WO2006038427A1 - 細胞剥離剤及び細胞シート剥離方法 - Google Patents

細胞剥離剤及び細胞シート剥離方法 Download PDF

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WO2006038427A1
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cell
cell sheet
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poly
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Wanpen Tachaboonyakiat
Masakazu Kato
Tooru Ooya
Nobuhiko Yui
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Japan Science And Technology Agency
Japan Tissue Engineering Co., Ltd.
Japan Advanced Institute Of Science And Technology
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    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a cell release agent and a cell sheet release method.
  • the cell sheet cultured in the container is adhered to the surface of the container, the cell sheet is recovered by using a proteolytic enzyme such as Dispase (registered trademark) to separate it from the surface of the container. It is carried out.
  • a proteolytic enzyme such as Dispase (registered trademark)
  • Dispase registered trademark
  • the extracellular matrix produced by the culture can be decomposed without damaging the cells.
  • Proteolytic enzymes are often animal-derived materials, and there are problems in safety when applied to cell sheets for regenerative medicine.
  • Japanese Patent Publication No. 6-104061 proposes a method of separating and recovering cultured cells adhered to the surface of a container without using a protein degrading enzyme.
  • the present invention employs the following means in order to achieve at least a part of the above-described object.
  • the cell sheet release agent of the present invention contains an aminated poly (oral taxane). According to this cell sheet remover, the cultured cells adhered to the container surface can be detached without damaging the cells and without controlling the temperature.
  • the polyoral taxane that forms the skeleton of the cell detachment agent of the present invention binds a bulky cap that prevents the cyclic molecule from coming off at both ends of the linear molecule in a state where a plurality of cyclic molecules are penetrated through the linear molecule. It has the structure made.
  • the linear molecules include polyethylene glycol, polypropylene glycol, star-shaped polyethylene glycolol, copolymers of polyethylene glycolol and polypropylene glycolol, polybule ether, hyperbranched polyether, hyperbranched oligoethylene.
  • Dalicol hyperbranched oligopropylene glycol, poly (trimethylene oxide), poly ( ⁇ -force prolatatone), polylactic acid, poly ( ⁇ -force prolatatone) and polylactic acid copolymer, polylactic acid and polyethylene glycol copolymer, poly (epsilon - lysine), polyamides, poly (I Mino oligomethylene), ⁇ Ionen, poly (vinyl Zhen chloride), polypropylene, oligo propylene, polyethylene, oligoethylene, poly (alkylene base lens imidazole), polyurethane , Poly (piorogen), poly ( ⁇ dimethyldecamethylene ammonium), poly (dimethylsiloxane), polyaniline, polycarbonate, poly (methyl metatalylate), poly ( ⁇ ethylethyleneimine), polyethyleneimine , Poly (4 birpyridine) dodecylbenzene sulfonate complex, fullerene polyethylene glycol conjugate, hydrophobized
  • the cyclic molecule is preferably ⁇ or ⁇ -cyclodextrin, but it may have a similar cyclic structure.
  • a cyclic polyether may be used.
  • a combination of a linear molecule and a cyclic molecule a combination of hy-cyclodextrin and polyethylene glycol is preferred.
  • the bulky cap may have any structure as long as the cyclic molecule does not come off, but is preferably a biocompatible group having a bulky substituent. It is preferably introduced via a hydrolyzable bond at both ends of the straight linear molecule.
  • the bioaffinity group is a group having a high affinity for a living body (highly safe for a living body). Group) as long as it is a group, for example, an amino acid, oligopeptide, oligosaccharide or sugar derivative is preferred.
  • amino acids examples include alanine, parin, oral cine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, tryptophan, aspartic acid, gnoretamic acid, glycine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, lysine, arginine, histidine and the like. It is done.
  • oligopeptides include those formed by peptide bonding of a plurality of the aforementioned amino acids.
  • oligosaccharides those having a repeating unit of about 1 to 10 and composed of monosaccharides constituting polysaccharides such as dextran, hyanorelonic acid, chitin, chitosan, alginic acid, chondroitin sulfate, and starch, ⁇ , which is a cyclic oligosaccharide, 3 or ⁇ -cyclodextrin, and the like.
  • examples of the sugar derivative include compounds obtained by chemically modifying oligosaccharides, polysaccharides or monosaccharides such as acetylation and isopropinolation.
  • amino acids having a benzene ring such as L-phenylalanine, L-tyrosine, and L-tryptophan are preferred.
  • the bulkiness and substituent may be any group as long as the cyclic molecule can be prevented from falling off from the linear molecule.
  • Preferred is a group having Examples of the group having one or more benzene rings include a benzyloxycarbonyl ( ⁇ ) group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, a benzyl ester ( ⁇ Bz) group, and the like.
  • the group having one or more tertiary butyl groups examples include tert-butylcarbonyl (Boc) group, amino acid tert-butyl ester (OBu group), etc. Among them, benzyloxycarbonyl group is preferred.
  • the hydrolyzable bond is preferably a bond that hydrolyzes in vivo, and is preferably an ester bond in view of rapid non-enzymatic hydrolysis in vivo.
  • the aminated polymouth taxane contained in the cell release agent of the present invention may be a compound in which at least a part of the hydroxyl groups in the cyclodextrin skeleton contained in the polymouth taxane is replaced with a substituent having an amino group.
  • the hydroxyl group in the cyclodextrin skeleton is preferably the hydroxyl group of glucose forming the cyclodextrin skeleton, more preferably the 6-position hydroxyl group of the glucose.
  • the substituent having an amino group is not particularly limited, but -OOCNH-A-NR'R 2 (A is branched and may be a hydrocarbon chain, R 1 and R 2 may be the same or different and may be hydrogen or branched. A hydrocarbon group).
  • A is preferably a hydrocarbon chain which may have a branch having 2 to 4 carbon atoms. For example, — (CH 2) — —CH (CH 2) CH———
  • Rl and R2 are preferably hydrogen or a hydrocarbon group which may have a branch of carbon number:! To 5; examples of the latter hydrocarbon group include a methyl group, an ethyl group, and n- Examples include propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec butyl group, tert butyl group and the like.
  • the -OOCNH part is considered to be a part that acts like a glue, and is not limited to this structure. For example, OCOO OOC- -OCH OC ( ⁇ H) CH OC (
  • the cell peeling agent of the present invention is used for peeling cells (adhesion-dependent cells) adhered to the surface of a container.
  • the adhesion-dependent cells include, for example, chondrocytes, osteoblasts, fibroblasts, epidermal cells, epithelial cells, adipocytes, hepatocytes, knee cells, muscle cells, or progenitor cells thereof, mesenchymal cells, and the like.
  • Examples include stem cells and embryonic stem cells (ES cells).
  • the cell peeling agent of the present invention is suitably used for peeling a cell sheet adhered to the surface of a container, particularly a cell sheet of epidermal cells.
  • the cell sheet is peeled by a culture process in which cells are adhered to the surface of the container and cultured to form a cell sheet, and after this culture process, the medium is replaced with a medium to which the cell sheet stripping agent of the present invention is added. And a peeling step of peeling the cell sheet from the substrate.
  • the repellant medium only needs to be a liquid that does not kill the cells that make up the cell sheet during the detachment process, or a basal medium such as DMEM, or a physiological medium that includes only a growth medium with a growth factor added to the basal medium. It may be a liquid such as saline or phosphate buffer. Further, it may include a recovery step of recovering the detached cell sheet after the peeling step. Here, in the peeling step, the cell sheet may be gradually peeled from the surface of the container while culturing the cells. In the recovery step, the peeled cell sheet may be recovered by attaching it to the suspension support membrane and pulling it up.
  • the supporting membrane for suspension may be any material as long as cells that have reached a predetermined state can be suspended as they are.
  • the supporting membrane for suspension may be any material as long as cells that have reached a predetermined state can be suspended as they are.
  • sterile gauze sterile Japanese paper, sterile filter paper, sterile nonwoven fabric, PVDF Hydrophilic membranes such as membranes (polyvinylidene fluoride membranes) and PTFE membranes (polytetrafluoroethylene membranes), and flexible polymer materials such as silicone rubber are biodegradable materials such as polyglycolic acid and polylactic acid. Examples include a sheet of a polymer, an agar medium, a hydrogen gel such as a collagen gel or a gelatin gel.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram showing a procedure for synthesizing an aminated polyortaxane.
  • a polymouth taxane (see FIG. 1) was synthesized by the following procedure.
  • PEG Polyethylene glycol
  • toluene (220 ml)
  • succinic anhydride (2 Og, 200 mmol)
  • toluene 220 ml
  • succinic anhydride 2 Og, 200 mmol
  • the mixture was poured into excess jetyl ether, filtered and dried under reduced pressure to obtain a crude product. This is dissolved in dichloromethane, insolubles are removed by centrifugation, poured into excess jetyl ether, filtered and dried under reduced pressure, and then PEG (compound A) having carboxyl groups at both ends as white powder. Obtained.
  • This compound A (20 g, 5.7 mmol) and N-hydroxysuccinimide (HOSu) (17. lg, 148.2 mmol) are dissolved in a mixed solution of 1,4-dioxane and dichloromethane (350 ml, volume ratio 1: 1). After cooling with ice, dicyclohexenolecarbodiimide (DCC) (23.5 g, 114 mmol) was added. The mixture was stirred for 1 hour with cooling on ice, and then stirred overnight at room temperature. The by-product dicyclohexylenourea was filtered off and the filtrate was concentrated and poured into excess jetyl ether.
  • DCC dicyclohexenolecarbodiimide
  • [1_2] pseudopolyrotaxane An aqueous solution (20 ml) of compound C (4 g, 1.12 mmol) was added dropwise at room temperature to a saturated aqueous solution (31 lml) of ⁇ -cyclodextrin (Hiichi CD) (48 g, 49.2 mmol). The mixture was stirred for 1 hour while being irradiated with ultrasonic waves, and then stirred at room temperature for 24 hours. White precipitates were collected by centrifugation and dried under reduced pressure at 50 ° C. to obtain a white powder pseudopolyrotaxane.
  • Hiichi CD ⁇ -cyclodextrin
  • Polyrotaxane refers to a product in which a linear molecule (eg, PEG) penetrates a large number of cyclic molecules (eg, cyclodextrin) and both ends of the linear molecule are capped with bulky substituents.
  • a linear molecule eg, PEG
  • cyclic molecules eg, cyclodextrin
  • poly (oral) taxane means that both ends of the poly (oral) taxane are not yet capped with bulky substituents.
  • Z—L Phe Z represents a benzyloxycarbonyl group
  • Z— The carboxyl group of L—Phe was activated. That is, Z-L Phe (100 g, 334 mmol) was dissolved in 1,4 dioxane (800 ml), and HOSu (38.42 g, 334 mmol) was calorie-free while cooling with ice.
  • Degradable poly (taxataxane) was obtained as a white powder. The synthesis was confirmed by NMR. Also this The number of pierced CDs of the polymouth taxane was 17 as determined from the integral ratio of the proton of PEG and the proton at the 1st position of C (carbon) of HI-CD in 1 H-NMR.
  • aminated polyortaxane a sulfonated polyortaxane, and a carboxylated polyortaxane were prepared as follows.
  • -PRlg (0. 029 mmol) was dissolved in 20 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), and an excess amount of amination reagent was added thereto, followed by stirring at room temperature for 3 hours. Thereafter, the reaction solution was poured into an excessive amount of jetyl ether, and the resulting precipitate was washed with the same solvent to obtain the desired amino polypolytaxane.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the amino reagent the one using 1,2-diaminopropane was designated as sample No. 1 (16 introduced amines and one CD penetration number 17), and the one using 1,3 -diaminopropane.
  • sample No. 3 (guided amine number)
  • Sample No. 4 (number of introduced amines 128, a-CD penetration number 17) was determined using 158, one CD penetration number 17), and N, N_dimethinole 1,3-diaminopropane.
  • a carboxynoleylated poly (oral) taxane was prepared by the following procedure. That is, in accordance with Example 1, a poly (taxane) taxane in which both ends of PEG (molecular weight 4000) penetrating a large number of CD cavities was capped with Z-tyrosine was prepared. This polytaxane with succinic anhydride A water-soluble carboxylated poly (taxane) taxane (with introduced CEE number 188, a-CD penetration number 15) was synthesized by stealization. This carboxylated polymouth taxane was designated as Sample No. 5.
  • a sulfonated polymouth taxane was prepared by the following procedure. That is, taurine was introduced into the carboxynolelated polydioxytaxane synthesized as described above using water-soluble carpositimide as a condensing agent to obtain a sulfonated polydioxytaxane (number of introduced taurines 1 17, a- Number of CDs 9).
  • This sulfonated polymouth taxane was designated as Sample No. 6.
  • the polymouth taxane of Example 1 was designated as Sampnore No. 7. Table 1 below shows the structural characteristics of each sample.
  • the cell detachment test was performed for the polymouth taxane of each sample according to the following procedure. That is, after accurately weighing each sample polypolytaxane, 70% ethanol was added to prepare a 20 Om / mL solution or suspension. Then, prepare a dilution series of 0.020 mg / mL in 70% ethanol, add 100 zL each to a 96-well plate, and It was dried in a fan in the air overnight.
  • NIH3T3 cell suspension (high density conditions: 3 X 10 5 cells ZmL, medium density conditions: 9 X 10 4 cells / mL, low density condition: 3 ⁇ 10 4 cellsZmL) was added 100 L at a time.
  • the final polymouth taxane concentrations are 0.01, 0.1, 1, lOmg / mL, and the NIH3 T3 cell density is 1, 3, 10 X 10 4 cells / cm 2 . After that, 5% CO, 37 ° C
  • the cells were cultured for up to 8 days and observed under a microscope.
  • the concentration was 10 mg / mL and the seeding density was a medium / high density condition
  • cell colonies aggregated and a large number of small spheroids were formed after the first day of culture. Because of this, the sheet colony's sheet contraction force at the stage of colony formation, where the amount of the aminated polymouth taxane and the cell is large, compared to the case where a single spheroid is formed by peeling into a sheet. It is surmised that the adhesive strength between the plate surface and the cells exceeded.
  • the above cell detachment test is the one in which the culturing step and the detachment step are performed simultaneously.
  • the aminated polymouth taxane is added immediately before becoming confluent in the culturing step, the cells proliferate.
  • a PVDF membrane polyvinylidene fluoride membrane
  • the cell sheet is brought into contact with the PV DF membrane, and then the membrane is pulled up. By this, it is possible to peel and collect the cell sheet.
  • the present invention can be used in the field of regenerative medicine.

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Abstract

　本発明の細胞シート剥離剤は、アミノ化ポリロタキサンを含有するものである。ここで、本発明の細胞剥離剤の骨格をなすポリロタキサンは、線状分子に環状分子を複数貫通した状態で線状分子の両端に環状分子が外れないような嵩高いキャップを結合させた構造を有している。また、本発明の細胞剥離剤に含まれるアミノ化ポリロタキサンは、ポリロタキサンに含まれるシクロデキストリン骨格中の少なくとも一部の水酸基がアミノ基を有する置換基で置換された化合物である。この細胞シート剥離剤によれば、細胞にダメージを与えることなく、また、温度をコントロールすることなく容器表面に接着した培養細胞を剥離することができる。

Description

明 細 書
細胞剥離剤及び細胞シート剥離方法
技術分野
[0001] 本発明は、細胞剥離剤及び細胞シート剥離方法に関する。
背景技術
[0002] 容器内で培養した細胞シートは容器表面に接着しているため、この細胞シートを回 収するにはデイスパーゼ (登録商標）のようなタンパク分解酵素を用いて容器表面か ら剥離する操作を行っている。このようなタンパク分解酵素を用いた剥離操作では、 細胞にダメージを与えるだけでなぐ培養にともなって産生された細胞外マトリクスも 分解してしまうことがある。また、タンパク分解酵素は動物由来材料である場合が多く 、再生医療用の細胞シートへ応用する場合、安全性に課題がある。この点に鑑み、 例えば特公平 6— 104061号公報では、容器表面に接着した培養細胞をタンパク分 解酵素を用いることなく剥離させて回収する方法が提案されている。即ち、表面をポ リ一 N—イソプロピルアクリルアミドで被覆したペトリ皿を用意し、このペトリ皿上にてゥ シの大動脈の血管内細胞の培養を 37°Cでおこなった後、 4°Cに冷却することにより ペトリ皿の表面を疎水性から親水性に変化させ、培養細胞を剥離させて回収してレ、 る。
発明の開示
[0003] し力しながら、上述した公報では、培養細胞を剥離させるには温度をコントロールす ることが必要になるため、操作が簡便であるとは言いにくかった。
[0004] 本発明は、容器表面に接着した細胞を簡便な操作により剥離可能な細胞剥離剤を 提供することを目的の一つとする。また、この細胞剥離剤を用いて容器表面に接着し た細胞シートを剥離する方法を提供することを目的の一つとする。
[0005] 本発明は、上述の目的の少なくとも一部を達成するために以下の手段を採った。
[0006] 本発明の細胞シート剥離剤は、アミノ化ポリ口タキサンを含有するものである。この 細胞シート剥離剤によれば、細胞にダメージを与えることなぐまた、温度をコントロー ルすることなく容器表面に接着した培養細胞を剥離することができる。 [0007] 本発明の細胞剥離剤の骨格をなすポリ口タキサンは、線状分子に環状分子を複数 貫通させた状態で線状分子の両端に環状分子が外れないような嵩高いキャップを結 合させた構造を有している。
[0008] ここで、線状分子としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、星形 ポリエチレングリコーノレ、ポリエチレングリコーノレとポリプロピレングリコーノレとの共重合 体、ポリビュルエーテル、高分岐ポリエーテル、高分岐オリゴエチレンダリコール、高 分岐オリゴプロピレングリコール、ポリ（トリメチレンォキシド）、ポリ（ ε—力プロラタトン） 、ポリ乳酸、ポリ（ ε—力プロラタトン）とポリ乳酸の共重合体、ポリ乳酸とポリエチレン グリコールとの共重合体、ポリ（ ε—リジン）、ポリアミド、ポリ（ィミノオリゴメチレン）、ァ ィォネン、ポリ（ビニルジェンクロリド）、ポリプロピレン、オリゴプロピレン、ポリエチレン 、オリゴエチレン、ポリ（アルキレンべンズイミダゾール）、ポリウレタン、ポリ（ピオロゲン )、ポリ（Ν ジメチルデカメチレンアンモニゥム）、ポリ（ジメチルシロキサン）、ポリア二 リン、ポリカーボネート、ポリ（メチルメタタリレート）、ポリ（Ν ァシルエチレンィミン）、 ポリエチレンィミン、ポリ（4 ビエルピリジン）ードデシルベンゼンスルホン酸複合体、 フラーレン ポリエチレングリコール結合体、疎水化多糖、ポリエチレングリコール 多糖グラフト共重合体、ポリプロピレングリコール 多糖グラフト共重合体、ジフエ二 ルへキサトリェンからなる群より選ばれる一種又は二種以上であることが好ましい。こ の,乎泉状分子の平均分子量は、 200〜1000000であること力好ましく、 400〜50000 であることがより好まし 1000〜5000であること力 S特に好ましレヽ。
[0009] また、環状分子としては、 ひ、 β又は γ—シクロデキストリンであることが好ましいが 、これと類似の環状構造を持つものであってもよぐそのような環状構造としては環状 ポリエーテル、環状ポリエステル、環状ポリエーテルァミン、環状ポリアミン等が挙げら れる。線状分子と環状分子の組み合わせとしては、 ひ—シクロデキストリンとポリェチ レングリコールとの組合せが好ましレ、。
[0010] また、嵩高いキャップは、環状分子が外れないような構造を有していればどのような ものであってもよいが、嵩高い置換基を有する生体親和性基であることが好ましぐ線 状分子の両末端に加水分解性結合を介して導入されていることが好ましい。ここで、 生体親和性基としては、生体に対する親和性が高い基（生体に対して安全性の高い 基）であればどのような基であってもよいが、例えばアミノ酸、オリゴペプチド、オリゴ糖 類又は糖誘導体であることが好ましい。アミノ酸としては、例えばァラニン、パリン、口 イシン、イソロイシン、メチォニン、プロリン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、ァスパラ ギン酸、グノレタミン酸、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン、リジン、ァ ルギニン、ヒスチジン等が挙げられる。また、オリゴペプチドとしては、前出のアミノ酸 の複数がペプチド結合して形成されたもの等が挙げられる。また、オリゴ糖類としては 、繰り返し単位が 1〜： 10程度であって、デキストラン、ヒアノレロン酸、キチン、キトサン、 アルギン酸、コンドロイチン硫酸、でんぷん等の多糖類を構成する単糖によって構成 されたものや、環状オリゴ糖である α、 ；3又は γ—シクロデキストリン等が挙げられる 。更に、糖誘導体としては、オリゴ糖類、多糖又は単糖をァセチル化ゃイソプロピノレ 化等の化学修飾した化合物等が挙げられる。このうち、ベンゼン環を有するアミノ酸、 例えば L—フエ二ルァラニン、 L—チロシン、 L—トリプトファン等が好ましい。また、嵩 高レ、置換基としては、線状分子から環状分子が抜け落ちるのを防止できればどのよう な基であってもよいが、例えば 1以上のベンゼン環を有する基又は 1以上の第三ブチ ルを有する基が好ましい。 1以上のベンゼン環を有する基としては、例えばべンジル ォキシカルボニル（Ζ)基、 9ーフレオレニルメチルォキシカルボニル（Fmoc)基、ベン ジルエステル（〇Bz)基等が挙げられ、また、 1以上の第三ブチルを有する基としては 、第三ブチルカルボニル（Boc)基、アミノ酸 tert—ブチルエステル（OBu基）等が挙 げられる力 このうち、ベンジルォキシカルボニル基が好ましレ、。また、加水分解性結 合としては、生体内で加水分解する結合であることが好ましぐ生体内で速やかに非 酵素的に加水分解することを考慮すればエステル結合であることが好ましい。
本発明の細胞剥離剤に含まれるアミノ化ポリ口タキサンは、ポリ口タキサンに含まれ るシクロデキストリン骨格中の少なくとも一部の水酸基がアミノ基を有する置換基で置 換された化合物であればよレ、。ここで、シクロデキストリン骨格中の水酸基は、シクロ デキストリン骨格をなすグルコースの水酸基であることが好ましぐ該グルコースの 6位 の水酸基であることがより好ましい。また、アミノ基を有する置換基は、特に限定され るものではなレ、が、 - OOCNH-A-NR'R2 (Aは分岐を有してレ、てもよレ、炭化水素 鎖、 R1及び R2は同じであっても異なってレ、てもよく水素又は分岐を有してレ、てもよレヽ 炭化水素基）であることが好ましい。ここで、 Aは、炭素数 2〜4の分岐を有していても よい炭化水素鎖であることが好ましぐ例えば—（CH ) ― -CH (CH ) CH― -
CH CH (CH )―、一（CH ) ―、 -CH (CH CH ) CH―、一 CH CH (CH CH ) 一、 -CH (CH ) CH CH一、 -CH CH (CH ) CH一、一 CH CH CH (CH )—、
- (CH ) —などが挙げられる。 Rl及び R2は、水素又は炭素数:!〜 5の分岐を有し ていてもよい炭化水素基であることが好ましぐ後者の炭化水素基としては、例えばメ チル基、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブチル基、イソブチル基、 s ec ブチル基、 tert ブチル基などが挙げられる。なお、― OOCNH の部位は糊 代（のりしろ）のような役割をする部位と考えられるため、この構造に限られるものでは なぐ例えば、 OCOO OOC— -OCH OC (〇H) CH OC (
= S) NH などであってもよい。
[0012] 本発明の細胞剥離剤は、容器表面に接着した細胞 (接着依存性細胞）を剥離する のに用いられる。ここで、接着依存性細胞としては、例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、 線維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、膝細胞、筋細胞又はこれら の前駆細胞や、間葉系幹細胞、胚性幹細胞 (ES細胞)等が挙げられる。
[0013] 本発明の細胞剥離剤は、容器表面に接着した細胞シート、特に表皮細胞の細胞シ ートを剥離するのに好適に用いられる。細胞シートを剥離する方法は、容器表面に細 胞を接着させて培養して細胞シートにする培養工程と、この培養工程のあと本発明 の細胞シート剥離剤を添加した培地に交換して容器表面から細胞シートを剥離させ る剥離工程とを含むものとしてもよレ、。ここでレ、う培地とは、剥離工程中に細胞シート を構成する細胞を死滅させない液体であればよぐ DMEMなどの基礎培地や、基礎 培地に増殖因子を添加した増殖用培地だけでなぐ生理食塩水やリン酸緩衝液など の液体であってもよい。また、剥離工程のあと剥離した細胞シートを回収する回収ェ 程を含むものとしてもよい。ここで、剥離工程では、細胞を培養しつつ容器表面から 徐々に細胞シートを剥離させてもよい。また、回収工程では、剥離した細胞シートを 懸架用支持膜に付着させて引き上げることにより回収してもよい。ここで、懸架用支持 膜とは、所定状態に達した細胞をほぼそのまま懸架できるものであればいずれのもの でもよく、たとえば、滅菌ガーゼ、滅菌和紙、滅菌濾紙、滅菌不織布のほか、 PVDF 膜 (ポリフッ化ビニリデン膜)や PTFE膜 (ポリテトラフルォロヱチレン膜)等の親水性 膜や、シリコーンゴムなどの柔軟性のある高分子材料ゃポリグリコール酸、ポリ乳酸な どの生分解性ポリマーや寒天培地やコラーゲンゲル、ゼラチンゲルなどのハイドロゲ ルなどをシート状にしたものなどが挙げられる。 図面の簡単な説明
[0014] [図 1]アミノ化ポリ口タキサンの合成手順を表す説明図である。
実施例
[0015] [実施例 1]
ポリ口タキサン（図 1参照）を以下の手順により合成した。
[0016] [1一 1]エステル結合を介して両末端にアミノ基を有する PEGの合成
分子量 3300のポリエチレングリコール（PEG) (33g， lOmmol)と無水コハク酸（2 Og， 200mmol)をトノレェン（220ml)に溶解させ、この溶液を 150°Cで 5時間還流さ せた。反応終了後、過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別'減圧乾燥して粗生 成物を得た。これをジクロロメタンに溶解させ、不溶物を遠心分離により除去し、過剰 のジェチルエーテルに注ぎ込んで、濾別'減圧乾燥後に両末端にカルボキシル基を 有する PEG (ィ匕合物 A)を白色粉末として得た。この化合物 A(20g, 5. 7mmol)と N ーヒドロキシスクシンイミド（HOSu) (17. lg, 148. 2mmol)を 1, 4ージォキサンとジ クロロメタンの混合溶液（350ml,体積比 1： 1)に溶解させ、氷冷後ジシクロへキシノレ カルボジイミド（DCC) (23. 5g, 114mmol)を加えた。氷冷したまま 1時間攪拌し、 その後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロへキシノレウレァを濾別し、濾液は 濃縮してから過剰のジェチルエーテルに注ぎ込んだ。濾別'減圧乾燥後にカルボキ シル基が活性化された PEG (ィ匕合物 B)を白色粉末として得た。次いで、エチレンジ ァミン（0. 4ml, 6mmol)を溶解させたジクロロメタン（75ml)に、化合物 B (10g， 2. 7mmol)を溶解させたジクロロメタン（75ml)を滴下し、滴下終了後から室温で 1時間 攪拌した。反応終了後、溶液を過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別 '減圧乾 燥後に両末端にアミノ基を有する PEG (化合物 C)を白色粉末として得た。
[0017] [1 _ 2]擬ポリロタキサンの調製 α—シクロデキストリン（ひ一CD) (48g, 49. 2mmol)の飽和水溶液（31 lml)に 化合物 C (4g， 1. 12mmol)の水溶液（20ml)を室温で滴下した。 1時間超音波を照 射しながら攪拌し、その後室温で 24時間攪拌した。遠心分離により白色の沈殿物を 回収し、 50°Cで減圧乾燥を行い、白色粉末の擬ポリロタキサンを得た。なお、ポリロタ キサンとは、多数の環状分子（例えばシクロデキストリン）に線状分子 (例えば PEG) が貫通し、その線状分子の両末端を嵩高い置換基でキャップしたものをレ、い、擬ポリ 口タキサンとは、ポリ口タキサンの両末端を未だ嵩高い置換基でキャップしていないも のをいう。
[0018] [ 1 3]末端キャップ剤の調製
a CDの脱離を防止する嵩高レ、置換基としてべンジルォキシカルボニル Lーフ ェニルァラニン（Z— L Phe、 Zはべンジルォキシカルボ二ル基を表す）を導入する ために、 Z— L— Pheのカルボキシル基の活性化を行った。すなわち、 Z— L Phe ( 100g, 334mmol)を 1 , 4 ジォキサン（800ml)に溶解させ、氷冷しながら HOSu ( 38. 42g, 334mmol)をカロ免た。 1時間後に DCC (75. 7g, 367mmol)を溶角军させ た 1 , 4 ジォキサン溶液（200ml)をゆっくり加え、氷冷したまま 1時間攪拌し、その 後室温で終夜攪拌した。副生成物のジシクロへキシルウレァを濾別し、濾液は濃縮し てから過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、濾別'減圧乾燥後に粗生成物を得た。 室温でできるだけ飽和濃度になるように粗生成物をジクロロメタンに溶解させた後、 石油エーテルを適量カ卩ぇ冷蔵し、再結晶を行った。結晶を濾別 ·減圧乾燥して白色 針状結晶の Z _ L - Pheのスクシンイミドエステル（Z _ L _ Phe - OSu)を得た。
[0019] [ 1 _4]ポリ口タキサンの調製
Z-L- Phe - OSu (80g, 200mmol)をジメチルスルフォキシド（DMS〇） (60ml )に溶解させ、擬ポリロタキサン（45g、 2mmol)を加えた。この不均一溶液を室温で 攪拌しながら、均一になるように少しずつ DMSOをカ卩えて 96時間攪拌した。反応終 了後、反応溶液を過剰のジェチルエーテルに注ぎ込み、粗生成物を得た。粗生成 物をアセトン、ジメチルホルムアミド（DMF)の順で洗浄して不純物（未反応 Z— L— P he - OSu, a _ CD、化合物 Cなど）を除去し、濾別 '減圧乾燥して生分解性のポリ口 タキサンを白色粉末として得た。合成の確認は、 NMRにより行った。また、この ポリ口タキサンのひ一CD貫通数を1 H— NMRでの PEGのプロトンとひ一CDの C (炭 素）の 1位のプロトンとの積分比から求めたところ、 17であった。
[0020] [実施例 2]
CDI活性化ポリ口タキサンを以下の手順により調製した。即ち、実施例 1で得られた ポリ口タキサン（lg， 0. 0369mol, CD = 0. 871mmol,〇H = 15. 6mmol)を DM SO ( 10ml)に窒素雰囲気下で溶解させ、 N, N，—カルボニルジイミダゾール（CDI) 2. 54g ( 15. 6mmol ;ポリ口タキサン中の水酸基と等量）を加え、窒素雰囲気下室温 で反応を行い、 3時間経過後エーテルに滴下して白色沈殿物を生成させ、これをろ 過し室温で減圧乾燥して白色粉末の CDI活性化ポリ口タキサン（CDI— PR)を得た。 この CDI— PRの活性化率を紫外吸光分光計を用いて 207nmの吸光度から算出し たところ、 91. 37%であった。
[0021] [実施例 3]
アミノ化ポリ口タキサンゃスルフォン化ポリ口タキサン、カルボキシル化ポリ口タキサン を以下のようにして調製した。
[0022] アミノ化ポリ口タキサンを以下の手順により調製した。即ち、実施例 2で得られた CDI
- PRlg (0. 029mmol)を 20mlのジメチルスルホキシド（DMSO)に溶解し、ここに 過剰量のアミノ化試薬をカ卩え、室温にて 3時間攪拌した。その後、反応溶液を過剰量 のジェチルエーテルに投じ、得られた沈殿物を同様の溶媒で洗浄後、 目的とするァ ミノ化ポリ口タキサンを得た。ここで、アミノィ匕試薬として、 1 , 2—ジァミノプロパンを使 用したものをサンプル No. 1 (導入されたァミン数 16， ひ一CD貫通数 17)とし、 1 , 3 —ジァミノプロパンを使用したものをサンプル No. 2 (導入されたァミン数 38, a - C D貫通数 17)とし、 N, N—ジメチル一1 , 2—ジアミノエタンを使用したものをサンプ ノレ No. 3 (導人されたァミン数 158， ひ一CD貫通数 17)とし、 N， N _ジメチノレ一 1， 3 —ジァミノプロパンを使用したものをサンプル No. 4 (導入されたァミン数 128, a - CD貫通数 17)とした。
[0023] カルボキシノレ化ポリ口タキサンを以下の手順により調製した。即ち、実施例 1に準じ て、多数のひ— CD空洞部を貫通した PEG (分子量 4000)の両末端を Z—チロシン でキャップしたポリ口タキサンを調製した。このポリ口タキサンの無水コハク酸によるェ ステル化により、 ひ— CD水酸基にカルボキシェチルエステル（CEE)基を導入した 水溶性のカルボキシル化ポリ口タキサン（導入された CEE数 188， a—CD貫通数 1 5)を合成した。このカルボキシル化ポリ口タキサンをサンプル No. 5とした。
[0024] スルホン化ポリ口タキサンを以下の手順により調製した。即ち、上述のように合成し たカルボキシノレ化ポリ口タキサンに水溶性カルポジイミドを縮合剤として用いてタウリ ンを導入し、スルホン化ポリ口タキサンを得た（導入されたタウリン数 1 17, a—CD貫 通数 9)。このスルホン化ポリ口タキサンをサンプル No. 6とした。なお、実施例 1のポリ 口タキサンをサンプノレ No. 7とした。下記表 1に各サンプルの構造的特徴を示す。
[0025] [表 1]
Figure imgf000011_0001
[実施例 4]
各サンプルのポリ口タキサンにつき、細胞剥離試験を以下の手順により行った。即 ち、各サンプルのポリ口タキサンを正確に秤量した後、 70%エタノールを加えて、 20 Om/mLの溶液あるいは懸濁液を調製した。その後、 70%エタノールで 0. 02 20 mg/mLの希釈系列を調製し、 96穴プレートに 100 z Lずつ添カロして、クリーンベン チ内にて一晩送風状態で乾燥させた。細胞増殖用培地 100 x Lを添加し、 1時間攪 拌してポリ口タキサンを再溶解後、 NIH3T3細胞懸濁液（高密度条件： 3 X 105cells ZmL、中密度条件：9 X 104cells/mL、低密度条件：3 X 104cellsZmL、）を 100 Lずつ添カロした。最終ポリ口タキサン濃度は 0. 01， 0. 1 , 1 , lOmg/mL, NIH3 T3細胞密度は 1 , 3, 10 X 104cells/cm2である。その後、 5%CO、 37°Cとレ、ぅ条
2
件下で 8日まで培養し、顕微鏡下所見を観察した。
[0027] その結果、カルボキシル化ポリ口タキサン（サンプル No. 5)、スルホン化ポリ口タキ サン（サンプル No. 6)及び α— CD水酸基が無置換のポリ口タキサン（サンプル No. 7)を含む培地においては、播種密度にかかわらず、濃度が lmg/mL以下ではプレ ート面に接着して増殖するのみで剥離はみられず、濃度が 10mg/mLでは細胞が 接着せず増殖しなかった。
[0028] これに対して、 1級ァミンを導入したアミノ化ポリ口タキサン（サンプル No. 1 , 2)にお いては、濃度が 0. ：!〜 lmg/mLで播種密度が中'高密度条件の場合、培養 3日目 までに細胞がシート状に増殖して剥離し、更には収縮して 1個のスフヱロイドが形成さ れた。このこと力ら、アミノ化ポリ口タキサンが細胞に弱く結合してプレート面への細胞 の接着を部分的に阻害し、シート形成後には細胞シートの収縮力がプレート面と細 胞との接着力を上回り、シート状に剥離したと推測される。このため、スフエロイドが形 成される前のシート状の段階で細胞シート支持体を用いて細胞シートを回収すること が可能である。また、同ァミノ化ポリ口タキサンにおいて、濃度が 10mg/mLで播種 密度が中'高密度条件の場合、培養 1日めで細胞コロニーが凝集して多数の小スフ ヱロイドが形成された。このこと力ら、シート状に剥離して 1個のスフヱロイドが形成さ れる場合に比べて、アミノ化ポリ口タキサンと細胞との結合量が多ぐ小さなコロニー 形成の段階で細胞コロニーのシート収縮力がプレート面と細胞との接着力を上回つ たと推測される。
[0029] 一方、 3級ァミンを導入したアミノ化ポリ口タキサン（サンプル No. 3， 4)においては 、濃度が 10mg/mLで高密度条件の場合、培養 2, 3日めまでに細胞コロニーが凝 集して多数の小スフエロイドが形成され、同濃度で中'低密度条件の場合、プレート 面に接着して細胞が増殖するのみであった。このこと力ら、 3級ァミンを導入したァミノ 化ポリ口タキサンは、 1級ァミンを導入したアミノ化ポリ口タキサンに比べて細胞との接 着性が弱いと推測される。
[0030] 以上の細胞剥離試験は、培養工程と剥離工程とを同時に進行させたものであるが 、培養工程においてコンフルェントになる直前にアミノ化ポリ口タキサンを添カ卩すれば 、細胞が増殖してシート状になりつつシート収縮力により容器表面から剥離するため 、例えば親水処理した PVDF膜 (ポリフッ化ビニリデン膜）を上方から落とし、この PV DF膜に細胞シートを接触させたあと膜ごと引き上げることにより、細胞シートを剥離- 回収すること力 Sできる。
[0031] なお、本発明は、 2004年 9月 30日に出願された日本国特許出願 2004— 28616 3号を優先権主張の基礎としており、その内容のすべてが編入される。 産業上の利用の可能性
[0032] 本発明は、再生医療分野に利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] アミノ化ポリ口タキサンを含有する細胞剥離剤。
[2] 前記アミノ化ポリ口タキサンは、ポリ口タキサンに含まれるシクロデキストリン骨格中の 少なくとも一部の水酸基がアミノ基を有する置換基で置換された化合物である、請求 項 1に記載の細胞剥離剤。
[3] 前記ポリ口タキサンは、線状分子に環状分子を複数貫通した状態で線状分子の両端 に加水分解性結合を介して嵩高い置換基を有する生体親和性基が導入された化合 物である、請求項 2に記載の細胞剥離剤。
[4] 前記アミノ基を有する置換基は、— OOCNH— A— NI^R^Aは分岐を有していても よい炭化水素鎖、 R1及び R2は同じであっても異なっていてもよく水素又は分岐を有し ていてもよい炭化水素基）である、請求項 2又は 3に記載の細胞剥離剤。
[5] Aは、炭素数 2〜4の分岐を有してレ、てもよレ、炭化水素鎖である、請求項 4に記載の 細胞剥離剤。
[6] R1及び R2は、同じであっても互いに異なっていてもよく水素又は炭素数 1〜5の分岐 を有していてもよい炭化水素基である、請求項 4又は 5に記載の細胞剥離剤。
[7] 容器表面に接着した細胞シートを剥離するのに用いられる、請求項:!〜 6のいずれか に記載の細胞剥離剤。
[8] 容器表面に細胞を接着させて培養して細胞シートにする培養工程と、
前記培養工程のあと請求項 7に記載の細胞シート剥離剤を添加した培地に交換し て前記容器表面から前記細胞シートを剥離させる剥離工程と、
を含む細胞シート剥離方法。
[9] 請求項 8に記載の細胞シート剥離方法であって、
前記剥離工程のあと前記剥離した細胞シートを回収する回収工程、
を含む細胞シート剥離方法。
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