WO2005116242A1 - 医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システム - Google Patents

医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システム Download PDF

Info

Publication number
WO2005116242A1
WO2005116242A1 PCT/JP2005/009938 JP2005009938W WO2005116242A1 WO 2005116242 A1 WO2005116242 A1 WO 2005116242A1 JP 2005009938 W JP2005009938 W JP 2005009938W WO 2005116242 A1 WO2005116242 A1 WO 2005116242A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
solution
measurement
drug
voltage
electrode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/009938
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuhiko Ozaki
Hiroaki Oka
Haruaki Nakaya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chiba University NUC
Panasonic Holdings Corp
Original Assignee
Chiba University NUC
Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiba University NUC, Matsushita Electric Industrial Co Ltd filed Critical Chiba University NUC
Priority to JP2006513999A priority Critical patent/JPWO2005116242A1/ja
Publication of WO2005116242A1 publication Critical patent/WO2005116242A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention relates to a drug safety test method and a drug safety test system for judging the danger of a test drug to a sample cell containing a HERG channel that causes arrhythmia.
  • proarrhythmic effects of pharmaceuticals have become a major problem.
  • This proarrhythmic effect is called drug-induced long QT syndrome (or acquired long QT syndrome), where the drug acts on ion channels on cardiomyocytes, prolonging the QT interval in the electrocardiogram, and causing severe arrhythmias.
  • Drug-induced prolongation of QT though less frequent, can cause severe side effects, such as torsades de pointes s ventricular tachycardia and sudden death.
  • the antihistamines terfenadine and astemizole are known to inhibit the delayed rectifier potassium ion channel and prolong the action potential, and ventricular tachycardia and sudden death have been reported.
  • the target ion channel that causes QT prolongation is said to be a delayed rectifier potassium channel.
  • Wild-type cells such as cardiomyocytes contain various ion channels in addition to delayed rectifier potassium channels.
  • the most sensitive and highly reliable method at present is the evaluation method, and the HERG (Human Enter-a-gogo-Related Gene) channel, which is a typical delayed rectifier potassium channel, is
  • a notch clamp method is used to perform electrophysiological evaluation using a system in which a host cell such as an oocyte of a lell or a cultured cell of a mammal such as HEK293 or CHO is forcibly expressed by a gene transfer technique as a sample cell.
  • HERG ionchia introduced into African omega frog oocytes Since the sensitivity of flannel is reduced, the system expressed in cultured mammalian cells can be a more reliable and evaluation method.
  • a drug candidate conjugate having a risk antagonizes the HERG ion channel.
  • HERG channel antagonism prevents the entry and exit of potassium ions and prevents repolarization. This series of actions is the mechanism that causes QT prolongation by the drug.
  • a common feature of drug candidate compounds having this danger is that once they antagonize the HERG channel, they are open channel antagonists that get stuck in pores, which are the entrances and exits of ions of the HERG channel, and do not escape.
  • All of the planar patch clamp sensors disclosed in Patent Documents 1 to 4 guide a subject cell to a through hole provided in a flat substrate in a solution close to the composition of the salt concentration in a living body. After the cells are placed in close contact with the through-hole (giga seal) by negative pressure, the cell membrane in the area in contact with the through-hole is broken by further negative pressure suction, so that the current passing through the cell membrane is applied to both sides of the membrane.
  • the measurement is performed with the arranged non-polarizable electrode (typically a silver monochloride electrode), that is, a measurement electrode and a reference electrode.
  • a current passing through an ion channel when an electric potential difference inside and outside a cell membrane is artificially held at a certain set value is measured.
  • an example of a specific protocol of a conventional test method using cells having a HERG ion channel, which is one of the target channels, is shown.
  • the measurement electrode side On the measurement electrode side, a solution inside the cell and a pseudo electrode in which the salt concentration and osmotic pressure were artificially adjusted were filled. Then, the reference electrode side is filled with extracellular solution containing artificial cell whose salt concentration and osmotic pressure are artificially prepared, and these two types are used.
  • the potential inside the cell is artificially held at -80 mV using the feedback mechanism of the measurement electrode. Then, the potential inside the cell is artificially increased from -80 mV to +20 mV stepwise, and held at that potential for 1.5 seconds, and then the potential inside the cell is artificially stepped again from +20 mV to -50 mV. To lower.
  • the magnitude of the outward current flowing when this is lowered can be treated as the flow of ions flowing through the HERG channel, and the safety of the drug under test is determined using the above current peak value as an index.
  • the danger of the drug is determined by measuring the current flowing outward through the membrane when the voltage inside and outside the cell is transiently changed in the absence of the candidate drug having the risk,
  • the QT prolongation is determined based on the decrease in the outward current when the voltage inside and outside the cell is repeatedly changed transiently in the presence of the candidate drug.
  • Non-Patent Document 3 measurement using a simulated intracellular solution to which an artificial component such as a calcium chelating agent is added has a small contribution to QT prolongation and enhances L-type calcium channel current. It has been reported that the current in the delayed rectifier potassium channel, the dominant factor causing QT prolongation, has decreased. This is due to the fact that various biomolecules responsible for intracellular communication exist in the original intracellular solution of cells, but the pseudo-internal solution cannot reproduce them faithfully.
  • Patent Document 2 improvements have been made to suppress the outflow of intracellular functional substances by using a pore-forming chemical substance such as amphotensin ⁇ . .
  • a pore-forming chemical substance such as amphotensin ⁇ .
  • the measurement state is in vitro, and that it is an ideal measurement system using the HERG ion channel expression system.
  • artificial potential It is a big problem to evaluate in the measurement state using the stimulation protocol.
  • Patent Document 1 a planar substrate sensor that determines the chemical substance discriminating ability of ion channels on cells based on a measurement principle different from those of the planar patch clamp sensors disclosed in Patent Documents 1 to 4 has already been disclosed (Patent Document 1). Reference 5).
  • the flat substrate sensor disclosed in Patent Document 5 has a through hole as in the case of the flat patch clamp sensor.
  • a large number of through-holes can be formed on one substrate by batch processing using microfabrication technology.
  • simultaneous parallel measurement of a large number of cells is possible as compared to a notch clamp.
  • the difference from the planar patch clamp sensor is that the electrode is a polarizable gold electrode. Then, it is based on the principle of measuring a test cell by a change in potential of an electrode arranged outside the cell. For this reason, there is no need to use an artificially prepared intracellular solution by disrupting the cell membrane. In other words, it is closer to the living environment than a flat patch clamp sensor! ⁇ ⁇ Tests can be performed under measurement conditions.
  • Patent Document 1 International Publication No. 01Z25769 pamphlet
  • Patent Document 2 US Pat. No. 6,488,829
  • Patent Document 3 International Publication No. 01Z59447 pamphlet
  • Patent Document 4 International Publication No.99Z31503 pamphlet
  • Patent Document 5 International Publication No. 02Z055653 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Molecular Biology of Cells, Third Edition, Garland Publishing Inc., New York, 1994, Japanese edition, edited by Keiko Nakamura et al., 181-182, 1995, Kyoikusha
  • Non-patent document 2 ASSAY and Drug Development Technologies, Vol. 1, Number 1-2, ppl 27-135, 2003
  • Non-Patent Document 3 Pflugers Arch.Vol. 417, ppl85-193, 1990
  • the danger of a drug is determined in the following steps. First, it transiently changes the voltage inside and outside the cell in the absence of a potentially dangerous drug. In other words, the current flowing outward when the HERG ion channel is opened by forcibly depolarizing the inside of the cell is measured. Second, the voltage inside and outside the cell is transiently changed in the presence of the candidate drug. In other words, similarly, the outgoing current observed when the HERG ion channel is opened by forcibly depolarizing the inside of the cell is measured.
  • the extent to which a candidate drug at risk antagonizes the HERG channel is determined by the decrease in outward current in the absence and presence of the candidate drug at risk.
  • voltage application is repeated in the presence of the candidate drug, and the voltage inside and outside the cell is repeatedly changed.
  • the outgoing current observed when the HERG ion channel is opened many times is measured.
  • the antagonist is an open channel antagonist that does not irreversibly fit into the pore of the HERG ion channel and does not detach.
  • the present invention solves the above-mentioned conventional problems, and has an open channel type having a risk of causing arrhythmia in a measurement state simulating a biological environment without newly applying an electric signal from the outside.
  • An object of the present invention is to provide a method for testing the safety of a drug for determining a HERG channel antagonist. Means for solving the problem
  • the pharmaceutical safety test method of the present invention uses a sensor having a measurement electrode to detect a sample containing a HERG ion channel or a homolog thereof of a drug to be tested.
  • a drug safety test method for testing the danger to cells uses a sensor having a measurement electrode to detect a sample containing a HERG ion channel or a homolog thereof of a drug to be tested.
  • step B replacing the control solution with a measurement solution containing the drug under test, and measuring a voltage signal with the measurement electrode;
  • step B replacing the measurement solution with the control solution again and measuring a voltage signal with the measurement electrode;
  • the response at the measurement electrode and the response time corresponding to the occurrence of QT prolongation can be evaluated. It is extended compared to. When returning to the absence of the test drug again, the response at the measurement electrode and the response time are kept extended. From the form of this response, it is possible to determine the force of the open channel antagonist, which corresponds to the irreversible entry of the drug under test into the ion channel pore (pore).
  • the test can be performed under measurement conditions closer to the biological environment without going through a process of artificially stimulating the target biological component. That is, a highly reliable and safety test can be performed.
  • step D clZal is calculated from the voltage value al measured in the step A and the voltage value cl measured in the step C,
  • clZal exceeds a preset value, it may be determined that there is a danger, and if clZal is less than or equal to the preset value, it may be determined that there is no danger.
  • step B and step C may be repeated at least two times at predetermined time intervals.
  • a first measurement solution containing the first drug to be tested is used as the measurement solution for the first time
  • a second measurement drug containing the second drug to be tested is contained as the measurement solution for the second time.
  • the first drug under test and the second drug under test may be different drugs.
  • the first drug under test and the second drug under test are the same, and the concentration of the first drug under test contained in the first measurement solution and the second drug under test contained in the second measurement solution are different.
  • the concentration of the medicinal product under test may be different from that in (2).
  • a third measurement solution containing a positive control reagent or a negative control reagent is used,
  • the ratio of the voltage signals (clZal) measured in the steps A and C using the first measurement solution or the second measurement solution and the third measurement solution are further determined.
  • the risk of the drug may be determined by comparing the ratio of the voltage signals measured in the step A and the step C (cl ′ Za 1,) using the method.
  • the specimen cell may be, for example, a cell line in which HERG ion channel is constantly expressed.
  • the second control solution and the second measurement solution respectively, wherein the first control solution and the first measurement solution and at least one ion concentration commonly contained other than the test drug May be different.
  • the voltage signal is a predetermined sample. It may be a statistical value of a set of unit deviation values for calculating the deviation value of the amplitude of the voltage signal for each time.
  • the statistical value may be an average value of the distribution of the unit deviation values. Further, the statistical value may be a variance of a distribution of the unit deviation value.
  • the voltage signal measured in a state where the specimen cells are in contact with the measurement solution containing the drug to be tested may be a voltage signal detected after exceeding a preset sample voltage threshold.
  • One or more measurement electrodes that are provided in the recess and that can be arranged in the vicinity of the specimen cells;
  • a sensor having a reference electrode immersed in the solution and separated from the measurement electrode
  • a voltage measuring device for measuring a voltage between the measuring electrode and the reference electrode, a solution injecting / discharging device for injecting and discharging a plurality of types of the solutions to and from the concave portion, and a control device,
  • the control device controls the solution injecting / ejecting device to fill the concave portion with a control solution that does not contain the drug under test as the first kind of the solution in the concave portion, and in this state a2, the voltage measuring device The voltage between the measurement electrode and the reference electrode is measured, and then the solution injecting / discharging device is controlled to discharge the control solution and the concave portion to be tested as the second type of the solution as the solution.
  • a measurement solution containing a drug is filled, and in this state b2, the voltage between the measurement electrode and the reference electrode is measured by the voltage measurement device,
  • the solution injecting / discharging device is controlled to discharge the measuring solution from the concave cap, and the concave portion is filled with the control solution again.
  • the measuring electrode and the reference are supplied by the voltage measuring device. Measure the voltage between the electrodes and A drug safety test system that compares the voltage measured in the state a2 with the voltage measured in the state c2 and determines the safety of the drug under test based on the comparison result. .
  • the pharmaceutical safety test system may have a configuration in which a plurality of the specimen cells are arranged near each of the measurement electrodes.
  • the above drug safety test system may be configured such that the sensor has a through hole penetrating the substrate in the thickness direction, and the measurement electrode is arranged near the through hole. good.
  • the QT is extended without a process of artificially applying an electric signal newly from the outside to the HERG channel. It is possible to evaluate open-channel drug candidates with inherent dangers, in which the response at the measurement electrode and the response time are irreversibly prolonged compared to the absence of the drug.
  • the pharmaceutical safety test method and the pharmaceutical safety test system of the present invention measurement can be performed in a one-liquid system without breaking cell membranes and without using an artificially prepared intracellular solution. Therefore, the test can be performed under measurement conditions closer to the biological environment. Due to the effects of both, the pharmaceutical safety test method of the present invention can be a more reliable test than the conventional method. In addition, the external application electric circuit and the like can be omitted, and the device can be simply configured. Furthermore, it contributes to improvement of the productivity and manufacturability of the device.
  • FIG. 1A is a flowchart showing a pharmaceutical safety test method according to Embodiment 1, and is a flowchart for comparing the measurement results of Step S1 and Step S3.
  • FIG. 1-B is a flow chart showing the pharmaceutical safety test method in Embodiment 1.
  • 9 is a flowchart for comparing the measurement results of step S2 and step S3.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically showing a drug safety test sensor according to Embodiment 1.
  • FIG. 3 is a top view of the sensor shown in FIG. 2.
  • FIG. 4 is a flowchart showing a preparation step (step SO) of the pharmaceutical safety test method in the first embodiment.
  • FIG. 5 is a flowchart showing steps of a pharmaceutical safety test method according to another embodiment of the first embodiment.
  • FIG. 6-A is a configuration diagram schematically showing the pharmaceutical safety test system shown in Embodiment 1, and is a medical device having a well solution replacement device and a well solution discharge device. It is a lineblock diagram of a medicine safety test system.
  • FIG. 6-B is a configuration diagram schematically showing the drug safety test system shown in the first embodiment.
  • FIG. 6-B is a configuration diagram schematically showing the drug safety test system shown in the first embodiment.
  • FIG. 6-C is a configuration diagram schematically showing the drug safety test system shown in the first embodiment, which includes a solution replacement device in a well and a solution discharge device in a well.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a pharmaceutical safety test system having no deviation.
  • FIG. 7-A is a flowchart showing the steps of the pharmaceutical safety test method of the present invention, and is a flowchart showing the steps of the pharmaceutical safety test method in the second embodiment.
  • FIG. 7-B is a flowchart showing the steps of the pharmaceutical safety test method of the present invention, and is a flowchart showing the steps of the pharmaceutical safety test method in the third embodiment.
  • FIG. 7-C is a flowchart showing the steps of the drug safety test method of the present invention, and is a flowchart showing the steps of the drug safety test method in the fourth embodiment.
  • FIG. 8 is a flowchart showing the steps of a drug safety test method in Embodiment 5. It is.
  • FIG. 9 is a partial cross-sectional view showing a structure of a pharmaceutical safety test sensor according to Embodiment 6.
  • FIG. 10 is a diagram (an overall perspective view) schematically showing the structure of a pharmaceutical safety test sensor according to the sixth embodiment.
  • FIG. 11 is a partial cross-sectional view showing a detailed structure of a sensor substrate of a pharmaceutical safety test sensor according to Embodiment 6.
  • FIG. 12 is a bottom view showing a detailed structure of a sensor substrate of a pharmaceutical safety test sensor according to Embodiment 6.
  • FIG. 13 is a configuration diagram of the pharmaceutical safety test system shown in Embodiment 6.
  • FIG. 14 is a view showing a measurement result of a time-series waveform of a sensor 120 electrode voltage in Experimental Protocol 1 of Example 1.
  • FIG. 15 is a view showing a measurement result of a time-series waveform of a sensor 120 electrode voltage in Experimental Protocol 2 of Example 1.
  • FIG. 16 is a view showing a measurement result of a change amount of a voltage histogram peak town regarding the drug solution 2 of Example 1.
  • FIG. 17 is a view showing a measurement result of a variation amount of a voltage histogram peak town regarding the control solution 2 of Example 1.
  • FIG. 18 is a view showing a measurement result of a change amount of a voltage histogram variance K for the drug solution 2 of Example 1.
  • FIG. 19 is a view showing a measurement result of a change amount of a voltage histogram variance K with respect to a control solution 2 of Example 1.
  • FIG. 20 is a diagram showing a measurement result of a statistic of a change in a voltage amplitude value in the first embodiment.
  • FIG. 21 is a diagram showing a measurement result of a time-series waveform of the electrode voltage of the sensor 120 according to the second embodiment.
  • FIG. 22 is a diagram showing a measurement result of a change amount of a voltage histogram peak town in the second embodiment.
  • FIG. 23 is a diagram showing a measurement result of a change amount of a voltage histogram variance K in the second embodiment.
  • FIG. 24 is a view showing a measurement result of a statistic of a change in a voltage amplitude value in the third embodiment.
  • FIG. 25 is a cross-sectional view showing a step 1 in the method for manufacturing a sensor substrate shown in the first embodiment.
  • FIG. 26 is a cross-sectional view showing a step 2 in the method for manufacturing a sensor substrate shown in the first embodiment.
  • FIG. 27 is a cross-sectional view showing a step 3 in the method for manufacturing a sensor substrate shown in the first embodiment.
  • FIG. 28 is a cross-sectional view showing a step 4 in the method for manufacturing a sensor substrate shown in the first embodiment.
  • FIG. 29 is a cross-sectional view showing a step 5 in the method for manufacturing a sensor substrate shown in the first embodiment.
  • FIG. 30 is a cross-sectional view showing a step 6 in the method for manufacturing a sensor substrate shown in the first embodiment.
  • FIGS. 1A and 1B are flowcharts showing steps of a drug safety test method according to Embodiment 1 of the present invention. Hereinafter, the present embodiment will be described with reference to FIGS. 1A and 1B.
  • the drug safety test method of the present invention is a method for preparing a sample cell near a measurement electrode of a drug safety test sensor (Step SO), and then generating a voltage signal based on an electric signal from the measurement electrode, Measuring a voltage signal including information on the HERG channel of the sample cell when the solution in contact with the sample cell is a control solution in which the drug under test does not exist (Step Sl, where the voltage signal is a); A step of measuring a voltage signal containing information on the HERG channel of the sample cell when the solution in contact with the sample cell is a measurement solution in which the drug under test is present (Step S2, where the voltage signal is b) And a step of measuring a voltage signal including information on the HERG channel of the specimen cells when the solution in contact with the specimen cells is returned to the control solution in which the drug under test does not exist again (Step S3, here).
  • step S4 The voltage signal of step S4) and the step of comparing the voltage signals of steps S1 and S3 (step S4A) or the step of comparing the voltage signals of steps S2 and S3 (step S4B). Based on the comparison results of the voltage signals, the process for determining the danger of the drug under test (Steps S5, S6 and S7, and Steps S8, S9 and S10) is included.
  • step S1 the control solution in contact with the specimen cells in step S3 and the control solution in contact with the specimen cells in step S3 have the same components. It is assumed that the measurement solution contacted by the sample cells in step S2 and the control solution contacted by the sample cells in step S1 or S3 differ only in the presence or absence of the test drug. Further, in step S1 or S3, the control solution in contact with the sample cells may be a solution to which a positive control reagent or a negative control reagent is added in place of the test drug in the measurement solution.
  • step S2 if the drug under test antagonizes the HERG channel, the entry and exit of potassium ions are inhibited as described above, and repolarization does not occur. Therefore, the voltage signal is a ⁇ b It becomes. On the other hand, if the drug under test is not an open channel antagonist, the voltage signal will be b> c in step S3 because the drug under test also has a HERG channel force, but if it is an open channel antagonist, becomes bc.
  • the comparison of the voltage signals in step S4A includes, for example, (1) detecting the difference [a-c] between the voltage signals a and c, and determining whether or not the force is equal to or less than a predetermined reference value. (2) detecting the ratio [cZa] of the voltage signal a and the voltage signal c and determining whether or not the value is equal to or less than a predetermined reference value.
  • the comparison of the voltage signals in step S4B includes, for example, (1) detecting the difference [bc] between the voltage signals b and c and determining whether or not the value is equal to or more than a certain reference value. That is, the ratio [cZb] between the voltage signals b and c is detected, and the force rejection force whose value exceeds a certain reference value is determined.
  • FIG. 1A shows a flowchart for comparing the measurement results of steps S1 and S3 in step S4A.
  • the safety of the test drug is evaluated in steps S5 to S7 based on the comparison result of step S4A.
  • the test drug is It is not an open channel antagonist that antagonizes the HERG channel. It is determined (step S6).
  • step S5 when it is determined that there is a difference in the measurement results (voltage signal) (for example, [cZa] exceeds a certain value), the test drug is an open channel that antagonizes the HERG channel. Therefore, it is determined that the drug has “arrhythmic action” (step S7).
  • FIG. 1B shows a flowchart in a case where the measurement results of steps S2 and S3 are compared in step S4B.
  • the safety of the test drug is evaluated in steps S8 to S10 based on the comparison result in step S4B.
  • step S8 As a result of comparing b and c in step S4B, if it is determined in step S8 that there is a difference in the measurement result (voltage signal) (for example, [cZb] is equal to or less than a certain reference value), Is determined to have "no proarrhythmia effect" (step S9).
  • step S8 when it is determined that there is no difference in the measurement result (voltage signal) (for example, [cZb] is less than a certain reference value), the drug under test antagonizes the HERG channel. It is an open channel antagonist and is determined to have "arrhythmic action" (step S10).
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically showing a structure of a sensor used in the pharmaceutical safety test system of the present embodiment.
  • FIG. 3 is a top view of the sensor shown in FIG.
  • the sensor 120 according to the present embodiment includes a substrate 101 and a solution holding unit 119 constructed on the substrate 101.
  • the solution holding section 119 includes a plurality of wells 104 for holding the measurement solution 51 and a reference electrode 103.
  • a plurality of island-shaped measurement electrodes 102 are formed at predetermined positions. Further, on the upper surface of the substrate 101, an external connection portion 107 is formed so as to correspond to each measurement electrode 102 so as to be located at the edge, and the external connection portion 107 is connected to the corresponding measurement electrode 102. A lead wire 105 is formed. Then, an insulating film 106 is formed so as to cover a portion of the upper surface of the substrate 101 other than a portion where the measurement electrode 102 and the external connection portion 107 are formed. The portion of the insulating film 106 located around the measurement electrode 102 is the measurement electrode 10 The recess 106a is formed in a mortar shape toward 2 to form a concave portion 106a. A film-shaped well forming body 131 is formed on the insulating film 106.
  • the hole forming body 131 has openings 13 la formed so as to be located on the insulating film 106 including the upper surface of each measuring electrode 102 and the concave portion 106 a around the measuring electrode 102.
  • the space surrounded by the upper surface of 02 and its surrounding insulating film 106 and the inner peripheral surface of the opening 131a constitutes the well 104.
  • a flanged cylindrical reference electrode 103 is formed along the edge and the inner peripheral surface of the opening 131a.
  • An external connection portion 109 is formed at the edge of the upper surface of the shell forming body 131 so as to correspond to each well 104, and the external connection portion 109 is formed on a lead wire formed on the upper surface of the shell forming body 131. It is connected by 108 to the reference electrode 103 of its corresponding cell 104. Then, at the time of measurement, the first amplification section 152 is connected to the external connection section 107, and the external connection section 109 is grounded.
  • the sample cell 1 is placed near the measurement electrode 102.
  • the potential signal of the measuring electrode 102 is measured with reference to the potential of the reference electrode 103 via the lead wire 105, the external connection unit 107, and the first amplifying unit 152 (hereinafter, the potential signal from the measuring electrode 102). And the difference between the potential signal from the reference electrode 103 and the voltage signal from the measurement electrode 102).
  • the potential of the reference electrode 103 is detected via the lead wire 108 and the external connection 109. As a result, a voltage signal caused by the specimen cell 1 arranged near the measurement electrode 102 is measured by the measurement electrode 102 (the above-described step B).
  • the sample cells used for the drug safety test of the present invention have a HERG channel.
  • the sample cell may be a cell different from the cell in which the HERG channel is previously contained or the cell into which the HERG channel is introduced.
  • the HERG channel refers to a biological component existing in a cell and on a cell membrane, and refers to a target on which a test drug having a risk to the human body acts.
  • the effect of the HERG channel to which the drug safety test of the present invention can be applied is The test drug may be activated or inactivated.
  • the power to be described only when the risk increases when the HERG channel is inactivated is not limited to that.
  • HERG channels include ion channels existing on cell membranes, various proteins and nucleic acids such as signal transduction substances and metabolites existing in cells, and modified products thereof.
  • HERG channels include HERG ion channels, delayed rectifier lithium ion channels, and the cause of congenital long QT syndrome. Gene LQT and the like.
  • sample cells in which the aforementioned HERG channel is pre-integrated include guinea pig papillary muscle sample dinosaur Purkinje fiber cells, guinea pig cardiomyocytes, guinea pig atrial muscle cells, and the like.
  • Sample cells that can be used as host cells include HEK293, CHO, African oocyte and the like.
  • a gene that expresses a HERG channel can be introduced using a gene transfer technique known to those skilled in the art. Both transiently expressing cells, into which a HERG channel expression gene such as a vector is introduced for each experiment, and cells that have been modified to constantly express the HERG channel expression gene, can be used. Since the expression of the HERG channel occurs steadily in the cell, it is excellent from the viewpoint of measurement error.
  • FIG. 4 is a flowchart showing details of a preparation step (step 0, step SO in FIG. 1) of preparing a sample cell containing a HERG ion channel near a measurement electrode of a drug safety test sensor prior to measurement. .
  • a preparation step as shown by the solid line, a step of filling the well 104 of the sensor 120 with the solution (step S21), the solution filled in the well 104 is suspended by a predetermined amount of a desired specimen cell 1. (Step S23).
  • the specimen cells can be arranged near the measurement electrode 102.
  • step SO the preparation step (step SO) is performed in step S 21, in which the fixing agent is fixed in the vicinity of the measurement electrode 102 and in the area of the surface of the substrate 101 (step S 21).
  • step S22 the fixing agent is fixed in the vicinity of the measurement electrode 102 and in the area of the surface of the substrate 101 (step S 21).
  • step S23 the fixing agent is fixed in the vicinity of the measurement electrode 102 and in the area of the surface of the substrate 101
  • step S24 a step of culturing the cells
  • the solution used in the pharmaceutical safety test method of the present invention includes a physiological saline solution containing 20 mM to 400 mM sodium chloride as a main component, and various nutrients, growth factors, antibiotics, and the like. It refers to a culture solution, a buffer solution in which a specified chemical substance, compound, or drug is dissolved. It is preferable to use a solution that has been degassed in advance. As the solution, for example, a solution whose temperature is set within a range of 4 ° C and 40 ° C can be used.
  • fixing agent refers to a material that facilitates cell fixation and enhances Z or firmness.
  • the immobilization of the immobilizing agent may be performed before the installation of the well 104 while the sensor 120 is being manufactured.
  • a dielectric As a material for fixing a fixing agent for fixing cells, a dielectric is usually used.
  • a polymer having a strongly basic or strongly acidic functional group is preferably used.
  • positively charged polymers such as polyethyleneimine (PEI), polyortin (PO), and polylysine (PL) are preferably used. These positively charged polymers also have the effect of attracting negatively charged cells.
  • a material having both cell adhesion ability is a polymer having a biguanide group or a rubamoylguazide group.
  • arylbiguanide-co-arylamine (PAB) and aryl-N-butyrubamoylgua-dino-co-arinoleamine (PAC) are preferably used.
  • a matrix material can be used. Cell-adhesive proteins are preferably used as the matrix material, and such proteins include collagen, fibronectin, vitronectin, laminin and the like.
  • the immobilizing solution in which the immobilizing material is dissolved at a predetermined concentration is exposed on the measuring electrode 102, and after a predetermined time has elapsed, the immobilizing solution is removed from the surface of the measuring electrode 102.
  • the washing can be carried out by washing the surface at least once with a washing liquid and drying.
  • a method may be used in which the immobilization solution is spotted only on the upper surface of the measurement electrode 102 and covered.
  • step S1 step A
  • the voltage signal generated by the sample cell 1 at the measurement electrode 102 of the sensor 120 is used as a control for the drug under test as a control. Only omitted! Measured against control solution.
  • step S2 the voltage signal generated by the specimen cell 1 at the measurement electrode 102 of the sensor 120 is a measurement solution containing the test drug at a predetermined concentration. Measured against.
  • Step S3 a voltage signal generated by the specimen cell 1 at the measurement electrode 102 of the sensor 120 is measured when the voltage signal is returned to the control solution again.
  • the HERG channel of the sample cell 1 is always activated at normal times, in this case, it is only necessary to measure the voltage signal with the measuring electrode 102 as it is.
  • the specimen cell is stimulated to activate the HERG channel of the specimen cell 1.
  • the number of times of detecting the voltage signal is arbitrary, and the measurement can be performed a plurality of times for each measurement solution and each control solution.
  • step S4 the voltage signal of the measurement electrode 102 measured in step S1 is compared with the measurement result of the voltage signal of the measurement electrode 102 measured in step S3, or
  • the voltage signal of the measurement electrode 102 measured in S2 is compared with the measurement result of the voltage signal of the measurement electrode 102 measured in step S3. Note that both measurement results may be compared.
  • An example of a specific comparison method is as described above.
  • step S 1 by comparing the voltage signal of the measurement electrode 102 measured in step S 1 with the voltage signal of the measurement electrode 102 measured in step S 2, the test cells given by the drug under test are compared. Antagonistic effects on one channel can be extracted.
  • the channel of the sample cell 1 provided by the drug under test is determined. Can be extracted.
  • a control solution a control solution in the presence of a positive control reagent or a negative control reagent can be used instead of or in addition to the above-described control solution in which the test drug is not present.
  • the comparison of the voltage signals in step S4A is realized by exchanging the solution in one of the wells 104 (method ex).
  • the force of each of the measurement solution and the control solution shown in steps S1 to S3 is entered. It can also be realized by directly comparing the voltage signals of the measurement electrodes 102 of different wells 104 (method ⁇ ).
  • Method a measures the signal with the same cell force in particular, and can perform highly reliable measurement.
  • method ⁇ detects the voltage signal difference at a high processing speed because the solution is not exchanged. can do.
  • step S5 the danger of the drug under test is determined based on the comparison result of the voltage signals in step S4A. It is desirable that the comparison of the voltage signals in step S4A be made by comparing the amplitude values of the voltage signals. The same applies to step S4B.
  • the antagonistic form of the HERG channel is characteristic, it can be determined from the difference between the amplitudes of the voltage signals in steps S1 and S3 calculated in step S4A, as described above.
  • Antagonists with an antiarrhythmic effect are open channel blockers in which the antagonist irreversibly fits into the pores of the channel. Therefore, the amplitude value of the voltage signal changes depending on the channel closing rate. Therefore, specifically, the amplitude of the voltage signal is cut out into small sections where the ion channel opens and closes, and the standard deviation of the amplitude of the voltage signal in the small section is frequency-distributed as a representative value of the small section. This makes it easy to quantitatively analyze the danger of the drug under test. In other words, the peak value of the frequency distribution increases as the amplitude value of the voltage signal of the measurement electrode 102 increases, and the half value width of the frequency distribution increases as the amplitude value of the voltage signal varies.
  • evaluation may be performed using a zero-cross time spanning a preset voltage threshold as an index.
  • a voltage signal larger than the set voltage threshold Since the time during which the signal is issued indicates the time when the hazard is activated, the longer the time, the greater the risk of the medicinal product under test.
  • the entire time of the analysis using the analysis method of dividing the frequency into the above-described small sections may be set to be equal to the above-mentioned zero crossing time.
  • the voltage signal appears in the direction of increasing.
  • the minimum detection sensitivity can be increased, the reliability is high, and the safety test can be performed.
  • FIG. 5 shows a flowchart of a drug safety test method in which different steps are added to the flowchart shown in FIG. 1A.
  • step S1 step A
  • the activation is similarly performed in advance. It has a step of inactivating non-HERG channels (step S11). This can be achieved, for example, by mixing in the solution an antagonist that selectively antagonizes only non-HERG channels. With such a configuration, only the activation voltage signal of the HERG channel can be measured, which is effective for detecting a target voltage signal with high sensitivity.
  • FIGS. 2 and 3 The configuration of the sensor 120 used in the pharmaceutical safety test method described in the present embodiment is shown in FIGS. 2 and 3 as described above. Here, the configuration will be described in further detail with reference to FIGS. 2 and 3, and a method for producing the sensor 120 will also be described.
  • the number of measurement electrodes 102 is not particularly limited, and may be one or plural for each well 104.
  • many wells 104 can be integrated on one sensor 120, and the pharmaceutical safety test of the present invention is processed in parallel. Ability to perform many tests in a short time.
  • a plurality of measurement electrodes 102 are arranged in each well 104, statistical processing based on a plurality of measurement data can be performed, so that the accuracy of a test performed in each well 104 is improved and high reliability is provided. Can be realized.
  • one measurement electrode 102 may measure a potential signal from one cell and a set of potential signals of a plurality of cells.
  • An insulating layer may be provided to cover and insulate the lead wire 105 that transmits the potential signal from the measurement electrode 102.
  • the material of the insulating layer include resins such as polyimide (PI) resin and epoxy resin.
  • a photosensitive resin such as a negative photo-sensitive polyimide (NPI) is used.
  • a photosensitive resin first, the photosensitive resin is applied to the entire upper surface of the sensor unit, and then the pattern is formed by photoetching to form an external connection 107 on the measuring electrode 102 and the lead wire 105.
  • the electrode 102 and the external connection portion 107 are exposed, and an insulating layer can be formed in an arbitrary region. From the viewpoint of production efficiency, it is preferable to form the insulating layer by the above-described method.
  • the solution holding section 119 has a plurality of pipes 104, in which the measurement solution 51 (the inside of the pipe 104 has a force to which the measurement solution and the control solution can be added). Measurement solution). Further, it has a reference electrode 103 and is electrically connected to the measurement electrode 102 via the measurement solution 51.
  • an injection tube may be arranged in the vicinity of the solution holding section 119 in order to introduce and replace the measurement solution 51 in each well 104.
  • the injection tube may take any form as long as the purpose of introducing the measurement solution 51 into each well 104 is achieved.
  • a flow path may be formed in the well 131 and the measurement solution 51 may flow toward the measurement electrode 102 through this flow path.
  • a new hole may be dug toward the electrode 102, and an injection tube may be inserted and fixed there.
  • the injection tube is disposed on the upper surface of the solution holding section 119, and a moving mechanism is desirably provided so that the measurement solution 51 can be introduced into each of the plurality of wells 104. If necessary, a discharge pipe for exchanging the measurement solution 51 may be provided.
  • the cells 1 can be cultured for a long time in the culture medium 51 in the well 104 when culturing the cell 1, and the measurement solution 51 in the absence of the drug under test and the drug Since the existing measurement solution 51 can be exchanged, the drug safety test can be quickly measured.
  • the reference electrode 103 is arranged so as to partially contact the measurement solution 51 in the well 104 and not to be directly connected to the measurement electrode 102.
  • Reference electrode 103 is used to reduce noise.
  • the area must be sufficiently large. Specifically, it is desirable that the total area of the reference electrodes 103 is formed so as to be at least five times larger than the total area of all the measurement electrodes 102.
  • the outermost surface of the reference electrode 103 is formed by a material such as gold, platinum, silver-silver chloride, etc. As shown in FIG. It may be formed on a surface excluding the vicinity thereof. In this case, the reference electrode 103 may be prepared separately for each well 104 or may be formed on the entire surface.
  • the reference electrode 103 may have any shape, such as immersing the rod-shaped electrode in the measurement solution 51 in the well 104, without being limited to the above.
  • the electrode material on the substrate 101 After depositing the electrode material on the substrate 101, etching is performed using a photoresist, so that the electrode 102, the corresponding lead wire 105, and the external connection portion 107 are one set, and a plurality of powerful sets are desired.
  • the pattern is formed. After that, the upper surface of the pattern except the electrode 102 and the external connection portion 107 and the upper surface of the substrate 101 are covered with an insulating layer. Then, the substrate is cut into small-piece substrates 101 having a predetermined angle.
  • the pattern of the electrode 102 may be formed by a mask method of vapor deposition through a stencil mask in which the pattern is formed in advance, or a lift-off method.
  • a concave portion 106a is formed on the upper surface of the small piece substrate 101 thus formed by a method known to those skilled in the art, and a solution holding portion 119 (a well formed body 131) on which the reference electrode 103 is formed is adhered, and the sensor 120 is mounted. obtain.
  • FIG. 6-A is a block diagram schematically illustrating an example of the pharmaceutical safety test system of the present embodiment.
  • the drug safety test system 150A includes a drug safety test sensor 120, a shielding box 151 that electrostatically shields at least the sensor 120, a measurement electrode 102 on the sensor 120, and a reference electrode.
  • the potential signal of the measurement electrode 102 with respect to the reference electrode 103 in the sensor 120 is output to the first amplifier 152 through the lead wire 105 of the measurement electrode 102.
  • the first amplifying unit 152 amplifies the potential signal with high sensitivity and outputs the amplified signal to the second amplifying unit 153.
  • the second amplification unit 153 outputs a potential signal to the calculation processing unit 155 via AZD conversion and the like.
  • the calculation processing unit 155 determines the safety of the drug under test in the sensor 120 by comparing the input voltage signals according to a predetermined procedure.
  • the change in the potential signal caused by the dangerous element of the target biological component for various drugs provided by the solution injection and discharge of the in-well solution replacement device 157a is detected by the cell. It can be measured as a change in potential of the electrode 102 disposed outside.
  • the drug safety test system 150A is configured integrally with a calculation processing unit 155 provided with appropriate measurement software to process the output from the drug safety test sensor 120.
  • the calculation processing unit 155 is configured by, for example, a computer, and the measurement software is stored in a storage unit of the computer, and a parameter setting screen on which the signal processing and measurement conditions can be set on the screen of the computer; It provides a recording screen that records potential changes detected from cells and can be displayed in real time, and a data analysis screen that can analyze recorded data.
  • the in-well solution replacement device 157a and the in-well solution discharge device 157b are electrically connected to and controlled by the calculation processing unit 150.
  • the calculation processing unit 155 sends a control signal to the solution switching device 158 so that the solution in the in-well solution replacing device 157a is injected into the well 104 of the sensor 120 at a predetermined timing and procedure. Further, the calculation processing unit 155 sends a control signal to the in-well solution discharging device 157b to discharge the solution in the well 104 at a predetermined timing and at a predetermined procedure. With this configuration, a predetermined timing The exchange of each solution can be performed automatically in the measurement and measurement procedures.
  • the shielding box 151 is installed so as to electrostatically shield the sensor 120. It is desirable that the shielding box 151 electrostatically shields not only the sensor 120 but also the first amplifying unit 152 as a whole. With such a configuration, the potential signal observed at the measurement electrode 102 is more resistant to noise. In addition, the shielding box 151 also shields the sensor 120 from external environmental forces, so that even when a photosensitive drug solution is used for measurement, it is possible to prevent photodecomposition, thereby ensuring long-term measurement stability and measurement stability. Reproducibility can be improved.
  • the reference electrode 103 is formed on the entire upper surface of the sensor 120.
  • the reference electrode 103 is connected to the shielding box 151.
  • the measurement environment adjustment device 156 is placed on an anti-vibration table, and further covered with a shielding box such as a Faraday basket, and is double-electrostatic shielded.
  • a shielding box such as a Faraday basket
  • the output signal measured by the sensor 120 is first-stage amplified by the first amplifying unit 152, and further amplified by the second amplifying unit 153 to reduce the frequency band. After being restricted, it is input to the computer (calculation unit) which is the calculation processing unit 155 via the AZD transformation.
  • the first amplifying unit 152 can be arranged at a position close to the sensor 120, so that the pharmaceutical safety test system 150A has a feature of being resistant to external noise.
  • the pharmaceutical safety test system 150A includes a circuit selector (not shown) for selectively transmitting an electric signal from the desired measurement electrode 102 to the first amplifier.
  • This circuit selector is composed of, for example, a multiplexer.
  • the in-well solution replacement device 157a is a device for injecting a predetermined amount of solution from the upper surface of the well 104.
  • the injection pipes 159 fixed to the well forming body 131 and radially extended from each well 104 are provided with the solution switching devices 158 for the number of kinds of the medicines.
  • the solution discharge device 157b in the well discharges the solution injected into the well 104 into each well.
  • This is a device for discharging through a discharge pipe 160 connected to 104.
  • the components connected to the in-well solution replacement device 157a shown in Fig. 6-A are the measurement solution reservoir (L1), the positive control drug solution reservoir (L2), and the drug solution A solution reservoir (L3).
  • the drug solution to be tested B reservoir (L4) is exemplified, but it is possible to simultaneously determine a plurality of types of drug solutions by increasing the number of elements other than those described above.
  • the pharmaceutical safety test system 150A includes a measurement environment control device (not shown) for maintaining the sensor 120 at a predetermined temperature, gas concentration, and humidity. For this reason, cell seeding, culturing, and measurement can be performed on a series of systems, and large-scale and efficient measurement and judgment are performed by full automation without having to go through complicated operations such as sterilization accompanying movement. can do.
  • FIG. 6B is a block diagram schematically showing another example of the configuration of the pharmaceutical safety test system of the present embodiment.
  • the drug safety test system 150B shown in Fig. 6-B differs from the drug safety system: L50A shown in Fig. 6-A only in that it does not have the in-well solution discharge device 157b and the discharge pipe 160.
  • L50A shown in Fig. 6-A only in that it does not have the in-well solution discharge device 157b and the discharge pipe 160.
  • the in-solution solution replacement device 157a injects the solution into the well 104 at a predetermined timing and measurement procedure, and after measuring a necessary voltage signal, Drain the solution in the well 140 sequentially.
  • the in-well solution replacement device 157a may be configured so that only the solution is injected, and the user discharges the solution in the well 104 using a pipette, an aspirator, or the like. In this case, after the solution in the well 104 is discharged, the in-well solution replacing device 157a is operated again to continue the measurement. Even with such a configuration, the same drug safety evaluation function as the drug safety system 150A can be exhibited.
  • FIG. 6-C is a block diagram schematically showing still another configuration example of the pharmaceutical safety test system of the present embodiment.
  • the pharmaceutical safety test system 150C shown in Figure 6-C has a solution replacement device 157a in the well, a solution discharge device 157b in the well, a solution switching device 158, It differs from the drug safety system 150A shown in Figure 6-A only in that it does not have an inlet 159 and an outlet 160. Hereinafter, only this difference will be described.
  • the pharmaceutical safety test system 150C according to this configuration example, after the user injects the solution into the well 104 at a predetermined timing and measurement procedure by pipetting or the like and measures the necessary voltage signal, The solution in the well 104 is discharged using a microtube and an aspirator. Then, another solution is injected by means such as pipetting, and the voltage is measured. In this way, the same drug safety evaluation function as the drug safety system 150A can be exerted even if the injection of the solution into the well 104, the discharge of the solution, and the switching of the solution are all manual.
  • FIG. 7A is a flow chart showing the steps of the pharmaceutical safety test method according to Embodiment 2 of the present invention.
  • step S12 is included.
  • the present embodiment will be described only with respect to this difference.
  • Step S12 includes a step of measuring a voltage signal with the sample cell 1 in contact with the measurement solution (Step S2), and a step of measuring the voltage signal with the measurement solution replaced again with the control solution (Step S2). This is the step of repeating S3).
  • the frequency stimulus characteristics of the test drug can be known.
  • the above-mentioned frequency stimulus information provides valuable judgment information as to whether or not a danger to the human body will occur when the test drug is actually prescribed to the human body as a drug for a long period of time.
  • the number of times the voltage signal is detected is arbitrary, and the voltage signal can be measured multiple times for each drug under test.
  • step S12 the process returns from step S21 to step S2 until steps S2 and S3 are repeated a predetermined number of times. Then, if step S2 and step S3 are repeated a predetermined number of times, the process proceeds from step S21 to step S4A, and step S12 ends.
  • step S4A may use the measurement values of step S2 and step S3 every predetermined number of times, or may use the average value of all the measurement values. In the former case, it can be seen how the difference between C and A changes at predetermined times. Change keeps track of times If it increases each time, it can be judged that there is a possibility that a risk to the human body may occur due to the accumulation effect when the test drug is actually prescribed to the human body as a pharmaceutical for a long period of time.
  • FIG. 7B is a flowchart showing the steps of the pharmaceutical safety test method according to Embodiment 3 of the present invention.
  • step S12 replaces step S13. Therefore, only this difference will be described.
  • Step S13 is the same as step S12, in which the sample cell 1 is in contact with the measurement solution 51 to measure the voltage signal (step S2), and the voltage signal is measured in the state returned to the control solution again. This is a step of repeating the step (step S3). Then, in step S13, in step S2 and step S3, the same sample cell 1 is replaced with a solution containing a different type of drug to be tested, and the voltage is measured.
  • step S13 until step S2 and step S3 are repeated a predetermined number of times, the test solution is replaced with a measurement solution in which the type of the drug under test is changed (steps S22 and S23), and thereafter, the process returns to step S2. If Step S2 and Step S3 are repeated a predetermined number of times, the process proceeds to Step S4A, and Step S13 ends.
  • step S13 the compound action characteristics of the test drug can be known.
  • the information on the combined action characteristics described above provides valuable information for judging whether or not there is any danger to the human body when the test drug is actually prescribed to the human body as a drug.
  • step S4A may use the measurement values of step S2 and step S3 every predetermined number of times, or the last measurement value obtained by repeating step S2 and step S3 a predetermined number of times. May be used. In the latter case, if there is a difference between the final readings and the initial readings, it is not possible to obtain information that a combination of multiple test drugs, rather than a single test drug, will show proarrhythmic effects only when combined. can get.
  • Fig. 7-C is a flowchart showing the steps of the pharmaceutical safety test method according to the fourth embodiment of the present invention. It is a chart. The only difference between the present embodiment and the second embodiment is that step S12 replaces step S14. Therefore, only this difference will be described.
  • Step S14 is a step of measuring a voltage signal in a state where the specimen cell 1 is in contact with the measurement solution 51 as in step S12 (step S2), and a voltage signal is measured in a state of returning to the control solution again. This is a step of repeating the step (step S3). Then, in step S14, in steps S2 and S3, the same sample cells 1 are replaced with solutions containing the same drug under test at different concentrations, and the voltage is measured. In general, proceed from the less concentrated test drug to the higher test drug. By this, it is possible to know at what concentration the proarrhythmic effect starts to occur, and V, and the dangerous concentration.
  • step S14 until step S2 and step S3 are repeated a predetermined number of times, the test solution is exchanged for a measurement solution having a different concentration of the test drug (steps S24 and S25), and thereafter, the process returns to step S2. If Step S2 and Step S3 are repeated a predetermined number of times, the process proceeds to Step S4A, and Step S14 ends.
  • step S4A may use the measurement values of step S2 and step S3 for each predetermined number of times, or may use the average value of all the measurement values! .
  • step S14 the concentration dependence of the test drug can be calculated.
  • the above information will provide valuable insights for calculating the safe prescription amount when the test drug is actually prescribed to the human body as a drug.
  • FIG. 8 is a diagram showing a flowchart of a pharmaceutical safety test method according to Embodiment 5 of the present invention.
  • the difference between the present embodiment and the second embodiment is that before step S1 and step S3, the concentration of ions commonly contained in the measurement solution and the control solution is changed in the control solution in contact with the sample cell 1.
  • the measurement solution in contact with the sample cells is made to have the same ion concentration as the control solution having a different ion concentration in Step S15.
  • the only difference is that it has a step (step S16) of exchanging the solution with the measurement solution.
  • step S11 a control solution having different concentrations of ions commonly contained in the measurement solution and the control solution is injected into the well (step S15). Measure the signal (Step SI).
  • step S16 the control solution in the well is replaced with a measurement solution having a different ion concentration (step S16), and a voltage signal is measured for this measurement solution (step S2).
  • step S17 the measurement solution in the well is replaced again with a control solution having a different ion concentration
  • step S3 a voltage signal is measured for the control solution
  • steps S16, S2, S17, and S3 are repeated a predetermined number of times. If these steps are repeated a predetermined number of times, the process proceeds to step S4A, and step S18 (corresponding to step S12 in FIG. 7A) ends.
  • the stimulus to the cells in the present embodiment is a solution stimulus by changing the ionic concentration of the solution, and can be distinguished from the electrical stimulus to the cells via the electrodes.
  • one of the effects of the pharmaceutical safety test method of the present invention that is, measurement without electrical stimulation can be realized, and the effect of high-sensitivity measurement can be sufficiently obtained.
  • the HERG channel is classified as a voltage-sensitive potassium ion channel.
  • the threshold of the force-activated membrane potential is near the resting membrane potential, and in a sample cell having a shallow membrane potential, it is slightly activated even in normal times. Therefore, the present inventors have found that the activation stimulation is not necessary.
  • Specific examples of channels that are inactive during normal times are found in receptor-activated ion channels, GTP-binding proteins, enzymes, and some voltage-sensitive ion channels with high thresholds. .
  • Stimuli that activate channels such as receptor-operated ion channels, GTP-binding proteins, enzymes, etc. are chemical substances that bind to the receptor.
  • the sensor response when this channel is activated can be specifically realized by putting an active substance solution in which the activation substance is dissolved at a predetermined concentration into the well. it can.
  • the present inventors have confirmed that when activating voltage-sensitive ion channels, solution stimulation that changes the ion composition of a solution has the same effect as electrical stimulation.
  • delayed rectifier potassium ion channels present in guinea pig papillary muscle are classified as voltage-sensitive ion channels.
  • a solution stimulus is applied when activating these ion channels, it is realized by increasing the concentration of potassium ions in the components of the solution.
  • the intracellular potential of a cell The intracellular potential is increased by increasing the potassium ion concentration of the extracellular solution to, for example, 2 mM to 40 mM, because it is determined by the ratio of the external potassium ion concentration. Is activated.
  • the voltage-sensitive ion channel is a HERG channel
  • a force that can also be applied to a solution stimulus is used. Due to the substitution with the concentration solution, the activation response speed is slowed down by the diffusion of the solution.
  • step S1 the number of times the voltage signal is detected is arbitrary, and the voltage signal can be measured a plurality of times for each drug under test.
  • a solution stimulus of the same size may be used and applied at the same timing, or the response may be measured multiple times with different stimulus intervals. Stimuli with different ion concentrations may be used.
  • the difference between the responses can be statistically processed such as an average and a deviation, so that a sudden disturbance can be performed. This contributes to the removal of false positive components due to the application of, and makes it possible to detect the difference in response with higher reliability.
  • Embodiment 6 of the present invention relates to a drug safety test sensor used in the drug safety test system of the present invention.
  • the drug safety test sensor according to the present embodiment will be described with reference to FIGS.
  • FIGS. 9 to 12 are schematic diagrams showing the configuration of the sensor used in the drug safety test described in the present embodiment.
  • the major difference between the sensor of the present embodiment and the sensor used in the first embodiment is that the sensor has a through hole in the vicinity of the electrode. Therefore, this difference will be mainly described.
  • FIG. 10 shows a perspective view of the entire sensor as a preferred example of the present embodiment having a through hole.
  • FIG. 9 is a partial cross-sectional view in which the vicinity of any three of the wells shown in FIG. 10 is enlarged and displayed so that the configuration to which the sensor substrate is connected is more powerful.
  • one sensor board shown in Fig. 9 and the bottom Fig. 11 shows a partial cross-sectional view in which the side is enlarged.
  • Figure 12 shows a bottom view of one and the same sensor substrate. 9 to 12, the same or corresponding parts as those in FIGS. 2 and 3 are denoted by the same reference numerals, and description thereof will be omitted.
  • FIG. 10 Note that, in Fig. 10, only the sensor 104 near the lower right of the sensor is shown as if the sensor substrate 122 is fixed to the bottom of the sensor. This force is used to explain the state of attachment of the sensor substrate 122. For the sake of convenience, only the sensor substrate 122 is illustrated only for the well 104 in this portion. In FIGS. 10 and 11, a partial configuration of the reference electrode and the specimen cells is omitted. Also, in FIG. 9, the tube 114 is shown to be connected only to the middle sensor board, but it is connected to other sensor boards as well! RU
  • the sensor 120 of the present embodiment has a solution holding section 119 in which a large number of columnar tubes 104 are formed so as to be located at nodes of a lattice, and a through hole 117. And a sensor substrate 122.
  • the mounting method of the sensor substrate 122 may be any force as long as the measurement solution 52 accumulates on the upper surface of the sensor substrate 122.
  • each well hereinafter, referred to as a first well
  • An opening 104a is provided on the bottom surface of 104, and a sensor substrate 122 is attached to the lower surface of the solution holding section 119 such that the through hole 117 is located in the opening 104a.
  • the measurement solution 52 is filled in the first well 104 so as to be in contact with the upper surface of the sensor substrate 122.
  • a sensor installation base 121 for receiving the sensor 120 is provided in order to stably install the sensor 120.
  • the sensor installation 121 can be omitted.
  • the sensor substrate 122 (cell immobilizer) is provided with a microdent 116 as a cell holding portion at a part thereof.
  • a second well 112 for holding a second solution which is communicated with the minute recess 116 through the through hole 117, is formed in the sensor substrate 122.
  • the solution holding section 119 includes the plate-shaped well forming body 131 and the reference electrode 103 as described in the first embodiment. Electrode contact pins 111 are erected at predetermined positions on the sensor installation base 121, and the sensor 120 is mounted thereon.
  • the sensor board 122 includes the board 101 as shown in FIG. At a predetermined position on the upper surface of the substrate 101, one or more hemispherical minute recesses 116 are formed. Under board 101 In a region of the surface located below the region where the micro dents 116 are formed, a second rail 112 formed of a concave portion is formed. Then, a through hole 117 is formed in the thickness direction of the substrate 101 so as to connect the minute recess 116 and the second well 112. On the lower surface of the substrate 101, an exchange port 113 having a groove force is formed from the second well 112 to its end face. The film-shaped measurement electrode 102 is formed on the inner surface of the second well 112.
  • a film-like external connection portion 107 is formed on the edge (end) of the lower surface of the substrate 101. Then, a lead wire 105 is formed on the lower surface of the substrate 101 so as to connect the measurement electrode 102 and the external connection portion 107. Then, an insulating film 106 is formed so as to cover the lower surface of the substrate 101, the measurement electrode 102, and the lead wire 105 except for the external connection portion 107. A through hole is formed in the measurement electrode 102 and the insulating film 106 so as to communicate with the through hole 117.
  • a bottom substrate 118 is provided on the lower surface of the substrate 101 on which the insulating film is formed.
  • the bottom substrate 118 is disposed so that the external connection portion 107 of the substrate 101 is exposed.
  • the opening of the second well 112 is closed by the bottom substrate 118.
  • the open surface of the groove-like exchange port 113 is closed on the bottom substrate 118.
  • a tube 114 is connected to the outer end of the exchange port 113.
  • the sensor 120 is placed on the sensor mounting base 121 such that the external connection portion of the sensor substrate 122 makes the abutment on the electrode contact pin 111.
  • the sensor substrate 122 can hold the specimen cell 1 that is a biological sample in close contact with the micro-dent 116 provided above the through-hole 117. As a result, the specimen cell 1 is placed near the measurement electrode 102, and a potential signal from the specimen cell 1 is measured at the measurement electrode 102.
  • the sample cells 1 can be easily captured on the sensor substrate 122. Further, by aspirating the sample cells 1 from below the through-holes 117 and by pressing the sample cells 1 with the upward force of the through-holes 117, the fixation of the sample cells 1 can be further facilitated.
  • the measurement electrode 102 is preferably formed in the hole of at least one through hole 117 formed in the sensor substrate 122 and around Z or the hole of the through hole 117 on the upper surface of the substrate 122. Yes.
  • the number and positional relationship of the through holes 117 formed on the sensor substrate 122 are arbitrary, and are not limited to the numbers shown in FIGS. 11 and 12, but the through holes 117 correspond to one measurement electrode 102. It is desirable to adopt a configuration in which a plurality is formed. Specifically, it is desirable that one or more measurement electrodes 102 have one or more and 2000 or less. With such a configuration, measurement that is not affected by the survival rate of the sample cells 1 can be performed.
  • the positional relationship between the through-holes 117 on the sensor substrate 122 can be arranged, for example, so as to be located at the nodes of the lattice, as shown in FIG.
  • an electric signal due to the specimen cell 1 held in the plurality of through holes 117 is detected from one measurement electrode 102 as one electric signal.
  • the sensor 120 according to the present embodiment is particularly useful for a drug screening or the like that simultaneously detects responses from a plurality of specimen cells 1.
  • the shape of the through-hole 117 is not particularly limited as long as it can hold the specimen cell 1.
  • the top opening may be cylindrical, which is larger than the bottom opening.
  • the shape in which the minute recess 116 is formed above the cylindrical through-hole 117 is a small recess.
  • the curvature of 116 is very desirable because the specimen cell 1 can be more securely adhered to and held at the boundary with the through hole 117.
  • the micro-dent 116 can be of any size depending on the target specimen cell 1, and is not particularly limited as long as it can hold the target specimen cell 1. More specifically, the size of the minute recess 116 is preferably in the range of 2 to 500 m in the same plane as the upper surface of the sensor substrate 122, and more preferably in the range of 10 to 100 / ⁇ . For example, when the major axis of the specimen cell 1 used as a biological sample is approximately 30 m, the diameter of the upper surface of the opening is preferably approximately 20 ⁇ m! / M.
  • the through-hole 117 may have a size that allows the measurement solution to pass by suction and does not allow the specimen cell 1 to pass.
  • the diameter of the through hole 117 is preferably in the range of 1 to 125 / ⁇ , and more preferably the diameter is in the range of 2 to 25 m.
  • the diameter of the through-hole 117 is preferably about 5 ⁇ m when the diameter of the minute recess 116 is about 20 ⁇ m.
  • the length of the through hole 117 is arbitrary.
  • the second well 112 stores a second solution.
  • the second page 112 There is no opening on the bottom (bottom board 118). For this reason, the second solution stored in the second well 112 is held in the second well 112 by gravity, and the through-hole 117 and the electrode 102 near the through-hole 117 do not separate, so that the second solution is stable. Voltage measurement becomes possible.
  • the second well 112 has an exchange port 113 for exchanging the second solution with another third solution on the side surface.
  • the pore forming substance such as nystatin can be brought into contact with the sample cell 1 at the portion in contact with the second well 112, if necessary.
  • the drug safety test sensor shown in Fig. 9 and Fig. 10 is made up of the three steps of manufacturing the sensor board, manufacturing the upper solution holding member, and bonding the sensor board and upper member shown in Figs. 11 and 12. It is formed.
  • 140 is prepared (step 1), and then a resist film 144 and a resist film 145 are laminated on both sides of the base 141 and the thin plate 143. Then, the resist film 144 on the base side is patterned to have a predetermined pattern to form a resist mask.
  • the substrate 140 as described above is called an SOI substrate, and is often used when manufacturing a semiconductor device, and is easily available. Therefore, a description of the substrate manufacturing method will be omitted.
  • the base 141 is etched to form the second well 112 and the groove-like exchange port 113 whose bottom is open (step 2).
  • an ordinary method such as dry etching or wet etching is used.
  • the resist film 145 on the thin plate 143 side is patterned so as to have an opening 145a at a predetermined position to form a resist mask (Step 3).
  • etching is performed from the thin plate 143 side by dry etching (step 4).
  • a gas that promotes etching is used as an etching gas.
  • SF6, CF4, XeF2, etc. can be used as a gas to promote etching. Wear. This is because they have the effect of promoting the etching of silicon not only in the depth direction but also in the lateral direction. In the experiment, the effect was confirmed using XeF2.
  • the shape of the etched portion becomes a hemisphere centered on the opening 145a of the resist film 145 as shown in FIG. 28, and a minute recess 116 having a partial force of the hemisphere is formed.
  • the resist film 145 resist mask
  • XeF2 hardly etched by XeF2
  • dry etching is again performed from the side of the thin plate 143 to form a through-hole 117 penetrating the thin plate 113 on the bottom surface of the minute recess 116 (step 5).
  • a dry etching method is optimal, and a gas that promotes etching and a gas that suppresses etching are used in dry etching.
  • Gases that promote etching include XeF2, CF4, and SF6.
  • Gases that suppress etching include CHF3 and C4F8.
  • a uniform protective film can be formed on the wall surface of the dry etching hole of the substrate 140.
  • SF6 was used as a gas to promote etching
  • C4F8 was used as a suppressing gas. Yes.
  • the formation of the through-holes 117 can be advanced only below the resist mask by the respective actions described above. Further, a protective film 146 is formed on the side surface of the through hole 117 by using a gas that suppresses etching at the same time.
  • a measurement electrode 102 mainly composed of gold is formed from the base 141 side of the substrate 140 by a normal thin film forming step and a patterning step (step 6).
  • a method of patterning an electrode an electrode material is vapor-deposited on a substrate and then etched using a photoresist to form a measurement electrode 102 and a corresponding lead wire 105 and an external connection 107. Is used as one set to form a desired pattern having a plurality of sets that are powerful.
  • a mask method of vapor deposition through a stencil mask in which an electrode pattern is formed in advance, and a lift-off method can also be applied to electrode pattern formation.
  • a flat bottom substrate 118 is attached from the base side with an adhesive to obtain a sensor substrate 122.
  • the sensor substrate 122 does not necessarily need to follow this configuration.
  • an exchange port is formed in the bottom substrate 118 so as to communicate with the second well 112 without forming an exchange port in the base, and the bottom substrate 118 is connected to the substrate. It may be attached to the lower surface of 140.
  • the shape of the bottom substrate 118 is not particularly limited as long as the solution in the exchange port 113 does not leak and the external connection portion 107 to which the measurement electrode 102 is connected via the lead wire 105 is exposed. As shown in FIG. 11 and FIG. 12, it is preferable that only the external connection portion 107 is formed in a flat plate shape with a cutout.
  • the wafer is diced and cut into small pieces having a predetermined angle, and one small piece is used as the sensor substrate 122.
  • the electrode 102, the lead wire 105, and the external connection 107 are formed on one small piece.
  • the sensor substrate 122 is mounted on one wafer. It is preferable from the viewpoint of productivity that a plurality of pieces are formed, and then cut into small pieces having a predetermined angle by dicing, and one small piece is used as a sensor substrate.
  • a thermal oxide film is formed on the surface of silicon by a normal thermal oxidation process. This process can be used when the surface resistance of silicon is to be increased as much as possible. Unless a very high surface resistance is required, only a natural oxide film naturally formed on the surface of silicon is sufficient. is there.
  • a sensor is provided on the bottom surface of a solution holding unit 119 having a well-formed body 131, which is a plate-shaped container provided with a large number of first wells 104 made of resin separately, and a reference electrode 103.
  • the thin plate 143 side of the substrate 122 is attached with an adhesive or the like.
  • a normal method such as press molding, stereolithography, and cutting is used. If these methods are used, it is not particularly difficult to provide the recess 104 with a predetermined shape in the recess 104 and the opening 104a on the bottom surface of the recess, so the description is omitted here.
  • the well-formed body 131 can be realized, for example, by selling a multi-hole plate (96-hole, 384-hole, etc.) conforming to the SBS standard, which is sold as a commercial product, only at the opening. These are also useful in terms of manufacturing costs.
  • the tube 114 is connected to the exchange port 113 of the sensor board 122.
  • the sensor used in the present embodiment is manufactured.
  • each of the second wells 112 and the exchange port 113 need not necessarily be integrally formed.
  • an insulating material is desirable.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • Such a material is excellent in microfabrication, is soft and has an adhesive force, so that it can be easily connected to the sensor substrate 122 and does not leak.
  • a metal deposition method such as vapor deposition and sputtering, or electroless plating can be used.
  • the target metal can be easily deposited on the side walls of the first well 104 and the second well 112 by performing the treatment of attaching the holding unit 119 to the rotating stage of the deposition apparatus at an angle.
  • FIG. 13 is a block diagram of a drug safety test system using the sensor described in the present embodiment.
  • the difference between the drug safety test system (2) of the present embodiment and the drug safety test system (1) shown in Embodiment 1 is that the device for injecting and replacing the second solution into the solution storage unit Therefore, the difference will be described below with reference to FIG.
  • the pharmaceutical safety test system of the present embodiment includes a second in-well solution replacement device 157c for replacing the solution in second well 112. Further, as a solution to be injected, a channel switching device 158c for switching between a second solution (L5 in FIG. 13) and a third solution (L6 in FIG. 13) is provided.
  • the flow path switching device 158c is electrically connected to the calculation processing unit 155, and the calculation processing unit 155 controls the flow path switching device 158c to switch the solution at a predetermined timing and procedure. Send a signal.
  • the second solution can be replaced with the third solution and the third solution can be replaced with the second solution.
  • the second intracellular solution replacement device 157c also has a device (P in Fig. 13) for guiding the sample cells into the through-hole, the sample cell through-hole can be mounted with the sensor 120 attached to the system. And pharmacological response measurement.
  • Examples of the device P for inducing cells include suctioning a solution in a through-hole by negative pressure.
  • the components connected to the second well solution replacement device 157c shown in Fig. 13 represent the second solution reservoir (L5), the third solution reservoir (L6), and the cell induction suction device (P). I have.
  • the measurement environment adjusting device 156 has a function of adjusting the solution in the first well and the solution in the second well 112 of the sensor 120 at different desired temperatures.
  • Example 1 a drug safety test sensor 120 of Embodiment 5 shown in FIGS. 9 to 12 was prototyped. Using the sensor 120, an experiment was performed to measure the response of cells.
  • a 4-inch SOW wafer was used as a substrate material for manufacturing the sensor substrate 122.
  • a through hole 117 group was formed on the substrate surface (upper surface) by dry etching using the gas described in the fifth embodiment.
  • the silicon oxide layer which was the intermediate layer, was removed, and the front and back surfaces were penetrated.
  • An electrode was patterned on the back surface by using a vacuum evaporation method or a sputtering method. Gold was used for the electrode material. Then, it was diced into small pieces of 30 mm square to make small pieces. As a result, one measurement electrode 102 was formed on a 30 mm square substrate, and a sensor substrate 122 in which about 100 through holes 117 were formed in the electrode 102 was obtained.
  • each first well 104 As the well forming body 131 of the sensor of Example 1, a well of a 96-well plate conforming to the SBS standard was used. An opening 104a was provided through a step of forming a tapered hole having a top surface diameter of 5 mm and a bottom surface diameter of lmm on the bottom surface of each first well 104, and the thin plate side force was also attached to the sensor substrate 122. Note that the connection was made at a position corresponding to the group of through holes 117 of the sensor substrate 122 described above. The volume of each first well 104 is approximately 250 ⁇ L.
  • the reference electrode 13 is made of gold having a diameter of 0.5 ⁇ m.
  • a slit structure 113 was further formed on the measurement electrode 102 side. On the back surface, a channel 113 having a width of lmm and a height of 360 m is formed. Exchange ports were provided at both ends, and a PEEK tube 114 with an outer diameter of 360 ⁇ m and an inner diameter of 150 ⁇ m was attached.
  • Specimen cells were obtained by genetic modification technology using HERG (Human Enter-a-gogo-Related Gene). Human kidney embryo cells HEK-293 (hereinafter, HERG cells) expressing the channel were used.
  • the HERG channel is a target ion channel that causes QT prolongation, and a drug safety test was performed using the above cells as specimen cells.
  • the HERG channel and the test cell will be described using a HERG ion channel and a HERG-expressing cell.
  • the inside of the first well 104 of the sensor 120 was filled with a culture solution, and then 100,000 HERG cells were seeded in each first well 104.
  • As the culture solution DMEM + 10% by weight FBS was used. After aspirating the sample cells from the back surface and guiding them to the through-holes, the cells were cultured in an incubator maintained at 37 ° C and a C02 concentration of 5%. After culturing the cells for a predetermined time, the sensor of Example 1 was removed from the incubator, installed in a drug safety test system, and an experiment for testing the safety of the drug was performed.
  • E-4031 (Sigma M5060), which has a known effect of selectively antagonizing HERG, was used as the drug to be tested.
  • E-4031 is known to cause acquired QT prolongation by selectively antagonizing the HERG channel.
  • control solution Prior to the measurement of the sensor response, the culture solution remaining in the first well 104 was replaced with a control solution. Thereby, measurement can be performed stably even in the atmosphere.
  • the composition of the control solution is based on Hanks' solution and has a buffering effect with HEPES.
  • the pH of the solution is set at 7.4.
  • a back-side control solution (second solution) containing nystatin is immediately injected into the exchange port 113 into the sensor 120 of the first embodiment.
  • the final concentration of nystatin is adjusted to 240 g / mL.
  • the composition of the back side control solution is a buffer solution obtained by chelating Ca ion with EGTA based on potassium salt. Then, the pH of the solution was adjusted to be maintained at 7.2 with 10 mM HEPES.
  • the voltage measurement was also started for 0 seconds with the Hanks control solution in the absence of the test drug described above in the first well 104 (state A1 in FIG. 14, time 0 to 15 seconds). . Then, 15 seconds later (at G1), the control solution 1 was replaced with the drug solution 1 (Hank's solution containing 1 ⁇ -40 of E-4031) (the state of B1 in FIG. 14, time 15 to 30 seconds). As a result, an increase in the voltage amplitude was observed with the injection of ⁇ -4031 (El in FIG. 14). In the experiment, the control solution 1 was returned to the control solution 1 again at the time of 30 seconds (at the time of HI) (state of C1 in FIG. 14), but thereafter, the increase in the voltage amplitude became uncontrollable. This is consistent with the data measured with the notch clamp.
  • the amplitude of the voltage signal in state A1 has increased to the amplitude of the voltage signal in state B1 by bringing the drug solution 1 into contact with the specimen cells. This is the result of E-4031 antagonizing the HERG ion channel.
  • the amplitude of the voltage signal in state C1 is approximately the same as the amplitude of the voltage signal in state B1. This phenomenon is caused by the fact that E-4031 irreversibly antagonizes the HERG ion channel, and thus the control solution This is because the amplitude of the voltage signal does not return to the level of the original state A1 even after returning to.
  • the test drug is irreversibly converted to the HER Since it is antagonizing the G ion channel, it can be determined that there is an "arrhythmic effect".
  • the comparison of the amplitude of the voltage signal can be performed by the operator while looking at a graph as shown in FIG. 14, or the measuring instrument that measures the amplitude of the voltage signal determines the amplitude of the voltage signal in state A1 and state C1 Is used to determine whether the difference in force is below a certain reference value or above a reference value.
  • A3 represents a state in which the control solution 1 was injected into the well 104
  • B3 a drug solution of the drug under test reversibly antagonizing the HERG ion channel
  • C3 a control solution 1 again in the well 104.
  • HERG is a slow voltage-sensitive ion channel. This is because they are slightly open.
  • control solution 1 (Hanks solution above)
  • the voltage measurement was started for a time of 0 seconds with the above-mentioned Hanks control solution in the absence of the test drug in the first well 104 (state A2 in FIG. 15, time 0 to 15 seconds). . Then, 15 seconds later (at G2), the control solution 1 was replaced with the control solution 2 (Hank's solution having the same composition as the control solution 1) (the state of B2 in FIG. 15, time 15 to 30 seconds). Even when the control solution was changed from the control solution 1 to the control solution 2, no increase in the amplitude of the voltage signal was observed (E2 in FIG. 15). In the experiment, the control solution 1 was returned to the control solution 1 again at a time of 30 seconds (at H2) (state of C2 in FIG. 15). Again, no increase in the amplitude of the voltage signal was noticeable.
  • the appropriate threshold varies depending on the experimental conditions and the judgment level of risk.
  • the c / a force Sl. Is set to about 2 to 5, more preferably about 1.5 to 2.5.
  • Example 1 the amplitude value of the voltage signal during the injection of the control solution was about 2 / z Vp-p, and the amplitude value of the voltage signal during the injection of the drug solution was a maximum of 8 / z Vp-p, which was about 4 times. It became. In order to quantitatively and automatically evaluate the effect of increasing the amplitude of these voltage signals, the following analytical algorithm was developed.
  • a voltage threshold is provided, and a change start time (G1 in FIG. 14) at which a transition from a steady state to an increased danger state due to antagonist injection is sensed based on whether or not the voltage threshold is exceeded.
  • Voltage time series data for 10 seconds after the change start time (in Fig. 14, time 15 to 25 (Voltage amplitude in seconds) as a danger rising state, and the change starting time force and the previous 10-second voltage time series data (voltage amplitude in time 5 to 15 seconds in Fig. 14) are similarly cut out as a steady state, and statistically To analyze.
  • the voltage threshold was set to ⁇ 3 / zV.
  • the voltage time-series data for 10 seconds after returning from the drug solution 1 to the control solution 1 in FIG. 14, the voltage amplitude in the time period of 25 to 35 seconds) is cut out in the same manner.
  • a standard deviation SD1 is obtained for each of a certain small section Y with respect to the time-series data of each state automatically cut out by the above method.
  • the frequency distribution of each SD1 was determined, the peak value of the distribution and the variance (half width) were compared as statistical values, and the increase rate of each was used as an index to determine the safety of the test drug.
  • the same analysis section and analysis method were applied to the voltage time series data for the control solution 2 shown in FIG. 15 in the same manner. The results are shown in FIGS.
  • FIG. 16 shows the results of comparison of the peak area sizes of the histograms of the state Al, the state B1, and the state C1 with respect to the drug solution 1 (E-4031).
  • Figure 18 shows the results of the comparison.
  • Fig. 17 shows the results of comparison of the peak town sizes of the histograms of state A2, state B2, and state C2 for control solution 2, which is the control, and
  • Fig. 17 shows the results of comparison of the magnitude of the same variance K.
  • FIG. The rate of change from state A to B, and from state A to state C, for the same variance K as the peak area of drug solution 1 (or control solution 2) and control solution 1 determined in Figs. 16 to 19
  • Figure 20 shows the results of determining the rate of change of
  • the rate of change from the state A to the state in the peak town and the variance value K of the histogram statistic is the percentage when the peak town (or the variance value K) in the state A is 100%, that is, It is calculated by JcZja by the peak mouth a of state A and the peak mouth c of state C.
  • Each small section Y was set to 10 msec in consideration of the fact that the opening and closing frequency of the ion channel is about several msec.
  • the peak town and the variance K of the histogram statistical values used as indices for judging drug safety in this example are both in a dangerous state (state B1) from the viewpoint of the drug safety test.
  • state B1 a dangerous state
  • the transition I an increasing index.
  • this sensor outputs to the side that increases when it transits to a dangerous state, the minimum resolution for recognizing the dangerous state can be set larger than that of the decrease index type output.
  • the rate of change of the dangerous drug solution from state A to state C was 236.1% at the peak town and 236.2% at the variance K, all of which increased slightly more than twice.
  • the change rate of 200% or more in the peak town JcZja calculated in the peak town c of the state C and the peak town a of the state C is 2 or more
  • a change in peak value K of 200% or more KcZKa calculated from the peak value Kc in state C and the peak value Ka in state C of 2 or more was also recognized as a significant difference.
  • the rate of change of state C when the state A of a chemical substance that does not have a danger exists and is not contained is 70.1% in the peak town and 70.1% in the variance value K when the state A is 100%. Both decreased slightly, but did not increase.
  • Example 2 is an example of the drug safety sensor according to Embodiment 1.
  • the sensor does not have a through-hole, and since the channel is positively activated by applying a solution stimulus, the signal output from one cell is collected with high sensitivity. What you can get.
  • sensor 120 includes sensor substrate 101 and well forming body 131.
  • a 4-inch Si wafer is used, and a photoresist is spin-coated thereon.
  • a circular measuring electrode 102 having a diameter of 5 m is placed upright on each of the grid-shaped nodes of 6 rows and 6 columns, and the distance between the centers of the electrodes 102 is 20 / zm.
  • a plurality of patterns having lead wires 105 radiating from the respective electrodes 102 were exposed to predetermined positions on the Si wafer and developed.
  • a gold thin film was deposited on the entire surface of the wafer by a vacuum evaporation method. Then, lift-off completes the patterning of the gold electrode on the Si wafer.
  • Guinea pig papillary muscle cells were acutely isolated from guinea pigs and used as specimen cells.
  • the delayed rectifier potassium channel Kr present in guinea pig papillary muscle cells is the target biological component of the drug under test.
  • the surface of the sensor 120 to be seeded including the measuring electrode 102 of the sensor 120 was modified to have biocompatibility.
  • a sensor including the surface of the measurement electrode 102 using collagen (Sigma, P-4511) which is a cell adhesive protein as an immobilizing material.
  • the substrate 101 was covered by a predetermined method for one hour (at 37 ° C.). Then, it was rinsed several times with PBS (phosphate buffered saline).
  • the cell suspension was resuspended in culture medium after concentration by isolated cells centrifuge, it was seeded at a concentration of the measuring electrode 102 in 1 X 10 5 cells ZCM 2 sensor 120, a predetermined The cells were cultured at 37 ° C and 5% CO for a period of time.
  • control solution 1 was replaced with a control solution having a buffering effect with HEPES based on Hanks' solution.
  • the solution was basically two types in addition to the above. The first is the control solution 1 described above. The positive control drug and the drug to be tested were used at a predetermined concentration in the control solution. Second, the control solution 1 has the same composition as that of the control solution 1 described above, and is a high ion concentration control solution in which only a specific ion concentration of the control solution 1 is set high. No operations such as crushing and pore formation were performed on the cells.
  • terfenadine Sigma, T9652 was used as a positive control drug.
  • ⁇ -conotoxin GVIA (Sigma, C9915) was used by mixing it with Control Solution 1 at a concentration of 1 ⁇ . It is known that ⁇ -conotoxin GVIA specifically inhibits voltage-dependent calcium channels and does not respond to channels present in muscle, but inhibits the aforementioned channels present in nerve synapses. It is expected that guinea pig papillary muscle cells do not respond to the delayed rectifier potassium ion channel. Control solution 1 contains 137 mM NaCl and 4 mM KCl in the ion concentration.KC1 of the high ion concentration control solution was set to 80 mM, and NaCl was reduced to 61 mM to avoid an increase in osmotic pressure. Was. In other words, the intracellular potential can be increased indirectly by replacing the solution with a high ion concentration control solution.
  • the pharmaceutical safety test method and system of the present invention provide a measurement electrode corresponding to the fact that QT prolongation occurs without a process of applying an electric signal newly to the HERG channel by an external force. This method is useful as a method for evaluating open-channel candidate drugs with inherent dangers, in which the response and response time are prolonged irreversibly compared to the absence of the drug.
  • the pharmaceutical safety test method and system of the present invention can be measured in a one-liquid system without disrupting the cell membrane and using an artificially prepared intracellular solution. Testing can be performed under measurement conditions close to the environment. Due to the effects of both, the pharmaceutical safety test method of the present invention can be a more reliable test than the conventional method.
  • the external application electric circuit and the like can be omitted, and the device can be simply configured. Contributes to equipment productivity and manufacturability.
  • the drug safety test system of the present invention judges the danger of the test drug using the voltage response difference of the sample cell composed of the target biological component containing the risk element to the test drug as an index.
  • This is a high-throughput drug safety test system that is useful, for example, in a high-speed drug screening device that excludes candidate compounds that pose a danger to the human body in the early stage of new drug development.
  • the pharmaceutical safety test method and system of the present invention can also be applied to uses such as a rapid diagnostic technique for congenital and acquired long Q Q syndrome.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　生体環境を模した測定状態で、医薬品の危険性評価の信頼性が高い、医薬品安全性試験方法及びシステムを提供することを目的とする。 　本発明の医薬品安全性試験方法は、ＨＥＲＧイオンチャネル及びその相同物で構成される細胞を用い、複数の測定電極を持つセンサを使用する医薬品安全性試験方法であって、Ａ）被試験医薬品を含まない対照溶液に接した状態で前記センサの電気応答を測定する工程、Ｂ）前記被試験医薬品を含む測定溶液に接した状態で前記センサの電気応答を測定する工程、Ｃ）工程Ｂ１の後、再び前記被試験医薬品を含まない前記対照溶液に接した状態で前記センサの電気応答を測定する工程を含み、前記工程Ａ及び前記工程Ｃで測定された電圧信号を比較し、その結果に基づいて、被試験医薬品の危険性を判断する。                                                                                 

Description

明 細 書
医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システム
技術分野
[0001] 本発明は、不整脈を引き起こす HERGチャネルを含む検体細胞に対する被試験 医薬品の危険性を判断する、医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システ ムに関するものである。
背景技術
[0002] 近年、医薬品による催不整脈作用が大きな問題となっている。この催不整脈作用は 、薬物誘発性 QT延長症候群 (又は、後天性 QT延長症候群)と呼ばれ、薬物が心筋 細胞上のイオンチャネルに作用し、心電図において QT間隔を延長させ、重篤な不 整脈を引き起こす。薬物による QT延長は、頻度は低いが、時には torsades de pointe s型の心室頻拍ゃ突然死といった重篤な副作用を誘発する。例えば、抗ヒスタミン薬 であるテルフエナジン、ァステミゾールは遅延整流性カリウムイオンチャネルを阻害し 活動電位を延長することが知られており、心室頻拍ゃ突然死が報告されている。
[0003] 国際的な医薬品承認審査資料の調和を目的とする日米 EU医薬品規制調和国際 会議 (ICH)においても、「安全性薬理試験ガイドライン」の中に、「再分極と伝達異常 に対する手法を含む in vivo, in vitro, ex vivoの評価も考慮すべきである」との記載が 盛り込まれた。安全性の高い医薬品の開発のためには、開発段階で効果的な催不 整脈作用検出法を適用することが必要とされている。
[0004] QT延長を引き起こす標的イオンチャネルは、遅延整流性のカリウムチャネルである と言われている。心筋細胞などの野生型細胞には、遅延整流性のカリウムチャネル 以外にも様々なイオンチャネルが内在している。このため、現在最も感度が高ぐ信 頼性の高!、評価方法は、代表的な遅延整流性のカリウムチャネルである HERG (Hu man Enter-a-gogo- Related Gene)チャネルを、アフリカッメガエルの卵母細胞などの 宿主細胞、 HEK293、 CHOなどの哺乳類培養細胞に遺伝子導入技術により強制 的に発現させた系を検体細胞として、ノツチクランプ法で電気生理学的評価を行う方 法である。なかでも、アフリカッメガエルの卵母細胞に導入された HERGイオンチヤ ネルは薬剤感受性が低くなるため、特に、哺乳類培養細胞に発現させた系がより信 頼性の高 、評価手法となりえる。
[0005] つまり、危険性を有する医薬品候補ィ匕合物は、 HERGイオンチャネルを拮抗する。
例えば、心筋細胞なら HERGチャネルが拮抗されたことにより、カリウムイオンの出入 りが阻害され、再分極が起こらなくなる。この一連の動作が、薬物による QT延長を発 生するメカニズムである。この危険性を有する医薬品候補化合物に共通する特徴は 、一度 HERGチャネルに拮抗すると、 HERGチャネルのイオンの出入り口である孔（ ポア）にはまり込み、抜けなくなるオープンチャネル型拮抗薬である。
[0006] 新規医薬品の開発の初期段階で安全性試験を実施し、医薬品の選別を開発前に 行うことは、開発投資コスト、開発時間、リソースの効率面などから望ましい。そのため には、大量の医薬品開発候補化合物に対し試験を実施する必要がある。この用途に は、測定の迅速性、大量処理能力がより重視される。ところが、ノツチクランプ手法は 、電極の調製及びその操作などに熟練した技術を要し、一つの試料の測定に多くの 時間を要するので、この目的には適していない。
[0007] そのため、貫通孔を持った平面パッチクランプセンサを用い、 HERGイオンチヤネ ルを通過する電流を得、安全性を試験するセンサが既に開示されている（例えば、特 許文献 1、特許文献 2、非特許文献 2参照)。
[0008] これら特許文献 1から特許文献 4に開示される平面パッチクランプセンサは、いずれ も、生体内塩濃度組成に近 ヽ溶液中で被検体細胞を平面基板に設けた貫通孔へと 誘導し、配置し、負圧により細胞を貫通孔へと密着 (ギガシール)させた後、貫通孔と 接する領域の細胞膜を更なる負圧吸引をもって破ることにより、細胞膜を通過する電 流を膜の両側に配置した不分極性の電極 (代表的には銀一塩ィ匕銀電極)、つまり、 測定電極と参照電極にて測定するものである。
[0009] 測定では、細胞膜内外の電位差を、人工的にある設定値で保持した際のイオンチ ャネルを通過する電流が測定される。ここで、標的チャネルのひとつである HERGィ オンチャネルを持った細胞を使った、従来の試験方法の具体的なプロトコールの一 例を示す。
[0010] 測定電極側に細胞内と塩濃度や浸透圧を人工的に調製した擬似電極内液を充た し、参照電極側に細胞外と塩濃度や浸透圧を人工的に調製した擬似電極外液を満 たして、これらの 2種類を使用する。まず、測定電極のフィードバック機構を利用し、 細胞内の電位を人工的に- 80mVに保持する。そして、 - 80mVから +20mVまでステップ 状に細胞内の電位を人工的に上昇させ、 1.5秒間その電位で保持した後、 +20mVか ら- 50mVへと再度ステップ状に細胞内の電位を人工的に下降させる。その下降させ た際に流れる外向き電流の大きさが HERGチャネルを流れるイオンの流れとして扱 え、上記電流ピーク値を指標に被試験医薬品の安全性が判断される。
[0011] 具体的には、医薬品の危険性は、危険性を有する候補薬剤の非存在下で、細胞 内外の電圧を過渡的に変化させたときの膜を外向きに流れる電流を測定し、候補薬 剤存在下で、繰り返し細胞内外の電圧を過渡的に変化させたときの同外向電流の減 少を持って、 QT延長を判断する。
[0012] しかし、このような評価方法として用いられる短時間間隔でのステップ状の大きな電 位変動は、生体環境では起こりえない。つまり、急激な電圧増減を使用する人工的な 電位差プロトコールと、人工的成分が加えられた擬似内液を用いた状態での測定は 、細胞本来の応答を測定して 、るとは必ずしも言えな 、。
[0013] なお、非特許文献 3によれば、カルシウムキレート剤等の人工的成分が加えられた 擬似細胞内液を用いた測定は、 QT延長に対する寄与が小さ 、L型カルシウムチヤ ネル電流の増強が前面に出て、 QT延長を引き起こす支配的な要因である遅延整流 性カリウムチャネルの電流が減少したと報告されている。これは、細胞本来の細胞内 溶液中には様々な細胞内情報伝達を担う生体分子が存在しているが、擬似内液は、 それらを忠実に再現できないことによるものである。
[0014] ノツチクランプ方式の測定に際してホールセル状態を得るために、貫通孔と接する 領域の細胞膜を破砕する必要がある。膜がきれいに破けない場合には、測定効率の 減少とともに、漏れ電流による測定感度低下を引き起こす。し力も、細胞にも傷害を 与えるという副次的な短所もあるが、もっと重要なことは、膜の破砕により細胞内機能 性物質の流出が起こり、細胞本来の応答の消失をきたす。
[0015] また、特許文献 2及び非特許文献 2にお 、ては、アンフォテンシン βなどの造孔性 の化学物質を使用して、細胞内機能性物質の流出を抑える改善を行っている。 [0016] しかしながら、測定状態が In vitroで、さらに HERGイオンチャネル発現系を用いた 理想測定系であるという仮定があり、さらに突然死をも引き起こす医薬品の除外という 目的から考えると、人工的な電位刺激プロトコールを用いた測定状態での評価をす るのは大きな問題となる。
[0017] そこで、これら特許文献 1から特許文献 4に開示される平面パッチクランプセンサと 異なる測定原理で細胞上のイオンチャネルの化学物質識別能を判定する平面基板 センサが既に開示されている (特許文献 5)。
[0018] この特許文献 5に開示される平面基板センサは、平面パッチクランプセンサと同様 に、貫通孔を持つ。貫通孔は、微細加工技術で一括加工することにより一つの基板 に多数作製できる。言い換えれば、ノツチクランプに比べ、多数の細胞の同時並列 測定が可能である。平面パッチクランプセンサとの違いは、電極が分極性電極である 金電極力 なることである。そして、被検体細胞を細胞外に配置した電極の電位変化 で測定する原理に基づく。このため、細胞膜を破砕することなぐよって、人工的に調 整した細胞内液を使用することがない。言い換えれば、平面パッチクランプセンサに 比べ、より生体環境に近！ヽ測定条件で試験を実施できる。
特許文献 1：国際公開第 01Z25769号パンフレット
特許文献 2：米国特許第 6488829号明細書
特許文献 3：国際公開第 01Z59447号パンフレット
特許文献 4:国際公開第 99Z31503号パンフレット
特許文献 5：国際公開第 02Z055653号パンフレット
非特許文献 1：細胞の分子生物学、第三版、 Garland Publishing Inc., New York, 1994 ，日本語版、中村桂子ら監訳、 181〜182頁、 1995年、教育社
非特許文献 2 : ASSAY and Drug Development Technologies, Vol.1, Number 1—2, ppl 27-135, 2003
非特許文献 3 : Pflugers Arch.Vol. 417, ppl85- 193,1990
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0019] しかしながら、前記のセンサ構成では、 HERGチャネルを拮抗するオープンチヤネ ル型の拮抗剤を特定することができな 、。
[0020] 従来例として挙げられる特許文献 1から特許文献 4に開示される平面パッチクランプ センサでは、医薬品の危険性は、以下の工程で判断される。第一に、危険性を有す る候補薬剤の非存在下で、細胞内外の電圧を過渡的に変化させる。つまり、細胞内 を強制的に脱分極させて HERGイオンチャネルを開けた時に外向きに流れる電流を 測定する。第二に、候補薬剤存在下で、細胞内外の電圧を過渡的に変化させる。つ まり、同様に、細胞内を強制的に脱分極させて HERGイオンチャネルを開けた時に 観測される同外向電流を測定する。危険性を有する候補薬剤の非存在下と候補薬 剤存在下での外向電流の減少をもって、危険性候補薬剤が HERGチャネルを拮抗 する度合いを判断する。第三に、候補薬剤存在下で電圧印加を繰り返し、細胞内外 の電圧を繰り返し変化させる。つまり、同様に、 HERGイオンチャネルを何度も開けた 時に観測される同外向電流を測定する。外向電流が変化しないことで、 HERGィォ ンチャネルのポアに不可逆的にはまり込み、脱離しない、オープンチャネル型の拮抗 剤であると判断できる。
[0021] 一方、特許文献 5に開示した前述のセンサ構成では、細胞膜を破砕せず、細胞外 に配した電極によって、細胞外の電位変化を測定するため、より生体環境に近い測 定条件で試験を実施できるという長所を持つものの、外部力 人工的に電気的な刺 激を印加し、強制的に HERGイオンチャネルを開くと 、う操作を行うことはできな!、。 つまり、危険性を有する候補薬剤存在下で、細胞内電位の変化に起因する電極電 位は測定できるものの、その変化がオープンチャネル型拮抗剤に依るもの力否かは 判断できない。
[0022] 以上に見られるように、平面基板センサでは、 HERGイオンチャネルを持つ被検体 細胞を使って、不整脈を引き起こす危険性を有する被試験化合物を判別することが できなかった。
[0023] 本発明は、前記従来の課題を解決するもので、外部から電気信号を新たに印加す ることなぐ生体環境を模した測定状態で、不整脈を引き起こす危険性を有するォー プンチャネル型 HERGチャネル拮抗剤を判別する医薬品の安全性試験方法を提供 することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0024] 上述した従来技術の課題を解決するために、本発明の医薬品安全性試験方法は、 測定電極を持つセンサを使用して、被試験医薬品の、 HERGイオンチャネル又は その相同物を含む検体細胞に対する危険性を試験する医薬品安全性試験方法であ つて、
O)被試験医薬品を含まな ヽ対照溶液中に、 HERGイオンチャネル又はその相同 物を含む検体細胞を保持し、前記検体細胞近傍に前記測定電極を配置する工程と
A)前記対照溶液に接した状態で、前記測定電極によって電圧信号を測定するェ 程と、
B)工程 Aの後、前記対照溶液を、前記被試験医薬品を含む測定溶液に置換し、 前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
C)工程 Bの後、前記測定溶液を、再び前記対照溶液に置換し、前記測定電極によ つて電圧信号を測定する工程と、
D)前記工程 Aと前記工程 Cで測定された電圧信号を比較し、その結果に基づ 、 て、前記被試験医薬品の危険性を判定することを特徴とする。
[0025] 危険性を内在する被試験医薬品を本発明の医薬品評価方法を用いて評価すれば 、 QT延長を起こしていることに相当する測定電極での応答及び応答時間力 被試験 医薬品非存在下にくらべ延長される。また、再び被試験医薬品非存在下に戻した時 は、測定電極での応答及び応答時間が延長されたまま保持される。この応答の形式 により、被試験医薬品が不可逆にイオンチャネル孔 (ポア）に入ることに相当するォー プンチャネル拮抗剤力否力が判別できる。また、標的生体構成要素を人工的に刺激 する処理を経ることなぐより生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。つまり、 信頼性の高 、安全性試験を実施することができる。
[0026] 前記工程 Dは、前記工程 Aによって測定された電圧値 al、及び前記工程 Cによつ て測定された電圧値 clから clZalを算出し、
clZalが予め設定された設定値を超えるときは危険性ありと判断し、 clZalが前 記設定値以下であるときは危険性なしと判断する工程であっても良い。 [0027] 前記医薬品安全性試験方法にお!、て、 E)前記工程 Aの前に、前記検体細胞に含 まれるイオンチャネルであって、前記 HERGイオンチャネル以外の少なくとも 1種類 以上のイオンチャネルを不活性ィ匕する化学物質をカ卩える工程を含んで ヽても良!ヽ。
[0028] 前記医薬品安全性試験方法にお!、て、所定の時間間隔で、前記工程 Bと前記ェ 程 Cとを少なくとも 2回以上繰り返しても良い。また、この繰り返しにおいて、 1回目に、 前記測定溶液として第 1の被試験医薬品が含まれる第 1の測定溶液を用い、 2回目 に、前記測定溶液として第 2の被試験医薬品が含まれる第 2の測定溶液を用いること もできる。この場合、前記第 1の被試験医薬品と前記第 2の被試験医薬品が異なる医 薬品であっても良い。また、前記第一の被試験医薬品と前記第 2の被試験医薬品が 同一であり、第 1の測定溶液に含まれる第 1の被試験医薬品の濃度と、第 2の測定溶 液に含まれる第 2の被試験医薬品の濃度とが異なって 、ても良 、。
[0029] 前記第 1の測定溶液又は前記第 2の測定溶液のどちらか一方の代わりに、陽性対 照試薬又は陰性対照試薬を含む第 3の測定溶液を用い、
前記工程 Dにおいて、更に、前記第 1の測定溶液又は前記第 2の測定溶液を用い て前記工程 A及び前記工程 Cで測定された電圧信号の比 (clZal)と、前記第 3の 測定溶液を用いて前記工程 A及び前記工程 Cで測定された電圧信号の比（cl ' Za 1， )を対比することによって、医薬品の危険性を判定しても良 、。
[0030] 前記医薬品安全性試験方法にお!、て、前記検体細胞は、例えば HERGイオンチ ャネルを定常発現させた細胞株であり得る。
[0031] 前記医薬品安全性試験方法にお!、て、 F)前記工程 A及び前記工程 Cの前に、所 定時間、前記検体細胞を第一の対照溶液に接触させた後、前記検体細胞が接する 前記第一の対照溶液を第二の対照溶液に換える工程があっても良い。また、 G)前 記工程 Bの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の測定溶液に接触させた後、前 記検体細胞が接する前記第一の測定溶液を第二の測定溶液に換える工程を含み、 前記第二の対照溶液及び前記第二の測定溶液が、それぞれ前記第一の対照溶液 及び前記第一の測定溶液と、前記試験医薬品以外の共通に含まれる少なくとも一つ のイオン濃度が異なるものであっても良い。
[0032] 前記医薬品安全性試験方法にお!、て、前記電圧信号が、予め設定したサンプル 時間毎の電圧信号の振幅の偏差値を計算する単位偏差値の集合の統計値であつ ても良い。
[0033] 前記統計値が、前記単位偏差値の分布の平均値であっても良い。また、前記統計 値が、前記単位偏差値の分布の分散値であっても良い。
[0034] 前記工程 Bにおいて、前記検体細胞が被試験医薬品を含む測定溶液に接した状 態で測定された電圧信号は、予め設定したサンプル電圧閾値を超えた後に検出した 電圧信号であることが好ま 、。
[0035] さらに、本発明は、
HERGイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を含む溶液を満たすことが 可能な凹部を有する基板と、
前記凹部に設けられ、かつ、前記検体細胞の近傍に配置可能な 1以上の測定電極 と、
前記溶液に浸し、前記測定電極と隔離するように設けられた参照電極とを有するセ ンサと、
前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定する電圧測定装置と、 前記凹部に対し複数種類の前記溶液を注入及び排出する溶液注入排出装置と、 制御装置と、を備え、
前記制御装置は、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部に第 1の種類の前 記溶液としての被試験医薬品を含まない対照溶液を前記凹部に満たし、この状態 a2 で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部力 前記対照溶液を排出し かつ前記凹部に第 2の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含む測定溶液を満 たし、この状態 b2で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との 間の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部カゝら前記測定溶液を排出し かつ前記凹部に前記対照溶液を再び満たし、この状態 c2で前記電圧測定装置によ つて前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、 前記状態 a2で測定された前記電圧と前記状態 c2で測定された前記電圧とを比較し 前記比較結果に基づ!、て前記被試験医薬品の安全性を判定する、医薬品安全性 試験システムである。
[0036] 上記医薬品安全性試験システムは、前記各測定電極の近傍に前記検体細胞が複 数配置されて 、る構成であっても良 、。
[0037] また、上記医薬品安全性試験システムは、前記センサが、前記基板を厚み方向に 貫通する貫通孔を有し、前記貫通孔近傍に前記測定電極が配置されて ヽる構成で あっても良い。
発明の効果
[0038] 本発明の医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性システムによれば、 HERGチ ャネルに外部から人工的に電気信号を新たに印加する処理を経ることなぐ QT延長 を起こしていることに相当する測定電極での応答及び応答時間が医薬品非存在下 にくらべ不可逆的に延長される、危険性を内在するオープンチャネル型候補医薬品 を評価できる。
[0039] また、本発明の医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システムによれば、 細胞膜を破砕することなぐかつ、人工的に調整した細胞内液を使用することなぐ 1 液系で測定できるので、より生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。この両 者の効果により、従来の方法に比べ、本発明の医薬品安全性試験方法は、より信頼 性の高い試験となることができる。また、外部印加用電気回路等を省略でき、装置を 簡便に構成することができる。さらに、装置の生産性、製造性の向上にも貢献する。
[0040] 本発明の上記目的、他の目的、特徴及び利点は、添付図面参照の下、以下の好 適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
図面の簡単な説明
[0041] [図 1-A]図 1 Aは、実施の形態 1における医薬品安全性試験方法を示すフローチヤ ートであって、ステップ S1とステップ S3の測定結果を比較する場合のフローチャート である。
[図 1-B]図 1—Bは、実施の形態 1における医薬品安全性試験方法を示すフローチヤ ートであって、ステップ S2とステップ S3の測定結果を比較する場合のフローチャート である。
[図 2]図 2は、実施の形態 1における医薬品安全性試験センサを模式的に示す断面 図である。
[図 3]図 3は、図 2に示すセンサの上面図である。
[図 4]図 4は、実施の形態 1における医薬品安全性試験方法の準備工程 (ステップ SO )を示すフローチャートである。
[図 5]図 5は、実施の形態 1の別の実施の形態における医薬品安全性試験方法のェ 程を示すフローチャートである。
[図 6-A]図 6—Aは、実施の形態 1に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示 す構成図であって、ゥエル内溶液置換装置及びゥエル内溶液排出装置を有する医 薬品安全性試験システムの構成図である。
[図 6-B]図 6— Bは、実施の形態 1に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示 す構成図であって、ゥエル内溶液置換装置を有する医薬品安全性試験システムの構 成図である。
[図 6-C]図 6— Cは、実施の形態 1に示した医薬品安全性試験システムを模式的に示 す構成図であって、ゥエル内溶液置換装置及びゥエル内溶液排出装置の！/、ずれも 有しない医薬品安全性試験システムの構成図である。
圆 7-A]図 7— Aは、本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャート であって、実施の形態 2における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチヤ一 トである。
圆 7-B]図 7— Bは、本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャートで あって、実施の形態 3における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャート である。
圆 7- C]図 7— Cは、本発明の医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチャート であって、実施の形態 4における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチヤ一 トである。
[図 8]図 8は、実施の形態 5における医薬品安全性試験方法の工程を示すフローチヤ ートである。
[図 9]図 9は、実施の形態 6における医薬品安全性試験センサの構造を示す部分断 面図である。
[図 10]図 10は、実施の形態 6の医薬品安全性試験センサの構造を模式的に示す図 (全体の斜視図）である。
[図 11]図 11は、実施の形態 6の医薬品安全性試験センサのセンサ基板の詳細構造 を示す部分断面図である。
[図 12]図 12は、実施の形態 6の医薬品安全性試験センサのセンサ基板の詳細構造 を示す下面図である。
[図 13]図 13は、実施の形態 6に示した医薬品安全性試験システムの構成図である。
[図 14]図 14は、実施例 1の実験プロトコール 1におけるセンサ 120電極電圧時系列 波形の測定結果を示す図である。
[図 15]図 15は、実施例 1の実験プロトコール 2におけるセンサ 120電極電圧時系列 波形の測定結果を示す図である。
[図 16]図 16は、実施例 1の薬剤溶液 2に関する電圧ヒストグラムピーク街の変化量の 測定結果を示す図である。
[図 17]図 17は、実施例 1の対照溶液 2に関する電圧ヒストグラムピーク街の変化量の 測定結果を示す図である。
[図 18]図 18は、実施例 1の薬剤溶液 2に関する電圧ヒストグラム分散値 Kの変化量に おける測定結果を示す図である。
[図 19]図 19は、実施例 1の対照溶液 2に関する電圧ヒストグラム分散値 Kの変化量に おける測定結果を示す図である。
[図 20]図 20は、実施例 1における電圧振幅値の変化の統計量の測定結果を示す図 である。
[図 21]図 21は、実施例 2におけるセンサ 120電極電圧時系列波形の測定結果を示 す図である。
[図 22]図 22は、実施例 2における電圧ヒストグラムピーク街の変化量の測定結果を 示す図である。 [図 23]図 23は、実施例 2における電圧ヒストグラム分散値 Kの変化量の測定結果を示 す図である。
[図 24]図 24は、実施例 3における電圧振幅値の変化の統計量の測定結果を示す図 である。
[図 25]図 25は、実施の形態 1に示したセンサ基板の製造方法における工程 1を示す 断面図である。
[図 26]図 26は、実施の形態 1に示したセンサ基板の製造方法における工程 2を示す 断面図である。
[図 27]図 27は、実施の形態 1に示したセンサ基板の製造方法における工程 3を示す 断面図である。
[図 28]図 28は、実施の形態 1に示したセンサ基板の製造方法における工程 4を示す 断面図である。
[図 29]図 29は、実施の形態 1に示したセンサ基板の製造方法における工程 5を示す 断面図である。
[図 30]図 30は、実施の形態 1に示したセンサ基板の製造方法における工程 6を示す 断面図である。
符号の説明
1 検体細胞
51 測定溶液
52 第一の溶液
101 基板
102 測定電極
103 参照電極
104 ゥエル（第一のゥエル）
105 リード線 (測定電極 102側）
106 絶縁膜
107 外部接続部 (測定電極 102側）
108 リード線 (参照電極 103側） 109 外部接続部 (参照電極 103側)
11 1 電極接点ピン
112 第二のゥエル
113 交換口
114 チューブ
115 開口
116 微小くぼみ
117 貫通孔
118 底面基板
119 溶液保持部
120 医薬品安全性試験センサ
121 センサ設置台
122 センサ基板 (小片基板）
131 ゥヱル形成体
31a . 開口
40 基板
41 ベース
42 中間層
43 薄板
44 レジスト膜 (ベース側）
45 レジスト膜 (薄板側）
45a パターン
46 保護膜
50 医薬品安全性試験システム 51 遮蔽箱
52 第一の増幅部
53 第二の増幅部
55 計算処理部 (コンピュータ） 156 測定環境調節装置
157a ゥエル内溶液置換装置
157b ゥエル内溶液排出装置
158 溶液切替装置
159 注入管
160 排出管
L1 測定溶液溜め
L2 陽性対照試薬溶液溜め
L3 試験医薬品 A溶液溜め
L4 試験医薬品 B溶液溜め
L5 第二の溶液 53溜め
L6 第二の溶液 54溜め
P 検体細胞 1導入装置
発明を実施するための最良の形態
[0043] 以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
[0044] (実施の形態 1)
図 1A及び図 1Bは、本発明の実施の形態 1における医薬品安全性試験方法のェ 程を示すフローチャートである。以下、本実施の形態を、図 1 A及び図 1Bを参照しつ つ説明する。
[0045] 本発明の医薬品安全性試験方法は、医薬品安全性試験センサの測定電極の近傍 に検体細胞を用意 (ステップ SO)した後、測定電極からの電気信号に基づく電圧信 号であって、検体細胞が接する溶液が、被試験医薬品が存在しない対照溶液である 場合における検体細胞の HERGチャネルの情報を含む電圧信号を測定する工程（ ステップ Sl、ここでの電圧信号を aとする）と、検体細胞が接する溶液が、被試験医薬 品が存在する測定溶液である場合における検体細胞の HERGチャネルの情報を含 む電圧信号を測定する工程 (ステップ S2、ここでの電圧信号を bとする）と、検体細胞 が接する溶液を再び被試験医薬品が存在しない対照溶液に戻した場合における検 体細胞の HERGチャネルの情報を含む電圧信号を測定する工程 (ステップ S3、ここ での電圧信号を cとする）と、ステップ S1とステップ S3の電圧信号を比較する工程 (ス テツプ S4A)、又はステップ S2と S3の電圧信号を比較する工程 (ステップ S4B)と、か 力る電圧信号の比較結果に基づ 、て、被試験医薬品の危険性を判断する工程 (ス テツプ S5、 S6及び S7、並びにステップ S8、 S9及び S10)力らなる。
[0046] ステップ S1にお 、て検体細胞が接する対照溶液と、ステップ S3にお 、て検体細胞 が接する対照溶液とは、成分が同じものである。ステップ S2において検体細胞が接 する測定溶液と、ステップ S1又は S3において検体細胞が接する対照溶液とは、被 試験医薬品が存在する力否かのみが異なるものであるとする。また、ステップ S1又は S3において、検体細胞が接する対照溶液は、測定溶液の被試験医薬品に換えて陽 性対照試薬又は陰性対照試薬を添加したものであっても良い。
[0047] ここで、ステップ S2にお!/、て、被試験医薬品が HERGチャネルを拮抗すると、上述 したようにカリウムイオンの出入りが阻害され、再分極が起こらなくなるため、電圧信号 は a<bとなる。一方、被試験医薬品がオープンチャネル型の拮抗剤でなければ、ス テツプ S3において、被試験医薬品が HERGチャネル力も離れるため、電圧信号は b > cとなるが、オープンチャネル型の拮抗剤であれば b cとなる。
[0048] すなわち、ステップ S4Aにおける電圧信号の比較とは、例えば、（1)電圧信号 a及 び cの差 [a— c]を検出し、その値が一定の基準値以下になる力否か判定すること、 ( 2)電圧信号 aと電圧信号 cの比 [cZa]を検出し、その値が一定の基準値以下になる か否力判定することをいう。同様に、ステップ S4Bにおける電圧信号の比較とは、例 えば、（1)電圧信号 b及び cの差 [b— c]を検出し、その値が一定の基準値以上にな るか否か判定すること、電圧信号 bと cの比 [cZb]を検出し、その値が一定の基準値 を超える力否力判定することを 、う。
[0049] 図 1Aは、ステップ S4Aでステップ S1と S3の測定結果を比較する場合のフローチヤ ートを示す。図 1 Aに示すフローチャートでは、ステップ S4Aの比較結果に基づき、ス テツプ S5〜S7にお!/、て被試験医薬品の安全性を評価する。ステップ S4Aで a及び c を比較した結果、ステップ S5において測定結果 (電圧信号）に差がない（例えば、 [c Za]が一定値以下である）と判断された場合、その被試験医薬品は、 HERGチヤネ ルを拮抗するオープンチャネル型の拮抗剤ではな 、ために、「催不整脈作用なし」と 判定される (ステップ S6)。
[0050] ステップ S5において、測定結果 (電圧信号）に差がある（例えば、 [cZa]が一定値 を超える）と判断された場合、その被試験医薬品は、 HERGチャネルを拮抗するォー プンチャネル型の拮抗剤であることになり、「催不整脈作用あり」と判定される (ステツ プ S7)。
[0051] 一方、図 1Bは、ステップ S4Bでステップ S2と S3の測定結果を比較する場合のフロ 一チャートを示す。図 1Bに示すフローチャートでは、ステップ S4Bの比較結果に基 づき、ステップ S8〜S10において被試験医薬品の安全性を評価する。ステップ S4B で b及び cを比較した結果、ステップ S8において測定結果 (電圧信号）に差がある（例 えば、 [cZb]が一定の基準値以下である）と判断された場合、その被試験医薬品は、 「催不整脈作用なし」と判定される (ステップ S9)。
[0052] ステップ S8において、測定結果 (電圧信号）に差がない (例えば、 [cZb]が一定の 基準値未満である）と判断された場合、その被試験医薬品は、 HERGチャネルを拮 抗するオープンチャネル型の拮抗剤であることになり、「催不整脈作用あり」と判定さ れる（ステップ S 10)。
[0053] [医薬品安全性試験システムのセンサ]
次に、本発明の医薬品安全性試験システムに用いるセンサの構造を説明する。図 2は、本実施の形態の医薬品安全性試験システムに用いるセンサの構造を模式的に 示す断面図である。また、図 3は、図 2に示すセンサの上面図である。本実施の形態 のセンサ 120は、基板 101と、基板 101の上に構築された溶液保持部 119とからなる 。溶液保持部 119は、測定溶液 51を保持するための複数のゥエル 104と、参照電極 103を備える。
[0054] 基板 101の上面には、複数の島状の測定電極 102が所定の位置に形成されてい る。また、基板 101の上面には、縁部に位置するように各測定電極 102に対応させて 外部接続部 107が形成され、この外部接続部 107とその対応する測定電極 102とを 接続するようにリード線 105が形成されている。そして、基板 101の上面の、測定電 極 102及び外部接続部 107が形成された部分を除く部分を覆うように絶縁膜 106が 形成されている。絶縁膜 106の測定電極 102の周囲に位置する部分は測定電極 10 2に向けてすり鉢状に窪んで凹部 106aを形成している。絶縁膜 106上には膜状のゥ エル形成体 131が形成されて!、る。
[0055] ゥエル形成体 131〖こは、各測定電極 102の上面とその周囲の凹部 106aを含む絶 縁膜 106の上に位置するように開口 13 laがそれぞれ形成されていて、各測定電極 1 02の上面及びその周囲の絶縁膜 106とこの開口 131aの内周面とで囲まれた空間が ゥエル 104を構成している。この開口 131aの縁部及び内周面に沿うように鍔付き筒 状の参照電極 103が形成されている。また、ゥ ル形成体 131の上面の縁部には、 各ゥエル 104に対応させて外部接続部 109が形成され、この外部接続部 109がゥェ ル形成体 131の上面に形成されたリード線 108によってその対応するゥヱル 104の 参照電極 103に接続されている。そして測定時には、外部接続部 107に第 1の増幅 部 152が接続され、外部接続部 109は接地される。
[0056] 電位測定時に、検体細胞 1は、測定電極 102の近傍に配置される。測定電極 102 力もの電位信号は、リード線 105、外部接続部 107、第一の増幅部 152を介して、参 照電極 103の電位を基準として測定される（以下、測定電極 102からの電位信号と、 参照電極 103からの電位信号の差を、測定電極 102からの電圧信号とも ヽぅ）。
[0057] 参照電極 103の電位はリード線 108、外部接続部 109を介して検出される。これに より、測定電極 102近傍に配置された検体細胞 1に起因する電圧信号が測定電極 1 02にて測定される（上述の工程 B)。
[0058] なお、電位測定時には、図 2に示したように、測定電極 102の近傍に検体細胞 1が 配置される力 図 3では、細胞は省略して、センサ 120の構成のみを表示する。セン サ 120の詳細な構成及び作成方法については後述する。
[0059] [検体細胞]
本発明の医薬品安全性試験に用いられる検体細胞は、 HERGチャネルを有する。 検体細胞は、 HERGチャネルを予め内在した細胞、 HERGチャネルを後力 導入し た細胞の 、ずれであっても良 、。
[0060] ここで、 HERGチャネルとは、細胞内及び細胞膜上に存在する生体構成要素であ つて、人体に対する危険性を有する被試験医薬品が作用する対象を指す。本発明 の医薬品安全性試験が適用できる HERGチャネルの作用は、危険性を有する被試 験医薬品に対して、活性化される場合と、不活性化される場合の、どちらであっても 良い。以下では、具体的に HERGチャネルが不活性ィ匕される時に危険性が増大す る場合にのみ記述する力 それだけに限定されない。
[0061] そのような HERGチャネルとしては、細胞膜上に存在するイオンチャネル、細胞内 に存在する情報伝達物質、代謝産物等の各種タンパク質、核酸類と、それらの改変 物などが挙げられる。特に、本発明の主要な応用例である、薬物誘発性 QT延長症 候群を例にとると、 HERGチャネルには、 HERGイオンチャネルや遅延整流性力リウ ムイオンチャネル、先天性 QT延長症候群の原因遺伝子 LQTなどが挙げられる。ま た、前述の HERGチャネルを予め内在した検体細胞としては、モルモット乳頭筋標 本ゃィヌ Purkinje線維の細胞、モルモット心筋細胞、モルモット心房筋細胞などが挙 げられ、後から HERGチャネルを導入される宿主細胞として利用可能な検体細胞は 、 HEK293、 CHO、アフリカッメガエルの卵母細胞などが挙げられる。
[0062] HERGチャネルの導入は、 HERGチャネルを発現する遺伝子を当業者に公知の 遺伝子導入技術を用いて導入することができる。実験毎にベクターなどの HERGチ ャネル発現遺伝子を導入する一過性発現細胞、 HERGチャネル発現遺伝子を定常 的に発現するように改変された定常発現細胞の両方を用いることができるが、定常発 現細胞は HERGチャネルの発現が定常的に起こって 、るので、測定誤差の観点か ら優れて 、るため、定常発現細胞を用いることが望ま 、。
[0063] [準備工程の詳細]
図 4は、測定に先だって、 HERGイオンチャネルを含む検体細胞を、医薬品安全試 験センサの測定電極の近傍に用意する準備工程 (工程 0、図 1のステップ SO)の詳 細を示すフローチャートである。この準備工程は、実線で示すように、センサ 120のゥ エル 104に溶液を満たす工程 (ステップ S21)、ゥエル 104に満たされている溶液を、 所望の検体細胞 1を所定の量だけ懸濁させた細胞懸濁液に置換する工程 (ステップ S23)からなる。このような工程により、測定電極 102の近傍に検体細胞を配置するこ とがでさる。
[0064] なお、図 4に点線矢印で示すように、準備工程 (ステップ SO)を、ステップ S21、測 定電極 102の近傍及び基板 101表面の領域に固定化剤を固定ィ匕する工程 (ステツ プ S22)、ステップ S23、細胞を培養する工程 (ステップ S24)の順に遂行する工程と してちよい。
[0065] 本発明の医薬品安全性試験方法に用いる溶液とは、 20mM〜400mMの塩ィ匕ナトリ ゥムを主成分とする生理食塩水溶液、及び種々の栄養素、成長因子、抗生物質など を含有する培養液、所定の化学物質、化合物、薬剤を溶解させた緩衝溶液などを指 す。溶液は、予め脱気されているものを使用すると好ましい。また、溶液は、例えば、 4°C力 40°Cの範囲内に温度設定されているものを用いることができる。
[0066] なお、固定化剤とは、細胞の固定ィ匕を容易及び Z又は強固にする材料のことをいう 。固定化剤の固定ィ匕は、センサ 120の作製途中である、ゥエル 104を設置する前に 行っても良い。
[0067] 細胞を固定ィ匕する固定化剤の固定ィ匕材料としては、通常、誘電体が用いられる。
誘電体としては、強塩基性もしくは強酸性官能基を持つ高分子が好適に用いられる 。具体的には、ポリエチレンィミン (PEI)、ポリオル-チン（PO)、ポリリジン（PL)等の 正荷電性ポリマーが好適に用いられる。正に荷電したこれらのポリマーは、負に荷電 した細胞を引き付ける効果も併せ持つ。同様に、細胞接着能を併せ持つ材料は、ビ グアニド基、もしくは力ルバモイルグァ -ジド基を持つ高分子が上げられる。具体的に はァリルビグアニド— co—ァリルアミン（PAB)、ァリル— N—力ルバモイルグァ -ジノ — co—ァリノレアミン (PAC)が好適に用いられる。また、マトリクス材料を用いることが できる。マトリクス材料として、細胞接着性のタンパク質が好適に用いられ、かかるタン パク質としてはコラーゲン、フイブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等が挙げられる
[0068] 固定化剤による被覆は、上記固定化材料を所定の濃度で溶解させた固定化溶液 を、測定電極 102上に曝し、所定時間経過後、測定電極 102の表面から固定化溶液 を取り除き、表面を洗浄液で少なくとも 1回以上洗浄し、乾燥することにより行うことが できる。又は、上記固定化溶液を、測定電極 102の上面だけにスポットし、被覆する 方法であっても良い。
[0069] 培養液内に播種された細胞は、培養が進行すると同時に、付着性細胞が、固定ィ匕 剤が固定ィ匕されている場合はこれを介して、測定電極 102上に強固に固定ィ匕される [0070] [測定開始以降の工程の詳細]
上述した準備工程（図 1のステップ SO)の後、ステップ S1 (工程 A)として、センサ 12 0の測定電極 102において検体細胞 1が発する電圧信号が、被試験医薬品との対照 として、被試験医薬品だけを省!ヽた対照溶液に対して測定される。
[0071] 次に、ステップ S1の後、ステップ S2 (工程 B)として、センサ 120の測定電極 102に おいて検体細胞 1が発する電圧信号が、被試験医薬品を所定の濃度で含有する測 定溶液に対して測定される。
[0072] 次に、ステップ S2の後、ステップ S3 (工程 C)として、センサ 120の測定電極 102に おいて検体細胞 1が発する電圧信号が、再び対照溶液に戻した時に測定される。例 えば、検体細胞 1の HERGチャネルが通常時に常時活性ィ匕して 、る場合にお!、て は、そのまま測定電極 102で電圧信号を測定するだけで良い。あるいは、例えば、検 体細胞 1の HERGチャネルが通常時に不活ィ匕している場合においては、検体細胞 1 の HERGチャネルを活性ィ匕するために、検体細胞には刺激が与えられる。
[0073] なお、刺激を与える場合の試験方法につ!、ては、実施の形態 5に詳述する。また、 工程 Aにおいて、電圧信号を検出する回数は任意であり、各測定溶液及び各対照 溶液に対して複数回測定しうる。
[0074] 次に、ステップ S4として、ステップ S1において測定された測定電極 102の電圧信 号と、ステップ S3にお 、て測定された測定電極 102の電圧信号の測定結果を比較 するか、又はステップ S2において測定された測定電極 102の電圧信号と、ステップ S 3において測定された測定電極 102の電圧信号の測定結果を比較する。なお、両方 の測定結果を比較しても良い。具体的な比較方法の一例は、上述した通りである。
[0075] ここで、ステップ S 1で測定された測定電極 102の電圧信号と、ステップ S 2で測定さ れた測定電極 102の電圧信号とを比較することによって、被試験医薬品が与える検 体細胞 1のチャネルへの拮抗影響を抽出することができる。
[0076] また、ステップ S2において測定された測定電極 102の電圧信号と、ステップ S3に おいて測定された測定電極 102の電圧信号と比較することによって、被試験医薬品 が与える検体細胞 1のチャネルへの拮抗形式を抽出することができる。 [0077] 対照溶液としては、上述した被試験医薬品が非存在の対照溶液の他に、陽性対照 試薬又は陰性対照試薬存在下の対照溶液を、代わりに、もしくは、さらに、適用でき る。
[0078] ステップ S4Aにおける電圧信号の比較は、一つのゥエル 104内の溶液を交換する ことによって実現される（方法 ex )力 ステップ S1〜S3に示した測定溶液及び対照溶 液のそれぞれが入った異なるゥエル 104の測定電極 102の電圧信号を、直接比較す ることによつても実現することができる（方法 β )。方法 aは、特に同じ細胞力もの信号 を測定することになり、信頼性の高い測定が実施でき、また、方法 βは、溶液を交換 することがないため、高い処理速度で電圧信号差を検出することができる。
[0079] 最後に、ステップ S5として、ステップ S4Aにおける電圧信号の比較結果に基づいて 、被試験医薬品の危険性を判定する。なお、ステップ S4Aにおける電圧信号の比較 は、電圧信号の振幅値を比較して評価することが望ましい。ステップ S4Bについても 同様である。
[0080] なお、以下においては、全て図 1Aに示すフローチャートの例、すなわち、ステップ S1 (工程 Α)とステップ S3 (工程 C)の電圧信号の差を比較することによって、被試験 医薬品の安全性を評価する方法及びシステムについて説明する。
[0081] HERGチャネルの拮抗形式は特徴的であるため、上述したように、ステップ S4Aで 計算される、ステップ S1及びステップ S3における電圧信号の振幅の差で判定できる 。催不整脈作用を有する拮抗剤 (被試験医薬品）は、チャネルの孔 (ポア）に拮抗剤 が不可逆的にはまり込む、オープンチャネルブロッカー型である。このため、チャネル 閉塞率に依存して、電圧信号の振幅値が変化する。よって、具体的には、電圧信号 の振幅を、イオンチャネル開閉が現れる小区間に切り出して、小区間での電圧信号 の振幅の標準偏差値を、その小区間の代表値として度数分布化させることによって、 容易に被試験医薬品の危険性を定量的に解析できる。つまり、測定用電極 102の電 圧信号の振幅値が大きいほど、度数分布のピーク値が大きくなり、電圧信号の振幅 値がばらつくほど、度数分布の半値幅は大きくなる。
[0082] また、別の電圧信号の差の解析方法としては、予め設定した設定電圧閾値をまたぐ ゼロクロス時間を指標として評価しても良い。つまり、設定電圧閾値より大きい電圧信 号を出している時間は、危険要素が活性化された時間を示すので、上記の時間が長 いということは、被試験医薬品の危険性が増す。前述の小区間で区切って度数分布 化する解析法で解析する全体の時間は、上記のゼロクロス時間と等しく設定しても良 い。
[0083] いずれの解析方法においても、測定電極の電圧信号を測定する本発明の医薬品 安全性試験方法及びシステムにおいては、被試験医薬品の危険度が増大すると、 電圧信号が増大する方向に表れるため、最低検知感度を高くすることができ、信頼 性の高!、安全性試験を実施することができると!ヽぅ特徴も備える。
[0084] 図 5に、図 1Aに示すフローチャートに、さらに異なる工程を付加した医薬品安全性 試験方法のフローチャートを示す。図 5に示した方法においては、ステップ S1 (工程 A)の前に、検体細胞 1の HERGチャネルの活動に由来する電圧信号をさらに大きく 測定するために、予め、同様に活性ィ匕している非 HERGチャネルを不活ィ匕させるェ 程 (ステップ S 11)を持つ。これは、例えば、非 HERGチャネルだけを選択的に拮抗 する拮抗剤を溶液に混合させておくことにより実現される。カゝかる構成により、 HERG チャネルの活性ィ匕電圧信号だけを測定することができ、目的の電圧信号を感度良く 検出するために有効である。
[0085] [センサの詳細構成と作製方法]
本実施の形態に示された医薬品安全性試験方法に用いられるセンサ 120の構成 は、上述したように、図 2及び図 3に示した。ここで、図 2及び図 3を参照しつつ、さら にその構成を詳述し、また、センサ 120の作成方法も説明する。
[0086] 測定電極 102の数は、特に限定されず、各ゥエル 104に一つであっても、複数であ つても良い。各ゥエル 104に一つの測定電極 102が配置される場合には、一つのセ ンサ 120上に多くのゥエル 104を集積ィ匕することができ、本発明の医薬品安全性試 験を並列的に処理する能力が向上し、短時間で多数の試験を実施できる。また、各 ゥエル 104に複数の測定電極 102が配置される場合には、複数の測定データによる 統計処理が可能となるので、各ゥエル 104で実施される試験の確度が向上し、高い 信頼性を実現することができる。さらに、一つの測定電極 102は、一つの細胞からの 電位信号、及び複数の細胞の電位信号の集合を測定しても良 、。 [0087] 測定電極 102からの電位信号を伝えるリード線 105を被覆し、絶縁するために絶縁 層を設けても良い。絶縁層の材料としては、ポリイミド (PI)榭脂、エポキシ榭脂などの 榭脂が挙げられる。好ましくは、ネガティブフォトセンシティブポリイミド (NPI)などの 感光性榭脂が用いられる。感光性榭脂を用いる場合、まず、センサ部上面全体に感 光性榭脂を塗布し、その後、フォトエッチングによるパターン形成を利用して、測定電 極 102上及びリード線 105の外部接続部 107の上に形成された絶縁層を取り除くこ とにより、該電極 102及び外部接続部 107を露出させ、任意の領域に絶縁層を形成 することが可能となる。生産効率の点から、上述した方法により、絶縁層を形成するこ とが好ましい。
[0088] 溶液保持部 119は、ゥヱル 104を複数有し、その内部に測定溶液 51 (ゥエル 104内 部には、測定溶液及び対照溶液が添加されうる力 以下においては両者を区別する ことなく単に測定溶液ともいう）を蓄えることができる。また、参照電極 103を有し、測 定溶液 51を介して測定電極 102と電気的に導通する。
[0089] 図示していないが、各ゥエル 104に測定溶液 51の導入及び置換を実現するために 、注入管が溶液保持部 119の近傍に配置されても良い。注入管は、各ゥエル 104に 測定溶液 51を導入する目的を達成するのであれば、どのような形態でも取りうる。一 例を挙げれば、ゥエル形成体 131に流路を形成し、この流路を通じて測定溶液 51を 測定電極 102に向けて流しても良いし、ゥエル形成体 131に注入管の外径とほぼ等 しい穴を電極 102に向けて掘り、そこに注入管を差し込み固定しても構わない。
[0090] 好適には、注入管は、溶液保持部 119の上面に配置され、複数の各ゥエル 104に 測定溶液 51が導入できるように移動機構を併設することが望ましい。また、必要に応 じて、測定溶液 51を交換するための排出管を備えても良い。カゝかる構成により、細胞 1の培養に際しては、ゥエル 104内で培養液 51にて長期培養することができ、また、 測定に際しては、被試験医薬品剤不存在の測定溶液 51と被試験医薬品剤存在の 測定溶液 51を交換することができるようになるため、医薬品安全性試験を迅速に測 定することができる。
[0091] 参照電極 103は、ゥエル 104内で測定溶液 51と一部分を接触し、かつ、測定電極 102と直接導通しないように配置される。参照電極 103は、ノイズを低減するために その面積を十分大きくする必要がある。具体的には、参照電極 103の面積の合計は 、すべての測定電極 102の面積の合計に対して 5倍以上大き 、構成となるように形 成されているのが望ましい。参照電極 103の最表面は、金、白金、銀—塩化銀など の材料で作製されたものである力 図 2に示すように、ゥエル 104と一体ィ匕して、細胞 が固定される部分とその近傍を除いた面に形成させても良い。この場合、参照電極 1 03は、ゥエル 104毎に個別に用意しても良いし、全面に形成させても良い。
[0092] かかる構成は、複数の測定電極 102を有するセンサ 120を実現すること、参照電極 103面積を大きくすることが容易であり、かつ、薄膜形成化技術を用いることでセンサ 120の効率的な生産の面からも望ましい。また、参照電極 103は、上記にこだわらず 、棒状電極をゥエル 104内の測定溶液 51に浸すなど任意の形であり得る。
[0093] 次に、センサ 120の作製方法の一例を示す。まず、電極材料を基板 101上に蒸着 した後、フォトレジストを用いてエッチングすることにより、電極 102と、対応するリード 線 105及び外部接続部 107を 1セットとして、力かるセットを複数セット有する所望の パターンを形成する。その後、電極 102上及び外部接続部 107を除く上記パターン の上面と基板 101の上面とを絶縁層で被覆する。そして、基板を所定角の小片基板 101に切り出す。電極 102のパターンは、予め前記パターンを形成させたステンシル マスクを通じて蒸着するマスク法や、リフトオフ法によって形成しても良い。このように 形成された小片基板 101の上面に、当業者に既知の方法で凹部 106aを作製し、参 照電極 103を形成した溶液保持部 119 (ゥエル形成体 131)を接着し、センサ 120を 得る。
[0094] [医薬品安全性試験システム (1)]
図 6— Aは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムの一例を模式的に示すブ ロック図である。図 6— Aに示すように、医薬品安全性試験システム 150Aは、医薬品 安全性試験センサ 120と、少なくともセンサ 120を静電的に遮蔽する遮蔽箱 151と、 センサ 120上の測定電極 102と参照電極 103間の電圧信号を増幅処理する第一の 増幅部 152と、第一の増幅部 152で増幅された電圧信号のうち、所定の周波数帯域 だけの信号成分を更に増幅処理する第二の増幅部 153、第二の増幅部 153で増幅 された電圧信号をデータ処理する計算処理部 155と、測定環境調節装置 156と、複 数の測定溶液又は薬剤溶液をゥエル 104内に導入及び置換するためのゥエル内溶 液置換装置 157aと、ゥエル 104内の測定溶液又は薬剤溶液を排出するゥエル内溶 液排出装置 157bと、溶液切替装置 158とを有している。
[0095] このような構成とすることにより、簡易なシステムで、多数の医薬品候補薬剤の危険 性を迅速に検出するシステムを提供することができる。
[0096] 医薬品安全性試験センサ 120において、センサ 120内の参照電極 103に対する測 定電極 102の電位信号は、測定電極 102のリード線 105を通じて、第一の増幅部 15 2へと出力される。第一の増幅部 152は、電位信号を高感度に増幅し、第二の増幅 部 153へと出力する。第二の増幅部 153は、 AZD変換等を経て、計算処理部 155 へと電位信号を出力する。最後に、計算処理部 155は、入力した電圧信号を所定の 手順で比較することにより、センサ 120内の被試験医薬品の安全性を判定する。すな わち、医薬品安全性試験システム 150Aにおいて、ゥエル内溶液置換装置 157aの 溶液注入及び排出によって提供される様々な薬剤に対する、標的生体構成成分の 危険要素に起因する電位信号の変化を、細胞外に配置された電極 102の電位変化 として測定し得る。
[0097] 医薬品安全性試験システム 150Aは、医薬品安全性試験センサ 120からの出力を 処理するため、適切な測定用ソフトウェアを備えた計算処理部 155によって一体とし て構成される。計算処理部 155は、例えば、コンピュータによって構成され、測定用ソ フトウェアは、コンピュータの記憶部に格納されていて、当該コンピュータの画面上に 、信号処理 ·測定条件などを設定し得るパラメータ設定画面、細胞から検出された電 位変化を記録し、リアルタイムで表示し得る記録画面、及び記録されたデータを解析 し得るデータ解析画面などを与える。
[0098] また、ゥエル内溶液置換装置 157a及びゥエル内溶液排出装置 157bは、計算処理 部 150に電気的に接続され、制御されている。計算処理部 155は、溶液切換装置 15 8に、所定のタイミングと手順でゥエル内溶液置換装置 157a内の溶液をセンサ 120 のゥエル 104に注入するように制御信号を送る。さらに、計算処理部 155は、ゥエル 内溶液排出装置 157bに、所定のタイミングと手順でゥエル 104内の溶液を排出する ように制御信号を送る。このように構成されているため、予め設定した所定のタイミン グ、測定手順で各溶液の交換を自動的に行うことができる。
[0099] 遮蔽箱 151は、センサ 120を静電遮蔽するよう設置される。遮蔽箱 151は、センサ 1 20のみならず、第一の増幅部 152も一体として静電遮蔽することが望ましい。かかる 構成により、測定電極 102で観測される電位信号がよりノイズに対して強くなる。また 、遮蔽箱 151によりセンサ 120は外環境力も遮光されるので、光感受性の薬剤溶液 を測定に用いる場合であっても、光分解を防ぐことができ、長期にわたる測定の安定 性と、測定の再現性を向上させることができる。特に、上方カもゥエル 104内の測定 溶液 51をバッチ式に置換する方式では、遮蔽箱 151の上方に位置する部分に開口 が必要となるため、参照電極 103をセンサ 120上面の全面に形成させ、上記参照電 極 103を遮蔽箱 151に接続することが好ましい。このように構成すると、信号が微小 であっても SZN比を高くすることができ、より高感度に検出することが可能となる。
[0100] 測定環境調節装置 156は、防振台の上に置かれ、さらに、ファラデーカゴ等の遮蔽 箱で覆い、二重に静電遮蔽されている。
[0101] なお、医薬品安全性試験システム 150Aでは、センサ 120で測定された出力信号 は、第一の増幅部 152によって初段増幅され、第二の増幅部 153によって、さらに増 幅され、周波数帯域を制限された後、 AZD変 を介して計算処理部 155である コンピュータ (計算部）に入力される。このような構成とすることにより、センサ 120に近 い位置に第一の増幅部 152を配置することができるので、医薬品安全性試験システ ム 150Aは、外来ノイズに強いという特徴を有する。
[0102] さら〖こ、医薬品安全性試験システム 150Aは、所望の測定電極 102からの電気信 号を選択的に第一の増幅器に送るための回路選択器（図示せず)を備える。この回 路選択器は、例えば、マルチプレクサで構成される。カゝかる回路選択器を備えること により、電極の数が増えても、必ずしも第一の増幅器の数を増やす必要がなぐ生産 性の面力 有用である。
[0103] ゥエル内溶液置換装置 157aは、ここでは、ゥエル 104の上面から所定の量の溶液 を注入する装置である。また、ゥエル形成体 131に固定され、各ゥエル 104から放射 状に伸びて配置された注入管 159に、薬剤種類の数だけ溶液切替装置 158を備え る。また、ゥエル内溶液排出装置 157bは、ゥエル 104に注入された溶液を、各ゥヱル 104に接続された排出管 160を通じて排出する装置である。これら二つの装置を有 する構成により、医薬品安全性試験システム 150Aは、センサ 120の細胞保持部近 傍の溶液だけを迅速に置換できる。このため、複数種類の薬剤に対する、細胞の薬 理特性を簡便に、かつ、精度良く検出することが可能である。
[0104] 図 6— Aに示した、ゥエル内溶液置換装置 157aにつながる各要素は、測定溶液溜 め (L1)、陽性対照薬剤溶液溜め (L2)、被試験医薬品剤 A溶液溜め (L3)、被試験 医薬品 B溶液溜め（L4)を例示しているが、これらに限定されるものではなぐ各要素 を増やすことにより、複数種類の薬剤溶液を同時に判定することができる。
[0105] さらに、医薬品安全性試験システム 150Aは、センサ 120を所定の温度、ガス濃度 、湿度に保っための測定環境調節装置（図示せず)を備える。このため、細胞の播種 から培養、そして測定までを一連のシステム上で行うことができ、移動に伴う滅菌など の煩雑な操作を経る必要がなぐ全自動化による大量かつ効率的な測定及び判定を 実施することができる。
[0106] 図 6— Bは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムの別の構成例を模式的に 示すブロック図である。図 6— Bに示す医薬品安全性試験システム 150Bは、ゥエル 内溶液排出装置 157b及び排出管 160を有しない点でのみ、図 6— Aに示す医薬品 安全性システム: L50Aと異なる。以下、この相違点についてだけ説明する。
[0107] 本構成例による医薬品安全性試験システム 150Bでは、ゥエル内溶液置換装置 15 7aがゥエル 104に溶液を予め設定した所定のタイミング、測定手順で注入し、必要な 電圧信号を測定した後、ゥエル 140内の溶液を順次排出する。なお、ゥエル内溶液 置換装置 157aは、溶液の注入のみ行い、使用者がゥエル 104内の溶液を、ピぺッテ イングやァスピレータ等を用いて排出するように構成しても良い。この場合、ゥエル 10 4内の溶液を排出した後、ゥエル内溶液置換装置 157aを再び作動させ、測定を続行 する。このような構成としても、医薬品安全性システム 150Aと同じ医薬品安全性評価 機能を発揮できる。
[0108] 図 6— Cは、本実施の形態の医薬品安全性試験システムのさらに別の構成例を模 式的に示すブロック図である。図 6— Cに示す医薬品安全性試験システム 150Cは、 ゥエル内溶液置換装置 157a、ゥエル内溶液排出装置 157b、溶液切換装置 158、注 入管 159及び排出管 160を有しない点でのみ、図 6— Aに示す医薬品安全性システ ム 150Aと異なる。以下、この相違点についてだけ説明する。
[0109] 本構成例による医薬品安全性試験システム 150Cでは、使用者がゥエル 104に所 定のタイミング、測定手順で、溶液をピペッティング等の手段で注入し、必要な電圧 信号を測定した後、ゥエル 104内の溶液を、マイクロチューブとァスピレータ等を用い て排出する。そして、別の溶液をピペッティング等の手段で注入し、電圧を測定する。 このように、ゥエル 104への溶液の注入、溶液の排出、溶液の切換を全て手動として も、医薬品安全性システム 150Aと同じ医薬品安全性評価機能を発揮できる。
[0110] (実施の形態 2)
図 7— Aは、本発明の実施の形態 2の医薬品安全性試験方法の工程を示すフロー チャートである。本実施の形態と実施の形態 1との違いは、ステップ S12を含むことの みであるので、以下、本実施の形態については、この相違点だけ説明する。
[0111] ステップ S12は、検体細胞 1が測定溶液と接した状態で電圧信号を測定する工程（ ステップ S2)と、測定溶液を対照溶液に再び交換した状態で電圧信号を測定するェ 程 (ステップ S3)を繰り返す工程である。ステップ S12によると、被試験医薬品の頻度 刺激特性を知ることができる。一般に、危険要素が示す拮抗応答は、被試験医薬品 によって、被試験医薬品が繰り返し与えられる時に増強する型と、減衰する型と、変 わらない型の 3種類が存在する。上記の頻度刺激情報は、被試験医薬品を実際に医 薬品として長期間慢性的に人体に処方する際に、人体に対する危険性が発生する か否かの貴重な判断材料を提供する。なお、ステップ S2及びステップ S3において、 電圧信号を検出する回数は任意であり、各被試験医薬品に対して複数回測定しうる
[0112] ここで、ステップ S12では、ステップ S2とステップ S3を所定回数繰り返すまでは、ス テツプ S21からステップ S2に戻る。そして、ステップ S2とステップ S3を所定回数繰り 返せば、ステップ S21からステップ S4Aへと進み、ステップ S12は終了する。
[0113] なお、ステップ S4Aにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップ S2とステ ップ S3の測定値を用いてもよいし、全ての測定値の平均値を用いても良い。前者の 場合、 Cと Aの差が所定回数ごとにどのように変化するかがわかる。変化が回数を追う 毎に増加すると、被試験医薬品を実際に医薬品として長期間慢性的に人体に処方 する際に、蓄積効果により人体に対する危険性が発生する可能性があると判断でき る。
[0114] (実施の形態 3)
図 7— Bは、本発明の実施の形態 3の医薬品安全性試験方法の工程を示すフロー チャートである。本実施の形態と実施の形態 2との違いは、ステップ S12がステップ S 13に代わることのみであるので、この相違点だけ説明する。
[0115] ステップ S13は、ステップ S12と同じぐ検体細胞 1が測定溶液 51と接した状態で電 圧信号を測定する工程 (ステップ S2)と再び対照溶液に戻した状態で電圧信号を測 定する工程 (ステップ S3)を繰り返す工程である。そして、ステップ S13では、ステップ S2とステップ S3において、同じ検体細胞 1に対し、種類の異なる被試験医薬品を含 む溶液に交換して電圧測定を行う。
[0116] ここで、ステップ S13では、ステップ S2とステップ S3を所定回数繰り返すまでは、被 試験医薬品の種類を変更した測定溶液に交換し (ステップ S22, S23)、その後、ス テツプ S2に戻る。ステップ S2とステップ S3を所定回数繰り返せば、ステップ S4Aへと 進み、ステップ S13は終了する。
[0117] ステップ S13によると、被試験医薬品の複合作用特性を知ることができる。一般に、 危険要素が示す拮抗応答は、単独の被試験医薬品によって起こる型と、複数種の被 試験医薬品が順番に作用して起こる型が存在する。上記の複合作用特性情報は、 被試験医薬品を実際に医薬品として人体に処方する際に、人体に対する危険性が 発生する力否かの貴重な判断材料を提供する。
[0118] なお、ステップ S4Aにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップ S2とステ ップ S3の測定値を用いてもよいし、ステップ S2とステップ S3を所定回数繰り返した最 終の測定値を用いても良い。後者の場合、初回の回数の測定値に差がなぐ最終の 測定値に差があるなら、単独の被試験医薬品ではなぐ複数の被試験医薬品の組合 せによって初めて、催不整脈作用を示すという情報が得られる。
[0119] (実施の形態 4)
図 7— Cは、本発明の実施の形態 4の医薬品安全性試験方法の工程を示すフロー チャートである。本実施の形態と実施の形態 2との違いは、ステップ S12がステップ S 14に代わることのみであるので、この相違点だけ説明する。
[0120] ステップ S14は、ステップ S12と同じぐ検体細胞 1が測定溶液 51と接した状態で電 圧信号を測定する工程 (ステップ S2)と再び対照溶液に戻した状態で電圧信号を測 定する工程 (ステップ S3)を繰り返す工程である。そして、ステップ S14では、ステップ S2とステップ S3が、同じ検体細胞 1に対し、濃度の異なる同一被試験医薬品を含む 溶液に交換して電圧測定を行う。通常は、濃度の薄い被試験医薬品から濃度の濃い 被試験医薬品へと進める。これにより、どの濃度で催不整脈作用が起こり始めるかと V、つた危険濃度を知ることができる。
[0121] ここで、ステップ S 14では、ステップ S2とステップ S3を所定回数繰り返すまでは、被 試験医薬品の濃度が異なる測定溶液に交換し (ステップ S24, S25)、その後、ステツ プ S2に戻る。ステップ S2とステップ S3を所定回数繰り返せば、ステップ S4Aへと進 み、ステップ S 14は終了する。
[0122] なお、ステップ S4Aにおける測定結果の比較は、所定回数ごとのステップ S2とステ ップ S3の測定値を用いてもょ 、し、全ての測定値の平均値を用いても良!、。
[0123] ステップ S14によると、被試験医薬品の濃度依存性を算出することができる。上記 の情報は、被試験医薬品を実際に医薬品として人体に処方する際の安全処方量を 算出するための貴重な判断材料を提供する。
[0124] (実施の形態 5)
図 8は、本発明の実施の形態 5の医薬品安全性試験方法のフローチャートを示す 図である。本実施の形態と実施の形態 2との違いは、ステップ S1及びステップ S3の 前に、検体細胞 1が接する対照溶液を、測定溶液と対照溶液の中に共通に含まれる イオンの濃度を異ならせた対照溶液に交換する工程 (それぞれ、ステップ S15及びス テツプ S17)と、ステップ S2の前に、検体細胞が接する測定溶液を、ステップ S15でィ オン濃度を異ならせた対照溶液と同じイオン濃度の測定溶液に交換する工程 (ステツ プ S16)を有することのみであるので、この相違点だけ説明する。
[0125] ステップ S11の次に、測定溶液と対照溶液の中に共通に含まれるイオンの濃度を 異ならせた対照溶液をゥエルに注入し (ステップ S 15)、この対照溶液について電圧 信号を測定する (ステップ SI)。次に、ステップ S1終了後、ゥエル内の対照溶液を、ィ オン濃度が異なる測定溶液に交換し、（ステップ S16)、この測定溶液について電圧 信号を測定する (ステップ S2)。さらに、ステップ S2終了後、ゥエル内の測定溶液を、 イオン濃度が異なる対照溶液に再び交換し (ステップ S 17)、この対照溶液について 電圧信号を測定する (ステップ S3)。
[0126] そして、ステップ S16, S2, S17, S3を所定回数繰り返す。そして、これらを所定回 数繰り返せば、ステップ S4Aへと進み、ステップ S18 (図 7— Aのステップ S12に相当 する）は終了する。
[0127] 本実施の形態における細胞への刺激は、溶液のイオン濃度を変化させることによる 溶液刺激であり、電極を介する細胞への電気的刺激とは区別できる。つまり、本発明 の医薬品安全性試験方法の効果の一つである、電気的刺激なしでの測定ができるこ とは実現され、高感度な測定ができるという効果は十分に得られる。
[0128] HERGチャネルは、電位感受性カリウムイオンチャネルに分類される力 活性化膜 電位の閾値が静止膜電位付近にあり、浅い膜電位を持つ検体細胞では、平常時に もわずかに活性ィ匕しているため、活性ィ匕刺激は必要ないことが本発明者らによって 発見された。平常時に不活ィ匕しているチャネルの例を具体的に挙げれば、受容体作 動型イオンチャネル、 GTP結合タンパク、酵素や、高い閾値を持つ電位感受性ィォ ンチャネルの一部に見られる。受容体作動型イオンチャネル、 GTP結合タンパク、酵 素等のチャネルを活性ィ匕させる刺激は、受容体に結合する化学物質である。
[0129] このため、このチャネルを活性ィ匕させた時のセンサ応答は、具体的には、活性化物 質を所定の濃度溶解させた活性ィヒ溶液をゥエルに投入することによって実現すること ができる。また、電位感受性イオンチャネルを活性ィ匕させる場合は、溶液のイオン組 成を変化させる溶液刺激が電気的刺激と同様の効果を持つということが本発明者ら によって確認されている。
[0130] 例えば、モルモット乳頭筋に存在する遅延整流性カリウムイオンチャネルは、電位 感受性イオンチャネルに分類される。これらのイオンチャネルを活性ィ匕する際に溶液 刺激を適用する場合には、溶液の成分中に占めるカリウムイオン濃度を上昇させるこ とにより実現される。細胞の細胞内電位は、ネルンストの式に示されるように、細胞内 外におけるカリウムイオン濃度の比によって決定されるため、細胞外に存在する溶液 のカリウムイオン濃度を、例えば、 2mM力 40mMに上昇させることにより、細胞内電 位は上昇し、遅延整流性カリウムイオンチャネルが活性ィ匕される。
[0131] 本発明の医薬品安全性試験方法は、電位感受性イオンチャネルを HERGチヤネ ルとする場合は、溶液刺激も適応できる力 溶液刺激は、一例として挙げたように、低 カリウム濃度溶液力 高カリウム濃度溶液への置換によるため、活性ィ匕応答速度が溶 液拡散で律速されるため遅 、。
[0132] なお、ステップ S1において、電圧信号を検出する回数は任意であり、各被試験医 薬品に対して複数回測定しうる。同じ大きさの溶液刺激を用い、同じタイミングで加え ても良ぐあるいは、刺激間隔を変化させ、複数回その応答を測定しても良い。異な るイオン濃度の刺激を用いても良い。
[0133] 例えば、同じイオン濃度の刺激を同じタイミングで注入したときの応答を複数回測 定する場合は、各々の応答の差を平均、偏差などの統計的に処理できることにより、 突発的な外乱の印加による擬陽性成分を除去できることに貢献し、応答の差をより信 頼性高く検出することが可能となる。
[0134] (実施の形態 6)
本発明の実施の形態 6は、本発明の医薬品安全性試験システムに使用される医薬 品安全性試験センサに関する。以下、本実施の形態の医薬品安全性試験センサに ついて、図 9から図 12を参照しながら説明する。
[0135] 本実施の形態に示した医薬品安全性試験に用いられるセンサの構成を表す模式 図を、図 9から図 12に示す。本実施の形態のセンサと実施の形態 1に用いられるセン サとの違いは、電極近傍に貫通孔を有することが大きな違いであるので、この相違点 を中心に説明する。
[0136] 本実施の形態のセンサは、測定電極の近傍に細胞を配置しやすいよう、貫通孔を 持って 、る。貫通孔を持った本実施の形態の好適例であるセンサ全体の斜視図を、 図 10に示す。また、センサ基板が接続された構成がより分力ゝるよう、図 10に示す任意 の 3つのゥエル付近を拡大表示した部分断面図を、図 9に示す。また、貫通孔を持つ たセンサ基板の構造がより分力るよう、図 9に示す一つのセンサ基板とゥエル底面近 傍を拡大した部分断面図を、図 11に示す。同じぐ一つのセンサ基板の下面図を、 図 12に示す。図 9から図 12において、図 2及び図 3と同一又は相当する部分には同 一符号を付してその説明を省略する。
[0137] なお、図 10では、センサ右下付近のゥヱル 104のみ、センサ基板 122がゥヱル底面 に固定されているように示されている力 これは、センサ基板 122の取り付け状態を 説明するために、便宜上この部分のゥエル 104についてのみ、センサ基板 122を図 示したに過ぎずない。また、図 10及び図 11では、参照電極と検体細胞等の一部構 成を省略して示す。また、図 9では、真ん中のセンサ基板だけにチューブ 114が接続 されて 、るように示されて 、るが、他のセンサ基板にも同様に接続されて！、る。
[0138] 本実施の形態のセンサ 120は、図 10に示すように、多数の円柱状のゥヱル 104が 格子のノードに位置するように多数形成された溶液保持部 119と、貫通孔 117を有 するセンサ基板 122とを備えている。センサ基板 122の取り付け方法は、センサ基板 122の上面に測定溶液 52が溜まるのであれば任意でありうる力 好適には、図 9に示 すように、各ゥエル（以下、第一のゥエルという） 104の底面に開口 104aを設け、この 開口 104aに貫通孔 117が位置するようにして溶液保持部 119の下面にセンサ基板 122が取り付けられる。測定溶液 52は、センサ基板 122の上面に接するように、第一 のゥエル 104内に満たされる。なお、本実施の形態では、センサ 120を安定的に設置 するため、図 9及び図 10に示すように、センサ 120を受けるためのセンサ設置台 121 が設けられる。もちろん、センサ設置第 121を省略することもできる。
[0139] 本実施の形態のセンサ 120においては、センサ基板 122 (細胞固定化器）に、図 1 1に示すように、その一部に細胞保持部である微小くぼみ 116が形成されている。ま た、センサ基板 122には、微小くぼみ 116と貫通孔 117を介して連通する、第二の溶 液を保持するための第二のゥエル 112が形成されている。溶液保持部 119は、実施 の形態 1で説明したように、板状のゥエル形成体 131と参照電極 103とを備える。セン サ設置台 121には、電極接点ピン 111が所定の位置に立設されており、その上にセ ンサ 120が載置されている。
[0140] センサ基板 122は、図 11に示すように、基板 101を備えている。基板 101の上面の 所定位置には、 1以上の半球形の微小くぼみ 116が形成されている。基板 101の下 面の、微小くぼみ 116が形成された領域の下方に位置する領域に、凹部からなる第 二のゥヱル 112が形成されている。そして、微小くぼみ 116と第二のゥヱル 112とを連 通するように、基板 101の厚み方向に貫通孔 117が形成されている。また、基板 101 の下面には、第二のゥエル 112からその端面に至るように溝力もなる交換口 113が形 成されている。そして、第二のゥエル 112の内面に膜状の測定電極 102が形成され ている。
[0141] 一方、基板 101の下面の縁部 (端部）には膜状の外部接続部 107が形成されてい る。そして、基板 101の下面に測定電極 102と外部接続部 107とを接続するようにリ ード線 105が形成されている。そして、外部接続部 107を除きかつ基板 101の下面と 測定電極 102とリード線 105とを覆うように絶縁膜 106が形成されて 、る。測定電極 1 02及び絶縁膜 106には貫通孔 117に連通するように貫通孔が形成されて!、る。
[0142] そして、この絶縁膜が形成された基板 101の下面に底面基板 118が配設されてい る。底面基板 118は、基板 101の外部接続部 107が露出するように配設されている。 この底面基板 118により第二のゥエル 112の開口が閉鎖されている。また、この底面 基板 118に溝状の交換口 113の開放面が閉鎖されている。また、交換口 113の外部 側の端にチューブ 114が接続されて 、る。
[0143] そして、図 9に示すように、センサ基板 122の外部接続部が 107が電極接点ピン 11 1に当接するようにして、センサ 120がセンサ設置台 121に載置されている。
[0144] 本実施の形態では、センサ基板 122は、貫通孔 117上部に設けられた微小くぼみ 116により、生体試料である検体細胞 1を密着して保持することができる。この結果、 検体細胞 1は、測定電極 102近傍に配置され、検体細胞 1からの電位信号が測定電 極 102にて測定される。
[0145] このように、貫通孔 117の上に微小くぼみ 116を形成することにより、検体細胞 1を 容易にセンサ基板 122上に捕捉することができる。また、貫通孔 117の下方から検体 細胞 1を吸引することや、貫通孔 117の上方力も検体細胞 1を加圧することにより、検 体細胞 1の固定ィ匕をさらに容易にすることもできる。
[0146] 測定電極 102は、センサ基板 122に形成された少なくとも一つの貫通孔 117の孔 内及び Z又は基板 122上面における貫通孔 117の孔周囲に形成されることが好まし い。
[0147] センサ基板 122上に形成する貫通孔 117の数及び位置関係は任意であり、図 11 及び図 12に示した数に限定されないが、貫通孔 117は、一つの測定電極 102に対 して複数形成されている構成とすることが望ましい。具体的には、一つの測定電極 10 2に対し、 1個以上 2000個以下が望ましい。このような構成とすれば、検体細胞 1の生 存率に影響されない測定が可能となる。センサ基板 122上における貫通孔 117同士 の位置関係は、例えば、図 12に示したように、格子のノードに位置するように配置し 得る。その場合、複数の貫通孔 117に保持された検体細胞 1に起因する電気信号が 、一つの電気信号として一つの測定電極 102から検出されることになる。本実施の形 態のセンサ 120は、複数の検体細胞 1の応答を同時に検出する薬品スクリ一ユング 等にお 1、て特に有用である。
[0148] 貫通孔 117の形状は、検体細胞 1を保持しうるものであれば、特に限定されない。
例えば、上面開口部が下面開口部より大きい円筒状であっても良いが、図 11に示し たように、円筒状の貫通孔 117の上部に微小くぼみ 116を形成した形状は、微小くぼ み 116の曲率によって、検体細胞 1をより確実に貫通孔 117との境界に密着及び保 持しうるため、非常に望ましい。
[0149] 微小くぼみ 116は、目的の検体細胞 1に依存した任意の大きさを採用することがで き、目的の検体細胞 1を保持しうる大きさであれば、特に制限されない。具体的な微 小くぼみ 116のサイズは、センサ基板 122上面と同じ平面における直径が 2〜500 mの範囲であることが好ましぐ 10〜100 /ζ πιの範囲であることがより好ましい。例えば 、生体試料として用いる検体細胞 1の長径が略 30 mの場合、開口部上面の直径が 略 20 μ mであることが好まし!/ヽ。
[0150] 貫通孔 117は、吸引によって測定溶液が通過し、かつ、検体細胞 1が通過しない大 きさであれば良い。貫通孔 117の直径は、 1〜125 /ζ πιの範囲であることが好ましぐ 直径が 2〜25 mの範囲であることがより好ましい。例えば、貫通孔 117の直径は、微 小くぼみ 116の直径が略 20 μ mである場合には、略 5 μ mであることが好ましい。貫 通孔 117の長さは、任意である。
[0151] 第二のゥエル 112には、第二の溶液が蓄えられている。第二のゥエル 112は、その 底面 (底面基板 118)に開口部がない。このため、第二のゥエル 112に蓄えられた第 二の溶液は、第二のゥエル 112内に重力によって保持され、貫通孔 117及び貫通孔 117近傍の電極 102部力も離れることがないため、安定な電圧測定が可能となる。
[0152] さらに、第二のゥエル 112には、第二の溶液を別の第三の溶液に交換するための 交換口 113を側面部に有している。力かる構成により、必要に応じて、ナイスタチンな どの小孔形成物質を第二のゥエル 112と接する部分の検体細胞 1と接触させることが できる。
[0153] 以下、本実施の形態の医薬品安全性試験センサの作成方法について説明する。
図 9と図 10に示す医薬品安全性試験センサは、図 11と図 12に示すセンサ基板の作 製工程、上部溶液保持部材の作製工程、及びセンサ基板と上部材の接着工程の 3 つの工程により形成される。
[0154] まず、医薬品安全性試験センサ 120のセンサ基板 122の作製方法について、図 2 5から図 30を参照しながら説明する。
[0155] センサ基板 122を製造するには、まず、図 25に示すように、シリコン力もなるベース 141と、二酸ィ匕シリコン力もなる中間層 142と、シリコン力もなる薄板 143で構成される 基板 140を用意し（工程 1)、次に、ベース 141と薄板 143の両側にレジスト膜 144と レジスト膜 145を積層させる。そして、ベース側のレジスト膜 144を、所定のパターン を有するようにパターユングしてレジストマスクとする。なお、上記のような基板 140は 、 SOI基板と呼ばれ、半導体デバイスを作製する際に良く用いられ、入手は容易であ るのでこの基板の製造方法にっ 、ては省略する。
[0156] 次に、図 26に示すように、ベース 141部分のエッチングを行い、第二のゥエル 112 と下方が開放された溝状の交換口 113を形成する（工程 2)。このときのエッチング方 法はドライエッチング、ウエットエッチングなど通常の方法を用いる。
[0157] 次に、図 27に示すように、薄板 143側のレジスト膜 145を、所定位置に開口 145a を有するようにパターユングしてレジストマスクとする（工程 3)。
[0158] 次に、図 28に示すように、ドライエッチングによって、薄板 143側からエッチングを 行う（工程 4)。このとき、エッチングガスとしてはエッチングを促進するガスのみを用い る。このため、エッチングを促進するガスには SF6、 CF4、 XeF2などを用いることがで きる。これらはシリコンのエッチングを深さ方向だけでなぐ横方向へのエッチングも促 進する作用があるからである。実験では XeF2を用いて効果を確認している。これによ つて、エッチングされた部分の形状は、図 28に示すようにレジスト膜 145の開口 145a を中心とする半球形となり、この半球形の部分力もなる微小くぼみ 116が形成される。 また、レジスト膜 145 (レジストマスク）は、 XeF2によってはほとんどエッチングされな いので、図 28に示すように、最初の形状を保っている。
[0159] 次に、図 29に示すように、再び薄板 143側から、ドライエッチングを行って、微小く ぼみ 116の底面に薄板 113を貫通する貫通孔 117を形成する（工程 5)。
[0160] このときのエッチング法は、ドライエッチングによる方法が最適であり、ドライエツチン グの際にはエッチングを促進するガスと、エッチングを抑制するガスを用いる。エッチ ングを促進するガスとしては、 XeF2、 CF4、 SF6などがある。また、エッチングを抑制 するガスとしては CHF3、 C4F8などがある。これらのガスを混合してエッチングするこ とで、エッチングされた壁面に CF2のポリマーである保護膜が形成されるので、ドライ エッチングによる微小貫通孔の形成をレジストマスクの下方のみに進行させることが 可能となるので、微小くぼみ 116及び貫通孔 117が連結して形成される。
[0161] ここで、エッチングが下方のみに進行する仕組みを少し詳しく説明する。まず、エツ チングを促進するガスによってエッチングを少しだけ行った後、エッチングを抑制する ガスによって保護膜を少しだけ形成する工程を繰り返すことで、ほぼ垂直なエツチン グ形状とすることができるのである。この工程では、エッチングを促進するガスによるド ライエッチングの際に、外部コイルによる誘導結合法によって生成されたプラズマ中 で、高周波を基板 140 (正確には薄板 143)に加えることで、基板 140にマイナスの バイアス電圧が発生する。このことにより、プラズマ中のプラスイオンである SF5+や C
F3+が基板 140に向力つて衝突するのでドライエッチングは垂直下方方向に進むこと になる。
[0162] ドライエッチングを抑制させる際には、基板に高周波を加えなければ、基板 140に ノィァス電圧が全く発生しないので、保護膜の材料となる CF+が偏向を受けなくなり
、基板 140のドライエッチング穴の壁面へ均一な保護膜の形成ができることになる。 実験ではエッチングを促進するガスとして SF6、抑制するガスとして C4F8を用いて確 認している。
[0163] これらガスを用いると、上述したようなそれぞれの作用によって、貫通孔 117の形成 をレジストマスクの下方のみに進行させることが可能となる。さらに同時にエッチング を抑制するガスを用いることにより、貫通孔 117の側面には保護膜 146が形成される
[0164] 次に、二酸ィ匕シリコンよりなる中間層 142の第二のゥエル 112に露出している部分 をベース 141側からドライエッチング、ウエットエッチングなどの通常のエッチング方 法によりエッチングする。その後、図 30に示すように、基板 140のベース 141側から 通常の薄膜形成工程とパター-ング工程により、金を主体とする測定電極 102を形 成する（工程 6)。ここでは、例えば、電極をパターユングする方法としては、電極材料 を基板上に蒸着した後、フォトレジストを用いてエッチングすることにより、測定電極 1 02、及び対応するリード線 105及び外部接続部 107を 1セットとして力かるセットを複 数セット有する所望のパターンを形成する。電極のパターン形成は、その他に、予め 電極パターンを形成させたステンシルマスクを通じて蒸着するマスク法や、リフトオフ 法も適応できる。
[0165] その後、基板 140の下面の外部接続部 107を除く（従って測定電極 102及びリード 線 105を含む)部分を絶縁膜 106 (図 11参照)で被覆する。
[0166] 最後に、平らな底面基板 118をベース側より接着剤にて貼り付け、センサ基板 122 を得る。なお、センサ基板 122は必ずしもこの構成に従う必要はなぐ例えば、ベース に交換口を作製せず、底面基板 118に交換口を第二のゥエル 112に連通するように 形成し、その底面基板 118を基板 140の下面に貼り付けても良い。
[0167] 底面基板 118は、交換口 113の溶液が漏れず、測定電極 102がリード線 105を介 して接続される外部接続部 107が露出していれば、特に形状は問わないが、図 11及 び図 12に示したように、外部接続部 107のみを切り欠いた平板形状とすることが好ま しい。
[0168] その後、ウェハをダイシングし、所定角の小片に切り出し、一つの小片を上記セン サ基板 122とする。一つの小片には、電極 102、リード線 105、及び外部接続部 107 力 セット形成されているようにする。このように、センサ基板 122は、一つのウェハ上 に複数作成し、その後、ダイシングすることで所定角の小片に切り出し、一つの小片 をセンサ基板とすることが、生産性の観点から望ましい。
[0169] なお、必要であれば、シリコンの表面に、熱酸化膜を通常の熱酸化工程によって形 成する。この工程は、シリコンの表面抵抗を極力あげたい場合に用いれば良ぐそれ ほど高い表面抵抗を必要としないのであれば、シリコンの表面に自然に形成される自 然酸ィ匕膜だけで十分である。
[0170] 次に、別途作成する榭脂よりなる第一のゥエル 104が多数設けられた板状の容器 であるゥエル形成体 131と参照電極 103とを備える溶液保持部 119の底面に、セン サ基板 122の薄板 143側を接着剤などで貼り付ける。なお、溶液保持部 119のゥェ ル形成体 131の製造方法についてはプレス成形、光造形、切削加工など通常の手 段が用いられる。これらの方法を用いればゥエル形成体 131に、凹部からなるゥエル 104と該凹部の底面の開口 104aとを所定の形状となるよう設けることは特に困難なこ とではないのでここでは説明を省略する。特に、ゥエル形成体 131は、例えば、商用 として販売されて 、る SBS規格に準ずる多穴プレート（96穴、 384穴等)等を開口部 のみカ卩ェすることによって実現することもできる。これらは、製造コストの面からも有用 である。
[0171] その後、センサ基板 122の交換口 113にチューブ 114を接続する。
[0172] このようにして、本実施の形態で使用されるセンサが製造される。
[0173] なお、センサ基板 122の第二のゥエル 112の形成において、それぞれの第二のゥェ ル 112と交換口 113は、必ずしも一体形成されている必要はない。一例を示すと、第 二のゥエル 112が設けられた底面基板 118と、各第二のゥエル 112に交換口が連通 したセンサ基板 122から構成されている方力 生産性の面からは望ましい。
[0174] 底面基板 118の材料としては、絶縁材料が望ま ヽ。例えば、好適には、 PDMS ( ポリジメチルシロキサン）が用いられる。かかる材料は、微細加工に優れ、軟質で粘着 力もあるため、センサ基板 122に接続が容易で、流路漏れは起こらない。
[0175] 溶液保持部 119の参照電極、及び第二のゥエル 112の測定電極 102の作製工程 は、蒸着、スパッタなどの金属堆積法、電解'無電解めつき等を用いることができる。 金属堆積法を用いて参照電極 103及び測定電極 102を作製する場合には、溶液保 持部 119を堆積装置の回転ステージに対して傾斜させて取り付ける処置を施すこと で、容易に第一のゥエル 104及び第二のゥエル 112の側壁にターゲット金属を堆積さ せることができる。
[0176] [医薬品安全性試験システム (2)]
本実施の形態に示すセンサを用いた医薬品安全性試験システムのブロック図を図 13に示す。本実施の形態の医薬品安全性試験システム (2)と、実施の形態 1に示した 医薬品安全性試験システム (1)との違いは、溶液貯留部へ第二の溶液を注入及び交 換する装置を備えることであるので、以下、図 13を参照しながら、その相違点を説明 する。
[0177] 本実施の形態の医薬品安全性試験システムは、第二のゥエル 112内の溶液を置換 するための第二ゥエル内溶液置換装置 157cを備える。また、注入する溶液として、 第二の溶液（図 13中 L5)と第三の溶液（図 13中 L6)を切り換えるための流路切替装 置 158cを備える。
[0178] 流路切替装置 158cは、計算処理部 155に電気的に接続されており、計算処理部 155は、所定のタイミングと手順で溶液の切替を行うように流路切替装置 158cに制 御信号を送る。このように構成すると、センサ 120を設置した状態で、第二の溶液を 第三の溶液に、逆に第三の溶液を第二の溶液に置換することができる。
[0179] さらに、第二ゥ ル内溶液置換装置 157cは、検体細胞を貫通孔に誘導する装置（ 図 13中 P)も併せ持つため、センサ 120をシステムに取り付けた状態で、検体細胞の 貫通孔への誘導と薬理応答測定が行える。
[0180] 細胞を誘導する装置 Pとしては、例えば、貫通孔内の溶液を負圧により吸引するこ とを挙げることができる。図 13に示した、第二ゥエル内溶液置換装置 157cにつなが る各要素は、第二の溶液溜め (L5)、第三の溶液溜め (L6)、細胞誘導用吸引装置（ P)を表している。
[0181] さらに、測定環境調節装置 156は、センサ 120の第一のゥエル中の溶液と、第二の ゥエル 112中の溶液とを異なる所望の温度で、それぞれ調整する機能を備える。 実施例
[0182] 以下、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムの実施例を、具体的に説明 する。なお、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
[0183] (実施例 1)
実施例 1として、図 9から図 12に示す、実施の形態 5の医薬品安全性試験センサ 1 20を試作した。そして、このセンサ 120を用いて、細胞の応答を測定する実験を行つ た。
[0184] [医薬品安全性試験センサの作製]
まず、図 9に示すセンサ基板及び溶液保持部の作成方法について説明する。
[0185] 図 9から図 12を参照して、センサ基板 122の作製には、基板材料に 4インチ SOW ェハを用いた。基板 101の裏面（下面）をエッチング後、基板表面（上面）は、実施の 形態 5で説明したガスを用いたドライエッチングにより貫通孔 117群を形成させた。次 に、中間層である酸ィ匕シリコン層を除去し、表面と裏面とを貫通させた。裏面の上に、 真空蒸着法あるいはスパッタ法を用いて、電極をパターユング形成した。電極材料に は金を用いた。その後、 30mm角の小片にダイシングし、小片化した。これにより 30mm 角の基板に 1個の測定電極 102が形成され、その電極 102に貫通孔 117がおよそ 10 0個形成されたセンサ基板 122を得た。
[0186] 実施例 1のセンサのゥエル形成体 131には、 SBS規格に準ずる 96穴プレートのゥェ ルを用いた。各第一のゥエル 104の底面に上面直径 5mm、下面直径 lmmのテーパー 形状の穴を開ける工程を経て開口 104aを設け、センサ基板 122を薄板側力も取り付 けた。なお、接続した場所は、上述したセンサ基板 122の貫通孔 117群に対応する 位置とした。各第一のゥエル 104の容量は、約 250 μ Lである。電極面から電極接点ピ ン 111が接触できるよう、配線（図示せず)を取り、参照電極 103を、その先端が第一 のゥエル 104中に浸すことができるように固定化した。この参照電極 13には、 φ 0.5πι m金 を用い 7こ。
[0187] センサ基板 122には、さらに測定電極 102側にスリット構造 113を形成させた。裏面 には、このスリット構造からなる幅 lmm、高さ 360 mの流路 113が形成されている。そ の両端に交換口を設け、外径 360 μ m、内径 150 μ mの PEEK製チューブ 114を取り付 けた。
[0188] 検体細胞は、遺伝子改変技術により HERG(Human Enter- a- gogo- Related Gene) チャネルを発現させたヒト腎臓胚細胞 HEK-293 (以下、 HERG細胞）を用いた。 HER Gチャネルは、 QT延長を引き起こす標的イオンチャネルであり、上記細胞を検体細 胞として用い、医薬品安全性試験を行った。本実施例では、 HERGチャネル及び検 体細胞に、 HERGイオンチャネル及び HERG発現細胞を用いて説明する。
[0189] センサ 120の第一のゥエル 104内を培養液で満たし、その後、 HERG細胞を各第 一のゥエル 104内に 100000個播種した。培養液は、 DMEM + 10重量％FBSを用い た。検体細胞を裏面から吸引し、貫通孔に誘導した後、 37°C、 C02濃度 5%に調整 保持したインキュベータ内で培養した。所定時間、細胞を培養させ、その後、実施例 1のセンサをインキュベータから取り出し、医薬品安全性試験システムに設置し、医薬 品の安全性を試験する実験を行った。
[0190] 本実施例では、 HERGに対して選択的に拮抗する作用が既知である E-4031 (Sigm a社 M5060)を被試験医薬品として用いた。 E-4031は、 HERGチャネルを選択的に 拮抗するため、後天性 QT延長を引き起こすことが知られている。
[0191] センサ応答の測定に先立ち、第一のゥエル 104に残存する培養液を対照溶液に置 換させた。これにより、大気中でも安定して測定を行うことができる。対照溶液の組成 は、ハンクス液を基本とし、 HEPESにて緩衝作用を持たせてある。溶液の pHは、 7.4 に設定してある。
[0192] 次に、実施例 1のセンサ 120に、速やかにナイスタチンを含む裏面対照液 (第二の 溶液)を交換口 113に注入する。ナイスタチンの最終濃度は、 240 g/mLに調製して 含有させている。裏面対照液の組成は、塩ィ匕カリウムをベースとし、 EGTAによって C aイオンをキレートした緩衝溶液を用いている。そして、溶液の pHは、 10mM HEPES によって 7.2に保つように調製した。
[0193] 次に、実施例 1の医薬品安全性センサ 120を用いて、 HERGイオンチャネルの電 圧センサ応答を測定した。その内の被試験医薬品の交換時期の前後における電圧 時系列データを、約 40秒間切り出して、図 14に表示する。実験は、下記に示す測定 プロトコール 1に従い、溶液を同じゥエルで交換した。図中白抜き四角又は黒四角で 表した時間だけ対照溶液 1及び薬剤溶液 1 (E-4031 1 μ Μ含有の対照溶液 1)を滴 下した。 [0194] <実験プロトコール 1 >
(A1) 0— 15秒対照溶液 1 (上記ハンクス液）
(B1) 15— 30秒薬剤溶液 1
(C1) 30— 40秒対照溶液 1
つまり、上述した被試験医薬品非存在であるハンクス対照溶液を第一のゥエル 104 に投入した状態で、電圧測定を時間 0秒力も開始した (図 14中 A1の状態、時間 0〜1 5秒)。その後、 15秒後（G1時）、上記対照溶液 1から、薬剤溶液 1 (E-4031 1 μ Μを 含有するハンクス液）に置換した（図 14中 B1の状態、時間 15〜30秒)。すると、 Ε-403 1の注入に伴い電圧振幅の増大が認められた（図 14中 El)。実験では、さらに、時間 30秒 (HI時）にて、再び対照溶液 1に戻した（図 14中 C1の状態）が、その後、電圧 振幅の増大は収まらな力つた。これは、ノツチクランプで測定したデータと整合する。
[0195] ここで、状態 A1における電圧信号の振幅は、薬剤溶液 1と検体細胞を接触させるこ とにより、状態 B1における電圧信号の振幅にまで増大している。これは、 E-4031が H ERGイオンチャネルに拮抗した結果である。次に、状態 C1における電圧信号の振 幅は、状態 B1における電圧信号の振幅とほぼ同じである力 この現象は、 E-4031が 不可逆的に HERGイオンチャネルに拮抗して ヽるため、対照溶液に戻した後も電圧 信号の振幅が、元の状態 A1のレベルに戻らないためである。
[0196] この図 14のように、状態 A1及び状態 C1の電圧信号の振幅を比較した結果、電圧 信号の振幅に差があると判断される場合には、被試験医薬品は、不可逆的に HER Gイオンチャネルに拮抗しているため、「催不整脈作用あり」と判定することができる。 電圧信号の振幅の比較は、例えば、図 14のようなグラフを測定者が見て行うこともで きるし、電圧信号の振幅を測定した測定機器が、状態 A1及び状態 C1における電圧 信号の振幅の差が、一定の基準値以下又は基準値以上である力否かを判定するこ とに行うことちでさる。
[0197] なお、上述したように、状態 B1及び状態 C1の電圧信号の振幅を比較した結果、電 圧信号の振幅に差がないと判断される場合に、不可逆的に HERGイオンチャネルに 拮抗しているため、「催不整脈作用あり」と判定することもできる。
[0198] ここで、プロトコール 1と同様にして、可逆的に HERGイオンチャネルに拮抗する被 試験医薬品の薬剤溶液を検体細胞と接触させた場合には、図 21に示すような実験 結果が得られる。図 21において、 A3は対照溶液 1、 B3は可逆的に HERGイオンチ ャネルに拮抗する被試験医薬品の薬剤溶液、 C3は再び対照溶液 1を、それぞれゥ エル 104に投入した状態を表している。
[0199] 薬剤溶液をゥエル 104に投入する（図 21中 B3の状態）と、電圧信号の振幅は A3の 状態よりも増大するが、薬剤溶液を対照溶液に戻す (図 21中 C3の状態)と、電圧信 号の振幅は、元の状態 A3とほぼ同じレベルに減少する。この場合、電圧信号の振幅 が減少して 、ることがわ力るため、被試験医薬品の HERGイオンチャネルに対する 拮抗が、可逆的であること判断でき、催不整脈作用がないと判定される。
[0200] なお、薬剤溶液中の被試験医薬品の濃度が低い場合には、 A1 (又は A3)と C1 ( 又は C3)の電圧信号の振幅の変化が小さくなる。このため、被試験医薬品の催不整 脈作用は小さぐ危険性は少ないと判断することができる。また、被試験薬剤溶液が 催不整脈作用を持たな 、場合には、 A1 (又は A3)と C1 (又は C3)の電圧信号の振 幅の変化はないため、危険性はないと判断することができる。つまり、対照溶液の電 圧信号との振幅の比較を行うだけで、被試験医薬品を含む薬剤溶液の電圧信号を 測定する工程を省略しても、危険性を判断することができる。
[0201] なお、今回の実験では、 HERGイオンチャネルを活性ィ匕するための刺激は必要な かった。 HERGはゆるやかな電位感受性イオンチャネルである力 静止膜電位下に お！、てもわずかに開 ヽて 、るためである。
[0202] 上記の対照実験として、同様に、薬剤溶液中の成分である E-4031を含有しない対 照溶液に対して、 HERG細胞を用いて、同じセンサにて同じプロトコールで測定を実 施した。そのプロトコールで観測された電圧時系列データを約 40秒間切り出して、図 15に表示する。実験は、具体的には、下記に示す実験の測定プロトコール 2に従い 、溶液を同じゥエル 104で交換した。図中白抜き四角又は黒四角で表した時間だけ 対照溶液 1及び対照溶液 2 (対照溶液 1と同組成)を滴下した。
[0203] <実験プロトコール 2 >
(A2) 0- 15秒対照溶液 1 (上記ハンクス液）
(B2) 15— 30秒対照溶液 2 (C2) 30— 40秒対照溶液 1
つまり、上述した被試験医薬品非存在であるハンクス対照溶液を第一のゥエル 104 に投入した状態で、電圧測定を時間 0秒力も開始した (図 15中 A2の状態、時間 0〜1 5秒)。その後、 15秒後（G2時)、上記対照溶液 1から、対照溶液 2 (対照溶液 1と同組 成であるハンクス液）に置換した（図 15中 B2の状態、時間 15〜30秒)。対照溶液 1か ら 2への交換にぉ 、ても電圧信号の振幅の増大は認められな力つた（図 15中 E2)。 実験では、さらに、時間 30秒 (H2時）にて、再び対照溶液 1に戻した（図 15中 C2の 状態)。ここでも、電圧信号の振幅の増大は認められな力つた。
[0204] 上記 2つの実験により、対照溶液の交換では電圧信号の振幅に変化が見られず、 薬剤溶液 1に対してのみ、不可逆的な電圧信号の振幅の増大が認められた。つまり 、プロトコール 1において観測された電圧信号の振幅の増大 E1は、流路を切り替える ことによる溶液変動の擬陽性ではなぐ活性化して 、た HERGイオンチャネルが薬剤 溶液 1に含まれる E-4031により拮抗された薬理応答を、センサで検出した結果である ことが明ら力となった。なお、 HERGチャネルを発現していない細胞に関しても、同じ センサにて同じプロトコールで測定を実施し、 E-4031によって拮抗されないことは確 認した（図示しない)。
[0205] 実験プロトコール 1と実験プロトコール 2の実験結果から、被試験医薬品の危険性を 判断するための設定値（閾値）としては、 cZa = 2程度に設定すればよい。しかし、適 切な閾値は、実験条件や危険度の判定レベルによっても異なる。一般的には、 c/a 力 Sl.2〜5程度、より望ましくは、 1.5〜 2.5程度に設定するのがよい。
[0206] [解法アルゴリズム]
実施例 1では、対照溶液注入時の電圧信号の振幅値は約 2 /z Vp-pとなり、薬剤溶 液注入時の電圧信号の振幅値は、最大 8 /z Vp-pと、約 4倍となった。そこで、これらの 電圧信号の振幅増大効果を定量的、かつ、自動的に評価するために、以下の解析 ァノレゴリズムを開発した。
[0207] すなわち、電圧閾値を設け、この電圧閾値を越えるカゝ否かで、定常状態から拮抗 剤注入による危険性上昇状態に遷移する変化開始時間（図 14では、 G1時)を感知 する。変化開始時間から後の 10秒間の電圧時系列データ（図 14では、時間 15〜25 秒の電圧振幅)を危険性上昇状態とし、また、変化開始時間力も前の 10秒間の電圧 時系列データ（図 14では時間 5〜15秒の電圧振幅)も定常状態として同様に切り出し 、統計的に解析する。ここでは、電圧閾値を ± 3 /z Vに設定した。さらに、薬剤溶液 1 から対照溶液 1へ戻した後の 10秒間の電圧時系列データ（図 14では、時間 25〜35 秒の電圧振幅)も同様に切り出す。
[0208] まず、上記の方法によって自動的に切り出されたそれぞれの状態の時系列データ に対し、ある小区間 Yごとに標準偏差 SD1を求める。それぞれの SD1の度数分布を 求め、分布のピーク値と分散（半値幅)を統計値として比較し、それぞれの増加率を、 被試験医薬品の安全性を判定する指標とした。同様の解析区間、解析方法を図 15 に示される対照溶液 2に対する電圧時系列データに関しても、同様に解析を行った。 その結果を、図 16から図 20に示す。
[0209] また、図 21に示される薬剤溶液 2に対する電圧時系列データに関しても、同様に解 析を行った。その結果を、図 22から図 24に示す。
[0210] 薬剤溶液 1 (E-4031)に関して、状態 Al、状態 B1及び状態 C1の各ヒストグラムのピ ーク街の大きさを比較した結果を図 16に示し、同分散値 Kの大きさを比較した結果 を図 18に示す。また、対照となる対照溶液 2に関して、状態 A2、状態 B2及び状態 C 2の各ヒストグラムのピーク街の大きさを比較した結果を図 17に示し、同分散値 Kの 大きさを比較した結果を、図 19に示す。図 16から図 19において求められた薬剤溶 液 1 (又は、対照溶液 2)と対照溶液 1のピーク街と同分散値 Kに関して、状態 Aから Bへの変化率、及び状態 Aから状態 Cへの変化率を求めた結果を図 20に示す。
[0211] ここで、ヒストグラム統計値のピーク街及び分散値 Kにおける状態 Aから状態じへの 変化率は、状態 Aのピーク街 (又は分散値 K)を 100%とした時の百分率、つまり、状 態 Aのピーク銜 aと状態 Cのピーク銜 cによって JcZjaで算出される。個々の小区間 Yは、イオンチャネルの開閉頻度が数 msec程度だということを考慮し、 10 msecとした 。この処理により、熱雑音などホワイトなノイズ成分は極力減じることができ、イオンチ ャネルに起因する成分だけの比較がより鮮明に行える。さらに、本実施例で医薬品の 安全性を判断する指標として用いた、ヒストグラム統計値のピーク街及び分散値 Kは 、いずれも、医薬品安全性試験の観点力 見ると危険な状態 (状態 B1)に遷移すると 、増加する指標である。一方、危険性の存在しない化学物質し力含まれていない溶 液に対しては、増加しな力つた。本センサは、危険な状態に遷移すると増加する側に 出力するため、危険状態を認識する最小分解能を減少指標型出力に比べて大きく 設定できる。
[0212] また、本実施例で医薬品の安全性を判断する指標として用いたヒストグラム統計値 のピーク街及び分散値 Kは、状態 C1に遷移しても、いずれの指標も状態 B1に比べ やや減少する傾向を見せるものの、薬剤溶液を導入する前の状態 A1に比べ有意に 増加したままであった（図 16及び図 18)。一方、危険性の存在しない化学物質しか 含まれて ヽな 、溶液に対しては、増加しなかった（図 17及び図 19)。
[0213] 危険性の存在する薬剤溶液の、状態 Aに対する状態 Cの変化率は、ピーク街で 23 6.1%、分散値 Kで 236.2%となり、いずれも 2倍強増加した。ピーク街で 200%以上（ 状態 Cのピーク街 cと状態 Cのピーク街 aで算出される JcZjaが 2以上)の変化率は 、有意な差として認識された。同様に、ピーク値 Kで 200%以上 (状態 Cのピーク値 Kc と状態 Cのピーク値 Kaで算出される KcZKaが 2以上）の変化率も、有意な差として 認識された。
[0214] 一方、危険性の存在しない化学物質し力含まれていない溶液の状態 Aを 100%とし た時の状態 Cの変化率は、ピーク街で 70.1%、分散値 Kで 70.1%となり、いずれもわ ずかに減少するも、増加しな力つた。
[0215] さらに、オープンチャネル型ではな 、拮抗剤として別のイオンチャネル、具体的に は ω—コノトキシン GVIAを持つ細胞に対して、統計値のピーク街及び分散値 Κは、 薬剤溶
液に対する指標の増大が起こり（状態 Β3)、対照溶液に戻すと元のレベルに戻った（ 状態 C3) (図 22及び図 23)状態 Αに対する状態 Cの変化率は、ピーク街で 7.3%、 分散値 Kで 70.2%となり、いずれもわずかに減少するも、増加しな力つた。（実施例 2 に詳述する。）本解析方法は、危険性の判別だけでなぐオープンチャネル型拮抗剤 など拮抗の形式まで判定ができ、信頼性も高 ヽことが ヽえる。
[0216] (実施例 2)
実施例 2は、実施の形態 1にかかる医薬品安全センサの一例である。本実施例が 実施例 1と違う点の一つは、センサが貫通孔を持たない構造であり、溶液刺激を入れ てチャネルを積極的に活性ィ匕するため、一つの細胞から出される信号を高感度に取 得しうることである。
[0217] [医薬品安全性試験センサの作製]
まず、本実施例に用いる医薬品安全性試験センサ 120の作成方法を以下に説明 する。
[0218] 図 2及び図を参照して、センサ 120は、センサ基板 101とゥエル形成体 131から構 成される。まず、センサ基板 101は、 4インチ Siウェハを用い、その上にフォトレジスト をスピンコートする。 6行 6列の格子状の各ノードには直径 5 mの円形の測定電極 1 02力 立置し、かつ、電極 102の中心間距離は 20 /z mである。そして、各電極 102か ら放射状に広がるリード線 105を有するパターンを複数、 Siウェハの所定の位置に 露光し、現像した。次に、ウェハの全面に真空蒸着法により金薄膜を堆積させた。そ の後、リフトオフにより、 Siウェハ上に金電極のパターユングが完了する。
[0219] そして、リード線 105部のみに専用現像液を要する絶縁材料であるネガティブ感光 性ポリイミド榭脂 UR-8300 (東レネ土製)で被覆した後、ダイシングし、 40mm角の小片に 切り出した。各小片は、中心に 6行 6列で直径 5 mの円形の測定電極 102が露出し 、電極 102から引き出されたリード線 105が、四方周囲に配置された配線引出し端子 (外部接続部 107)に連通した構成であった。このように作製した各小片を、センサ基 板と 101した。次に、ゥエル形成体 131を作製した。ゥエル 104を構成する凹部は切 削加工により作製し、その後、このゥエル形成体 131をセンサ基板 101の測定電極 1 02が形成された表面側に配設した。
[0220] 次に、本実施例の医薬品安全性試験方法を以下に説明する。
[0221] 検体細胞には、モルモット乳頭筋細胞をモルモットから急性単離して使用した。モ ルモット乳頭筋細胞に存在する遅延整流性カリウムチャネル Krが、被試験医薬品の 標的生体構成要素となる。
[0222] まず、作製したセンサ 120の測定電極 102を含めた細胞播種予定の表面に生体親 和性を持たせるための表面改質を行った。具体的には、細胞接着性タンパク質であ るコラーゲン (Sigma社、 P-4511)を固定化材として測定電極 102の表面を含むセンサ 基板 101上に所定の方法で 1時間被覆した (37°C雰囲気下)。その後、 PBS (リン酸 緩衝生理食塩水）で数回リンスした。
[0223] 単離した細胞を遠心操作により濃縮した後に培養液に再懸濁した細胞懸濁液を、 センサ 120の測定電極 102上に 1 X 105細胞 Zcm2の濃度で播種し、所定の時間の 間、 37°C、 CO濃度 5%下にて培養した。
2
[0224] その後、測定時に、ハンクス液を基本とし、 HEPESにて緩衝作用を持たせた対照 溶液に置換した。溶液は、基本的に上記の他、 2種類とした。まず、第一に、上述した 対照溶液 1である。陽性対照薬及び被試験医薬品は、上記対照溶液に所定の濃度 溶力して使用した。第二に、上述した対照溶液 1と組成が同じで、対照溶液 1の特定 のイオン濃度のみを高く設定した高イオン濃度対照溶液である。なお、細胞に対して は、破砕及び造孔などの操作はしていない。
[0225] 測定に際しては、陽性対照薬として、テルフヱナジン (Sigma社、 T9652)を使用した。
また、被試験試薬には、今回 ω—コノトキシン GVIA(Sigma社、 C9915)を 1 μ Μの濃 度で対照溶液 1に混合して使用した。 ω—コノトキシン GVIAは、電位依存性のカル シゥムチャネルを特異的に阻害すること、さらに筋肉に存在するチャネルには反応せ ず、神経シナプスに存在する前述チャネルを阻害することが知られているので、モル モット乳頭筋細胞が持つ遅延整流性カリウムイオンチャネルには感応しないことが予 想される。対照溶液 1には、 NaClが 137mM、 KClが 4mMのイオン濃度で含まれる力 高イオン濃度対照溶液の KC1を 80mMに設定し、これによる浸透圧の上昇を避ける目 的で、 NaClを 61mMに下げた。つまり、溶液から高イオン濃度対照溶液に置換するこ とによって、間接的に細胞内電位を上昇させることができる。
[0226] 本実施例が実施例 1と違う点の一つは、溶液を対照溶液から高イオン濃度対照溶 液に置換することによって、積極的に溶液刺激を起こし、標的生体構成成分を一定 の量、活性ィ匕させることである。なお、実験結果を図 24に示す。
[0227] 陽性対照薬であるテルフエナジン 0.3 μ Μの電圧応答は、不可逆的に増大した。一 方、試験試薬である ω—コノトキシン GVIA 1 μ Μの濃度では電圧応答は、変化しな かった。
[0228] このように、標的生体構成要素である遅延整流性カリウムチャネルの拮抗効果を、 刺激に対する電極電圧応答の変化時間として検出することができ、これにより、被試 験試薬である ω—コノトキシンは QT延長を起こす危険性はないと判断することができ た。
[0229] 上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施形態が明らか である。従って、上記説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行 する最良の形態を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を 逸脱することなぐその構造及び Ζ又は機能の詳細を実質的に変更できる。
産業上の利用可能性
[0230] 本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、 HERGチャネルに外部力ゝら人 ェ的に電気信号を新たに印加する処理を経ることなぐ QT延長を起こしていることに 相当する測定電極での応答及び、応答時間が医薬品非存在下にくらべ不可逆的に 延長される、危険性を内在するオープンチャネル型候補医薬品の評価方法として有 用である。
[0231] また、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、細胞膜を破砕することなく 、かつ、人工的に調整した細胞内液を使用することなぐ 1液系で測定できるので、よ り生体環境に近い測定条件で試験を実施できる。この両者の効果により、従来の方 法に比べ、本発明の医薬品安全性試験方法は、より信頼性の高い試験となることが できる。また、外部印加用電気回路等を省略でき、装置を簡便に構成することができ る。装置の生産性、製造性に貢献する。
[0232] また、本発明の医薬品安全性試験システムは、危険要素を内在する標的生体構成 要素で構成される検体細胞の被試験医薬品に対する電圧応答差を指標として、被 試験医薬品の危険性を判断するハイスループット医薬品安全性試験システムであり 、例えば、新薬開発初期段階に人体に危険性を有する候補化合物を除外する高速 薬品スクリーニング装置等に有用である。
[0233] さらに、本発明の医薬品安全性試験方法及びシステムは、先天性及び後天性の Q Τ延長症候群の迅速な診断手法等の用途にも応用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 測定電極を持つセンサを使用して、被試験医薬品の、 HERGイオンチャネル又は その相同物を含む検体細胞に対する危険性を試験する医薬品安全性試験方法であ つて、
O)被試験医薬品を含まな ヽ対照溶液中に、 HERGイオンチャネル又はその相同 物を含む検体細胞を保持し、前記検体細胞近傍に前記測定電極を配置する工程と
A)前記対照溶液に接した状態で、前記測定電極によって電圧信号を測定するェ 程と、
B)工程 Aの後、前記対照溶液を、前記被試験医薬品を含む測定溶液に置換し、 前記測定電極によって電圧信号を測定する工程と、
C)工程 Bの後、前記測定溶液を、再び前記対照溶液に置換し、前記測定電極によ つて電圧信号を測定する工程と、
D)前記工程 Aと前記工程 Cで測定された電圧信号を比較し、その結果に基づ ヽて 、前記被試験医薬品の危険性を判定する工程
を含む医薬品安全性試験方法。
[2] 前記工程 Dは、前記工程 Aによって測定された電圧値 al、及び前記工程 Cによつ て測定された電圧値 clから clZalを算出し、
clZalが予め設定された設定値を超えるときは危険性ありと判定し、 clZalが前 記設定値以下であるときは危険性なしと判定する工程である、請求項 1に記載の医 薬品安全性試験方法。
[3] 前記工程 Aの前に、前記検体細胞に含まれるイオンチャネルであって、 HERGィォ ンチャネル以外の少なくとも 1種類以上のイオンチャネルを不活性化する化学物質を 加える工程 E、を含む請求項 1に記載の医薬品安全性試験方法。
[4] 所定の時間間隔で、前記工程 B及び前記工程 Cを 2回以上繰り返す請求項 1に記 載の医薬品安全性試験方法。
[5] 前記工程 B及び前記工程 Cを少なくとも 2回以上くり返す場合において、
1回目に、前記測定溶液として第 1の被試験医薬品が含まれる第 1の測定溶液を用 い、
2回目に、前記測定溶液として第 2の被試験医薬品が含まれる第 2の測定溶液を用
Vヽる請求項 4に記載の医薬品安全性試験方法。
[6] 前記第 1の被試験医薬品と、前記第 2の被試験医薬品が異なる医薬品である請求 項 5に記載の医薬品安全性試験方法。
[7] 前記第 1と第 2の被試験医薬品が同一であり、第 1の測定溶液に含まれる第 1の被 試験医薬品の濃度と、第 2の測定溶液に含まれる第 2の被試験医薬品の濃度とが異 なる請求項 5に記載の医薬品安全性試験方法。
[8] 前記第 1の測定溶液又は前記第 2の測定溶液のどちらか一方の代わりに、陽性対 照試薬又は陰性対照試薬を含む第 3の測定溶液を用い、
前記工程 Dにおいて、更に、前記第 1の測定溶液又は前記第 2の測定溶液を用い て前記工程 A及び前記工程 Cで測定された電圧信号の比 (clZal)と、前記第 3の 測定溶液を用いて前記工程 A及び前記工程 Cで測定された電圧信号の比（cl ' Za
1 ' )とを対比することによって、医薬品の危険性を判定する請求項 5に記載の医薬品 安全性試験方法。
[9] 前記検体細胞が HERGイオンチャネルを定常発現させた細胞株である、請求項 1 に記載の医薬品安全性試験方法。
[10] 前記工程 Α及び前記工程 Cの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の対照溶液 に接触させた後、前記検体細胞が接する前記第一の対照溶液を第二の対照溶液に 換える工程 Fと、
前記工程 Bの前に、所定時間、前記検体細胞を第一の測定溶液に接触させた後、 前記検体細胞が接する前記第一の測定溶液を第二の測定溶液に換える工程 Gとを 含み、
前記第二の対照溶液及び前記第二の測定溶液が、それぞれ前記第一の対照溶液 及び前記第一の測定溶液と比較して、共通して含まれるイオン濃度が異なる請求項 1に記載の医薬品安全性試験方法。
[11] 前記電圧信号が、予め設定したサンプル時間毎の電圧信号の振幅の偏差値を計 算する単位偏差値の集合の統計値を表す、請求項 1に記載の医薬品安全性試験方 法。
[12] 前記統計値が、前記単位偏差値の分布の平均値である、請求項 11に記載の医薬 品安全性試験方法。
[13] 前記統計値が、前記単位偏差値の分布の分散値である、請求項 11に記載の医薬 品安全性試験方法。
[14] 前記検体細胞が被試験医薬品を含む測定溶液に接した状態で測定された電圧信 号が、予め設定したサンプル電圧閾値を超えた後に検出した電圧信号である、請求 項 1に記載の医薬品安全性試験方法。
[15] HERGイオンチャネル又はその相同物を含む検体細胞を含む溶液を満たすことが 可能な凹部を有する基板と、
前記凹部に設けられ、かつ、前記検体細胞の近傍に配置可能な 1以上の測定電極 と、
前記溶液に浸し、前記測定電極と離隔するように設けられた参照電極とを有するセ ンサと、
前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定する電圧測定装置と、 前記凹部に対し複数種類の前記溶液を注入及び排出する溶液注入排出装置と、 制御装置と、を備え、
前記制御装置は、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部に第 1の種類の前 記溶液としての被試験医薬品を含まない対照溶液を前記凹部に満たし、この状態 a2 で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部力 前記対照溶液を排出し かつ前記凹部に第 2の種類の前記溶液としての被試験医薬品を含む測定溶液を満 たし、この状態 b2で前記電圧測定装置によって前記測定電極と前記参照電極との間 の電圧を測定し、
その後、前記溶液注入排出装置を制御して前記凹部カゝら前記測定溶液を排出し かつ前記凹部に前記対照溶液を再び満たし、この状態 c2で前記電圧測定装置によ つて前記測定電極と前記参照電極との間の電圧を測定し、 前記状態 a2で測定された前記電圧と前記状態 c2で測定された前記電圧とを比較し 前記比較結果に基づ!、て前記被試験医薬品の安全性を判定する、医薬品安全性 試験システム。
[16] 前記各測定電極の近傍に前記検体細胞が複数配置されている、請求項 15に記載 の医薬品安全性試験システム。
[17] 前記センサが、前記基板を厚み方向に貫通する貫通孔を有し、該貫通孔近傍に前 記測定電極が配置されている、請求項 15に記載の医薬品安全性試験システム。
PCT/JP2005/009938 2004-05-31 2005-05-31 医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システム Ceased WO2005116242A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006513999A JPWO2005116242A1 (ja) 2004-05-31 2005-05-31 医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システム

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-162457 2004-05-31
JP2004162457 2004-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005116242A1 true WO2005116242A1 (ja) 2005-12-08

Family

ID=35450903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/009938 Ceased WO2005116242A1 (ja) 2004-05-31 2005-05-31 医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システム

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2005116242A1 (ja)
WO (1) WO2005116242A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007225425A (ja) * 2006-02-23 2007-09-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細胞電気生理センサとそれを用いた測定方法およびその製造方法
JP2007298351A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細胞電気生理測定デバイスおよびこれの製造方法
JP2007333571A (ja) * 2006-06-15 2007-12-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法
JP2007333569A (ja) * 2006-06-15 2007-12-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法
JPWO2006022092A1 (ja) * 2004-08-25 2008-05-08 松下電器産業株式会社 細胞電位測定プローブ
WO2014045618A1 (ja) * 2012-09-19 2014-03-27 独立行政法人科学技術振興機構 神経細胞ネットワークの形成及びその利用、並びに神経細胞播種デバイス
WO2016092803A1 (ja) * 2014-12-12 2016-06-16 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 電気化学測定デバイスおよび当該電気化学測定デバイスを備える電気化学測定装置
WO2023286507A1 (ja) * 2021-07-15 2023-01-19 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス 信号処理装置、信号処理方法および信号処理プログラム

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013224934A (ja) * 2012-03-21 2013-10-31 National Institute For Materials Science 微量サンプル測定用センサー素子

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHACHIN M.: "HERG Chennel Hatsugenkei o Mochiita Iyakuhin no Saifuseimyaku Sayo Kenshutsuho", FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, vol. 119, no. 6, 2003, pages 345 - 351, XP002997601 *
NAKATANI H.: "QT Encho Yakubutsu no Saibo Denki Yakurigakuteki Hyokaho", FOLIA PHARMACOLOGICA JAPONICA, vol. 121, no. 6, 2003, pages 384 - 392, XP002997100 *
TSUJIMAE K.: "HERG Channel to KCNQ1/KCNE1 Channel", IGAKU NO AYUMI, vol. 201, no. 13, 2002, pages 1011 - 1016, XP002997602 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2006022092A1 (ja) * 2004-08-25 2008-05-08 松下電器産業株式会社 細胞電位測定プローブ
JP2007225425A (ja) * 2006-02-23 2007-09-06 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細胞電気生理センサとそれを用いた測定方法およびその製造方法
JP2007298351A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細胞電気生理測定デバイスおよびこれの製造方法
JP2007333571A (ja) * 2006-06-15 2007-12-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法
JP2007333569A (ja) * 2006-06-15 2007-12-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 細胞電気生理センサおよびそれを用いた細胞電気生理現象の測定方法
CN104640971A (zh) * 2012-09-19 2015-05-20 独立行政法人科学技术振兴机构 神经细胞网络的形成及其利用、以及神经细胞播种器件
WO2014045618A1 (ja) * 2012-09-19 2014-03-27 独立行政法人科学技術振興機構 神経細胞ネットワークの形成及びその利用、並びに神経細胞播種デバイス
JPWO2014045618A1 (ja) * 2012-09-19 2016-08-18 国立研究開発法人科学技術振興機構 神経細胞ネットワークの形成及びその利用、並びに神経細胞播種デバイス
US9829477B2 (en) 2012-09-19 2017-11-28 Japan Science And Technology Agency Formation and use of neuronal network, and neuron seeding device
WO2016092803A1 (ja) * 2014-12-12 2016-06-16 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 電気化学測定デバイスおよび当該電気化学測定デバイスを備える電気化学測定装置
JPWO2016092803A1 (ja) * 2014-12-12 2017-09-28 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 電気化学測定デバイスおよび当該電気化学測定デバイスを備える電気化学測定装置
WO2023286507A1 (ja) * 2021-07-15 2023-01-19 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス 信号処理装置、信号処理方法および信号処理プログラム
JP2023013011A (ja) * 2021-07-15 2023-01-26 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス 信号処理装置、信号処理方法および信号処理プログラム
JP7807881B2 (ja) 2021-07-15 2026-01-28 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス 信号処理装置、信号処理方法および信号処理プログラム

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2005116242A1 (ja) 2008-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6936462B1 (en) High throughput screen
US20200278339A1 (en) System and method for monitoring cardiomyocyte beating, viability and morphology and for screening for pharmacological agents which may induce cardiotoxicity or modulate cardiomyocyte function
EP2213721B1 (en) Cell measuring vessel, extracellular potential measuring method, and chemical testing method
Atienza et al. Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system
Kloß et al. Microcavity array (MCA)-based biosensor chip for functional drug screening of 3D tissue models
JP6337113B2 (ja) ハイスループット電気生理機能のためのデバイス、システム、及び方法
CA2760941C (en) System and method for monitoring cardiomyocyte beating, viability and morphology and for screening for pharmacological agents which may induce cardiotoxicity or modulate cardiomyocyte function
Wang et al. Automated electrophysiology: high throughput of art
US20030113833A1 (en) Device for measuring extracellular potential, method of measuring extracellular potential by using the same and apparatus for quickly screening drug provided therewith
EP1982167A1 (en) Biosensor
WO2010088234A2 (en) Method and apparatus for facilitating evaluating migration of cells in vitro
Stett et al. Patch-clamping of primary cardiac cells with micro-openings in polyimide films
WO2005116242A1 (ja) 医薬品安全性試験方法及び医薬品安全性試験システム
EP2037268A1 (en) Apparatus and method for recording electrical activity in cells
Py et al. Culturing and electrophysiology of cells on NRCC patch-clamp chips
Marino et al. High-throughput impedance monitoring in 3D tumor cultures: a multiplex, microfluidic-free platform for drug screening
Stoelzle-Feix State-of-the-art automated patch clamp: heat activation, action potentials, and high throughput in ion channel screening
Thiébaud Fabrication of microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures by interface
Villiger et al. Importance of Biochips in the Study of Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors: Biochips and nicotinic receptors
Guia et al. Planar Electrodes
JP2011191241A (ja) 電気生理測定デバイス
JP2007225483A (ja) 細胞電気生理センサとその使用方法およびその製造方法
Wilson Automated patch clamping systems design using novel materials
JP2009002876A (ja) 細胞電気生理センサ
Robitzki et al. Integrative Nanobioengineering: Novel Bioelectronic Tools for Real Time Pharmaceutical High Content Screening in Living Cells and Tissues

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006513999

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase