WO2006041157A1 - 動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、ハイブリドーマの製造方法、及びモノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents

動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、ハイブリドーマの製造方法、及びモノクローナル抗体の製造方法 Download PDF

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Jun-Ichi Hata
Naoki Nishiguchi
Masahiro Furutani
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Definitions

  • Animal immunization method, immunization composition, antibody production method, hypridoma production method, and monoclonal antibody production method Animal immunization method, immunization composition, antibody production method, hypridoma production method, and monoclonal antibody production method
  • the present invention relates to an animal immunization method, an immunization composition, an antibody production method, a hyperidoma production method, and a monoclonal antibody production method, and more specifically, a gene encoding an antigen protein and Method of immunizing an animal that induces a humoral immune response by administering a fusion gene with a gene encoding a chaperocinin, an immune composition for use in the immunization method, and an antibody using the immunization method
  • the present invention relates to a production method, a production method of a hyperidoma using immune cells of an animal immunized by the immunization method, and a production method of a monoclonal antibody using the hyperidoma.
  • Antibodies play a major role in humoral immunity and play an important role in biological defense mechanisms together with sensitized lymphocytes.
  • antibodies are frequently used in various technologies that utilize their specific affinity with antigens, such as affinity chromatography and immunoassays, and are indispensable in the biotechnology field. It has become a tool.
  • antibodies have been produced by administering antigenic proteins to animals as an immunogen and inducing a humoral immune response.
  • an antigen protein used as an immunogen is isolated and purified from a biological sample or the like.
  • gene immunization there is a technique called gene immunization in which an immune response is induced by expressing a gene encoding an antigen protein in an animal body rather than inoculating the antigen protein.
  • gene immunization for example, a gene encoding an antigen protein is appropriately generated. It is integrated into the current vector and the expression vector is inoculated into the animal. Then, the gene incorporated in the expression vector is expressed in the animal body, and the antigen protein is synthesized. As a result, an immune response is induced by the antigen protein synthesized in the animal body.
  • immunization can be performed as long as the gene encoding the antigen protein is isolated, and it is not necessary to isolate and purify the antigen protein. Therefore, even an antigen protein for which no purification method has been established, an antigen protein that is difficult to purify, or an unknown antigen protein for which only a gene is known can induce an immune response against the antigen protein. As a result, an antibody against such an antigen protein can be obtained.
  • an immune response can be induced even if the amount of antigen protein expressed and synthesized in the animal body is much smaller than the amount required for direct administration of antigen protein.
  • the entire length of a gene that does not require separate chemical synthesis of peptide antigens as in the conventional method is introduced into animals. There are also advantages.
  • gene immunization has advantages not found in conventional methods, but depending on the type of antigen protein, a humoral immunity response may not be induced and antibodies may not be produced.
  • a humoral immune response may not be induced as in the conventional immunization method.
  • the protein is highly homologous to the protein inherently possessed by the immunized animal, even if the antigen protein is synthesized in the animal body, it is not recognized as a foreign substance, and therefore humoral.
  • An immune response may not be induced.
  • the antigen protein is unstable in the animal body, the amount of the antigen protein in the animal body decreases, and a humoral immune response may not be induced.
  • the antigen protein when the antigen protein mainly induces cellular immunity, humoral immunity is not induced.
  • Another problem unique to genetic immunity is when the antigen protein gene is poorly introduced into the animal, or when the antigen protein gene has a low expression level in the animal body. However, the amount of antigenic protein may be reduced, and a humoral immune response may not be induced.
  • a fusion gene chimeric nucleic acid of a gene encoding HSP70, which is a heat shock protein, and a gene encoding an antigen protein is used as a DNA fragment
  • Patent Document 2 a gene encoding HSP70 derived from Mycobacterium tuberculosis is used.
  • this technique was able to induce antigen-specific cellular immunity (killer T cells), but not humoral immunity, ie antibody production.
  • HSP70 functions as a suitable adjuvant and induces antibody production against the antigen protein
  • Patent Document 3 the immune response mechanism in the antigen-presenting cells differs between the immune response due to the fusion protein of HSP70 and the antigen protein and the immune response due to the fusion gene of the HSP70 gene and the antigen protein gene. is doing.
  • an immune response of a humoral immune response to a certain antigen protein is induced, immunization using the gene of the antigen protein does not always induce a desired immune response. Rather, it is more likely that the desired immune response against the antigenic protein cannot be induced.
  • Patent Document 1 Pamphlet of International Publication No. 02Z08416
  • Patent Document 2 Pamphlet of International Publication No. 01Z29233
  • Patent Document 3 International Publication No. 94Z29459 Pamphlet
  • An object of the invention is to provide various techniques capable of inducing a humoral immune response with higher efficiency when producing an antibody against an antigen protein by gene immunization.
  • the present inventors code a gene encoding a protein and a chaperone even if the antigen protein cannot induce a humoral immune response even when the gene is inoculated into an animal. It was found that humoral immunity responses to antigenic proteins can be induced by inoculating animals with a gene fusion gene, and the present invention was completed.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the first aspect of the present invention is a fusion gene in which a gene encoding all or a part of an antigen protein and a gene encoding a chaperonin subunit or a chaperinine subunit conjugate are linked.
  • the animal immunization method of this aspect belongs to genetic immunity, and a gene encoding all or part of an antigen protein and a gene encoding a chapein nin subunit or a chaperuminin subunit conjugate. And a fusion gene linked to is administered to the animal. Then, the fusion gene is expressed in the animal body, and a fusion protein of all or part of the antigen protein and a gene encoding a chaperonin subunit or a chaperonin subunit conjugate is synthesized. . As a result, a response of humoral immunity against the antigen protein is induced.
  • the animal immunization method of this aspect even if an antigen protein that cannot induce a humoral immune response by administration of a gene encoding the antigen protein alone, the humoral property is affected by the action of the chape mouth nin. An immune response can be induced. As a result, an antibody against such an antigen protein can be produced in an animal.
  • Chaperone is a kind of molecular chaperone and is a complex protein with a molecular weight of about 60,000 subunits (chaperonin subunits).
  • the chapein nin can store other proteins inside and fold correctly.
  • a “chaperonin subunit conjugate” has two or more chaperone subunits connected in series via peptide bonds. Defined as an artificial protein tied.
  • a chapemouth nin subunit subunit is an artificial protein in which two or more chapemouth nin subunits are linked in tandem.
  • a gene encoding a chaperonenin subunit and a gene encoding a chaperonenin subunit conjugate are collectively referred to as “a gene encoding chaperonin”.
  • the chape mouth nin subunit or the chape mouth nin subunit conjugate is derived from E. coli.
  • Chapeguinin derived from E. coli is called GroEL, and its biochemical and physicochemical properties are well examined, and genes are also readily available.
  • the chapemouth nin subunit or the chapemouth nin subunit conjugate is derived from Escherichia coli. Due to the powerful configuration, a fusion gene for administration to animals can be easily produced.
  • the fusion gene is incorporated into an expression vector, and expression is regulated by a promoter on the expression vector.
  • the fusion gene is incorporated into an expression vector, and its expression is regulated by a promoter. Due to the powerful structure, the fusion gene can be expressed in the animal more reliably. As a result, a humoral immune response can be induced more reliably.
  • the promoter is a CMV promoter, AML promoter, SV40 promoter, SRa promoter, or EF-1 ⁇ promoter.
  • the expression vector contains a CpG motif.
  • the CpG motif is a nucleotide sequence contained in microbial DNA, and is known to enhance the immune stimulation system of mammals.
  • the expression vector contains a CpG motif.
  • the animal is a mammal or a bird.
  • This preferred method of immunizing an animal is a mammal or a bird that is easy to handle by the animal to be immunized. Improving configuration makes it easier to immunize
  • the mammal is a mouse, a rat, a rabbit, a rabbit, a horse, a dog, a cat, a goat, a sheep or a pig.
  • the bird is a -bird, duck or turkey.
  • the antigen protein is a G protein-coupled receptor, an ion channel receptor, a tyrosine kinase receptor, a CD antigen, a cell adhesion molecule, a cancer antigen, a cytokine, a growth factor, or a growth factor.
  • Trophic factors viral antigens, bacterial antigens or toxin antigens.
  • this is a protein useful for the development of pharmaceuticals such as antigen-protein receptor, protein-synthesizing receptors, etc., for the immunization method of animals of this aspect.
  • pharmaceuticals such as antigen-protein receptor, protein-synthesizing receptors, etc.
  • antibodies against these useful proteins can be obtained and applied to the construction of assembly systems.
  • a second aspect of the present invention is an immunizing composition for use in the animal immunization method of the present invention, comprising a gene encoding all or part of an antigen protein and a chapein nin subunit or It is an immunizing composition comprising as a main component a fusion gene linked to a gene encoding a chapemouth nin subunit subunit.
  • a composition in which the fusion gene is dissolved in an appropriate solvent can be prepared, and the composition can be administered to the animal.
  • the immunizing composition of this aspect is for use in the animal immunization method of the present invention.
  • the main component is a fusion gene in which a gene encoding all or part of an antigenic protein and a gene encoding a chapein nin subunit or a chaperuminin subunit conjugate are linked.
  • the fusion gene can be administered to the animal by a method such as injection. Further, the dosage of the fusion gene can be accurately adjusted by adjusting the concentration of the fusion gene in the composition.
  • a third aspect of the present invention is that an antigen is immunized by immunizing an animal using the animal immunization method of the present invention.
  • a method for producing an antibody which induces a response of humoral immunity to a protein, causes the animal to produce an antibody against an antigen protein, and collects the antibody from the animal.
  • the animal immunization method of the present invention described above induces a response of humoral immunity, and as a result, the animal can produce antibodies. Then, the antibody production method of this aspect induces a humoral immunity response by the animal immunization method of the present invention, causes the animal to produce an antibody against the antigen protein, and collects the animal strength antibody. .
  • an antigen protein for which no purification method has been established an antigen protein that is difficult to purify, an unknown antigen protein for which only a gene is known, or the expression level of a gene in recombinant DNA technology is low. Even if it is an antigen protein such as an antigen protein that does not produce an antibody even when its gene is administered alone, an antibody can be produced in an animal. When collecting antibodies from animal serum, they are collected as polyclonal antibodies.
  • the fourth aspect of the present invention is to immunize an animal by the immunization method of the animal of the present invention to induce a humoral immunity response against an antigen protein, then collect immune cells from the animal, This is a method for producing a hyperidoma that produces a hybridoma that produces an antibody against an antigen protein by fusing an immune cell and a myeloma.
  • the antigen protein is obtained by fusing the myeloma with the immune cells of the animal whose humoral immune response has been induced by the immunization method of the animal of the present invention described above.
  • To produce a monoclonal antibody that produces a monoclonal antibody against With such a structure, it is possible to obtain a hyperidoma that produces a monoclonal antibody against an antigen protein, even if the antigen protein itself or its gene is administered alone, but no antibody is produced.
  • a fifth aspect of the present invention is a method for producing a monoclonal antibody, comprising culturing the hyperidoma produced by the method for producing a hyperidoma of the present invention and collecting a monoclonal antibody against an antigen protein from the culture product. .
  • the hyperidoma produced by the above-described production method of the hyperidoma of the present invention is cultured, and the monoclonal antibody is collected from the culture.
  • the antigen protein itself or its gene can be Even if it is administered, no antibody is produced. Even if it is an antigenic protein, a monoclonal antibody against it can be obtained.
  • the sixth aspect of the present invention is to prepare an mRNA against an antibody from an animal after immunizing the animal by the immunization method of the present invention to induce a humoral immune response against the antigen protein.
  • This is a production method in which cDNA is prepared using the mRNA as a saddle type and a monoclonal antibody against the antigen protein is prepared by a phage display method using the cDNA.
  • the monoclonal antibody production method of this aspect uses a phage display method.
  • An animal force mRNA in which a humoral immunity response is induced by the above-described animal immunization method of the present invention is prepared, and the mRNA is prepared from the mRNA.
  • a cDNA is prepared, and a monoclonal antibody against the antigen protein is prepared by a phage display method using the cDNA.
  • a hyperidoma of the present invention when a gene immunization is performed, a humoral immunity response cannot be induced even if the gene is inoculated alone in an animal. Even so, a hyperidoma that produces a monoclonal antibody against an antigenic protein can be produced.
  • FIG. 1 The analysis results of interaction between hETAR gene-introduced cells and serum anti-hETAR antibody in Example 3 are shown, and FIG. 1 (a) shows the use of serum before gene immunization (day 0).
  • FIG. 1 (b) is a two-dimensional dot display diagram when using serum 35 days after gene immunization.
  • FIG. 2 The analysis results of the interaction between hETBR gene-introduced cells and serum anti-hETAR antibody in Example 3 are shown, and FIG. 2 (a) shows the case where serum before gene immunization (day 0) was used.
  • FIG. 2 (b) are two-dimensional dot display diagrams when using serum on day 35 after gene immunization.
  • FIG. 3 shows the analysis results of the interaction between the control cells and serum anti-hETAR antibody in Example 3, and FIG. 3 (a) shows the results when serum before genetic immunization (day 0) was used.
  • Dimensional dot display diagram Fig. 3 (b) is a two-dimensional dot display diagram when using serum on day 35 after gene immunization.
  • the animal immunization method of the present invention belongs to gene immunity, and comprises a gene encoding all or a part of an antigen protein and a chape mouth nin subunit or a chape mouth nin subunit subunit conjugate.
  • both a gene encoding the whole antigen protein and a gene encoding a part of the antigen protein can be used, and can be used or separated according to the purpose.
  • a gene encoding all of the antigen protein when used, for example, it is suitable for producing an antibody against each of a plurality of epitopes of the antigen protein or an antibody that recognizes the three-dimensional structure of the antigen protein.
  • the use of a gene encoding a part of an antigenic protein is suitable, for example, when an antibody against a specific epitope is produced.
  • Chapeguinin is a kind of molecular chaperone and is present in all living organisms such as bacteria, archaea, and eukaryotes. In particular, the cytoplasm of nocteria, mitochondria of eukaryotic cells, leaf green A large amount exists in the body. Chapeguinin has an activity of promoting protein folding and an activity of preventing protein denaturation.
  • Chape mouth nin is a cylindrical shape with a total molecular weight of about 800,000 to 1,000,000, consisting of two ring-shaped structures consisting of 7 to 9 chape mouth nin subunits (also called Hsp60) with a molecular weight of about 60,000. It is a huge complex protein.
  • Chape mouth nin has a cavity inside its ring-shaped structure, and a complex (hereinafter referred to as “chaperonin —protein”) is temporarily stored in the cavity and protein in the middle of folding or denatured protein. Complex "). It is known that the protein stored in the cavity is correctly folded, and subsequently the protein with the cavity force correctly released is also released.
  • Chapeguchinin is roughly divided into group 1 type and group 2 type. Chaperognin present in bacteria and eukaryotic organelles is classified as group 1 type, and a cofactor is a cyclic complex of a protein with a molecular weight of about 10 kDa called co-chaperonin.
  • group 2 chaperonin is found in the cytoplasm and archaea of eukaryotes, and there are many unclear points regarding their structure and function, which is equivalent to group 1 type chaperonin. No protein has been found at present. (Gupta, Mol. Microbiol., 15, 1—, 1995). In the animal immunization method of the present invention, any type of chapein nin gene can be used.
  • Group 1 type chapein nins include Escherichia coli GroEL
  • group 2 type chapein nins include archaeal TCP. That is, a gene encoding a GroEL subunit or a GroEL subunit conjugate, a gene encoding a TCP subunit or a TCP subunit conjugate can be used.
  • a fusion gene of a gene encoding all or part of an antigen protein and a chapein nin subunit is administered to an animal.
  • a humoral immune response to the antigen protein can be sufficiently induced.
  • the chapeinin is an antigenic protein in the cells of the immunized animal. It is conceivable that the state is stable.
  • chapein nin has been presented as an antigen.
  • Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 which are cellular antigen receptors (Gobert, AP et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 245). From this, it is possible that V or chaperinin functions as a suitable adjuvant for the fusion gene product of chaperinin and target antigen.
  • a fusion gene of a gene encoding all or a part of an antigen protein and a gene encoding a chaperocinin subunit conjugate is administered to the animal.
  • a “chaperonin subunit linked body” is defined as an artificial protein in which two or more chaperonin subunits are linked in series via peptide bonds.
  • a chape mouth nin subunit linked body is a human protein in which two or more chape mouth nin subunits are linked in tandem.
  • the gene encoding a chapemouth nin subunit subunit is an artificial gene in which two or more chapemouth nin subunit genes are linked in series.
  • the chape mouth nin subunit conjugates can gather together to have a complex structure similar to that of natural chape mouth nin. Therefore, even in this aspect, the expression product of the fusion gene is likely to form a complex in the same way as a natural chaperocinin-protein complex, and It may be possible to stabilize the antigenic protein.
  • the antigen protein is stored inside the chapein mouth and exists as a correctly folded normal protein.
  • GroEL A chapein nin derived from E. coli is called GroEL.
  • GroEL has a structure in which two ring-shaped structures consisting of seven subunits (GroEL subunits) overlap each other, and is formed from a total of 14 GroEL subunits.
  • the GroEL subunit gene is known and easily available, and is suitable for carrying out the animal immunization method of the present invention more simply.
  • SEQ ID NO: 10 shows the nucleotide sequence of a known GroEL subunit gene.
  • a GroEL subunit gene can be obtained by designing a primer based on this base sequence and performing PCR using E. coli genomic DNA as a saddle.
  • a single-ring chaperone having only one ring-shaped structure is also known as a chapein nin.
  • a gene encoding a single ring chaperinin can also be used.
  • a modified GroEL subunit in which a part of amino acid residues of the GroEL subunit is substituted.
  • An example of a modified GroEL subunit gene is shown in SEQ ID NO: 24.
  • This modified GroEL subunit gene encodes a modified GroEL subunit (SR1) in which the 452nd amino acid residue of the GroEL subunit is replaced with glutamic acid and the 461, 463, and 464th amino acid residues are replaced with alanine. To do.
  • the "gene encoding chaperonin subunit" in the animal immunization method of the present invention in addition to the gene encoding the full length of the natural chaperonin subunit, natural genes It also includes genes encoding proteins with similar activity derived from chaperonin subunits.
  • An example of such a gene is a gene encoding a mutant chaperorinin subunit obtained by modifying a natural chaperorinin subunit by amino acid substitution or the like.
  • Other examples include a gene encoding a protein that also has a domain power of a part of the natural or the above-mentioned mutant type chapein nin subunit.
  • Still other examples include a gene encoding a protein from which a domain of a part of the natural or the above-mentioned mutant type chapein nin subunit has been deleted.
  • operations such as preferentially inducing an immune response to an antigenic protein by using a highly immunogenic gene that can serve as an antigen-determining site in the chapeguinin subunit and a domain-deleted gene. Is possible.
  • a fusion gene is incorporated into an expression vector and is under the control of a promoter on the expression vector.
  • Any expression vector can be used as long as it can be replicated in animal cells. Can be mentioned.
  • the promoter on the expression vector is not limited as long as it functions in animal cells. For example, cytomegalovirus (CMV) CMV promoter, adenovirus major late (AML) AML promoter, Simian Virus 40 (Simian Virus 40, SV40) SV40 promoter, SV40 and HTLV-1 LTR fusion promoter SRa promoter, Elongation Factor (EF) EF-1 ⁇ promoter.
  • the expression vector may contain an enhancer that enhances promoter activity.
  • the expression vector may contain a CpG motif.
  • the CpG motif is a methylated sequence rich in cytosine (C) and guanine (G).
  • the CpG motif is recognized by Toll like receptor 9 (TLR9) present on the cell surface of immunized animals, and activates the immune reaction due to gene expression of cytoforce-in via the intracellular signal transduction system. Can enhance the specific immune response through antigen presentation and activation of helper T cells.
  • TLR9 Toll like receptor 9
  • a higher immune response can be obtained by the action of enhancing the immune stimulation system of the CpG motif.
  • the CpG motif may be contained in any position in the expression vector, or may be in one place or multiple places.
  • the administration method of the fusion gene in the animal immunization method of the present invention includes, without limitation, subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection and the like. Also, particle guns can be applied.
  • the dose of the fusion gene in the animal immunization method of the present invention may be appropriately determined according to the type of expression vector or promoter used, etc., but generally 1 to 3 mgZkg body weight per time, which is the case for mice. Is 25 ⁇ : L00 gZ times.
  • the number of administrations may be one, but a higher V, humoral immune response can be induced by performing multiple administrations at regular intervals.
  • Antigen proteins suitable for the animal immunization method of the present invention include, for example, G protein-coupled receptor, ion channel receptor, tyrosine kinase receptor, CD antigen, cell adhesion molecule, cancer antigen, Examples include site force-in, growth factor, growth factor, nutrient factor, viral antigen, bacterial antigen or toxin antigen.
  • the animal immunization method of the present invention can be carried out as long as the genes for these proteins are available, and the proteins themselves do not have to be purified.
  • the animal used in the animal immunization method of the present invention is preferably a mammal or a bird that is easy to handle.
  • mammals are mouse, rat, usagi, ushi, horse, inu, ne Examples include ko, goat, hidge, and pig.
  • birds include: -birds, birds or turkeys.
  • a monoclonal antibody is finally obtained, it is preferable to use a mouse, a rat, a rabbit, or a chicken in order to facilitate cell fusion.
  • Monoclonal antibodies can be obtained if B cell tumor cells can be obtained from any animal species.
  • the composition for immunization of the present invention comprises a fusion gene in which a gene encoding all or part of an antigen protein and a gene encoding a chapemouth nin subunit or a chape mouth nin subunit linked body are linked. Is the main component.
  • a typical form of the immunizing composition of the present invention is one in which the fusion gene is dissolved in an isotonic solution. Examples of isotonic solutions include saline and phosphate buffered saline (PBS). In addition, various buffers can be used as the solvent. It is also effective to add a metal ion such as Mg 2+ to the isotonic solution in order to increase the antibody production ability. Furthermore, by adding an immunosuppressant that specifically suppresses cellular immunity, it is possible to induce more humoral immunity and increase antibody production. Sarasuko used T 2 helper T cell sorting to induce humoral immunity.
  • GM-CSF TNFo ;
  • IL-4 which is a site force-in that induces
  • IL-10 or IL-10 encoding gene which is one of the cyto force in, is added to isotonic fluid to suppress cellular immunity, thereby inducing humoral immunity and increasing antibody production It is also possible.
  • IL 1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 which are cytoforces that induce activation, division, and differentiation into antibody-producing cells, which are the main players in antibody production It is also possible to increase antibody production by adding IL-10 or a gene encoding them to an isotonic solution.
  • concentration of the fusion gene in the immunizing composition of the present invention is, for example, about 10 to 500 / ⁇ ⁇ .
  • the immunizing composition of the present invention may contain an oligonucleotide having CpG motif power.
  • the oligonucleotide functions as an adjuvant and can induce a higher immune response.
  • the immunizing composition of the present invention can also be used as a vaccine for inducing humoral immunity. When used as a vaccine, it can be administered to humans.
  • an antibody is collected from an animal immunized by the above-described animal immunization method of the present invention. Specifically, for example, partial blood collection is periodically performed from an immunized animal, the antibody titer is measured, and the production state of the antibody is monitored.
  • the obtained antibody is a polyclonal antibody.
  • a method for isolating and purifying an antibody from serum a method generally used for antibody purification can be used, for example, using affinity chromatography using protein A! /, Can.
  • a hyperidoma is produced by cell fusion with myeloma.
  • known methods can be used as they are for cell fusion, selection of high-pridoma and cloning.
  • cell fusion can be performed by the method of Keiler and Milstein.
  • selection of hypridoma can be performed by culture using a HAT selective medium.
  • hypridoma cloning can be performed by limiting dilution.
  • a monoclonal antibody against the antigenic protein can be produced by culturing the hyperidoma thus cloned. Incubation of wild and hybridomas may be performed in vitro using a dish or the like that may be performed in the abdominal cavity of an animal such as a mouse. When a hybridoma is cultured in the abdominal cavity of an animal such as a mouse, ascites can be collected and a monoclonal antibody can be isolated and purified from the ascites. When cultured in vitro, it is also possible to isolate and purify a monoclonal antibody with its culture solution. As a method for purifying a monoclonal antibody, in the case of a monoclonal antibody whose subclass is IgG, for example, it can be performed by affinity chromatography using the above-mentioned protein A.
  • the method for producing a monoclonal antibody of the present invention also includes a method using a phage display method. That is, a single-chain antibody (scFV) gene that prepares mRNA from an animal immunized by the above-described animal immunization method of the present invention, prepares cDNA using the mRNA as a cage, and codes only the antibody variable region. Is made. The gene is then cloned into a phagemid vector and transferred to E. coli, and then the phage is infected, and the scFV antibody is transferred to the phage. Can be expressed on the surface coating.
  • scFV single-chain antibody
  • scFV By screening scFV expressed in this way against an antigen protein, it is possible to produce a monoclonal scFV antibody specific for the antigen protein.
  • Known methods can be used as they are for mRNA preparation, cDNA preparation, phagemid subcloning and transfer to Escherichia coli, phage infection, and screening for monoclonal scFV antibodies specific for antigen proteins.
  • the scFV gene is subcloned into a phagemid vector containing two elements, a gene fragment encoding a leader sequence (signal sequence) and a phage coat protein ⁇ , and an M13 replication origin.
  • M13 phage By using M13 phage, it is possible to express scFV antibody on M13 phage.
  • scFV antibody By infecting a specific bacterium with the phage obtained by screening and culturing, it is possible to collect a large amount of monoclonal antibody specific for the antigen protein as well as the culture fluid power.
  • a monoclonal antibody of the present invention it is also possible to produce a Fab antibody fragment or the like excluding the antibody constant region other than the scFV antibody alone.
  • hETAR human endothelin A receptor
  • PCR was performed using a human lung cDNA library (Takara Bio Inc.) as a base, oligonucleotides having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 as primer pairs, and endothelin A having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • a DNA fragment containing the receptor (hET AR) gene was amplified. In this amplified DNA fragment, the Nhel site was introduced at the 5 'end and the Sail site was introduced at the 3' end, derived from the primer.
  • PCR was performed using the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 and 4 as a primer pair, and a DNA fragment containing the hETAR gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 was amplified.
  • the amplified DNA fragment was introduced with a sequence encoding a Nhel site at the 5, terminal, 3 stop codons (TAATAG) at the end, and a Sail site, derived from the primer.
  • TATAG 3 stop codons
  • PCR was performed using the oligonucleotide to be a primer pair, and a DNA fragment containing the hETAR gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 was amplified.
  • This amplified DNA fragment is derived from the primer, and contains a Sail site at the 5 ′ end, a sequence encoding a FLAG tag (FL AG Tag, SEQ ID NO: 7) at the 3 ′ end, and two stop codons.
  • a sequence encoding (TAATAG) and a Hindlll site were introduced.
  • Escherichia coli HMS174 (DE3) strain (Novajin) also extracted and purified genomic DNA.
  • PCR was performed using the purified genomic DNA as a saddle, oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 8 and 9 as primer pairs, and a GroEL subunit gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 was obtained.
  • the containing DNA fragment was amplified.
  • the amplified DNA fragment was introduced with a Sail site at the 5 ′ end and a sequence encoding two stop codons (TAATAG) at the 3 ′ end and a Notl site derived from the primer.
  • TATAG sequence encoding two stop codons
  • Mammalian L animal expression vector pCI Mammalian Expression Vector (Promega) was digested with restriction enzymes Nhel and Sail, the end was dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase (BAP), and then amplified in (1) above. 5 A DNA fragment containing the hETAR gene with a Nhel site at the 'end and a Sail site at the 3' end was inserted. Furthermore, after digesting this expression vector with Sail and Notl and dephosphorylating the ends with BAP, the DNA fragment containing the GroEL subunit gene amplified in (2) above was inserted, The vector pCI—hETAR'GroEL was constructed.
  • the vector pCI-hETAR′GroEL has a fusion gene of a gene encoding hETAR and a gene encoding GroEL subunit.
  • the mammalian expression vector pCI Mammalian Expression Vector was digested with the restriction enzymes Nhel and Sail in the same manner, and the end was dephosphorylated with BAP, and then amplified at (1) above with the Nhel at the 5 ′ end.
  • the vector—pCI—hETAR was constructed by inserting a DNA fragment containing the hETAR gene with a stop codon and Sail site at the 3 ′ end. That is, the vector pCI-hETAR has only the hETAR gene.
  • a human endothelin A receptor (antigen protein) for antibody detection was prepared by the following procedure.
  • the expression vector pMAL-hETAR constructed in (4) above was introduced into E. coli BL21 (Novagen) to obtain a transformant.
  • the transformant was cultured in 2 XY. T. medium (16 gZL bactotryptone, lOgZL yeast extract, 5 gZL NaCl) at 25 ° C. and lOrpm for 18 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (30,000 g, 30 minutes, 4 ° C). The collected cells were washed with PBS, suspended in PBS, and disrupted by sonication.
  • the cell lysate was centrifuged (100,000 g, 1 hour, 4 ° C.) to recover an insoluble precipitate. Each insoluble precipitate was dissolved in 4% Triton X-100 and then subjected to SDS-PAGE. Furthermore, Western blotting was performed using an anti-FLAG antibody (ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody, Sigma) as the primary antibody. For blotting, a PVDF membrane (Immo bilon-P, Millipore) was used, and as a secondary antibody, a biotin labeled universal secondary antibody kit (Universal Quick Kit, Vector Laboratories) was used. For detection, Co-Kimnostin HRP-100 (Seikagaku Corporation) was used.
  • the vector pCI-hETAR'GroEL was dissolved in physiological saline to a concentration of 250 ⁇ gZmL to prepare a composition for immunization.
  • This immunizing composition was applied to 8-week-old mouse BALBZc (female ) Was injected and 0.12 mL each was injected into both thigh muscles (day 0).
  • 30 g each of pCI—hETAR'GroEL was administered to both legs, that is, 60 g per animal.
  • immunization was repeated repeatedly on the 7th, 21st, and 28th days.
  • blood was collected on days 0, 7, 14, 21, 28, 35, and 42 to prepare serum.
  • mice were immunized with the vector pCI—hETAR, which expresses hETAR alone.
  • the vector pCI-hETAR'GroEL was dissolved in physiological saline to a concentration of 250 ⁇ gZmL to prepare a composition for immunization.
  • This immunization composition was immunized by injecting 0.12 mL each into both thigh muscles of 8-week-old mouse BALBZc (female) (day 0).
  • 30 g each of pCI—hETAR'GroEL was administered to both legs, that is, 60 g per animal. Thereafter, immunization was repeated repeatedly on the 7th, 21st, 28th, and 35th days. Blood was collected on days 0, 7, 14, 21, 28, 35, and 42 to prepare serum.
  • oligonucleotide having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 11 and 12 was annealed to prepare double-stranded DNA.
  • This double-stranded DNA is transformed into pTrc99A (Amersham Bioscience PTrc99AII was constructed at Ncol-Hindlll site.
  • pTrc99AII genes encoding a Spel site, an Xbal site, and a FLAG tag derived from double-stranded DNA were introduced.
  • PCR was performed using the genomic DNA of Escherichia coli K12 strain as a cage and oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 13 and 14 as primer pairs, and a DNA fragment containing the GroE L subunit gene (SEQ ID NO: 10) was obtained. Amplified. Due to the primers used, a Spel site was introduced at the 5 'end and an Xbal site was introduced at the 3' end of this amplified DNA fragment. This amplified DNA fragment was introduced into the Spel-Xbal site of pTrc99AII to construct pTrcGroEL.
  • SEQ ID NOs: 15 and 16 were annealed to prepare double-stranded DNA. This double-stranded DNA was introduced into the Drain—BamHI site of pTrcGroEL to construct pTrcS R1. This introduced a mutation into the GroEL subunit gene on pTrcGroEL.
  • SEQ ID NO: 24 shows the nucleotide sequence of the GroEL subunit gene (SR1 gene) into which the mutation was introduced.
  • pTrcSRl expresses a modified GroEL subunit (SR1) in which the 452nd amino acid residue of the GroEL subunit is replaced with glutamic acid and the 461, 463, and 464th amino acid residues are replaced with alanine. Can do.
  • SR1 modified GroEL subunit
  • pTrcSRl was treated with Spel and Xbal, and a DNA fragment containing the SR1 gene was isolated. This DNA fragment was introduced into pTrcSR1 previously treated with Xbal and BAP to construct pTrcSR2.
  • pTrcSR2 contains a gene (SR2 gene) in which two SR1 genes are linked in one direction.
  • a DNA fragment containing the SR1 gene was introduced into pTrcSR2 treated with Xbal and BAP, and pTrcSR3 was constructed.
  • pTrcSR3 contains a gene (SR3 gene) in which three SR1 genes are linked in one direction. The same operation was repeated to construct pTrcSR7.
  • pTrcSR7 contains a gene (SR7 gene) in which seven SR1 genes are linked in one direction. In other words, pTrcSR7 can express a modified GroEL subunit 7-fold conjugate (SR7).
  • PCR was carried out using pCI—hETAR constructed in (1) of Example 1 as a saddle type and oligonucleotide pairs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 and 18 as primer pairs, and the hETAR gene (SEQ ID NO: 3 ) was amplified.
  • the Nhel site was introduced at the 5, end and the Xhol site was introduced at the 3, end from the primer. This increase
  • the wide DNA fragment was introduced into pTrcSR7 previously treated with Nhel, XhoI, and BAP to construct pTrcSR7-hETAR.
  • pTrcSR7 hETAR can express a fusion protein of SR7 and hETAR (hereinafter referred to as “SR7—hETAR fusion protein”).
  • SR7 hETAR fusion protein
  • Sarako SR7—hETAR fusion protein has a FLAG tag at the C-terminus.
  • pTrcSR7 hETAR was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) strain to obtain a transformant.
  • the transformant was rotationally cultured in 2 XY. T. medium containing carbecillin (100 / z g / mL) at 23 ° C. and 1 lOrpm for 24 hours. After completion of the culture, the cultured cells were collected by centrifugation. The collected bacterial cells were crushed by ultrasonic treatment. This cell disruption solution was centrifuged, and the supernatant was collected. The supernatant was subjected to an immunoprecipitation reaction using anti-FLAG antibody-fixed beads (Sigma).
  • the SR7-hETAR fusion protein was purified by affinity chromatography using Gel (Sigma-Aldrich) and hydrophobic chromatography using Butyl Sepharose FF (Amersham Bioscience).
  • mice Eight-week-old mice (BALBZc, female) were immunized subcutaneously with 50 ⁇ g of purified SR7-hETAR fusion protein (day 0). Thereafter, immunization was repeated on days 7, 21, 28 and 35 as in the case of gene immunization in this Example (1). Serum was prepared from 0, 7, 14, 21, 28, 35, and 42nd eyes.
  • the Escherichia coli cell disruption solution containing MAL-hETAR (84 kDa) obtained in Example 1 (5) was applied to an Amylose Resin (New England Biolabs) column, and MAL-hETAR was bound to rosin. After washing the fat, MAL-hETAR was eluted with maltose and collected. The recovered MAL-hETAR was adsorbed on a 96-well plate. This 96 hole plate An ELISA was performed to measure the anti-hETAR titer of each serum obtained by gene immunization (1) and each serum obtained by protein immunization (2). Peroxidase-labeled anti-mouse IgG was used as the secondary antibody, and TMB was used as the chromogenic substrate.
  • each value is the ELISA titer expressed as the dilution factor of serum.
  • a higher titer indicates more antibody is produced, indicating that humoral immunity is strongly induced. That is, in the short period from the start of immunization to the 21st day, protein-immunized mice showed higher titers than gene-immunized mice. However, after that, the titer of the mice immunized rapidly increased, and on day 42, the titer was 10 times higher than that of the protein immunized mice. Based on the above, it was possible to induce humoral immunity stronger than protein immunity by gene immunity.
  • the anti-hETAR antibody in serum obtained in (1) of Example 2 was used to evaluate the binding property to the active hETAR on the cell surface.
  • human placenta cDNA live PCR was carried out using a rally (Takara Bio Inc.) as a saddle type, and an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 21 and 22 as a primer pair, and contained the human endothelin B receptor (hETBR) gene (SEQ ID NO: 23) A DNA fragment was obtained. This DNA fragment was introduced into the Nhel-Xhol site of pCIneo to construct pCIneo-hETBR.
  • hETBR human endothelin B receptor
  • each COS7 cell was cultured overnight in a 96-well microtiter plate at an initial cell concentration of 2 ⁇ 10 4 cells ⁇ .
  • 10- 6 ⁇ : L0- 12 ⁇ - 1 ( Peptide Institute) in the concentration range of ⁇ the result was stimulated each cell, the Ca concentration in cells transiently increased.
  • the Ca concentration was measured using a Ca signal analyzer (FLIPR; MD) and an intracellular Ca staining kit (Ca3kit; MD). This indicates that both active hETAR and active hETBR are normally expressed on the force COS7 cell membrane.
  • COS 7 cells into which pCIneo-hETAR has been introduced (hereinafter referred to as “hETAR gene-introduced cells”), COS7 cells into which pCIneo—hETBR has been introduced (hereinafter referred to as “hETBR gene-introduced cells”), and COS7 cells into which pCIneol had been introduced (control cells) were washed with PBS. Sera on day 35 after immunization prepared in Example 2 were diluted 500-fold and incubated with each cell.
  • Fig. 1 shows the analysis results of interaction between hETAR gene-introduced cells and anti-hETAR antibody in serum.
  • Fig. 1 (a) is a two-dimensional dot when serum before gene immunization (day 0) is used.
  • Fig. 1 (b) is a two-dimensional dot display diagram when using serum on day 35 after gene immunization.
  • Fig. 2 shows the analysis results of the interaction between hETBR gene-introduced cells and anti-hETAR antibody in the serum.
  • Fig. 2 (a) is a two-dimensional dot display diagram when using serum before gene immunization (day 0).
  • FIGS. 1 to 3 the vertical axis represents the fluorescence intensity derived from phycoerythrin (PE), and the horizontal axis represents the fluorescence intensity derived from fluorescein isothiocyanate (FITC).
  • PE phycoerythrin
  • FITC fluorescence intensity derived from fluorescein isothiocyanate

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Abstract

　遺伝子免疫によって抗原タンパク質に対する抗体を作製する際に、より高効率で体液性免疫の応答を誘導することができる方法を提供することを課題とする。 　抗原タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子とシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子を動物に投与することにより、該動物体内で該融合遺伝子を発現させ、抗原タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導する。シャペロニンの例としては、大腸菌ＧｒｏＥＬが挙げられる。免疫用組成物、抗体の製造方法、ハイブリドーマの製造方法、及びモノクローナル抗体の製造方法も提供される。

Description

明 細 書
動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、ハイプリドーマの製 造方法、及びモノクローナル抗体の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、ハイプリドーマの 製造方法、及びモノクローナル抗体の製造方法に関し、さらに詳細には、抗原タンパ ク質をコードする遺伝子とシャぺ口ニンをコードする遺伝子との融合遺伝子を投与し て体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法、該免疫方法に使用するための免 疫用組成物、該免疫方法を用いる抗体の製造方法、該免疫方法により免疫された動 物の免疫細胞を使用するハイプリドーマの製造方法、及び該ハイプリドーマを用いる モノクローナル抗体の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 抗体は体液性免疫の主役であり、感作リンパ球とともに生体防御機構の重要な役 割を担っている。一方で、抗体は、その抗原との特異的親和性を利用した各種の技 術、例えば、ァフィユティークロマトグラフィーや免疫測定法等にも頻繁に利用されて おり、バイオテクノロジー分野において必要不可欠のツールとなっている。従来より、 抗体は、抗原タンパク質を免疫原として動物に投与し、体液性免疫の応答を誘導さ せることにより作製されている。この際、免疫原として用いる抗原タンパク質は、例え ば、生体試料等から単離'精製されたものを使用する。最近では、組換え DNA技術 を用いて宿主細胞に抗原タンパク質をコードする遺伝子を導入し、該宿主細胞の培 養物から組み換え型の抗原タンパク質を単離 ·精製することもよく行われている。また 、組換え DNA技術によって抗原タンパク質を調製することが困難な場合等には、抗 原タンパク質の一部に対応するペプチドをィ匕学的に合成し、それを免疫原として動 物に投与することも行われて 、る。
[0003] 一方、抗原タンパク質を接種するのではなぐその抗原タンパク質をコードする遺伝 子を動物体内で発現させて免疫応答を誘導する、遺伝子免疫と呼ばれる技術がある 。遺伝子免疫を行う場合は、例えば、抗原タンパク質をコードする遺伝子を適宜の発 現ベクターに組み込み、該発現ベクターを動物に接種する。すると、発現ベクターに 組み込まれた遺伝子が動物体内で発現し、抗原タンパク質が合成される。その結果 、動物体内で合成された抗原タンパク質により免疫応答が誘導される。遺伝子免疫 によれば、抗原タンパク質をコードする遺伝子さえ単離されておれば免疫を行うこと ができ、抗原タンパク質を単離'精製する必要がない。したがって、精製法が確立さ れていない抗原タンパク質、精製が困難な抗原タンパク質、遺伝子のみ知られている 未知の抗原タンパク質であっても、その抗原タンパク質に対する免疫応答を誘導する ことが可能である。その結果、そのような抗原タンパク質に対する抗体を取得すること が可能になる。また、遺伝子免疫の場合は、動物体内で遺伝子が発現して合成され る抗原タンパク質の量が、抗原タンパク質を直接投与する場合に必要な量と比較し て格段に少なくても免疫応答を誘導できるという利点もある。さらに、組換え DNA技 術によって抗原タンパク質を調製することが困難な場合等であっても、従来の方法の ようにペプチド抗原を別途ィ匕学合成する必要がなぐ遺伝子の全長を動物に導入す るだけでょ 、と 、う利点もある。
[0004] 上記のように、遺伝子免疫は従来の方法にはない利点を有するが、抗原タンパク質 の種類によっては体液性免疫の応答が誘導されず、抗体が産生されない場合がある 。例えば、以下のような場合は、従来の免疫方法と同じく体液性免疫の応答が誘導さ れないことがある。すなわち、抗原タンパク質力 免疫した動物が内在的に有するタ ンパク質と極めて相同性が高 、ものである場合は、動物体内でその抗原タンパク質 が合成されても異物として認識されな 、ため、体液性免疫の応答が誘導されな ヽこと がある。また、抗原タンパク質がその動物体内で不安定なものである場合、動物体内 における抗原タンパク質の量が少なくなり、体液性免疫の応答が誘導されないことが ある。また、抗原タンパク質が主として細胞性免疫を誘導するものである場合は、体 液性免疫が誘導されに《なる。また、遺伝子免疫特有の問題点として、抗原タンパ ク質の遺伝子が動物への導入効率が悪 、ものである場合や、抗原タンパク質の遺伝 子が動物体内での発現量が低いものである場合にも、抗原タンパク質の量が少なく なり、体液性免疫の応答が誘導されないことがある。
[0005] 上記した遺伝子免疫の問題点を解決するために、各種の工夫が提案されて!ヽる。 例えば、ゥロキナーゼに対する免疫応答を誘導する際に、ゥロキナーゼ遺伝子を単 独で投与するのではなぐ膜貫通ドメインの遺伝子との融合遺伝子の形で投与するこ とにより、ゥロキナーゼに対する高い免疫応答を誘導し、ゥロキナーゼに対する抗体 を取得した例がある（特許文献 1)。ここで得られた高い免疫応答は、融合遺伝子の 発現産物である融合タンパク質において、ゥロキナーゼ部分が強制的に細胞表面に 配置されるために起こったと考えられる。
[0006] また、ワクチンの分野において、ヒートショックプロテインである HSP70をコードする 遺伝子と抗原タンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子 (キメラ核酸)を DNAヮ クチンとして使用した例がある（特許文献 2)。この例では、結核菌由来 HSP70をコー ドする遺伝子を使用している。しカゝしながら、この技術では、抗原特異的細胞性免疫 (キラー T細胞)を誘導することはできたが、体液性免疫すなわち抗体産生は誘導さ れていない。一方で、結核菌由来 HSP70と抗原タンパク質との融合タンパク質を免 疫原として用いると、 HSP70が好適なアジュバントとして機能し、抗原タンパク質に 対する抗体産生が誘導されたという報告がある（特許文献 3)。これらのことは、 HSP7 0と抗原タンパク質との融合タンパク質による免疫応答と、 HSP70遺伝子と抗原タン パク質遺伝子との融合遺伝子による免疫応答とでは、抗原提示細胞での免疫応答 機構が異なることを意味している。このように、ある抗原タンパク質に対する体液性免 疫の免疫応答を誘導した 、場合に、その抗原タンパク質の遺伝子を用いて免疫して も、所望の免疫応答が誘導されるとは限らない。むしろ、抗原タンパク質に対する所 望の免疫応答を誘導できな 、可能性の方が高 、と考えられる。
[0007] 特許文献 1：国際公開第 02Z08416号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 01Z29233号パンフレット
特許文献 3：国際公開第 94Z29459号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 以上のように、遺伝子免疫にはまだ未知の部分が多ぐなお試行錯誤の域を出な い。遺伝子免疫により抗体を作製するためには、抗原タンパク質の種類を問わずに 再現性よく確実に体液性免疫の応答を誘導することができる技術が求められる。本 発明の目的は、遺伝子免疫によって抗原タンパク質に対する抗体を作製する際に、 より高効率で体液性免疫の応答を誘導することができる各種の技術を提供することに ある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、その遺伝子を動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導できない 抗原タンパク質であっても、抗原タンパク質をコードする遺伝子とシャぺ口-ンをコ一 ドする遺伝子との融合遺伝子を動物に接種することにより、抗原タンパク質に対する 体液性免疫の応答を誘導することができることを見出し、本発明を完成した。本発明 の要旨は以下の通りである。
[0010] 本発明の第 1の様相は、抗原タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子とシャ ぺロニンサブユニット又はシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子とが連 結された融合遺伝子を動物に投与することにより、該動物体内で該融合遺伝子を発 現させ、抗原タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法であ る。
[0011] 本様相の動物の免疫方法は、遺伝子免疫に属するものであり、抗原タンパク質の 全部又は一部をコードする遺伝子とシャぺ口ニンサブユニット又はシャぺ口ニンサブ ユニット連結体をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子を動物に投与する。そ して、該動物体内で該融合遺伝子を発現させ、抗原タンパク質の全部又は一部とシ ャぺロニンサブユニット又はシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子との 融合タンパク質が合成される。その結果、抗原タンパク質に対する体液性免疫の応 答が誘導される。本様相の動物の免疫方法によれば、抗原タンパク質をコードする遺 伝子を単独で投与しても体液性免疫の応答を誘導できない抗原タンパク質であって も、シャぺ口ニンの作用によって体液性免疫の応答を誘導することができる。その結 果、そのような抗原タンパク質に対する抗体を動物に産生させることができる。
[0012] シャぺ口-ンは分子シャペロンの 1種であり、分子量約 6万のサブユニット（シャぺロ ニンサブユニット）力もなる複合タンパク質である。そして、シャぺ口ニンはその内部に 他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。また、「シャぺロニンサブュ-ッ ト連結体」は、 2個以上のシャぺ口ニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連 結された人工のタンパク質と定義される。換言すれば、シャぺ口ニンサブユニット連結 体は、 2個以上のシャぺ口ニンサブユニットがタンデムに連結された人工タンパク質で ある。なお、本明細書においては、シャぺ口ニンサブユニットをコードする遺伝子、及 びシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子を総称して「シャぺロニンをコ ードする遺伝子」と呼ぶことがある。
[0013] 好ましくは、前記シャぺ口ニンサブユニット又はシャぺ口ニンサブユニット連結体は、 大腸菌由来のものである。
[0014] 大腸菌由来のシャぺ口ニンは GroELと呼ばれ、その生化学的及び物理化学的性 質がよく調べられており、遺伝子も入手しやすい。そして、この好ましい様相の動物の 免疫方法にぉ 、ては、シャぺ口ニンサブユニット又はシャぺ口ニンサブユニット連結 体が大腸菌由来のものである。力かる構成により、動物に投与するための融合遺伝 子を容易に作製することができる。
[0015] 好ましくは、前記融合遺伝子は、発現ベクターに組み込まれており、かつ該発現べ クタ一上のプロモーターによって発現が調節されている。
[0016] この好ましい様相の動物の免疫方法においては、融合遺伝子が発現ベクターに組 み込まれており、その発現がプロモーターにより調節されている。力かる構成により、 より確実に融合遺伝子を動物内で発現させることができる。その結果、より確実に体 液性免疫の応答を誘導することができる。
[0017] 好ましくは、前記プロモーターは、 CMVプロモーター、 AMLプロモーター、 SV40 プロモーター、 SR aプロモーター又は EF— 1 αプロモーターである。
[0018] この好まし!/、様相の動物の免疫方法にお!、ては、発現ベクター上のプロモーター 力 SCMVプロモーター等の誘導が強力なものであり、かつその性質もよく知られてい るものである。カゝかる構成により、融合遺伝子を高効率で発現することができる。その 結果、より確実に体液性免疫の応答を誘導することができる。
[0019] 好ましくは、前記発現ベクターは、 CpGモチーフを含むものである。
[0020] CpGモチーフは微生物の DNAに含まれている塩基配列であり、ほ乳類の免疫刺 激系を高めることが知られている。そして、この好ましい様相の動物の免疫方法にお いては、発現ベクターが CpGモチーフを含むものである。力かる構成により、動物に 対してより高い免疫の応答を誘導することができる。その結果、高効率に抗原タンパ ク質に対する抗体を産生させることができる。
[0021] 好ましくは、前記動物は、哺乳類又は鳥類である。
[0022] この好まし 、様相の動物の免疫方法にお!、ては、免疫する動物がその取り扱 、が 簡単な哺乳類又は鳥類である。力かる構成により、より簡単に免疫を行うことができる
[0023] 好ましくは、前記哺乳類は、マウス、ラット、ゥサギ、ゥシ、ゥマ、ィヌ、ネコ、ャギ、ヒッ ジ又はブタである。好ましくは、前記鳥類は、 -ヮトリ、ァヒル又は七面鳥である。
[0024] 好ましくは、前記抗原タンパク質は、 Gタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型 受容体、チロシンカイネース型受容体、 CD抗原、細胞接着分子、癌抗原、サイトカイ ン、成長因子、増殖因子、栄養因子、ウィルス抗原、細菌抗原又は毒素抗原である。
[0025] この好ま 、様相の動物の免疫方法にぉ 、ては、抗原タンパク質力 タンパク質共 役型受容体等の医薬品開発に有用なタンパク質である。力かる構成により、これらの 有用なタンパク質に対する抗体を取得でき、アツセィ系の構築等に適用することがで きる。
[0026] 本発明の第 2の様相は、本発明の動物の免疫方法に使用するための免疫用組成 物であって、抗原タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子とシャぺ口ニンサブ ユニット又はシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子とが連結された融合 遺伝子を主成分とする免疫用組成物である。
[0027] 上記した本発明の動物の免疫方法を実施する場合は、例えば、融合遺伝子を適宜 の溶媒に溶かした組成物を調製し、該組成物を動物に投与することができる。そして 、本様相の免疫用組成物は、本発明の動物の免疫方法に使用するためのものであり
、抗原タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子とシャぺ口ニンサブユニット又 はシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子を 主成分とする。本様相の免疫用組成物によれば、注射等の方法により融合遺伝子を 動物に投与することができる。また、組成物中の融合遺伝子の濃度を調整することに より、融合遺伝子の投与量を正確に調節することができる。
[0028] 本発明の第 3の様相は、本発明の動物の免疫方法により動物を免疫して抗原タン パク質に対する体液性免疫の応答を誘導し、該動物に抗原タンパク質に対する抗体 を産生させ、該動物から該抗体を採取する抗体の製造方法である。
[0029] 上記した本発明の動物の免疫方法は体液性免疫の応答を誘導するものであり、そ の結果、動物に抗体を産生させることができる。そして、本様相の抗体の製造方法は 、本発明の動物の免疫方法によって体液性免疫の応答を誘導し、動物に抗原タンパ ク質に対する抗体を産生させ、該動物力 抗体を採取するものである。本様相の抗 体の製造方法によれば、精製法が確立されていない抗原タンパク質、精製が困難な 抗原タンパク質、遺伝子のみ知られている未知の抗原タンパク質、組換え DNA技術 では遺伝子の発現量が少な!、抗原タンパク質等で、かつその遺伝子を単独で投与 しても抗体が産生されない抗原タンパク質であっても、動物に抗体を産生させること ができる。動物の血清から抗体を採取する場合は、ポリクローナル抗体として採取さ れる。
[0030] 本発明の第 4の様相は、本発明の動物の免疫方法により動物を免疫して抗原タン パク質に対する体液性免疫の応答を誘導した後に、該動物から免疫細胞を採取し、 該免疫細胞とミエローマとを細胞融合することにより抗原タンパク質に対する抗体を 産生するハイプリドーマを作製するハイプリドーマの製造方法である。
[0031] 本様相のハイプリドーマの製造方法においては、上記した本発明の動物の免疫方 法により体液性免疫の応答を誘導された動物の免疫細胞とミエローマを細胞融合す ることにより、抗原タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ を作製する。カゝかる構成により、抗原タンパク質自身あるいはその遺伝子を単独で投 与しても抗体が産生されな 、抗原タンパク質であっても、それに対するモノクローナ ル抗体を産生するハイプリドーマを得ることができる。
[0032] 本発明の第 5の様相は、本発明のハイプリドーマの製造方法で製造されたハイプリ ドーマを培養し、培養物カゝら抗原タンパク質に対するモノクローナル抗体を採取する モノクローナル抗体の製造方法である。
[0033] 本様相のモノクローナル抗体の製造方法は、上記した本発明のハイプリドーマの製 造方法によって製造されたハイプリドーマを培養し、該培養物からモノクローナル抗 体を採取する。カゝかる構成により、抗原タンパク質自身あるいはその遺伝子を単独で 投与しても抗体が産生されな 、抗原タンパク質であっても、それに対するモノクロ一 ナル抗体を産生するノ、イブリドーマを得ることができる。
[0034] 本発明の第 6の様相は、本発明の動物の免疫方法により動物を免疫して抗原タン パク質に対する体液性免疫の応答を誘導した後に、該動物から抗体に対する mRN Aを調製し、該 mRNAを铸型として cDNAを調製し、該 cDNAを用いたファージディ スプレイ法により抗原タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製する製造方法で ある。
[0035] 本様相のモノクローナル抗体の製造方法はファージディスプレイ法を用いるもので あり、上記した本発明の動物の免疫方法により体液性免疫の応答を誘導された動物 力 mRNAを調製し、該 mRNAから cDNAを調製し、該 cDNAを用いたファージデ イスプレイ法により抗原タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製する。かかる構 成により、抗原タンパク質を投与したり、その遺伝子を単独で投与したりしても抗体が 産生されな 、抗原タンパク質であっても、それに対するモノクローナル抗体を製造す ることがでさる。
発明の効果
[0036] 本発明の動物の免疫方法及び免疫用組成物によれば、遺伝子免疫を行う際に、そ の遺伝子を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができな ヽ抗 原タンパク質であっても、体液性免疫の応答を誘導することができる。
[0037] 本発明の抗体の製造方法によれば、遺伝子免疫を行う際に、その遺伝子を単独で 動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができない抗原タンパク質であ つても、抗原タンパク質に対する抗体を製造することができる。
[0038] 本発明のハイプリドーマの製造方法によれば、遺伝子免疫を行う際に、その遺伝子 を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができな ヽ抗原タンパ ク質であっても、抗原タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイプリドー マを製造することができる。
[0039] 本発明のモノクローナル抗体の製造方法によれば、遺伝子免疫を行う際に、その 遺伝子を単独で動物に接種しても体液性免疫の応答を誘導することができな ヽ抗原 タンパク質であっても、抗原タンパク質に対するモノクローナル抗体を製造することが できる。
図面の簡単な説明
[0040] [図 1]実施例 3における hETAR遺伝子導入細胞と血清中の抗 hETAR抗体と相互作 用の解析結果を表し、図 1 (a)は遺伝子免疫前 (0日目）の血清を用いた場合の二次 元ドット表示図、図 1 (b)は遺伝子免疫後 35日目の血清を用いた場合の二次元ドット 表示図である。
[図 2]実施例 3における hETBR遺伝子導入細胞と血清中の抗 hETAR抗体と相互作 用の解析結果を表し、図 2 (a)は遺伝子免疫前 (0日目）の血清を用いた場合の二次 元ドット表示図、図 2 (b)は遺伝子免疫後 35日目の血清を用いた場合の二次元ドット 表示図である。
[図 3]実施例 3における対照の細胞と血清中の抗 hETAR抗体と相互作用の解析結 果を表し、図 3 (a)は遺伝子免疫前 (0日目）の血清を用いた場合の二次元ドット表示 図、図 3 (b)は遺伝子免疫後 35日目の血清を用いた場合の二次元ドット表示図であ る。
発明を実施するための最良の形態
[0041] 以下、本発明を実施するための最良の形態について、詳しく説明する。
[0042] 本発明の動物の免疫方法は、遺伝子免疫に属するものであり、抗原タンパク質の 全部又は一部をコードする遺伝子とシャぺ口ニンサブユニット又はシャぺ口ニンサブ ユニット連結体をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子を動物に投与するもの である。本発明の動物の免疫方法においては、抗原タンパク質の全部をコードする 遺伝子と、抗原タンパク質の一部をコードする遺伝子の両方が使用可能であり、目的 に応じて使 、分けることができる。抗原タンパク質の全部をコードする遺伝子を用いる 場合は、例えば、抗原タンパク質がもつ複数のェピトープそれぞれに対する抗体や、 抗原タンパク質の立体構造を認識する抗体を産生させる際に好適である。一方、抗 原タンパク質の一部をコードする遺伝子を用いる場合は、例えば、特定のェピトープ に対する抗体を産生させる際に好適である。
[0043] シャぺ口ニンは分子シャペロンの一種であり、バクテリア、古細菌、真核生物等の全 ての生物に存在している。特に、ノクテリアの細胞質、真核細胞のミトコンドリア、葉緑 体に多量に存在している。シャぺ口ニンは、タンパク質の折り畳みを促進する活性や タンパク質の変性を阻止する活性を有する。シャぺ口ニンは、分子量約 6万のシャぺ 口ニンサブユニット（Hsp60ともいう） 7〜9個からなるリング状構造体が 2個重なった、 総分子量 80万〜 100万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャぺ 口ニンはそのリング状構造体の内部に空洞を有しており、その空洞内に折り畳み途中 のタンパク質や変性したタンパク質を一時的に収納して複合体 (以下、「シャぺロニン —タンパク質複合体」という。）を形成する。そして、空洞内で収納したタンパク質を正 しく折り畳み、続いて空洞力も正しく折り畳まれたタンパク質を放出することが知られ ている。
[0044] シャぺ口ニンはグループ 1型とグループ 2型とに大別される。バクテリアや真核生物 のオルガネラに存在するシャぺ口ニンはグループ 1型に分類され、コシャぺロニンと 称される分子量約 lOkDaのタンパク質の環状複合体を補因子とする。一方、グルー プ 2型シャぺ口ニンは、真核生物の細胞質や古細菌に見られ、それらの構造や機能 に関しては不明な点が多く残されており、グループ 1型のコシャぺロニンに相当する タンパク質も現在のところ見つかっていない。 (Gupta, Mol. Microbiol.、 15、 1— 、 1995年)。本発明の動物の免疫方法においては、いずれの型のシャぺ口ニンの遺 伝子でも使用可能である。例えば、グループ 1型のシャぺ口ニンとしては大腸菌の Gr oEL、グループ 2型のシャぺ口ニンとしては古細菌由来の TCPが挙げられる。すなわ ち、 GroELサブユニット若しくは GroELサブユニット連結体をコードする遺伝子、 TC Pサブユニット若しくは TCPサブユニット連結体をコードする遺伝子を使用することが できる。
[0045] 本発明の動物の免疫方法における一つの様相では、抗原タンパク質の全部又は 一部をコードする遺伝子とシャぺ口ニンサブユニットとの融合遺伝子を動物に投与す る。すると、抗原タンパク質をコードする遺伝子単独では免疫応答が誘導されない場 合でも、十分に抗原タンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導することができる。 なお、融合遺伝子が動物内で発現した際の発現産物がどのような形態をとっている かは不明であるが、可能性としては、免疫動物の細胞内でシャぺ口ニンが抗原タンパ ク質を安定ィ匕しているような状態が考えられる。また近年、シャぺ口ニンが抗原提示 細胞の抗原受容体である Toll— like receptor 2及び Toll— like receptor 4と 結合するという報告がある（Gobert, A. P. et al. , 2004, J. Biol. Che m. 279, 245)。このことから、シャぺ口ニンと標的抗原との融合遺伝子産物にお V、て、シャぺ口ニンが好適なアジュバントとして機能する可能性もある。
[0046] 本発明の動物の免疫方法における他の様相では、抗原タンパク質の全部又は一 部をコードする遺伝子とシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子との融 合遺伝子を動物に投与する。ここで、「シャぺロニンサブユニット連結体」は、 2個以上 のシャぺ口ニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結された人工のタンパ ク質と定義される。換言すれば、シャぺ口ニンサブユニット連結体は、シャぺ口-ンサ ブユニット連結体は 2個以上のシャぺ口ニンサブユニットがタンデムに連結された人 ェタンパク質である。そして、シャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子は 、 2個以上のシャぺ口ニンサブユニット遺伝子が直列に連結された人工の遺伝子であ る。換言すれば、 2個以上のシャぺ口ニンサブユニット遺伝子がタンデムに連結され た人工遺伝子である。そして本様相は、この人工遺伝子と抗原タンパク質をコードす る遺伝子との融合遺伝子を動物に投与するものである。なお、シャぺ口ニンサブュ- ット連結体は、互いに集合して、天然のシャぺ口ニンと同様の複合体構造をとることが できる。したがって、本様相においても、融合遺伝子の発現産物が、可能性として、 天然のシャぺ口ニン—タンパク質複合体と同じように複合体を形成し、免疫動物の細 胞内でシャぺ口ニンが抗原タンパク質を安定ィ匕して 、ることが考えられる。以上のよう に、本発明の動物の免疫方法においては、抗原タンパク質がシャぺ口ニンの内部に 格納され、正しく折り畳まれた正常型タンパク質として存在して ヽると考えられる。
[0047] 大腸菌由来のシャぺ口ニンは GroELと呼ばれるものである。 GroELは、サブュ-ッ ト (GroELサブユニット） 7個からなるリング状構造体が 2個重なった構造を有しており 、計 14個の GroELサブユニットから形成されている。 GroELサブユニットの遺伝子 は公知で入手容易であり、本発明の動物の免疫方法をより簡便に行うのに好適であ る。配列番号 10に公知の GroELサブユニット遺伝子の塩基配列を示す。例えば、こ の塩基配列を元にプライマーを設計し、大腸菌のゲノム DNAを铸型として PCRを行 えば、 GroELサブユニット遺伝子を得ることができる。 [0048] シャぺ口ニンには、 1個のリング状構造体のみを有するシングルリングのシャぺ口- ンも知られている。本発明の動物の免疫方法においては、シングルリングのシャぺ口 ニンをコードする遺伝子も使用可能である。シングルリングのシャぺ口ニンの例として
、 GroELサブユニットの一部のアミノ酸残基が置換された改変型 GroELサブユニット が挙げられる。改変型 GroELサブユニット遺伝子の例を配列番号 24に示す。この改 変型 GroELサブユニット遺伝子は、 GroELサブユニットの 452番目のアミノ酸残基 がグルタミン酸に、 461、 463、及び 464番目のアミノ酸残基がァラニンに置換された 改変型 GroELサブユニット（SR1)をコードする。
[0049] なお、本発明の動物の免疫方法における「シャぺロニンサブユニットをコードする遺 伝子」には、天然のシャぺ口ニンサブユニットの全長をコードする遺伝子の他に、天 然のシャぺロニンサブユニットに由来する同様の活性を有するタンパク質をコードす る遺伝子も含むものとする。そのような遺伝子の例としては、天然のシャぺ口ニンサブ ユニットをアミノ酸置換等により改変した変異型のシャぺ口ニンサブユニットをコードす る遺伝子が挙げられる。他の例としては、天然型又は前記変異型のシャぺ口ニンサブ ユニットの一部のドメイン力もなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。さらに 他の例としては、天然型又は前記変異型のシャぺ口ニンサブユニットの一部のドメイ ンを欠失させたタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。例えば、シャぺ口ニン サブユニットの中の抗原決定部位となりうる免疫原性の高 、ドメインを欠失させた遺 伝子を用いることにより、抗原タンパク質に対する免疫応答を優先的に誘導する等の 操作が可能である。
[0050] 本発明の動物の免疫方法においては、融合遺伝子が発現ベクターに組み込まれ、 発現ベクター上のプロモーターの制御下にある実施形態が好まし 、。発現ベクターと しては、動物細胞内で複製可能な発現ベクターであればよぐ pCI、 pSI、 pAdVant age, pTriEX、 pKAl、 pCDM8、 pSVK3、 pMSG、 pSVL、 pBK— CMV、 pBK— RSV、 EBV等の発現ベクターを挙げることができる。また、発現ベクター上のプロモ 一ターは、動物細胞内で機能するものであればよぐ例えば、サイトメガロウィルス (C ytomegaro virus, CMV)の CMVプロモーター、アデノウイルス後期（Adenovirus Major Lateゝ AML)の AMLプロモーター、シミアンウィルス 40 (Simian Virus 40、 SV40)の SV40プロモーター、 SV40および HTLV— 1 LTRの融合プロモー ターである SR aプロモーター、伸長因子（Elongation Factor, EF)の EF— 1 αプ 口モーター等が挙げられる。さらに、発現ベクターにはプロモーター活性を増強する ェンハンサーを含むものでもよ 、。
[0051] さらに、発現ベクターには CpGモチーフが含まれていてもよい。 CpGモチーフはメ チル化されて 、な 、シトシン（C)とグァニン（G)に富む配列である。 CpGモチーフは 、免疫動物の細胞表面に存在する Toll like receptor 9 (TLR9)によって認識さ れ、細胞内情報伝達系を介してサイト力インの遺伝子発現による免疫反応を活性ィ匕 すると同時に、抗原情報の発現を促進し抗原提示とヘルパー T細胞の活性化による 特異的免疫応答を高めることができる。 CpGモチーフを含む発現ベクターによれば、 CpGモチーフの免疫刺激系を高める作用により、より高い免疫応答を得ることができ る。なお、 CpGモチーフは発現ベクターのどの位置に含まれていてもよぐ 1箇所でも よいし複数箇所でもよい。
[0052] 本発明の動物の免疫方法における融合遺伝子の投与方法としては特に制限はな ぐ皮下注射、筋肉注射、静脈注射等が挙げられる。またパーティクルガンによる投 与も適用可能である。また、本発明の動物の免疫方法における融合遺伝子の投与量 は、用いる発現ベクターやプロモーターの種類等に応じて適宜決定すればよいが、 1 回当たりおおむね l〜3mgZkg体重で、これはマウスの場合は 25〜： L00 gZ回に なる。また投与の回数は、 1回でもよいが、一定間隔をおいて複数回行う方がより高 V、体液性免疫の応答を誘導することができる。
[0053] 本発明の動物の免疫方法に好適な抗原タンパク質としては、例えば、 Gタンパク質 共役型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンカイネース型受容体、 CD抗原、 細胞接着分子、癌抗原、サイト力イン、成長因子、増殖因子、栄養因子、ウィルス抗 原、細菌抗原又は毒素抗原が挙げられる。なお、本発明の動物の免疫方法ではこれ らのタンパク質の遺伝子さえ入手できれば実施することができ、タンパク質自身が精 製されている必要はない。
[0054] 本発明の動物の免疫方法に用いる動物としては、取り扱いが容易である哺乳類又 は鳥類が好ましい。哺乳類の例としては、マウス、ラット、ゥサギ、ゥシ、ゥマ、ィヌ、ネ コ、ャギ、ヒッジ、ブタ等を挙げることができる。また、鳥類の例としては、 -ヮトリ、ァヒ ル又は七面鳥を挙げることができる。特に、最終的にモノクローナル抗体を取得する 場合、細胞融合の容易さからマウス、ラット、ゥサギ又は-ヮトリを用いることが好まし い。また、いかなる動物種であろうと B細胞の腫瘍細胞が取得できればモノクローナ ル抗体を取得することは可能である。
[0055] 本発明の免疫用組成物は、抗原タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子と シャぺ口ニンサブユニット又はシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子と が連結された融合遺伝子を主成分とするものである。本発明の免疫用組成物の代表 的な形状としては、等張液に該融合遺伝子を溶解させたものである。等張液の例とし ては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS)が挙げられる。その他、溶媒に は各種の緩衝液を用いることもできる。また、抗体産生能を上昇させるために、 Mg2+ 等の金属イオンを等張液に添加することも効果的である。さらに、細胞性免疫を特異 的に抑制する免疫抑制剤を加えることで、より体液性免疫を誘導し、抗体産生を高め ることも可能である。さら〖こは、体液性免疫を誘導する T 2ヘルパー T細胞の分ィ匕を
H
誘導するようなサイト力インである GM— CSF、 TNF o;、 IL— 4を等張液に添カ卩したり 、またそれらのサイト力インをコードする遺伝子を添加したりすることも、抗体産生能を 上昇させるためには効果的である。同様に、サイト力インの 1つである IL— 10又は IL —10をコードする遺伝子を等張液に添加し、細胞性免疫を抑制することで、体液性 免疫を誘導し、抗体産生を高めることも可能である。さらには、抗体産生の主役であ る B細胞の活性化、分裂、抗体産生細胞への分化を誘導するサイト力インである IL 1、 IL— 2、 IL— 4、 IL— 5、 IL— 6、 IL— 10又はそれらをコードする遺伝子を等張液 に添加することで、抗体産生を高めることも可能である。本発明の免疫用組成物にお ける融合遺伝子の濃度は、例えば、 10〜500/^ΖπΛ程度である。
[0056] さらに、本発明の免疫用組成物には、 CpGモチーフ力もなるオリゴヌクレオチドを含 むものでもよい。この場合、該オリゴヌクレオチドはアジュバントとして機能し、より高い 免疫応答を誘導することができる。また、本発明における免疫用組成物は、体液性免 疫を誘導するためのワクチンとしても用いることができる。ワクチンとして用いる場合は 、ヒトに投与することが可能である。 [0057] 本発明の抗体の製造方法においては、上記した本発明の動物の免疫方法によつ て免疫した動物から抗体を採取する。具体的には、例えば、免疫後の動物から定期 的に部分採血を行って抗体価を測定し、抗体の産生状態をモニターする。そして、 抗体価が最大に達した時点で全採血を行い、血清を調製する。そして、得られた血 清力 抗体を得る。この際、得られる抗体はポリクローナル抗体である。また、血清か ら抗体を単離 ·精製する方法としては、一般に抗体の精製に用いられている方法を 使用することができ、例えば、プロテイン Aを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを 用!/、ることができる。
[0058] 本発明のハイプリドーマの製造方法においては、上記した本発明の動物の免疫方 法によって免疫した動物力 免疫細胞を採取し、これをミエローマと細胞融合するこ とによりハイプリドーマを作製する。細胞融合、ハイプリドーマの選抜及びクローニン グについては、公知の方法をそのまま使用することができる。例えば、細胞融合はケ 一ラーとミルシュタインの方法により行うことができる。また、ハイプリドーマの選抜は、 HAT選択培地を用いた培養により行うことができる。さらに、ハイプリドーマのクロー ユングは限界希釈法により行うことができる。そして、このようにしてクローユングされ たハイプリドーマを培養することにより、抗原タンパク質に対するモノクローナル抗体 を製造することができる。ノ、イブリドーマの培養は、マウス等の動物の腹腔内で行って もよぐディッシュ等を用いてインビトロで行ってもよい。マウス等の動物の腹腔内でノヽ イブリドーマを培養した場合は、腹水を採取し、その腹水カゝらモノクローナル抗体を 単離 '精製することができる。インビトロで培養した場合は、その培養液力もモノクロ一 ナル抗体を単離'精製することができる。モノクローナル抗体を精製する方法としては 、サブクラスが IgGのモノクローナル抗体の場合は、例えば、上記したプロテイン Aを 用いたァフィユティークロマトグラフィーによって行うことができる。
[0059] また、本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、ファージディスプレイ法を用いる 方法も含む。すなわち、上記した本発明の動物の免疫方法によって免疫した動物か ら mRNAを調製し、該 mRNAを铸型として cDNAを調製し、抗体可変領域のみをコ ードする 1本鎖抗体 (scFV)遺伝子を作製する。そして、該遺伝子をファージミドベタ ターにクロー-ングして大腸菌に移入した後、ファージを感染させ、 scFV抗体をファ ージ被膜上に発現させることができる。このようにして発現させた scFVを抗原タンパ ク質に対してスクリーニングすることで、抗原タンパク質に特異的なモノクローナル sc FV抗体を作製することが可能である。なお、 mRNAの調製、 cDNAの調製、ファー ジミドへのサブクローユングや大腸菌への移入、ファージの感染、抗原タンパク質に 特異的なモノクローナル scFV抗体のスクリーニングは、公知の方法をそのまま使用 することができる。例えば、リーダー配列（シグナル配列）とファージ被膜タンパク ΠΙと をコードする遺伝子断片、及び M13複製開始点、の 2つの要素を含むファージミドベ クタ一に、 scFV遺伝子をサブクローユングし、ファージとしては、 M13ファージを用 いることで、 M13ファージ上に scFV抗体を発現させることが可能である。また、スクリ 一-ングによって得られたファージを特定の細菌に感染させ、培養することで、培養 液力も抗原タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を大量に回収することも可能で ある。なお、本発明のモノクローナル抗体の製造方法によれば、 scFV抗体だけでは なぐ抗体の定常領域を除いた Fab抗体断片などを作製することも可能である。
[0060] 以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
実施例 1
[0061] (1)ヒトエンドセリン A受容体遺伝子の単離
モデル抗原タンパク質としてヒト由来エンドセリン A受容体 (hETAR)を用い、以下 の手順で遺伝子免疫を行った。まず、ヒト肺 cDNAライブラリー (タカラバイオ社)を铸 型とし、配列番号 1及び 2に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対 として PCRを行 ヽ、配列番号 3に示す塩基配列を有するエンドセリン A受容体 (hET AR)遺伝子を含む DNA断片を増幅した。なお、この増幅された DNA断片には、プ ライマーに由来して、 5'末端に Nhelサイト、 3'末端に Sailサイトが導入された。また 、同様にして配列番号 1及び 4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ 一対として PCRを行ヽ、配列番号 3に示す塩基配列を有する hETAR遺伝子を含む DNA断片を増幅した。なお、この増幅された DNA断片には、プライマーに由来して 、 5，末端に Nhelサイト、 3，末端に 2個の停止コドン (TAATAG)をコードする配列及 び Sailサイトが導入された。また、同様にして配列番号 5及び 6に示す塩基配列を有 するオリゴヌクレオチドをプライマー対として PCRを行 ヽ、配列番号 3に示す塩基配 列を有する hETAR遺伝子を含む DNA断片を増幅した。なお、この増幅された DN A断片には、プライマーに由来して、 5'末端に Sailサイト、 3'末端に FLAGタグ (FL AG Tag,配列番号 7)をコードする配列、 2個の停止コドン (TAATAG)をコードす る配列及び Hindlllサイトが導入された。
[0062] (2) GroELサブユニット遺伝子の単離
大腸菌 HMS174 (DE3)株 (ノバジヱン社)力もゲノム DNAを抽出 '精製した。次に 、精製したゲノム DNAを铸型とし、配列番号 8及び 9に示す塩基配列を有するオリゴ ヌクレオチドをプライマー対として PCRを行 、、配列番号 10に示す塩基配列を有す る GroELサブユニット遺伝子を含む DNA断片を増幅した。なお、この増幅された D NA断片には、プライマーに由来して、 5'末端に Sailサイト、 3'末端に 2個の停止コ ドン (TAATAG)をコードする配列及び Notlサイトが導入された。
[0063] (3)ヒトエンドセリン A受容体と GroELサブユニットとの融合タンパク質を発現する遺 伝子免疫用ベクターの構築
哺孚 L動物発現ベクター pCI Mammalian Expression Vector (Promega社)を 制限酵素 Nhelと Sailで消化し、バクテリア由来アルカリフォスファターゼ (BAP)にて 末端を脱リン酸化処理した後、上記（1)で増幅した 5'末端に Nhelサイトを、 3'末端 に Sailサイトを付加した hETAR遺伝子を含む DNA断片を挿入した。さら〖こ、この発 現ベクターを Sailおよび Notlで消化し、 BAPにて末端を脱リン酸ィ匕処理した後、上 記（2)で増幅した GroELサブユニット遺伝子を含む DNA断片を挿入し、ベクター p CI— hETAR'GroELを構築した。すなわち、ベクター pCI— hETAR 'GroELは、 h ETARをコードする遺伝子と GroELサブユニットをコードする遺伝子との融合遺伝子 を有している。一方、同様にして、哺乳動物発現ベクター pCI Mammalian Expre ssion Vectorを制限酵素 Nhelと Sailで消化し、 BAPにて末端を脱リン酸化処理し た後、上記（1)で増幅した 5'末端に Nhelサイトを、 3'末端に停止コドンおよび Sail サイトを付カ卩した hETAR遺伝子を含む DNA断片を挿入し、ベクタ— pCI— hETAR を構築した。すなわち、ベクター pCI— hETARは hETAR遺伝子のみを有している。
[0064] (4)ヒトエンドセリン A受容体を発現するベクターの構築 大腸菌用の発現ベクター pMAL (New England Biolabs社）を制限酵素 Sailと Hindmで消化し、 BAPにて末端を脱リン酸ィ匕処理した後、上記（1)で増幅した 5'末 端に Sailサイトを、 3 '末端に FLAGタグをコードする配列、停止コドンおよび Hindlll サイトを付加した hETAR遺伝子を含む DNA断片を挿入し、発現ベクター pMAL - hETARを構築した。発現ベクター pMAL— hETARによれば、マルトースバインディ ングプロテイン（MBP)と hETARの融合タンパク質（以下、「MBP— hETAR融合タ ンパク質」と称する。 )を大腸菌で発現させることができる。
[0065] (5)ヒトエンドセリン A受容体の調製
抗体検出用のヒトエンドセリン A受容体 (抗原タンパク質)を以下の手順で調製した 。上記 (4)で構築した発現ベクター pMAL— hETARを大腸菌 BL21 (Novagen社） に導入し、形質転換体を得た。該形質転換体を 2 XY. T.培地（16gZL バクトトリ プトン、 lOgZL 酵母エキス、 5gZL NaCl)中で 25°C、 l lOrpmで 18時間培養し た。培養終了後、菌体を遠心分離 (30, 000g、 30分、 4°C)にて回収した。回収した 菌体を PBSで洗浄した後、 PBSに懸濁し、超音波処理にて菌体を破砕した。菌体破 砕液を遠心分離（100, 000g、 1時間、 4°C)して不溶性沈殿を回収した。この不溶性 沈殿をそれぞれ 4% Triton X— 100に溶解した後、 SDS— PAGEに供した。さら に、抗 FLAG抗体（ANTI— FLAG M2 Monoclonal Antibody、シグマ社）を 1 次抗体としたウェスタンブロッテイングを行った。ブロッテイングには PVDF膜 (Immo bilon— P、ミリポア社)を用い、 2次抗体として、ピオチン標識ユニバーサル 2次抗体 キット（Universal Quick Kit、ベクターラボラトリーズ社）を用いた。検出には、コ- カイムノスティン HRP— 100 (生化学工業社)を用いた。対照として、 hETARをコー ドする遺伝子を挿入して ヽな 、プラスミド pMALにつ ヽても同様の操作を行った。そ の結果、対照には現れない MBP— hETAR融合タンパク質（84kDa)の分子量に相 当する位置にバンドが出現した。これにより、 hETARの全長が取得できていることが 確認された。
[0066] (6)遺伝子免疫
生理食塩水にベクター pCI— hETAR'GroELを 250 μ gZmLの濃度になるよう溶 解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、 8週齢のマウス BALBZc (雌 )の両足大腿筋に各 0. 12mLずつ注射を行い、免疫した (0日目）。これにより、 pCI — hETAR'GroELを両足に各 30 gずつ、すなわち、 1匹につき 1回あたり 60 g 投与した。その後、 7日目、 21日目、及び 28日目にも同様して繰り返し免疫した。そ して、 0、 7、 14、 21、 28、 35、 42日目に採血を行い、血清を調製した。対照として、 hETARを単独で発現するベクター pCI— hETARを用いてマウスを免疫した。
[0067] (7)ウェスタンブロッテイングによる抗体の検出
上記（5)で得られた MBP— hETAR融合タンパク質を含有する菌体破砕液に対し て、上記（6)で調製した血清を 1次抗体として用いてウェスタンブロッテイングを行つ た。ブロッテイングには PVDF膜 (Immobilon— P、ミリポア社）を用い、 2次抗体とし て、ピオチン標識ユニバーサル 2次抗体キットを用い、検出には、コ-カイムノスティ ン HRP— 100を用いた。その結果、 pCI— hETAR'GroELで免疫して 28日目以降 に採血された血清においてのみ、 MBP— hETAR融合タンパク質に相当するバンド が検出された。以上より、 hETAR遺伝子と GroELサブユニット遺伝子との融合遺伝 子によって、 hETARに対する抗体産生を誘導することができた。
実施例 2
[0068] 本実施例では、遺伝子免疫とタンパク免疫との比較を行なった。
[0069] (1)シャぺ口ニンサブユニット連結体遺伝子とヒト由来エンドセリン A受容体遺伝子と の融合遺伝子による遺伝子免疫
生理食塩水にベクター pCI— hETAR'GroELを 250 μ gZmLの濃度になるよう溶 解し、免疫用組成物を調製した。この免疫用組成物を、 8週齢のマウス BALBZc (雌 )の両足大腿筋に各 0. 12mLずつ注射を行い、免疫した (0日目）。これにより、 pCI — hETAR'GroELを両足に各 30 gずつ、すなわち、 1匹につき 1回あたり 60 g 投与した。その後、 7日目、 21日目、 28日目、及び 35日目にも同様して繰り返し免 疫した。そして、 0、 7、 14、 21、 28、 35、 42日目に採血を行い、血清を調製した。
[0070] (2)シャぺ口ニンサブユニット連結体とヒト由来エンドセリン A受容体との融合タンパク 質によるタンパク免疫（比較例）
配列番号 11及び 12に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ 、 2本鎖 DNAを調製した。この 2本鎖 DNAを pTrc99A (アマシャムバイオサイエンス 社）の Ncol— Hindlllサイトに導入し、 pTrc99AIIを構築した。 pTrc99AIIには、 2 本鎖 DNAに由来する Spelサイト、 Xbalサイト、及び FLAGタグをコードする遺伝子 が導入された。一方、大腸菌 K12株のゲノム DNAを铸型とし、配列番号 13及び 14 に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対として PCRを行 ヽ、 GroE Lサブユニット遺伝子 (配列番号 10)を含む DNA断片を増幅した。用いたプライマー に由来して、この増幅 DNA断片の 5'末端には Spelサイトが、 3'末端には Xbalサイ トが導入された。この増幅 DNA断片を pTrc99AIIの Spel— Xbalサイトに導入し、 p TrcGroELを構築した。
[0071] 配列番号 15及び 16に示すオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、 2本鎖 DNAを調 製した。この 2本鎖 DNAを、 pTrcGroELの Drain— BamHIサイトに導入し、 pTrcS R1を構築した。これにより、 pTrcGroEL上の GroELサブユニット遺伝子に変異が導 入された。変異が導入された GroELサブユニット遺伝子 (SR1遺伝子)の塩基配列 を配列番号 24に示す。すなわち、 pTrcSRlは、 GroELサブユニットの 452番目のァ ミノ酸残基がグルタミン酸に、 461、 463、及び 464番目のアミノ酸残基がァラニンに 置換された改変型 GroELサブユニット（SR1)を発現することができる。
[0072] pTrcSRlを Spelと Xbalで処理し、 SR1遺伝子を含む DNA断片を単離した。この DNA断片を、あらかじめ Xbalと BAPで処理された pTrcSRlに導入し、 pTrcSR2を 構築した。 pTrcSR2は、 2個の SR1遺伝子が一方向に連結された遺伝子（SR2遺伝 子）を含む。同様にして、 SR1遺伝子を含む DNA断片を、あらカゝじめ Xbalと BAPで 処理された pTrcSR2に導入し、 pTrcSR3を構築した。 pTrcSR3は、 3個の SR1遺 伝子が一方向に連結された遺伝子（SR3遺伝子）を含む。同様の操作を繰り返し、 p TrcSR7を構築した。 pTrcSR7は 7個の SR1遺伝子が一方向に連結された遺伝子（ SR7遺伝子）を含む。換言すれば、 pTrcSR7は改変型 GroELサブユニット 7回連結 体 (SR7)を発現することができる。
[0073] 実施例 1の（3)で構築した pCI— hETARを铸型とし、配列番号 17及び 18に示す 塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対として PCRを行 、、 hETAR遺伝 子 (配列番号 3)を含む DNA断片を増幅した。なお、この増幅 DNA断片には、プライ マーに由来して、 5，末端に Nhelサイト、 3，末端に Xholサイトが導入された。この増 幅 DNA断片を、あらかじめ Nhel、 XhoI、及び BAPで処理された pTrcSR7に導入 し、 pTrcSR7— hETARを構築した。 pTrcSR7— hETARは SR7と hETARとの融 合タンパク質 (以下、「SR7— hETAR融合タンパク質」と称する。）を発現することが できる。さら〖こ、 SR7— hETAR融合タンパク質の C末端には FLAGタグが付加され ている。
[0074] pTrcSR7— hETARを大腸菌 BL21 (DE3)株に導入し、形質転換体を得た。該 形質転換体を、カルべ-シリン（100 /z g/mL)を含む 2 XY. T.培地中で 23°C、 1 lOrpmで 24時間回転培養した。培養終了後、培養菌体を遠心分離にて回収した。 回収した菌体を超音波処理にて破砕した。この菌体破砕液を遠心分離し、上清を回 収した。この上清を抗 FLAG抗体固定ィ匕ビーズ (シグマ社)を用いて免疫沈降反応 に供した。得られた沈降画分を SDS— PAGEZCBBに供した。その結果、 SR7-h ETAR融合タンパク質の分子量に相当する 470kDa付近の位置にバンドが検出され た。さらに、抗 FLAG抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行ったところ、このバン ドが反応した。以上より、 SR7— hETAR融合タンパク質が大腸菌の可溶性画分に発 現されていた。
[0075] 得られた上清を、 ANTI— FLAG Monoclonal Antibody Agarose Affinity
Gel (シグマ一アルドリッチ社）によるァフィ-ティクロマトグラフィー、及びブチルセフ ァロース FF (Butyl Sepharose FF、アマシャムバイオサイエンス社）による疎水ク 口マトグラフィ一に供し、 SR7 - hETAR融合タンパク質を精製した。
[0076] 8週齢のマウス（BALBZc、雌）に、 50 μ gの精製された SR7— hETAR融合タン パク質を皮下注射し、マウスを免疫した (0日目）。その後、本実施例（1)の遺伝子免 疫の場合と同様に、 7、 21、 28及び 35日目にも繰り返し免疫した。そして、 0、 7、 14 , 21、 28、 35、 42曰目【こ採血を行!/、、血清を調製した。
[0077] (3) ELISAによる評価結果
実施例 1の（5)で得られた MAL— hETAR(84kDa)を含む大腸菌の菌体破砕液 を Amylose Resin (New England Biolabs社）カラムに供し、 MAL— hETARを 榭脂に結合させた。榭脂を洗浄後、マルトースによって MAL— hETARを溶出し、回 収した。回収した MAL— hETARを 96穴プレートに吸着させた。この 96穴プレート を用いて ELISAを行な 、、 (1)の遺伝子免疫で得られた各血清、及び（2)のタンパ ク免疫で得られた各血清の抗 hETAR力価を測定した。なお、 2次抗体としてはペル ォキシダーゼ標識抗マウス IgGを用い、発色基質としては TMBを用いた。 ELISAの 結果を第 1表に示す。第 1表において、各数値は血清の希釈倍率で表した ELISA 力価である。力価が高いほど抗体が多く産生されていることを示し、これは体液性免 疫が強く誘導されていることを示す。すなわち、免疫開始から 21日目までの短期間 では遺伝子免疫したマウスよりもタンパク免疫したマウスの方が高 、力価を示した。し かし、その後は遺伝子免疫したマウスの力価が急激に上昇し、 42日目にはタンパク 免疫したマウスの力価よりも 10倍高い力価を示した。以上より、遺伝子免疫によって タンパク免疫よりも強く体液性免疫を誘導することができた。
[表 1]
第 1表
Figure imgf000024_0001
実施例 3
[0078] 本実施例では、実施例 2の（1)で得られた血清中の抗 hETAR抗体にっ 、て、細 胞表面の活性型 hETARに対する結合性を評価した。
[0079] (1)ヒトエンドセリン A受容体発現細胞及びエンドセリン B受容体発現細胞の作製 実施例 1の（3)で構築した pCI— hETAR'GroELを铸型とし、配列番号 19及び 20 に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー対として PCRを行 ヽ、 hET AR遺伝子を含む DNA断片を得た。この DNA断片を pCIneo (Promega社）の Nhe I—Xholサイトに導入し、 pCIneo— hETARを構築した。一方、ヒト胎盤 cDNAライブ ラリー（タカラバイオ社)を铸型とし、配列番号 21及び 22に示す塩基配列を有するォ リゴヌクレオチドをプライマー対として PCRを行 、、ヒトエンドセリン B受容体（hETBR )遺伝子（配列番号 23)を含む DNA断片を得た。この DNA断片を pCIneoの Nhel - Xholサイトに導入し、 pCIneo - hETBRを構築した。
[0080] 37. 5 μ Lの Lipofectamin溶液と、 625 μ Lの ΟΡΤΙ— ΜΕΜΙ培地と、 20 μ gの ρ CIneo— hETARを含む 625 μ Lの ΟΡΤΙ— ΜΕΜΙ培地とを混和した。この混和液を 用いて、 pCIneo—hETARを 2 X 105個の COS7細胞（大日本製薬社）に導入した。 同様の手順で、 pCIneo— hETBRを COS7細胞に導入した。対照として、 pCIneol のみを COS7細胞に導入した。遺伝子が導入された各 COS7細胞を、 Ham' sF12 K+ 10%FBS培地（ICN社）にて 30時間培養した。さらに、 2 X 104個 ΖΐΟΟ μ の 初期細胞濃度にて、各 COS7細胞を 96穴マイクロタイタープレートを用いて一昼夜 培養した。培養終了後、 10— 6〜： L0— 12Μの濃度範囲内の ΕΤ— 1 (ペプチド研究所）に よって各細胞を刺激したところ、細胞内の Ca濃度が一過的に上昇した。 Ca濃度は、 Caシグナル解析装置（FLIPR； MD社)及び細胞内 Ca染色キット (Ca3kit； MD社） を用いて測定した。このこと力ら、活性型 hETARと活性型 hETBRのいずれも力 C OS7細胞膜上に正常に発現していることがわ力つた。
[0081] (2)フローサイトメトリーによる活性型 hETARに対する結合性評価
pCIneo—hETARが導入された COS 7細胞（以下、「hETAR遺伝子導入細胞」と 称する。）、 pCIneo— hETBRが導入された COS7細胞（以下、「hETBR遺伝子導 入細胞」と称する。）、及び、 pCIneolが導入された COS7細胞 (対照の細胞）を PBS で洗浄した。実施例 2で調製された免疫後 35日目の血清を 500倍希釈し、各細胞と 一緒にインキュベートした。さらに、 2次抗体としてフィコエリスリン標識抗マウス IgG抗 体（ベックマンコールター社）を添カ卩した後、フローサイトメーター EPICS XL (ベック マンコールター社)を用いて、各細胞と血清中の抗 hETAR抗体との相互作用を解 祈した。結果を図 1、図 2、及び図 3に示す。
[0082] 図 1は hETAR遺伝子導入細胞と血清中の抗 hETAR抗体と相互作用の解析結果 を表し、図 1 (a)は遺伝子免疫前 (0日目）の血清を用いた場合の二次元ドット表示図 、図 1 (b)は遺伝子免疫後 35日目の血清を用いた場合の二次元ドット表示図である 。図 2は hETBR遺伝子導入細胞と血清中の抗 hETAR抗体と相互作用の解析結果 を表し、図 2 (a)は遺伝子免疫前 (0日目）の血清を用いた場合の二次元ドット表示図 、図 2 (b)は遺伝子免疫後 35日目の血清を用いた場合の二次元ドット表示図である 。図 3は対照の細胞と血清中の抗 hETAR抗体と相互作用の解析結果を表し、図 3 ( a)は遺伝子免疫前 (0日目）の血清を用いた場合の二次元ドット表示図、図 3 (b)は 遺伝子免疫後 35日目の血清を用いた場合の二次元ドット表示図である。図 1〜3に おいて、縦軸はフィコエリスリン (PE)由来の蛍光強度、横軸はフルォレセインイソチ オシァネート（FITC)由来の蛍光強度を表す。 4つのエリア（B1〜B4)のうち、 B1 (左 上）に属するドットが血清中の抗 hETAR抗体と結合した細胞を表す。各エリアに記 載されて!、る値は各エリアに属するドットの割合（％)である。
その結果、 hETAR遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫前の血清では B 1のエリアにはドットがほとんど検出されな力つたが（図 1 (a) )、遺伝子免疫後の血清 では B1のエリアに多くのドットが検出された（図 l (b) )。これは、免疫後の血清中の抗 hETAR抗体が hETAR遺伝子導入細胞に結合することを示していた。一方、 hETB R遺伝子導入細胞を用いた場合は、遺伝子免疫後の血清でも B1のエリアにはほとん どドットが検出されな力つた（図 2)。これは、免疫後の血清中の抗 hETAR抗体が hE TBR遺伝子導入細胞に結合しないことを示していた。なお、対照の細胞を用いた場 合も、遺伝子免疫後の血清でも B1のエリアにはほとんどドットが検出されな力つた（ 図 3)。これは、免疫後の血清中の抗 hETAR抗体が対照の細胞に結合しないことを 示していた。以上のことから、遺伝子免疫によって、活性型 hETARの細胞外ドメイン を特異的に認識する抗体の産生を誘導することができた。

Claims

請求の範囲
[1] 抗原タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子とシャぺ口ニンサブユニット又 はシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子とが連結された融合遺伝子を 動物に投与することにより、該動物体内で該融合遺伝子を発現させ、抗原タンパク質 に対する体液性免疫の応答を誘導する動物の免疫方法。
[2] 前記シャぺ口ニンサブユニット又はシャぺ口ニンサブユニット連結体は、大腸菌由来 のものである請求項 1に記載の動物の免疫方法。
[3] 前記融合遺伝子は、発現ベクターに組み込まれており、かつ該発現ベクター上の プロモーターによって発現が調節されている請求項 1又は 2に記載の動物の免疫方 法。
[4] 前記プロモーターは、 CMVプロモーター、 AMLプロモーター、 SV40プロモータ 一、 SR aプロモーター又は EF— 1 αプロモーターである請求項 3に記載の動物の 免疫方法。
[5] 前記発現ベクターは、 CpGモチーフを含むものである請求項 3又は 4に記載の動 物の免疫方法。
[6] 前記動物は、哺乳類又は鳥類である請求項 1乃至 5のいずれかに記載の動物の免 疫方法。
[7] 前記哺乳類は、マウス、ラット、ゥサギ、ゥシ、ゥマ、ィヌ、ネコ、ャギ、ヒッジ又はブタ である請求項 6に記載の動物の免疫方法。
[8] 前記鳥類は、ニヮトリ、ァヒル又は七面鳥である請求項 6に記載の動物の免疫方法
[9] 前記抗原タンパク質は、 Gタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型受容体、チ 口シンカイネース型受容体、 CD抗原、細胞接着分子、癌抗原、サイト力イン、成長因 子、増殖因子、栄養因子、ウィルス抗原、細菌抗原又は毒素抗原である請求項 1乃 至 8の 、ずれかに記載の動物の免疫方法。
[10] 請求項 1乃至 9のいずれかに記載の動物の免疫方法に使用するための免疫用組 成物であって、抗原タンパク質の全部又は一部をコードする遺伝子とシャぺ口-ンサ ブユニット又はシャぺ口ニンサブユニット連結体をコードする遺伝子とが連結された融 合遺伝子を主成分とする免疫用組成物。
[11] 請求項 1乃至 9のいずれかに記載の動物の免疫方法により動物を免疫して抗原タ ンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導し、該動物に抗原タンパク質に対する抗 体を産生させ、該動物から該抗体を採取する抗体の製造方法。
[12] 請求項 1乃至 9のいずれかに記載の動物の免疫方法により動物を免疫して抗原タ ンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導した後に、該動物から免疫細胞を採取し 、該免疫細胞とミエローマとを細胞融合することにより抗原タンパク質に対する抗体を 産生するハイプリドーマを作製するハイプリドーマの製造方法。
[13] 請求項 12に記載の方法で製造されたハイブリドーマを培養し、培養物力も抗原タ ンパク質に対するモノクローナル抗体を採取するモノクローナル抗体の製造方法。
[14] 請求項 1乃至 9のいずれかに記載の動物の免疫方法により動物を免疫して抗原タ ンパク質に対する体液性免疫の応答を誘導した後に、該動物から抗体に対する mR NAを調製し、該 mRNAを铸型として cDNAを調製し、該 cDNAを用いたファージデ イスプレイ法により抗原タンパク質に対するモノクローナル抗体を作製するモノクロ一 ナル抗体の製造方法。
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