WO2006043644A1 - 温度応答性デプシペプチドポリマー - Google Patents

温度応答性デプシペプチドポリマー Download PDF

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WO2006043644A1
WO2006043644A1 PCT/JP2005/019332 JP2005019332W WO2006043644A1 WO 2006043644 A1 WO2006043644 A1 WO 2006043644A1 JP 2005019332 W JP2005019332 W JP 2005019332W WO 2006043644 A1 WO2006043644 A1 WO 2006043644A1
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gly
pro
hmb
ala
mmol
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PCT/JP2005/019332
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroyuki Oku
Kazuaki Shichiri
Tomohiro Taira
Aya Inoue
Keiichi Yamada
Ryoichi Katakai
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National University Corporation Gunma University
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/68—Polyesters containing atoms other than carbon, hydrogen and oxygen
    • C08G63/685—Polyesters containing atoms other than carbon, hydrogen and oxygen containing nitrogen
    • C08G63/6852—Polyesters containing atoms other than carbon, hydrogen and oxygen containing nitrogen derived from hydroxy carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a novel temperature-responsive material. More specifically, the present invention relates to a temperature-responsive polymer having a depsipeptide formed by dehydration condensation of a valic acid residue and an amino acid residue as a constituent component.
  • the polymer of the present invention utilizes the property of aggregating in response to temperature in water or a buffer solution, so that a bioabsorbable composition, an environmentally degradable composition, a cell adhesive, a microcapsule, a biomachine, a biosensor It is useful for constructing separation membranes and test kits.
  • Non-patent Document 1 Materials using amino acids
  • Non-patent Document 2 Research on the use of polyamino acids as biomaterials and degradable materials in soil has been conducted with the idea that amino acids are naturally derived compounds and will be easily degraded in vivo.
  • polyamino acids and oligoamino acids are high molecules in which the main chains are linked by amide bonds, and form stable hydrogen structures by forming strong hydrogen bonds between molecules or within molecules. It is characterized by having. Many studies have shown that ease of formulation and biodegradability are closely related to the strength of intermolecular and intramolecular interactions.
  • Polyhydroxy acid or oligohydroxy acid is a substance in which the main chain is linked by an ester bond as shown in Formula 2. Since the ester bond cannot form a hydrogen bond, the polyhydroxy acid does not have a strong interaction between molecules or within the molecule. Therefore, polyhydroxy acids are expected to show better in vivo degradation than polyamino acids.
  • Depsipeptide is a polymer or oligomer in which the main chain is linked by an ester bond and an amide bond as shown in Formula 3.
  • the skeleton of the structure has an amide bond and an ester bond.
  • the amide bond strength contained in the skeleton causes a strong interaction within and between molecules, and is expected to be structurally stable and rigid due to mechanical strength.
  • the ester bond strengths are weakly interacting with each other! Therefore, structural instability and mechanical strength decrease are expected. Therefore, depsipeptides can be used as materials that make use of the characteristics of oligomers and polymers of amino acids and hydroxy acids. In other words, a material having a wide range of properties can be synthesized by changing the type, composition, and arrangement of amino acids and hydroxy acids. Thus, depsipeptide is a very attractive substance.
  • the side chain of hydroxy acid is hydrophobic and sterically hindered, such as H-, CH-, (CH) CH-, (CH) CH-CH-
  • Non-patent Document 6 Another characteristic is that no inflammation is observed on the joint surface with the living tissue.
  • Patent Document 14 or 15 A recently developed method by genetic recombination is also used for the development of temperature-responsive materials. This is based on the synthesis of a protein model substance called elastin and its structural research (Non-patent Document 7). These can be made into temperature-responsive materials having a wide range and characteristics by changing the amino acid sequence and composition.
  • the basic sequence mainly used is -Gly-Aaa-Gly-Baa-Pro- (SEQ ID NO: 1: Aaa is most ⁇ -amino acids including palin and Baa is palin or isoleucine).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 7-228639
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 8-143631
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 9-169850
  • Patent Document 4 JP-A-10-273451
  • Patent Document 5 JP 2000-212144 A
  • Patent Document 6 JP 2000-344834 A
  • Patent Document 7 JP 2002-256075 A
  • Patent Document 8 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-252936
  • Patent Document 9 Japanese Patent Laid-Open No. 11-322941
  • Patent Document 10 JP 2000-80158 A
  • Patent Document 11 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-160473
  • Patent Document 12 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-35791
  • Patent Document 13 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-256075
  • Patent Document 14 Special Table 2001-514263
  • Patent Document 15 Special Table 2004-501784
  • Non-Patent Document 1 Journal of Organic Chemistry 1985, 50 ⁇ , 715 pages
  • Non-patent document 2 Journal of Biomedical Materials Research, 1977, 11 pp. 405
  • Non-patent document 3 Journal of Macromolecular Science- Chemistry, 1984, A21 ⁇ , 561 page 1 ⁇
  • Non-Patent Document 4 Macromolecular Chemie, 1983, 184 ⁇ , p. 1761
  • Non-Patent Document 5 Biomaterials, 1989, 10 ⁇ , p. 569
  • Non-Patent Document 6 Journal of Biomedical Materials Research, 1990, 24 ⁇ , 1173
  • Non-Patent Document 7 Progress in Biophysics and Molecular Biology ⁇ 1992, 57 ⁇ , 23 pages
  • Non-Patent Document 8 Peptide Science 2003, Peptide Society of Japan, 2004, p. 177 Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide a novel material combining a depsipeptide capable of molecular design with a wide range of characteristics and temperature responsiveness.
  • Hmb represents a valinic acid residue of the following formula (II), and R represents an amino group bonded by an ester bond.
  • Acid, polypeptide or hydroxy acid, R is an amino acid or polypeptide bound by an amide bond
  • a polymer compound in which the repeating unit represented by the above general formula (I) contains -Gly-Hmb- is preferred, and the above general formula (I) is preferably Gly-Hmb-Pro- or -Gly-Hmb-
  • the above general formula (I) is more preferred for polymer compounds containing Ala-Pro- -Gly-X -Gly-Hmb-Ala-Pro- or — Gly— X -Gly-Hmb-Pro-
  • polymer compounds wherein X and X are a amino acid residues.
  • the polymer compound of the present invention may also be one in which a sugar chain sequence, protein, polysaccharide, metal complex or polymer carrier, gel, film, latex particle, metal fine particle, or plastic plate is bonded to the terminal of the polymer compound.
  • the present invention further provides a temperature-responsive composition comprising any of the polymer compounds described above.
  • FIG. 1 is an embodiment of the present invention, polyKGly 1 -Vaf-Gly 3 -Hmb 4 -Ala 5 -Pro 6 ) -co-(Gly -Lys (Z) 8 -Gly 9 -v- About Ala 11 -Pro 12 )] DMSO-d 30 500 measured in C
  • FIG. 2 is a spectrum obtained by measuring poly (Gly-Va-Gly-Hmb-Ala-Pro), which is one embodiment of the present invention, by MALDI-TOF mass spectrometry.
  • FIG. 3 shows an embodiment of the present invention, an aqueous solution of poly (Gly-Va) Gly-Hmb-Ala-Pro) (1 mg / 1000 / zl) for an absorption spectrum made of quartz having a thickness of 1 mm. It is a temperature-change circular dichroism spectrum measured when it was put into a cell and the temperature was increased every 10 ° C between 40 to 60 ° C and temperature equilibrium was reached at each temperature.
  • FIG. 4 shows an embodiment of the present invention, an aqueous solution of poly (Gly-Va-Gly-Hmb-Ala-Pro) (1 mg / 50 / zl) for an absorption spectrum made of quartz having a thickness of 1 mm. This is a picture when it is put in a cell and kept at 25 ° C.
  • FIG. 5 shows an embodiment of the present invention, an aqueous solution of poly (Gly-VaGGly-Hmb-Ala-Pro) (1 mg / 50 / zl) for an absorption spectrum made of quartz having a thickness of 1 mm. This is a picture when it is put in a cell and maintained at 55 ° C.
  • FIG. 6 shows an embodiment of the present invention, an aqueous solution of poly (Gly-Va-Gly-Hmb-Ala-Pro) (1 mg / 50 / zl) for an absorption spectrum made of quartz having a thickness of 1 mm. It is a graph in which the apparent absorbance was measured at a wavelength of 500 nm when the temperature was increased by 40 ° C to 57 ° C every 1 ° C and temperature equilibrium at each temperature was reached. . The vertical axis represents the apparent absorbance, and the horizontal axis represents the temperature (. C).
  • FIG. 7 is an embodiment of the present invention, poly [(Gly-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro) -co- (Gly-Lys (Z) -Gly-Va-Ala-Pro) In a 1 mm-thick quartz absorption spectrum cell, and the temperature is increased by 1 ° C between 33 and 50 ° C. When the equilibrium is reached, the apparent absorbance is measured at a wavelength of 500 nm and plotted. The vertical axis shows the apparent absorbance, and the horizontal axis shows the temperature (° C).
  • FIG. 8 shows an embodiment of the present invention, in which an aqueous solution of poly (Gly-Va) Gly-Hmb-Pro) (1 mg / 50 / zl) is placed in a 1 mm thick quartz absorption spectrum cell. It is a graph in which the apparent absorbance is measured at 500 wavelengths when the temperature is increased at every 1 ° C between 20-30 ° C and temperature equilibrium is reached at each temperature. The vertical axis represents the apparent absorbance, and the horizontal axis represents the temperature (° C).
  • FIG. 9 shows an embodiment of TFA'H- (Gly-Va Glv-Hmb-Pro) -OH, which is an embodiment of the present invention.
  • Aqueous solution (1 mg / 50 / zl) was put into a 1 mm thick quartz absorption spectrum cell, and the temperature was increased by 1 ° C between 47 ° C and 59 ° C.
  • the apparent absorbance was measured at a wavelength of 500 nm and plotted.
  • the vertical axis represents the apparent absorbance, and the horizontal axis represents the temperature (° C).
  • FIG. 10 shows an embodiment of the present invention, an aqueous solution of X- (Gly-Va-Gly-Hmb-Ala-Pro) -Y (concentration: 1.0 mg / 20 ⁇ 1) having a diameter of 5 mm. Agglomeration when heated at 80 ° C in a tube The state was described. ++ indicates strong agglomeration, + indicates agglomeration, one indicates no agglomeration, and X indicates that it is insoluble in water and cannot be examined.
  • FIG. 11 shows an embodiment of the present invention, an aqueous solution of poly (Glylie-Gly-Hmb-Pro) (0.1 mg / 1000 / zl) for an absorption spectrum made of quartz having a thickness of 1 mm. It is a temperature-changing circular dichroism spectrum measured when the temperature is increased by 10 ° C between 10 and 40 ° C and the temperature is equilibrated at each temperature.
  • FIG. 12 shows an absorption spectrum of a 1 mm-thick quartz aqueous solution (10 mg / 1000 / zl) of poly (Gly-Va-Gly-Hmb-Ala-Pro) according to one embodiment of the present invention. It is a photograph when it puts in the cell and maintains at 0 ° C and 20 ° C.
  • FIG. 13 is an absorption spectrum made of quartz of 1 mm thickness of an aqueous solution (10 mg / 1000 / zl) of poly (Gly-Va-Gly-Hmb-Ala-Pro) according to one embodiment of the present invention.
  • the transmittance (%) is calculated using the 500 wavelength. It was measured.
  • the vertical axis of the graph is shown as turbidity (100-transmittance (%)).
  • the horizontal axis shows temperature (° C).
  • FIG. 14 is an absorption spectrum made of quartz of 1 mm thickness of an aqueous solution (20 mg / 1000 / zl) of poly (Gly-Va) Gly-Hmb-Ala-Pro) according to one embodiment of the present invention.
  • the transmittance (%) is calculated using the 500 wavelength. It was measured.
  • the vertical axis of the graph is shown as turbidity (100-transmittance (%)).
  • the horizontal axis shows temperature (° C).
  • the compound of the present invention is a polymer compound having a repeating unit represented by the following general formula (I) and having a total number of amino acid residues and hydroxy acid residues of 18 or more.
  • R represents an amino acid, polypeptide or hydroxy acid linked by an ester bond.
  • R is an amino acid or polypeptide linked by an amide bond or an ester bond.
  • Hmb represents a valic acid residue of the following formula (II).
  • the amino acid (including those constituting the polypeptide) contained in R 1 and R 2 is preferably an a amino acid.
  • the side chain may be modified, or the side chain may be bound with a peptide.
  • R 1 and R 2 are polypeptides, those having 1 to 20 amino acids are preferred, and those having 2 to 9 amino acids are more preferred.
  • the types of amino acids (including those constituting the polypeptide) contained in R 1 and R 2 are selected for the purpose of adjusting the response temperature, solubility, and swelling properties according to the components of the temperature-responsive composition. Is called. For example, in general, if there is no charge, the higher the hydrophobicity of the amino acid X 1 side chain, the lower the response temperature, and the higher the hydrophilicity, the higher the temperature. This is clear from the research by the inventors (special 2004-501784) related to the inventors' research (eg Macromolecules, 1998, 31 pages, 33 pages 83; Macromolecules, 1996, 29 pages, pages 1065, etc.). is there.
  • Hydroxy acid means a carboxylic acid having a hydroxyl group, and examples thereof include valic acid, citrate, lactic acid and malic acid represented by the formula (III).
  • the polymer compound of the present invention preferably has a repeating unit represented by the above general formula (I) in which the repeating unit represented by the above general formula (I) contains -Gly-Hmb-. Those containing Pro- or -Gly-Hmb-Ala-Pro- are more preferred.
  • repeating unit of the general formula (I) -Gly- X-Gly- Hmb- Ala- Pro-,-Gl yX -Gly-Hmb-Pro-.
  • X and X are any ⁇ -amino acid residues.
  • the repeating unit is not limited to these.
  • the polymer compound of the present invention is a compound having a structure in which the above structural unit is repeated a plurality of times.
  • the structure of the polymer compound is preferably a linear structure, but may have a branched chain branched from the amino acid side chain.
  • the number of repetitions is not particularly limited as long as the total number of amino acid residues and hydroxy acid residues contained in the compound is 18 or more, and may be an oligomer having about 2 to 10 repetitions.
  • the total number of amino acid residues and hydroxy acid residues contained in the polymer compound of the present invention is preferably 1000 or less, more preferably 500 or less.
  • the polymer compound of the present invention preferably has a molecular weight of 1,500 to 100,000, more preferably 1,500 to 50,000.
  • at least one amino acid residue at the terminus and C-terminus of the polymer compound of the present invention is deprotected, it is more suitable for dissolution in an aqueous environment.
  • the polymer compound of the present invention may contain two or more types of repeating units of the general formula (I), or may contain repeating units of the general formula (I) and other repeating units such as polypeptides. May be.
  • the polymer compound of the present invention can be obtained, for example, by first synthesizing a compound of a repeating unit (debuspeptide) and polymerizing it.
  • the polymerization can be carried out by a normal amide condensation reaction.
  • an amino acid having a reactive side chain is contained, it is preferable to carry out the polymerization reaction while protecting the side chain.
  • segment condensation an extension reaction of one unit called segment condensation can also be used.
  • the polymer compound of the present invention may be one in which another compound or material is bonded to the terminal.
  • the terminal may be either the amino terminal side or the carboxy terminal side, or both.
  • hydroxy acid sequence, amino acid sequence, sugar chain sequence, protein, polysaccharide, metal complex or polymer carrier, gel, film, latex particle, metal fine particle, plastic plate, etc. can be used.
  • Other compounds and materials can be bonded by covalent bonds, coordinate bonds, ionic bonds, hydrophobic interactions, hydrogen bonds, and the like.
  • the compound of the present invention has temperature responsiveness! /, Preferably. What is temperature responsiveness? For example, in water or in a buffer solution, it refers to the property of agglomeration when heated from a first temperature on the low temperature side to a second temperature on the high temperature side.
  • the first temperature and the second temperature vary depending on the type of amino acid contained in the polymer compound and the type of other compound to be bonded to the terminal, and are appropriately set for each polymer compound.
  • the difference in temperature is preferably 10 ° C or more.
  • the difference between the second temperature and the first temperature is
  • poly (Gly-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro) is aggregated when heated from 25 ° C to 55 ° C.
  • a difference between the second temperature and the first temperature of about 10 to 20 ° C is sufficient.
  • poly (Gly-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro) is clearly aggregated when heated from 0 ° C to 20 ° C.
  • Aggregation can be confirmed by visual observation, a change in transmittance using a spectrophotometer, or an apparent change in absorbance.
  • the polymer compound of the present invention can be used in the production of a temperature-responsive composition.
  • the temperature-responsive composition is used alone or in combination with a physiologically acceptable carrier, the polymer compound of the present invention or the polymer compound of the present invention bound to the above-mentioned other compound or material. .
  • the physiologically acceptable carrier is not particularly limited and may be a solid agent such as a powder or a powder.
  • the polymer compound of the present invention is usually used as a liquid agent in combination with a liquid carrier.
  • liquid carriers include water, physiological saline, buffer solution (phosphate buffer solution, etc.), aqueous alcohol solution (ethanol solution, etc.), polyhydric alcohol aqueous solution (5% glycerin aqueous solution, ethylene glycol aqueous solution, propylene glycol).
  • Aqueous solution 5% glucose aqueous solution, glucose aqueous solution etc.
  • albumin aqueous solution 5% albumin solution etc.
  • the liquid preparation may be a solution, a suspension, an emulsion, an ointment, an aerosol, a patch (a pasta or a nop).
  • concentration of the temperature-responsive material (or temperature-responsive polymer) in the liquid is, for example, 0.1 to 90% by weight, preferably 0.5 to 50% by weight, depending on the solution viscosity of the polymer. More preferably 1-30 A range force of about 1% by weight (eg 1 to 15% by weight), in particular 1 to about LO weight%, can also be selected.
  • the temperature-responsive composition includes various physiologically and pharmacologically acceptable additives such as polypyrrole pyrrolidone, macrogol, polybulal alcohol, and cellulose derivatives (cell mouth ethers, etc.). molecules, preservatives, stabilizers, emulsifiers or suspending agents, P H adjusting agents, buffering agents, agents (fungicides, disinfectants, antibacterial agents, antiviral agents, anti-inflammatory agents, antiallergic one, analgesics, A hemostatic agent, etc.).
  • physiologically and pharmacologically acceptable additives such as polypyrrole pyrrolidone, macrogol, polybulal alcohol, and cellulose derivatives (cell mouth ethers, etc.). molecules, preservatives, stabilizers, emulsifiers or suspending agents, P H adjusting agents, buffering agents, agents (fungicides, disinfectants, antibacterial agents, antiviral agents, anti-inflammatory agents, antiallergic one, analgesics, A hemostatic agent, etc.).
  • the temperature-responsive composition of the present invention has the property of aggregating in response to temperature (for example, changing from a liquid to a gel), and also has an advantage of high safety in vivo. is there. Therefore, a gel-like film can be formed on the application part by application to a living body (for example, an affected part).
  • the polymer or composition of the present invention is a composition that can be decomposed and absorbed in vivo, a composition that can be decomposed and absorbed in an environment such as soil, a cell adhesive, a wound dressing material, a microcapsule, a biomachine, a biosensor, and a separation membrane. Can be used to construct test kits, etc.
  • operations common in the practice are shown as synthesis procedures 1 to 3.
  • the following specific examples are not intended to limit the present invention. Of course, it can be changed as appropriate, such as by substituting.
  • Other depsipeptide units for example, -Gly-X-Gly- Hmb- Pro- and-Gly- X-
  • Boc-Gly-OH N a -t-butoxycarbol-glycine
  • Boc-Ala-OH Na-t-butoxycarbonyl-L-alanine
  • EDC ⁇ HC1 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carpositimide hydrochloride
  • L-amino acid or side chain protected L-amino acid (1.0 mol) was dissolved in 4M NaOH (250 ml, 1.0 mol) and slowly cooled with ice-MeOH in a minimum amount of dioxane (Boc) 0 (
  • a peptide compound having an amino group protected with N-a-t-butoxycarbol was placed in 300 ml of Nasflask and TFA (or 4M HC1 in dioxane) was added and dissolved in a fume hood. Immediately, the lid was covered with a calcium salt tube to prevent moisture from entering. After confirming the completion of the reaction by TLC, concentrate and concentrate by adding distilled Et 0 repeatedly until there is no TFA odor (or hydrochloric acid odor).
  • An oily or colorless powdered condensation product is obtained. This can be purified by silica gel chromatography (distilled CH C ⁇ petroleum ether) or gel filtration chromatography (Falmacia LH20,
  • Hmb a CH 2.09 (1H, Hmb ⁇ CH); 1.50, 1.00 (6H, Hmb y CH).
  • Boc-Gly-OH (1.54 g, 8.82 mmol) was put into a 500 ml eggplant flask and dissolved in CHC1
  • Boc-Gly-OSu (1.00 g, 3.7 mmol) is placed in a 500 ml eggplant flask and dissolved in distilled THF. Further, DMAP (0.040 g, 0.37 mmol) was added and dissolved. Next, paric acid (0.52 g, 4.4 mmol) was placed in a 300 ml eggplant flask, dissolved in distilled THF, and pyridine (0.29 ml, 4.4 mmol) was added to protect the lupoxy terminal side. The two solutions were combined and stirred under cooling.
  • Boc-Gly-Hmb-OH (4.59 g, 16.6 mmol), HOBt (2.25 g, 16.6 mmol), EDC-HC1 (3. 17 g, 16.6 mmol), HCl 'H- Ala- Pro- OBzl (4.15 g, 13.34 mmol), NMM (1.46 ml, 13.3
  • Boc-Gly 1 -Vaf-Gly 3 -Hmb 4 -Ala 5 -Pro 6 -OBzl (1.14 g, 1.65 mmol) was placed in a 500 ml eggplant flask and dissolved in MeOH to prepare palladium carbon powder. After assembling the apparatus, the eggplant flask was filled with H and stirred to start the catalytic reduction reaction. Above the liquid level
  • Boc- Gly 1 -Val 2 -Gly 3 -Hmb 4 -Ala 5 -Pro 6 -OH (0.38 g, 0.63 mmol) was dissolved in distilled DMF and DCC (0.14 g, 0.69 mmol) and HOSu (0.08 g, 0.69 mmol) was added and stirring was started under ice-cooling. After one night, the completion of the reaction was confirmed by TLC. After removing DCUrea and concentrating, white powder was obtained. Yield: 0.35.g (80%).
  • TFA'H-Gly 1 -Val 2 -Gly 3 -Hmb 4 -Ala 5 -Pro 6 -OSu (0.80 g, 1.12 mmol) was placed in 100 ml eggplant flask and dissolved in distilled Dioxane, and stirring was started. Tetraethylamine (155 ⁇ , 1.12 mmol) was dropped into the system to initiate polymerization. Two weeks later, when the solution gelled, the molecular weight was confirmed by mass spectrometry.
  • gel polymer was dissolved in distilled DMF, EDC'HCl (0.21 g, 1.12 mmol) and HOBt (0.15 g, 1.12 mmol) were added, and the mixture was stirred again for 2 weeks. Then, dialyze with a semipermeable membrane that passes a molecular weight of 3500 or less for 1 week. A colorless powder was obtained by lyophilization. Yield: 91 mg (ll%), melting point 175-180 ° C., average molecular weight 6500 (apparent value by MALDI-TOF mass spectrometry).
  • TFA-H-Gly-Val-Ala-Pro-OMe (SEQ ID NO: 4) (0.50 g, 1.06 mmol), NMM (approximately equimolar for TFA salt neutralization), Boc-Lys (Z) -OH (0.48 g, 1.28 mmol), EDC-HCl (0.24 g, 1.28 mmol), and HOBt (0.17 g, 1.28 mmol) were used for the condensation reaction. Distilled CHC1 -Steam
  • Boc- Gly 1 -Lys (Z) 2 -Gly 3 -Val 4 -Ala 5 -Pro 6 -OMe (SEQ ID NO: 5) (0.33 g, 0.42 mmol) is placed in a 100 ml eggplant flask and mixed with MeOH and water. 1M NaOH aqueous solution (0.6 37 ml) was added and stirring was started under cooling. After 1 hour, the completion of the reaction was confirmed by TLC, and the solution was concentrated and washed with ether. Then, adjust the pH to around 3-4 with IN HC1, and extract with CHC1.
  • Boc- Gly- Lys (Z)-Gly- Hmb- Ala- Pro- OH (SEQ ID NO: 7) (0.27 g, 0.35 mmol) was dissolved in distilled DMF and DCC (0.08 g, 0.42 mmol) and HOSu (0.05 g , 0.42 mmol) and stirring was started under cooling. After one night, the completion of the reaction was confirmed by TLC, and the solution from which DCUrea had been removed was concentrated to obtain a white powder. Yield: 0.24 mg (80%). 1H NMR (DMSO-d, 30
  • TFA 'H- Gly 1 - Vaf- Gly 3 - Hmb 4 - Ala 5 - Pro 6 - OSu (0.430 g, 0.600 mmol) and TFA' H- Gl y 1 - Lys (Z) 2 - Gly 3 - Val 4 - Ala 5 -Pro 6 -OSu (SEQ ID NO: 9) (0.040 g, 0.050 mnol) was prepared in a molar ratio of 0.90: 0.10 and dissolved in distilled dioxane. Polymerization was initiated by adding tetraethylamine (90 ⁇ 1, 0.65 mmo 1). After stirring for 1 week, the molecular weight was confirmed by mass spectrometry.
  • HCl-H-Pro-OBzl (10.22 g, 42.3 mmol) was placed in a 500 ml eggplant flask, and distilled chloroform (250 ml) was added and stirred using a magnetic stirrer to dissolve. And NMM (4.70 ml, 42.6 mmol), Boc-Gly-Hmb-OH (13.99 g, 50.8 mmol), HOBt (7.74 g, 57.3 mmol) were added. Then, DCC (12.01 g, 58.2 mmol) was added with ice cooling, and the mixture was stirred. After the reaction was completed, DCUrea was removed by filtration and concentrated. Then, EtOAc (300 ml) was added and allowed to stand for 1 hour. After removing DCUrea again, the sample was washed with 10% aqueous citrate solution three times, brine once, saturated NaHCO aqueous solution three times, and brine once in this order. The organic phase is dried by adding Na SO
  • Boc-Gly-Va-Gly-Hmb-Pro-OBzl (2.51 g, 4.06 mmol) was placed in a 300 ml eggplant flask and dissolved in MeOH (30 ml). Thereafter, a full amount of palladium spatula was added and stirring was started. The system was replaced with hydrogen gas, and catalytic reduction was carried out for about 24 hours. After completion of the reaction, palladium carbon was removed by filtration, MeOH was distilled off, and hexane (30 ml) was added to the residue for crystallization. Then, recrystallization was performed with EtOAc (20 ml) and hexane (50 ml). Yield: 1.85 g (86%), mp 73-77. C, [ ⁇ ] 20 : -89 deg. (MeOH, c 0.1).
  • Boc-Gly-Val-Gly-Hmb-Pro-OH (0.34 g, 0.64 mmol) was placed in a 50 ml eggplant flask and dissolved in 5 ml of DMF. Then, HOSu (0.10 g, 0.87 mmol) was added, and DCC (0.17 g, 0.82 mmol) was added and stirred while cooling with ice. After the reaction was completed, the produced DCUrea was filtered off, and the filtrate was concentrated. The residue was filtered with EtOAc and again DCUrea was filtered off. A colorless solid was obtained after drying with a vacuum pump. Yield: 0.36 g (89%), [ ⁇ ] 20 :-79 deg. (MeOH, c 0.1), melt
  • Boc-Gly-Thr-Gly-Hmb-Pro-OH (0.71 g, 1.34 mmol) was placed in a 100 ml eggplant flask and dissolved in DMF (10 ml). Then, HOSu (0.23 g, 2.01 mmol) was added, and D CC (0.41 g, 2.01 mmol) was added with ice cooling, followed by stirring. After the reaction was completed, DCUrea was filtered off and the filtrate was concentrated. EtOAc was added to remove insoluble DCUrea again. Concentration again gave a colorless oil. Yield: 1.0 g (almost quantitative).
  • Boc- Gly- Hmb- OH (10.71 g, 38.9 mmol) was dissolved in distilled CHC1 and DCC (8.03 g, 38.9 mmol) was dissolved.
  • H lie NH); 5.09 (2H, -OBzl— CH-); 4.87 (IH, Hmb a CH); 4.38 (IH, Pro a CH);
  • Boc- Gly- OH (2.58 g, 14.7 mmol), EDC-HCl (2.83 g, 14.7 mmol), HOBt (1.99 g, 14.7 mmol), HCl 'H— lie— Gly— Hmb— Pro— OBzl (6.88 g, 13.4 mmol), NMM (1.47 ml, 1 3.4 mmol) was used to carry out the condensation reaction. Purification was performed by column chromatography (EtOAc: benzene 1: 10) to obtain an oily target product.
  • Boc-Gly 1 -lie 2 -Gly 3 -Hmb 4 -Pro 5 -OBzl (4.93 g, 7.79 mmol) was dissolved in MeOH to prepare paradium carbon powder. After assembling the device, fill the eggplant flask with H. And the catalytic reduction reaction was started. While confirming the progress of the reaction from the rise in the liquid level, the reaction was completed when the spot of the raw material disappeared by TLC. Thereafter, the palladium carbon powder was removed and the filtrate was concentrated. Thereafter, benzene was added for azeotropy to obtain an oily target product.
  • Boc-Gly 1 -lie 2 -Gly 3 -Hmb 4 -Pro 5 -OH (4.34 g, 8.00 mmol) was dissolved in distilled DMF, DCC (1.82 g, 8.80 mmol) was added, and stirring was started under ice cooling. After slowly returning to room temperature and stirring overnight, DCUrea was removed. Then concentrate and dehydrate with Et 0 / petroleum ether
  • the temperature-changing circular dichroism spectrum of the compound obtained by the present invention was measured. This can obtain information different from the temperature responsiveness change by visual observation. For example, knowledge about the solution structure. As an example, poly (Gly_ValyGly-Hmb-Ala-Pro) is shown in FIG. 3, and poly (Gly-Gly-Hmb-Pro) is shown in FIG.
  • Fig. 11 changed while showing an isocircular dichroic point at 220 nm. At low temperatures, it showed a negative maximum at 195 nm, and as the temperature rose, it showed a positive maximum at 210 nm and a negative maximum at 225 nm. The negative maximum seen at 195 nm decreases with increasing temperature. This is the same trend as in Fig. 3, and the same structural change can be considered. Aggregation is not observed due to dilute aqueous solution (0.1 mg / mL).
  • FIG. 4 and FIG. 5 show the case of poly (Gly-Va-Gly-Hmb-Ala-Pro), and FIG. 12 shows the case of poly (Gly-Gly-Gly-Hmb-Pro).
  • 4 and 5 show that the clear aqueous solution becomes cloudy when heated to 55 ° C at 25 ° C.
  • Fig. 12 it can be seen that the clear aqueous solution becomes cloudy when heated to 20 ° C at 0 ° C.
  • FIG. 6-9 shows poly (Gly-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro), poly [(Gly- Vato Gly- Hmb- Ala- Pro)-co- (Gly- Lys (Z)- Gly- Va- Ala- Pro)], poly (Gly- Va ⁇ Gly- Hmb- Pro), poly (Gly- Thr- Gly- Hmb- Pro), TFA-H-(Gly-Val-Gly-Hmb-Pro) ) -OH example is shown.
  • the vertical axis of the graph is not the transmittance
  • the transition temperature during heating was 5 ° C, which was a lower value.
  • the transition temperature during cooling was 3.5 ° Ct °. V and deviation were confirmed to be a reversible transition phenomenon.
  • Figure 10 shows a compound with a certain number (3 or 6) of Gly-VaA Gly-Hmb-Ala-Pro- units, poly (Gly-Va ⁇ Gly-Hmb-Ala-Pro), poly (Gly- Examples of Val-Gly-Hmb-Pro), poly (Gly-Thr-Gly-Hmb-Pro), and poly (Gly-Gly-Gly-Hmb-Pro) are shown.
  • a temperature-responsive depsipeptide polymer and a temperature-responsive composition containing the same can be obtained.
  • the polymer or composition of the present invention is a composition that can be decomposed and absorbed in vivo, a composition that can be decomposed and absorbed in an environment such as soil, a cell adhesive, a wound dressing material, a microphone mouth capsule, a biomachine, a nanosensor, It can be used to construct separation membranes and test kits.
  • the polymer and temperature-responsive composition of the present invention have the advantage of being highly safe in vivo.

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Abstract

　下記一般式（I） -R1-Hmb-R2-  （I） （式中、Hmbは下記式（II）のバリン酸残基を示し、R1はエステル結合で結合したアミノ酸、ポリペプチドまたはヒドロキシ酸、R2はアミド結合で結合したアミノ酸もしくはポリペプチド、またはエステル結合で結合したヒドロキシ酸を表す） で表される繰り返し単位を有し、アミノ酸残基及びヒドロキシ酸残基の総数が１８以上である温度応答性ポリマー化合物を提供する。

Description

明 細 書
温度応答性デプシペプチドポリマー
技術分野
[0001] 本発明は、新規な温度応答性材料に関する。更に詳しくは、バリン酸残基とアミノ酸 残基が脱水縮合されてできたデプシペプチドを構成成分として持つ温度応答性ポリ マーに関する。本発明のポリマーは、水または緩衝液中で温度に応答し凝集する性 質を利用して、生体吸収性組成物、環境分解性組成物、細胞接着剤、マイクロカブ セル、バイオマシン、バイオセンサー、分離膜、検査キットなどを構成するのに有用で ある。
背景技術
[0002] (1)デプシペプチドおよび関連材料の現況：
(la:アミノ酸を用いた材料)ポリアミノ酸は蛋白質のモデル物質として多くの研究が 行われてきた。ポリアミノ酸は例えば、アミノ酸とホスゲンとの反応で得られる N-カルボ キシアミノ酸無水物の開環重合によって容易に得ることができる（非特許文献 1)。ポリ アミノ酸を生体材料や土壌中での分解性材料として利用する研究はアミノ酸が天然 由来の化合物であり生体内で容易に分解されるであろうとの考え力 行われている（ 非特許文献 2)。
[0003] ポリアミノ酸やオリゴアミノ酸は式 1に示すように主鎖がアミド結合で連結された高分 子であり、分子間または分子内で強固な水素結合を形成して安定な高次構造を持つ ことを特徴としている。多くの研究より製剤の容易さや生体分解性は分子間や分子内 相互作用の強弱と密接に関連があるとわ力つた。
[化 1] ァミ ド結合 ァミ ド結合 [0004] 実際、無極性の側鎖を持つポリアミノ酸やオリゴアミノ酸は溶融法や溶液法で成型 加工することができない。しかし側鎖保護のなされた極性アミノ酸、例えばァスパラギ ン酸ゃグルタミン酸、を含むポリアミノ酸は溶融成型が可能であった。また有機溶媒 にも比較的溶けやすい。これは強固な水素結合の形成が阻害されたため、成型加工 が可能になったと考察されている (非特許文献 3)。
[0005] し力しこの様にして成型された材料でも、生体分解速度の遅いことが欠点であった 。例えばラット皮下に埋め込んだ場合、最も早い場合で 90日後に 35%しか分解が起 きて 、な ヽ (非特許文献 4)。よって主鎖のアミド結合間の水素結合によって分子間ま たは分子内に強固な相互作用を持つポリアミノ酸やオリゴアミノ酸は、成型加工や分 解性の点で生体材料としては適さないことがわ力つた。
[0006] (lb：ヒドロキシ酸を用いた材料） ポリヒドロキシ酸またはオリゴヒドロキシ酸は式 2に示 すように主鎖がエステル結合で連結された物質である。エステル結合は水素結合を 形成することができないので、ポリヒドロキシ酸は分子間または分子内に強固な相互 作用を持たな 、。そのためにポリヒドロキシ酸はポリアミノ酸より優れた生体内での分 解性を示すことが期待される。
[化 2] エステル結合 エステル結合
Figure imgf000004_0001
[0007] 実際にポリヒドロキシ酸は分子量の比較的低いもの（1万前後）に関しては溶融成型 が比較的容易である。また生体内での分解速度は分子量に依存して大きく変化し、 低分子量のものほど分解速度は速い。また生体内で完全に分解し消失する (非特許 文献 5)。
[0008] このような性質力 ポリヒドロキシ酸は、ポリ乳酸やポリ (乳酸- Co-グリコール酸) (-CO- は共重合化合物を示す記号)が臨床的にも生体材料として実用化されている。また 逆に欠点も明らかになつてきた。例えば、分解過程で多量の酸性成分を放出するた め、体内に炎症をおこす、耐酸性のある物質しか生体材料として利用できない、分子 間や分子内相互作用がほとんどないために機械的強度が低い、ことの 3点である。
[0009] (1 ヒドロキシ酸とアミノ酸を用いた材料） デプシペプチドは式 3に示すように主鎖 がエステル結合とアミド結合で連結されたポリマーまたはオリゴマーである。その構造 の骨格はアミド結合とエステル結合力 できて 、る。
[化 3] アミ ド結合 エステル結合
Figure imgf000005_0001
[0010] 骨格に含まれるアミド結合力 は分子内と分子間に強い相互作用を起こし構造安 定ィ匕や機械的強度による剛直性が期待される。またエステル結合力ゝらは相互作用が 弱!ヽまたは反発を起こしやす！/ヽために構造不安定化や機械的強度の減少〖こよる柔 軟性が期待される。従ってデプシペプチドはアミノ酸ゃヒドロキシ酸によるオリゴマー やポリマーの特徴を生力した材料とすることができる。つまりアミノ酸とヒドロキシ酸の 種類や組成、配列を変化させることで幅広 ヽ特性を持つ材料を合成することができる 。このようにデプシペプチドは極めて魅力的な物質である。
[0011] 実際にデプシペプチドについてはさまざまな研究が行われた。例えばヒドロキシ酸 の側鎖を H -、 CH -、 (CH ) CH -、 (CH ) CH-CH -のように疎水性と立体障害の大き
3 3 2 3 2 2
さを変化させると生体内での分解速度が 2週間から 6ヶ月まで幅広く調節できることが ゎカゝつている。また生体組織との接合面に炎症はみられないことも特徴的である（非 特許文献 6)。
[0012] (2)温度応答性材料の現況：
近年、温度を上昇させることで凝集する温度応答性材料の研究に注目が集まって いる。これらは水を多く含有する性質を利用して創傷被覆材料、マイクロカプセル、 バイオマシン、バイオセンサー、分離膜などへの利用が期待されている。
(2a:ビニルポリマー） 温度応答性材料中でも最も研究が盛んであるのは、ポリ (N置 換メタクリルアミド)またはポリ (N置換アクリルアミド)というビニルポリマーを主成分とし た材料である（例えば、特許文献 1〜6)。ビニルポリマーは生体内や土壌中での分 解ができな 、ためにこれを改良する研究も盛んである。例えばデンプン (特許文献 7) 、デキストラン (特許文献 8)、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコール (特許 文献 9)との共重合体が用いられている力 生体や土壌で分解されないビュルオリゴ マーの残留は依然として問題となりうる。
[0013] (2b :その他の材料）
デプシペプチドのように種類や組成、配列を変化させることで製剤や分解性に幅広 V、特性を持たせることはできな 、ものの、生体や土壌で安全な化合物にまで分解可 能な材料が幾つか知られている。例えばポリエーテルエステル (特許文献 10)、メチ ルセルロース (特許文献 11)、ポリ (N-置換ァスパラギン)（特許文献 12)、デンプンま たはアルギン酸-ペプチド共重合体 (特許文献 13)である。特にメチルセルロース材 料は市販の目薬成分として実用化されて!/ヽる。
[0014] 近年発達した遺伝子組み換えによる方法も温度応答性材料の開発に用いられて いる（特許文献 14または 15)。これはエラスチンと呼ばれる蛋白質のモデル物質合 成やその構造研究がもとになつて 、る（非特許文献 7)。これらはアミノ酸配列や組成 を変化させて幅広 、特性を持つ温度応答性材料とすることが可能である。主に用い られて 、る基本配列は- Gly-Aaa- Gly-Baa-Pro- (配列番号 1： Aaaはパリンをはじめと するほとんどの α—アミノ酸、 Baaはパリンまたはイソロイシン）である。生体材料として 用いる際の問題点としては菌体を破砕して抽出精製する際の、発熱物質と呼ばれる 菌体由来の不純物の混入に注意しなくてはならな 、。また数グラム単位での合成に は、数百リットル以上の大規模な培養設備が必要となる。
[0015] (3)温度応答性デプシペプチドの合成研究と問題点：
本発明の実施に於 、て用いられるデプシペプチド単位の一態様、 -Gly-Val-Gly-H mb- Pro- (Hmb = /《リン酸残基）は発明者らによって合成法が報告されている (非特 許文献 8)。しかし有機溶媒を含まな!/、水系溶媒中で温度応答性を示す材料になら な 、と考えられた。なぜなら同じ文献には関連化合物である Boc-(Gly-Va卜 Gly-Hmb -Pro) - OBzl (n = 1-3) (Boc = t-ブトキシカルボ-ル、 OBzl =ベンジルエステル）が 報告されているが、これらは長さが短くかつ末端に保護基が付いていることもあり、へ キサフルォロイソプロパノールを 2.5%以上含有することによってしか水溶液にするこ とができず、従ってそれらの溶液に於いては目視ゃ濁度による温度応答性は観測さ れなかったからである。そのためデプシペプチド単位、 -Gly-X -Gly-Hmb-Pro- (X =
2 2 任意の α—アミノ酸残基）は温度応答性を示す材料には不適であるとみなし、十分 な検討がなされなかった。
特許文献 1：特開平 7-228639号公報
特許文献 2：特開平 8-143631号公報
特許文献 3：特開平 9-169850号公報
特許文献 4 :特開平 10-273451号公報
特許文献 5：特開 2000-212144号公報
特許文献 6：特開 2000-344834号公報
特許文献 7：特開 2002-256075号公報
特許文献 8：特開 2003-252936号公報
特許文献 9：特開平 11-322941号公報
特許文献 10：特開 2000-80158号公報
特許文献 11：特開 2003-160473号公報
特許文献 12：特開 2004-35791号公報
特許文献 13：特開 2002-256075号公報
特許文献 14 :特表 2001-514263号公報
特許文献 15：特表 2004-501784号公報
非特許文献 1 : Journal of Organic Chemistry 1985年、 50卷、 715ページ
非特許文献 2 : Journal of Biomedical Materials Research, 1977年、 11卷、 405ページ 非特許文献 3 : Journal of Macromolecular Science- Chemistry, 1984年、 A21卷、 561 ぺ1 ~~ジ
非特許文献 4 : Macromolecular Chemie、 1983年、 184卷、 1761ページ
非特許文献 5 : Biomaterials、 1989年、 10卷、 569ページ
非特許文献 6 Journal of Biomedical Materials Research, 1990年、 24卷、 1173ページ 非特許文献 7 : Progress in Biophysics and Molecular Biology^ 1992年、 57卷、 23ぺー ジ
非特許文献 8 : Peptide Science 2003、 日本ペプチド学会、 2004年、 177ページ 発明の開示
[0016] 本発明の課題は、広範な特性の分子設計ができるデプシペプチドと温度応答性を 組み合わせた新規な材料を提供することにある。
[0017] 本発明者等は、上記目的を達成するために新たな配列に着目した。即ち従来は不 溶'性のために注目されてこなかったエラスチン中の酉己列、 -Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pr 。- (配列番号 2)に着目し、ノ《リン酸に置換したデプシペプチド、 -Gly-X -Gly-Hmb- Ala-Pro- (Xは任意の α -アミノ酸残基）の合成を行った。最初に Boc-(Gly-Va卜 Gly- Hmb-Ala-Pro) - OBzl (n = 1-6)の合成を行った。これらは特に 3〜6量体（n = 3-6)に 於、てカルボキシ末端ゃァミノ末端の保護基を外すことにより容易に水溶液となり目 視による明瞭な温度応答性を示すことが確認された。つづいて重合ィ匕合物 (例えば p oly(Gly-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro))や共重合化合物（例えば poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)- co- (Gly- Lys(Z)- Gly- Va卜 Ala- Pro)) )などの誘導体を合成し、その温度応 答性を確認した。
[0018] そこで再び当初のデプシペプチド単位、 -Gly-X - Gly-Hmb-Pro- (Xは任意のアミ
2 2
ノ酸残基）をもつ化合物（例えば poly(Gly-Va卜 Gly-Hmb- Pro))について検討したとこ ろ当初の予想と異なり水溶性があり、水系溶媒中での温度応答性を見出した。その ため poly(Gly- Thr- Gly- Hmb- Pro)や poly(Gly- lie- Gly- Hmb- Pro)などの関連化合物 の合成を行った。このように種々のノ リン酸残基を含むデプシペプチドにつ 、て鋭意 検討した結果、本発明を完成するに至った。
[0019] すなわち、本発明は、下記一般式 (I)
-R -Hmb-R - (I)
1 2
(式中、 Hmbは下記式 (II)のバリン酸残基を示し、 Rはエステル結合で結合したァミノ
1
酸、ポリペプチドまたはヒドロキシ酸、 Rはアミド結合で結合したアミノ酸もしくはポリべ
2
プチド、またはエステル結合で結合したヒドロキシ酸を表す）
[化 4]
Figure imgf000009_0001
で表される繰り返し単位を有し、アミノ酸残基及びヒドロキシ酸残基の総数が 18以上 であるポリマー化合物を提供する。
具体的には、上記一般式 (I)で表される繰り返し単位が- Gly-Hmb-を含むポリマー 化合物が好ましぐ上記一般式（I)カ Gly-Hmb-Pro-または- Gly-Hmb-Ala-Pro-を 含むポリマー化合物がより好ましぐ上記一般式（I)力 -Gly-X -Gly-Hmb-Ala-Pro- または— Gly— X -Gly-Hmb-Pro-
2
(X及び Xは a アミノ酸残基を示す)であるポリマー化合物が特に好ましい。
1 2
本発明のポリマー化合物はまた、上記ポリマー化合物の末端に糖鎖配列、タンパク 質、多糖、金属錯体または高分子担体、ゲル、フィルム、ラテックス粒子、金属微粒子 、プラスチックプレートが結合したものであってもよ 、。
本発明はさらに、上記のいずれかのポリマー化合物を含む温度応答性組成物を提 供する。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は本発明の一実施態様である、 polyKGly1- Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) -co - (Gly -Lys(Z)8- Gly9- v - Ala11- Pro12) ]について DMSO- d中 30。Cで測定した 500
l-n 6
MHz 1!"! NMR ^ベクトルである。
[図 2]図 2は本発明の一実施態様である、 poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)を MALDI -TOF質量分析法により測定したスペクトルである。
[図 3]図 3は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Va卜 Gly-Hmb-Ala-Pro)の水溶液 (1 mg/1000 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 40〜60°Cの間で 10°C毎に温度上昇させ、各温度での温度平衡になった際に測定された、温度変化 円偏光二色性スペクトルである。 [図 4]図 4は本発明の一実施態様である、 poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)の水溶液 (1 mg/50 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 25°Cに維持した際の 写真である。
[図 5]図 5は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Va卜 Gly-Hmb-Ala-Pro)の水溶液 (1 mg/50 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 55°Cに維持した際の 写真である。
[図 6]図 6は本発明の一実施態様である、 poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)の水溶液 (1 mg/50 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 40〜57°Cの間で 1 °C毎に温度上昇させ、各温度での温度平衡になった際に 500 nmの波長で見かけ上 の吸光度を測定し、プロットしたグラフである。縦軸は見かけの吸光度、横軸は温度（ 。C)を示す。
[図 7]図 7は本発明の一実施態様である、 poly[(Gly-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro)-co-(Gly - Lys(Z)- Gly- Va- Ala- Pro)]の水溶液（1 mg/50 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スぺタト ル用セルに入れ、 33〜50°Cの間で 1°C毎に温度上昇させ、各温度での温度平衡に なった際に 500 nmの波長で見かけ上の吸光度を測定し、プロットしたグラフである。 縦軸は見かけの吸光度、横軸は温度 (°C)を示す。
[図 8]図 8は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Va卜 Gly-Hmb-Pro)の水溶液（1 m g/50 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 20〜30°Cの間で 1°C毎 に温度上昇させ、各温度での温度平衡になった際に 500應の波長で見かけ上の吸 光度を測定し、プロットしたグラフである。縦軸は見かけの吸光度、横軸は温度 (°C) を示す。
[図 9]図 9は本発明の一実施態様である、 TFA'H- (Gly- Va卜 Glv- Hmb- Pro) -OHの
5 水溶液（1 mg/50 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 47〜59°Cの 間で 1°C毎に温度上昇させ、各温度での温度平衡になった際に 500 nmの波長で見 かけ上の吸光度を測定し、プロットしたグラフである。縦軸は見かけの吸光度、横軸 は温度 (°C)を示す。
[図 10]図 10は本発明の実施態様である、 X- (Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro) - Yの水溶 液 (濃度： 1.0 mg/20 μ 1)を直径 5mmのガラス管に入れ、 80°Cで加温した際の凝集の 様子を記載した。 + +は強い凝集を、 +は凝集を、一は凝集が見られないことを、 X は水に難溶なため検査できな 、ことを示す。
[図 11]図 11は本発明の一実施態様である、 poly(Gly- lie- Gly- Hmb- Pro)の水溶液（0. 1 mg/1000 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 10〜40°Cの間 で 10°C毎に温度上昇させ、各温度での温度平衡になった際に測定された、温度変 化円偏光二色性スペクトルである。
[図 12]図 12は本発明の一実施態様である、 poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)の水溶 液（10 mg/1000 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 0°Cと 20°Cに 維持した際の写真である。
[図 13]図 13は本発明の一実施態様である、 poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)の水溶 液（10 mg/1000 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 0〜20°Cの間 で 1°C毎に温度を上昇または下降させ、各温度での温度平衡になった際に、 500 應 の波長を用いて透過率（％)を測定した。グラフの縦軸は濁度（100-透過率（％) )と して記載した。横軸は温度 (°C)を示す。
[図 14]図 14は本発明の一実施態様である、 poly(Gly-Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)の水溶 液（20 mg/1000 /z l)を 1 mm厚の石英製吸収スペクトル用セルに入れ、 0〜20°Cの間 で 1°C毎に温度を上昇または下降させ、各温度での温度平衡になった際に、 500 應 の波長を用いて透過率（％)を測定した。グラフの縦軸は濁度（100-透過率（％) )と して記載した。横軸は温度 (°C)を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の化合物は、下記一般式 (I)で表される繰り返し単位を有し、アミノ酸残基及 びヒドロキシ酸残基の総数が 18以上であるポリマー化合物である。
-R -Hmb-R - (I)
1 2
ここで、 Rはエステル結合で結合したアミノ酸、ポリペプチドまたはヒドロキシ酸を表
1
し、 Rはアミド結合で結合したアミノ酸もしくはポリペプチド、またはエステル結合で結
2
合したヒドロキシ酸を表す。また、 Hmbは下記式 (II)のバリン酸残基を示す。
[化 5]
Figure imgf000012_0001
on
R 1及び R 2に含まれるアミノ酸 (ポリペプチドを構成するものも含む）は a アミノ酸が 好ましい。また、側鎖が修飾されたもの、側鎖にペプチドなどが結合したものなどであ つてもよい。また、 R 1及び R 2がポリペプチドの場合、アミノ酸の数が 1〜20個のものが 好ましぐ 2〜9個のものがより好ましい。
R 1及び R 2に含まれるアミノ酸 (ポリペプチドを構成するものも含む）の種類は、温度 応答性組成物の成分に合わせて、応答温度や溶解性ゃ膨潤性の調節を目的として 選択が行われる。例えば一般に電荷を帯びることがなければ、アミノ酸 X 1側鎖の疎水 性が大きいほど応答温度が低温側へ、親水性が大きいほど高温側に調節することが 可能である。これは発明者らの関連研究（例えば Macromolecules、 1998年、 31卷、 33 83ページ； Macromolecules、 1996年、 29卷、 1065ページなど）ゃゥリーらの研究例（特 表 2004-501784)により明らかである。
ヒドロキシ酸とは水酸基を有するカルボン酸を意味し、式 (III)で表されるバリン酸、 クェン酸、乳酸、リンゴ酸などが挙げられる。
[化 6]
Figure imgf000012_0002
本発明のポリマー化合物は、上記一般式 (I)で表される繰り返し単位が- Gly-Hmb- を含むものが好ましぐ上記一般式 (I)で表される繰り返し単位が- Gly-Hmb- Pro-ま たは- Gly- Hmb- Ala- Pro-を含むものがより好ましい。
一般式（I)の繰り返し単位としてより具体的には、 - Gly- X -Gly- Hmb- Ala- Pro-、 - Gl y-X -Gly-Hmb-Pro-などが挙げられる。ここで、 X 、 Xは任意の α—アミノ酸残基を
2 1 2
示している。ただし、繰り返し単位はこれらのものには限定されない。
[0024] 本発明のポリマー化合物は上記構造単位が複数回繰り返された構造を有する化合 物である。ポリマー化合物の構造は直鎖状構造が好ましいが、アミノ酸側鎖から分岐 した分岐鎖を有するものであってもよ 、。
繰り返しの回数は化合物に含まれるアミノ酸残基及びヒドロキシ酸残基の総数が 18 個以上であれば特に制限されず、繰り返し回数が 2〜10個程度のオリゴマーであつ てもよい。なお、本発明のポリマー化合物に含まれるアミノ酸残基及びヒドロキシ酸残 基の総数は好ましくは 1000個以下、より好ましくは 500個以下である。本発明のポリ マー化合物は分子量 1500〜10万であることが好ましぐ 1500〜5万であることがよ り好ましい。なお、本発明のポリマー化合物の Ν末端及び C末端の少なくとも一方のァ ミノ酸残基が脱保護された場合、水系環境への溶解に、より適している。
本発明のポリマー化合物は、一般式 (I)の繰り返し単位を 2種類以上含むものであ つてもよいし、一般式 (I)の繰り返し単位と他の繰り返し単位、例えばポリペプチドなど を含むものであってもよ 、。
[0025] 本発明のポリマー化合物は、例えば、まず、繰り返し単位の化合物（デブシぺプチ ド）を合成し、これを重合させること〖こより得ることができる。重合は通常のアミド縮合 反応によって行うことができるが、反応性側鎖を有するアミノ酸が含まれる場合は側 鎖を保護して重合反応を行うことが好まし ヽ。
また、セグメント縮合と呼ばれる一単位ずつの伸長反応を用いることもできる。
[0026] 本発明のポリマー化合物は、末端に他の化合物や材料が結合したものであっても よい。末端はァミノ末端側とカルボキシ末端側のいずれか一方でもよいし、両方でも よい。
他の化合物や材料には、ヒドロキシ酸配列、アミノ酸配列、糖鎖配列、タンパク質、 多糖、金属錯体または高分子担体、ゲル、フィルム、ラテックス粒子、金属微粒子、プ ラスチックプレートなどを使用することができる。他の化合物や材料とは、共有結合、 配位結合、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合などで結合させることができる。
[0027] 本発明の化合物は温度応答性を有して!/、るものが好ま U、。温度応答性とは、例 えば、水中または緩衝液中において、低温側の第一の温度から高温側の第二の温 度まで加温されることで凝集する性質をいう。第一の温度、第二の温度はポリマー化 合物に含まれるアミノ酸の種類や末端に結合させる他の化合物の種類によって異な り、ポリマー化合物ごとに適宜設定されるが、第二の温度と第一の温度の差は 10°C 以上であることが好ましい。
例えば、応答のゆっくりしたポリマー化合物の場合、第二の温度と第一の温度の差は
30°C位必要である。これは図 4と図 5に示されるように、 poly(Gly-Val-Gly-Hmb-Ala- Pro)は 25°Cから 55°Cに加温することで凝集が観測される。
また例えば、応答がより早いポリマー化合物の場合、第二の温度と第一の温度の差 は 10〜20°C位で十分である。これは図 12に示されるように、 poly(Gly-Val-Gly-Hmb -Ala-Pro)は 0°Cから 20°Cに加温することで明瞭に凝集が観測される。
なお、凝集は目視、分光光度計を用いた透過率変化やみかけ上の吸光度変化な どによって確認することができる。
このような性質により、本発明のポリマー化合物は温度応答性組成物の製造に用い ることがでさる。
[0028] 温度応答性組成物は、本発明のポリマー化合物または上記他の化合物や材料に 結合した本発明のポリマー化合物を単独、または、生理学的に許容される担体と組 み合わせて使用される。
[0029] 生理学的に許容される担体は、特に制限されず、粉体、散剤などの固形剤であつ てもよいが、本発明のポリマー化合物は、通常、液体の担体と組み合わせることにより 液剤として利用される。すなわち、液剤の担体としては、水、生理食塩水、緩衝液 (リ ン酸緩衝液など）、アルコール水溶液 (エタノール水溶液など）、多価アルコール水溶 液（5%グリセリン水溶液、エチレングリコール水溶液、プロピレングリコール水溶液な ど）、糖水溶液（5%グルコース水溶液、ブドウ糖水溶液など）、アルブミン水溶液（5 %アルブミン溶液など)などが例示できる。なお、液剤は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、軟 膏剤、エアゾール剤、貼付剤 (パスタ剤、ノップ剤）などであってもよい。液剤中の温 度応答性材料（又は温度応答性重合体)の濃度は、重合体の溶液粘度などに応じ て、例えば、 0. 1〜90重量％、好ましくは 0. 5〜50重量％、さらに好ましくは 1〜30 重量％(例えば、 1〜15重量％)、特に 1〜： LO重量％程度の範囲力も選択できる。
[0030] 温度応答性組成物は、生理的又は薬理的に許容される種々の添加剤、例えば、ポ リビュルピロリドン、マクロゴール、ポリビュルアルコール、セルロース誘導体（セル口 ースエーテル類など)などの高分子、保存剤、安定剤、乳化剤や懸濁化剤、 PH調整 剤、緩衝剤、薬剤 (殺菌剤、消毒剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、抗アレルギ 一剤、鎮痛剤、止血剤など)などを含んでいてもよい。
[0031] 本発明の温度応答性組成物は、温度に応答して凝集する（例えば、液体からゲル へ変化する）という性質を有しており、さらに生体内での安全性が高いという利点もあ る。そのため、生体 (例えば、患部など)への適用により、塗布部にゲル状の皮膜を形 成できる。本発明のポリマーや組成物は生体内で分解吸収される組成物、土壌など の環境下で分解吸収される組成物、細胞接着剤、創傷被覆材料、マイクロカプセル 、バイオマシン、バイオセンサー、分離膜、検査キットなどを構成するのに利用できる 。これは発明者らの関連研究を踏まえれば容易に開発することが可能である（例えば 、吉田ら、 Advanced Materials, 1997年、 9卷、 757ページ；廣木ら、 Journal of Polymer Science, 1998年、 36卷、 1495ページ；特開平 7- 233194 ;吉田ら、 Drug Design and D elivery, 1991年、 7卷、 159ページ；真下ら、北関東医学、 1991年、 41卷、 311ページ） 実施例
[0032] 以下本発明の実施態様である、 - Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro -ユニットの合成方法 、およびこれらを用いて得られる、 2〜6量体 - (Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro) - (n = 1- 6)、重合化合物 poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)、共重合化合物 poly(Gly- Va卜 Gly -Hmb-Ala-Pro)- co- (Gly- Lys(Z)- Gly- Va卜 Ala- Pro》の合成方法をについて合成の 詳細をそれぞれ実施例 1〜4に示す。またその他の実施態様として、 poly(Gly-Va卜 G1 y-Hmb-Pro)と poly(Gly— Thr— Gly— Hmb— Pro)と poly(Gly— lie— Gly— Hmb— Pro)につ!/、て 合成の詳細をそれぞれ実施例 5〜7に示す。また実施に於 ヽて共通した操作は合成 手順 1〜3として示した。し力し以下の具体例は本発明を限定するものではなぐ例え ば保護基や縮合剤を他の慣用のものと置換することなど、適宜変更できることは勿論 である。 [0033] その他のデプシペプチド単位、つまり例えば、 -Gly-X - Gly- Hmb- Pro-や- Gly- X -
1 2
Gly-Hmb- Pro-に於ける Xと Xへの任意のアミノ酸残基の導入は実施例の N a -t-ブ
1 2
トキシカルボニル -L-パリンに代えて、対応する N a -t-ブトキシカルボ-ル-アミノ酸を 使用することで同様に実施される。
[0034] なお、以下の実施例では次のような略号を使用した。
(アミノ酸誘導体）
Boc-Gly-OH： N a -t-ブトキシカルボ-ル-グリシン
Boc-Ala-OH： N a -t-ブトキシカルボニル- L-ァラニン
Boc-Val-OH： N a -t-ブトキシカルボニル- L -パリン
Boc-Thr-OH： N a -t-ブトキシカルボニル- L-トレオニン
Boc- Lys(Z)-〇Η : Ν α - 1-ブトキシカルボ-ル- N ε -ベンジルォキシカルボ-ル- L-リ ジン
HCl' H- Pro - OBzl : L-プロリンベンジノレエステル塩酸塩
[0035] (アミノ酸の主鎖および側鎖保護基）
Boc： tert—ブトキシカルボ-ル (t-Bu-0-CO-)
OBzl :ベンジル（- 0- CH - C H )
2 6 5
[0036] (ペプチド合成用試薬、その関連化合物）
DCC： Ν,Ν'-ジクロロへキシルカルボジイミド
DCUrea:ジシクロへキシルゥレア
HOSu： N-ヒドロキシスクシンイミド
HOBt : 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
TFA:トリフルォロ酢酸
(Boc) 0 :ジ- 1-ブチルカルボネート
2
NMM： N-メチルモルフォリン
EDC · HC1： 1-ェチル -3-(3-ジメチルァミノプロピル) -カルポジイミド塩酸塩
DMAP： Ν,Ν'-ジメチルァミノピリジン
[0037] (溶媒）
THF :テトラヒドロフラン CHC1：クロロホルム
3
CDC1：重水素化クロ口ホルム
3
AcOEt :酢酸ェチル
DMF： Ν,Ν'-ジメチルホルムアミド
DMSO-d：重水素化ジメチルスルホキシド
6
MeOH :メタノーノレ
Et 0：ジェチルエーテル
2
(その他）
TLC：薄相クロマトグラフィー
[0038] [合成手順 1： Boc-L-アミノ酸の合成]
L-アミノ酸または側鎖を保護した L-アミノ酸（1.0 mol)を 4M NaOH (250 ml, 1.0 mol) に溶かし、氷- MeOHで徐々に冷却しながら最小量のジォキサンに溶かした (Boc) 0 (
2
240.0 g, 1.1 mol)を 30分かけて徐々〖こカ卩えた。氷浴で 1時間、室温で 1時間半攪拌し た。析出した Na COをろ去し、 Na SOで乾燥させた。ろ過後ろ液を減圧濃縮し、残渣
2 3 2 4
をへキサンで結晶化させた。その後、 AcOEt-へキサンで再結晶を行い、 Boc-L-アミ ノ酸を得た。
[0039] [合成手順 2 :アミノ基末端の脱保護反応、脱 Boc化合物の合成]
アミノ基を N- a -t-ブトキシカルボ-ル保護したペプチド化合物を 300 mlナスフラス コに入れドラフト内で TFA (または 4M HC1のジォキサン溶液）を加え溶解させた。直ち に塩ィ匕カルシウム管で蓋をし、水分の混入を防いだ。 TLCにより反応の終了を確認 後、濃縮し TFA臭（または塩酸臭）がなくなるまで繰り返し蒸留 Et 0を加えて濃縮する
2
と最終的に TFA塩 (または塩酸塩)の白色粉末を得る。収率は、ほぼ定量的である。
[0040] [合成手順 3 :縮合反応]
アミノ基を N- a -t-ブトキシカルボ-ルで保護し、カルボキシル末端を脱保護したぺ プチド化合物（2.1 mmol)を 300 ml三角フラスコに入れ蒸留 CHC1〖こ溶力し、 HOBt (
3
0.28 g, 2.1 mmol), EDC ' HCl (0.40 g, 2.1 mmol) (または DCC (0.43 g, 2.1 mmol ))を 加え攪拌した。次に 300 mlのナスフラスコにアミノ基を上記合成手順 2で脱保護し TF A塩のペプチド化合物（1.4 mmol)を入れ NMMで TFA塩を中和する。ほぼ等モル (0.1 5 ml, 1.40 mmol)で中和を確認できる力 結晶性が悪い塩の場合やや多くなることが ある。二つの溶液を混合攪拌しながら、直ちに氷冷し反応を開始した。そのままゆつ くり室温に戻して一晩攪拌する。この混合物をエバポレーターにより濃縮し AcOEtに 溶かしてから、（DCCを使用した場合は AcOEtに不溶の DCUreaを除く） 10%クェン酸 、蒸留水飽和 NaHCO蒸留水、飽和食塩水で洗浄を行い Na SOで乾燥し濃縮して
3 2 4
オイル状または無色粉末の縮合生成物を得る。これを、シリカゲルクロマトグラフィー（ 蒸留 CH C卜石油エーテル）またはゲルろ過クロマトグラフィー（フアルマシア製 LH20、
3
DMFまたは MeOH)により精製する。無色粉末の場合は AcOEt-蒸留 Et 0や蒸留 CH
2 3
C卜石油エーテルの溶媒系を用いて再結晶により精製しても良い。収率はおおよそ 7 0-90%の範囲で得ることができる。
[0041] [実施例 1]
(1) Boc- Gly- Va Gly- Hmb- Ala- Pro- OBzlの合成
(la:バリン酸の合成） 1 L三口丸底フラスコにパリン（835 g, 0.5 mol )を入れ 1M H S
2
0 500 ml (18 M H SO 27.7 ml)に蒸留水をカ卩えて 500mlに溶かした。次に氷冷攪拌
4 2 4
下で 0°C以下のまま、亜硝酸ナトリウム飽和水溶液 2等量（69.17 g)を 2時間かけてカロ えた。泡がでなくなるまで攪拌後、 Et 0 (約 1L)で抽出した。 NaHCOで乾燥後、濃縮
2 3
し白色の結晶を得た。収量： 45.7 g (77.5%). JH NMR (CDC1 , 300 MHz): 4.15 (1H,
3
Hmb a CH); 2.09 (1H, Hmb β CH); 1.50, 1.00 (6H, Hmb y CH ).
3
[0042] (lb : Boc- Gly- OSuの合成）
Boc-Gly-OH (1.54 g, 8.82 mmol)を 500 mlのナスフラスコに入れ蒸留 CHC1に溶力
3 し、 DCU ( 2.18 g, 10.58 mmol), HOSu (1.21 g, 10.58 mmol)を入れ冷却下で攪拌を 開始した。一晩放置後、 TLCにより反応の終了を確認後、濃縮し DCUreaをろ過した 後、 AcOEtに溶かし再度析出した DCUreaをろ過した。その後、濃縮し AcOEt-蒸留 Et 0による再結晶を 2回行い Boc- Gly- OSuを得た。収量： 1.74 g (63.9%) . 1H NMR (C
2
DC1 , 300 MHz): 5.04 (1H, Boc— Gly NH); 4.27, 4.23 (2H, Gly a CH ); 2.79 (4H, O
3 2
Su); 1.40 (9H, Boc t— Bu).
[0043] (lc : Boc- Gly- Hmb- OHの合成）
Boc- Gly- OSu (1.00 g, 3.7 mmol)を 500 mlナスフラスコに入れ、蒸留 THFに溶かし 、さらに DMAP (0.040 g, 0.37 mmol)を入れ溶かした。次に 300mlナスフラスコにパリン 酸（0.52 g, 4.4 mmol)を入れ蒸留 THFに溶かしピリジン（0.29 ml, 4.4 mmol)を入れ力 ルポキシ末端側を保護した。 2つの溶液を混ぜ合わせ冷却下で攪拌した。 TLCで反 応終了を確認後、濃縮し AcOEtを入れ希釈したのち、 1M HC1水溶液、蒸留水で洗 浄後、飽和 NaHCO水溶液により生成物を抽出し 2M HC1水溶液で pH2〜3にした後
3
、再度 AcOEtで抽出し溶媒転換を行った。その後蒸留水と飽和 NaCl水溶液で洗浄、 Na COで乾燥させた後、濃縮し無色オイル状生成物を得た。収量： 1.1 g (ほぼ定量
2 3
的). JH NMR (CDC1 , 300 MHz) : 9.25 (IH, Hmb - COOH); 6.40, 5.12 (IH, Boc— Gl
3
y NH); 4.95 (IH, Hmb a CH); 4.13, 4.11 (IH, Gly a CH ); 2.28 (IH, Hmb β CH); 1
2
.50 (9H, Boc t-Bu); 1.02 (6H, Hmb y CH ).
3
[0044] (ld: HCl'H- Pro- OBzlの合成）
排気フード内で 1L三口丸底フラスコにベンジルアルコール（100 mL)を入れ冷却 攪拌する。そこへ塩化チォ -ル（50.0 g, 0.420 mol)を 1時間かけて滴下する。つづ いてプロリン（22.0 g, 0.190 mmol)を加えて、ゆっくり室温に戻しそのまま 3日間攪拌 を続けた。ベンジルアルコールをロータリーエバポレーターで除き、蒸留 Et 0を加え
2 て結晶化させた。精製は熱エタノールより再結晶を繰り返すことで行った。収量: 20.8 7 g (45.5%). JH NMR (CDC1 , 300 MHz) : 7.30 (5H, -OBzl C H ); 5.21 (2H, OBzl
3 6 5
— CH -); 4.80 (IH, Pro a CH); 3.51 (2H, Pro δ CH ); 2.20, 1.90 (2H, Pro β CH ); 1
2 2 2
.99 (2H, Pro y CH ).
2
[0045] (le : Boc- Ala- Pro- OBzlの合成）
Boc- Ala- OH (9.4 g, 50 mmol)を蒸留 CHC1に溶かし DCC (10 g, 50 mmol)をカロえ
3
た。別のナスフラスコに HCl'H- Pro- OBzl (10 g, 41 mmol)の蒸留 CHC1溶液を用意し
3
NMM (4.5 ml, 41 mmol)で中和した。両者を氷冷下で混合攪拌し縮合反応を開始し た。そのままゆっくりと室温へ戻し終夜攪拌した後、系を濃縮した。残渣に EtOAcをカロ え、析出する DCUreaを繰り返し除いた。溶液は 10%クェン酸、蒸留水飽和 NaHCO
3 蒸留水、飽和食塩水で洗浄を行い Na SOで乾燥し濃縮して無色粉末を得た。これを
2 4
AcOEt-蒸留 Et 0による再結晶で精製した。収量： 13.2 g (85%). 'Η NMR (CDC1， 30
2 3
0 MHz) : 7.33 (5H， -OBzl C H ); 5.36 (1H， Ala NH); 5.14 (2H, OBzl— CH -); 4.58 ( IH, Pro a CH); 4.45 (IH, Ala a CH); 3.60 (2H, Pro δ CH ); 2.20, 1.90 (2H, Pro jS
2
CH ); 1.99 (2H, Pro y CH ); 1.41 (9H, Boc t— Bu); 1.28 (3H, Ala β CH ).
2 2 2
[0046] ( lf: Boc— Gly— Hmb— Ala— Pro— OBzlの合成）
Boc-Gly-Hmb-OH (4.59 g, 16.6 mmol), HOBt (2.25 g, 16.6 mmol), EDC - HC1 (3. 17 g, 16.6 mmol), HCl ' H- Ala- Pro- OBzl (4.15 g, 13.34 mmol), NMM (1.46 ml, 13.3
4 mmol)を使用し、縮合反応を行った。この後、 CHC1： MeOH = 97 : 3の展開溶媒でシ
3
リカゲルクロマトグラフィーにより精製を行い、オイル状目的物を得た。
収量： 3.91 g (54.9%). 'Η NMR (CDCl , 300 MHz) : 7.35, 7.14 (2H, Ala NH, Gly NH
3
); 7.35 (5H, -OBzl, C H ); 5.15 (2H, -OBzl,— CH -); 5.08 (Hmb a CH); 4.70 (IH,
6 5 2
Ala a CH); 4.57 (IH, Pro a CH); 4.02 (2H, Gly a CH ); 2.27, 2.00 (2H, Pro β CH
2 2
); 2.00 (IH, Val jS CH); 1.35 (3H, Ala β CH ); 1.45 (9H, Boc t— Bu); 0.93 (6H, Val y
2
CH ); 2.00 (2H, Pro y CH ); 3.65 (2H, Pro δ CH ), 0.98 (9H, Boc t— Bu).
3 2 2
[0047] ( lg : Boc- Va Gly- Hmb- Ala- Pro- OBzlの合成）
Boc-Val-OH (0.52 g, 2.41 mmol), HOBt (0.32 g, 2.41 mmol), EDC - HC1 (0.46 g, 2.41 mmol), TFA. H— Gly— Hmb— Ala— Pro— OBzl (1.02 g, 1.87 mmol), NMM (0.20 ml, 1.87 mmol)を使用し、縮合反応を行い、オイル状の生成物を得た。収量： 1.18 g (77. 1%). JH NMR (CDCl , 300 MHz) : 7.34 (5H, -OBzl C H ); 7.12 (IH, Ala NH); 6.80
3 6 5
(IH, Gly NH); 5.38 (IH, Val NH); 5.15 (2H, -OBzl— CH -); 5.07 (IH, Hmb a CH);
2
4.72 (IH, Ala a CH); 4.61 (IH, Pro a CH); 4.21 (IH, Val a CH); 4.05 (2H, Gly a CH ); 2.21 (2H, Pro β CH ); 2.09 (IH, Hmb β CH); 1.95 (IH, Val β CH); 1.29 (3H,
2 2
Ala β CH ); 2.00 (2H, Pro δ CH ); 0.90, 0.81 (12H, Val y CH , Hmb y CH ); 3.64,
3 2 3 3
3.50 (2H, Pro δ CH ); 0.98 (9H, Boc t- Bu).
2
[0048] ( lh : Boc- Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OBzlの合成）
Boc— Gly— OH (0.369 g, 2.11 mmol) HOBt (0.284 g, 2.11 mmol), EDC - HC1 (0.40 g, 2.11 mmol), TFA，H— Val— Gly— Hmb— Ala— Pro— OBzl (0.90 g, 1.40 mmol), NMM (0.1
5 ml, 1.40 mmol)を使用し、縮合反応を行った。精製はゲルろ過クロマトグラフィーに より行った。収量： 0.39 g (40%、オイル状生成物）。 JH NMR (DMSO- d , 300 MHz) : 8.
6
47 (IH, Gly3 NH); 8.14 (IH, Ala5 NH); 7.63 (IH, Va NH); 6.98 (IH, Gly NH); 7.34 (5H,— OBzl C H ); 5.09 (2H,— OBzl— CH -); 4.76 (IH, Hmb4 a CH); 4.50 (IH, Ala
6 5 2
5 a CH); 4.33 (IH, Pro6 a CH); 4.21 (IH, Val2 a CH); 3.90, 3.58 (4H, Gly1 a CH ,
2
Gly3 a CH ); 2.20 (2H, Pro6 CH ); 2.10, 2.00 (2H, Val2 β CH, Hmb4 β CH); 1.18 (3
2 2
H, Ala5 β CH ); 2.00 (2H, Pro6 y CH ); 0.86 (12H, Va y CH , Hmb4 y CH ); 3.56 (
3 2 3 3
2H, Pro6 δ CH ).
2
[0049] [実施例 2]
(2) Boc- (Gly1- Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) -OBzl (n = 2〜6)の合成
(2a： Boc- Gly1- Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OHの合成）
500mlのナスフラスコに Boc- Gly1- Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OBzl (1.14 g, 1.65m mol)を入れ、 MeOHに溶解させ、パラジウムカーボン粉末をカ卩えた。装置を組み立て た後、ナスフラスコを Hで満たしてカゝら攪拌し、接触還元反応を開始した。液面の上
2
昇より反応の進行を確認しつつ TLCにより原料のスポットが消えたことで反応の終了 とした。その後、ノ ラジウムカーボン粉末を除去しろ液を濃縮した。その後、ベンゼン を加えて共沸を行った。残渣に蒸留 CH C卜石油エーテルを加え結晶化させた。収量
3
: 9.28 g (93%)、 [ α ] 2°:- 87.4 deg. (MeOH, c 0.1)、融点： 117- 119 ° C. 'Η NMR (D
D
MSO-d , 300 MHz) : 12.39 (IH, OH); 8.51 (IH, Gly3 NH); 8.14 (IH, Ala5 NH); 7.63
6
(IH, Vaf NH); 6.99 (IH, Boc- Gly1 NH)
； 4.77 (IH, Hmb4 a CH); 4.49 (IH, Ala5 a CH); 4.21 (2H, Pro6 a CH, Val2 a CH); 3.89, 3.60 (4H, Gly1 a CH , Gly3 a CH ); 2.00 (4H, Pro6- γ , β CH ); 1.18 (2H, Va
2 2 2
12 J8 CH, Hmb4 j8 CH); 1.37 (9H, Boc t- Bu); 0.85 (12H, Va y CH , Hmb4 y CH ); 3.
3 3
50 (2H, Pro6 δ CH ).
2
[0050] (2b： Boc- (Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) -OBzlの合成）
2
TFA'H— Gly1— Val2— Gly3— Hmb4— Ala5— Pro6— OBzl (0.28 g, 0.41 mmol), NMM (0.04 ml, 0.41 mmol), Boc— Gly1— Val2— Gly3— Hmb4— Ala5— Pro6— OH (0.25 g, 0.41 mmol), ED C -HCl (0.09 g, 0.41 mmol), HOBt (0.06 g, 0.41 mmol)を使用し、縮合反応を行った 。精製は蒸留 CHC1 -蒸留 Et 0の溶媒系で再結晶を繰り返すことで行った。収量 : 0.3
3 2
7 g (75.8%), [ a ] 20 :— 101.2 deg. (MeOH, c 0.1),融点： 123— 126。 C. 'Η NMR (DMS
D
〇— d ， 300 MHz) : 8.40 (2H, Gly3 NH); 8.14 (3H， Ala5 NH, Gly1 NH); 7.61 (2H, Val2 NH); 6.99 (IH, Boc- Gly1 NH); 7.33 (5H, -OBzl C H ); 5.09 (2H, -OBzl— CH -); 4.7
6 5 2
7 (2H, Hmb4 a CH); 4.50 (2H, Ala5 a CH); 4.38, 4.28 (2H, Pro6 a CH); 4.23 (2H, Val2 a CH); 3.92, 3.52 (8H, Gly1 a CH , Gly3 a CH ); 2.09 (IH, Hmb4 β CH); 1.86
2 2
(IH, Val2 β CH); 2.18, 1.95 (2H, Pro6 β CH ); 1.19 (6H, Ala5 β CH ); 1.17 (9H, Boc
2 3
t-Bu); 0.86 (24H, Val2 y CH , Hmb4 y CH ); 1.98 (4H, Pro6 y CH ); 3.57 (4H, Pro6
3 3 2
6 CH ).
2
[0051] (2c： Boc- (Gly1- Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) -OBzlの合成）
3
TFA' H— (Gly1— Vaf— Gly3— Hmb4— Ala5— Pro6) -OBzl (0.33 g, 0.28 mmol), (0.03 ml, 0
2
.28 mmol), Boc— Gly1— Vaf— Gly3— Hmb4— Ala5— Pro6— OH (0.16 g, 0.28 mmol), EDC - H CI (0.04 g, 0.27 mmol), HOBt (0.03 g, 0.28 mmol)を使用し、縮合反応を行った。精 製はゲルろ過クロマトグラフィーにより行った。収量： 0.37 g (80%)、 [ α ] 2° : - 110.6 deg.
D
(MeOH, c 0.1)、融点： 152-154。 C. JH NMR (DMSO-d , 300 MHz) : 8.48 (3H, Gly
6
3 NH); 8.12 (5H, Ala5, Gly3 NH); 7.62 (3H, Vaf NH); 6.99 (IH, Boc- Gly1 NH); 7.34 (5H, -OBzl C H ); 5.09 (2H, -OBzl— CH -); 4.77 (3H, Hmb4 a CH); 4.51 (3H, Ala5
6 5 2
a CH); 4.29, 4.20 (3H, Pro6 a CH); 4.23 (3H, Vaf a CH); 3.91 , 3.70 (12H, Gly1 a CH , Gly3 a CH ); 2.00, 2.20 (6H, Pro6 β CH ); 1.85, 2.00 (6H, Vaf β CH, Hmb
2 2 2
β CH); 1.37 (9H, Boc t-Bu); 2.05 (6H, Pro6 y CH ); 0.89 (36H, Vaf, Val4, Hmb y
2
CH ); 3.58 (6H, Pro6 δ CH ).
3 2
[0052] (2d : B。c- (Gly1- Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) -OBzlの合成）
4
TFA. H— (Gly1— Val2— Gly3— Hmb4— Ala5— Pro6) -OBzl (0.34 g, 0.20 mmol), NMM (0.02
3
ml, 0.20 mmol), Boc- Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OH (0.12 g, 0.30 mmol), E DC - HCl (0.05 g, 0.30 mmol), HOBt (0.04 g, 0.30 mmol)を使用し、縮合反応を行つ た。精製はゲルろ過クロマトグラフィーにより行った。収量： 0.34 g, 77%、 [ α ] 20： -114.
D
2 deg. (MeOH, c 0.1)、融点 150— 156° C. 1H NMR (DMSO-d , 300 MHz) : 8.46 (4H,
6
Gly3 NH); 8.14 (7H, Ala5, Gly1 NH); 7.63 (4H, Vaf NH); 6.98 (IH, Boc— Gly1 NH); 7.35 (5H, -OBzl, C H ); 5.09 (2H, -OBzl,— CH -); 4.75 (4H, Hmb4 a CH); 4.50 (4
6 5 2
H, Ala5 a CH); 4.29, 4.18 (4H, Pro6 a CH); 4.18 (4H, Vaf a CH); 3.92, 3.71 (16H , Gly1 a CH , Gly3 a CH ); 2.0 (24H, Pro6 β CH , Pro6 y CH , Vaf β CH, Hmb4 β C H); 1.18 (12H, Ala5 β CH ); 1.37 (9H, Boc t— Bu); 0.84 (48H, Va y CH ); 2.00 (8H
3 3
, Pro6 δ CH ); 3.53 (8H, Pro6 δ CH ).
3 2
[0053] (2e： Boc- (Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) - OBzlの合成）
5
TFA. H- (Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) -OBzl (0.34 g, 0.15 mmol), NMM (17
4
μ 1, 0.15 mmol), Boc— Gly1— Val2— Gly3— Hmb4— Ala5— Pro6— OH (0.11 g, 0.19 mmol )、 E DC - HCl (0.03 g, 0.19 mmol), HOBt (0.02 g, 0.19 mmol)を使用し、縮合反応を行つ た。精製はゲルろ過クロマトグラフィーにより行った。収量: 0.28 g (67%)、 [ a ] 2° : - 113.
D
8、融点： 159-162° C. JH NMR (DMSO-d , 300ΜΗζ) : 8.45 (5Η, Gly3 NH); 8.11 (9Η
6
, Ala5, Gly1 NH); 7.60 (5H, Va NH); 6.94 (1H, Boc- Gly1 NH); 7.33 (5H, -OBzl— C
6
H ); 5.04 (2H, -OBzl— CH -); 4.75 (5H, Hmb4 a CH); 4.50 (5H, Ala5 a CH); 4.26 (
5 2
5H, Pro6 a CH); 4.17 (5H, Vaf a CH); 3.90, 3.69 (20H, Gly1 a CH , Gly3 a CH );
2 2
2.00 (30H, Pro6 β CH , Pro CH , Vaf β CH, Hmb' jS CH); 1.19 (15H, Ala5 β CH
2 2 3
); 1.36 (9H, Boc t-Bu); 0.84 (60H, Vaf y CH , Hmb CH ); 2.00 (10H, Pro CH
3 3
); 3.44 (10H, Pro6 δ CH ).
2 2
[0054] (2f: Boc- (Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) -OBzlの合成）
6
TFA' H- (Gly1- Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) -OBzl (0.28 g, 0.10 mmol), NMM (11.7
5
μ 1, 0.10 mmol), Boc— Gly1— Vaf— Gly3—
Hmb4— Ala5— Pro6— OH (0.07 g, 0.12 mmol), EDC - HC1 ( 0.01 g, 0.12 mmol), HOBt (0. 01 g, 0.12 mmol)を使用し、縮合反応を行った。精製はゲルろ過クロマトグラフィーに より行った。収量： 0.10 g (33%)、 [ α ] 20 : - 120.1 deg. (MeOH, c 0.1)、融点： 164- 166
D
° C.
[0055] [実施例 3]
(3) poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)の合成
(3a： Boc- Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OSuの合成）
Boc- Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OH (0.38 g, 0.63 mmol)を蒸留 DMFに溶か し DCC (0.14 g, 0.69 mmol)と HOSu (0.08 g, 0.69 mmol)を入れ氷冷下で攪拌を開 始した。一晩後、 TLCにより反応の終了を確認後、 DCUreaを除去したのち濃縮する と白色粉末を得た。収量： 0.35.g (80%)。 JH NMR (DMSO-d , 300 MHz) : 8.50 (1H, Gly3 NH); 8.23 (1H, Ala5 NH); 7.63 (1H, Va -NH); 6.99 (1H, Boc-Gly1 NH); 4.78 ( 1H, Hmb4 a CH); 4.71 (1H, Pro6 a CH); 4.52 (1H, Ala5 a CH); 4.23 (1H, Va a C H); 3.92, 3.60 (4H, Gly1 a CH , Gly3 a CH ); 2.79 (4H,— OSu); 2.00 (4H, Pro6 j8 CH
2 2
, Val2 β CH, Hmb4 β CH); 1.21 (3H, Ala5 β CH ); 1.37 (9H, Boc t— Bu); 0.88 (12H,
2 3
Val2 y CH , Hmb4 y CH ); 2.00 (2H, Pro6 y CH ), 3.57 (2H, Pro6 δ CH ).
3 3 2 2
[0056] (3b： TFA' H- Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OSuの合成）
Boc— Gly1— Vaf— Gly3— Hmb4— Ala5— Pro6— OSu (0.20 g, 0.28 mmol)を TFAによりァミノ 基末端を脱保護し白色粉末を得た。収量： 0.18 g(89%)。 JH NMR (DMSO- d , 300M
6
Hz) : 8.60 (1H, Gly3 NH); 8.45 (1H, Ala5 NH); 8.25 (1H, Vaf NH); 7.94 (1H, Boc- Gl y1 NH); 4.78 (1H, Hmb4 a CH); 4.70 (1H, Pro6 a CH); 4.51 (1H, Ala5 a CH); 4.29 (1H, Vaf a CH); 3.95, 3.50 (4H, Gly1 a CH Gly3 a CH ); 2.79 (4H, OSu); 2.00 (6
2, 2
H, Pro6 β CH , Pro CH , Vaf β CH, Hmb4 β CH); 1.21 (3H:Ala5 β CH ); 0.88 (12
2 2 3
H, Vaf y CH , Hmb4 y CH ); 3.50 (2H, Pro6 δ CH ).
2 2 2
[0057] (3ο :ρο1Υ(α - Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6)の合成、蒸留 DMF中の重合反応）
TFA'H- Gly1- Vaf- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OSu (0.18 g, 0.25 mmol)を 100 mlナスフ ラスコに入れ蒸留 DMFに溶かし攪拌を開始した。系中へテトラエチルァミン（139 1, 0.25 mmol)を滴下し、重合を開始した。 2週間後、溶液がゲルイ匕した時点で質量分 析法により分子量を確認した。更に高分子量ィ匕させるため、 EDC 'HCl (0.05 g, 0.25 mmol)と HOBt (0.03 g, 0.25 mmol)を加え再度、 2週間攪拌を行った。その後、分子 量 3500以下を通す半透膜で透析を 1週間行い凍結乾燥により目的物を得た。収量： 1 5 mg (8%)、融点 172-180° C.
[0058] (3d： pobKGly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6)の合成、蒸留ジォキサン中の重合反応）
TFA'H- Gly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6- OSu( 0.80 g, 1.12 mmol )を 100 mlナスフ ラスコに入れ蒸留 Dioxaneに溶かし攪拌を開始した。系中へテトラエチルァミン（155 μ ΐ, 1.12 mmol)を滴下し、重合を開始した。 2週間後、溶液がゲルイ匕した時点で質量 分析法により分子量を確認した。更に高分子量化させるため、ゲル状の polymerを蒸 留 DMFに溶かして EDC 'HCl (0.21 g, 1.12 mmol)と HOBt (0.15 g, 1.12 mmol)をカロ え再び、 2週間攪拌を行った。その後、分子量 3500以下を通す半透膜で透析を 1週 間行い凍結乾燥により無色粉末を得た。収量: 91 mg (l l%)、融点 175-180° C、平均 分子量 6500 (MALDI-TOF質量分析法による見かけの数値）。
[0059] [実施例 4]
(4) poly[(Gly1-Val2-Gly3-Hmb4-Ala5-Pro6)-co-(Gly7-Lys(Z)8-Gly9-Val10-Ala11-Pro12) ]の合成
(4a： Boc-Lys(Z)-Gly-Val-Ala-Pro-OMe (配列番号 3)の合成）
TFA - H-Gly-Val-Ala-Pro-OMe (配列番号 4) (0.50 g, 1.06 mmol)、 NMM (TFA塩 の中和用にほぼ等モル)、 Boc-Lys(Z)-OH (0.48 g, 1.28 mmol)、 EDC - HCl (0.24 g, 1 .28 mmol)、 HOBt (0.17 g, 1.28 mmol)を使用し、縮合反応を行った。蒸留 CHC1 -蒸
3 留 Et 0で結晶化した。収量： 0.50 g (65%)、 [ α ] 20 : -65.1 deg. (MeOH, c 0.1)、融点：
2 D
115-117° C. JH NMR (DMSO-d , 300 MHz) : 8.15 (IH, Ala NH); 7.99 (IH, Lys(Z)
6
ε NH); 7.61 (IH, Val NH); 7.19 (IH, Gly NH); 6.86 (IH, Lys(Z) NH); 7.34 (5H, Z- C H ); 4.98 (2H, Z— CH -); 4.46 (IH, Ala a CH); 4.27 (IH, Pro a CH); 4.18 (IH,
6 5 2
Val a CH); 3.85 (IH, Lys(Z) a CH); 3.63 (2H, Gly a CH ); 2.13, 1.92 (2H, Pro j8 C
2
H ); 2.13 (IH, Val β CH ); 1.05 (3H, Ala β CH ); 1.56 (2H, Lys(Z) β CH ); 1.89 (2
2 2 3 2
H, Pro y CH ); 0.78 (6H, Val- y CH ); 1.45 (2H, Lys(Z), y CH ); 3.60 (2H, Pro δ
2 3 2
CH ); 1.80 (2H, Lys(Z) δ CH ); 2.95 (2H, Lys(Z) ε CH ); 1.18 (3H,— OMe); 1.36 (
2 2 2
9H, Boc t-Bu).
[0060] (4b： Boc- Gly1- Lys(Z)2- Gly3- Val4- Ala5- Pro6- OMe (配列番号 5)の合成）
TFA - H-Lys(Z)-Gly-Val-Ala-Pro- OMe (配列番号 6) (0.48 g, 0.69 mmol), NMM ( 82 μ 1, 0.72 mmol), Boc- Gly- OH (0.137 g, 0.785 mmol), EDC - HCl (0.149 g, 0.785 mmol), HOBt (0.105 g, 0.785 mmol)を使用し、縮合反応を行った。精製は蒸留 CHC 1 -蒸留 Et 0による再結晶で行った。収量： 0.33 mg (65%)、 [ α ] 20： -60.5 deg. (MeOH
3 2 D
, c 0.1)、融点： 130-132° C. 1H NMR (CDC1 , 300 MHz) : 8.29 (IH, Lys(Z)2 ε NH);
3
8.14 (IH, Ala5 NH); 7.87 (IH, Val4 NH); 7.62 (IH, Lys(Z)2 NH); 7.18 (IH, Gly3 NH) ； 6.89 (IH, Boc- Gly1 NH); 7.32 (5H, Z- C H ); 4.98 (2H, Z—— CH -); 4.46 (IH, Ala5
6 5 2
a CH); 4.29-4.16 (3H, Pro6 a CH, Val4 a CH, Lys(Z)2 a CH), 3.70 (4H, Gly1 a C H , Gly3 a CH ); 2.17, 2.00 (2H, Pro6 β CH ); 2.00 (IH, Val' jS CH ); 1.17 (3H, Ala 5 j8 CH ); 1.62 (2H, Lys(Z)2 β CH ); 2.00 (2H, Pro6 y CH ); 0.79 (6H, Val4 y CH );
3 2 2 3
1.39 (2H, Lys(Z)2 y CH ); 3.60 (2H, Pro6 δ CH ); 1.80 (2H, Lys(Z)2 δ CH ); 2.94 (2
2 2 2
H, Lys(Z)2 ε CH ); 1.18 (3H, - OMe); 1.36 (9H, Boc t- Bu).
2
[0061] (4c： Boc- Gly1- Lys(Z)2- Gly3- Val4- Ala5- Pro6- OH (配列番号 7)の合成）
Boc- Gly1- Lys(Z)2- Gly3- Val4- Ala5- Pro6- OMe (配列番号 5) (0.33 g, 0.42 mmol)を 100 mlナスフラスコに入れ MeOHと水の混合溶液にに溶かし、 1M NaOH水溶液（0.6 37 ml)を入れ、冷却下で攪拌を開始した。 1時間後 TLCにより反応終了を確認後、溶 液を濃縮し ether洗浄を行った。その後、 IN HC1で pHを 3〜4付近にし、 CHC1で抽出
3 し飽和 NaCl水溶液で洗浄、続いて Na SOで乾燥を行った。精製は蒸留 CHC1 -蒸留
2 4 3
Et 0による再結晶で行った。収量： 0.27 mg (84%)、 [ α ] 20 : -63.1 deg. (MeOH, c 0.1)
2 D
、融点： 105- 109° C. JH NMR (CDCl , 300 MHz) : 8.19 (IH, Lys(Z)2 ε NH); 8.13 (1
3
H, Ala5 NH); 7.87 (IH, Val4 NH); 7.62 (IH, Lys(Z)4 NH); 7.18 (IH, Gly3 NH); 6.89 ( IH, Boc- Gly1 NH); 7.34 (5H, Z— C H ); 4.98 (2H, Z— CH ), 4.46(1H, Ala5 a CH); 4.
6 5 2
25-4.05 (3H, Pro6 a CH, Val4 a CH, Lys(Z)2 a CH); 3.70 (4H, Gly1 a CH , Gly3 a C
2
H ); 2.15, 1.90 (2H, Pro^ CH ); 1.90 (IH, Val4 β CH ); 1.18 (3H, Ala5 β CH ); 1.
2 2 2 3
62 (2H, Lys(Z)2 β CH ); 1.90 (2H, Pro CH ); 0.77 (6H, Val4 y CH ); 1.45 (2H, Ly
2 2 3
s(Z)2 y CH ); 3.60 (2H, Pro6 δ CH ); 1.80 (2H, Lys(Z)2 δ CH ); 2.94 (2H, Lys(Z)2 ε
2 2 2
CH ), 1.36 (9H, Boc t— Bu).
2
[0062] (4d： Boc- Gly1- Lys(Z)2- Gly3- Val4- Ala5- Pro6- OSu (配列番号 8)の合成）
Boc- Gly- Lys(Z)- Gly- Hmb- Ala- Pro- OH (配列番号 7) (0.27 g, 0.35 mmol)を蒸留 DMFに溶力し DCC ( 0.08 g, 0.42 mmol)と HOSu (0.05 g, 0.42 mmol)を入れ冷却下 で攪拌を開始した。一晩後、 TLCにより反応の終了を確認後、 DCUreaを除去した溶 液を濃縮すると白色粉末が得られた。収量： 0.24 mg (80%) . 1H NMR (DMSO-d , 30
6
0 MHz) : 8.25 (IH, Lys(Z)2 ε NH); 8.21 (IH, Ala5 NH); 7.86 (IH, Val4 NH); 7.63 (IH , Lys(Z)2 NH); 7.19 (IH, Gly3 NH); 6.89 (IH, Boc- Gly1 NH); 7.35 (5H, Z— C H ); 4.
6 5
98 (2H, Z-— CH -); 4.68 (IH, Ala5 a CH); 4.67 (IH, Pro6 « CH); (2H, Val4 a CH, Ly
2
s(Z)2 a CH); 3.70 (4H, Gly1 a CH , Gly3 a CH ); 2.31 , 1.90 (2H, Pro6 β CH ); 1.90 (
2 2 2
IH, Val4 j8 CH ); 1.18 (3H, Ala5 β CH ); 1.48 (2H, Lys(Z)2 β CH ); 1.90 (2H, Pro CH ); 0.78 (6H, Val4 y CH ); 1.39 (2H, Lys(Z)2 y CH ); 3.55 (2H, Pro6 δ CH ); 1.3
2 3 2 2
5 (2H, Lys(Z)2 δ CH ); 2.94 (2H, Lys(Z)2 ε CH ); 1.36 (9H, Boc t— Bu); 2.78 (4H, O
2 2
Su).
[0063] (4e： TFA' H- Gly1- Lys(Z)2- Gly3- Val4- Ala5- Pro6- OSu (配列番号 9)の合成）
Boc- Gly1- Lys(Z)2- Gly3- Val4- Ala5- Pro6- OSu (配列番号 8) (0.13 g, 0.16 mmol)を TFAによりアミノ基末端を脱保護し白色粉末を得た。収量: 0.13 g (90%) . JH NMR (D MSO-d , 300MHz) : 8.51 (IH, Ala5- NH); 8.29 (IH, Lys(Z)2 ε NH); (IH, Val4 NH); (1
6
H, Lys(Z)2 NH), 7.20 (IH, Gly3 NH); 7.98 (3H, Gly1 NH); 7.34 (5H, Z- C H ); 5.00 (
6 5
2H, Z-— CH -); 4.48, 4.33, 4.28, 4.20 (4H, Ala a CH, Pro a CH, Val a CH, Lys(Z)
2
a CH); 3.70 (4H, Gly1 a CH , Gly3 a CH ); 2.13, 1.93 (2H, Pro6 β CH ); 1.93 (IH,
2 2 2
Val4 β CH ); 1.23 (3H, Ala5 β CH ); 1.67 (2H, Lys(Z)2 β CH ); 1.93 (2H, Pro CH
2 3 2
); 0.82 (6H, Val' y CH ); 1.52 (2H, Lys(Z)2 y CH ); 3.55 (2H, Pro6 δ CH ); 1.82 (2
2 3 2 2
H, Lys(Z)2 δ CH ); 2.96 (2H, Lys(Z)2 ε CH ); 2.78 (4H, OSu).
2 2
[0064] (4f: Poly[(Gly1-Val2-Gly3-Hmb4-Ala5-Pro6)-co-(Gly7-Lys(Z)8-Gly9-Va1°-Ala11-Pro12) ]、蒸留ジォキサン中の重合反応）
TFA' H— Gly1— Vaf— Gly3— Hmb4— Ala5— Pro6— OSu (0.430 g, 0.600 mmol)と TFA' H— Gl y1- Lys(Z)2- Gly3- Val4- Ala5- Pro6- OSu (配列番号 9) (0.040 g, 0.050 mnol)を 0.90:0.1 0のモル比でカ卩えて蒸留ジォキサンに溶かした。テトラエチルァミン（90 μ 1, 0.65 mmo 1)を加えることで重合を開始した。 1週間攪拌後、質量分析法により分子量を確認し た。更に EDC ' HCl ( 0.12 g, 0.65 mmol)と HOBt (0.08 g, 0.65 mmol)を追加してもう 1 週間攪拌した。その後、分子量 3500以下を除去する透析を 1週間行い凍結乾燥によ り共重合ィ匕合物を得た。図 1に示すように IH NMR ^ベクトルより共重合組成比を検討 した。 Lys(Z)8シグナルの積分比より見ることで組成比が 0.93:0.07とわ力つた。収量: 3 5.8 mg、融点 164-170° C、平均分子量 6000 (MALDI-TOF質量分析法による見か けの数値)。
• 1H NMR (DMSO-d , 500MHz) : 8.42 (Gly3 NH); 8.11 (Gly1 NH, Ala5 NH); 7.60 (Va
6
l2 NH); 7.33 (Z-, C H ), 4.98 (Z, - CH -); 4.75 (Hmb4, a CH); 4.50 (Ala5 a CH); 4.2
6 5 2
6 (Pro6 a CH); 4.18 (Vaf, a CH); 3.89 (Gly3 a CH ); 3.96 (Gly1 a CH ); 2.00, 1.81 ( Pro6 j8 CH ); 2.00 (Val2 β CH ); 1.19 (Ala5 β CH ); 2.00 (Pro6
2 2 3
y CH ); 0.82 (Val2 y CH ); 3.59, 3.54 (Pro6, δ CH ).
2 3 2
[0065] (4g： Lys(Z)8側鎖の脱保護反応、 polyKGly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6)- co- (Gly7- L ys8— Gly9— Va10— Ala11— Pro12)]の合成）
50mlのナスフラスコ中 polyKGly1- Val2- Gly3- Hmb4- Ala5- Pro6) - co- (Gly7- Lys(Z)8- Gl y9-Val10-Alan-Pro12) ] (10 mg)を MeOHに溶解させた後、パラジウムカーボン粉末を
1- n
加えた。接触還元反応装置を組み立て、系全体を水素ガスで置換し攪拌を開始した
。反応の進行は水素ガスの消費量と TLCによる原料スポットの消失で確認し、反応の 終了を決めた。その後、ノ ラジウムカーボン粉末を除去しろ液を濃縮した。残渣にべ ンゼンを加えて共沸により水分を除いた。これを蒸留 CHC1 -石油エーテルの溶媒系
3
で繰り返し再沈殿した。 Lys(Z)8側鎖が脱保護されたことは1 H NMRスペクトルによつ て確認した。収量： 9 mg (90%) , JH NMR (DMSO— d , 500MHz) : 8.42 (Gly3 NH); 8.11
6
(Gly1 NH, Ala5 NH); 7.60 (Va NH); 4.76 (Hmb4, a CH); 4.50 (Ala' a CH); 4.27 (Pr 。6, a CH); 4.27 (Vaf, a CH); 3.90 (Gly3, a CH ); 3.70 (Gly1, a CH ); 2.00, 1.83 (
2 2
Pro6 j8 CH ); 2.00 (Vaf, β CH ); 2.00 (Hmb4 β CH); 1.19 (Ala5 β CH ); 2.00 (Pro
2 2 3
CH ); 0.87 (Vaf y CH ); 3.59, 3.50 (Pro6 δ CH ).
2 3 2
[0066] [実施例 5]
(5) pobKGly1- Val2- Gly3- Hmb4- Pro5)の合成
(5a： Boc- Gly- Hmb- Pro- OBzlの合成）
HCl - H-Pro-OBzl (10.22 g, 42.3 mmol)を 500 mlナスフラスコに入れ、蒸留クロロホ ルム（250 ml)をカ卩えてマグネチックスターラーを用いて攪拌し、溶解させた。そして、 NMM (4.70 ml, 42.6 mmol), Boc- Gly- Hmb- OH (13.99 g, 50.8 mmol), HOBt (7.74 g , 57.3 mmol)を加えた。そして、氷冷しながら DCC (12.01 g, 58.2 mmol)を加え、攪 拌した。反応終了後、 DCUreaをろ去して濃縮した。その後、 EtOAc (300 ml)をカロえ て 1時間放置した。再び DCUreaをろ去した後、 10%クェン酸水溶液 3回、食塩水 1回、 飽和 NaHCO水溶液 3回、食塩水 1回の順に洗浄した。有機相は Na SOを加えて乾
3 2 4
燥の後、濃縮した。展開溶媒として酢酸ェチル:ベンゼン = 1 : 9を用いるシリカゲル力 ラムクロマトグラフィーで精製しオイル状生成物を得た。不純物がわずかに残って ヽ た力 そのまま次の実験に進んだ。収量: 7.0 g(68%) .
[0067] (5b： Boc- Va Gly- Hmb- Pro- OBzlの合成）
HC1 - H-Gly-Hmb-Pro-OBzl (9.36 g, 22.6 mmol), NMM (2.50 ml, 22.6 mmol), Boc -Val-OH (7.44 g, 34.2 mmol), HOBt (4.66 g, 34.5 mmol), DCC (7.14 g, 34.6 mmol) を使用し、縮合反応を行った。精製は EtOA ベンゼン = 1 : 9を展開溶媒とするシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィーで精製しオイル状生成物を得た。不純物と目的物がわ ずかに残っていた力 そのまま次の実験で用いた。収量： 11.8 g(93%) .
[0068] (5c： Boc- Gly- Va Gly- Hmb- Pro- OBzlの合成）
HC1 - H-Val-Gly-Hmb-Pro-OBzl (5.03 g, 9.79 mmol), NMM (1.10 ml, 9.97 mmol) 、 Boc-Val-OH (2.82 g, 15.9 mmol), HOBt (2.17 g, 16.1 mmol), EDC -HCl (3.04 g： 15.7 mmol)を使用し、縮合反応を行った。精製は EtOA ベンゼン = 4: 1を展開溶媒 とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。収量: 2.03 g (34%)、融点 51-54 ° C、 [ α ]
Figure imgf000029_0001
[0069] (5d： Boc- Gly- Va Gly- Hmb- Pro- OHの合成）
300 mlナスフラスコに Boc- Gly- Va卜 Gly- Hmb- Pro- OBzl (2.51 g, 4.06 mmol)を入 れ、 MeOH (30 ml)に溶力した。その後、パラジウムカーボンをミクロスパチュラ一杯分 加え攪拌を開始した。系を水素ガスに置換し接触還元を約 24時間行った。反応終了 後、パラジウムカーボンをろ去した後、 MeOHを留去し、残渣にへキサン（30 ml)をカロ えて結晶化させた。その後、 EtOAc (20 ml),へキサン（50 ml)で再結晶を行った。収 量： 1.85 g (86%)、融点 73-77。 C、 [ α ] 20 :-89 deg. (MeOH, c 0.1).
D
[0070] (5e： Boc- Gly- Va Gly- Hmb- Pro- OSuの合成）
Boc-Gly-Val-Gly-Hmb-Pro-OH (0.34 g, 0.64 mmol)を 50 mlナスフラスコに入れ、 DMF 5 mlに溶力した。そして、 HOSu (0.10 g, 0.87 mmol)加え、氷冷しながら DCC (0 .17 g, 0.82 mmol)をカ卩えてー晚攪拌した。反応終了後、生成した DCUreaをろ別し、 ろ液は濃縮した。残渣に EtOAcをカ卩ぇ再び DCUreaをろ別した。真空ポンプで乾燥さ せると無色固体が得られた。収量： 0.36 g (89%)、 [ α ] 20:- 79 deg. (MeOH, c 0.1)、融
D
点： 45-49。 C.
[0071] (5f:poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Pro)の合成、蒸留 CHC1中の重合反応） TFA-H-Gly-Val-Gly- Va卜 Pro— ONSu (0.27 g, 0.58 mmol)を 50mlナスフラスコにい れ、蒸留 CHCl (10 ml)に溶解させた。氷冷しながら TEA (0.081 ml, 0.58 mmol)加え
3
て攪拌した。 1時間後、氷浴をはずし、室温で 2週間攪拌を行った。その後、分子量 35 00以下を通す半透膜で透析を 1週間行い、凍結乾燥により無色粉末を得た。収量 : 5 3 mg (22%)、融点 173-186° C. 平均分子量 5000 (MALDI-TOF質量分析法による 見かけの数値)。
[0072] [実施例 6]
(6) polyCGly -Thr'-Gly'-Hmb'-Pro5)の合成
(6a： Boc- Thr- Gly- Hmb- Pro- OBzlの合成）
HC1 - H-Gly-Hmb-Pro-OBzl (11.24 g, 27.1 mmol), NMM (3.30 ml, 29.9 mmol), Bo c-Thr-OH (7.40 g, 33.8 mmol), HOBt (3.77 g, 27.4 mmol), DCC (7.35 g, 35.6 mmo 1)により縮合反応を行った。展開溶媒として EtOA ベンゼン = 4: 1によるシリカゲル カラムクロマトグラフィーで精製し、無色オイルを得た。収量 : 6.03 g (38%) .
[0073] (6b： Boc- Gly- Thr- Gly- Hmb- Pro- OBzlの合成）
HCl'H— Thr— Gly— Hmb— Pro— OBzl (4.89 g, 9.48 mmol), NMM (1.05 ml, 9.53 mmol) 、 Boc-Val-OH (2.75 g, 15.5 mmol), HOBt (1.28 g, 9.47 mmol), EDC -HC1 (2.75 g, 14.3 mmol)により縮合反応を行った。展開溶媒が EtOA ベンゼン = 1 : 1であるシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、無色結晶を得た。収量: 4.40 g (75%)、 [ α ]
D
20 :-80 deg. (MeOH, c 0.1)、融点： 70- 72° C、エレクトロスプレー質量分析： 621.4 ([ M+H]+), 643.4 ([M+Na]+).
[0074] (6c： Boc- Gly- Thr- Gly- Hmb- Pro- OHの合成）
100mlナスフラスコに Boc— Gly— Thr— Gly— Hmb— Pro— OBzl (1.00 g, 1.61 mmol)を入 れ、 MeOH (15 ml)に溶力した。その後、パラジウムカーボンをスパチュラ一杯入れ攪 拌した。そして、水素ガスにより接触還元を約 4時間行った。反応終了後、パラジウム カーボンをろ去して濃縮により MeOHを除いて、へキサン (30 ml)をカ卩えて結晶化させ た。その後、 EtOAc (10 ml)、へキサン（20 ml)で再結晶を行った。収量： 0.73 g (86%) 、 [ α ] 20:- 77 deg. (MeOH, c 0.1)、融点： 96- 97° C、エレクトロスプレー質量分析： 56
D
9.3 ([M+Na]+). [0075] (6d： Boc- Gly- Thr- Gly- Hmb- Pro- OSuの合成）
Boc-Gly-Thr-Gly-Hmb-Pro-OH (0.71 g, 1.34 mmol)を 100 mlナスフラスコに入れ 、 DMF (10 ml)に溶力した。そして、 HOSu (0.23 g, 2.01 mmol)加え、氷冷しながら D CC (0.41 g, 2.01 mmol)を加えてー晚攪拌した。反応終了後、 DCUreaをろ別し、ろ 液は濃縮した。 EtOAcをカ卩えて不溶な DCUreaを再び除いた。再び濃縮し無色のオイ ルを得た。収量： 1.0 g (ほぼ定量的）.
[0076] (6d:poly(Gly- Thr- Gly- Hmb- Pro)の合成、蒸留 CHC1中の重合反応）
3
TFA-H-Gly-Thr-Gly- Va卜 Pro— OSu (0.93 g, 1.34 mmol)を 100 mlナスフラスコに いれ、蒸留 CHC1 (15 ml)に溶解させた。氷冷しながら TEA (0.19 ml, 1.36 mmol)を
3
加えて攪拌した。 1時間後、氷浴をはずし、室温で 2週間攪拌を行った。その後、分子 量 3500以下を通す半透膜で透析を 1週間行い、凍結乾燥により無色粉末を得た。収 量： 31 mg(6%)、融点： 162-176° C、数平均分子量 4000 (MALDI-TOF質量分析法 によるみかけの数値)。
[0077] [実施例 7]
(7) pobKGly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5)の合成
(7a： Boc- Gly- Hmb- Pro- OBzlの合成）
Boc- Gly- Hmb- OH (10.71 g, 38.9 mmol)を蒸留 CHC1に溶かし DCC (8.03 g, 38.9
3
mmol)と HOBt (5.96 g, 38.9 mmol)を加えた。別のナスフラスコに HCl'H— Pro— OBzl ( 10.34 g, 35.4 mmol)の蒸留 CHC1溶液を用意し NMM (3.89 ml, 35.4 mmol)で中和し
3
た。両者を攪拌し縮合反応を開始した。そのままゆっくりと室温へ戻し終夜攪拌した 後、系を濃縮した。残渣に EtOAcを加え、析出する DCUreaを繰り返し除いた。溶液 は 10%クェン酸、蒸留水、飽和 NaHCO、蒸留水、飽和 NaClで洗浄を行い Na SOで
3 2 4 乾燥し濃縮してオイル状目的物を得た。
収量： 15.39 g (94.0 %).
1H NMR (CDC1 , 300 MHz): 7.33 (5H, -OBzl C H ); 5.13 (2H, -OBzl— CH -); 4.84
3 6 5 2
(1H, Hmb a CH); 4.60 (1H, Gly NH); 4.01 (2H, Gly a CH ); 3.84 (1H, Pro a CH);
2
3.62 (2H, Pro δ CH ); 2.20 (2H, Pro β CH ); 2.04 (1H, Hmb β CH); 2.00 (2H, Pro
2 2
y CH ); 1.44 (9H, Boc t- Bu); 1.00 (3H, Hmb y CH ). [0078] (7b： Boc- lie- Gly- Hmb- Pro- OBzlの合成）
Boc— lie— OH . 1/2H O (8.86 g, 36.9 mmol), EDC - HCl (6.43 g, 36.9 mmol), HOBt (
2
4.98 g, 36.9 mmol), HCl ' H— Gly— Hmb— Pro— OBzl (13.37 g, 33.5 mmol), NMM (3.69 ml, 33.5 mmol)を使用し、縮合反応を行った。精製はカラムクロマトグラフィー（EtOA c:ベンゼン = 1 :9)で精製しオイル状目的物を得た。
収量： 17.76 g (92.0 %),エレクトロスプレー質量分析： 576.4 ([M+H]+), 598.4 ([M+Na]+ ).
JH NMR (DMSO-d , 300 MHz): 8.32 (IH, Gly NH); 7.33 (5H, -OBzl C H ); 6.64 (1
6 6 5
H, lie NH); 5.09 (2H, -OBzl— CH -); 4.87 (IH, Hmb a CH); 4.38 (IH, Pro a CH);
2
4.00 (IH, lie a CH); 3.80 (2H, Gly a CH ); 3.72 (2H, Pro δ CH ); 2.19, 1.88 (2H,
2 2
Pro β CH ); 2.01 (IH, Hmb β CH); 1.88 (2H, Pro y CH ); 1.66 (IH, lie β CH); 1.3
2 2
5 (9H, Boc t-Bu); 1.14 (2H, lie y CH ); 0.92 (3H, lie y CH ); 0.89 (3H, lie δ CH );
2 3 3
0.78 (3H, Hmb y CH ).
3
[0079] (7c： Boc- Gly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5- OBzlの合成）
Boc- Gly- OH (2.58 g, 14.7 mmol), EDC - HCl (2.83 g, 14.7 mmol), HOBt (1.99 g, 14.7 mmol), HCl ' H— lie— Gly— Hmb— Pro— OBzl (6.88 g, 13.4 mmol), NMM (1.47 ml, 1 3.4 mmol)を使用し、縮合反応を行った。精製はカラムクロマトグラフィー（EtOAc:ベ ンゼン = 1 : 10)で精製しオイル状目的物を得た。
収量： 4.93 g (58.1 %),エレクトロスプレー質量分析： 633.5 ([M+H]+), 655.5 ([M+Na]+). 1H NMR (DMSO-d , 300 MHz): 8.50 (IH, Gly3 NH); 7.64 (IH, lie2 NH); 7.32 (5H, -
6
OBzl C H ); 6.96 (IH, Gly1 NH); 5.09 (2H, -OBzl— CH -); 4.88 (IH, Hmb4 a CH);
6 5 2
4.37 (IH, Pro5 a CH); 4.23 (2H, Pro5 δ CH ); 3.98 (2H, Gly3 a CH ); 3.92 (IH, lie2
2 2
a CH); 3.72 (2H, Gly1 a CH ); 2.19, 1.80 (2H, Pro5 β CH ); 2.02 (IH, Hmb4 β C
2 2
H); 1.93 (2H, Pro5 y CH ); 1.68 (IH, lie2 β CH); 1.36 (9H, Boc t-Bu); 1.14 (2H, lie
2
2 γ CH ); 0.92 (3H, lie2 y CH ); 0.88 (3H, lie2 δ CH ); 0.79 (3H, Hmb4 y CH )
2 3 3 3
[0080] (7d： Boc- Gly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5- OHの合成）
Boc- Gly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5- OBzl (4.93 g, 7.79 mmol)を MeOHに溶かし、パラ ジゥムカーボン粉末をカ卩えた。装置を組み立てた後、ナスフラスコを Hで満たしてか ら攪拌し、接触還元反応を開始した。液面の上昇より反応の進行を確認しつつ TLC により原料のスポットが消えたことで反応の終了とした。その後、パラジウムカーボン 粉末を除去しろ液を濃縮した。その後、ベンゼンを加えて共沸を行い、オイル状目的 物を得た。
収量: 4.34 g (定量的).
1H NMR (DMSO-d , 300 MHz): 8.49 (IH, Gly3 NH) ; 7.60 (IH, lie2 NH) ;6.95 (IH, G
6
ly1 NH) ;4.90 (IH, Hmb4 a CH) ;4.22 (IH, Pro5 a CH); 4.22 (IH, lie2 a CH); 3.98 ( 2H, Gly3 a CH ); 3.79 (2H, Pro5 δ CH ); 3.53 (2H, Gly1 a CH ); 2.07, 1.75 (2H, Pr
2 2 2
o5 β CH ); 1.97 (IH, Hmb4 β CH); 1.97 (2H, Pro5 y CH ); 1.67 (IH, lie2 β CH); 1.
2 2
36 (9H, Boc t-Bu); 1.14 (2H, lie2 y CH ); 0.98 (3H, Hmb4 y CH ); 0.84 (3H, lie2 y
2 3
CH ); 0.79 (3H, lie2 δ CH ).
3 3
[0081] (7e： Boc- Gly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5- OSuの合成）
Boc- Gly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5- OH (4.34 g, 8.00 mmol)を蒸留 DMFに溶かし DCC ( 1.82 g, 8.80 mmol)を加え、氷冷下で攪拌を開始した。そのままゆっくりと室温へ戻し 終夜攪拌した後、 DCUreaを除去した。その後、濃縮し、脱水 Et 0/石油エーテルで
2
結晶化させ目的物を得た。
収量： 4.09 g (79.9 %).
JH NMR (DMSO-d , 300 MHz): 8.52 (IH, Gly3 NH); 7.62 (IH, lie2 NH); 6.96 (IH,
6
Gly1 NH); 4.92 (IH, Hmb4 a CH); 4.74 (IH, Pro5 a CH); 4.23 (IH, lie2 a CH); 3.93 (2H, Gly3 a CH ); 3.77 (2H, Pro5 δ CH ); 3.55 (2H, Gly1 a CH ); 2.78 (4H, -OSu)
2 2 2
； 2.45, 1.99 (2H, Pro5 β CH ); 1.99 (IH, Hmb4 β CH); 1.99 (2H, Pro5 y CH ); 1.66
2 2
(IH, lie2 β CH); 1.36 (9H, Boc t— Bu); 1.04 (2H, lie2 y CH ); 0.93 (3H, Hmb4 y C
2
H ); 0.81 (3H, lie2 y CH ); 0.76 (3H, lie2 δ CH ).
3 3 3
[0082] (7f: HC1 · H- Gly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5- OSuの合成）
Boc- Gly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5- OSu (2.47 g, 3.86 mmol)を 4M HC1/ジォキサン（9.
7 ml)によりアミノ基末端を脱保護し、 目的物を得た。
収量: 2.33 g (定量的).
[0083] (7g： pohKGly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5)の合成） HCl'H- Gly1- lie2- Gly3- Hmb4- Pro5- OSu (1.51 g, 2.62 mmol)を蒸留 DMFに溶かし、 系中にテトラエチルァミン（0.36 mL, 2.62 mmol)を滴下し、重合を開始した。 2週間後 反応溶液を濃縮し、 CHC1に溶解し、蒸留水、飽和 NaHCOで洗浄を行った。その後
3 3
、脱水 Et 0で結晶化させ、その生成した固体を 3日間蒸留水に溶かし、それを凍結
2
乾燥した後、目的物を得た。
収量： 0.67 g (57.8 %)、融点： 176-189°C、数平均分子量 2640 (MALDI-TOF質量分 析法による見かけの数値）
[0084] [実施例 8]
(8) MALDHTOF法による質量分析：
本発明により得られた化合物のうち、重合反応で合成された化合物がどの程度の 大きさの分子量を持ったポリマーであるかを確かめるために MALDI-TOF法による質 量分析を行った。ここには図 2に poly(Gly-Va卜 Gly-Hmb-Ala-Pro)の例を示した。そ の結果、スペクトルの高分子量側（分子量 3000以上）の領域でピークが約 481毎に観 測されることから、重合反応によりポリマーを生成したことが確認された。ここで用いた 試料は透析により分子量 3500以下の成分を除 、たものを用いて 、る。低分子量側 ( 分子量 3000以下）のシグナルは分析装置内で分解または多価イオンに由来するピー クと帰属される。また高分子量側の各ピークの強度は照射レーザーの強度によって 変化するため、分子量分布そのものには対応していない。実際にはレーザー強度を 上げることで分子量 1万以上の成分を観測することも可能であった。
[0085] [実施例 9]
(9)円偏光二色性スペクトル：
本発明により得られたィ匕合物について温度変化円偏光二色性スペクトルを測定し た。これは目視観測による温度応答性変化とは異なった情報を得ることができる。例 えば溶液構造についての知見である。ここには例として、図 3に poly(Gly_Va卜 Gly-H mb- Ala- Pro)、図 11に poly(Gly- lie- Gly- Hmb- Pro)を示した。
[0086] 図 3のスペクトルは 212應に等円二色性点を示しながら変化した。希薄水溶液（1 m g/mL)のために凝集はみられない。温度が上昇するに従って 196 nmに見られる負の バンドが減少してゆくことがわかる。これは発明者らの関連研究により溶液構造がより 乱雑になってゆくためと考えられている（例えば、奥ら、 Journal of Polymer Science, P art A, Polymer Chemistry, 2000年、 38卷、 4524ページ）。
[0087] また、図 11のスペクトルでは 220 nmに等円二色性点を示しながら変化した。低温時 では 195 nmに負の極大を示し、温度が上昇するにつれて 210 nmに正の極大、 225 n mに負の極大を示した。温度上昇に伴い 195 nmに見られる負の極大が減少している 。これは図 3の場合と同様な傾向であり、同様な構造変化が考えられる。希薄水溶液 (0.1 mg/mL)のため凝集は見られない。
[0088] [実施例 10]
(10)温度応答性の写真観測：
本発明により得られたィ匕合物についてそれらの水系溶液を加温することによる温度 応答性変化を写真により観測した。ここには例として、図 4と図 5に poly(Gly-Va卜 Gly- Hmb- Ala- Pro)の、図 12には poly(Gly- lie- Gly- Hmb- Pro)の場合を示した。図 4と図 5 では 25°Cでは透明な水溶液が 55°Cに加温することで白濁することがわかる。図 12 では 0°Cでは透明な水溶液が 20°Cに加温することで白濁することがわかる。これらの 白濁現象は加熱と冷却を交互に行うことで何度も繰り返し観測することができる。
[0089] [実施例 11]
(11)みかけの吸光度による温度応答性の観測：
本発明により得られたィ匕合物についてそれらの水系溶液を加温することによる温度 応答性変化をみかけの吸光度により観測した。観測波長には 500應を用いた。これ は目視による光の散乱即ち白濁する現象に対応している。ここには図 6〜9に poly(Gl y-Val-Gly-Hmb-Ala-Pro) , poly[(Gly- Vaト Gly- Hmb- Ala- Pro)- co- (Gly- Lys(Z)- Gly- Va- Ala- Pro)]、 poly(Gly- Va卜 Gly- Hmb- Pro)、 poly(Gly- Thr- Gly- Hmb- Pro)、 TFA-H -(Gly-Val-Gly-Hmb-Pro) -OHの例を示した。グラフの縦軸は透過率ではなく見か
5
けの吸光度を用いた。これにより温度応答の鋭敏さを比較することができる。 目視に よる観測との対応では、見かけの吸光度がおおよそ 0.1を越えた時点で十分に凝集 が進行し、これ以上ほとんど変化が起きて 、な 、と感じて 、る。
[0090] [実施例 12]
(12)温度応答性の可逆的な観測： 本発明により得られたィ匕合物についてそれらの水系溶液を加温することによる、可 逆的な温度応答性変化を透過率により観測した。ここでは観測波長には 500 應を用 いた。これは目視による光の散乱即ち白濁する現象に対応している。ここには図 13と 14に poly(Gly-Ile-Gly-Hmb-Pro)の濃度別の例を示した。その結果、透過率 50%の ときの温度を転移温度とした場合、ポリマー濃度が 10 mg/mLの場合、加熱時に転移 温度 10.2°C、冷却時に転移温度 9.2°Cであった。より高濃度な 20 mg/mLの条件では 、加熱時の転移温度 5°Cとより低温である値を示した。同じく冷却時の転移温度は 3.5 °Ct ヽぅ値を示した。 V、ずれも可逆的な転移現象であると確認できた。
[0091] [実施例 13]
(13)温度応答性の目視観測：
本発明により得られたィ匕合物についてそれらの水系溶液を加温することによる温度 応答性変化を目視により観測した。ここには図 10に - Gly-Va卜 Gly-Hmb-Ala-Pro- 単位を一定数（3または 6)持つ化合物と poly(Gly-Va卜 Gly-Hmb-Ala-Pro)、 poly(Gly -Val-Gly-Hmb-Pro), poly(Gly- Thr- Gly- Hmb- Pro)、 poly(Gly- lie- Gly- Hmb- Pro)、の 例を示した。
産業上の利用の可能性
[0092] 本発明によれば、温度応答性デプシペプチドポリマーやこれを含む温度応答性組 成物を得ることができる。本発明のポリマーや組成物は生体内で分解吸収される組 成物、土壌などの環境下で分解吸収される組成物、細胞接着剤、創傷被覆材料、マ イク口カプセル、バイオマシン、ノィォセンサー、分離膜、検査キットなどを構成する のに利用できる。また、本発明のポリマーや温度応答性組成物は生体内での安全性 が高 ヽと 、う利点も有して 、る。

Claims

請求の範囲 [1] 下記一般式 (I) -R -Hmb-R - (I) 1 2 (式中、 Hmbは下記式 (II)のバリン酸残基を示し、 Rはエステル結合で結合したァミノ 1 酸、ポリペプチドまたはヒドロキシ酸、 Rはアミド結合で結合したアミノ酸もしくはポリべ 2 プチド、またはエステル結合で結合したヒドロキシ酸を表す）
[化 1]
Figure imgf000037_0001
で表される繰り返し単位を有し、アミノ酸残基及びヒドロキシ酸残基の総数が 18以上 であるポリマー化合物。
[2] 前記一般式 (I)が、
-Gly-Hmb- を含む請求項 1に記載のポリマー化合物。
[3] 前記一般式 (I)が、
- Gly-Hmb-Pro-または- Gly-Hmb-Ala-Pro-を含む請求項 1に記載のポリマー化合物
[4] 前記一般式 (I)が、
-Gly-X— Gly— Hmb— Ala— Pro—または— Gly— X— Gly— Hmb— Pro—
1 2
(X及び Xは a アミノ酸残基を示す）
1 2
である、請求項 1に記載のポリマー化合物。
[5] 末端に糖鎖配列、タンパク質、多糖、金属錯体、高分子担体、ゲル、フィルム、ラテツ タス粒子、金属微粒子、またはプラスチックプレートが結合した、請求項 1〜4のいず れか一項に記載のポリマー化合物。
[6] 請求項 1〜5の！、ずれか一項に記載のポリマー化合物を含む温度応答性組成物。
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