KR20070073908A - 동물의 면역 방법, 면역용 조성물, 항체의 제조 방법,하이브리도마의 제조 방법 및 모노클로날 항체의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
유전자 면역에 의해 항원 단백질에 대한 항체를 제조할 때에, 보다 고효율로 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 동물에게 투여함으로써, 상기 동물체내에서 상기 융합 유전자를 발현시켜 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도한다. 샤페로닌의 예로서는, 대장균 GroEL을 들 수 있다. 면역용 조성물, 항체의 제조 방법, 하이브리도마의 제조 방법 및 모노클로날 항체의 제조 방법도 제공된다.
유전자 면역, 체액성 면역, 샤페로닌, 모노클로날 항체
Description
본 발명은 동물의 면역 방법, 면역용 조성물, 항체의 제조 방법, 하이브리도마의 제조 방법 및 모노클로날 항체의 제조 방법에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 항원 단백질을 코딩하는 유전자와 샤페로닌(chaperonin)을 코딩하는 유전자와의 융합 유전자를 투여하여 체액성 면역 반응을 유도하는 동물의 면역 방법, 상기 면역 방법에 사용하기 위한 면역용 조성물, 상기 면역 방법을 사용하는 항체의 제조 방법, 상기 면역 방법에 의해 면역된 동물의 면역 세포를 사용하는 하이브리도마의 제조 방법, 및 상기 하이브리도마를 사용하는 모노클로날 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
항체는 체액성 면역의 주역이고, 감작 림프구와 함께 생체 방어 기구의 중요한 역할을 담당하고 있다. 한편, 항체는 그 항원과의 특이적 친화성을 이용한 각종 기술, 예를 들면 친화성 크로마토그래피나 면역 측정법 등에도 빈번하게 이용되고 있고, 생물 공학 분야에 있어서 필요 불가결한 툴(tool)이 되었다. 종래부터 항체는 항원 단백질을 면역원으로서 동물에게 투여하여 체액성 면역 반응을 유도시킴으로써 제조되었다. 이 때, 면역원으로서 사용되는 항원 단백질은, 예를 들면 생체 시료 등으로부터 단리ㆍ정제된 것을 사용하였다. 최근에는 재조합 DNA 기술을 이용하여 숙주 세포에 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하고, 상기 숙주 세포의 배양물로부터 재조합형 항원 단백질을 단리ㆍ정제하는 것도 자주 행해졌다. 또한, 재조합 DNA 기술에 의해 항원 단백질을 제조하는 것이 곤란한 경우 등에는, 항원 단백질의 일부에 대응하는 펩티드를 화학적으로 합성하고, 그것을 면역원으로서 동물에게 투여하는 것도 행해졌다.
한편, 항원 단백질을 접종하는 것이 아니라, 그 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 동물체내에서 발현시켜 면역 반응을 유도하는, 유전자 면역이라 불리는 기술이 있었다. 유전자 면역을 행하는 경우에는, 예를 들면 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 적절한 발현 벡터에 조립하고, 상기 발현 벡터를 동물에게 접종하였다. 그렇게 하면, 발현 벡터에 조립된 유전자가 동물체내에서 발현하여 항원 단백질이 합성되었다. 그 결과, 동물체내에서 합성된 항원 단백질에 의해 면역 반응이 유도된다. 유전자 면역에 따르면, 항원 단백질을 코딩하는 유전자만 단리된다면 면역을 행할 수 있어, 항원 단백질을 단리ㆍ정제할 필요가 없었다. 따라서, 정제법이 확립되어 있지 않은 항원 단백질, 정제가 곤란한 항원 단백질, 유전자만 알려져 있는 미지의 항원 단백질이라도, 그 항원 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 것이 가능하다. 그 결과, 그와 같은 항원 단백질에 대한 항체를 취득하는 것이 가능해졌다. 또한, 유전자 면역의 경우에는, 동물체내에서 유전자가 발현하여 합성되는 항원 단백질의 양이, 항원 단백질을 직접 투여하는 경우에 필요한 양과 비교하여 각별히 적더라도 면역 반응을 유도할 수 있다고 하는 이점도 있었다. 또한, 재조합 DNA 기술에 의해 항원 단백질을 제조하는 것이 곤란한 경우 등이라도, 종래 방법과 같이 펩티드 항원을 별도로 화학 합성할 필요가 없고, 유전자의 전장을 동물에게 도입하는 것만으로 충분하다고 하는 이점도 있었다.
상기와 같이, 유전자 면역은 종래 방법에는 없는 이점을 갖지만, 항원 단백질의 종류에 따라서는 체액성 면역 반응이 유도되지 않고, 항체가 생산되지 않는 경우가 있었다. 예를 들면, 이하와 같은 경우에는, 종래의 면역 방법과 동일하게 체액성 면역 반응이 유도되지 않는 경우가 있었다. 즉, 항원 단백질이, 면역된 동물이 내재적으로 갖는 단백질과 매우 상동성이 높은 것인 경우에는, 동물체내에서 그 항원 단백질이 합성되더라도 이물질로서 인식되지 않기 때문에, 체액성 면역 반응이 유도되지 않는 경우가 있었다. 또한, 항원 단백질이 그 동물체내에서 불안정한 것인 경우, 동물체내에서의 항원 단백질의 양이 적어져 체액성 면역 반응이 유도되지 않는 경우가 있었다. 또한, 항원 단백질이 주로 세포성 면역을 유도하는 것인 경우에는, 체액성 면역이 유도되기 어려워졌다. 또한, 유전자 면역 특유의 문제점으로서, 항원 단백질 유전자의 동물에의 도입 효율이 나쁜 경우나, 항원 단백질 유전자의 동물체내에서의 발현량이 낮은 경우에도, 항원 단백질의 양이 적어져 체액성 면역 반응이 유도되지 않는 경우가 있었다.
상기한 유전자 면역의 문제점을 해결하기 위해서 각종 고안이 제안되었다. 예를 들면, 우로키나제에 대한 면역 반응을 유도할 때에, 우로키나제 유전자를 단 독으로 투여하는 것이 아니라, 막 관통 도메인의 유전자와의 융합 유전자의 형태로 투여함으로써, 우로키나제에 대한 높은 면역 반응을 유도하여 우로키나제에 대한 항체를 취득한 예가 있었다(특허 문헌 1). 여기서 얻어진 높은 면역 반응은, 융합 유전자의 발현 산물인 융합 단백질에 있어서 우로키나제 부분이 강제적으로 세포 표면에 배치되기 때문에 일어났다고 생각된다.
또한, 백신 분야에서 히트 쇼크(heat-shock) 프로테인인 HSP70을 코딩하는 유전자와 항원 단백질을 코딩하는 유전자와의 융합 유전자(키메라 핵산)를 DNA 백신으로서 사용한 예가 있었다(특허 문헌 2). 이 예에서는, 결핵균 유래 HSP70을 코딩하는 유전자를 사용하였다. 그러나, 이 기술에서는 항원 특이적 세포성 면역(킬러 T 세포)을 유도할 수는 있었지만, 체액성 면역, 즉 항체 생산은 유도되지 않았다. 한편, 결핵균 유래 HSP70과 항원 단백질과의 융합 단백질을 면역원으로서 사용하면, HSP70이 바람직한 어쥬번트(adjuvant)로서 기능하여 항원 단백질에 대한 항체 생산이 유도되었다고 하는 보고가 있었다(특허 문헌 3). 이것은, HSP70과 항원 단백질과의 융합 단백질에 의한 면역 반응과, HSP70 유전자와 항원 단백질 유전자와의 융합 유전자에 의한 면역 반응에서는, 항원 제시 세포에서의 면역 반응 기구가 다른 것을 의미하였다. 이와 같이, 어떤 항원 단백질에 대한 체액성 면역의 면역 반응을 유도하고자 하는 경우에, 그 항원 단백질의 유전자를 사용하여 면역시켜도, 원하는 면역 반응이 유도된다고는 할 수 없었다. 오히려, 항원 단백질에 대한 원하는 면역 반응을 유도할 수 없을 가능성이 높다고 생각되었다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제02/08416호 공보
특허 문헌 2: 국제 공개 제01/29233호 공보
특허 문헌 3: 국제 공개 제94/29459호 공보
<발명의 개시>
<발명이 해결하고자 하는 과제>
이상과 같이, 유전자 면역에는 아직 미지의 부분이 많고, 또한 시행 착오의 영역을 벗어나지 못한다. 유전자 면역에 의해 항체를 제조하기 위해서는, 항원 단백질의 종류를 막론하고 양호한 재현성으로 확실하게 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 기술이 요구된다. 본 발명의 목적은 유전자 면역에 의해 항원 단백질에 대한 항체를 제조할 때, 보다 고효율로 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 각종 기술을 제공하는 것에 있다.
<과제를 해결하기 위한 수단>
본 발명자들은 그 유전자를 동물에게 접종하여도 체액성 면역 반응을 유도할 수 없는 항원 단백질이라도, 항원 단백질을 코딩하는 유전자와 샤페로닌을 코딩하는 유전자와의 융합 유전자를 동물에게 접종함으로써, 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 요지는 이하와 같다.
본 발명의 제1 양상은 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 동물에게 투여함으로써, 상기 동물체내에서 상기 융합 유전자를 발현시켜 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 동물의 면역 방법이다.
본 양상의 동물 면역 방법은 유전자 면역에 속하는 것이고, 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 동물에게 투여한다. 또한, 상기 동물체내에서 상기 융합 유전자를 발현시켜, 항원 단백질의 전부 또는 일부와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자와의 융합 단백질이 합성된다. 그 결과, 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응이 유도된다. 본 양상의 동물 면역 방법에 따르면, 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 단독으로 투여하여도 체액성 면역 반응을 유도할 수 없는 항원 단백질이라도, 샤페로닌의 작용에 의해 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 그 결과, 그와 같은 항원 단백질에 대한 항체를 동물에게 생산시킬 수 있다.
샤페로닌은 분자 샤페론의 1종이고, 분자량 약 6만의 서브유닛(샤페로닌 서브유닛)으로 이루어지는 복합 단백질이다. 또한, 샤페로닌은 그의 내부에 다른 단백질을 수용하여 올바르게 폴딩(folding)할 수 있다. 또한, 「샤페로닌 서브유닛 연결체」는 2개 이상의 샤페로닌 서브유닛이 펩티드 결합을 통해 직렬로 연결된 인공 단백질이라고 정의된다. 다시 말하면, 샤페로닌 서브유닛 연결체는 2개 이상의 샤페로닌 서브유닛이 나란히 연결된 인공 단백질이다. 또한, 본 명세서에서는 샤페로닌 서브유닛을 코딩하는 유전자 및 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자를 총칭하여 「샤페로닌을 코딩하는 유전자」라 부르는 경우가 있다.
바람직하게는 상기 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체는 대장균 유래의 것이다.
대장균 유래의 샤페로닌은 GroEL이라 불리고, 그의 생화학적 및 물리 화학적성질이 잘 조사되어 있으며 유전자도 입수하기 쉽다. 또한, 이 바람직한 양상의 동물 면역 방법에 있어서는, 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체가 대장균 유래의 것이다. 이러한 구성에 의해, 동물에게 투여하기 위한 융합 유전자를 용이하게 제조할 수 있다.
바람직하게는, 상기 융합 유전자는 발현 벡터에 조립되면서 또한 상기 발현 벡터 상의 프로모터에 의해 발현이 조절된다.
이 바람직한 양상의 동물 면역 방법에 있어서는, 융합 유전자가 발현 벡터에 조립되고, 그의 발현이 프로모터에 의해 조절된다. 이러한 구성에 의해, 보다 확실하게 융합 유전자를 동물내에서 발현시킬 수 있다. 그 결과, 보다 확실하게 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다.
바람직하게는, 상기 프로모터는 CMV 프로모터, AML 프로모터, SV40 프로모터, SRα 프로모터 또는 EF-1α 프로모터이다.
이 바람직한 양상의 동물 면역 방법에 있어서는, 발현 벡터 상의 프로모터는 CMV 프로모터 등의 유도가 강력한 것이고, 또한 그의 성질도 잘 알려져 있는 것이다. 이러한 구성에 의해, 융합 유전자를 고효율로 발현시킬 수 있다. 그 결과, 보다 확실하게 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다.
바람직하게는, 상기 발현 벡터는 CpG 모티프(motif)를 포함하는 것이다.
CpG 모티프는 미생물의 DNA에 포함되어 있는 염기 서열이고, 포유류의 면역 자극계를 높이는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 바람직한 양상의 동물 면역 방법에 있어서는, 발현 벡터가 CpG 모티프를 포함하는 것이다. 이러한 구성에 의해, 동물에 대하여 보다 높은 면역 반응을 유도할 수 있다. 그 결과, 고효율로 항원 단백질에 대한 항체를 생산시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 동물은 포유류 또는 조류이다.
이 바람직한 양상의 동물 면역 방법에 있어서는, 면역시키는 동물이 그의 취급이 간단한 포유류 또는 조류이다. 이러한 구성에 의해, 보다 간단하게 면역을 행할 수 있다.
바람직하게는, 상기 포유류는 마우스, 래트, 토끼, 소, 말, 개, 고양이, 염소, 양 또는 돼지이다. 바람직하게는 상기 조류는 닭, 오리 또는 칠면조이다.
바람직하게는 상기 항원 단백질은 G 단백질 결합 수용체, 이온 채널형 수용체, 티로신 키나제형 수용체, CD 항원, 세포 접착 분자, 암 항원, 사이토카인, 성장 인자, 증식 인자, 영양 인자, 바이러스 항원, 세균 항원 또는 독소 항원이다.
이 바람직한 양상의 동물 면역 방법에 있어서는, 항원 단백질이 G 단백질 결합 수용체 등의 의약품 개발에 유용한 단백질이다. 이러한 구성에 의해, 이들 유용한 단백질에 대한 항체를 취득할 수 있고, 분석법의 구축 등에 적용할 수 있다.
본 발명의 제2 양상은 본 발명의 동물 면역 방법에 사용하기 위한 면역용 조성물이며, 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 주성분으로 하는 면역용 조성물이다.
상기한 본 발명의 동물 면역 방법을 실시하는 경우에는, 예를 들면 융합 유전자를 적절한 용매에 용해시킨 조성물을 제조하고, 상기 조성물을 동물에게 투여할 수 있다. 또한, 본 양상의 면역용 조성물은 본 발명의 동물 면역 방법에 사용하기 위한 것이고, 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 주성분으로 한다. 본 양상의 면역용 조성물에 따르면, 주사 등의 방법에 의해 융합 유전자를 동물에게 투여할 수 있다. 또한, 조성물 중의 융합 유전자의 농도를 조정함으로써, 융합 유전자의 투여량을 정확하게 조절할 수 있다.
본 발명의 제3 양상은 본 발명의 동물 면역 방법에 의해 동물을 면역시켜 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도하고, 상기 동물에게 항원 단백질에 대한 항체를 생산시켜, 상기 동물로부터 상기 항체를 채취하는 항체의 제조 방법이다.
상기한 본 발명의 동물 면역 방법은 체액성 면역 반응을 유도하는 것이고, 그 결과, 동물에게 항체를 생산시킬 수 있다. 또한, 본 양상의 항체 제조 방법은, 본 발명의 동물 면역 방법에 의해 체액성 면역 반응을 유도하여 동물에게 항원 단백질에 대한 항체를 생산시키고, 상기 동물로부터 항체를 채취하는 것이다. 본 양상의 항체 제조 방법에 따르면, 정제법이 확립되지 않은 항원 단백질, 정제가 곤란한 항원 단백질, 유전자만 알려져 있는 미지의 항원 단백질, 재조합 DNA 기술에서는 유전자의 발현량이 적은 항원 단백질 등이면서, 또한 그 유전자를 단독으로 투여하여도 항체가 생산되지 않는 항원 단백질이라도, 동물에게 항체를 생산시킬 수 있다. 동물의 혈청으로부터 항체를 채취하는 경우에는, 폴리클로날 항체로서 채취된다.
본 발명의 제4 양상은 본 발명의 동물 면역 방법에 의해 동물을 면역시켜 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도한 후에, 상기 동물로부터 면역 세포를 채취하고, 상기 면역 세포와 골수종 세포를 세포 융합함으로써 항원 단백질에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하는 하이브리도마의 제조 방법이다.
본 양상의 하이브리도마의 제조 방법에 있어서는, 상기한 본 발명의 동물 면역 방법에 의해 체액성 면역 반응을 유도시킨 동물의 면역 세포와 골수종 세포를 세포 융합함으로써, 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조한다. 이러한 구성에 의해, 항원 단백질 자체 또는 그 유전자를 단독으로 투여하여도 항체가 생산되지 않는 항원 단백질이라도, 그에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있다.
본 발명의 제5 양상은, 본 발명의 하이브리도마의 제조 방법으로 제조된 하이브리도마를 배양하여, 배양물로부터 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 채취하는 모노클로날 항체의 제조 방법이다.
본 양상의 모노클로날 항체의 제조 방법은, 상기한 본 발명의 하이브리도마의 제조 방법에 의해 제조된 하이브리도마를 배양하여, 상기 배양물로부터 모노클로날 항체를 채취한다. 이러한 구성에 의해, 항원 단백질 자체 또는 그 유전자를 단독으로 투여하여도 항체가 생산되지 않는 항원 단백질이라도, 그에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수 있다.
본 발명의 제6 양상은, 본 발명의 동물 면역 방법에 의해 동물을 면역시켜 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도한 후에, 상기 동물로부터 항체에 대한 mRNA를 제조하고, 상기 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 제조하며, 상기 cDNA를 사용한 파지 디스플레이(phage display)법에 의해 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 제조하는 제조 방법이다.
본 양상의 모노클로날 항체의 제조 방법은 파지 디스플레이법을 사용하는 것이고, 상기한 본 발명의 동물 면역 방법에 의해 체액성 면역 반응이 유도된 동물로부터 mRNA를 제조하고, 상기 mRNA로부터 cDNA를 제조하며, 상기 cDNA를 사용한 파지 디스플레이법에 의해 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 제조한다. 이러한 구성에 의해, 항원 단백질을 투여하거나 그 유전자를 단독으로 투여하거나 하여도 항체가 생산되지 않는 항원 단백질이라도, 그에 대한 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.
<발명의 효과>
본 발명의 동물 면역 방법 및 면역용 조성물에 따르면, 유전자 면역을 행할 때에 그 유전자를 단독으로 동물에게 접종하여도 체액성 면역 반응을 유도할 수 없는 항원 단백질이라도 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 항체 제조 방법에 따르면, 유전자 면역을 행할 때에 그 유전자를 단독으로 동물에게 접종하여도 체액성 면역 반응을 유도할 수 없는 항원 단백질이라도 항원 단백질에 대한 항체를 제조할 수 있다.
본 발명의 하이브리도마의 제조 방법에 따르면, 유전자 면역을 행할 때에 그 유전자를 단독으로 동물에게 접종하여도 체액성 면역 반응을 유도할 수 없는 항원 단백질이라도, 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 제조 방법에 따르면, 유전자 면역을 행할 때에 그 유전자를 단독으로 동물에게 접종하여도 체액성 면역 반응을 유도할 수 없는 항원 단백질이라도, 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 제조할 수 있다.
도 1은 실시예 3에서의 hETAR 유전자 도입 세포와 혈청 중의 항 hETAR 항체와 상호 작용의 해석 결과를 나타내고, 도 1(a)는 유전자 면역 전(0일째)의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도, 도 1(b)는 유전자 면역 후 35일째의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도이다.
도 2는 실시예 3에서의 hETBR 유전자 도입 세포와 혈청 중의 항 hETAR 항체와 상호 작용의 해석 결과를 나타내고, 도 2(a)는 유전자 면역 전(0일째)의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도, 도 2(b)는 유전자 면역 후 35일째의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도이다.
도 3은 실시예 3에서의 대조의 세포와 혈청 중의 항 hETBR 항체와 상호 작용의 해석 결과를 나타내고, 도 3(a)는 유전자 면역 전(0일째)의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도, 도 3(b)는 유전자 면역 후 35일째의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하, 본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 동물 면역 방법은 유전자 면역에 속하는 것이고, 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 동물에게 투여하는 것이다. 본 발명의 동물 면역 방법에 있어서는, 항원 단백질의 전부를 코딩하는 유전자와 항원 단백질의 일부를 코딩하는 유전자를 둘다 사용 가능하고, 목적에 따라서 구분하여 사용할 수 있다. 항원 단백질의 전부를 코딩하는 유전자를 사용하는 경우에는, 예를 들면 항원 단백질이 갖는 복수개의 에피토프 각각에 대한 항체나, 항원 단백질의 입체 구조를 인식하는 항체를 생산시킬 때에 바람직하다. 한편, 항원 단백질의 일부를 코딩하는 유전자를 사용하는 경우에는, 예를 들면 특정 에피토프에 대한 항체를 생산시킬 때에 바람직하다.
샤페로닌은 분자 샤페론의 일종이고, 박테리아, 고세균, 진핵 생물 등의 모든 생물에 존재한다. 특히, 박테리아의 세포질, 진핵 세포의 미토콘드리아, 엽록체에 다량 존재한다. 샤페로닌은 단백질의 폴딩을 촉진시키는 활성이나 단백질의 변성을 저지하는 활성을 갖는다. 샤페로닌은 분자량 약 6만의 샤페로닌 서브유닛(Hsp60이라고도 함) 7 내지 9개를 포함하는 링상 구조체가 2개 중첩된, 총 분자량 80만 내지 100만 정도의 실린더 형상의 거대한 복합 단백질이다. 샤페로닌은 그 링상 구조체 내부에 공동을 가지고, 그 공동내에 폴딩 도중의 단백질이나 변성된 단백질을 일시적으로 수용하여 복합체(이하, 「샤페로닌 단백질 복합체」라 함)를 형성한다. 또한, 공동내에서 수용된 단백질을 올바르게 폴딩하고, 계속해서 공동 으로부터 올바르게 폴딩된 단백질을 방출하는 것으로 알려져 있다.
샤페로닌은 그룹 1형과 그룹 2형으로 크게 구별된다. 박테리아나 진핵 생물의 세포소기관(organelle)에 존재하는 샤페로닌은 그룹 1형으로 분류되고, 코샤페로닌이라 불리는 분자량 약 10 kDa의 단백질의 환상 복합체를 보인자(cofactor)로 한다. 한편, 그룹 2형 샤페로닌은 진핵 생물의 세포질이나 고세균에서 나타나고, 이들의 구조나 기능에 대해서는 불명확한 점이 많이 남아 있으며, 그룹 1형의 코샤페로닌에 상당하는 단백질도 현재 시점에서 발견되지 않았다. (문헌[Gupta, Mol. Microbiol., 15, 1-, 1995년]). 본 발명의 동물 면역 방법에 있어서는, 모든 형태의 샤페로닌 유전자가 사용 가능하다. 예를 들면, 그룹 1형의 샤페로닌으로서는 대장균의 GroEL, 그룹 2형의 샤페로닌으로서는 고세균 유래의 TCP를 들 수 있다. 즉, GroEL 서브유닛 또는 GroEL 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자, TCP 서브유닛 또는 TCP 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자를 사용할 수 있다.
본 발명의 동물 면역 방법에서의 하나의 양상으로는, 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛와의 융합 유전자를 동물에게 투여한다. 그렇게 하면, 항원 단백질을 코딩하는 유전자 단독으로는 면역 반응이 유도되지 않는 경우에도, 충분히 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 융합 유전자가 동물내에서 발현하였을 때의 발현 산물이 어떠한 형태를 취하고 있는가는 불명확하지만, 가능성으로는, 면역 동물의 세포내에서 샤페로닌이 항원 단백질을 안정화시키는 것과 같은 상태를 생각할 수 있다. 또한, 최근에 샤페로닌이 항원 제시 세포의 항원 수용체인 톨 유사 수용체 2 및 톨 유사 수용체 4 와 결합한다고 하는 보고가 있다(문헌[Gobert, A. P. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 245]). 이로부터, 샤페로닌과 표적 항원과의 융합 유전자 산물에 있어서, 샤페로닌이 바람직한 어쥬번트로서 기능할 가능성도 있다.
본 발명의 동물 면역 방법에서의 다른 양상으로는, 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자와의 융합 유전자를 동물에게 투여한다. 여기서, 「샤페로닌 서브유닛 연결체」는 2개 이상의 샤페로닌 서브유닛이 펩티드 결합을 통해 직렬로 연결된 인공 단백질이라 정의된다. 바꾸어 말하면, 샤페로닌 서브유닛 연결체는 2개 이상의 샤페로닌 서브유닛이 탠덤하게 연결된 인공 단백질이다. 또한, 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자는 2개 이상의 샤페로닌 서브유닛 유전자가 직렬로 연결된 인공 유전자이다. 바꾸어 말하면, 2개 이상의 샤페로닌 서브유닛 유전자가 탠덤하게 연결된 인공 유전자이다. 또한, 본 양상은 이 인공 유전자와 항원 단백질을 코딩하는 유전자와의 융합 유전자를 동물에게 투여하는 것이다. 또한, 샤페로닌 서브유닛 연결체는 서로 집합하여 천연 샤페로닌과 동일한 복합체 구조를 이룰 수 있다. 따라서, 본 양상에 있어서도 융합 유전자의 발현 산물이, 가능성으로서, 천연 샤페로닌 단백질 복합체와 동일하게 복합체를 형성하여, 면역 동물의 세포내에서 샤페로닌이 항원 단백질을 안정화시키는 것을 생각할 수 있다. 이상과 같이, 본 발명의 동물 면역 방법에 있어서는 항원 단백질이 샤페로닌의 내부에 수용되어, 올바르게 폴딩된 정상형 단백질로서 존재하고 있다고 생각된다.
대장균 유래의 샤페로닌은 GroEL이라 불리는 것이다. GroEL은 서브유닛 (GroEL 서브유닛) 7개를 포함하는 링상 구조체가 2개 포개진 구조를 가지고, 총 14개의 GroEL 서브유닛으로 형성되어 있다. GroEL 서브유닛의 유전자는 공지되어 있으며 입수 용이하고, 본 발명의 동물 면역 방법을 보다 간편하게 행하는 데 바람직하다. 서열 10에 공지된 GroEL 서브유닛 유전자의 염기 서열을 나타낸다. 예를 들면, 이 염기 서열을 바탕으로 프라이머를 설계하고, 대장균의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하면, GroEL 서브유닛 유전자를 얻을 수 있다.
샤페로닌에는, 1개의 링상 구조체만을 갖는 싱글 링의 샤페로닌도 알려져 있다. 본 발명의 동물 면역 방법에 있어서는 싱글 링의 샤페로닌을 코딩하는 유전자도 사용 가능하다. 싱글 링의 샤페로닌의 예로서, GroEL 서브유닛 일부의 아미노산 잔기가 치환된 개변형 GroEL 서브유닛을 들 수 있다. 개변형 GroEL 서브유닛 유전자의 예를 서열 24에 나타낸다. 이 개변형 GroEL 서브유닛 유전자는, GroEL 서브유닛의 452번째의 아미노산 잔기가 글루탐산으로, 461, 463 및 464번째의 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환된 개변형 GroEL 서브유닛(SR1)을 코딩한다.
또한, 본 발명의 동물 면역 방법에 있어서의 「샤페로닌 서브유닛을 코딩하는 유전자」에는, 천연 샤페로닌 서브유닛의 전장을 코딩하는 유전자 외에, 천연 샤페로닌 서브유닛에서 유래하는 동일한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자도 포함하는 것으로 한다. 그와 같은 유전자의 예로서는, 천연 샤페로닌 서브유닛을 아미노산 치환 등에 의해 개변시킨 변이형 샤페로닌 서브유닛을 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 다른 예로서는, 천연형 또는 상기 변이형 샤페로닌 서브유닛 일부의 도메인으로 이루어지는 단백질을 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 또한, 다른 예로 서는, 천연형 또는 상기 변이형 샤페로닌 서브유닛 일부의 도메인을 결실시킨 단백질을 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다. 예를 들면, 샤페로닌 서브유닛 내의 항원 결정 부위가 될 수 있는 면역원성이 높은 도메인을 결실시킨 유전자를 사용함으로써, 항원 단백질에 대한 면역 반응을 우선적으로 유도하는 등의 조작이 가능하다.
본 발명의 동물 면역 방법에 있어서는, 융합 유전자가 발현 벡터에 조립되어, 발현 벡터 상의 프로모터의 제어하에 있는 실시 형태가 바람직하다. 발현 벡터로서는, 동물 세포내에서 복제 가능한 발현 벡터이면 되고, pCI, pSI, pAdVantage, pTriEX, pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 등의 발현 벡터를 들 수 있다. 또한, 발현 벡터 상의 프로모터는 동물 세포내에서 기능하는 것이면 되고, 예를 들면 사이토메가로바이러스(Cytomegarovirus, CMV)의 CMV 프로모터, 아데노바이러스 후기(Adenovirus Major Late, AML)의 AML 프로모터, 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40, SV40)의 SV40 프로모터, SV40 및 HTLV-1 LTR의 융합 프로모터인 SRα 프로모터, 신장 인자(Elongation Factor, EF)의 EF-1α 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 발현 벡터에는 프로모터 활성을 증강시키는 인핸서(enhancer)를 포함하는 것일 수도 있다.
또한, 발현 벡터에는 CpG 모티프가 포함될 수도 있다. CpG 모티프는 메틸화되지 않은 시토신(C)과 구아닌(G)이 풍부한 서열이다. CpG 모티프는 면역 동물의 세포 표면에 존재하는 톨 유사 수용체 9(TLR9)에 의해 인식되고, 세포내 정보 전달계를 통해 사이토카인의 유전자 발현에 의한 면역 반응을 활성화시킴과 동시에, 항원 정보의 발현을 촉진시켜 항원 제시와 헬퍼 T 세포의 활성화에 의한 특이적 면역 반응을 높일 수 있다. CpG 모티프를 포함하는 발현 벡터에 따르면, CpG 모티프의 면역 자극계를 높이는 작용에 의해, 보다 높은 면역 반응을 얻을 수 있다. 또한, CpG 모티프는 발현 벡터의 어느 위치에 포함될 수도 있고, 1 부분일 수도 있으며 복수개 부분일 수도 있다.
본 발명의 동물 면역 방법에서의 융합 유전자의 투여 방법으로서는 특별히 제한은 없고, 피하 주사, 근육 주사, 정맥 주사 등을 들 수 있다. 또한, 파티클 건에 의한 투여도 적용 가능하다. 또한, 본 발명의 동물 면역 방법에서의 융합 유전자의 투여량은 사용되는 발현 벡터나 프로모터의 종류 등에 따라서 적절하게 결정할 수 있지만, 1회당 대략 1 내지 3 mg/kg체중이며, 이것은 마우스의 경우에는 25 내지 100 μg/회가 된다. 또한, 투여 횟수는 1회일 수도 있지만, 일정 간격을 두고 복수회 행하는 것이 보다 높은 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 동물 면역 방법에 바람직한 항원 단백질로서는, 예를 들면 G 단백질 결합 수용체, 이온 채널형 수용체, 티로신 키나제형 수용체, CD 항원, 세포 접착 분자, 암 항원, 사이토카인, 성장 인자, 증식 인자, 영양 인자, 바이러스 항원, 세균 항원 또는 독소 항원을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 동물 면역 방법에서는 이들 단백질의 유전자만 입수할 수 있다면 실시할 수 있고, 단백질 자체가 정제되어 있을 필요는 없다.
본 발명의 동물 면역 방법에 사용되는 동물로서는, 취급이 용이한 포유류 또는 조류가 바람직하다. 포유류의 예로서는 마우스, 래트, 토끼, 소, 말, 개, 고양이, 염소, 양, 돼지 등을 들 수 있다. 또한, 조류의 예로서는 닭, 오리 또는 칠면 조를 들 수 있다. 특히, 최종적으로 모노클로날 항체를 취득하는 경우, 세포 융합 용이성 때문에 마우스, 래트, 토끼 또는 닭을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 어떤 동물종이든 B 세포의 종양 세포를 취득할 수 있다면 모노클로날 항체를 취득하는 것은 가능하다.
본 발명의 면역용 조성물은, 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 주성분으로 하는 것이다. 본 발명의 면역용 조성물의 대표적인 형상으로서는, 등장액에 상기 융합 유전자를 용해시킨 것이다. 등장액의 예로서는 생리 식염수, 인산 완충화 생리 식염수(PBS)를 들 수 있다. 그 밖에, 용매에는 각종 완충액을 사용할 수도 있다. 또한, 항체 생산능을 상승시키기 위해서, Mg2 + 등의 금속 이온을 등장액에 첨가하는 것도 효과적이다. 또한, 세포성 면역을 특이적으로 억제하는 면역 억제제를 첨가함으로써, 보다 체액성 면역을 유도하고, 항체 생산을 높이는 것도 가능하다. 또한, 체액성 면역을 유도하는 TH2 헬퍼 T 세포의 분화를 유도하는 것과 같은 사이토카인인 GM-CSF, TNFα, IL-4를 등장액에 첨가하거나, 또한 이들의 사이토카인을 코딩하는 유전자를 첨가하거나 하는 것도, 항체 생산능을 상승시키기 위해서는 효과적이다. 동일하게, 사이토카인 중 하나인 IL-10 또는 IL-10을 코딩하는 유전자를 등장액에 첨가하여 세포성 면역을 억제함으로써, 체액성 면역을 유도하여 항체 생산을 높이는 것도 가능하다. 또한, 항체 생산의 주역인 B 세포의 활성화, 분열, 항체 생산 세포로의 분화를 유도하는 사이토카 인인 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 또는 이들을 코딩하는 유전자를 등장액에 첨가함으로써, 항체 생산을 높이는 것도 가능하다. 본 발명의 면역용 조성물에서의 융합 유전자의 농도는, 예를 들면 10 내지 500 μg/mL 정도이다.
또한, 본 발명의 면역용 조성물에는, CpG 모티프로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것일 수도 있다. 이 경우, 상기 올리고뉴클레오티드는 어쥬번트로서 기능하여, 보다 높은 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 면역용 조성물은 체액성 면역을 유도하기 위한 백신으로서도 사용할 수 있다. 백신으로서 사용하는 경우에는, 인간에게 투여하는 것이 가능하다.
본 발명의 항체 제조 방법에 있어서는, 상기한 본 발명의 동물 면역 방법에 의해 면역시킨 동물로부터 항체를 채취한다. 구체적으로는, 예를 들면 면역 후의 동물로부터 정기적으로 부분 채혈을 행하여 항체가를 측정하고, 항체의 생산 상태를 모니터링한다. 또한, 항체가가 최대에 도달한 시점에서 전채혈을 행하고, 혈청을 제조한다. 또한, 얻어진 혈청으로부터 항체를 얻는다. 이 때, 얻어지는 항체는 폴리클로날 항체이다. 또한, 혈청으로부터 항체를 단리ㆍ정제하는 방법으로서는, 일반적으로 항체의 정제에 사용되는 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면 프로테인 A를 사용한 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
본 발명의 하이브리도마의 제조 방법에 있어서는, 상기한 본 발명의 동물 면역 방법에 의해 면역시킨 동물로부터 면역 세포를 채취하고, 이것을 골수종 세포와 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제조한다. 세포 융합, 하이브리도마의 선발 및 클로닝에 대해서는 공지된 방법을 그대로 사용할 수 있다. 예를 들면, 세포 융합 은 케이라와 밀슈타인(Kohler-Milstein)의 방법에 의해 행할 수 있다. 또한, 하이브리도마의 선발은 HAT 선택 배지를 사용한 배양에 의해 행할 수 있다. 또한, 하이브리도마의 클로닝은 한계 희석법에 의해 행할 수 있다. 또한, 이와 같이 하여 클로닝된 하이브리도마를 배양함으로써, 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 하이브리도마의 배양은 마우스 등의 동물의 복강내에서 행할 수도 있고, 디쉬(dish) 등을 사용하여 시험관내에서 행할 수도 있다. 마우스 등의 동물의 복강내에서 하이브리도마를 배양한 경우에는, 복수(腹水)를 채취하고, 그 복수로부터 모노클로날 항체를 단리ㆍ정제할 수 있다. 시험관내에서 배양한 경우에는, 그 배양액으로부터 모노클로날 항체를 단리ㆍ정제할 수 있다. 모노클로날 항체를 정제하는 방법으로서는, 서브클래스가 IgG인 모노클로날 항체인 경우는, 예를 들면 상기한 프로테인 A를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체의 제조 방법은 파지 디스플레이법을 사용하는 방법도 포함한다. 즉, 상기한 본 발명의 동물 면역 방법에 의해서 면역시킨 동물로부터 mRNA를 제조하고, 상기 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 제조하며, 항체 가변 영역만을 코딩하는 1본쇄 항체(scFV) 유전자를 제조한다. 또한, 상기 유전자를 파지미드(phagemid) 벡터에 클로닝하여 대장균에 이입(移入)한 후, 파지를 감염시키고, scFV 항체를 파지 피막 상에 발현시킬 수 있다. 이와 같이 하여 발현시킨 scFV를 항원 단백질에 대하여 스크리닝함으로써, 항원 단백질에 특이적인 모노클로날 scFV 항체를 제조하는 것이 가능하다. 또한, mRNA의 제조, cDNA의 제조, 파지미드에의 서브클로닝이나 대장균에의 이입, 파지의 감염, 항원 단백질에 특이적인 모노클로날 scFV 항체의 스크리닝은 공지된 방법을 그대로 사용할 수 있다. 예를 들면, 리더 서열(시그널 서열)과 파지 피막 단백질 III을 코딩하는 유전자 단편, 및 M13 복제 개시점의 2 가지 요소를 포함하는 파지미드 벡터에, scFV 유전자를 서브클로닝하고, 파지로서는 M13 파지를 사용함으로써, M13 파지 상에 scFV 항체를 발현시키는 것이 가능하다. 또한, 스크리닝에 의해 얻어진 파지를 특정 세균에 감염시켜 배양함으로써, 배양액으로부터 항원 단백질에 특이적인 모노클로날 항체를 대량으로 회수하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체의 제조 방법에 따르면, scFV 항체뿐만 아니라 항체의 정상 영역을 제외한 Fab 항체 단편 등을 제조하는 것도 가능하다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(1) 인간 엔도세린(endothelin) A 수용체 유전자의 단리
모델 항원 단백질로서 인간 유래 엔도세린 A 수용체(hETAR)를 사용하여 이하의 절차로 유전자 면역을 행하였다. 우선, 인간 폐 cDNA 라이브러리(다카라바이오사)를 주형으로 하고, 서열 1 및 2에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍(primer set)으로서 PCR을 행하여, 서열 3에 나타내는 염기 서열을 갖는 엔도세린 A 수용체(hETAR) 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 또한, 이 증폭된 DNA 단편에는, 프라이머에서 유래하며, 5' 말단에 NheI 사이트, 3' 말단 에 SalI 사이트가 도입된다. 또한, 동일하게 하여 서열 1 및 4에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로서 PCR을 행하여, 서열 3에 나타내는 염기 서열을 갖는 hETAR 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 또한, 이 증폭된 DNA 단편에는, 프라이머에서 유래하며, 5' 말단에 NheI 사이트, 3' 말단에 2개의 정지 코돈(TAATAG)을 코딩하는 서열 및 SalI 사이트가 도입되었다. 또한, 동일하게 하여 서열 5 및 6에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로서 PCR을 행하여, 서열 3에 나타내는 염기 서열을 갖는 hETAR 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 또한, 이 증폭된 DNA 단편에는, 프라이머에서 유래하며, 5' 말단에 SalI 사이트, 3' 말단에 FLAG 태그(FLAG Tag, 서열 7)를 코딩하는 서열, 2개의 정지 코돈(TAATAG)을 코딩하는 서열 및 HindIII 사이트가 도입되었다.
(2) GroEL 서브유닛 유전자의 단리
대장균 HMS174(DE3)주(노바젠사)로부터 게놈 DNA를 추출ㆍ정제하였다. 다음에, 정제한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열 8 및 9에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로서 PCR을 행하여, 서열 10에 나타내는 염기 서열을 갖는 GroEL 서브유닛 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 또한, 이 증폭된 DNA 단편에는, 프라이머에서 유래하며, 5' 말단에 SalI 사이트, 3' 말단에 2개의 정지 코돈(TAATAG)을 코딩하는 서열 및 NotI 사이트가 도입되었다.
(3) 인간 엔도세린 A 수용체와 GroEL 서브유닛과의 융합 단백질을 발현하는 유전자 면역용 백터의 구축
포유 동물 발현 벡터 pCI 포유류 발현 벡터(Mammalian Expression Vector)(Promega사)를 제한 효소 NheI과 SalI로 소화시키고, 박테리아 유래 알칼리 포스파타제(BAP)로써 말단을 탈인산화 처리한 후, 상기 (1)에서 증폭된 5' 말단에 NheI 사이트를, 3' 말단에 SalI 사이트를 부가한 hETAR 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입하였다. 또한, 이 발현 벡터를 SalI 및 NotI로 소화시키고, BAP로 말단을 탈인산화 처리한 후, 상기 (2)에서 증폭된 GroEL 서브유닛 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입하여 벡터 pCI-hETAR·GroEL을 구축하였다. 즉, 벡터 pCI-hETARㆍGroEL은 hETAR을 코딩하는 유전자와 GroEL 서브유닛을 코딩하는 유전자와의 융합 유전자를 갖는다. 한편, 동일하게 하여, 포유 동물 발현 벡터 pCI 포유류 발현 벡터를 제한 효소 NheI과 SalI로 소화시키고, BAP로 말단을 탈인산화 처리한 후, 상기 (1)에서 증폭된 5' 말단에 NheI 사이트를, 3' 말단에 정지 코돈 및 SalI 사이트를 부가한 hETAR 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입하여 벡터 pCI-hETAR을 구축하였다. 즉, 벡터 pCI-hETAR은 hETAR 유전자만을 갖는다.
(4) 인간 엔도세린 A 수용체를 발현하는 벡터의 구축
대장균용 발현 벡터 pMAL(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)사)을 제한 효소 SalI와 HindIII으로 소화시키고, BAP로 말단을 탈인산화 처리한 후, 상기 (1)에서 증폭된 5' 말단에 SalI 사이트를, 3' 말단에 FLAG 태그를 코딩하는 서열, 정지 코돈 및 HindIII 사이트를 부가한 hETAR 유전자를 포함하는 DNA 단편을 삽입하여 발현 벡터 pMAL-hETAR을 구축하였다. 발현 벡터 pMAL-hETAR에 따르면, 말토스(맥아당) 결합 단백질(MBP)과 hETAR의 융합 단백질(이하, 「MBP-hETAR 융합 단백질」이라 함)을 대장균에서 발현시킬 수 있다.
(5) 인간 엔도세린 A 수용체의 제조
항체 검출용 인간 엔도세린 A 수용체(항원 단백질)를 이하의 절차로 제조하였다. 상기 (4)에서 구축한 발현 벡터 pMAL-hETAR을 대장균 BL21(노바젠(Novagen)사)에 도입하여 형질 전환체를 얻었다. 상기 형질 전환체를 2×Y.T. 배지(16 g/L 박토트립톤, 10 g/L 효모 엑기스, 5 g/L NaCl) 중에서 25 ℃, 110 rpm에서 18 시간 배양하였다. 배양 종료 후, 균체를 원심 분리(30,000 g, 30 분, 4 ℃)하여 회수하였다. 회수한 균체를 PBS로 세정한 후, PBS에 현탁시켜 초음파 처리로 균체를 파쇄하였다. 균체 파쇄액을 원심 분리(100,000 g, 1 시간, 4 ℃)하여 불용성 침전을 회수하였다. 이 불용성 침전을 각각 4 ％ 트리톤 X-100에 용해시킨 후, SDS-PAGE에 적용하였다. 또한, 항 FLAG 항체(항-FLAG M2 모노클로날 항체, 시그마사)를 1차 항체로 한 웨스턴 블로팅을 행하였다. 블로팅에는 PVDF막(이모빌론(Immobilon)-P, 밀리포어사)을 사용하고, 2차 항체로서 비오틴 표지 유니버설 2차 항체 키트(유니버설 퀵 키트(Universal Quick Kit), 벡터 래보러토리즈사)를 사용하였다. 검출에는, 코니카 이뮤노스테인 HRP-100(세이까가꾸 고교사)를 사용하였다. 대조(control)로서, hETAR을 코딩하는 유전자를 삽입하지 않은 플라스미드 pMAL에 대해서도 동일한 조작을 행하였다. 그 결과, 대조에는 나타나지 않는 MBP-hETAR 융합 단백질(84 kDa)의 분자량에 상당하는 위치에 밴드가 출현하였다. 이에 의해, hETAR의 전장이 취득된 것이 확인되었다.
(6) 유전자 면역
생리 식염수에 벡터 pCI-hETARㆍGroEL을 250 μg/mL의 농도가 되도록 용해시켜 면역용 조성물을 제조하였다. 이 면역용 조성물을 8주령의 마우스 BALB/c(암컷)의 양족(兩足) 대퇴근에 각 0.12 mL씩 주사를 행하여 면역시켰다(0일째). 이에 따라, pCI-hETARㆍGroEL을 양족에 각 30 μg씩, 즉 1 마리에 대하여 1회당 60 μg 투여하였다. 그 후, 7일째, 21일째 및 28일째에도 동일하게 반복하여 면역시켰다. 또한, 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42일째에 채혈을 행하여 혈청을 제조하였다. 대조로서, hETAR을 단독으로 발현하는 벡터 pCI-hETAR을 사용하여 마우스를 면역시켰다.
(7) 웨스턴 블로팅에 의한 항체의 검출
상기 (5)에서 얻어진 MBP-hETAR 융합 단백질을 함유하는 균체 파쇄액에 대하여, 상기 (6)에서 제조한 혈청을 1차 항체로서 사용하여 웨스턴 블로팅을 행하였다. 블로팅에는 PVDF막(이모빌론-P, 밀리포어사)을 사용하고, 2차 항체로서 비오틴 표지 유니버설 2차 항체 키트를 사용하며, 검출에는 코니카 이뮤노스테인 HRP-100을 사용하였다. 그 결과, pCI-hETARㆍGroEL로 면역시켜 28일째 이후에 채혈된 혈청에서만, MBP-hETAR 융합 단백질에 상당하는 밴드가 검출되었다. 이상으로부터, hETAR 유전자와 GroEL 서브유닛 유전자와의 융합 유전자에 의해 hETAR에 대한 항체 생산을 유도할 수 있었다.
실시예 2
본 실시예에서는 유전자 면역과 단백질 면역과의 비교를 행하였다.
(1) 샤페로닌 서브유닛 연결체 유전자와 인간 유래 엔도세린 A 수용체 유전자와의 융합 유전자에 의한 유전자 면역
생리 식염수에 벡터 pCI-hETARㆍGroEL을 250 μg/mL의 농도가 되도록 용해시켜 면역용 조성물을 제조하였다. 이 면역용 조성물을 8주령의 마우스 BALB/c(암컷)의 양족 대퇴근에 각 0.12 mL씩 주사를 행하여 면역시켰다(0일째). 이에 따라, pCI-hETARㆍGroEL을 양족에 각 30 μg씩, 즉 1 마리에 대하여 1회당 60 μg 투여하였다. 그 후, 7일째, 21일째, 28일째 및 35일째에도 동일하게 반복하여 면역시켰다. 또한, 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42일째에 채혈을 행하여 혈청을 제조하였다.
(2) 샤페로닌 서브유닛 연결체와 인간 유래 엔도세린 A 수용체와의 융합 단백질에 의한 단백질 면역(비교예)
서열 11 및 12에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켜 2본쇄 DNA를 제조하였다. 이 2본쇄 DNA를 pTrc99A(아마샴 바이오사이언스사)의 NcoI-HindIII 사이트에 도입하여 pTrc99AII를 구축하였다. pTrc99AII에는 2본쇄 DNA에서 유래하는 SpeI 사이트, XbaI 사이트 및 FLAG 태그를 코딩하는 유전자가 도입되었다. 한편, 대장균 K12주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열 13 및 14에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로서 PCR을 행하여, GroEL 서브유닛 유전자(서열 10)를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 사용한 프라이머에서 유래하며, 이 증폭 DNA 단편의 5' 말단에는 SpeI 사이트가, 3' 말단에는 XbaI 사이트가 도입되었다. 이 증폭 DNA 단편을 pTrc99AII의 SpeI-XbaI 사이트에 도입하여 pTrcGroEL을 구축하였다.
서열 15 및 16에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켜 2본쇄 DNA를 제조하였다. 이 2본쇄 DNA를 pTrcGroEL의 DraIII-BamHI 사이트에 도입하여 pTrcSR1 을 구축하였다. 이에 따라, pTrcGroEL 상의 GroEL 서브유닛 유전자에 변이가 도입되었다. 변이가 도입된 GroEL 서브유닛 유전자(SR1 유전자)의 염기 서열을 서열 24에 나타내었다. 즉, pTrcSR1은 GroEL 서브유닛의 452번째의 아미노산 잔기가 글루탐산으로, 461, 463 및 464번째의 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환된 개변형 GroEL 서브유닛(SR1)을 발현할 수 있다.
pTrcSR1을 SpeI과 XbaI로 처리하여, SR1 유전자를 포함하는 DNA 단편을 단리하였다. 이 DNA 단편을, 미리 XbaI과 BAP로 처리된 pTrcSR1에 도입하여 pTrcSR2를 구축하였다. pTrcSR2는 2개의 SR1 유전자가 한 방향으로 연결된 유전자(SR2 유전자)를 포함한다. 동일하게 하여, SR1 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 미리 XbaI과 BAP로 처리된 pTrcSR2에 도입하여 pTrcSR3을 구축하였다. pTrcSR3은 3개의 SR1 유전자가 한 방향으로 연결된 유전자(SR3 유전자)를 포함한다. 동일한 조작을 반복하여 pTrcSR7을 구축하였다. pTrcSR7은 7개의 SR1 유전자가 한 방향으로 연결된 유전자(SR7 유전자)를 포함한다. 바꾸어 말하면, pTrcSR7은 개변형 GroEL 서브유닛 7회 연결체(SR7)를 발현할 수 있다.
실시예 1의 (3)에서 구축한 pCI-hETAR을 주형으로 하고, 서열 17 및 18에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로서 PCR을 행하여, hETAR 유전자(서열 3)을 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 또한, 이 증폭 DNA 단편에는, 프라이머에서 유래하며, 5' 말단에 NheI 사이트, 3' 말단에 XhoI 사이트가 도입되었다. 이 증폭 DNA 단편을, 미리 NheI, XhoI 및 BAP로 처리된 pTrcSR7에 도입하여 pTrcSR7-hETAR을 구축하였다. pTrcSR7-hETAR은 SR7과 hETAR과의 융합 단백 질(이하, 「SR7-hETAR 융합 단백질」이라 함)을 발현할 수 있다. 또한, SR7-hETAR 융합 단백질의 C 말단에는 FLAG 태그가 부가되었다.
pTrcSR7-hETAR을 대장균 BL21(DE3)주에 도입하여 형질 전환체를 얻었다. 상기 형질 전환체를 카르베니실린(100 μg/mL)을 포함하는 2×Y.T. 배지 중에서 23 ℃, 110 rpm에서 24 시간 회전 배양하였다. 배양 종료 후, 배양 균체를 원심 분리하여 회수하였다. 회수한 균체를 초음파 처리로써 파쇄하였다. 이 균체 파쇄액을 원심 분리하여 상등액을 회수하였다. 이 상등액을 항 FLAG 항체 고정화 비드(시그마사)를 사용하여 면역 침강 반응시켰다. 얻어진 침강 분획을 SDS-PAGE/CBB에 적용하였다. 그 결과, SR7-hETAR 융합 단백질의 분자량에 상당하는 470 kDa 부근의 위치에 밴드가 검출되었다. 또한, 항 FLAG 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 행한 결과, 이 밴드가 반응하였다. 이상으로부터, SR7-hETAR 융합 단백질이 대장균의 가용성 분획에 발현되어 있었다.
얻어진 상등액을, ANTI-FLAG 모노클로날 항체 아가로스 친화성 겔(시그마-알드리치사)에 의한 친화성 크로마토그래피, 및 부틸세파로스 FF(Butyl Sepharose FF, 아마샴 바이오사이언스사)에 의한 소수 크로마토그래피에 적용하여 SR7-hETAR 융합 단백질을 정제하였다.
8주령의 마우스(BALB/c, 암컷)에 50 μg의 정제된 SR7-hETAR 융합 단백질을 피하 주사하여 마우스를 면역시켰다(0일째). 그 후, 본 실시예(1)의 유전자 면역의 경우와 동일하게, 7, 21, 28 및 35일째에도 반복하여 면역시켰다. 또한, 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42일째에 채혈을 행하여 혈청을 제조하였다.
(3) ELISA에 의한 평가 결과
실시예 1의 (5)에서 얻어진 MAL-hETAR(84 kDa)을 포함하는 대장균의 균체 파쇄액을 아밀로스 수지(뉴 잉글랜드 바이오랩스사) 칼럼에 적용하여 MAL-hETAR을 수지에 결합시켰다. 수지를 세정 후, 말토스(맥아당)에 의해 MAL-hETAR을 용출시켜 회수하였다. 회수한 MAL-hETAR을 96웰 플레이트에 흡착시켰다. 이 96웰 플레이트를 사용하여 ELISA를 행하고, (1)의 유전자 면역으로 얻어진 각 혈청 및 (2)의 단백질 면역으로 얻어진 각 혈청의 항 hETAR 역가를 측정하였다. 또한, 2차 항체로서는 퍼옥시다제 표지 항 마우스 IgG를 사용하고, 발색 기질로서는 TMB를 사용하였다. ELISA의 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에서 각 수치는 혈청의 희석 배율로 나타낸 ELISA 역가이다. 역가가 높을수록 항체가 많이 생산되는 것을 나타내고, 이것은 체액성 면역이 강하게 유도된 것을 나타낸다. 즉, 면역 개시로부터 21일째까지의 단기간에는 유전자 면역시킨 마우스보다 단백질 면역시킨 마우스의 경우가 높은 역가를 나타내었다. 그러나, 그 후에는 유전자 면역시킨 마우스의 역가가 급격히 상승하고, 42일째에는 단백질 면역시킨 마우스의 역가보다 10배 높은 역가를 나타내었다. 이상으로부터, 유전자 면역에 의해 단백질 면역보다 강하게 체액성 면역을 유도할 수 있었다.
실시예 3
본 실시예에서는, 실시예 2의 (1)에서 얻어진 혈청 중의 항 hETAR 항체에 대하여 세포 표면의 활성형 hETAR에 대한 결합성을 평가하였다.
(1) 인간 엔도세린 A 수용체 발현 세포 및 엔도세린 B 수용체 발현 세포의 제조
실시예 1의 (3)에서 구축한 pCI-hETARㆍGroEL을 주형으로 하고, 서열 19 및 20에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로서 PCR을 행하여, hETAR 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 pCIneo(프로메가사)의 NheI-XhoI 사이트에 도입하여 pCIneo-hETAR을 구축하였다. 한편, 인간 태반 cDNA 라이브러리(다카라바이오사)를 주형으로 하고, 서열 21 및 22에 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로서 PCR을 행하여, 인간 엔도세린 B 수용체(hETBR) 유전자(서열 23)를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 pCIneo의 NheI-XhoI 사이트에 도입하여 pCIneo-hETBR을 구축하였다.
37.5 μL의 리포펙타민 용액, 625 μL의 OPTI-MEMI 배지 및 20 μg의 pCIneo-hETAR을 포함하는 625 μL의 OPTI-MEMI 배지를 혼합하였다. 이 혼합액을 사용하여 pCIneo-hETAR을 2×105개의 COS7 세포(다이닛본 세이야꾸사)에 도입하였다. 동일한 절차로 pCIneo-hETBR을 COS7 세포에 도입하였다. 대조로서, pCIneo1만을 COS7 세포에 도입하였다. 유전자가 도입된 각 COS7 세포를, Ham'sF12K+10 ％ FBS 배지(ICN사)에서 30 시간 배양하였다. 또한, 2×104개/100 μL의 초기 세포 농도로, 각 COS7 세포를 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 일주야 배양하였다. 배양 종료 후, 10-6 내지 10-12 M의 농도 범위내의 ET-1(펩티드 겡뀨쇼)에 의해 각 세포를 자극한 결과, 세포내의 Ca 농도가 일시적으로 상승하였다. Ca 농도는 Ca 시그날 해석 장치(FLIPR; MD사) 및 세포내 Ca 염색 키트(Ca3kit; MD사)를 사용하여 측정하였다. 이로부터, 활성형 hETAR과 활성형 hETBR 중 어느 것이 COS7 세포막 상에 정상적으로 발현된 것을 알 수 있었다.
(2) 유동세포 계측법에 의한 활성형 hETAR에 대한 결합성 평가
pCIneo-hETAR이 도입된 COS7 세포(이하, 「hETAR 유전자 도입 세포」라 함), pCIneo-hETBR이 도입된 COS7 세포(이하, 「hETBR 유전자 도입 세포」라 함) 및 pCIneo1이 도입된 COS7 세포(대조 세포)를 PBS로 세정하였다. 실시예 2에서 제조된 면역 후 35일째의 혈청을 500배 희석하여 각 세포와 함께 배양하였다. 또한, 2차 항체로서 피코에리스린 표지 항 마우스 IgG 항체(벡만 코울터사)를 첨가한 후, 유동세포 계측기 EPICSXL(벡만 코울터사)을 사용하여 각 세포와 혈청 중의 항 hETAR 항체와의 상호 작용을 해석하였다. 결과를 도 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 1은 hETAR 유전자 도입 세포와 혈청 중의 항 hETAR 항체와 상호 작용의 해석 결과를 나타내고, 도 1(a)는 유전자 면역 전(0일째)의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도, 도 1(b)는 유전자 면역 후 35일째의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도이다. 도 2는 hETBR 유전자 도입 세포와 혈청 중의 항 hETAR 항체와 상호 작용의 해석 결과를 나타내고, 도 2(a)는 유전자 면역 전(0일째)의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도, 도 2(b)는 유전자 면역 후 35일째의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도이다. 도 3은 대조의 세포와 혈청 중의 항 hETAR 항체와 상호 작용의 해석 결과를 나타내고, 도 3(a)는 유전자 면역 전(0일째)의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도, 도 3(b)는 유전자 면역 후 35일째의 혈청을 사용한 경우의 이차원 도트 표시도이다. 도 1 내지 3에서 종축은 피코에리스린(PE) 유래의 형광 강도, 횡축은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 유래의 형광 강도를 나타낸다. 4개의 영역(B1 내지 B4) 중, B1(좌측위)에 속하는 도트가 혈청 중의 항 hETAR 항체와 결합한 세포를 나타낸다. 각 영역에 기재되어 있는 값은 각 영역에 속하는 도트의 비율(％)이다.
그 결과, hETAR 유전자 도입 세포를 사용한 경우에는, 유전자 면역 전의 혈청에서는 B1의 영역에는 도트가 거의 검출되지 않았지만(도 1(a)), 유전자 면역 후의 혈청에서는 B1의 영역에 많은 도트가 검출되었다(도 1(b)). 이것은, 면역 후의 혈청 중의 항 hETAR 항체가 hETAR 유전자 도입 세포에 결합된 것을 나타내었다. 한편, hETBR 유전자 도입 세포를 사용한 경우에는, 유전자 면역 후의 혈청이라도 B1의 영역에는 거의 도트가 검출되지 않았다(도 2). 이것은, 면역 후의 혈청 중의 항 hETAR 항체가 hETBR 유전자 도입 세포에 결합되지 않은 것을 나타내었다. 또한, 대조 세포를 사용한 경우에도, 유전자 면역 후의 혈청이라도 B1의 영역에 거의 도트가 검출되지 않았다(도 3). 이것은, 면역 후의 혈청 중의 항 hETAR 항체가 대조 세포에 결합되지 않은 것을 나타내었다. 이상의 점으로부터, 유전자 면역에 의해 활성형 hETAR의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하는 항체의 생산을 유도할 수 있었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Sekisui Chemical Co., Ltd.
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<212> DNA
<213> Artificial
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tacattaaca ctgtgatatc ttgtactatt ttcatcgtgg gaatggtggg gaatgcaact 300
ctgctcagga tcatttacca gaacaaatgt atgaggaatg gccccaacgc gctgatagcc 360
agtcttgccc ttggagacct tatctatgtg gtcattgatc tccctatcaa tgtatttaag 420
ctgctggctg ggcgctggcc ttttgatcac aatgactttg gcgtatttct ttgcaagctg 480
ttcccctttt tgcagaagtc ctcggtgggg atcaccgtcc tcaacctctg cgctcttagt 540
gttgacaggt acagagcagt tgcctcctgg agtcgtgttc agggaattgg gattcctttg 600
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gcgattggct tcgtcatggt accctttgaa tataggggtg aacagcataa aacctgtatg 720
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gccaaagcag gcaaaccgct gctgatcatc gctgaagatg tagaaggcga agcgctggca 780
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gccagcttgg ctctgggaga cctgctgcac atcgtcattg acatccctat caatgtctac 480
aagctgctgg cagaggactg gccatttgga gctgagatgt gtaagctggt gcctttcata 540
cagaaagcct ccgtgggaat cactgtgctg agtctatgtg ctctgagtat tgacagatat 600
cgagctgttg cttcttggag tagaattaaa ggaattgggg ttccaaaatg gacagcagta 660
gaaattgttt tgatttgggt ggtctctgtg gttctggctg tccctgaagc cataggtttt 720
gatataatta cgatggacta caaaggaagt tatctgcgaa tctgcttgct tcatcccgtt 780
cagaagacag ctttcatgca gttttacaag acagcaaaag attggtggct gttcagtttc 840
tatttctgct tgccattggc catcactgca tttttttata cactaatgac ctgtgaaatg 900
ttgagaaaga aaagtggcat gcagattgct ttaaatgatc acctaaagca gagacgggaa 960
gtggccaaaa ccgtcttttg cctggtcctt gtctttgccc tctgctggct tccccttcac 1020
ctcagcagga ttctgaagct cactctttat aatcagaatg atcccaatag atgtgaactt 1080
ttgagctttc tgttggtatt ggactatatt ggtatcaaca tggcttcact gaattcctgc 1140
attaacccaa ttgctctgta tttggtgagc aaaagattca aaaactgctt taagtcatgc 1200
ttatgctgct ggtgccagtc atttgaagaa aaacagtcct tggaggaaaa gcagtcgtgc 1260
ttaaagttca aagctaatga tcacggatat gacaacttcc gttccagtaa taaatacagc 1320
tcatcttaa 1329
<210> 24
<211> 1647
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 24
atggcagcta aagacgtaaa attcggtaac gacgctcgtg tgaaaatgct gcgcggcgta 60
aacgtactgg cagatgcagt gaaagttacc ctcggtccaa aaggccgtaa cgtagttctg 120
gataaatctt tcggtgcacc gaccatcacc aaagatggtg tttccgttgc tcgtgaaatc 180
gaactggaag acaagttcga aaatatgggt gcgcagatgg tgaaagaagt tgcctctaaa 240
gcaaacgacg ctgcaggcga cggtaccacc actgcaaccg tactggctca ggctatcatc 300
actgaaggtc tgaaagctgt tgctgcgggc atgaacccga tggacctgaa acgtggtatc 360
gacaaagcgg ttaccgttgc agttgaagaa ctgaaagcgc tgtccgtacc atgctctgac 420
tctaaagcga ttgctcaggt tggtaccatc tccgctaact ccgacgaaac cgtaggtaaa 480
ctgatcgctg aagcgatgga caaagtcggt aaagaaggcg ttatcaccgt tgaagacggt 540
accggtctgc aggacgaact ggacgtggtt gaaggtatgc agttcgaccg tggctacctg 600
tctccttact tcatcaacaa gccggaaact ggcgcagtag aactggaaag cccgttcatc 660
ctgctggctg acaagaaaat ctccaacatc cgcgaaatgc tgccggttct ggaagctgtt 720
gccaaagcag gcaaaccgct gctgatcatc gctgaagatg tagaaggcga agcgctggca 780
actctggttg ttaacaccat gcgtggcatc gtgaaagtcg ctgcggttaa agcaccgggc 840
ttcggcgatc gtcgtaaagc tatgctgcag gatatcgcaa ccctgactgg cggtaccgtg 900
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gaccgtgaaa aactgcagga acgcgtagcg aaactggcag gcggcgttgc agttatcaaa 1140
gtgggtgctg ctaccgaagt tgaaatgaaa gagaaaaaag cacgcgttga agatgccctg 1200
cacgcgaccc gtgctgcggt agaagaaggc gtggttgctg gtggtggtgt tgcgctgatc 1260
cgcgtagcgt ctaaactggc tgacctgcgt ggtcagaacg aagaccagaa cgtgggtatc 1320
aaagttgcac tgcgtgcaat ggaagctccg ctggagcaga tcgtattgaa ctgcggcgaa 1380
gcgccggcag ctgttgctaa caccgttaaa ggcggcgacg gcaactacgg ttacaacgca 1440
gcaaccgaag aatacggcaa catgatcgac atgggtatcc tggatccaac caaagtaact 1500
cgttctgctc tgcagtacgc agcttctgtg gctggcctga tgatcaccac cgaatgcatg 1560
gttaccgacc tgccgaaaaa cgatgcagct gacttaggcg ctgctggcgg tatgggcggc 1620
atgggtggca tgggcggcat gatgtaa 1647
Claims (14)
- 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌(chaperonin) 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 동물에게 투여함으로써 상기 동물체내에서 상기 융합 유전자를 발현시키고, 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 동물의 면역 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체가 대장균 유래의 것인 동물의 면역 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 유전자가 발현 벡터에 조립되고, 또한 상기 발현 벡터 상의 프로모터에 의해서 발현이 조절되는 동물의 면역 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터, AML 프로모터, SV40 프로모터, SRα 프로모터 또는 EF-1α 프로모터인 동물의 면역 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 발현 벡터가 CpG 모티프를 포함하는 것인 동물의 면역 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 포유류 또는 조류인 동물의 면역 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 포유류가 마우스, 래트, 토끼, 소, 말, 개, 고양이, 염소, 양 또는 돼지인 동물의 면역 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 조류가 닭, 오리 또는 칠면조인 동물의 면역 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 단백질이 G 단백질 결합 수용체, 이온 채널형 수용체, 티로신 키나제형 수용체, CD 항원, 세포 접착 분자, 암 항원, 사이토카인, 성장 인자, 증식 인자, 영양 인자, 바이러스 항원, 세균 항원 또는 독소 항원인 동물의 면역 방법.
- 항원 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자와 샤페로닌 서브유닛 또는 샤페로닌 서브유닛 연결체를 코딩하는 유전자가 연결된 융합 유전자를 주성분으로 하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 동물의 면역 방법에 사용하기 위한 면역용 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 동물의 면역 방법에 의해 동물을 면역시켜 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도하고, 상기 동물에 항원 단백질에 대한 항체를 생산시켜 상기 동물로부터 상기 항체를 채취하는 항체의 제조 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 동물의 면역 방법에 의해 동물을 면역시켜 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도한 후에, 상기 동물로부터 면역 세포를 채취하고, 상기 면역 세포와 골수종 세포를 세포 융합함으로써 항원 단백질에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하는 하이브리도마의 제조 방법.
- 제12항에 기재된 방법으로 제조된 하이브리도마를 배양하고, 배양물로부터 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 채취하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 동물의 면역 방법에 의해 동물을 면역시켜 항원 단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도한 후에, 상기 동물로부터 항체에 대한 mRNA를 제조하고, 상기 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 제조하며, 상기 cDNA를 이용한 파지 디스플레이법에 의해 항원 단백질에 대한 모노클로날 항체를 제조하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
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