列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDISSYLN WYQQ KPGKAPKLLIY YTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QQGNTL PYT FGQGTKVEIKR (配列番号： 2)力 なる請求項 10に記載のポリヌクレオチド。
[13] 前記 scFvが、 L鎖 V領域の C末端においてヒト免疫グロブリン IgG Fc部分に結合した 請求項 10に記載のポリヌクレオチド。
[14] 前記 scFvが、 N末端カゝら H鎖 V領域、リンカ一及び L鎖 V領域の順に結合された請求 項 13に記載のポリヌクレオチド。
[15] リンカ一のアミノ酸配列力 SGGGGSGGRASGGGGSGGGGS (配列番号： 9)である請求 項 14に記載のポリヌクレオチド。
[16] 請求項 10— 15のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[17] 請求項 10— 15のいずれかに記載のポリヌクレオチド、またはそれを含むベクターを 発現可能に保持した形質転換体。
[18] ヒト細胞由来である請求項 17に記載の形質転換体。
[19] 請求項 17に記載の形質転換体を培養し、培養物に蓄積された改変抗体を回収する 工程を含む、改変抗体の製造方法。
[20] 請求項 1 7のいずれかに記載の改変抗体、請求項 10— 15に記載のいずれかのポ リヌクレオチド、請求項 10— 15に記載の 、ずれかのポリヌクレオチドを発現可能に保 持したベクター、および請求項 1 7の 、ずれかに記載の改変抗体を産生する細胞 からなる群から選択されたいずれかの成分を有効成分として含有する、インターロイ キン 6受容体阻害剤。
[21] 請求項 1 7のいずれかに記載の改変抗体、請求項 10— 15に記載のいずれかのポ リヌクレオチド、請求項 10— 15に記載の 、ずれかのポリヌクレオチドを発現可能に保 持したベクター、および請求項 1 7の 、ずれかに記載の改変抗体を産生する細胞 からなる群から選択されたいずれかの成分を投与する工程を含む、インターロイキン 6受容体の阻害方法。
[22] 請求項 10— 15に記載のいずれかのポリヌクレオチドをヒト細胞中で発現可能に保持 した遺伝子治療用ベクター。
[23] 次の工程を含む、インターロイキン 6の作用に起因する疾患の治療方法。
(1)請求項 10— 15に記載のいずれかのポリヌクレオチドをヒト細胞中で発現可能 に保持したベクターを細胞に導入する工程、および
(2)前記ベクターを導入された細胞を患者に投与する工程
[24] 細胞が、治療すべき患者力 採取された細胞である請求項 23に記載の方法。
[25] 細胞が末梢血リンパ球である請求項 24に記載の方法。
[26] 次の要素を含む、インターロイキン 6の作用に起因する疾患の治療用キット。
(1)請求項 10— 15に記載のいずれかのポリヌクレオチドをヒト細胞中で発現可能 に保持したベクター
(2)ベクター導入用試薬、および
(3)末梢血リンパ球の分離用試薬
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