WO2005106023A1 - Verfahren und anordnung zur dna-amplifikation mittels pcr unter einsatz von trockenreagenzien - Google Patents

Verfahren und anordnung zur dna-amplifikation mittels pcr unter einsatz von trockenreagenzien Download PDF

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WO2005106023A1
WO2005106023A1 PCT/EP2005/051874 EP2005051874W WO2005106023A1 WO 2005106023 A1 WO2005106023 A1 WO 2005106023A1 EP 2005051874 W EP2005051874 W EP 2005051874W WO 2005106023 A1 WO2005106023 A1 WO 2005106023A1
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pcr
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dna
water
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PCT/EP2005/051874
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Walter Gumbrecht
Peter Paulicka
Manfred Stanzel
Original Assignee
Siemens Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention relates to a method for DNA amplification by PCR with thermocyclization of the substances containing the DNA, including the associated reagents.
  • the invention also relates to an associated arrangement for performing the method.
  • the DNA is bound to so-called magnetic beads for isolation.
  • the magnetic beads can be specifically transported with the DNA via external magnetic fields and enriched at the predetermined locations.
  • the isolated DNA can then be eluted from the beads or used together with the beads (as a DNA / bead complex) for PCR (polymerase chain reaction).
  • the isolated genomic DNA is added to a PCR reagent solution (polymerase, primer, nucleotides, buffers, auxiliary substances) and the entire batch is subjected to a thermal cyclization suitable for the PCR.
  • a PCR reagent solution polymerase, primer, nucleotides, buffers, auxiliary substances
  • a composition for PCR reagents is known from EP 0 572 057 A1, in which the reagents are covered with a meltable material in order to prevent undesired reactions. Furthermore, from the publication in "Nucleic Acids Research", Vol. 20, No. 7, Page 1717 to 1723, it is described in detail how incorrect reactions can be avoided before the actual PCR. In addition, ww. Ioexpress. Com So-called hot-start PCR is described, in which an elevated start temperature is assumed.
  • US 2002/0022261 A1 also describes a system for miniaturized genetic analysis and associated operating methods in which a cartridge with at least one input to a channel is used. Cell digestion for a subsequent PCR should take place in the channel. Relevant reagents are provided for the PCR.
  • the invention is based on WO 02/0072262 AI with the name "analysis device".
  • analysis device There is already the use tion of dry stored reagents stable at room temperature in microchannels or microcavities of a "chip card", which are brought into solution by adding water shortly before use.
  • the focus is on providing the dry reagents in pre-portioned form, so that a quantitative analysis means results after dissolution.
  • the present invention is concerned with PCR for subsequent analysis, for which a cell disruption with isolation of DNA, in particular from a whole blood sample, has to be carried out beforehand.
  • PCR reagents are pre-dosed in dried form, a defined dosage of liquid with regard to volume and composition must be ensured, since the quality and quantity of the PCR reaction depend crucially on these parameters. Flow of liquid through a channel coated with dry reagent without thorough mixing could lead to incorrect concentration of the reagents
  • Whole blood samples in particular can now be processed directly with a cell disruption. Especially if, for example, magnetic bead-bound DNA from a whole blood cell disruption is to be used for the PCR, it is necessary to remove PCR-inhibiting substances from the sample.
  • array arrangements can be used for the PCR reaction in the invention. This makes it possible to carry out tests for different DNA target sequences at the same time, which is associated with considerable time savings.
  • An arrangement according to the invention has the following features: at least one microchannel or microcavity is present.
  • the PCR reagent introduced in the microchannel or preferably in microcavity has the following properties: the dryable substances have negligible vapor pressure; - With substances that are stable at room temperature, the properties of being able to carry out a PCR are retained; the substance mixture adheres to microchannel or microcavity walls; - The mixture of substances forms a thin film; the substance mixture is covered with a water-insoluble medium, in particular a thin paraffin layer.
  • lysis properties for white blood cells and / or other cells are bacteria, viruses; Dryable substances with negligible vapor pressure are also used; - With the substances stable at room temperature, the cell disruption properties are retained; the mixture of substances adheres to microchannel or microcavity walls; the "lysis channel" opens into the PCR cavity.
  • FIG. 1 shows a top view of an analysis device
  • FIG. 2 to 5 each show a detail from FIG. 1 along the line II-II in longitudinal section to illustrate the PCR preparation, the individual sub-figures 2 to 5 each representing different functional steps,
  • FIG. 6 shows a plan view of an array arrangement for simultaneously performing a PCR on different DNAs
  • an analysis device which can be designed as a central or decentralized measuring device.
  • the analysis device is of the type of Chip card "Lab-on-a-Chip"), which contains all means for the treatment and evaluation of measurement samples.
  • the device consists of a card 1 which has inlets and outlets.
  • a card 1 which has inlets and outlets.
  • an inlet (port) 2 for introducing water
  • an inlet 3 (port) for introducing a measurement sample, for example blood.
  • 2 to 10 measurement samples on the one hand and solvents on the other hand are brought together via suitable fluidic devices and, after isolation of the DNA contained in the measurement sample, are fed to a PCR chamber 20.
  • the fluidic devices include in particular two reagent channels 4, 4 ⁇ and a flow channel 5 with outlet 6, a receiving channel 8 for waste and a further fluidic channel 9 designated a central mixing area in the flow channel 5 for sample preparation.
  • card 1 (“cartridge”) also contains a detection module 30 with associated connections for signal processing. Means for absorbing the residues are also available. An integration is thus ensured in which no substances hazardous to health can escape to the outside.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the measurement sample reaches the PCR cavity 20 via a flow channel 21 after cell disruption.
  • a PCR dry reagent 25 that is stable in storage and has runtime stability is stored in the PCR cavity 20.
  • storage-stable / long-term stable solid is understood to mean that the solid is stored in this connection for at least several months at room temperature while maintaining the property which effects the PCR.
  • the dry reagent 25 is water-soluble and must be used before the actual PCR reaction, i.e. at the stage of sample preparation and rinsing, before dissolving and denaturing e.g. are protected by the digestion reagents.
  • a non-water-soluble medium 26 is located on the dry reagent 25.
  • a paraffin layer can be used for this purpose.
  • valves 22, 22 ⁇ and a magnet 15 are indicated functionally in FIG. Their function is explained below in the further sub-steps of FIGS. 3 to 5:
  • the actual PCR reaction then begins.
  • the paraffin layer 26 is melted in accordance with FIG. 5 and separated into small beads 27, 27 ⁇ .
  • the PCR reagent 25 is dissolved in a suitable dosage in the solvent or in the buffer solution 24.
  • the concentrated DNA, bound to the magnetic bead 13, is then in the PCR cavity 20 as a suspension 28.
  • the PCR can now be carried out in a known manner with multiple passes through a thermal cyclization program.
  • the solid provided as a PCR reagent in FIGS. 2 to 5 is about selecting a substance with negligible vapor pressure that is stable in storage at room temperature.
  • the substance can be a mixture of substances. It is essential that it is long-term stable in a pre-dosed form. That over several months, its properties of being able to carry out the PCR reaction with it.
  • FIG. 6 shows an arrangement for carrying out the PCR as an array.
  • the chamber 200 has an inlet 205 and an outlet 206, which serve as an inflow and outflow for solvents.
  • the chamber 200 from FIG. 6 consists of a base body 210 with cavities 201ik distributed as an array, of which a line n is illustrated in FIG. It is still a lid 220 available, with which the individual PCR cavities 201 ik can be closed separately from each other.
  • the individual PCR cavities 201 ⁇ are filled in accordance with FIGS. 2 to 5.
  • FIGS. 7 to 9 shows a series of individual measurement cavities as a section. It is essential here that a first solid 250a, b, c, ... is introduced into the measurement cavities in accordance with a row, this solid being a dry reagent specific for a particular DNA.
  • a sealing medium 260 is located on the solids 250a, b, c,...
  • a DNA mixture 270 to be examined is supplied in solution or as a suspension via the inflow 205.
  • FIG. 8 shows that after the solvent has been supplied to the individual measuring cavities 201ik, the lid 220 is closed, so that the individual PCR cavities are now separated. If now thermal cycling with the lid closed acc. 9, different reagents specific to the amplification of a target DNA are located in the individual PCR cavities together with the sample DNA. Several PCR reactions can thus be carried out simultaneously and in parallel for a large number of DNA to be analyzed.
  • a PCR array according to FIG. 6 can be integrated into an analysis unit according to FIG. 1.
  • Each PCR cavity can additionally be equipped with a sensor device for the detection of the PCR product, for example with a noble metal electrode for electrical detection.
  • the electrodes can also be equipped with hybridization probes or with PCR primers. This results in improved application possibilities, such as, for example, the analysis of complex DNA mixtures which cannot be implemented with multiplex PCR in a single PCR tube.
  • substrates with DNA-binding properties for example DNA-binding magnetic beads
  • the lysis reagents and magnetic beads can be contained together in a single matrix
  • whole blood sample input port is available
  • - There are means for supplying water, for example an inflow port, for connection to an external water supply;
  • In the microchannel or microcavity with the dry buffer substances there is a defined ionic strength after water supply;
  • Means for mixing whole blood sample and water or buffer solution are available; there are means for flowing through the microchannel coated with lysis / bead reagent, or microcavity with blood, or blood / water, blood / buffer mixture;
  • - There are means for generating a magnetic field for fixing the DNA / magnetic bead complex in the PCR cavity;
  • means for closing the PCR cavity are available;
  • means for thermal cycling are available for the PCR;
  • the PCR cavity has means for at least partial pressure equalization.
  • the PCR reagent is precisely dosed during the manufacture of the cartridges; During operation, a precise amount and composition of the PCR reagent is obtained when filling or flowing through the PCR cavity. There are therefore no changes in the target reagent concentration, in particular dilution effects;
  • the volume of the PCR cavity is constant and known when filling; After the paraffin separating layer has melted, dry PCR reagent is combined with the solvent, in particular water or water with a low salt content, and a defined PCR reagent solution can be formed by convection; when combined with the binding of DNA to beads (bead technique), the DNA does not have to be eluted outside the PCR cavity.
  • solvent in particular water or water with a low salt content

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Abstract

Bei einem Verfahren zur DNA-Amplifikation durch PCR mit Thermozyklisierung das die zugehörigen Reagenzien enthält, wobei eine vollständige Integration aller Stoffe und Verfahrensschritte in einer geschlossenen, einmal verwendbaren Einheit (sog. Cartridge), in der die Reagenzien in einer bei Raumtemperatur lagerstabilen Form bevorratet sind, werden die wasserlöslichen Reagenzien durch ein nichtwasserlösliches Medium abgedeckt, die zu amplifizierenden DNA wird zugeführt und das nichtwasserlösliche Medium wird entfernt, so dass die wasserlöslichen Reagenzien gelöst werden, wodurch die PCR gestartet wird. Bei der zugehörigen Anordnung ist eine Probeneinheit, welche als Einmalprodukt (sog. Cartridge) vorhanden, wobei wenigstens ein Mikrokanal (5) bzw. Mikrokavität (20) zur Aufnahme eines PCR-Reagens vorhanden, in denen die PCR-Reagenzien als trockenbares Gemisch mit vernachlässigbarem Dampfdruck, das bei Raumtemperatur eine lagerstabile Substanz bildet, an den Wandungen des Mikrokanals (5) bzw. der Mikrokavität (20) haftet und einen dünnen Film (25) bildet, welcher mit einem nichtlöslichen Medium (26) abgedeckt ist.

Description

Beschreibung
Verfahren und Anordnung zur DNA-Amplifi ation mittels PCR unter Einsatz von Trockenreagenzien
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur DNA-Amplifikation durch PCR mit Thermozyklisierung der die DNA enthaltenden Substanzen einschließlich der zugehörigen Reagenzien. Daneben bezieht sich die Erfindung auch auf eine zugehörige Anordnung zur Durchführung des Verfahrens.
Zur Nukleinsäureanalytik z.B. von weißen Blutzellen aus Vollblut zur Beantwortung von humangenomischen Fragestellungen müssen zunächst in einem Probenvorbereitungsschritt die Zel- len aufgebrochen und anschließend die dabei freigesetzte DNA isoliert werden. Dabei müssen Blutbestandteile, wie z.B. Hämoglobin, Immunoglobuline und Laktoferrin, die eine nachfolgende PCR inhibieren könnten, entfernt werden.
Im Labor werden diese Arbeitsschritte nach hinlänglich bekanntem Stand der Technik durchgeführt. Insbesondere werden zur Isolierung die DNA an sog. Magnet-Beads gebunden. Über externe Magnetfelder können die Magnet-Beads mit der DNA gezielt befördert und an den vorbestimmten Stellen angereichert werden. Die isolierte DNA kann anschließend von den Beads eluiert werden oder zusammen mit den Beads (als DNA-/Bead- Komplex) für die PCR (Polymerase Chain Reaction) eingesetzt werden .
Gemäß dem Stand der Technik wird die isolierte genomische DNA einer PCR-Reagenz-Lösung (Polymerase, Primer, Nukleotide, Puffer, Hilfsstoffe) zugesetzt und der gesamte Ansatz einer für die PCR geeigneten Thermozyklisierung unterworfen.
Die Realisierung letzteren Verfahrens ist vom Vorhandensein von Laborgeräten wie PCR-Gerät (Thermocycler) , sog. Eppen- dorf-Reaktionsgefäße, Pipettier-Geräten, Kühlbehälter für Reagenzien abhängig und muss von geschultem Personal unter Ein- haltung von Sicherheitsvorschriften (Infektionsgefahr, Abfallentsorgung ...) durchgeführt werden. Mehrere volumetrische, genaue Dosierungen (Pipettieren) von Reagenzlösungen müssen durchgeführt werden. Zusätzlich sind diese Arbeitsschritte zeitaufwendig.
Aus der EP 0 572 057 AI ist eine Zusammensetzung für PCR- Reagenzien bekannt, bei dem die Reagenzien mit einem schmelzbaren Material bedeckt werden, um unerwünschte Reaktionen zu verhindern. Weiterhin ist aus der Veröffentlichung in „Nuc- leic Acids Research", Vol. 20, No. 7, Page 1717 bis 1723, im Einzelnen beschrieben, wie vor der eigentlichen PCR Fehlreaktionen vermieden werden können. Daneben ist in ww . ioexpress . com die so genannte Hot-Start-PCR beschrieben, bei der von einer erhöhten Starttemperatur ausgegangen wird.
Die oben beschriebenen Verfahren sind im Prinzip für eine Laboranalyse geeignet. Aus der US 2002/0022261 AI wird daneben ein System zur miniaturisierten genetischen Analyse und zuge- hörige Betriebsverfahren beschrieben, bei denen eine Cartridge mit wenigstens einem Eingang zu einem Kanal verwendet wird. Dabei soll in dem Kanal ein Zellaufschluss für eine anschließende PCR erfolgen. Für die PCR werden diesbezügliche Reagenzien bereitgestellt.
Von letzterem Stand der Technik ausgehend ist es Aufgabe der Erfindung, die PCR-Reaktion in einer integrierten miniaturisierten Cartridge zu realisieren und dafür eine geeignete Anordnung zu schaffen.
Die Aufgabe ist bei einem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß durch die Maßnahmen des Patentanspruches 1 gelöst. Eine zugehörige Anordnung ist im Patentanspruch 9 angegeben. Weiterbildungen des Verfahrens und der Anordnung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Die Erfindung geht von der WO 02/0072262 AI mit der Bezeichnung "Analyseeinrichtung" aus. Dort wird bereits die Verwen- dung von trockengelagerten, bei Raumtemperatur stabile Reagenzien in Mikrokanälen bzw. Mikrokavitäten einer "Chipkarte" beschrieben, die durch Zuführen von Wasser, kurz vor Verwendung, in Lösung gebracht werden. Dabei wird bei diesem Stand der Technik darauf abgestellt, die Trockenreagenzien vorportioniert bereitzustellen, so dass sich nach Auflösung ein quantitatives Analysemittel ergibt. Demgegenüber geht es bei vorliegender Erfindung um die PCR zwecks nachfolgender Analyse, wofür vorher ein Zellaufschluss mit Isolierung von DNA insbesondere aus einer Vollblut-Probe durchgeführt werden muss .
Mit der Erfindung werden folgende Vorteile im Vergleich zur Labormethode erzielt: - Es erfolgt eine vollständige Integration aller Stoffe und Verfahren in einer geschlossenen einmal verwendbaren Cartridge; die Bevorratung der Reagenzien erfolgt in einer bei Raumtemperatur lagerstabilen Form; - es sind keine manuellen Arbeitsschritte notwendig, außer Injektion der zu amplifizierenden DNA bzw. der Blutprobe bei Integration von Zellaufschluss und PCR; es erfolgt kein direkter Kontakt mit gesundheitsgefährden- den Stoffen, indem Blut, Reagenzien und Reagenzien-Abfall in der Cartridge verbleiben; eine kompakte Cartridge-Geometrie erlaubt eine effiziente und schnelle Thermozyklisierung; die Cartridge ist kostengünstig herzustellen.
Werden PCR-Reagenzien in getrockneter Form vordosiert, so ist auf eine definierte Dosierung von Flüssigkeit hinsichtlich Volumen und Zusammensetzung zu achten, da die Qualität und Quantität der PCR-Reaktion entscheidend von diesen Parametern abhängt. Das Durchströmen von Flüssigkeit durch einen mit Trockenreagenz beschichteten Kanal ohne gründliche Durchmischung könnte zu einer falschen Konzentration der Reagenzien führen Bei der Erfindung ist es in vorteilhafter Weise möglich, bei in biologischen Behältnissen, beispielsweise Zellen, gebundener DNA vor der PCR-Reaktion einen Aufschluss des Behältnisses mit Isolierung der DNA vorzunehmen. Mit einem Zellauf- schluss können nunmehr insbesondere Vollblut-Proben direkt verarbeitet werden. Insbesondere dann wenn z.B. Magnet-Bead gebundene DNA aus einem Vollblut-Zellaufschluss für die PCR eingesetzt werden soll ist es erforderlich PCR inhibierende Stoffe aus der Probe zu entfernen. Dies kann besonders vor- teilhaft durch Fixierung der Magnet-Beads in der PCR-Kammer durch ein Magnetfeld und Waschen der Beads erreicht werden. Bei Verwendung von Trocken-PCR-Reagenzien müssen Mittel vorhanden sein, die ein Auflösen dieser Reagenzien beim Waschvorgang verhindern. Dies wird erfindungsgemäß durch Einfüh- rung einer Schutzschicht wie z.B. Paraffin gelöst.
In eigenerfinderischer Weiterbildung können bei der Erfindung zur PCR-Reaktion Array-Anordnungen eingesetzt werden. Damit wird ermöglicht, gleichzeitig Untersuchungen auf verschiedene DNA-Zielsequenzen vorzunehmen, womit eine erhebliche Zeitersparnis verbunden ist.
Eine erfindungsgemäße Anordnung weist folgende Merkmale auf: Es ist mindestens ein Mikrokanal bzw. Mikrokavitat vorhan- den.
Das im Mikrokanal bzw. vorzugsweise in Mikrokavitat eingebrachte PCR-Reagenz hat folgende Eigenschaften: Die trockenbaren Substanzen haben vernachlässigbaren Dampfdruck; - bei den bei Raumtemperatur lagerstabilen Substanzen bleibt die Eigenschaften eine PCR damit ausführen zu können erhalten; das Substanzgemisch haftet an Mikrokanal- bzw. Mikrokavitat-Wandungen; - das Substanzgemisch bildet einen dünnen Film; das Substanzgemisch ist mit einem nicht wasserlöslichen Medium, insbesondere einer dünnen Paraffin-Schicht, wasserdicht abgedeckt . Speziell bei einer Kombination mit einem Zellaufschluss aus Vollblut ergeben sich für das in die Mikrokavitat bzw. vorzugsweise im Mikrokanal eingebrachte Lyse-Reagenz folgende Eigenschaften: Es liegen Lyseeigenschaften für weiße Blutzellen und/oder andere Zellen Bakterien Viren vor; Es werden ebenfalls trockenbare Substanzen mit vernachlässigbarem Dampfdruck verwendet; - bei den bei Raumtemperatur stabilen Substanzen bleiben die Zeilaufschlusseigenschaften erhalten; das Substanzgemisch haftet an Mikrokanal-, bzw. Mikrokavi- tät-Wandungen; der "Lysekanal" mündet in der PCR-Kavität.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen.
Es zeigen:
Figur 1 eine Draufsicht auf eine Analyseeinrichtung,
Figur 2 bis Figur 5 jeweils im Längsschnitt einen Ausschnitt aus Figur 1 längs der Linie II - II zur Verdeut- lichung der PCR-Vorbereitung, wobei die einzelnen Teilfiguren 2 bis 5 jeweils unterschiedliche Funktionsschritte darstellen,
Figur 6 eine Draufsicht auf eine Array-Anordnung zur gleichzeitigen Durchführung einer PCR auf unter- schiedliche DNA' s und
Figur 7 bis Figur 9 jeweils einen Längsschnitt durch Figur 6 längs der Linie VII - VII in drei verschiedenen Funktionsschritten .
In Figur 1 ist eine Analyseeinrichtung dargestellt, die als zentrale oder dezentrale Messeinrichtung ausgebildet sein kann. Insbesondere ist die Analyseeinrichtung nach Art einer Chipkarte "Lab-on-a-Chip") ausgebildet, die alle Mittel zur Behandlung und Auswertung von Messproben beinhaltet.
Beispielsweise besteht die Einrichtung aus einer Karte 1, welche Ein- und Auslässe aufweist. Insbesondere sind ein Ein- lass (Port) 2 zum Einbringen von Wasser und ein Einlass 3 (Port) zum Einbringen einer Messprobe, beispielsweise Blut, vorhanden. Dabei ist wesentlich, dass über geeignete Fluidik- Einrichtungen 2 bis 10 Messproben einerseits und Lösungsmit- tel andererseits zusammengeführt und nach Isolierung der in der Messprobe enthaltenen DNA letztere einer PCR-Kammer 20 zugeführt werden.
Die Fluidik-Einrichtungen beinhalten im Einzelnen neben den bereits erwähnten Wasser- und Probenports 2, 3 zwei Reagenz- Kanäle 4, 4Λ sowie einen Strömungskanal 5 mit Auslass 6, einen Aufnahmekanal 8 für Abfall und einem weiteren Fluidik- Kanal 9. Mit 10 ist ein zentraler Mischbereich im Strömungskanal 5 für die Probenaufbereitung bezeichnet.
Neben den Mitteln zur PCR enthält die Karte 1 ("Cartridge") weiterhin ein Detektionsmodul 30 mit zugehörigen Anschlüssen für eine Signalverarbeitung. Ferner sind Mittel zur Aufnahme der Rückstände vorhanden. Es wird somit eine Integration ge- währleistet, bei dem keine gesundheitsgefährdenden Substanzen nach außen gelangen können.
Der Aufschluss einer Vollblutprobe wird im Einzelnen anhand der parallelen Patentanmeldung der Anmelderin mit gleicher Anmeldepriorität mit der Bezeichnung "Verfahren und Anordnung zur DNA-Isolierung mit Trockenreagenzien" beschrieben. Anhand der Figuren 2 bis 5 wird verdeutlicht, wie im Einzelnen die Vorbereitungen für eine DNA-Amplifikation durchgeführt werden:
Es ist eine Kavität 20 vorhanden, in der eine PCR-Reaktion stattfindet. Die PCR (Polymerase Chain Reaction) -Amplifikation ist vom Stand der Technik hinreichend bekannt . Im" Einzelnen erfolgt dabei eine Thermozyklierung nach einem vorgegebenen Temperaturprogramm.
In Figur 2 gelangt die Messprobe nach dem Zellaufschluss über einen Strömungskanal 21 in die PCR-Kavität 20. In der PCR- Kavität 20 ist ein lagerstabiles und laufzeitstabiles PCR- Trockenreagenz 25 gelagert. Unter lagerstabil/langzeitstabi- lem Feststoff ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass der Feststoff in diesem Zusammenhang mindestens mehrere Mona- te bei Raumtemperatur gelagert wird unter Erhaltung der die PCR bewirkende Eigenschaft.
Das Trockenreagenz 25 ist wasserlöslich und muss vor der eigentlichen PCR-Reaktion, d.h. im Stadium der Probenaufberei- tung und Spülung, vor dem Auflösen und der Denaturierung z.B. durch die AufSchlussreagenzien geschützt werden. Dazu befindet sich auf dem Trockenreagenz 25 ein nicht wasserlösliches Medium 26. Es kann für diesen Zweck insbesondere eine Paraffinschicht verwendet werden.
Das Trennen von zwei Flüssigkeiten mit Hilfe einer erstarrten Paraffin-Trennschicht, mit dem Ziel durch Aufschmelzen des Paraffins die beiden Flüssigkeiten zu vereinigen, ist zwar bereits bekannt. Es wird insbesondere angewandt bei der sog. klassischen "Hot-Start"-PCR. Im vorliegenden Fall wird jedoch keine Flüssigkeit, sondern ein Feststoff mit Paraffin beschichtet .
Weiterhin sind in Figur 2 Ventile 22, 22 Λ und ein Magnet 15 funktionsmäßig angedeutet. Deren Funktion wird nachfolgend bei den weiteren Teilschritten der Figuren 3 bis 5 erläutert :
Aus Figur 3 ist ersichtlich, dass bei geöffneten Ventilen 22, 22 Λ die Messlösung mit den über die Magnet-Beads 12 gebunde- nen DNA in die Messkavitat 20 gelangen. Die DNA konzentriert sich dabei über die Magnetwirkung an den diesbezüglichen Magnetpol. In diesem Stadium kann zunächst ein Spülvorgang er- folgen, wobei nach dem Spülen die Ventile 22, 22 Λ geschlossen werden.
In der entsprechend Figur 4 abgeschlossenen PCR-Kavität 20 befinden sich nunmehr das Reagenz 25, die Abdeckschicht 26 und die wässrige Lösung 24 mit den aufkonzentrierten DNA. Anschließend beginnt die eigentliche PCR-Reaktion. Beim ersten Erwärmen entsprechend der PCR-Thermozyklierung wird gemäß Figur 5 die Paraffinschicht 26 aufgeschmolzen und in kleinen Kügelchen 27, 27 Λ separiert. Das PCR-Reagenz 25 wird dagegen in geeigneter Dosierung im Lösungsmittel bzw. in der Pufferlösung 24 gelöst. In der PCR-Kavität 20 befindet sich dann die aufkonzentrierte, an die Magnet-Bead 13 gebundene DNA als Suspension 28. Nunmehr kann in bekannter Weise die PCR mit mehrfachem Durchlaufen eines Thermozyklisierungsprogrammes durchgeführt werden .
Bei dem in den Figuren 2 bis 5 als PCR-Reagenz vorgesehenen Feststoff geht es darum, eine Substanz mit vernachlässigbarem Dampfdruck auszuwählen, die bei Raumtemperatur lagerstabil ist. Die Substanz kann ein Stoffgemisch sein. Wesentlich ist, dass sie in vordosierter Form langzeitstabil ist. D.h. über mehrere Monate, ihre Eigenschaften die PCR-Reaktion damit ausführen zu können beibehält.
In der Figur 6 ist eine Anordnung zur Durchführung der PCR als Array ausgebildet. Dies bedeutet, dass statt einer einzigen PCR-Kavität, beispielsweise die Kavität 20 in den Figuren 1 bis 5, nunmehr in einem abgeschlossenen Volumen 200 einzel- ne PCR-Kavitäten 201ik vorhanden sind, wobei für die Indices gilt: i = 1 bis m und k = 1 bis n. Die Kammer 200 hat einen Einlass 205 und einen Auslass 206, welcher als Zufluss bzw. Abfluss für Lösungsmittel dienen.
Die Kammer 200 aus Figur 6 besteht aus einem Grundkörper 210 mit als Array verteilten Kavitäten 201ik, von dem in Figur 7 eine Zeile n verdeutlicht ist. Es ist weiterhin ein Deckel 220 vorhanden, mit dem die einzelnen PCR-Kavitäten 201ik jeweils voneinander getrennt abgeschlossen werden können.
Die einzelnen PCR-Kavitäten 201^ werden im Prinzip entspre- chend den Figuren 2 bis 5 befüllt. Dies wird aus den Figuren 7 bis 9 deutlich, die als Schnitt eine Reihe einzelner Mess- kavitäten wiedergibt. Wesentlich ist hier, dass in den Mess- kavitäten entsprechend einer Zeile ein erster Feststoff 250a, b, c, ... eingebracht ist, wobei dieser Feststoff als Tro- ckenreagenz jeweils spezifisch für eine bestimmte DNA ist.
Auf den Feststoffen 250a, b, c, ... befindet sich ein abdichtendes Medium 260. Über den Zufluss 205 wird ein zu untersuchendes DNA-Gemisch 270 in Lösung oder als Suspension zugeführt .
In der Figur 8 ist gezeigt, dass nach dem Zuführen des Lösungsmittels zu den einzelnen Messkavitäten 201ik der Deckel 220 geschlossen wird, so dass nunmehr die einzelnen PCR-Kavitäten separiert sind. Wenn nunmehr eine Thermozyklisierung bei geschlossenem Deckel gem. Fig. 9 durchgeführt wird, befinden sich in den einzelnen PCR-Kavitäten jeweils unterschiedliche, für die Amplifikation einer Ziel-DNA spezifische Reagenzien zusammen mit der Proben-DNA. Es können somit gleichzeitig und parallel mehrere PCR-Reaktionen für eine Vielzahl von zu analysierender DNA durchgeführt werden.
Ein PCR-Array entsprechend der Figur 6 kann in eine Analysen- einheit entsprechend Figur 1 integriert werden. Jede PCR- Kavität kann zusätzlich mit einer Sensor-Einrichtung zur De- tektion des PCR-Produkts, z.B. mit einer Edelmetallelektrode zur elektrischen Detektion ausgestattet sein. Die Elektroden können außerdem mit Hybridisierungs-Sonden oder auch mit PCR- Primern ausgestattet sein. Es ergeben sich somit verbesserte Anwendungsmöglichkeiten, wie z.B. die Analyse von komplexen DNA-Gemischen, die mit Multiplex-PCR in einem einzigen PCR- Gefäß nicht realisierbar sind. Bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren und der zugehörigen Anordnungen sind folgende Maßnahmen bzw. Merkmale wesentlich: im Mikrokanal bzw. Mikrokavitat sind Substrate mit DNA- bindenden Eigenschaften eingebracht, z.B. DNA-bindende Magnet-Beads; die Lyse-Reagenzien und Magnet-Beads können zusammen in einer einzigen Matrix enthalten sein; es ist Eingabe-Port für Vollblut-Probe vorhanden; - es sind Mittel zur Zufuhr von Wasser, z.B. ein Zufluss- Port, zum Anschluss an externe Wasserzufuhr vorhanden; im Mikrokanal bzw. Mikrokavitat mit den trockenen Puffersubstanzen herrscht nach Wasserzufuhr definierte Ionenstärke; - es sind Mittel zum Mischen von Vollblutprobe und Wasser bzw. Puffer-Lösung vorhanden; es sind Mittel zum Durchströmen des mit Lyse/Bead-Reagenz beschichteten Mikrokanals, bzw. Mikrokavitat mit Blut, bzw. Blut/Wasser-, Blut/Puffer-Gemisches vorhanden; - es sind Mittel zum Generieren eines Magnetfeldes zum Fixieren des DNA/Magnet-Bead-Komplexes in der PCR-Kavität vorhanden; es sind Mittel zum Verschließen der PCR-Kavität vorhanden; für die PCR sind Mittel zur Thermozyklisierung vorhanden; - die PCR-Kavität hat Mittel zum mindestens partiellen Druckausgleich.
Wesentliche Vorteile der Anordnung und des Verfahrens sind: es erfolgt bereits bei Herstellung der Cartridges eine präzise Dosierung des PCR-Reagenz; im Betrieb wird eine präzise Menge und Zusammensetzung des PCR-Reagenz beim Befüllen, bzw. Durchströmen der PCR- Kavität erhalten. Somit liegen keine Veränderungen der Reagenzien-Soll-Konzentration insbesondere Verdünnungs- Effekte vor;
- das Volumen der PCR-Kavität ist beim Befüllen konstant und bekannt; nach Aufschmelzen der Paraffin-Trennschicht wird trockenes PCR-Reagenz mit dem Lösungsmittel, insbes. Wasser oder Wasser mit niedrigem Salzgehalt, vereinigt und es kann durch Konvektion eine definierte PCR-Reagenzlösung entste- hen; bei Kombination mit der Bindung von DNA an Beads (Bead- Technik) muss die DNA nicht extra außerhalb der PCR- Kavität eluiert werden.
Somit ist gewährleistet, dass der gesamte Analysevorgang einschließlich der Probenbereitstellung im abgeschlossenen System, das eine Einmal-Cartridge bildet, erfolgt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur DNA-Amplifikation durch PCR mit Thermozyklisierung der die DNA enthaltenden Substanzen einschließlich der zugehörigen Reagenzien, mit folgenden Maßnahmen:
- Es erfolgt eine vollständige Integration aller Stoffe und Verfahrensschritte in einer geschlossenen Analyseneinheit mit einer einmal verwendbaren Cartridge mit Mikrokanälen oder Mikrokavitäten, in denen zumindest die für die PCR er- forderlichen Reagenzien in einer bei Raumtemperatur lagerstabilen Form bevorratet sind, wobei zunächst die wasserlöslichen Reagenzien durch ein nichtwasserlösliches Medium abgedeckt werden und die zu amplifizierende DNA in einem wässrigen Lösungsmit- tel zugeführt wird, anschließend wird die abdeckende Wirkung des nicht wasserlöslichen Mediums aufgehoben, wodurch die wasserlöslichen Reagenzien im wässrigen Lösungsmittel gelöst werden, - wonach die PCR-Thermozyklisierungsreaktionen gestartet werden .
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Reagenzien für die PCR wasserfreie, über mehrere Monate bei Raumtemperatur lagerbare Substanzen verwendet werden, die nach Wasserzufuhr die Durchführung einer PCR ermöglichen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei in biologischen Behältnissen gebundener DNA, beispiels- weise einer Vollblutprobe, eine Integration des Aufschlusses der Behältnisse, beispielsweise des Zellaufschlusses von weißen Blutzellen, mit der PCR erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Analyseneinheit (Cartridge) mit solcher Geometrie verwendet wird, die eine effiziente und schnelle Thermozyklisierung ermöglicht .
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Analyseneinheit zur Ausführung der Reaktionen ein Einmalprodukt verwendet wird, das in Massenfertigung klein und kostengünstig herzustellen ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Reaktionen in einer Array-Anord- nung mit gegebenenfalls verschiedenen Primern parallel für unterschiedliche DNA-Amplifikationen durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass für die unterschiedlichen DNA-Amplifikationen unterschiedliche zusammengesetzte PCR-Reagenzien verwendet werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Array mit einer DNA-Probe befüllt wird, der Deckel (210) die PCR-Kavitäten (250j_k) abschließt und voneinander flui- disch isoliert, die Paraffinschichten (260) aufgeschmolzen werden und individuelle DNA-Amplifikationen parallel durchge- führt werden.
9. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 8, mit einer Analyseneinheit, welche als einmal verwendbare Cartridge ausgeführt ist, wobei wenigstens ein Mikrokanal (5) und/oder Mikrokavitat (20) zur Aufnahme eines PCR-Reagens vorhanden ist, worin die PCR-Reagenzien als Gemisch, das bei Raumtemperatur eine stabile Substanz bildet, eingebracht sind , und mit einer Schicht (26) eines wasserunlöslichen Mediums abgedeckt sind.
10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch ein wasserfreier Feststoff ist.
11. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Feststoff (25) an den Wandungen des Mikrokanals (5) bzw. der Mikrokavitat (20) haftet.
12. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mittels eines ■ Filmbildners ein PCR-Reagenz-Film gebildet ist.
13. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserunlösliche Medium Paraffin ist.
14. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Paraffin zur Freigabe der PCR-Reagenzien einen definierter Schmelzpunkt hat .
15. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung eines Zellaufschlusses in der Mikrokavitat (20) bzw. im Mikrokanal (5) weiterhin ein Lyse-Reagenz vorhanden ist, welches spezifische Eigenschaften z.B. für weiße Blutzellen.
16. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Lyse-Reagenz aus trockenbaren Substanzen mit vernachlässigbarem Dampfdruck besteht, die bei Raumtemperatur lagerst - bil sind und das Lyse-Reagenz an den Wandungen des der PCR- Kavität (20) vorgeschalteten Mikrokanals (5) haftet, wobei der Kanal (5) für die Lyse-Substanz in die PCR-Kavität (20) mündet .
17. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Mikrokanal (5) bzw. in der Mikrokavitat (20) Substrate vorhanden sind, die DNA bindende Eigenschaften haben .
18. Anordnung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrate DNA-bindende so genannte Magnet-Beads sind.
19. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse-Reagenzien und die Magnet-Beads in einer gemeinsamen Trockenmatrix enthalten sind.
20. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Eingabeport (2) für Vollblut-Proben vorhanden ist .
21. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Zufuhr von Wasser vorhanden sind.
22. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 21, dadurch ge- kennzeichnet, dass Mittel zum Mischen von Blutblutprobe und
Wasser, bzw. einer Pufferlösung, vorhanden sind.
23. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Durchströmen des mit Lyse- /Bead-Reagenz beschichteten Mikrokanals (5) bzw. Mikrokavitat (20) mit Blut, Blut/Wasser- oder Blut/Puffer-Gemische vorhanden sind.
24. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 23, dadurch ge- kennzeichnet, dass Mittel (25) zum Generieren eines Magnetfeldes zwecks Fixieren eines DNA-Magnet-Bead-Komplexes in der PCR-Kavität (20) vorhanden sind.
25. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 24, dadurch ge- kennzeichnet, dass Mittel zur Thermozyklisierung vorhanden sind.
26. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum zumindest eines partiellen Druckausgleiches in der PCR-Kavität vorhanden sind.
27. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein Array von PCR-Kavitäten (210ik) vorhanden ist .
28. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass in den PCR-Kavitäten (250χk) unterschiedliche PCR-Reagenzien (251a, b, ...) bevorratet sind.
29. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Deckel (210) zum Abschluss der PCR- Kavitäten (250Xk) während der PCR vorhanden ist
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