WO2005113806A1 - ブドウ膜炎を診断する方法 - Google Patents

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WO2005113806A1
WO2005113806A1 PCT/JP2005/008950 JP2005008950W WO2005113806A1 WO 2005113806 A1 WO2005113806 A1 WO 2005113806A1 JP 2005008950 W JP2005008950 W JP 2005008950W WO 2005113806 A1 WO2005113806 A1 WO 2005113806A1
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dna
nucleic acid
uveitis
cxcr1
cx3cr1
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Hiroshi Okamura
Kouichi Hirayama
Hirofumi Yamano
Koh-Hei Sonoda
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Toyo Kohan Co Ltd
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Kyushu TLO Co Ltd
Toyo Kohan Co Ltd
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing uveitis, a nucleic acid therefor, a carrier having the nucleic acid immobilized thereon, and a method for screening a compound for preventing or treating uveitis.
  • Uveitis an ocular disease, causes inflammation of the uveal tissue in the eyeball, causing inflammatory cells and exudates such as leukocytes and lymphocytes to appear in the vitreous, causing symptoms such as flying mosquitoes. It is a disease that develops and causes cataracts and glaucoma.
  • the causes of uveitis are many and varied, and it is difficult to provide appropriate treatment methods that are difficult to diagnose due to various factors such as viruses and bacteria.
  • Ophthalmological examinations include, for example, the usual visual acuity tests' Intraocular pressure tests' Slit lamp tests' Fundus examinations', or in patients with retinal vasculitis, a fluorescent fundus contrast test 'OCT Equipment) Inspections are being conducted.
  • a whole-body examination for example, chest / lumbar X-ray photography, electrocardiogram, tuberculin reaction, etc., and if necessary, cerebrospinal fluid examination, etc. are also performed.
  • These tests measure peripheral blood leukocyte count, inflammatory response (CRP, ESR), autoantibody titer, presence or absence of infectious disease (specific antibody titer), and so on.
  • CRP inflammatory response
  • ESR inflammatory response
  • autoantibody titer presence or absence of infectious disease (specific antibody titer)
  • the present invention aims to provide a method for diagnosing uveitis at a low cost and speedy means.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that The present inventors have found that the amount of nucleic acid encoding a specific chemokine receptor is increased in a conventional sample and that uveitis can be diagnosed by detecting the nucleic acid, thereby completing the present invention. .
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for diagnosing uveitis in an individual comprising measuring at least one gene expression level of a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 in a sample derived from the individual.
  • the diagnostic method comprising:
  • the gene expression level of a chemokine receptor is measured by measuring at least one mRNA encoding a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1, and CXCR4 as described in (1). the method of.
  • the carrier is a solid support having a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid on a substrate, and at least one surface layer selected from diamond, soft diamond, carbon-based materials, and carbides; (8) A carrier according to item 1.
  • (10) A group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 in the presence and absence of the test compound.Uveitis by comparing the gene expression levels of at least one selected chemokine receptor. A method for screening a compound that prevents or treats cancer.
  • FIG. 1 shows spotting positions of each chemokine receptor on a solid support in Examples 1 and 2.
  • Figure 2 shows the results obtained by labeling cDNAs derived from the blood of healthy subjects and uveitis patients, hybridizing them with the probe nucleic acids immobilized on a solid support, and taking images with a fluorescence scanner. is there.
  • a chemokine means a low-molecular protein having chemotactic activity on leukocytes.
  • Chemokines are structurally similar, with four conserved cysteines. Of these cysteines, they are classified into four subfamilies, CC chemokines, CXC chemokines, CXC chemokines, and C chemokines, based on the positional relationship of the two N-terminal residues.
  • Chemokine receptors are seven-transmembrane G protein-coupled receptors. Depending on the subfamily of chemokines that specifically bind to them, CC chemokines, CXC chemokines, CXC chemokines, CXs Classified as chemokine receptors.
  • the present inventors have found that, in a sample derived from an individual suffering from uveitis, among the above chemoforce receptors, four types of chemokines CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 are used. It was found that the gene expression level of the receptor was significantly increased in comparison with an individual suffering from uveitis.
  • Uvea refers to the choroid, pigment, or middle layer of the eyeball and consists of the choroid, ciliary body, and iris. Uveitis refers to a condition in which these are in an inflammatory state.
  • the present invention provides a method for diagnosing uveitis in an individual, comprising: (a) in a sample derived from the individual, a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1, and CXCR4; At least one gene expression level is measured. (B) The gene expression level of the chemokine receptor measured in (a) is compared with the standard gene expression level of the corresponding chemokine receptor, and the standard gene expression level is determined. The decrease or increase in the expression level of the chemoforce-in receptor gene of said individual as compared to that of said individual indicates the presence of uveitis.
  • the individual to be diagnosed is not particularly limited as long as it is an animal expressing a chemokine receptor, and is a mammal, particularly a human.
  • the expression level of a chemokine receptor gene is measured directly (for example, by detecting an absolute protein level or mRNA level) or relatively (for example, by detecting a chemokine receptor protein level or mRNA level). Means in the first sample qualitatively or quantitatively measuring the level of the chemokine receptor protein or the level of the mRNA encoding the chemokine receptor in the first sample (by comparing with the second sample).
  • a chemokine receptor protein level or mRNA level in the first sample is measured, and a second sample derived from the individual who is also afflicted with uveitis, a force that is also obtained, or uveitis When compared to a standard chemokine receptor protein level or mRNA level determined by averaging the levels from a population of individuals. Once the standard chemokine receptor protein or mRNA levels are known, they can be used repeatedly as a standard for comparison.
  • the above-mentioned chem in an individual afflicted with uveitis compared to a standard gene expression level The decrease or increase in the expression level of the force-in receptor gene is different for each chemokine receptor. That is, for CCR4, when its expression level in an individual is reduced compared to the standard gene expression level, for CXCR1, when its expression level in the individual is increased compared to the standard gene expression level, For CX3CR1, when its expression level in the individual is reduced compared to the standard gene expression level, for CXCR4, when its expression level in the individual is reduced compared to the standard gene expression level In addition, the individual can be diagnosed as having uveitis.
  • Measuring at least one gene expression level of a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 means that one of the four chemokine receptors CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 This means measuring the gene expression levels of the species, preferably two, more preferably three, and most preferably four.
  • the sample of the individual to be detected is not particularly limited as long as it is a sample that can express a chemokine receptor.
  • a body fluid such as blood, and leukocytes, lymphocytes, monocytes, activated T Cells, dendritic cells, eosinophils, NK cells, basophils, Th2 cells, Tel cells, Tc2 cells, mature dendritic cells, naive T cells, neutrophils, etc. It is preferred to use
  • nucleic acid quantification methods known in the art, for example, nucleic acid amplification (eg, PCR, RT-PCR), RNase It can be measured by Ze protection, Northern blotting, or other hybridization methods.
  • Northern 'blot analysis is described by Harada et al., Cell,
  • S1 mapping can be performed as described in Fujita et al., Cell, 49: 357-367 (1987).
  • At least one probe nucleic acid that specifically hybridizes with a nucleic acid encoding any one of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 is provided on a carrier.
  • a carrier By immobilizing the probe nucleic acid and contacting the probe nucleic acid with the sample cDNA obtained by reverse transcription of the mRNA derived from the individual, and detecting the sample cDNA that hybridizes with the probe nucleic acid. The corresponding chemocha The level of mRNA encoding the in receptor is measured.
  • the sample cDNA can be prepared by a method known in the art. For example, total RNA isolated from a sample is added to a reaction mixture containing an RT primer and an appropriate buffer. After incubation for primer annealing, additional RT buffer, dNTP, DTT, RNase inhibitor and reverse transcriptase are added. After incubation to complete the reverse transcription of the RNA, the RT product is subjected to a PCR reaction using a labeled primer. Alternatively, labeled primer dNTP may be incubated in the PCR reaction mixture without labeling the primer. PCR amplification can be performed in a DNA thermal cycle according to conventional techniques.
  • the label is not particularly limited as long as it can be incorporated into the nucleic acid.
  • Examples of the label include fluorescent labels (CyDye such as Cy3 and Cy5, FITC, RITC, rhodamine, texathread, TET, TAMRA, FAM , HEX, ROX, etc.) and radioactive labels ( ⁇ -32P, y-32P, 35S, etc.).
  • This sample cDNA is prepared as a spotting solution by dissolving it in a spotting buffer so that the concentration is usually from 0.002 to 50 ⁇ M, preferably from 0.2 to 0.5 ⁇ M.
  • This spotting solution is dropped onto the carrier on which the probe DNA prepared above is immobilized, and incubation is carried out to form a hybrid.
  • High Priestess head formation method a publicly known method, for example, Molecular Cloning 2 nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) can be carried out ⁇ Tsu like the method described in .
  • the incubation is carried out usually at 25 to 95 ° C, preferably 40 to 65 ° C, usually for 0.01 to: 00 hours, preferably for 1 to 16 hours. Also in the hybridization step, it is preferable to carry out the incubation in a high humidity atmosphere. Finally, after the carrier is washed and dried, hybridization can be detected by reading the label derived from the nucleic acid that has formed the hybrid.
  • the present invention also provides a nucleic acid specifically hybridizing to any one of nucleic acids encoding a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 for diagnosing uveitis. And a reagent comprising: Such nucleic acids are It is useful as a probe nucleic acid for diagnosing meningitis, for example, a probe nucleic acid for measuring a gene expression level based on the above mRNA level.
  • a nucleic acid that specifically hybridizes with any one of nucleic acids encoding a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 is referred to as a probe nucleic acid.
  • the term "specifically hybridizes” means that it hybridizes with a nucleic acid encoding a chemokine receptor under stringent hybridization conditions.
  • the stringent hybridization conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is 19 to 40 mM, preferably 19 to 20 mM, and the temperature is 50 to 70 ° C, preferably 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is 19 mM and the temperature is 65 ° C. is most preferable.
  • the probe nucleic acid of the present invention includes at least a part of a base sequence complementary to a nucleic acid encoding any one of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4, at least 15 base length, preferably 15 to : LOO base length nucleic acids. At least a portion refers to at least 15 bases, more preferably at least 20 bases, and most preferably, a nucleic acid having a base sequence complementary to a nucleic acid encoding any one of CCR4, CXCR1, CX3CR1, and CXCR4. It means a nucleic acid portion having a continuous base sequence of 30 to 70 bases in length.
  • the nucleic acid encoding any one of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 includes both DNA and RNA, and is preferably cDNA.
  • the probe nucleic acid also contains both DNA and RNA, preferably DNA.
  • the probe nucleic acid of the present invention comprises at least 70% or more of the probe nucleic acid containing at least a part of a nucleotide sequence complementary to a nucleic acid encoding one of CCR4, CXCR1, CX3CR1, and CXCR4. It consists of a nucleotide sequence having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more, and corresponds to a corresponding one of nucleic acids encoding CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4. Nucleic acids that specifically hybridize to nucleic acids are also included.
  • the nucleic acid specifically hybridizing with the nucleic acid encoding CCR4 for diagnosing uveitis is preferably the following DNA (a) or (b):
  • (b) contains at least a portion of the DNA of (a) and specifically hybridizes to a nucleic acid encoding CCR4; Soy DNA.
  • the nucleic acid specifically hybridizing with the nucleic acid encoding CXCR1 for diagnosing uveitis is preferably the following DNA (a) or (b):
  • the nucleic acid that specifically and specifically hybridizes with the nucleic acid encoding CX3CR1 for diagnosing uveitis is preferably the following DNA (a) or (b):
  • the nucleic acid specifically hybridizing with the nucleic acid encoding CXCR4 for diagnosing uveitis is preferably the following DNA (a) or (b):
  • At least a part is at least 15 nucleotides in length, more preferably at least 20 nucleotides in the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 6, 12, 15 and 17, respectively. It means a nucleic acid portion consisting of a continuous base sequence having a base length, even more preferably at least 30 base lengths, most preferably 30 to 60 base lengths.
  • the DNA of (b) is usually a DNA having a length of 5 to 1000 bases, preferably 10 to 100 bases, and most preferably 30 to 70 bases.
  • the present invention also includes at least one probe nucleic acid that specifically hybridizes with any one of nucleic acids encoding a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4.
  • the present invention relates to a carrier on which a nucleic acid of at least one species is immobilized.
  • the nucleic acid-immobilized carrier is useful for measuring the chemokine receptor gene expression level in a sample derived from an individual in the method for diagnosing uveitis of the present invention.
  • the term "comprising at least one kind of the probe nucleic acid specifically hybridizing with one kind of nucleic acid encoding a chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4" means that four kinds of chemokines One, preferably two, more preferably three, and most preferably four of the four probe nucleic acids that specifically hybridize to the nucleic acid encoding any one of the receptors CCR4, CXCR1, CX3CR1, and CXCR4 Includes seeds.
  • nucleic acids other than these four types of probe nucleic acids may be further immobilized.However, the total number of nucleic acids immobilized on the carrier due to cost reasons is 200 or less, Preferably 100 or less.
  • the probe nucleic acid immobilized on the carrier of the present invention is preferably DNA.
  • the immobilization of the probe nucleic acid on the carrier can be performed by a method known in the art.
  • probe nucleic acid DNA or PCR products DNA fragments obtained by amplifying cDNA by PCR
  • these can be immobilized on a polycation (polylysine) using the spotter device provided in the DNA chip preparation device. (Polyethyleneimine, etc.), and a method of spotting the carrier on the surface of the carrier and electrostatically bonding the carrier to the carrier using the charge of the DNA is generally used.
  • a method for treating the surface of the carrier a method using a silane coupling agent having an amino group, an aldehyde group, an epoxy group, or the like is also used. In this case, amino groups, aldehyde groups, and the like are introduced to the carrier surface by covalent bonds, and therefore, are stably present on the carrier surface as compared with the case of using polycations.
  • the probe nucleic acid to be immobilized is a synthetic oligonucleotide
  • an oligonucleotide having a reactive group introduced therein can be synthesized, and the oligonucleotide can be spotted on the surface-treated carrier surface and covalently bonded.
  • PDC p-phenylenediisothiocyanate
  • a carrier for immobilizing the probe nucleic acid those usually used in the art can be used.
  • noble metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and conductive materials such as graphite and carbon typified by carbon fiber; single-crystal silicon, amorphous silicon, Silicon carbide, acid Semiconductor materials typified by silicon nitride and silicon nitride; composite materials of these semiconductor materials typified by SOI (silicon on insulator); glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramitas, forsterite And inorganic materials such as photosensitive glass; polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, and poly (vinyl)
  • Buracetal acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene
  • examples include organic materials such as copolymers, polyphenylene oxide, and polysulfone.
  • a carrier for immobilizing a probe nucleic acid a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid on a substrate, and at least one surface layer selected from diamond, soft diamond, a carbon-based substance, and a carbide It is preferable to use a carrier that is a solid support having the following.
  • the material of the substrate used for the solid support examples include silicone, glass, fiber, wood, paper, ceramics, and plastics (eg, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin). (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, Shiraidani vinyl resin ), Synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon; metals such as gold, silver, copper, aluminum, tungsten, and molybdenum; And the like, in which the above-mentioned resin is mixed and formed as a binder; That a material obtained by powder raw materials such as metal powder or ceramic powder with a press molding machine and sintered at high temperature and the like.
  • plastics eg, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin.
  • nylon acrylic resin, fluor
  • the solid support of the present invention has a surface layer on a substrate. With this surface layer, a compound for introducing a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid can be firmly fixed on a substrate.
  • the surface layer is selected from diamond, soft diamond, carbon-based material and carbide. At least one kind is formed.
  • the diamond, soft diamond, carbon-based material and carbide include synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon, and carbon-based material (for example, graphite, fullerene, Carbon nanotubes), a mixture thereof, or a laminate thereof, hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, Carbides such as molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide;
  • soft diamond is a general term for imperfect diamond structures that are a mixture of diamond and carbon, such as so-called diamond-like carbon (DLC), and the mixing ratio is not particularly limited. In the present invention, it is preferable to use soft diamond.
  • DLC diamond-like carbon
  • the substrate is formed of at least one material selected from diamond, soft diamond, a carbon-based material, and carbide
  • it is not necessary to form a new surface layer on the substrate When the substrate is formed of another material, a surface treatment is performed to form a surface layer formed of at least one material selected from diamond, soft diamond, a carbon-based material, and carbide.
  • An example of a substrate that has been subjected to a surface treatment is a substrate in which soft diamond is formed on a slide glass.
  • diamond-like carbon is used in the presence of hydrogen gas 0 to 9
  • It is preferably prepared by ionization vapor deposition in a mixed gas containing 9% by volume and the remaining methane gas of 100 to 1% by volume.
  • the thickness of the surface layer formed by the surface treatment is Inn! Preferably it is ⁇ 100 ⁇ m.
  • the surface treatment of the substrate is performed by a known method, for example, a microwave plasma CVD (Chemical Vapor Deposit) method, an ECRCVD (Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit) method, an ICP (Inductive Coupled Plasma) method, a DC sputtering method. , ECR (Electric Cyclotron Resonance) notting method, ion plating method, arc ion plating method, EB (Electron Beam) evaporation method, resistance heating evaporation method, ionization evaporation method, arc evaporation method, laser evaporation method, etc. Can be performed.
  • a surface layer may be formed by forming a laminate or a composite of the above-described substrate material (for example, a composite of diamond and another substance (for example, a two-phase body)).
  • the shape and size of the substrate are not particularly limited! ⁇ , but examples of the shape include a plate shape, a thread shape, a spherical shape, a polygonal shape, and a powder shape. Is about 0.1 to 100 mm in width, 0.1 to 100 mm in length, and 0.01 to in thickness: about LOmm.
  • a single layer of Ti, Au, Pt, Nb, Cr, TiC, TiN, or the like or a composite film thereof may be formed as a reflective layer on the front or back surface of the substrate.
  • the thickness of the reflective layer is required to be uniform over the entire surface, and is therefore preferably lOnm or more, more preferably lOOnm or more.
  • the surface is intentionally roughened with Ra (jIS B 0601) in a range of 1 nm to 1000 nm.
  • Ra jIS B 0601
  • Such a roughened surface is advantageous in that the surface area of the substrate increases and a large amount of probe nucleic acid can be immobilized at a high density.
  • the solid support of the present invention may be provided with an electrostatic layer for electrostatically attracting nucleic acids.
  • the electrostatic layer is not particularly limited as long as it can attract nucleic acids electrostatically and improve the amount of immobilized nucleic acids.
  • a compound having a positive charge such as an amino group-containing compound can be used. Can be formed.
  • the amino group-containing compound may be an unsubstituted amino group (1-NH 2) or a C 1-6
  • the amino group-containing compound is introduced into a film forming apparatus to form a carbon-based film containing an amino group.
  • the non-substituted or mono-substituted substrate is formed on the substrate in order to enhance the affinity between the electrostatic layer and the surface layer, that is, the adhesion.
  • the carbon compound used here is not particularly limited as long as it can be supplied as a gas. However, for example, methane, ethane, and propane, which are gases at ordinary temperature, are preferable.
  • the method of vapor deposition the ionization vapor deposition method is preferable.
  • the working pressure is in the range of 0.1 to 50 Pa and the accelerating voltage is in the range of 200 to 1000 V! /.
  • the electrostatic layer is formed by covalent bonding with the surface layer
  • the surface of the substrate having the surface layer is chlorinated by irradiating ultraviolet rays in chlorine gas to chlorinate the surface.
  • a polyvalent amine such as polyallylamine, polylysine, 4,4 ', 4 "-triaminotriphenylmethane or triamterene is reacted, and an amino group is added to the end not bound to the substrate. Is introduced, an electrostatic layer can be formed.
  • a reaction for introducing a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid for example, introduction of a carboxyl group using a dicarboxylic acid or a polycarboxylic acid
  • a substrate is immersed in a solution containing the above-mentioned compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group, and then a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid is introduced.
  • the solvent for the solution include water, N-methylpyrrolidone, and ethanol.
  • the substrate When a carboxy group is introduced into the substrate provided with the electrostatic layer using a dicarboxylic acid or a polycarboxylic acid, the substrate may be activated in advance with N-hydroxysuccinimide and Z or carpoimides, Alternatively, it is preferable to carry out the reaction in the presence of N-hydroxysuccinimide and Z or carpoimides.
  • the solid support of the present invention has a functional group capable of covalently binding to a nucleic acid.
  • the functional group can be formed by chemically modifying the substrate surface.
  • Examples of the functional group include a carboxyl group, an active ester group, a haloformyl group, a hydroxyl group, a sulfate group, a cyano group, a nitro group, a thiol group, and an amino group.
  • Examples of the compound used to introduce a carboxyl group as a functional group include, for example, a compound represented by the formula: X—I ⁇ —COOH (where X is a halogen atom, and R 1 is a divalent C 1 to C 12 A hydrocarbon group.), For example, chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, odoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3chloroacrylinoleic acid, Dicarboxylic acid represented by the formula: HOOC—R 2 —COOH (where R 2 represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), for example, oxalic acid , Malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, phthalic acid; polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid and butanetetracarboxylic acid; formula: R 3
  • X- OC- R 5 COOH (wherein, X is a halogen atom, R 5 is Monohalide of a dicarboxylic acid represented by a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms, for example, succinic monochloride, malonic monochloride; phthalic anhydride, succinic anhydride, oxalic anhydride Acid anhydrides such as acid, maleic anhydride, and butanetetracarboxylic anhydride are exemplified.
  • the carboxyl group introduced as described above is a compound such as N-hydroxysuccinimide and a dehydrating condensing agent such as cyanamide percarboimide (for example, 1- [3 (dimethylamino) propyl] 3ethylcarboimide).
  • a dehydrating condensing agent such as cyanamide percarboimide (for example, 1- [3 (dimethylamino) propyl] 3ethylcarboimide).
  • Activated ester can be used.
  • Examples of the compound used for introducing a haloformyl group as a functional group include, for example, a compound represented by the following formula: 00 ⁇ 1 ⁇ 6— ⁇ 0— (wherein X is a halogen atom, R 6 is a single bond or carbon Dino and dilide of a dicarboxylic acid represented by the following formulas (1 to 12). Examples thereof include succinic chloride and malonic chloride.
  • Examples of the compound used to introduce a hydroxyl group as a functional group include, for example, a compound represented by the formula: HO—R 7 —COOH (where R 7 represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms). ), And hydroxy acids or phenolic acids. [0065] Examples of the compound used to introduce an amino group as a functional group include amino acids.
  • polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polymethacrylic acid, trimellitic acid, and butanetetracarboxylic acid can also be used to improve hydrophilicity.
  • the probe nucleic acid can be firmly immobilized, so that a highly sensitive diagnosis with high detection sensitivity is possible.
  • a method for directly measuring the level of a chemokine receptor protein in a sample obtained from an individual is used as a method for measuring the expression level of a chemokine receptor gene.
  • a method for directly measuring the level of a chemokine receptor protein in a sample obtained from an individual is used.
  • Assessing the chemokine receptor protein level in a sample can be performed using any method known in the art.
  • Preferred for the assay of chemokine receptor protein levels in the sample is an antibody-based technique.
  • antibody-based methods useful for detecting chemokine receptor protein levels include immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA).
  • chemokine receptor protein-specific monoclonal antibodies can be used both as immunosorbents and as enzyme-labeled probes to detect and quantify chemokine receptor proteins.
  • Antibodies to each of the CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 proteins may be commercially available or can be obtained by immunizing an animal by a method known in the art.
  • Behcet's disease which is a factor in the onset of uveitis
  • changes in CXCR2 are found in the protein detection level, and the expression level of CXCR2 in patients with Behcet's disease is stronger than that in healthy subjects. .
  • the diagnosis method of the present invention can perform diagnosis in several hours to several days, and rapid diagnosis is possible. It is possible.
  • the present invention also relates to the presence and absence of a test compound. Screening for a compound that prevents or treats uveitis by comparing gene expression levels of at least one chemokine receptor selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 in the absence and presence of .
  • the expression level of the chemokine receptor can be measured by detecting the protein level or the mRNA level as described above for the diagnostic method.
  • the screening method of the present invention can be implemented, for example, as follows.
  • a test compound is administered to a normal or uveitis model non-human mammal, and after a certain period of time after administration (30 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 2 days, more preferably 1 hour to 2 days) After 24 hours), at least one of the mRNAs encoding any one of the chemokine receptors selected from the group consisting of CCR4, CXCR1, CX3CR1 and CXCR4 contained in the animal-derived sample, preferably blood. Measure the seed.
  • the test compound can be determined to be a compound having an activity of preventing or treating uveitis.
  • a diamond-like carbon layer was coated on a 3 mm square silicon substrate, modified with a carboxyl group, and then activated with N-hydroxysuccinimide to produce a solid support.
  • a microarray spotter SPBIO2000 (Hitachi Software) 25 types of 60-mer fragments of the DNA encoding the chemokine receptor were spotted on the solid support as probe DNA.
  • the DNA fragment was dissolved in a 20% PEG (polyethylene glycol) solution at a concentration of 10 IX M to obtain a spotting solution.
  • the substrate was placed in an oven at 80 ° C. for 1 hour, and then washed with a 2 ⁇ SSCZ 0.2% SDS solution at room temperature for 15 minutes. Then 95. After washing with 2XSSCZ0.2% SDS solution heated to C for 5 minutes, washing with ultrapure water several times and blowing with compressed air The substrate was dried.
  • the labeled cDNA sample was dropped on the solid support on which the probe DNA was immobilized, and hybridization was performed at 42 ° C for 18 hours. Then, after washing sequentially with 2 ⁇ SSCZ 0.2% SDS, 0.2 ⁇ SSC / 0.2% SDS, and 0.2 ⁇ SSC, an image was taken with a fluorescence scanner. The results are shown on the right side of FIG.
  • CCR4 the expression level in uveitis patients decreases compared to the expression level in healthy subjects
  • CXCR1 the expression level in uveitis patients increases compared to the expression levels in healthy subjects.
  • the expression level of CX3CR1 in uveitis patients was decreased as compared to the expression level in healthy subjects
  • the expression level of CXCR4V in uveitis patients was compared to the expression level in healthy subjects. The decrease was evident.
  • the causes of uveitis which is an eye disease, are diverse, and it is difficult to provide an appropriate treatment method that is difficult to diagnose because various factors such as viruses and bacteria are considered.
  • diagnosis of uveitis is made by performing various ophthalmic examinations and whole-body examinations, including direct observation with a biological microscope, and observing the progress over a long period of time.
  • a method of diagnosing uveitis in an individual wherein the diagnosis is performed by measuring the gene expression level of at least one chemokine receptor selected from a specific group in a sample derived from the individual. It will be possible to diagnose uveitis cheaply and quickly.

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Abstract

　本発明は、ブドウ膜炎を安価かつ効果的に診断することを目的とする。 　血液等の体液、ならびに白血球、リンパ球、単球、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、ＮＫ細胞、好塩基球、Ｔｈ２細胞、Ｔｃ１細胞、Ｔｃ２細胞、成熟樹状細胞などの個体由来の試料における、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ１、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＸＣＲ４からなる群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも１種の遺伝子発現レベルを測定することによる個体におけるブドウ膜炎を診断する方法。

Description

ブドウ膜炎を診断する方法
技術分野
[0001] 本発明は、ブドウ膜炎を診断する方法、そのための核酸および該核酸が固定化さ れた担体、ブドウ膜炎を予防又は治療する化合物をスクリーニングする方法に関する 背景技術
[0002] 眼病であるブドウ膜炎は、眼球にあるブドウ膜という組織が炎症を起こし、白血球や リンパ球のような炎症細胞や滲出物が硝子体中に出現して飛蚊症等の症状を発生さ せ、白内障や緑内障の原因ともなる疾患である。しかし、ブドウ膜炎の原因は多種多 様であり、ウィルスや細菌など、様々な要因が考えられるために診断が難しぐ適切な 治療方法を提供することが困難な状況にある。
[0003] 現在、ブドウ膜炎の診断は、生体顕微鏡による直接観察を始めとする様々な眼科 的検査や全身検査を行い、長時間かけて経過を観察することによって行われている 。眼科的検査としては、例えば、通常の視力検査 '眼圧検査'細隙灯検査 '眼底検査 など、あるいは、網膜血管炎を合併している症例では蛍光眼底造影検査 'OCT (光 干渉網膜厚測定装置)検査などが行われている。全身検査としては、例えば、胸部' 腰部 X線撮影、心電図、ッベルクリン反応など、必要な場合は脳脊髄液検査なども行 われている。このような検査により、末梢血白血球数、炎症反応（CRP、 ESR)、自己 抗体価、感染症の有無 (特異抗体価)などが測定される。しかし、このような検査によ つて診断されるのは、患者の半分程度というのが現状である。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、ブドウ膜炎を安価かつ迅速に診断する方法を提供することを目的とする 課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ブドウ膜炎患者由 来の試料にぉ 、て特定のケモカイン受容体をコードする核酸が増大して 、ること、当 該核酸を検出することによりブドウ膜炎を診断できることを見出し、本発明を完成させ るに至った。
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
(1)個体におけるブドウ膜炎を診断する方法であって、該個体由来の試料における、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイン受 容体の少なくとも 1種の遺伝子発現レベルを測定することを含む、上記診断方法。
(2) CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイ ン受容体をコードする mRNAの少なくとも 1種を測定することによって、ケモカイン受 容体の遺伝子発現レベルを測定する（1)に記載の方法。
(3)ブドウ膜炎を診断するための、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4から なる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか 1種と特異的に ハイブリダィズする 15〜： LOOO塩基長の核酸を含む試薬。
(4)ブドウ膜炎を診断するための、以下の（a)または (b)の DNAを含む試薬：
(a)配列番号 6で表される塩基配列力 なる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CCR4をコードする核酸と特異的にハイプリ ダイズする DNA。
(5)ブドウ膜炎を診断するための、以下の（a)または (b)の DNAを含む試薬：
(a)配列番号 12で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CXCR1をコードする核酸と特異的にハイブ リダィズする DNA。
(6)ブドウ膜炎を診断するための、以下の（a)または (b)の DNAを含む試薬：
(a)配列番号 15で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CX3CR1をコードする核酸と特異的にハイ ブリダィズする DNA。
(7)ブドウ膜炎を診断するための、以下の（a)または (b)の DNAを含む試薬：
(a)配列番号 17で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CXCR4をコードする核酸と特異的にハイブ リダィズする DNA。
(8)ブドウ膜炎を診断するための、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4から なる群力 選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか 1種と特異的に ハイブリダィズするプローブ核酸を少なくとも 1種含む 2000種以下の核酸が固定ィ匕 された担体。
(9)担体が、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤ モンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体 支持体である、 (8)に記載の担体。
(10)被検化合物の存在下および不在下における、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1お よび CXCR4力 なる群力 選択されるケモカイン受容体の少なくとも 1種の遺伝子発 現レベルを比較することにより、ブドウ膜炎を予防または治療する化合物をスクリー- ングする方法。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]図 1は、実施例 1および 2において、固体支持体上における各ケモカイン受容体 のスポッティング位置を示す。
[図 2]図 2は、健常者およびブドウ膜炎患者の血液に由来する cDNAを標識し、それ ぞれ固体支持体上に固定されたプローブ核酸とハイブリダィズさせ、蛍光スキャナー で画像撮影した結果である。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明においてケモカインとは、白血球に対する走化活性をもつ低分子タンパク質 を意味する。ケモカインは構造的に類似し、 4つのシスティンが保存されている。これ らのシスティンのうち、 N末端側の 2残基の位置関係により、 CCケモカイン、 CXCケ モカイン、 CX Cケモカイン、 Cケモカインの 4つのサブファミリーに分類される。
3
[0009] ケモカイン受容体は、 7回膜貫通型 Gタンパク共役型受容体であり、特異的に結合 するケモカインのサブファミリーにより、 CCケモカイン受容体、 CXCケモカイン受容体 、 CX Cケモカイン受容体、 Cケモカイン受容体に分類される。
3
[0010] 本発明者らは、ブドウ膜炎に罹患した個体に由来する試料において、上記のケモ 力イン受容体のうち、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4の 4種のケモカイン 受容体の遺伝子発現レベルが、ブドウ膜炎に罹患して 、な 、個体と比較して有意に 増大していることを見出した。
[0011] ブドウ膜とは、眼球の脈絡層、色素層または中層で脈絡膜、毛様体、虹彩からなる 組織を意味し、ブドウ膜炎とはこれらが炎症状態にある症状を意味する。
[0012] すなわち本発明は、個体におけるブドウ膜炎を診断する方法であって、（a)該個体 由来の試料における、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選 択されるケモカイン受容体の少なくとも 1種の遺伝子発現レベルを測定し、 (b) (a)で 測定したケモカイン受容体の遺伝子発現レベルを、対応するケモカイン受容体の標 準の遺伝子発現レベルと比較し、標準の遺伝子発現レベルと比較した該個体のケモ 力イン受容体遺伝子の発現レベルにおける減少または増加がブドウ膜炎の存在を示 すものとする、上記診断方法に関する。
[0013] CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4の塩基配列およびアミノ酸配列につい て【ま、 b\VISS-PROT Protein Sequence Database (http://www.expasy.ch/sprot /sprot-top.html)に登録されている。
[0014] 診断の対象となる個体は、ケモカイン受容体を発現する動物であれば特に制限さ れず、哺乳動物、特にヒトである。
[0015] ケモカイン受容体遺伝子の発現レベルを測定するとは、直接的に（例えば、絶対的 なタンパク質レベルまたは mRNAレベルを検出することによって）または相対的に（ 例えば、ケモカイン受容体タンパク質レベルまたは mRNAレベルを第 2の試料と比 較することによって）第 1の試料において、ケモカイン受容体タンパク質のレベルまた はケモカイン受容体をコードする mRNAのレベルを定性的または定量的に測定する ことを意味する。好ましくは、第 1の試料におけるケモカイン受容体タンパク質レベル または mRNAレベルを測定し、ブドウ膜炎に罹患して ヽな 、個体由来の第 2の試料 力も得られたものである力、またはブドウ膜炎に罹患して 、な 、個体の集団からレべ ルを平均化することによって決定されている標準のケモカイン受容体タンパク質レべ ルまたは mRNAレベルと比較する。標準ケモカイン受容体タンパク質レベルまたは mRNAレベルがいったん判ると、比較の標準として繰り返し使用することができる。
[0016] 標準の遺伝子発現レベルと比較したブドウ膜炎に罹患した個体における上記ケモ 力イン受容体遺伝子の発現レベルの減少または増加は、各ケモカイン受容体によつ て異なる。すなわち、 CCR4については、個体におけるその発現レベルが標準の遺 伝子発現レベルと比較して減少した場合、 CXCR1については、個体におけるその 発現レベルが標準の遺伝子発現レベルと比較して増加した場合、 CX3CR1につ ヽ ては、個体におけるその発現レベルが標準の遺伝子発現レベルと比較して減少した 場合、 CXCR4については、個体におけるその発現レベルが標準の遺伝子発現レべ ルと比較して減少した場合に、その個体はブドウ膜炎に罹患していると診断すること ができる。
[0017] CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイン 受容体の少なくとも 1種の遺伝子発現レベルを測定するとは、 4種のケモカイン受容 体 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4のうちの 1種、好ましくは 2種、より好ま しくは 3種、最も好ましくは 4種の遺伝子発現レベルを測定することを意味する。
[0018] 検出の対象となる個体の試料としては、ケモカイン受容体が発現されうる試料であ れば特に限定されないが、例えば、血液等の体液、ならびに白血球、リンパ球、単球 、活性化 T細胞、榭状細胞、好酸球、 NK細胞、好塩基球、 Th2細胞、 Tel細胞、 Tc 2細胞、成熟榭状細胞、ナイーブ T細胞、好中球等の細胞などが挙げられ、血液を使 用するのが好ましい。
[0019] ケモカイン受容体遺伝子の発現の増加または減少を、 mRNAレベルで測定する場 合は、当業界で公知の核酸の定量法、例えば核酸増幅 (例： PCR、 RT— PCR)、 R Nァーゼプロテクション、ノーザンブロッテイング、その他のハイブリダィゼーシヨン法 により測定することができる。ノーザン'ブロット分析は、 Haradaら、 Cell,
63:303-312(1990)に記載のように行うことができる。また、 S1マッピングは、 Fujitaら、 Cell, 49:357-367(1987)に記載のように行うことができる。
[0020] 本発明の診断方法の好ま 、実施態様では、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4のうちのいずれ力 1種をコードする核酸と特異的にハイブリダィズするプロ一 ブ核酸の少なくとも 1種を担体上に固定ィ匕し、該固定ィ匕プローブ核酸と、該個体由来 の mRNAを逆転写することにより得られる試料 cDNAとを接触させ、プローブ核酸と ハイブリッド形成する試料 cDNAを検出することによって、試料中の対応するケモカ イン受容体をコードする mRNAレベルを測定する。
[0021] 試料 cDNAは、当技術分野で公知の方法によって調製できる。例えば、試料から 単離された全 RNAを RTプライマーおよび適当なバッファーを含む反応混合物中に 添カロする。プライマーアニーリングのためのインキュベート後、 RTバッファー、 dNTP 、 DTT、 RNaseインヒビターおよび逆転写酵素をさらに添加する。 RNAの逆転写が 完了するようにインキュベーション後、 RT産物を標識ィ匕プライマーを用いる PCR反 応に付す。別法では、プライマーを標識せずに、標識ィ匕 dNTPを PCR反応混合物中 でインキュベートしてもよい。 PCR増幅は、従来の技術に従って、 DNAサーマルサイ クラ一中で行うことができる。
[0022] 標識としては、核酸に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例 えば、蛍光標識（Cy3および Cy5などの CyDye、 FITC、 RITC、ローダミン、テキサ スレッド、 TET、 TAMRA、 FAM、 HEX, ROXなど）、放射能標識（ α— 32P、 y - 32P、 35Sなど）などが挙げられる。
[0023] この試料 cDNAは、濃度が通常 0. 002〜50 μ Μ、好ましくは 0. 2〜0. 5 μ Μとな るようにスポッティング用バッファーに溶解することによって、スポッティング溶液として 調製する。このスポッティング溶液を、上記で調製したプローブ DNAが固定ィ匕された 担体上に滴下し、インキュベーションを行うことによりハイブリッド形成させる。ハイプリ ッド形成は、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、 Molecular Cloning 2nd ( J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従つ て行うことができる。
[0024] 本発明の一実施態様において、インキュベーションは、通常 25〜95°C、好ましくは 40〜65°Cで、通常 0. 01〜： L00時間、好ましくは 1〜16時間で行う。ハイブリダィゼ ーシヨン工程においても、高湿度雰囲気下でインキュベーションを行うのが好ましい。 最後に、担体を洗浄し、乾燥後、ノ、イブリツド形成した核酸に由来する標識を読みと ることによりハイブリッド形成を検出することができる。
[0025] 本発明はまた、ブドウ膜炎を診断するための、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか 1 種と特異的にハイブリダィズする核酸を含む試薬に関する。このような核酸は、ブドウ 膜炎を診断するためのプローブ核酸、例えば、上記の mRN Aレベルによって遺伝子 発現レベルを測定するためのプローブ核酸として有用である。以下、 CCR4、 CXCR 1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイン受容体をコードす る核酸のいずれか 1種と特異的にハイブリダィズする核酸をプローブ核酸と称する。
[0026] 特異的にハイブリダィズするとは、ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下で 、ケモカイン受容体をコードする核酸とハイブリダィズすることを意味する。ストリンジェ ントなハイブリダィゼーシヨン条件とは、例えば、ナトリウム濃度が 19〜40mM、好ま しくは 19〜20mMで、温度が 50〜70°C、好ましくは 60〜65°Cの条件を示す。特に 、ナトリウム濃度が 19mMで温度が 65°Cの場合が最も好ましい。
[0027] 本発明のプローブ核酸としては、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4のい ずれ力 1種をコードする核酸と相補的な塩基配列の少なくとも一部を含む、少なくとも 15塩基長、好ましくは 15〜： LOO塩基長の核酸が挙げられる。少なくとも一部とは、 C CR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4のいずれ力 1種をコードする核酸と相補的 な塩基配列力もなる核酸における、少なくとも 15塩基長、より好ましくは少なくとも 20 塩基長、最も好ましくは 30〜70塩基長の連続した塩基配列力もなる核酸部分を意 味する。ここで、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4のいずれ力 1種をコード する核酸には、 DNAおよび RNAの双方が含まれ、好ましくは cDNAである。プロ一 ブ核酸も同様に DNAおよび RNAの双方を含む力 好ましくは DNAである。
[0028] 本発明のプローブ核酸には、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4のいず れカ 1種をコードする核酸と相補的な塩基配列の少なくとも一部を含む上記プローブ 核酸と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好まし くは約 95%以上の相同性を有する塩基配列からなり、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1 および CXCR4をコードする核酸のうちの対応する核酸と特異的にハイブリダィズす る核酸も包含される。
[0029] ブドウ膜炎を診断するための、 CCR4をコードする核酸と特異的にハイブリダィズす る核酸は、好ましくは、以下の（a)または（b)の DNAである：
(a)配列番号 6で表される塩基配列力 なる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CCR4をコードする核酸と特異的にハイプリ ダイズする DNA。
[0030] ブドウ膜炎を診断するための、 CXCR1をコードする核酸と特異的にハイブリダィズ する核酸は、好ましくは、以下の（a)または（b)の DNAである：
(a)配列番号 12で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CXCR1をコードする核酸と特異的にハイブ リダィズする DNA。
[0031] ブドウ膜炎を診断するための、 CX3CR1をコードする核酸と特異的にノ、イブリダイ ズする核酸は、好ましくは、以下の（a)または（b)の DNAである：
(a)配列番号 15で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CX3CR1をコードする核酸と特異的にハイ ブリダィズする DNA。
[0032] ブドウ膜炎を診断するための、 CXCR4をコードする核酸と特異的にハイブリダィズ する核酸は、好ましくは、以下の（a)または（b)の DNAである：
(a)配列番号 17で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CXCR4をコードする核酸と特異的にハイブ リダィズする DNA。
[0033] 上記 (b)の DNAにおいて、少なくとも一部とは、それぞれ配列番号 6、 12、 15及び 17のいずれかで表される塩基配列において、少なくとも 15塩基長、より好ましくは少 なくとも 20塩基長、なおより好ましくは少なくとも 30塩基長、最も好ましくは 30〜60塩 基長の連続した塩基配列からなる核酸部分を意味する。
[0034] また、（b)の DNAは、通常 5〜1000塩基長、好ましくは 10〜 100塩基長、最も好 ましくは 30〜70塩基長の DNAである。
[0035] 本発明はまた、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択さ れるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか 1種と特異的にハイブリダィズす る上記プローブ核酸を少なくとも 1種含む 2000種以下の核酸が固定ィ匕された担体に 関する。当該核酸固定化担体は、本発明のブドウ膜炎の診断方法において、個体由 来の試料におけるケモカイン受容体の遺伝子発現レベルを測定するために有用で ある。 [0036] CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイン 受容体をコードする核酸のいずれか 1種と特異的にハイブリダィズする上記プローブ 核酸を少なくとも 1種含むとは、 4種のケモカイン受容体 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1 および CXCR4のいずれ力 1種をコードする核酸と特異的にハイブリダィズする 4種の プローブ核酸のうちの 1種、好ましくは 2種、より好ましくは 3種、最も好ましくは 4種を 含むことを意味する。本発明の担体においては、これらの 4種のプローブ核酸以外の 核酸がさらに固定ィ匕されていてもよいが、コスト上の理由力も担体上に固定ィ匕される 核酸は合計で 200種以下、好ましくは 100種以下とする。本発明の担体に固定ィ匕さ れるプローブ核酸は、好ましくは DNAである。
[0037] プローブ核酸の担体への固定化は、当技術分野で公知の方法によって行うことが できる。固定化するプローブ核酸力 DNAや PCR産物（cDNAを PCR法によって増 幅させた DNA断片）の場合には、これらを DNAチップ作製装置に備えられたスポッ ター装置を用いて、ポリ陽イオン (ポリリシン、ポリエチレンイミン等)で表面処理した担 体表面にスポッティングして、 DN Aの荷電を利用して担体上に静電結合させる方法 が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、 エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて 、る。この場合 には、アミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ 陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。
[0038] 固定ィ匕するプローブ核酸が合成オリゴヌクレオチドの場合には、反応活性基を導入 したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した担体表面に該オリゴヌクレオチドをス ポッテイダし、共有結合させることができる。例えば、アミノ基を導入したスライドガラス に、 PDC (p—フエ-レンジイソチオシァネート)存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチ ドを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチド を反応させる方法などがある。
[0039] プローブ核酸を固定ィ匕する担体としては、当技術分野で通常用いられるものを使 用できる。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン およびそれらの化合物などの貴金属、およびグラフアイト、カーボンファイバーに代表 される炭素などの導電体材料;単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケィ素、酸 化ケィ素、窒化ケィ素などに代表される半導体材料、 SOI (シリコン'オン'インシユレ ータ)などに代表されるこれら半導体材料の複合素材;ガラス、石英ガラス、アルミナ、 サファイア、セラミタス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料;ポリエチレン 、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリ エステル、含フッ素榭脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩ィ匕ビユリデン、ポリ酢酸ビュル、ポリ ビュルアルコール、ポリビュルァセタール、アクリル榭脂、ポリアクリロニトリル、ポリス チレン、ァセタール榭脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール榭脂、ユリア榭脂、 エポキシ榭脂、メラミン榭脂、スチレン'アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル 'ブ タジエンスチレン共重合体、ポリフエ-レンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機 材料等が挙げられる。
[0040] 本発明においては、プローブ核酸を固定ィ匕する担体として、基板上に核酸と共有 結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物 力 選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体である担体を用いるのが好 ましい。
[0041] 上記固体支持体に用いられる基板の材料としては、例えば、シリコーン、ガラス、繊 維、木材、紙、セラミックス、プラスチック (例えば、ポリエステル榭脂、ポリエチレン榭 脂、ポリプロピレン榭脂、 ABS榭脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene榭脂）、ナ ィロン、アクリル榭脂、フッ素榭脂、ポリカーボネート榭脂、ポリウレタン榭脂、メチルぺ ンテン樹脂、フエノール榭脂、メラミン榭脂、エポキシ榭脂、塩ィ匕ビニル榭脂)、合成 ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド (例えば、ダ ィャモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングス テン、モリブデン等の金属;前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記榭脂をバインダ 一として混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス 成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられる。
[0042] 本発明の固体支持体は、基板上に表面層を有する。この表面層により、核酸と共有 結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定ィ匕することができ る。
[0043] 表面層は、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる 少なくとも 1種カゝら形成される。ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化 物としては、例えば、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟 ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系 物質（例えば、グラフアイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの 混合物、又はそれらを積層させたもの、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭 化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコ二 ゥム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を挙げることができる
。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC : Diamond Like Carbon)等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド 構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。本発明においては、軟ダイ ャモンドを用いるのが好まし 、。
[0044] 基板が、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少 なくとも 1種の材料で形成されている場合は、基板上に新たに表面層を形成させる必 要はないが、基板がそれ以外の材料で形成されている場合は、表面処理を施すこと によりダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくと も 1種の材料で形成される表面層を形成させる。
[0045] 表面処理を施した基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した 基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス 0〜9
9体積％、残りメタンガス 100〜1体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法によ り作成したものであることが好ま 、。
表面処理によって形成される表面層の厚みは、 Inn！〜 100 μ mであることが好まし い。
[0046] 基板への表面処理は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマ CVD (Chemical Vapor Deposit)法、 ECRCVD (Electric Cyclotron Resonance Chemical Va por Deposit)法、 ICP (Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、 E CR (Electric Cyclotron Resonance)スノ ッタリング法、イオンプレーティング法、 アークイオンプレーティング法、 EB (Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、ィ オン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。 [0047] また、前記の基板材料の積層体や複合体 (例えば、ダイヤモンドと他の物質との複 合体 (例えば 2相体)）を形成することにより、表面層としてもよい。
[0048] 基板の形状及びサイズは特に限定されな!ヽが、形状としては、平板状、糸状、球状 、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は 、幅 0. 1~ 100mm,長さ 0. 1~ 100mm,厚み 0. 01〜： LOmm程度である。
[0049] また、基板の表面又は裏面に、反射層として Ti、 Au、 Pt、 Nb、 Cr、 TiC、 TiN等の 単層又はこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であること が必要なため、好ましくは lOnm以上、更に好ましくは lOOnm以上である。
[0050] 基板としてガラスを用いる場合、その表面は、 Ra (jIS B 0601)で lnm〜1000nm の範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の 表面積が増えて、多量のプローブ核酸を高密度で固定化できる点で好都合である。
[0051] 本発明の固体支持体には、核酸を静電的に引き寄せるために静電層が設けられて いてもよい。
[0052] 静電層としては、核酸を静電的に引き寄せ、核酸の固定ィ匕量を向上させるものであ れば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物 を用いて形成することができる。
[0053] 前記アミノ基含有ィ匕合物としては、非置換のアミノ基（一 NH )、又は炭素数 1〜6の
2
アルキル基等で一置換されたァミノ基（一 NHR;Rは置換基)を有する化合物、例え ばエチレンジァミン、へキサメチレンジァミン、 n—プロピルァミン、モノメチルァミン、 ジメチルァミン、モノェチルァミン、ジェチルァミン、ァリルァミン、アミノアゾベンゼン、 ァミノアルコール (例えば、エタノールァミン）、アタリノール、ァミノ安息香酸、アミノア ントラキノン、アミノ酸（グリシン、ァラニン、ノ リン、ロイシン、セリン、トレオ-ン、システ イン、メチォニン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グル タミン酸、ァスパラギン酸、グルタミン、ァスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン） 、ァ-リン、又はこれらの重合体 (例えば、ポリアリルァミン、ポリリシン)や共重合体; 4 , 4', 4"—トリアミノトリフエニルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレ シンなどのポリアミン（多価ァミン）が挙げられる。
[0054] 静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理する際 に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有す る炭素系皮膜を製膜する。また、静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合 には、静電層と表面層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非 置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させた後、核 酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物として は、気体として供給することができれば特に制限はな 、が、例えば常温で気体である メタン、ェタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオンィ匕蒸着法が好ましく
、イオン化蒸着法の条件としては、作動圧が 0. l〜50Pa、そして加速電圧が 200〜 1000Vの範囲であることが好まし!/、。
[0055] 静電層を表面層と共有結合させて形成する場合には、例えば、表面層を有する基 板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有ィ匕合 物のうち、例えば、ポリアリルァミン、ポリリシン、 4, 4', 4"—トリアミノトリフエ-ルメタン 、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミ ノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。
[0056] また、静電層が施された基板に核酸と共有結合しうる官能基を導入する反応 (例え ば、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で 行う場合には、基板を、前記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を 含有する溶液中に浸潰した後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好まし い。前記溶液の溶媒としては、例えば水、 N—メチルピロリドン、エタノールが挙げら れる。
[0057] 静電層が施された基板に、ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキシ ル基を導入する場合には、予め N—ヒドロキシスクシンイミド及び Z又はカルポジイミ ド類で活性化させたり、あるいは、反応を N—ヒドロキシスクシンイミド及び Z又はカル ポジイミド類の存在下に行うことが好まし 、。
[0058] 基板を、非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸 漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有ィ匕合物としてポリアリルアミ ンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸の固定ィ匕量がより向上する。静電層の厚 みは、 lnm〜500 mであることが好ましい。 [0059] 本発明の固体支持体は、核酸と共有結合しうる官能基を有する。該官能基は、基 板表面に化学修飾を施すことにより形成することができる。
[0060] 前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、 水酸基、硫酸基、シァノ基、ニトロ基、チオール基、ァミノ基が挙げられる。
[0061] 官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば 、式: X—I^— COOH (式中、 Xはハロゲン原子、 R1は炭素数 1〜12の 2価の炭化水 素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロ口酢酸、フルォロ酢酸、ブロモ 酢酸、ョード酢酸、 2 クロ口プロピ才ン酸、 3 クロ口プロピ才ン酸、 3 クロロアクリノレ 酸、 4—クロ口安息香酸;式: HOOC— R2— COOH (式中、 R2は単結合又は炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシユウ酸、マロ ン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリ メリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式: R3— CO—R4— COO H (式中、 R3は水素原子又は炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基、 R4は炭素数 1〜1 2の 2価の炭化水素基を表す。 )で示されるケト酸又はアルデヒド酸；式: X— OC— R5 COOH (式中、 Xはハロゲン原子、 R5は単結合又は炭素数 1〜12の 2価の炭化水 素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、 マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シユウ酸、無水マレイン酸、 無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
[0062] 前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドゃカルポジイミド (例えば 、 1— [3 (ジメチルァミノ)プロピル] 3 ェチルカルポジイミド)などの脱水縮合剤 と N—ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステルイ匕することができる。
[0063] 官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、 式: ー0じー1^6—じ0— (式中、 Xはハロゲン原子、 R6は単結合又は炭素数 1〜1 2の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジノ、ライド、例えばコハク 酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。
[0064] 官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式: HO —R7— COOH (式中、 R7は炭素数 1〜12の 2価の炭化水素基を表す。）で示される ヒドロキシ酸又はフエノール酸が挙げられる。 [0065] 官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸 が挙げられる。
[0066] 前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラ力 ルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。
[0067] 担体として上記のような固体支持体を用いることにより、プローブ核酸を強固に固定 化することができるため、検出感度と信頼性の高い診断が可能になる。
[0068] また、本発明の診断方法では、ケモカイン受容体遺伝子の発現レベルを測定する 方法として、個体カゝら得られた試料中のケモカイン受容体タンパク質のレベルを直接 測定する方法を使用することができる。試料におけるケモカイン受容体タンパク質レ ベルのアツセィは、いずれかの当該分野で周知の方法を用いて行うことができる。試 料におけるケモカイン受容体タンパク質レベルのアツセィについて好ましいものは、 抗体に基づく技術である。例えば、ケモカイン受容体タンパク質レベルを検出するの に有用な抗体に基づ ヽた方法としては、固相酵素免疫吸着アツセィ (ELISA)およ びラジオィムノアッセィ (RIA)などの免疫アツセィが挙げられる。例えば、ケモカイン 受容体タンパク質 特異的モノクローナル抗体は、免疫吸着剤としておよび酵素標 識プローブの両方として使用でき、ケモカイン受容体タンパク質を検出および定量で きる。 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4タンパク質のそれぞれ対する抗体 は、市販のものを使用してもよいし、当技術分野で公知の方法によって動物を免疫 することによって得ることができる。また、ブドウ膜炎発症の要因であるベーチェット病 では、タンパク質検出レベルにおいて、 CXCR2に変化が見られ、ベーチェット病患 者の CXCR2発現レベルは、健常者に於ける発現レベルに比較して強!、。
[0069] 従来のブドウ膜炎の診断においては、数週間から数ケ月という長期間を要したが、 本発明の診断方法では、数時間〜数日で診断を行うことができ、迅速な診断が可能 となる。
[0070] ブドウ膜炎患者においては、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4の発現レ ベルが変化していることが明ら力となったことから、ブドウ膜炎患者におけるこれらケ モカイン受容体の発現レベルの変化を抑制する化合物は、ブドウ膜炎を予防又は治 療する活性を有すると考えられる。従って、本発明はまた、被検化合物の存在下およ び不在下における、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択 されるケモカイン受容体の少なくとも 1種の遺伝子発現レベルを比較することにより、 ブドウ膜炎の予防または治療する化合物をスクリーニングする方法に関する。
[0071] ケモカイン受容体の発現レベルは、診断方法につ!、て既に記載したように、タンパ ク質レベルまたは mRNAレベルを検出することによって測定できる。本発明のスクリ 一二ング方法は、例えば、以下のように実施できる。
[0072] 正常またはブドウ膜炎モデル非ヒト哺乳動物に対して被検化合物を投与し、投与後 一定時間経過後（30分後〜 3日後、好ましくは 1時間後〜 2日後、より好ましくは 1時 間後〜 24時間後）、動物由来の試料、好ましくは血液中に含まれる CCR4、 CXCR1 、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイン受容体のいずれか 1 種をコードする mRNAの少なくとも 1種を測定する。
[0073] そして、被検化合物を投与した動物において、投与しない動物と比較して、 CCR4 発現レベルの増加、 CXCR1発現レベルの減少、 CX3CR1発現レベルの増力！]、 CX CR4発現レベルの増加の 1つ以上、好ましくはすべてが観察された場合に、その被 検化合物はブドウ膜炎を予防または治療する活性を有する化合物であると判別する ことができる。
実施例
[0074] (実施例 1 健常者におけるケモカイン受容体の発現）
3mm角のシリコン基板にダイヤモンドライクカーボン層をコ一ティングし、カルボキ シル基で修飾後、 N—ヒドロキシスクシンイミドで活性エステルイ匕し、固体支持体を作 製した。この固体支持体上に、マイクロアレイ用スポッター SPBIO2000 (日立ソフト） を使用して、ケモカイン受容体をコードする DNAの 60merの断片 25種類をプローブ DNAとしてスポットした。 20% PEG (ポリエチレングリコール）溶液に DNA断片を 10 IX Mの濃度で溶解し、スポッティング溶液とした。
[0075] スポッティング位置を図 1にそれぞれ番号で示す。各番号にスポッティングされた D NA断片を以下の表 1に示す。また、スポット番号 1〜25の配列は、それぞれ配列番 号 1〜25として、配列表に示す。
[0076] [表 1] P T/JP2005/008950
Figure imgf000019_0001
この基板を 80°Cのオーブンに 1時間入れた後に、室温の 2XSSCZ0. 2%SDS 溶液で 15分間洗浄を行った。その後、 95。Cに加熱した 2XSSCZ0. 2%SDS溶液 で 5分間洗浄した後に、超純水で数回洗浄して、圧縮空気を吹きかけることによって 基板を乾燥させた。
[0078] 次に、健常者の血液を 10ml採取し、白血球，リンパ球を遠心分離し、 mRNAを抽 出した。そして、逆転写酵素を用いて mRNAから cDNAに逆転写して精製を行った 。その後、 Cy 3で蛍光標識した。
[0079] 標識した cDNA試料をプローブ DNA固定化固体支持体に滴下し、 42°Cで 18時 間のハイブリダィゼーシヨンを行った。その後、 2 X SSCZ0. 2%SDS、 0. 2 X SSC /0. 2%SDS、0. 2 X SSCで順次洗浄した後、蛍光スキャナーで画像撮影した。結 果を図 2右側に示す。
[0080] (実施例 2 健常者とブドウ膜炎患者の比較）
ブドウ膜炎に罹患した患者の血液を 10ml採取し、白血球'リンパ球を遠心分離し、 mRNAを抽出した。そして、逆転写酵素を用いて mRNAカゝら cDNAに逆転写して 精製を行った後、 Cy3で蛍光標識し、実施例 1で使用したものと同じプローブ DNA 固定ィ匕固体支持体に滴下した。蛍光スキャナーで画像撮影した結果を図 2左側に示 す。
[0081] 図 2の左右の画像を比較すると、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4の 4 種のケモカイン受容体にぉ 、て、遺伝子発現レベルの変化が見られることがわかる。 CCR4については、ブドウ膜炎患者における発現レベルが健常者における発現レべ ルと比較して減少し、 CXCR1については、ブドウ膜炎患者における発現レベルが健 常者における発現レベルと比較して増加し、 CX3CR1については、ブドウ膜炎患者 における発現レベルが健常者における発現レベルと比較して減少し、 CXCR4につ V、ては、ブドウ膜炎患者における発現レベルが健常者における発現レベルと比較し て減少していることが明ら力となった。
産業上の利用可能性
[0082] 眼病であるブドウ膜炎の原因は多種多様であり、ウィルスや細菌など、様々な要因 が考えられるために診断が難しぐ適切な治療方法を提供することが困難な状況にあ る。現在、ブドウ膜炎の診断は、生体顕微鏡による直接観察を始めとする様々な眼科 的検査や全身検査を行い、長時間かけて経過を観察することによって行われている 本発明により、個体におけるブドウ膜炎を診断する方法であって、該個体由来の試 料における特定の群から選択されるケモカイン受容体の少なくとも 1種の遺伝子発現 レベルを測定することによって、診断が行われ、ブドウ膜炎を安価かつ迅速に診断す ることが可能になる。

Claims

請求の範囲
[1] 個体におけるブドウ膜炎を診断する方法であって、該個体由来の試料における、 c
CR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイン受容 体の少なくとも 1種の遺伝子発現レベルを測定することを含む、上記診断方法。
[2] CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からなる群から選択されるケモカイン 受容体をコードする mRNAの少なくとも 1種を測定することによって、ケモカイン受容 体の遺伝子発現レベルを測定する請求項 1に記載の方法。
[3] ブドウ膜炎を診断するための、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からな る群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか 1種と特異的にハ イブリダィズする 15〜： LOOO塩基長の核酸を含む試薬。
[4] ブドウ膜炎を診断するための、以下の（a)または (b)の DNAを含む試薬：
(a)配列番号 6で表される塩基配列力 なる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CCR4をコードする核酸と特異的にハイプリ ダイズする DNA。
[5] ブドウ膜炎を診断するための、以下の（a)または (b)の DNAを含む試薬：
(a)配列番号 12で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CXCR1をコードする核酸と特異的にハイブ リダィズする DNA。
[6] ブドウ膜炎を診断するための、以下の（a)または (b)の DNAを含む試薬：
(a)配列番号 15で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CX3CR1をコードする核酸と特異的にハイ ブリダィズする DNA。
[7] ブドウ膜炎を診断するための、以下の（a)または (b)の DNAを含む試薬：
(a)配列番号 17で表される塩基配列力もなる DNA
(b) (a)の DNAの少なくとも 1部を含み、 CXCR4をコードする核酸と特異的にハイブ リダィズする DNA。
[8] ブドウ膜炎を診断するための、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4からな る群から選択されるケモカイン受容体をコードする核酸のいずれか 1種と特異的にハ イブリダィズするプローブ核酸を少なくとも 1種含む 2000種以下の核酸が固定ィ匕さ れた担体。
[9] 担体が、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモ ンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支 持体である、請求項 8に記載の担体。
[10] 被検化合物の存在下および不在下における、 CCR4、 CXCR1、 CX3CR1および CXCR4力 なる群力 選択されるケモカイン受容体の少なくとも 1種の遺伝子発現レ ベルを比較することにより、ブドウ膜炎を予防または治療する化合物をスクリーニング する方法。
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADAMUS G ET AL: "Expression of CC chemokines and their receptors in the eye in autoimmune anterior uveitis associated with EAE.", INVEST OPHTHALMOL VIS SCI., vol. 42, no. 12, 2001, pages 2894 - 2903, XP009026619 *
KANEKO F. ET AL: "Behcet's Disease Kanja Masshoketsu Hakkekkyu ni okeru Chemokine Juyotai Hatsugen no Kan'yo ni Tsuite.", 2002, pages 60 - 63, XP002997646 *
KLITGAARD T.L.S. ET AL: "Chemokine receptors and early activation markers in acute anterior uveitis.", ACTA OPHTHALMOLOGICA SCANDINAVICA, vol. 82, no. 2, April 2004 (2004-04-01), pages 179 - 183, XP002997645 *

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