WO2005100566A1 - 新規サルｇｐｒ１０３及びサルｑｒｆｐ並びにｇｐｒ１０３を用いた化合物の評価方法 - Google Patents

新規サルｇｐｒ１０３及びサルｑｒｆｐ並びにｇｐｒ１０３を用いた化合物の評価方法 Download PDF

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WO2005100566A1
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gpr103
protein
seq
gene
nucleic acid
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PCT/JP2005/007174
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Hideki Sano
Hisashi Iwaasa
Satoshi Mashiko
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Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH

Definitions

  • the present invention relates to a novel monkey and rat GPR103 gene and protein, and to a method for evaluating a conjugate using the gene or protein.
  • the present invention also relates to the ligand protein of GPR103.
  • G protein guanosine triphosphate binding protein
  • GPR103 (also referred to as SP9155 or AQ27) is a type of G protein-coupled receptor.
  • ESTs and genomic DNAs are determined based on the amino acid sequences of various G protein-coupled receptors.
  • the amino acid sequence of human GPR103 protein is also disclosed in Patent Document 1.
  • mouse GPR103 is disclosed in Patent Documents 2 and 3.
  • GPR103 is disclosed in Patent Document 3.
  • GPR103 has high homology to orexin, neuropeptide FF, and cholecystokinin receptor, and is expected to have a similar function to these molecules. The function was unknown. .
  • Ying Jiang et al. Later discovered a peptide that functions as a ligand (Non-patent Document 2, Patent Document 4), and was involved in the induction of aldosterone (Aldosterone) secretion on the glandular zone of the rat adrenal gland. (Non-Patent Document 3).
  • candidate compounds for development are evaluated for their physiological effects in rodents and primates. This is because candidate compounds may show different efficacy in different animal species, and evaluation in primates closer to humans will contribute to the efficient development of less toxic therapeutics and diagnostics. .
  • Patent Document l WO0011015
  • Patent document 2 WO2002042458
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-000113
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-136981
  • Non-patent literature l Gene, 275, 83 (2001)
  • Non-Patent Document 2 Journal of biological chemistry, 278, 27652 (2003)
  • Non-Patent Document 3 Journal of biological chemistry, 278, 46387 (2003) Disclosure of the Invention
  • the GPR103 gene of non-human primates has not been isolated yet, and it has not been possible to evaluate therapeutic or diagnostic agents using such a gene.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the related art, and has as its object to provide a GPR103 gene and protein of a primate other than a human. Another object is to provide a method for evaluating a compound using the gene or protein. It is also an object of the present invention to provide a novel ligand with high utility value for functional analysis of GPR103 gene and protein and evaluation of the compound.
  • the nucleic acid of the present invention is characterized by including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • “including the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 3” means that the base sequence is modified with a linker sequence with a vector or a gene such as a restriction enzyme cleavage site usable for gene recombination.
  • An additional base sequence, such as a sequence required for the above, is added.
  • nucleic acid of the present invention is characterized in that it also has the nucleotide sequence strength described in SEQ ID NO: 1 or 3.
  • nucleic acid of the present invention is characterized in that it encodes the protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • nucleic acid of the present invention as described above makes it possible to obtain information on GPR103 genes and proteins of non-human primates and rats and their sequences. It is possible to build a model system.
  • the gene of the present invention is also characterized in that it has a nucleic acid ability to hybridize under stringent conditions to a nucleic acid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a gene having high homology to the monkey GPR103 gene can be detected.
  • the gene of the present invention is characterized in that it has a nucleic acid ability to hybridize with a nucleic acid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 under stringent conditions. By using such a gene, it is possible to detect and isolate a gene having high homology to the rat GPR103 gene.
  • the present invention also includes an expression vector containing the above-described nucleic acid or gene. By using such a vector, manipulation at the gene level of GPR103, expression of a recombinant protein, and the like can be performed. [0020]
  • the present invention further includes a host cell containing the expression vector. By using such host cells, research at the cellular level, such as evaluation of ligands such as compounds and peptides, becomes possible.
  • the protein of the present invention is characterized by including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • “comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4" refers to the amino acid sequence such as a reporter protein and other necessary amino acid sequences usable for detection and evaluation of the protein. Means that additional amino acid sequences are combined.
  • the protein of the present invention is characterized by comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the protein of the present invention contains an amino acid sequence having substitution, deletion, addition or insertion of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, and has an activity of GPR103 protein. It is characterized by having.
  • the protein of the present invention as described above makes it possible to obtain information on the GPR103 gene and protein of non-human primates and rats and their sequences, and is mainly a target of human medicine.
  • GPR103 model system can be constructed.
  • the present invention further includes antibodies against the above-mentioned proteins.
  • an antibody By using such an antibody, it becomes possible to cause an antigen-antibody reaction of the GPR103 protein, and it becomes possible to detect the protein, make a diagnosis targeting the GPR103 protein, and the like.
  • the method for evaluating a compound of the present invention includes the steps of: introducing a GPR103 gene and preparing a cell that expresses a GPR103 protein; contacting the cell with a test compound; Detecting the specific binding of the test compound.
  • the method for evaluating a compound of the present invention comprises the steps of: introducing a GPR103 gene and preparing a cell that expresses a GPR103 protein; contacting the cell with a test compound; Measuring the activity of the intracellular signal transmitter, and comparing the activity with the activity of the intracellular signal transmitter when the test compound is not contacted.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is characterized by comprising a step of bringing a test compound into contact with a GPR103 protein and a step of detecting a change in the activity of the protein due to the contact.
  • the compound evaluation method as described above enables the evaluation of a compound (for example, an agonist or an antagonist) that binds to the GPR103 protein.
  • the present invention further encompasses a compound selected by the compound evaluation method of the present invention.
  • Powerful compounds provide diagnostics and therapeutics for diseases associated with GPR103.
  • GPR103 is preferably monkey GPR103.
  • monkey GPR103 By using the monkey GPR103, it becomes possible to evaluate the conjugate under conditions closer to the human body.
  • the nucleic acid of the present invention is characterized by including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • “including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5" means that the nucleotide sequence is necessary for modifying a gene such as a linker sequence with a vector or a restriction enzyme cleavage site usable for gene recombination. An additional base sequence such as a sequence is added.
  • the nucleic acid of the present invention is characterized by comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • nucleic acid of the present invention is characterized by encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • nucleic acids provide a nucleic acid encoding a ligand protein (QRFP) of GPR103 and information on the nucleic acid, and are also used for analyzing the functions of the GPR103 gene and protein and for evaluating the compound of the present invention.
  • QRFP ligand protein
  • the gene of the present invention is also characterized in that it has a nucleic acid ability to hybridize under stringent conditions to a nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a gene having high homology to QRFP can be detected and isolated.
  • the protein of the present invention is characterized by including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • “including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6” means that the amino acid sequence can be used for detection and evaluation of a reporter protein, other proteins, and the like. Additional amino acid sequences, such as required amino acid sequences, are combined.
  • the protein of the present invention is also characterized in that it has the amino acid sequence power of SEQ ID NO: 6.
  • the protein of the present invention contains an amino acid sequence having substitution, deletion, addition or insertion of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and comprises a GPR103 ligand protein (QRFP ) It is characterized by having activity.
  • QRFP GPR103 ligand protein
  • the protein of the present invention is characterized by having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 49 or 50.
  • the present invention further encompasses antibodies against the above-mentioned proteins.
  • an antibody By using such an antibody, it becomes possible to cause an antigen-antibody reaction of the QRFP protein, and it becomes possible to detect the protein, make a diagnosis targeting the protein, and the like.
  • nucleic acids, proteins, and antibodies provide information on the ligand protein (QRFP) of GPR103 and the protein, and can be used for analyzing the functions of the GPR103 gene and protein, and evaluating the compound of the present invention. Highly useful ligands are provided.
  • QRFP ligand protein
  • nucleic acid, gene, protein and antibody of the present invention information on the GPR103 gene and protein of non-human primates and rats and their sequences, as well as the ligand protein (QRFP) of GPR103 and the protein Information is provided. Further, according to the method for evaluating a compound of the present invention, it becomes possible to evaluate and develop a compound serving as a therapeutic agent or a diagnostic agent for a disease relating to the physiological function of GPR103.
  • QRFP ligand protein
  • FIG. 1 is a diagram comparing the amino acid sequences of GPR103 proteins in various animal species.
  • FIG. 2 is a view comparing the amino acid sequences of QRFP in various animal species.
  • FIG. 3 is a view showing intracellular calcium ion elevating activity of various concentrations of QRFP on human and monkey GPR103-expressing 293T-expressing cells.
  • FIG. 2 is a view showing the intracellular calcium ion increasing activity shown by.
  • FIG. 5 is a graph showing intracellular calcium ion concentration increasing activity in monkey GPR103 or human GPR103 gene-expressing CHO cells stimulated by monkey QRFP43.
  • FIG. 6 is a graph showing intracellular calcium ion concentration increasing activity in monkey GPR103 or human GPR103 gene-expressing CHO cells stimulated by monkey QRFP26.
  • FIG. 7 is a graph showing the amount of food consumed 2 hours after QRP was administered to rats in the third ventricle.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of food consumed for 2 hours after QRFP was administered to mice in the lateral ventricle.
  • FIG. 9 shows the expression of GPR103 in obZob mice.
  • FIG. 10 is a view showing expression of QRFP in obZob mouse.
  • nucleic acid in the present invention refers to, for example, DNA, RNA or modified DNA or RNA, preferably DNA.
  • the DNA may be single-stranded or double-stranded, regardless of whether it is genomic DNA or cDNA.
  • isolated in the present invention refers to a substance containing substantially no cell material when produced by recombinant DNA technology or a culture medium containing substantially no culture medium, and a precursor substance when chemically synthesized. Or a nucleic acid or protein substantially free of other substances.
  • to hybridize under stringent conditions refers to the power of two nucleic acid fragments, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Novel (1989), 9.47. -9.62 and 11.45 11.61 [means to hybridize with each other under the hybridization conditions described. More specifically, for example, a condition in which hybridization is performed at 6.0 ⁇ SSC at about 45 ° C., followed by washing with 2.0 ⁇ SSC at 50 ° C. For stringency selection, select the salt concentration in the washing step at, for example, 50 ° C, from about 2.0 X SSC power as low stringency to about 0.2 X SSC as high stringency. can do. In addition, the temperature of the washing process can be raised from room temperature, low stringency conditions, about 22 ° C, to high stringency conditions, about 65 ° C.
  • the monkey GPR103 gene (SEQ ID NO: 1) of the present invention has an open reading frame of 1293 bases (positions 105 to 1397 in the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1), and a 431 amino acid protein (SEQ ID NO: 1). Code 2).
  • the method of clogging the monkey GPR103 gene There is no particular limitation on the method of clogging the monkey GPR103 gene. Specifically, for example, 5'-RACE based on the nucleic acid sequence information derived from the monkey GPR103 gene or a gene highly homologous to the gene is used. Alternatively, a method of amplifying full-length cDNA by 3'-RACE, and a method of screening a cDNA library constructed using an appropriate vector (eg, a plasmid vector or a noctorio phage) using a nucleic acid fragment of a monkey GPR103 gene. I can do it.
  • an appropriate vector eg, a plasmid vector or a noctorio phage
  • the homology between the monkey GPR103 gene and the human GPR103 gene is about 97% in the coding region, and differs by 35 bases.
  • the nucleic acid of the present invention includes those having substitution, deletion, insertion, or addition at one or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the number of bases for such substitution, deletion, insertion and addition is preferably from 1 to 34 bases, more preferably from 1 to 30 bases, still more preferably from 1 to 20 bases. Particularly preferred is 1 to 15 bases, and more preferred is 1 to 10 bases.
  • such a nucleic acid preferably has a homology to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of greater than 97%, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more. It is particularly preferable that the above is satisfied.
  • such a nucleic acid encodes a protein having an activity as GPR103 (for example, a signal transduction activity as a G protein-coupled receptor), which preferably encodes a biologically active protein. It is better to do it.
  • such a nucleic acid can be obtained by isolating a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1 according to the present invention.
  • the animal species from which the nucleic acid is derived is not particularly limited.
  • a GPR103 gene derived from a primate other than human is more preferable, and more specifically, for example, The GPR103 gene of a force-mouse, macaque, squirrel monkey, green monkey, Anubis baboon or common marmoset.
  • the homology at the same position is 98.1%, which differs by 8 amino acids.
  • the protein of the present invention includes those having substitution, deletion, insertion, or addition in one or more amino acids of SEQ ID NO: 2.
  • the number of bases for such substitution, deletion, insertion and addition is preferably 1 to 7 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acids, and particularly preferably 1 to 3 amino acids.
  • such a protein preferably has a homology of 98.2% or more with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 and preferably 98.5% or more. Is more preferably 99% or more.
  • the method for preparing monkey GPR103 is not particularly limited. Specifically, for example, the isolated monkey GPR103 gene is introduced into an expression vector and introduced into host cells such as animal cells, insect cells, and E. coli. And expressing the recombinant protein, followed by purification.
  • the present invention also includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a variant thereof.
  • the mutant include a protein in which 1 or 2 or more and 7 or less amino acids have been substituted or deleted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or addition or insertion of 1 or 2 or more amino acids.
  • Such a mutant protein more preferably has an activity as GPR103 (eg, a signaling activity as a G protein-coupled receptor), which preferably has biological activity.
  • the present invention also includes an expression vector containing the following nucleic acid gene.
  • An isolated nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a monkey GPR103 gene comprising a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector known to those skilled in the art.
  • the term "comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1" in the above item 1 means that the nucleotide sequence is a gene such as a linker sequence with a vector or a restriction enzyme cleavage site usable for gene recombination. Means that a sequence necessary for the modification of has been added.
  • the present invention also includes a host cell containing the expression vector.
  • the host cell may be any of animal cells, insect cells, plant cells, and microorganisms, as long as they are well known to those skilled in the art.
  • viable cells include, for example, COSl, COS7, CHO, NIH / 3T3, 293, Raji, CV11, C1271, MRC-5, CPAE, L-M (TK-), HeLa, 293T or Sf9.
  • the present invention also includes an antibody against the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a variant thereof.
  • the antibody can be prepared using the protein or a partial peptide thereof as an antigen, and can be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody! / It may be wrong.
  • the antibody may react not only with the monkey GPR103 but also with the GPR103 of a different animal species depending on the amino acid sequence serving as the epitope.
  • an antibody having a desired specificity can be prepared.
  • the rat GPR103b gene (SEQ ID NO: 3) of the present invention has an open reading frame of 1245 bases (positions 1-1245 in the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 3), and is a 415 amino acid protein (SEQ ID NO: 4). ).
  • the nucleotide sequence of the rat GPR103 gene is different from the previously isolated rat GPR103b gene of the present invention.
  • the known rat GPR103 is referred to as rat GPR103 or rat GPR103a
  • the rat GPR103 of the present invention is referred to as rat GPR103b.
  • the rat GPR103b gene closing method is not particularly limited, but specifically, for example, 5'-RACE or 5'-RACE based on the nucleic acid sequence information derived from the rat GPR103b gene or a gene highly homologous to the gene.
  • 3'-RACE Amplification of full-length cDNA Screening of cDNA library constructed using an appropriate vector (plasmid vector, noctorio phage, etc.) using rat GPR103b gene nucleic acid fragment Is mentioned.
  • the homology between the rat GPR103b gene and the rat GPR103 gene is 81% in total in the coding region, and differs by 240 bases.
  • the homology between the rat GPR103b gene and the human GPR103 gene is about 84% in the coding region, and differs by 191 bases.
  • the nucleic acids of the present invention also include those having substitution, deletion, insertion or addition at one or more bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the number of bases for such substitution, deletion, insertion and addition is preferably from 1 to 190 bases, more preferably from 1 to 150 bases, and 1 to: LOO bases are more preferable. Particularly preferred is 1 to 50 bases, and more preferred is 1 to 30 bases.
  • such a nucleic acid preferably has a homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of 85% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 95% or more. More preferably, it is particularly preferably 98% or more.
  • Such a nucleic acid preferably encodes a protein having an activity as GPR103 (eg, a signal transduction activity as a G protein-coupled receptor), which preferably encodes a biologically active protein. That is more preferred.
  • such a nucleic acid can be obtained by isolating a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid containing the base sequence of SEQ ID NO: 3 according to the present invention.
  • rat GPR103b has 415 amino acids, has 79% homology with rat GPR103 at the amino acid level, and has a difference of 88 amino acids.
  • rat GPR103b and human GPR103 (SEQ ID NO: 7) is 83%, differing by 71 amino acids.
  • the protein of the present invention also includes those having substitution, deletion, insertion, or addition in one or more amino acids of SEQ ID NO: 4.
  • the number of bases for such substitutions, deletions, insertions, and additions is preferably 1 to 70 amino acids, more preferably 1 to 50 amino acids, and still more preferably 1 to 30 amino acids. 1 to: Particularly preferred are LO amino acids.
  • such a protein preferably has a homology of 84% or more with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4, more preferably 90% or more. % Is more preferable, and 98% or more is particularly preferable.
  • such a mutant protein more preferably has an activity as GPR103 (eg, a signal transduction activity as a G protein-coupled receptor), which is preferably biologically active.
  • the method for preparing rat GPR103b is not particularly limited, but specifically, for example, the isolated rat GPR103b gene is introduced into an expression vector, and the gene is introduced into host cells such as animal cells, insect cells, and E. coli. There is a method of purifying after introducing and expressing the recombinant protein.
  • the present invention also includes an expression vector containing the following nucleic acid gene.
  • An isolated nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • a rat GPR103 gene consisting of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector known to those skilled in the art.
  • pcDNA3.1 pBlueBacHis2, pCI-neo, pcDNAI, pMClneo, pXT1, pSG5, pEFlZV5—HisB , PCR2.l, pETll, gtll or pCR3.1.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the above item 1 means that the nucleotide sequence is a sequence such as a linker sequence with a vector or a restriction enzyme cleavage site usable for gene recombination. Means that a sequence necessary for the modification of has been added.
  • the present invention also includes a host cell containing the expression vector.
  • the host cell may be any of animal cells, insect cells, plant cells, and microorganisms, as long as they are well known to those skilled in the art.
  • viable cells include, for example, COSl, COS7, CHO, NIH / 3T3, 293, Raji, CV11, C1271, MRC-5, CPAE, L-M (TK-), HeLa, 293T or Sf9.
  • the present invention also relates to a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a variant thereof.
  • the antibody can be prepared using the protein or a partial peptide thereof as an antigen, and can be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody! /, May be different.
  • the antibody may react not only with rat GPR103b, but also with GPR103 of different animal species depending on the amino acid sequence used as the epitope.
  • an antibody having the desired specificity can be prepared.
  • the compound acting on GPR103 can be evaluated using the nucleic acid or protein of the present invention.
  • a method for detecting an effect on GPR103 a method for detecting specific binding of a test compound to the receptor, a method for detecting the expression level of a gene or protein changed by contact with a test compound, and a method for detecting To detect the activity of intracellular signal transduction via GPR103 caused by the above. These will be described below in order.
  • the method for evaluating a compound of the present invention comprises the steps of: preparing a cell that expresses the receptor by introducing the GPR103 gene; contacting a test compound with the cell; Detecting the specific binding of the test compound.
  • the second method for evaluating a compound of the present invention comprises the steps of: introducing a GPR103 gene and preparing a cell that expresses the receptor; contacting the cell with a test compound; Measuring the activity of the intracellular signaling substance generated by the above, and comparing the activity with the activity of the intracellular signaling substance when the test compound is not contacted.
  • the test compound is not particularly limited, and examples thereof include proteins, peptides, non-peptidic compounds, and artificially synthesized compounds.
  • Cells expressing the GPR103 gene may be prepared by a method known to those skilled in the art, and the specific method is not particularly limited. For example, the following method can be used. That is, the nucleic acid having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention or a nucleic acid comprising a part thereof is cloned into an expression vector containing a suitable promoter and transcription regulatory element, and the vector having the cloned nucleic acid is used as a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it can be used as an expression vector.
  • the vector is not particularly limited as long as it can be used as an expression vector.
  • pcDNA3.1 pBlueBacHis2, pCI-neo, pcDNAI, pMClneo, pXTl, pSG5, pEFlZV5-histB, pCR2. 1, pETll, gtl 1 or pCR3.1.
  • the expression vector into which the nucleic acid of the present invention has been introduced is introduced into a host cell.
  • host cells are not particularly limited as long as they are commonly used for gene expression, and may be any of animal cells, insect cells, plant cells, and microorganisms.
  • the method for introducing an expression vector into a host cell is not particularly limited as long as it is a known method. Specific examples include, but are not limited to, electoporation, calcium phosphate method, DEAE-dextran method, lipofection method, and gene gun. Is mentioned.
  • the test compound is brought into contact with the cells expressing GPR103 thus prepared.
  • the contacting method is not particularly limited, and examples thereof include a method of contacting in a solution such as an aqueous solution or a buffer solution.
  • the binding between the receptor expressed on the cell surface and the test compound can be determined by, for example, detecting with a label attached to the bound compound (for example, detecting the amount of binding by radioactivity or fluorescence intensity), Signal transduction into cells by binding of a test compound to the receptor on the cell surface, for example, activation of G protein, change in calcium ion (Ca 2+ ) or cAMP concentration, activation of phospholipase C, Changes, receptor internalization, etc. can be detected as indices.
  • a label attached to the bound compound for example, detecting the amount of binding by radioactivity or fluorescence intensity
  • Signal transduction into cells by binding of a test compound to the receptor on the cell surface for example, activation of G protein, change in calcium ion (Ca 2+ ) or cAMP concentration, activation of phospholipase C, Changes, receptor internalization, etc.
  • the activity of the expression level of a molecule on signal transduction generated by the signal transduction can be used as an index.
  • the expression level when used as an index, the expression level is used as an index, the expression level
  • the expression level Although there is no particular limitation on the measurement method, Northern blotting, Western blotting or a DNA chip can be used.
  • the term “expression level” in the present invention refers to the absolute amount or relative amount of a gene encoding a protein present on a signal transduction pathway via the GPR103 protein and a transcript thereof when the target of expression detection is a nucleic acid. .
  • the ⁇ expression level '' refers to the absolute or relative amount of the translation product of the gene encoding the protein present on the signal transduction pathway via the GPR103 protein.
  • a method for measuring the activity is not particularly limited, and a suitable method may be selected depending on the type of the molecule to be measured.
  • the isolated GPR103 protein can also be used directly for evaluation of a conjugate. That is, a test compound is brought into contact with a GPR103 protein, and then a change in the activity of the GPR103 protein caused by the contact is detected.
  • the method of the forceful contact is not particularly limited. Specifically, for example, a method of contacting by mixing in a solution such as a buffer solution (phosphate buffer solution or the like), or a method of placing the GPR103 protein on a membrane Immobilized and contacted with a test compound on a membrane.
  • a solution such as a buffer solution (phosphate buffer solution or the like)
  • a method of placing the GPR103 protein on a membrane Immobilized and contacted with a test compound on a membrane is not particularly limited. Specifically, for example, a method of contacting by mixing in a solution such as a buffer solution (phosphate buffer solution or the like), or a method of placing the GPR103 protein on a membrane Immobilized and contacted with a test compound on a membrane.
  • the method for measuring the activity of the protein may be appropriately set depending on the properties of the protein to be used. Specific examples include a method using the binding activity of a ligand (for example, QRFP) to the GPR103 protein as an index.
  • a ligand for example, QRFP
  • the method for using the binding activity of the ligand as an index is not particularly limited, but specifically, for example, by measuring the affinity of a test compound to a membrane on which GPR103 protein is immobilized.
  • a method for measuring the binding activity may be mentioned.
  • the compound used here may be labeled with a radioisotope or the like for easy detection.
  • a method for detecting the binding activity a method of detecting a ligand labeled with a radioisotope that binds to the GPR103 protein in competition with a test compound can also be mentioned. No labeling of the test compound is required.
  • the test compound is determined to have the activity of inhibiting the binding between the GPRl 03 protein of the present invention and the ligand.
  • conjugates include compounds (agonists) having an activity of binding to the receptor to induce signal transduction into cells, and compounds (antagonists) having no such activity. It is.
  • An agonist has the same physiological activity as a ligand for the receptor and an analog thereof, while an antagonist suppresses the biological activity of the ligand for the receptor and an analog thereof. Therefore, these agonists and antagonists are useful as pharmaceutical compositions for treating diseases caused by abnormalities in the signal transduction system mediated by the GPR103 protein according to the present invention.
  • the method for evaluating a compound of the present invention enables screening for a substance that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of a test compound to the GPR103 protein. That is, by evaluating a plurality of test compounds by the above-described method, a compound that functions as an agonist or an antagonist can be selected. As a result of such selection, if the change is suppressed as compared with the change in intracellular signal transduction when a ligand or an analog thereof is acted on in the absence of the test compound, the test compound becomes It is determined that the compound inhibits intracellular signal transduction after binding of the test compound to GPR103 according to the present invention.
  • the compound is determined to be a compound that promotes intracellular signal transduction after binding of the test compound to GPR103 according to the present invention.
  • various diseases involving GPR103 and its ligands such as angina pectoris, acute and congestive heart failure, myocardial infarction, hypertension, and kidney disease
  • PET positron emission tomography
  • the ligand used for PET can be evaluated by the above-described method for evaluating the compound of the present invention.
  • PET is a non-invasive method of observing biological functions by radiolabeling substances present in the body, such as water, oxygen, glucose, and amino acids, or ligands for a target receptor, and administering them to the body. Used in research and clinical practice.
  • a feature of PET is that it enables function-specific imaging depending on the ligand used as a tracer, and the development of a new tracer is indispensable for elucidating unknown biological functions and diagnosing diseases.
  • the compound evaluation method of the present invention by applying a PET ligand candidate substance as a test compound, it becomes possible to evaluate the substance at the in-vivo port.
  • the GPR103 gene can be detected by using a nucleic acid capable of partially or wholly activating the nucleic acid of the present invention as a probe for hybridization. Such detection can be applied not only to detection of the GPR103 gene using a tissue or cell derived from a living body as a subject, but also to clawing of the GPR103 gene or a gene highly homologous to the gene. Further, by using the nucleic acid as a probe and examining gene expression in various tissues, the distribution of gene expression can be identified.
  • the method of hybridization is not particularly limited.
  • Southern hybridization Northern hybridization, colony hybridization.
  • examples include hybridization, dot hybridization, fluorescence in situ hybridization (FISH), in situ hybridization (ISH), and DNA chip method.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • ISH in situ hybridization
  • the nucleic acid When the nucleic acid is used as a probe for hybridization, it is necessary to have a continuous nucleic acid having a length of at least 20 bases, preferably 40 bases, more preferably 60 bases, and particularly preferably 60 bases. Preferably 80 bases or more are used.
  • the probe may be labeled and used so that it can be detected as necessary. Specifically, for example, it is labeled with a radioactive isotope such as 32 P, 14 c, 125 ⁇ , 3 H, and 35 S, and is labeled with a biotin, a fluorescent dye, an enzyme, a gold colloid, or the like.
  • a radioactive isotope such as 32 P, 14 c, 125 ⁇ , 3 H, and 35 S
  • hybridization may occur.
  • the conditions of the hybridization may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the length of the probe and the type of the gene to be hybridized.For example, Molecular C1oning: A Laboratory Manual, 2nd edition, See Cold Spring Harbor (1989), 9.47-9.62 and 11.45-11.61. More specifically include conditions of washing with [this, 50 o G [trowel 2. 0 X SSC after Nono Eve Lida I See Chillon at about 45 0 G [trowel 6. 0 X SSC .
  • a salt concentration in the washing step from, for example, about 2.0 X SSC, 50 ° C for low stringency, to about 0.2 X SSC, 50 ° C for high stringency. can do.
  • the temperature of the washing step can be increased from low stringency conditions at room temperature, about 22 ° C, to high stringency conditions at about 65 ° C.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the length of such a primer can be appropriately set depending on its nucleotide sequence, the nucleotide sequence of the gene to be isolated, and the like. Generally, it is preferable that the length be 10 to 60 consecutive nucleotides. More preferably, it has 15 to 30 bases.
  • the GPR103 ligand gene (preproP518ZQRFP) (SEQ ID NO: 5) of the present invention has an open reading frame of 408 bases (positions 37 to 444 in the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 5) and a protein having a power of 136 amino acids (sequence: Code number 6).
  • the method of closing the monkey GPR103 ligand gene is not particularly limited, and specifically, for example, based on nucleic acid sequence information derived from the monkey GPR103 ligand gene or a gene highly homologous to the gene. Method for amplifying full-length cDNA by '-RACE or 3'-RACE, cDNA library constructed using an appropriate vector (plasmid vector, nocteriophage, etc.) Screening method is used. [0103] The homology between the monkey GPR103 ligand gene and the human GPR103 ligand gene is about 92% in the coding region, and differs by 32 bases.
  • the nucleic acids of the present invention also include those having substitution, deletion, insertion and addition at one or more bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the number of bases for such substitution, deletion, insertion and addition is preferably from 1 to 31 bases, more preferably from 1 to 20 bases, still more preferably from 1 to 10 bases. Particularly preferred is 1 to 5 bases. More preferred is 1 to 3 bases.
  • such a nucleic acid preferably has a homology of 93% or more with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, more preferably 95% or more.
  • such a nucleic acid preferably encodes a protein having biological activity, and more preferably encodes a protein having activity as a GPR103 ligand.
  • such a nucleic acid can be obtained by isolating a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising the base sequence of SEQ ID NO: 5 according to the present invention.
  • the animal species from which the nucleic acid is derived is not particularly limited. Specifically, for example, a GPR103 ligand gene derived from a primate other than human is more preferable. GPR103 ligand gene of a quiz monkey, macaque, squirrel monkey, squirrel monkey, green monkey, Anubis baboon or common marmoset.
  • the homology at the amino acid level between the monkey GPR103 ligand and the human GPR103 ligand is 87.5%, differing by 17 amino acids.
  • the protein of the present invention includes those having substitution, deletion, insertion, and / or addition at one or more amino acids of SEQ ID NO: 6.
  • the number of bases for such substitutions, deletions, insertions, and additions is preferably 1 to 16 amino acids 1 to: more preferably LO amino acids, and more preferably 1 to 5 amino acids. Particularly preferred is 1 to 3 amino acids.
  • such a protein preferably has a homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 of 88% or more, more preferably 90% or more.
  • the method for preparing monkey GPR103 is not particularly limited. Specifically, for example, the isolated monkey GPR103 gene is introduced into an expression vector and introduced into host cells such as animal cells, insect cells, or E. coli. And expressing the recombinant protein, followed by purification.
  • the present invention also includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or a variant thereof.
  • the mutant include a protein in which 1 or 2 or more and 16 or less amino acids are substituted or deleted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, or addition or insertion of 1 or 2 or more amino acids.
  • Such a mutant protein more preferably has activity as a GPR103 ligand (eg, binding ability to a G protein-coupled receptor), which is preferably biologically active.
  • the present invention also includes the protein having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 49 or 50.
  • the protein may be purified by isolating the nucleic acid encoding the protein by the above-described method and expressing it in a host cell, or may be synthesized using a commercially available peptide synthesizer.
  • the present invention also includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or a variant thereof, and an antibody against the protein having amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 49 or 50.
  • the antibody can be prepared using the GPR103 ligand protein of the present invention or a part of the peptide as an antigen, and may be a variant of a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the antibody may react not only with the monkey GPR103 ligand but also with the GPR103 ligand of a different animal species depending on the amino acid sequence serving as the epitope.
  • an antibody having a desired specificity can be prepared.
  • the monkey GPR103 ligand of the present invention makes it possible to restore the normal function of the GPR103 protein by administering the ligand to, for example, a disease in which the expression of GPR103 is reduced in vivo.
  • Circulatory diseases such as angina pectoris, acute depressive heart failure, myocardial infarction, hypertension, kidney disease, electrolyte abnormality, vasospasm, etc., such as bulimia, anorexia nervosa, depression, anxiety, convulsions, Nervous system disorders such as epilepsy, dementia, pain, alcoholism, withdrawal symptoms associated with withdrawal of drugs, circadian rhythm modulation, schizophrenia, memory disorders, sleep disorders, cognitive disorders, such as obesity, diabetes, Hormonal abnormalities, gout, metabolic diseases such as fatty liver, infertility, premature labor, reproductive diseases such as sexual dysfunction, gastrointestinal diseases, respiratory diseases, inflammatory diseases, hypercholesterolemia, hyperlipidemia It is considered useful for the prevention or treatment of diseases, arteriosclerosis or glaucoma.
  • Circulatory diseases such as angina pectoris, acute depressive heart failure, myocardial infarction, hypertension, kidney disease, electrolyte abnormality, vasospasm, etc., such as
  • the rhesus monkey GPR103 gene has an open reading frame of 1128 bases (the 105th position is also the 1397th position based on the base sequence of SEQ ID NO: 1).
  • the amino acid sequence (431 residues) predicted from each open reading frame is shown in SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 1 shows a diagram comparing the amino acid sequences of 4).
  • hBG29F2 ATAGGATCCTCCCGCGCGGCTGACTCCAGAGTA (SEQ ID NO: 15)
  • hBG29Rl ACAGCGGCCGCTCTTTGGGTTACAATCTGAAGGGC (SEQ ID NO: 16)
  • T7 TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO: 17)
  • [0122] Fasttrack from the macaque monkey brain tissue 2. Purify the mRNA using the OmRNA isolation kit (Invitrogen), synthesize the cDNA using the Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen), and synthesize the cDNA. Using these primers, a cycle of 94 ° C for 10 seconds (denaturation reaction), Z60 ° C for 30 seconds (annealing) / 68 ° C for 1 minute and 30 seconds (extension reaction) was repeated 40 times, and PCR was performed. . The obtained PCR amplification product was digested with restriction enzymes BamHI and Notl, and cloned into pEFlZV5-HisB plasmid vector (Invitrogen).
  • the rhesus monkey preproQRFP gene has an open reading frame of 408 bases (from position 37 to position 444).
  • the amino acid sequence (136 residues) predicted from each open reading frame is shown in SEQ ID NO: 6.
  • hQRFPF2 ATAGGATCCTTGGTGAGTTGCGCTTGGCCACGTGTG (SEQ ID NO: 27) Number 28)
  • T7 TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO: 29)
  • hQRFP-1 CATGCTGGCTGCAGATTCCG (SEQ ID NO: 31)
  • hQRFP-2 TCACTGCCTTCGTCCTGCCT (SEQ ID NO: 32).
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • 20 mM HEPES pH 7.4, Invitrogen
  • 0.5% ⁇ serum albumin 0.5% ⁇ serum albumin (Sigma) was prepared as an Assay buffer.
  • the cells were washed with Atsushi buffer to remove excess Fluo4, and set on FLIPR (Molecular Devices).
  • Various concentrations of human QRFP43 (SEQ ID NO: 51) dissolved in Atsushi buffer were also set in FLIPR, samples were added to the cells, and changes in the amount of fluorescence depending on the intracellular calcium ion concentration generated by irradiation with excitation light was measured.
  • rhesus monkey GPR103 exhibits properties as a QRFP receptor, similar to known human GPR103.
  • a homology search was performed using the Blast algorithm with the base sequence of the rat GPR103 gene (GenBank accession No. NM—198199) against the rat genome database provided by Serrera. A gene sequence having was found and named GPR103b.
  • the cDNA was transformed into type I, and using these primers, a cycle of 94 ° C for 10 seconds (denaturation reaction) and Z68 ° C for 1 minute 30 seconds (annealing and extension reaction) was repeated 40 times. The reaction was performed. The obtained PCR amplification product was digested with restriction enzymes BamHI and Notl, and cloned into pEFI / V5-HisB plasmid vector (Invitrogen).
  • the rat GPR103b gene has an open reading frame of 1245 bases (from the first position).
  • GR346b (GenPept accession No. CAD82895) has a 94% amino acid sequence homology with rat GPR103b (392 out of 416 residues are identical), and may be a receptor for QRFP, similar to rat GPR103b. It could be confirmed.
  • rBG29LFl ATAGGATCCGGTCAAGGCGCCTACCGAACCCAGCATG (SEQ ID NO: 33)
  • rBG29LR4 ACAGCGGCCGCAACAGGTCCTCATTCTGAAGACAC (SEQ ID NO: 3 4)
  • T7 TAATACGACT CACTATAGGG (SEQ ID NO: 35)
  • rQRFP2R-1 TCACCTTCTTCTGCATTCCC (SEQ ID NO: 37)
  • rQRFP2R-2 AAAATCTACACCACCTTCAT (SEQ ID NO: 38)
  • rQRFP2R-3 GCATGGAAGCTTGGGAGCCA (SEQ ID NO: 39)
  • rQRFP2R-4 CCCCCAAATGCTTCCCCTTT (SEQ ID NO: 40)
  • rQRFP2R- 5 AGCTCATAACCGATTTTCCC (SEQ ID NO: 41)
  • rQRFP2R-6 ATGAGCAGGTCGCTGAGTGCCA (SEQ ID NO: 42).
  • the cells were seeded on a 96-well black culture plate coated with poly-D-lysine (Bettaton Dickinson) at a cell number of 3 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured at room temperature. After removing the cell culture medium, add 4 ⁇ l of Fluo4-AM (Morecular Probes) and 0.04% Pluronic acid (Morecular Probes) to DMEM (Invitrogen) containing 10% Fetal bovine serum (Neuroclone). was added and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • HBSS Hank's Balanced Salt Solution
  • 20 mM HEPES pH 7.4, Invitrogen
  • 0.5% ⁇ serum albumin 0.5% ⁇ serum albumin (Sigma) was prepared as an Atsushi buffer.
  • the cells were washed with Atsushi buffer to remove excess Fluo4, and set on FLIPR (Molecular Devices).
  • Various concentrations of human QRFP43 (SEQ ID NO: 51) dissolved in Atsushi buffer were also set in FLIPR, samples were added to the cells, and the amount of fluorescence generated by irradiation with excitation light was dependent on the intracellular calcium ion concentration. was measured.
  • preproQRFP is processed, its C-terminal is amidated and its N-terminal is pyrodaltamylated.
  • the monkey preproQRFP is also expected to be processed at positions corresponding to other species of QRFP.
  • the peptide produced by processing monkey preproQRFP represented by SEQ ID NO: 6 is referred to as monkey QRFP43 (SEQ ID NO: 49). It is known that only a portion corresponding to 26 amino acids from the C-terminus of human QRFP has a sufficient agonist activity against GPR103. Even in monkey QRFP, it is expected that a portion corresponding to 26 amino acids from the C-terminus can exert sufficient agonist activity, and the corresponding peptide is referred to as monkey QRFP26 (SEQ ID NO: 50).
  • the monkeys QRFP43 and QRFP26 were synthesized by the Fmoc method using NovaSyn® TGR resin sold by Novabuochem as a starting material and HATU as a condensing reagent using a Pioneer TM peptide synthesizer. After condensation, TFA / thioanisole / ethandithiol / m-cresol (95/2. 5/1. 5ZD) was added to the obtained resin, the mixture was shaken at room temperature for 1 hour 30 minutes, and the resin was removed by filtration.
  • Example 7 Detection of intracellular calcium ion concentration increasing activity in monkey GPR103 or human GPR103 gene-expressing CHO cells stimulated by monkey QRFP43 or QRFP26.
  • the pEFlZV5-HisB plasmid vector carrying the monkey GPR103 gene or human GPR103 gene obtained in Example 1 and the same vector without an insert (mock) were transfected into CHO cells, and the final concentration in the medium was adjusted. Geneticin (Invitrogen) was added to 2 mgZml to select the expression cells. Thereafter, monkey or human GPR103 gene-expressing cells were single-cloned by the limiting dilution method and subjected to the following tests. In addition, monkeys QRFP43 and QRFP26 synthesized by the method described in Example 6 were subjected to the following tests.
  • the cells were seeded on a 96-well poly-D-lysine-coated black culture plate (Betaton Dickinson) at a cell number of 2.5 ⁇ 10 4 cells / well, and ⁇ Cultivated. After removing the cell culture medium, add 4 ⁇ l of Fluo4-AM (Morecular Probes) and 0.04% Pluronic acid (Morecular Probes) to DMEMZF-12 (Invitrogen) containing 10% Fetal bovine serum (Sigma). ) And 2.5 mM Probenec id (Sigma) were added, and then incubated at 37 ° C for 1 hour. Hank 's
  • Simultaneously measured monkey QRFP26 The 50% effective concentration of intracellular calcium concentration increasing activity was 9.2 nM for monkey GPR103 gene-expressing CHO cells and 1.7 nM for human GPR103 gene-expressing CHO cells, respectively (FIG. 6).
  • the change in intracellular calcium ion concentration by each monkey QRFP was not observed (FIGS. 5 and 6).
  • a guide force-Yure (27 gauge) was introduced into the lateral ventricle of a C57BL mouse (9 to 12 weeks of age) and fixed with a dental resin.
  • the guide force-Yure position was 0.4 mm behind Bredamas, 0.8 mm to the right, and 1 mm deep from the skull surface.
  • Fig. 7 shows the amount of food consumed for 2 hours after administration of human QRFP43 to rats in the third ventricle
  • Fig. 8 shows the amount of food consumed for 2 hours after administration of human QRFP43 to mice. I have.
  • FIG. 7 and FIG. 8 when compared with the reinforced animals not receiving QRFP and the animals receiving QRFP, the food consumption after the administration was significantly increased. Therefore, it was confirmed that QRFP and its receptor, GPR103, are involved in regulating food intake.
  • the amount of food consumed when only artificial cerebrospinal fluid (aCSF) was administered instead of QRFP was used as a reference.
  • aCSF cerebrospinal fluid
  • the hypothalamus was excised from each of 14 obZob mice and 10 C57BLZ6J mice, the total RNA was extracted using IS OGEN (-Tubong Gene), and the cDNA was isolated using Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems). Synthesis was performed.
  • a 100 microliter reverse transcription reaction contains a random hexamer and 2 microliters of total RNA.
  • a negative control having the same composition as the reverse transcription reaction solution was prepared except for removing the reverse transcriptase.
  • Detection and quantification of mouse GPR103 and mouse preproQRFP mRNA were performed by real-time quantitative PCR (using ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) according to the attached manual). The following primers and probes were used.
  • mGPR103F TCTTTGGCAACTCTCTGGTCATC (SEQ ID NO: 43)
  • mGPR103R CAGAAGAAGGCAATGAGCAGATC (SEQ ID NO: 44)
  • mGPR103T TCGCGACCGTCACCAACATCTTC (SEQ ID NO: 45)
  • mQRFPF TCTCCCTCTGAGTGCCTGCT (SEQ ID NO: 46)
  • mQRFPT CAGACATCGGTGACATCGGAGCCA (SEQ ID NO: 48).
  • both mGPR103F and mGPR103R primers and a probe labeled with FAM mGPR103T were used.
  • both mQRFPF and mQRFPR primers and TaqMan probe mQRFPT labeled with FAM were used.
  • Beta-actin was adopted as an internal standard (FEBS Lett. 2001 Sep 7; 505): 136-40).
  • the GPR103 of the present invention As described above, according to the GPR103 of the present invention and the compound evaluation method using the same, it is possible to obtain information on the GPR103 gene and protein of non-human primates and rats and their sequences. This makes it possible to construct a GPR103 model system targeting human drugs. Further, according to the method for evaluating a compound of the present invention, it is possible to evaluate and develop a compound serving as a therapeutic drug or a diagnostic agent for a disease relating to the physiological function of GPR103.

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Abstract

【課題】 　ヒト以外の霊長類又はラットのＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質及び当該遺伝子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法を提供すること。また、ＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質の機能解析や、前記化合物の評価において利用価値の高い新規リガンドを提供すること。 【解決手段】 　配列番号１～４に記載の配列を有する核酸又はタンパク質により、ヒト以外の霊長類又はラットのＧＰＲ１０３遺伝子及びタンパク質や、これらの遺伝子及びタンパク質に基づく情報が提供される。また、これらの遺伝子及びタンパク質を用いて化合物の評価が可能となる。さらに、配列番号５及び６に記載の配列を有する核酸又はタンパク質により、ＧＰＲ１０３リガンドが提供される。

Description

新規サル GPR103及びサル QRFP並びに GPR103を用いた化合物の 評価方法
技術分野
[0001] 本発明は、新規サル及びラット GPR103遺伝子、タンパク質に関し、当該遺伝子又 はタンパク質を用いたィ匕合物の評価方法に関する。また、本発明は、 GPR103のリ ガンドタンパク質に関する。
背景技術
[0002] 生体内の機能を調節するホルモン、神経伝達物質又は生理活性物質の多くは、細 胞膜上に存在するグアノシン三リン酸結合タンパク質 (以下、「Gタンパク質」という）共 役型レセプターを介して標的細胞にシグナルを伝達し、固有の機能を発揮する。 かるレセプターは、細胞膜を 7回貫通するという共通の構造を有し、 Gタンパク質共役 型レセプタースーパーファミリーを形成して 、る。
[0003] Gタンパク質共役型レセプターは、これまでにすでに数百種が単離されているが、 依然、単離されていないものもある。また、そのリガンドが不明である、いわゆるォーフ アンレセプターも多く存在する。
[0004] このようなレセプターやリガンドが単離され、機能が解明されることにより、生体内で 生じる生理機能を解明することが可能となるとともに、当該機能をコントロールすること ができるァゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニングが可能となり、医薬品の開発に 貢献することが期待されて!ヽる。
[0005] GPR103 (SP9155又は AQ27とも称される）は Gタンパク質共役型レセプターの 一種であり、ヒト GPR103遺伝子及びタンパク質については、種々の Gタンパク質共 役型レセプターのアミノ酸配列を元に EST及びゲノム DNAのデータベース検索を行 い、得られた配列情報に基づいて PCR (Polymerase chain reaction)〖こより単離 された (非特許文献 1)。また、ヒト GPR103タンパク質のアミノ酸配列は、特許文献 1 にも開示されている。
[0006] また、マウス GPR103は、特許文献 2及び特許文献 3に開示されている。さらに、ラ ット GPR103は、特許文献 3に開示されている。
[0007] GPR103は、ォレキシン、神経ペプチド FF、コレシストキ-ン（Cholecystokinin) レセプターと高い相同性を有し、これらの分子と類似の機能を有することは予想され た力 その機能については未知であった。しかし、その後、 Ying Jiangらによって、リ ガンドとして機能するペプチドが見出され (非特許文献 2、特許文献 4)、また、ラット 副腎の球状帯上において、アルドステロン (Aldosterone)の分泌の誘導に関与する ことが示唆されて 、る (非特許文献 3)。
[0008] 一方、治療薬や診断薬の開発にお！ヽて、開発候補化合物は、げっ歯類及び霊長 類においてその生理学的作用が評価される。これは、候補化合物が動物種によって 異なる薬効を示すことがあるためであり、よりヒトに近い霊長類において評価すること が毒性の低い治療薬や診断薬の効率的な開発に寄与することとなる。
[0009] 特許文献 l :WO0011015号公報
特許文献 2： WO2002042458号公報
特許文献 3：特開 2004— 000113号公報
特許文献 4：特開 2001— 136981号公報
非特許文献 l : Gene、 275卷、 83頁（2001年）
非特許文献 2 Journal of biological chemistry、 278卷、 27652頁（2003) 非特許文献 3 Journal of biological chemistry、 278卷、 46387頁（2003) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] し力しながら、ヒト以外の霊長類 GPR103遺伝子は未だ単離されておらず、かかる 遺伝子を用いた治療薬や診断薬の評価は不可能な状況であった。
[0011] 本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ヒト以外の霊 長類の GPR103遺伝子及びタンパク質を提供することを目的とする。また、当該遺伝 子又はタンパク質を用いた化合物の評価方法を提供することを目的とする。併せて、 GPR103遺伝子及びタンパク質の機能解析や、前記化合物の評価にお!ヽて利用価 値の高 、新規リガンドを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0012] 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、新規サル及びラッ ト GPR103遺伝子（配列番号 1及び 3)を単離すること、及び、サル由来の GPR103リ ガンドである preproP518ZQRFP (配列番号 5)を単離することに成功し、さらにサ ル QRFPに基づき GPR103リガンド活性を有するタンパク質である QRFP43 (配列 番号 49)及び QRFP26 (配列番号 50)を設計し合成することに成功するとともに、こ れらの分子を用いた結合実験によりリガンドの評価を行うことに成功し、本発明を完 成した。
[0013] すなわち、本発明の核酸は、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を含むことを特徴 とする。ここで、「配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列に 、ベクターとのリンカ一配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の遺 伝子の改変に必要な配列等の、付加的な塩基配列が付加されて 、ることを 、う。
[0014] また、本発明の核酸は、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列力もなることを特徴と する。
[0015] さらに、本発明の核酸は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク 質をコードすることを特徴とする。
[0016] 以上述べたような本発明の核酸により、ヒト以外の霊長類及びラットの GPR103遺 伝子及びタンパク質とこれらの配列に関する情報を得ることが可能となり、主としてヒト の医薬の標的である GPR103のモデルシステムの構築が可能となる。
[0017] また、本発明の遺伝子は、配列番号 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする核酸力もなることを特徴とする。かかる遺伝子を用 いることにより、サル GPR103遺伝子と相同性の高い遺伝子の検出が可能となる。
[0018] さらに、本発明の遺伝子は、配列番号 3に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジ ェントな条件下でノ、イブリダィズする核酸力もなることを特徴とする。かかる遺伝子を 用いることにより、ラット GPR103遺伝子と相同性の高い遺伝子の検出や単離が可能 となる。
[0019] また、本発明は、上記の核酸又は遺伝子を含む発現ベクターをも包含する。かかる ベクターを用いることにより、 GPR103の遺伝子レベルでの操作や、組換えタンパク 質の発現等が可能となる。 [0020] さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞をも包含する。かかる宿主細 胞を用いることにより、化合物やペプチド等のリガンドの評価等の細胞レベルでの研 究が可能となる。
[0021] また、本発明のタンパク質は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を含むことを 特徴とする。ここで、「配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を含む」とは、前記アミ ノ酸配列に、レポータータンパク、その他当該タンパク質の検出及び評価のため等に 使用可能な必要なアミノ酸配列等の、付加的なアミノ酸配列が結合されて 、ることを いう。
[0022] さらに、本発明のタンパク質は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列からなること を特徴とする。
[0023] さらに、本発明のタンパク質は、配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において 1 又は 2以上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入があるアミノ酸配列を含有し、 GP R103タンパク質の活性を有することを特徴とする。
[0024] 以上述べたような本発明のタンパク質により、ヒト以外の霊長類及びラットの GPR10 3遺伝子及びタンパク質とこれらの配列に関する情報を得ることが可能となり、主とし てヒトの医薬の標的である GPR103のモデルシステムの構築が可能となる。
[0025] さらに、本発明は、前記のタンパク質に対する抗体をも包含する。かかる抗体を用 いることにより、 GPR103タンパク質の抗原抗体反応を生じさせることが可能となり、 当該タンパク質の検出や、 GPR103タンパク質を標的とした診断等が可能となる。
[0026] また、本発明の化合物の評価方法は、 GPR103遺伝子を導入し、 GPR103タンパ ク質を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と 、当該 GPR103に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むこと を特徴とする。
[0027] さらに、本発明の化合物の評価方法は、 GPR103遺伝子を導入し、 GPR103タン パク質を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程 と、当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性 と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較するェ 程と、を含むことを特徴とする。 [0028] また、本発明の化合物の評価方法は、被検化合物を、 GPR103タンパク質に接触 させる工程と、当該接触による該タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含む ことを特徴とする。
[0029] 以上述べたような化合物の評価方法により、 GPR103タンパク質に結合する化合 物（例えば、ァゴ-スト又はアンタゴニスト）の評価が可能となる。
[0030] さらに、本発明は、本発明の化合物の評価方法によって選択された化合物をも包 含する。力かる化合物により、 GPR103に関与する疾病の診断薬や治療薬が提供さ れる。
[0031] また、本発明の化合物の評価方法においては、 GPR103がサル GPR103であるこ とが好ましい。サル GPR103を用いることにより、よりヒトの生体内に近い条件下でィ匕 合物の評価を行うことが可能となる。
[0032] また、本発明の核酸は、配列番号 5に記載の塩基配列を含むことを特徴とする。こ こで、「配列番号 5に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列に、ベクターとのリ ンカー配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の遺伝子の改変に 必要な配列等の、付加的な塩基配列が付加されて 、ることを 、う。
[0033] また、本発明の核酸は、配列番号 5に記載の塩基配列からなることを特徴とする。
[0034] さらに、本発明の核酸は、配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコ ードすることを特徴とする。
[0035] これらの核酸により、 GPR103のリガンドタンパク質（QRFP)をコードする核酸及び 当該核酸に係る情報が提供され、併せて、 GPR103遺伝子及びタンパク質の機能 解析や、本発明の化合物の評価方法において利用価値の高いリガンドが提供される
[0036] さらに、本発明の遺伝子は、配列番号 5に記載の塩基配列を有する核酸とストリン ジェントな条件下でハイブリダィズする核酸力もなることを特徴とする。かかる遺伝子 を用いることにより、 QRFPと相同性の高い遺伝子の検出や単離が可能となる。
[0037] また、本発明のタンパク質は、配列番号 6に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴と する。ここで、「配列番号 6に記載のアミノ酸配列を含む」とは、前記アミノ酸配列に、 レポータータンパク、その他当該タンパク質の検出及び評価のため等に使用可能な 必要なアミノ酸配列等の、付加的なアミノ酸配列が結合されて 、ることを 、う。
[0038] また、本発明のタンパク質は、配列番号 6に記載のアミノ酸配列力もなることを特徴 とする。
[0039] また、本発明のタンパク質は、配列番号 6に記載のアミノ酸配列において 1又は 2以 上のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入があるアミノ酸配列を含有し、 GPR103の リガンドタンパク質 (QRFP)活性を有することを特徴とする。
[0040] また、本発明のタンパク質は、配列番号 49又は 50に記載のアミノ酸配列力 なるこ とを特徴とする。
[0041] さらに、本発明は、前記のタンパク質に対する抗体をも包含する。かかる抗体を用 いることにより、 QRFPタンパク質の抗原抗体反応を生じさせることが可能となり、当 該タンパク質の検出や、当該タンパク質を標的とした診断等が可能となる。
[0042] これらの核酸、タンパク質及び抗体により、 GPR103のリガンドタンパク質（QRFP) 及び当該タンパク質に係る情報が提供され、併せて、 GPR103遺伝子及びタンパク 質の機能解析や、本発明の化合物の評価方法において利用価値の高いリガンドが 提供される。
発明の効果
[0043] 本発明の核酸、遺伝子、タンパク質及び抗体によれば、ヒト以外の霊長類及びラッ トの GPR103遺伝子及びタンパク質とこれらの配列に関する情報、並びに GPR103 のリガンドタンパク質 (QRFP)及び当該タンパク質に係る情報が提供される。また、 本発明の化合物の評価方法によれば、 GPR103の生理機能に関与する疾病に対し て、治療薬や診断薬となる化合物の評価、開発が可能となる。
図面の簡単な説明
[0044] [図 1]種々の動物種における GPR103タンパク質のアミノ酸配列を比較した図である
[図 2]種々の動物種における QRFPのアミノ酸配列を比較した図である。
[図 3]ヒト及びサル GPR103発現 293T発現細胞に対する種々の濃度の QRFPが示 す細胞内カルシウムイオン上昇活性を示す図である。
[図 4]マウス及びラット GPR103b発現 293T発現細胞に対する種々の濃度の QRFP が示す細胞内カルシウムイオン上昇活性を示す図である。
[図 5]サル QRFP43刺激によるサル GPR103又はヒト GPR103遺伝子発現 CHO細 胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を示す図である。
[図 6]サル QRFP26刺激によるサル GPR103又はヒト GPR103遺伝子発現 CHO細 胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を示す図である。
[図 7]QRFPをラットに第 3脳室内投与した後、 2時間の摂食量を示す図である。
[図 8]QRFPをマウスに側脳室内投与した後、 2時間の摂食量を示す図である。
[図 9]obZobマウスにおける GPR103の発現を示す図である。
[図 10]obZobマウスにおける QRFPの発現を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0045] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0046] 本発明における「核酸」とは、例えば、 DNA、 RNA若しくは修飾された DNA又は R NAをいい、好ましくは DNAをいう。また、前記 DNAとしては、ゲノム DNAである力 c DNAであるかを問わず、一本鎖であってもよぐ二本鎖であってもよい。
[0047] また、本発明における「単離された」とは、組換え DNA技術により作成された場合 は細胞物質、培養培地を実質的に含有せず、化学合成された場合には前駆体物質 又はその他の物質を実質的に含まな 、、核酸又はタンパク質を 、う。
[0048] また、本発明における「ストリンジェントな条件でノ、イブリダィズする」とは、二つの核 酸断片力 Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第 2版、コールドスプ リングノヽーノ ー（1989)、 9. 47- 9. 62及び 11. 45 11. 61【こ記載されたノヽイブリ ダイゼーシヨン条件下で、相互にハイブリダィズすることを意味する。より具体的には 、例えば、約 45°Cにて 6. 0 X SSCでハイブリダィゼーシヨンを行った後に、 50°Cにて 2. 0 X SSCで洗浄する条件が挙げられる。ストリンジエンシー選択のため、洗浄工程 における塩濃度を、例えば 50°Cにて、低ストリンジエンシーとしての約 2. 0 X SSC力 ら、高ストリンジエンシーとしての約 0. 2 X SSCまで選択することができる。さらに、洗 浄工程の温度を低ストリンジエンシー条件の室温、約 22°Cから、高ストリンジエンシー 条件の約 65°Cまで上昇させることができる。
[0049] 以下、本発明に係るサル (ァカゲザル) GPR103について説明する。 [0050] 本発明のサル GPR103遺伝子（配列番号 1)は、 1293塩基のオープンリーデイン グフレーム（配列番号 1に記載の核酸における 105〜 1397番目 )を有し、 431ァミノ 酸のタンパク質 (配列番号 2)をコードする。
[0051] サル GPR103遺伝子のクローユング方法としては特に制限はないが、具体的には 、例えば、サル GPR103遺伝子又は当該遺伝子に相同性の高い遺伝子由来の核 酸配列情報をもとに 5'— RACE又は 3'— RACEで全長 cDNAを増幅する方法、適 切なベクター（プラスミドベクター、ノ クテリオファージ等）を用いて構築された cDNA ライブラリーをサル GPR103遺伝子の核酸断片を用いてスクリーニングする方法が挙 げられる。
[0052] また、サル GPR103遺伝子とヒト GPR103遺伝子との間の相同性は、コーディング 領域において約 97%であり、 35塩基が相違する。本発明の核酸には、配列番号 1に 記載の塩基配列のうち、 1又は 2以上の塩基において置換、欠失、挿入、付加がある ものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、 1〜34塩基である ことが好ましぐ 1〜30塩基であることがより好ましぐ 1〜20塩基であることがさらに好 ましぐ 1〜15塩基であることが特に好ましぐ 1〜10塩基であることがさらに好ましい 。また、このような核酸は、その相同性に基づけば、配列番号 1に記載の塩基配列と の相同性が 97%より大きいことが好ましぐ 98%以上であることがより好ましぐ 99% 以上であることが特に好ましい。また、このような核酸は、生物学的に活性を有するタ ンパク質をコードすることが好ましぐ GPR103としての活性 (例えば、 Gタンパク質共 役型レセプターとしての情報伝達活性)を有するタンパク質をコードすることがより好 ましい。
[0053] ここで、このような核酸は、本発明に係る配列番号 1に記載の塩基配列を含む核酸 とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸を単離することにより得ることがで きる。また、その核酸の由来となる動物種としては特に限定されないが、具体的には、 例えば、ヒト以外の霊長類由来の GPR103遺伝子であることが好ましぐより具体的 には、例えば、ァカゲザル、力-クイザル、二ホンザル、リスザル、ミドリザノレ、ァヌビス ヒヒ又はコモンマーモセットの GPR103遺伝子が挙げられる。
[0054] また、サル GPR103 (配列番号 2)とヒト GPR103 (配列番号 7)との間のアミノ酸レべ ルでの相同性は 98. 1%であり、 8アミノ酸が相違する。本発明のタンパク質には、配 列番号 2の 1又は 2以上のアミノ酸において、置換、欠失、挿入、付加があるものも含 まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、 1〜7アミノ酸であることが 好ましぐ 1〜5アミノ酸であることがより好ましぐ 1〜3アミノ酸であることが特に好まし い。また、このようなタンパク質は、その相同性に基づけば、配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列との相同性が 98. 2%以上であることが好ましぐ 98. 5%以上であることが より好ましぐ 99%以上であることが特に好ましい。
[0055] サル GPR103の調製方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、単離 したサル GPR103遺伝子を発現ベクターに導入し、動物細胞、昆虫細胞又は大腸 菌等の宿主細胞に導入して組換えタンパク質を発現させた後、精製する方法が挙げ られる。
[0056] また、本発明は、配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変 異体を含む。前記変異体としては、配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1又 は 2以上であり且つ 7箇所以下のアミノ酸が置換、欠失しているタンパク質や、 1又は 2以上のアミノ酸の付加、挿入があるタンパク質が挙げられる。このような変異タンパク 質は、生物学的に活性を有することが好ましぐ GPR103としての活性 (例えば、 Gタ ンパク質共役型レセプターとしての情報伝達活性)を有することがより好ま 、。
[0057] また、本発明は以下の核酸 '遺伝子を含む発現ベクターをも含む。
1.配列番号 1に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
2.配列番号 1に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
3.配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする単離された核酸
4.配列番号 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズする核酸カゝらなるサル GPR103遺伝子。
[0058] ここで、前記発現ベクターとしては、当業者に周知のベクターであれば特に制限は なく、例えば、 pcDNA3. 1、 pBlueBacHis2、 pCI— neo、 pcDNAI、 pMClneo、 p XT1、 pSG5、 pEFlZV5— HisB、 pCR2. l、pETl l、 gtl l又は pCR3. 1力挙 げられる。 [0059] また、前記 1. における「配列番号 1に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列 に、ベクターとのリンカ一配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の 遺伝子の改変に必要な配列が付加されていることを意味する。
[0060] さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞をも含む。当該宿主細胞とし ては、当業者に周知の細胞であれば特に制限はなぐ動物細胞、昆虫細胞、植物細 胞、微生物のいずれでもよい。力かる細胞としては、具体的には、例えば、 COSl、 C OS7、 CHO、 NIH/3T3, 293、 Raji、 CV11、 C1271、 MRC— 5、 CPAE、 L— M (TK—）、 HeLa、 293T又は Sf9が挙げられる。
[0061] また、本発明は、配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変 異体に対する抗体を含む。当該抗体は、前記タンパク質又はその一部のペプチドを 抗原として調製することができ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の！/、ず れであってもよ 、。当該抗体はェピトープとなるアミノ酸配列によってサル GPR103 のみならず、異なった動物種の GPR103にも反応する場合がある力 サル GPR103 にのみ選択性を有する抗体を調製する場合には、サルと異動物種の GPR103にお いて相同性の低い領域をペプチド抗原として使用してモノクローナル抗体を調製す ることにより、所望の特異性を有する抗体を調製することができる。
[0062] 次に、本発明のラット GPR103bについて説明する。
[0063] 本発明のラット GPR103b遺伝子（配列番号 3)は、 1245塩基のオープンリーデイン グフレーム（配列番号 3に記載の核酸における 1〜1245番目 )を有し、 415アミノ酸 のタンパク質 (配列番号 4)をコードする。上述したように、ラット GPR103遺伝子は既 に単離されている力 本発明のラット GPR103b遺伝子と塩基配列が相違する。便宜 上、既知のラット GPR103をラット GPR103又はラット GPR103aと、本発明のラット G PR103をラット GPR103bと称する。
[0064] ラット GPR103b遺伝子のクローユング方法としては特に制限はないが、具体的に は、例えば、ラット GPR103b遺伝子又は当該遺伝子に相同性の高い遺伝子由来の 核酸配列情報をもとに 5'— RACE又は 3'— RACEで全長 cDNAを増幅する方法、 適切なベクター（プラスミドベクター、ノ クテリオファージ等）を用いて構築された cDN Aライブラリーをラット GPR103b遺伝子の核酸断片を用いてスクリーニングする方法 が挙げられる。
[0065] また、ラット GPR103b遺伝子とラット GPR103遺伝子との間の相同性は、コーディ ング領域にぉ 、て 81 %であり、 240塩基が相違する。
[0066] さらに、ラット GPR103b遺伝子とヒト GPR103遺伝子との間の相同性は、コーディ ング領域において約 84%であり、 191塩基が相違する。本発明の核酸には、配列番 号 1に記載の塩基配列において、 1又は 2以上の塩基において置換、欠失、挿入、付 加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、 1〜190 塩基であることが好ましぐ 1〜150塩基であることがより好ましぐ 1〜： LOO塩基である ことがさらに好ましぐ 1〜50塩基であることが特に好ましぐ 1〜30塩基であることが さらに好ましい。また、このような核酸は、その相同性に基づけば、配列番号 1の塩基 配列との相同性が 85%以上であることが好ましぐ 90%以上であることがより好ましく 、 95%以上であることがさらに好ましぐ 98%以上であることが特に好ましい。また、こ のような核酸は、生物学的に活性を有するタンパク質をコードすることが好ましぐ GP R103としての活性 (例えば、 Gタンパク質共役型レセプターとしての情報伝達活性） を有するタンパク質をコードすることがより好まし 、。
[0067] ここで、このような核酸は、本発明に係る配列番号 3に記載の塩基配列を含む核酸 とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸を単離することにより得ることがで きる。
[0068] また、ラット GPR103bは、上述したように、 415アミノ酸力 なり、ラット GPR103との 間のアミノ酸レベルでの相同性は 79%であり、 88アミノ酸が相違する。
[0069] さらに、ラット GPR103bとヒト GPR103 (配列番号 7)との間の相同性は 83%であり 、 71アミノ酸が相違する。
[0070] 本発明のタンパク質には、配列番号 4の 1又は 2以上のアミノ酸において、置換、欠 失、挿入、付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数として は、 1〜70アミノ酸であることが好ましぐ 1〜50アミノ酸であることがより好ましぐ 1〜 30アミノ酸であることがさらに好ましぐ 1〜： LOアミノ酸であることが特に好ましい。また 、このようなタンパク質は、その相同性に基づけば、配列番号 4に記載のアミノ酸配列 との相同性が 84%以上であることが好ましぐ 90%以上であることがより好ましぐ 95 %以上であることがさらに好ましぐ 98%以上であることが特に好ましい。また、このよ うな変異タンパク質は、生物学的に活性であることが好ましぐ GPR103としての活性 (例えば、 Gタンパク質共役型レセプターとしての情報伝達活性)を有することがより 好ましい。
[0071] ラット GPR103bの調製方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、単 離したラット GPR103b遺伝子を発現ベクターに導入し、動物細胞、昆虫細胞又は大 腸菌等の宿主細胞に導入して組換えタンパク質を発現させた後、精製する方法が挙 げられる。
[0072] また、本発明は以下の核酸 '遺伝子を含む発現ベクターをも含む。
1.配列番号 3に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
2.配列番号 3に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
3.配列番号 4に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする単離された核酸
4.配列番号 3に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズする核酸カゝらなるラット GPR103遺伝子。
[0073] ここで、前記発現ベクターとしては、当業者に周知のベクターであれば特に制限は なく、例えば、 pcDNA3. 1、 pBlueBacHis2、 pCI— neo、 pcDNAI、 pMClneo、 p XT1、 pSG5、 pEFlZV5— HisB、 pCR2. l、pETl l、 gtl l又は pCR3. 1力挙 げられる。
[0074] また、前記 1.における「配列番号 3に記載の塩基配列を含む」とは、前記塩基配列 に、ベクターとのリンカ一配列や遺伝子組換えに使用可能な制限酵素切断部位等の 遺伝子の改変に必要な配列が付加されていることを意味する。
[0075] さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞をも含む。当該宿主細胞とし ては、当業者に周知の細胞であれば特に制限はなぐ動物細胞、昆虫細胞、植物細 胞、微生物のいずれでもよい。力かる細胞としては、具体的には、例えば、 COSl、 C OS7、 CHO、 NIH/3T3, 293、 Raji、 CV11、 C1271、 MRC— 5、 CPAE、 L— M (TK—）、 HeLa、 293T又は Sf9が挙げられる。
[0076] また、本発明は、配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変 異体に対する抗体を含む。当該抗体は、前記タンパク質又はその一部のペプチドを 抗原として調製することができ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の！/、ず れであってもよい。当該抗体はェピトープとなるアミノ酸配列によってラット GPR103b のみならず、異なった動物種の GPR103にも反応する場合がある力 ラット GPR103 bにのみ選択性を有する抗体を調製する場合には、ラットと異動物種の GPR103に おいて相同性の低い領域をペプチド抗原として使用してモノクローナル抗体を調製 することにより、所望の特異性を有する抗体を調製することができる。
[0077] 次に、本発明にかかる、配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を有する核酸若しくは 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の用途について列挙し、 それぞれ説明する。
[0078] (1)化合物の評価
本発明の核酸又はタンパク質を用いて、 GPR103に作用する化合物の評価をする ことができる。 GPR103に対する作用を検出する方法として、被検化合物の当該受 容体に対する特異的結合を検出する方法、被検化合物の接触によって変化した遺 伝子又はタンパク質の発現量を検出する方法、及び、当該接触によって生じた GPR 103を介した細胞内情報伝達の活性を検出する方法が挙げられる。以下、順に説明 する。
[0079] すなわち、本発明の化合物の評価方法は、 GPR103遺伝子を導入し、当該受容 体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該受容体に対する当該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を含むことを 特徴とする。
[0080] また、本発明の第 2の化合物の評価方法は、 GPR103遺伝子を導入し、当該受容 体を発現する細胞を調製する工程と、当該細胞に被検化合物を接触させる工程と、 当該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、当該活性と被 検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比較する工程と 、を含むことを特徴とする。
[0081] 被検化合物としては、特に制限はなぐ例えば、タンパク質、ペプチド、非ペプチド 性化合物、人工的に合成された化合物が挙げられる。 [0082] また、 GPR103遺伝子を発現する細胞は、当業者が公知の方法で調製すればよく 、具体的な方法としては特に制限はないが、例えば以下の方法によることができる。 すなわち、本発明の配列番号 1に記載の塩基配列を有する核酸又はその一部から なる核酸を好適なプロモーター及び転写調節エレメントを含む発現ベクターにクロー ユングし、クローユングされた核酸を有するベクターを宿主細胞に導入することにより 調製する。ここで、前記ベクターとしては、発現ベクターとして利用可能なものであれ ば特に限定されないが、例えば、 pcDNA3. 1、 pBlueBacHis2、 pCI— neo、 pcD NAI、 pMClneo、 pXTl、 pSG5、 pEFlZV5— HisB、 pCR2. 1、 pETl l、 gtl 1又は pCR3. 1が挙げられる。
[0083] 次に、本発明の核酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に導入する。かかる宿 主細胞としては、遺伝子の発現に通常使用されるものであれば特に限定されず、動 物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物のいずれであってもよぐ具体的には、例えば 、 COSl、 COS7、 CHO、 NIH/3T3, 293、 Raji、 CV11、 C1271、 MRC— 5、 C PAE、 HeLa、 293T又は Sf9が挙げられる。また、発現ベクターを宿主細胞に導入 する方法としては、公知の方法であれば特に限定されないが、具体的には、例えば、 エレクト口ポレーシヨン、リン酸カルシウム法、 DEAE—デキストラン法、リポフエクショ ン法又は遺伝子銃が挙げられる。
[0084] 次に、このようにして調製した GPR103を発現する細胞に被検化合物を接触させる 。接触させる方法としては特に制限はなぐ例えば、水溶液や緩衝液のような溶液中 で接触させる方法が挙げられる。
[0085] 細胞表面に発現した受容体と被検化合物との結合は、例えば、結合した化合物に 付された標識による検出 (例えば、結合量を放射活性や蛍光強度により検出する)の ほか、被検化合物の細胞表面上の前記受容体への結合による細胞内へのシグナル 伝達、例えば、 Gタンパク質の活性化、カルシウムイオン (Ca2+)又は cAMPの濃度 変化、ホスホリパーゼ Cの活性化、 pHの変化、受容体のインターナリゼーシヨンなど を指標に検出することができる。
[0086] また、前記シグナル伝達によって生じたシグナル伝達上の分子の発現レベルゃ活 性を指標にすることもできる。ここで、当該発現レベルを指標とする場合、発現レベル の測定法は特に制限されないが、例えば、ノーザンブロッテイング、ウェスタンブロッ ティング又は DNAチップが挙げられる。ここで、本発明における「発現レベル」とは、 発現の検出対象が核酸の場合、 GPR103タンパク質を介した情報伝達経路上に存 在するタンパク質をコードする遺伝子及びその転写産物の絶対量又は相対量をいう 。また、発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、 GPR103タン パク質を介した情報伝達経路上に存在するタンパク質をコードする遺伝子の翻訳産 物の絶対量又は相対量をいう。また、シグナル伝達上の分子の活性を指標にする場 合、活性測定方法は特に制限されず、測定の対象となる分子の種類によって好適な 方法を選択すればよい。
[0087] 一方、単離された GPR103タンパク質をィ匕合物の評価に直接使用することもできる 。すなわち、被検化合物を GPR103タンパク質に接触させ、次に、接触によって生じ た GPR103タンパク質の活性の変化を検出する方法である。
[0088] 力かる接触の方法としては特に制限はなぐ具体的には、例えば、緩衝液 (リン酸緩 衝液等)等の溶液中で混合することにより接触させる方法や、 GPR103タンパク質を メンブレン上に固定し、メンブレン上で被検化合物と接触させる方法が挙げられる。
[0089] 次に、接触によって生じた GPR103タンパク質の活性の変化を検出する。タンパク 質の活性測定方法としては、使用するタンパク質の性質により適宜設定すればよぐ 具体的には、例えば、 GPR103タンパク質に対するリガンド (例えば、 QRFP)の結合 活性を指標にする方法が挙げられる。
[0090] 前記のリガンドの結合活性を指標にする方法としては特に制限はな 、が、具体的に は、例えば、 GPR103タンパク質が固定されたメンブレンに対する被検化合物の親 和性を測定することによって結合活性を測定する方法が挙げられる。ここで用いられ る化合物は、検出が容易なように放射性同位体等で標識されていてもよい。また、前 記結合活性の検出方法として、被検化合物と競合して GPR103タンパク質へ結合す る放射性同位体で標識したリガンドを検出する方法も挙げられ、係る方法を用いた場 合には、被検化合物の標識は不要である。
[0091] 以上のように、本発明の化合物の評価方法により化合物を検出した結果、被検化 合物の存在下におけるリガンドの結合活性力 被検化合物の非存在下における結合 活性 (対照)より低い値を示した場合には、当該被検化合物は、本発明に係る GPR1 03タンパク質とリガンドとの結合を阻害する活性を有すると判定される。このようなィ匕 合物は、前記受容体に結合して細胞内へのシグナル伝達を誘導する活性を有する 化合物 (ァゴ二スト)及び当該活性を有しな 、化合物 (アンタゴニスト)等が含まれる。 ァゴ-ストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログと同様の生理活性を有 しており、一方、アンタゴニストは、前記受容体に対するリガンド及びそのアナログが 有する生理活性を抑制する。このため、これらァゴニストやアンタゴ-ストは、本発明 に係る GPR103タンパク質を介したシグナル伝達系の異常などに起因する疾患の治 療などのための医薬組成物として有用である。
また、本発明の化合物の評価方法により、 GPR103タンパク質への被検化合物結 合後の細胞内シグナル伝達を促進又は阻害する物質のスクリーニングを行うことがで きる。すなわち、上述した方法によって複数の被検化合物を評価することにより、ァゴ 二スト又はアンタゴ-ストとして機能する化合物を選択することができる。かかる選択 の結果、被検化合物非存在下にお 、てリガンド及びそのアナログを作用させた場合 の細胞内シグナル伝達の変化と比較して、その変化が抑制されれば、当該被検化合 物は、本発明に係る GPR103への被検化合物結合後の細胞内シグナル伝達を阻害 する化合物であると判定される。逆に、被検化合物が細胞内シグナル伝達を増強さ せれば、当該化合物は、本発明に係る GPR103への被検化合物結合後の細胞内シ グナル伝達を促進する化合物であると判定される。このようなスクリーニング方法によ つて選択された化合物を医薬品として使用する場合には、 GPR103及びそのリガン ドが関与する各種疾患、例えば狭心症、急性 ·うつ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、 腎臓病、電解質異常、血管れん縮等の循環器系疾患、例えば過食症、拒食症、うつ 病、不安、痙攣、てんかん、痴呆、痛み、アルコール依存症、薬物の断薬に伴う禁断 症状、概日リズムの変調、統合失調症、記憶障害、睡眠障害、認知障害等の神経系 疾患、例えば肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝等の代謝性疾患、 不妊、早産、性機能障害等の生殖系疾患、消化管系疾患、呼吸器系疾患、炎症性 疾患、高コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症又は緑内障等の予防又は治 療に有用であると考えられる。 [0093] また、上述した本発明の化合物の評価方法により、 PET(positron emission to mography)に用いるリガンドの評価を行うことができる。 PETは、水、酸素、ブドウ糖 、アミノ酸といった生体内に存在する物質あるいは目的とする受容体に対するリガンド を放射線標識して体内に投与することにより、非侵襲的に生体機能を観察する方法 であり、研究や臨床において利用されている。 PETの特徴は、トレーサーとして用い るリガンドに依存した機能特異的なイメージングを可能にする点にあり、新たなトレー サ一の開発は未知の生体機能の解明や疾患の診断に不可欠である。本発明の化合 物の評価方法によれば、被検化合物として PETリガンド候補物質を適用することによ り、当該物質のインビト口での評価を行うことが可能となる。
[0094] (2)ハイブリダィゼーシヨンに用いるプローブ
本発明の核酸の一部、又は全部力もなる核酸をノヽイブリダィゼーシヨン用のプロ一 ブとして使用することにより、 GPR103遺伝子を検出することが可能である。かかる検 出としては、生体由来の組織や細胞を被検体とした GPR103遺伝子の検出のみなら ず、 GPR103遺伝子又は当該遺伝子と相同性の高い遺伝子のクローユング等にも 応用可能である。また、前記核酸をプローブとして使用し、種々の組織における遺伝 子発現を調べることにより、遺伝子発現の分布を同定することも可能である。
[0095] 前記核酸をプローブとして使用する場合、ハイブリダィゼーシヨンの方法としては特 に制限はなぐ例えば、サザンノヽイブリダィゼーシヨン、ノザンノヽイブリダィゼーシヨン、 コロニーノヽイブリダィゼーシヨン、ドットノヽイブリダィゼーシヨン、 Fluorescence in si tu hybridization (FISH)、 in situ hybridization (ISH)、 DNAチップ法が挙 げられる。
[0096] 前記核酸をノ、イブリダィゼーシヨン用のプローブとして使用する場合、少なくとも連 続する 20塩基の長さの核酸が必要であり、好ましくは 40塩基、さらに好ましくは 60塩 基、特に好ましくは 80塩基以上のものが使用される。また、当該プローブは、必要に 応じて検出可能なように標識して用いてもよい。具体的には、例えば、 32P、 14c、 125ι 、 3H、 35S等の放射性同位体で標識されていてもよぐピオチン、蛍光色素、酵素、金 コロイド等で標識されて 、てもよ 、。
[0097] また、前記核酸をノ、イブリダィゼーシヨン用のプローブとして使用する場合のハイブ リダィゼーシヨンの条件としては、プローブの長さやハイブリダィゼーシヨンの対象とな る遺伝子の種類に応じて当業者が適宜選択すればよいが、例えば、 Molecular C1 oning :A Laboratory Manual、第 2版、コールドスプリングハーバー（1989)、 9 . 47- 9. 62及び 11. 45 - 11. 61を参照して行うこと力 Sできる。より具体的には、約 450G【こて 6. 0 X SSCでノヽイブリダィゼーシヨンを行った後【こ、 50oG【こて 2. 0 X SSC で洗浄する条件が挙げられる。ストリンジエンシー選択のため、洗浄工程における塩 濃度を、例えば低ストリンジエンシーとしての約 2. 0 X SSC、 50°Cから、高ストリンジ エンシーとしての約 0. 2 X SSC、 50°Cまで選択することができる。さらに、洗浄工程 の温度を低ストリンジエンシー条件の室温、約 22°Cから、高ストリンジエンシー条件の 約 65°Cまで増大させることができる。
[0098] (3) PCRに使用するプライマー
GPR103遺伝子を検出する方法として、本発明の配列番号 1に記載の塩基配列の 一部をプライマーとして使用した Polymerase Chain Reaction (PCR)法を挙げ ることがでさる。
[0099] このようなプライマーの長さは、その塩基配列や単離する遺伝子の塩基配列等によ つて適宜設定することができる力 一般に、連続した 10〜60塩基であることが好まし く、 15〜30塩基であることがより好ましい。
[0100] 最後に、本発明の GPR103リガンド（QRFP :pyroglutamylated arginine— phe nylalanine― amide peptide)につ!/、て説明する。
[0101] 本発明の GPR103リガンド遺伝子（preproP518ZQRFP) (配列番号 5)は、 408 塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号 5に記載の核酸における 37〜444 番目）を有し、 136アミノ酸力もなるタンパク質 (配列番号 6)をコードする。
[0102] サル GPR103リガンド遺伝子のクローユング方法としては特に制限はないが、具体 的には、例えば、サル GPR103リガンド遺伝子又は当該遺伝子に相同性の高い遺 伝子由来の核酸配列情報をもとに 5'—RACE又は 3'— RACEで全長 cDN Aを増 幅する方法、適切なベクター（プラスミドベクター、ノ クテリオファージ等）を用いて構 築された cDNAライブラリーをサル GPR103リガンド遺伝子の核酸断片を用いてスク リーニングする方法が挙げられる。 [0103] また、サル GPR103リガンド遺伝子とヒト GPR103リガンド遺伝子との間の相同性は 、コーディング領域において約 92%であり、 32塩基が相違する。本発明の核酸には 、配列番号 5に記載の塩基配列のうち、 1又は 2以上の塩基において置換、欠失、挿 入、付加があるものも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、 1 〜31塩基であることが好ましぐ 1〜20塩基であることがより好ましぐ 1〜10塩基で あることがさらに好ましぐ 1〜5塩基であることが特に好ましぐ 1〜3塩基であることが さらに好ましい。また、このような核酸は、その相同性に基づけば、配列番号 5に記載 の塩基配列との相同性が 93%以上であることが好ましぐ 95%以上であることがより 好ましい。また、このような核酸は、生物学的に活性を有するタンパク質をコードする ことが好ましぐ GPR103リガンドとしての活性を有するタンパク質をコードすることが より好まし 、。
[0104] ここで、このような核酸は、本発明に係る配列番号 5に記載の塩基配列を含む核酸 とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸を単離することにより得ることがで きる。また、その核酸の由来となる動物種としては特に限定されないが、具体的には、 例えば、ヒト以外の霊長類由来の GPR103リガンド遺伝子であることが好ましぐより 具体的には、例えば、ァカゲザル、力-クイザル、二ホンザル、リスザル、ミドリザル、 ァヌビスヒヒ又はコモンマーモセットの GPR103リガンド遺伝子が挙げられる。
[0105] また、サル GPR103リガンドとヒト GPR103リガンド（配列番号 11)との間のアミノ酸 レベルでの相同性は 87. 5%であり、 17アミノ酸が相違する。本発明のタンパク質に は、配列番号 6の 1又は 2以上のアミノ酸において、置換、欠失、挿入、付加があるも のも含まれる。かかる置換、欠失、挿入、付加の塩基数としては、 1〜16アミノ酸であ ることが好ましぐ 1〜： LOアミノ酸であることがより好ましぐ 1〜5アミノ酸であることがさ らに好ましぐ 1〜3アミノ酸であることが特に好ましい。また、このようなタンパク質は、 その相同性に基づけば、配列番号 6に記載のアミノ酸配列との相同性が 88%以上で あることが好ましぐ 90%以上であることがより好ましぐ 95%以上であることがさらに 好ましぐ 98%以上であることが特に好ましい。また、このようなタンパク質は、生物学 的に活性であることが好ましぐ GPR103リガンドとしての活性を有することがより好ま しい。 [0106] サル GPR103の調製方法としては特に制限はないが、具体的には、例えば、単離 したサル GPR103遺伝子を発現ベクターに導入し、動物細胞、昆虫細胞又は大腸 菌等の宿主細胞に導入して組換えタンパク質を発現させた後、精製する方法が挙げ られる。
[0107] また、本発明は、配列番号 6に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変 異体を含む。前記変異体としては、配列番号 6に記載のアミノ酸配列において、 1又 は 2以上であり且つ 16以下のアミノ酸が置換、欠失しているタンパク質や、 1又は 2以 上のアミノ酸の付加、挿入があるタンパク質が挙げられる。このような変異タンパク質 は、生物学的に活性であることが好ましぐ GPR103リガンドとしての活性 (例えば、 G タンパク質共役型レセプターに対する結合能）を有することがより好ましい。
[0108] 又、本発明は、配列番号 49又は 50に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質を含 む。当該タンパク質は、前記の方法でタンパク質をコードする核酸を単離し、宿主細 胞において発現させることによって精製してもよぐまた、市販のペプチド合成機を用 いて合成してもよい。
[0109] また、本発明は、配列番号 6に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質又はその変 異体、及び配列番号 49又は 50に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質に対する抗 体を含む。当該抗体は、本発明の GPR103リガンドタンパク質又はその一部のぺプ チドを抗原として調製することができ、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の V、ずれであってもよ 、。当該抗体はェピトープとなるアミノ酸配列によってサル GPR1 03リガンドのみならず、異なった動物種の GPR103リガンドにも反応する場合がある 力 サル GPR103リガンドにのみ選択性を有する抗体を調製する場合には、サルと 異動物種の GPR103にお 、て相同性の低 ヽ領域をペプチド抗原として使用してモノ クローナル抗体を調製することにより、所望の特異性を有する抗体を調製することが できる。
[0110] 本発明のサル GPR103リガンドにより、例えば、生体内において GPR103の発現 が減少しているような疾患において、当該リガンドを投与して GPR103タンパク質の 正常な機能を回復させることが可能となる。
[0111] 本発明のサル GPR103リガンドを医薬として使用する場合には、 GPR103が関与 する各種疾患、例えば狭心症、急性 ·うつ血性心不全、心筋梗塞、高血圧、腎臓病、 電解質異常、血管れん縮等の循環器系疾患、例えば過食症、拒食症、うつ病、不安 、痙攣、てんかん、痴呆、痛み、アルコール依存症、薬物の断薬に伴う禁断症状、概 日リズムの変調、統合失調症、記憶障害、睡眠障害、認知障害等の神経系疾患、例 えば肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、痛風、脂肪肝等の代謝性疾患、不妊、早 産、性機能障害等の生殖系疾患、消化管系疾患、呼吸器系疾患、炎症性疾患、高 コレステロール血症、高脂血症、動脈硬化症又は緑内障等の予防又は治療に有用 であると考えられる。
実施例
[0112] 以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施 例に限定されるものではない。
[0113] ¾細
(ァカゲザル GPR103遺伝子の単離）
ヒト GPR103遺伝子（GenBank accession No. BD270051)の 5，及び 3，非翻 訳領域の塩基配列に基づ!ヽて hBG29F2 (配列番号 15)及び hBG29Rl (配列番号 16)の 2本のオリゴ DNAプライマーを設計した。
[0114] ァカゲザルの脳組織からファストトラック 2. OmRNA分離キット（インビトロジェン社） を用いて mRNAを精製し、スーパースクリプト IIIファーストストランド合成システム (ィ ンビトロジェン社）を用いて cDNAの合成を行い、その cDNAを铸型にして、これらの プライマーを用い、 94°C10秒間（変性反応) /60°C 30秒間（アニーリング) /68°C 1分 30秒間（伸長反応）のサイクルを 40回繰り返し、 PCR反応を行った。得られた P CR増幅産物を制限酵素 BamHI及び Notlで消化し、 pEFlZV5— HisBプラスミド ベクター（インビトロジェン社）にクローユングした。
[0115] 独立した 5つの PCR反応より得られたクローンから 5クローンを無作為に選び、 T7、 BGHreverse、 monBG29— 1、 monBG29— 2、 monBG29— 3、 monBG29— 4、 monBG29— 5、 monBG29— 6、 monBG29— 21、 monBG29— 31の 10本のプラ イマ一（配列番号 17〜26)を用いてダイターミネータ一法により塩基配列を決定した 。これら 5クローンの塩基配列の比較により、ァカゲザル GPR103遺伝子の塩基配列 が明らかとなった。
[0116] ァカゲザル GPR103遺伝子は、 1128塩基のオープンリーディングフレーム（配列 番号 1に記載の塩基配列にぉ 、て 105番目力も 1397番目）を有する。各々のォー プンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列 (431残基)を配列番号 2に示 す。
[0117] ァカゲザル GPR103とヒト GPR103のアミノ酸配列（GenPept accession No. B AC98938)と比較したところ、 98% (431残基中 423残基が同一）の非常に高い同 一性を示し、クローユングした遺伝子の塩基配列はァカゲザルの GPR103受容体を コードして 、ることが確認できた。
[0118] また、ヒト GPR103遺伝子について発現部位を検討した結果、視床下部、橋 (Pon) に強 、発現が見られ、脳のその他の部位につ!、ても比較的強!、発現が見られた。
[0119] ヒト GPR103 (配列番号 7)、サル GPR103 (配列番号 2)、マウス GPR103 (配列番 号 8)、ラット GPR103 (配列番号 9)、マウス GPR103b (配列番号 10)、ラット GPR10 3b (配列番号 4)のアミノ酸配列を比較した図を図 1に示す。
[0120] また、以下に、本実施例において使用したプライマーの塩基配列を示す。
hBG29F2 : ATAGGATCCTCCCGCGCGGCTGACTCCAGAGTA (配列番号 15) hBG29Rl： ACAGCGGCCGCTCTTTGGGTTACAATCTGAAGGGC (配列番号 1 6)
T7： TAATACGACTCACTATAGGG (配列番号 17)
BGHreverse： GGAGCTGACACGGAAGAT (配列番号 18)
monBG29- 1 : GGGAGCAGTTCATCGCT (配列番号 19)
monBG29- 2 : CTCGTGCTCACCGGCGTGCT (配列番号 20)
monBG29- 3 : CAGTCATCGTAGGATCACC (配列番号 21)
monBG29- 4 : TTCTCCTCTGTCTGTTCACA (配列番号 22)
monBG29- 5 : AATGACAGCTCGTTTCTTCT (配列番号 23)
monBG29- 6 : CAATGCAGGTCATAGTGAGG (配列番号 24)
monBG29- - 21 ： AGCACGCCGGTGAGCACGAG (配列番号 25)
monBG29- 31 ： GGTGATCCTACGATGACTG (配列番号 26) [0121] 実施例 2
(ァカゲザル preproQRFP遺伝子の単離）
ヒト preproQRFP遺伝子（GenBank accession No. NT— 035014)の 5 '及び 3 '非翻訳領域の塩基配列に基づ!/、て hQRFPF2 (配列番号 27)及び hQRFPRl ( 配列番号 28)の 2本のオリゴ DNAプライマーを設計した。
[0122] ァカゲザルの脳組織からファストトラック 2. OmRNA分離キット（インビトロジェン社） を用いて mRNAを精製し、スーパースクリプト IIIファーストストランド合成システム (ィ ンビトロジェン社）を用いて cDNAの合成を行い、その cDNAを铸型にして、これらの プライマーを用い、 94°C10秒間（変性反応) Z60°C30秒間（アニーリング) /68°C1 分 30秒間（伸長反応）のサイクルを 40回繰り返し、 PCR反応を行った。得られた PC R増幅産物を制限酵素 BamHI及び Notlで消化し、 pEFlZV5— HisBプラスミドべ クタ一 (インビトロジェン社）にクローユングした。独立した 8つの PCR反応より得られた クローンから 8クローンを無作為に選び、 T7、 BGHreverse、 hQRFP— 1、 hQRFP 2の 4本のプライマー（配列番号 29〜32)を用いてダイターミネータ一法により塩基 配列を決定した。これら 5クローンの塩基配列の比較により、ァカゲザル preproQRF P遺伝子の塩基配列が明ら力となった。
[0123] ァカゲザル preproQRFP遺伝子は、 408塩基のオープンリーディングフレーム（37 番目力ら 444番目 )を有する。各々のオープンリーディングフレームから予測されるァ ミノ酸配列（ 136残基)を配列番号 6に示す。
[0124] ァカゲザル preproQRFPとヒト preproQRFPのアミノ酸配列（GenPept accessio n No. BAC98934)と比較したところ、 87% (136残基中 119残基が同一）の非常 に高い同一性を示し、クローユングした遺伝子の塩基配列はァカゲザルの preproQ RFPをコードして 、ることが確認できた。
[0125] サル preproQRFP (配列番号 6)、ヒト preproQRFP (配列番号 11)、マウス prepro QRFP (配列番号 12)、ラット preproQRFP (配列番号 13)、ゥシ preproQRFP (配 列番号 14)のアミノ酸配列を比較した図を図 2に示す。
[0126] また、以下に、本実施例において使用したプライマーの塩基配列を示す。
hQRFPF2： ATAGGATCCTTGGTGAGTTGCGCTTGGCCACGTGTG (配列番号 27) 番号 28)
T7： TAATACGACTCACTATAGGG (配列番号 29)
BGHreverse： GGAGCTGACACGGAAGAT (配列番号 30)
hQRFP- 1： CATGCTGGCTGCAGATTCCG (配列番号 31)
hQRFP- 2： TCACTGCCTTCGTCCTGCCT (配列番号 32)。
[0127] 実施例 3
(ァカゲザル GPR103遺伝子発現 293T細胞における細胞内カルシウムイオン濃度 上昇活性の検出）
6cm培養シャーレに 1 X 106個の 293T細胞を播種し、 24時間後に実施例 1で得ら れたァ力ゲザル GPR103遺伝子を保持した pEFlZV5— HisBプラスミドベクター及 びインサートを持たない同ベクター（mock)を、リポフエクトァミン 2000 (インビトロジェ ン社）を用いてトランスフエクシヨンした。また、比較のために既知のヒト GPR103cDN Aを持つ同ベクターをトランスフエクシヨンした細胞も用意した。
[0128] それぞれの細胞を 24時間培養後、 96— wellのポリ—D—リジン塗布済み黒色培 養プレート（ベタトンデッキンソン社）に 3 X 104cellsZwellの細胞数で播種し、ー晚 培養した。細胞の培地を除去し、 10%Fetal bovine serum (ハイクローン社）を 含む DMEM (インビトロジェン社）に 4 μ Μの Fluo4— AM (Morecular Probes社） 及び 0. 04%Pluronic acid (Morecular Probes社）を添カ卩したものをカ卩え、 37°C で 1時間インキュベーションした。 Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)に 20mMの HEPES (pH7. 4、インビトロジェン社）、 0. 5%ゥシ血清アルブミン（シグマ 社)を添カ卩したものをアツセィバッファ一として用意した。細胞をアツセィバッファーで 洗浄して過剰な Fluo4を除去し、 FLIPR (モレキュラーデバイス社）にセットした。アツ セィバッファーに溶解した各種濃度のヒト QRFP43 (配列番号 51)も同じく FLIPRに セットした後、サンプルを細胞に添加し、励起光の照射によって発生する細胞内カル シゥムイオン濃度に依存した蛍光量の変化を測定した。
[0129] ヒト QRFP43によってペプチド添加直前の蛍光量と添加後の最大値の差を蛍光変 化量とし、 Prism Version 4. 00 (グラフパッド社）を用いて各種濃度のペプチドに よる蛍光変化量をグラフ化し、 50%有効濃度を求めた（図 3)。
[0130] その結果、ヒト QRFP43は濃度依存的にァカゲザル GPR103遺伝子発現 293T細 胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが示され、その 50%有効濃度は 3 9nMであった。また、同時に観測したヒト GPR103発現細胞におけるヒト QRFP43の 細胞内カルシウム濃度上昇活性の 50%有効濃度は 97nMであった。一方、 mockベ クタ一をトランスフエタトした細胞ではヒト QRFP43による細胞内カルシウムイオン濃度 の変化は見られな力つた。
[0131] このように、ァカゲザル GPR103は既知のヒト GPR103と同様に QRFP受容体とし ての特性を示すことが明らかとなった。
[0132] ¾細14
(ラット GPR103遺伝子と相同性を持つ遺伝子の単離）
ラット GPR103遺伝子（GenBank accession No. NM— 198199)の塩基配列 をクエリーとして Blastアルゴリズムを用いてセレーラ社提供のラットゲノムデータべ一 スに対して相同性検索を行ったところ、ラット GPR103遺伝子と相同性を持つ遺伝子 配列を見出し、 GPR103bと命名した。
[0133] セレーラ社データベース由来の配列を基に、 rBG29LFl (配列番号 33)及び rBG 29LR4 (配列番号 34)の 2本のオリゴ DNAプライマーを設計した。ラットの視床下部 組織からファストトラック 2. OmRNA分離キット（Invitrogen社）を用いて mRNAを精 製し、スーパースクリプト ΠΙファーストストランド合成システム（Invitrogen社）を用いて cDNAの合成を行った。
[0134] 次に、その cDNAを铸型にして、これらのプライマーを用い、 94°C10秒間（変性反 応） Z68°C1分 30秒間（アニーリング及び伸長反応）のサイクルを 40回繰り返し、 PC R反応を行った。得られた PCR増幅産物を制限酵素 BamHI及び Notlで消化し、 pE Fl/V5—HisBプラスミドベクター（Invitrogen社）にクローユングした。
[0135] 独立した 4つの PCR反応より得られたクローンから 4クローンを無作為に選び、 T7、 BGHreverse、 rQRFP2R— 1、 rQRFP2R— 2、 rQRFP2R— 3、 rQRFP2R— 4、 r QRFP2R— 5、rQRFP2R— 6の 8本のプライマー（配列番号 35〜42)を用いてダイ ターミネータ一法により塩基配列を決定した。
[0136] これら 4クローンの塩基配列の比較によって得られたコンセンサス配列は 100%セ レーラ社提供のデータベース由来配列と同一であった。
[0137] ラット GPR103b遺伝子は、 1245塩基のオープンリーディングフレーム（1番目から
1245番目）を有する。そのオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列
(415残基)を配列番号 4に示す。
[0138] ラット GPR103b遺伝子のアミノ酸配列とヒト GPR103 (GenPept accession No
. BAC98938)と比較したところ、 83%の高い同一性を示し、ラット GPR103bは P5
18ZQRFPの受容体であることを確認した（図 1)。また、既知の配列を持つマウス T
GR346b (GenPept accession No. CAD82895)は、ラット GPR103bとアミノ酸 配列が 94%の高い相同性 (416残基中 392残基が同一）を有し、ラット GPR103b同 様に QRFPの受容体であることが確認できた。
[0139] 以下に、使用したプライマーの塩基配列を示す。
rBG29LFl： ATAGGATCCGGTCAAGGCGCCTACCGAACCCAGCATG (配列番 号 33)
rBG29LR4 : ACAGCGGCCGCAACAGGTCCTCATTCTGAAGACAC (配列番号 3 4)
T7： TAATACGACT CACTATAGGG (配列番号 35)
BGHreverse： GGAGCTGACACGGAAGAT (配列番号 36)
rQRFP2R- 1 : TCACCTTCTTCTGCATTCCC (配列番号 37)
rQRFP2R- 2 : AAAATCTACACCACCTTCAT (配列番号 38)
rQRFP2R- 3 : GCATGGAAGCTTGGGAGCCA (配列番号 39)
rQRFP2R- 4 : CCCCCAAATGCTTCCCCTTT (配列番号 40)
rQRFP2R- 5 : AGCTCATAACCGATTTTCCC (配列番号 41)
rQRFP2R- 6 : ATGAGCAGGTCGCTGAGTGCCA (配列番号 42)。
実施例 5
(ラット GPR103b遺伝子発現 293T細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇 活性の検出） 6cm培養シャーレに 1 X 106個の 293T細胞を播種し、 24時間後に実施例 4で得ら れたラット GPR103b遺伝子を保持した pEFlZV5— HisBプラスミドベクター及びィ ンサートを持たない同ベクター（mock)をリポフエクトァミン 2000 (インビトロジェン社） を用いてトランスフエクシヨンした。また、マウス GPR103b (図 1に示すように、ラット G PR103bと高い相同性を有する） cDNAを持つ同ベクターをトランスフエクシヨンした 細胞も用意した。
[0141] 24時間培養後、 96— wellのポリ—D—リジン塗布済み黒色培養プレート（ベタトン デッキンソン社）に 3 X 104cellsZwellの細胞数で播種し、ー晚培養した。細胞の培 地を除去し、 10%Fetal bovine serum (ノヽイクローン社）を含む DMEM (インビト ロジェン社）に 4 μ Μの Fluo4— AM (Morecular Probes社）及び 0. 04%Pluroni c acid (Morecular Probes社）を添カ卩したものを加え、 37°Cで 1時間インキュベー シヨンした。 Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)に 20mMの HEPES (p H7. 4、 インビトロジェン社）、 0. 5%ゥシ血清アルブミン（シグマ社）を添カ卩したもの をアツセィバッファ一として用意した。細胞をアツセィバッファーで洗浄して過剰な Flu o4を除去し、 FLIPR (モレキュラーデバイス社）にセットした。アツセィバッファーに溶 解した各種濃度のヒト QRFP43 (配列番号 51)も同じく FLIPRにセットした後、サンプ ルを細胞に添加し、励起光の照射によって発生する細胞内カルシウムイオン濃度に 依存した蛍光量の変化を測定した。
[0142] ヒト QRFP43によってペプチド添加直前の蛍光量と添加後の最大値の差を蛍光変 化量とし、 Prism Version 4. 00 (グラフパッド社）を用いて各種濃度のペプチドに よる蛍光変化量をグラフ化し、 50%有効濃度を求めた（図 4)。
[0143] その結果、ヒト QRFP43は濃度依存的にラット GPR103b遺伝子発現 293T細胞の 細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが示され、その 50%有効濃度は 217η Μであった。また、同時に観測したマウス GPR103b発現細胞におけるヒト QRFP43 の細胞内カルシウム濃度上昇活性の 50%有効濃度は 76nMであった。一方、 mock ベクターをトランスフエタトした細胞ではヒト QRFP43による細胞内カルシウムイオン濃 度の変化は見られなかった。このように、ラット GPR103b及びマウス GPR103bは Q RFP受容体としての特性を示すことが明らかとなつた。 [0144] 実施例 6
(サル QRFP43及び QRFP26の合成）
公知の事実より preproQRFPはプロセシング受け、その C—末端がアミド化され、 N 末端がピロダルタミル化されることが知られて 、る。サル preproQRFPも他の種の QRFPに相当する位置でプロセシングを受けることが予想される。配列番号 6で示さ れるサル preproQRFPがプロセシングを受けて生成されるペプチドをサル QRFP43 とする（配列番号 49)。また、ヒト QRFPの C 末端から 26アミノ酸に相当する部分の みで GPR103に対する十分なァゴ-スト活性を有することが知られている。サル QR FPにお 、ても C 末端から 26アミノ酸に相当する部分で十分なァゴニスト活性を発 揮できることが予想され、それに相当するペプチドをサル QRFP26とする（配列番号 50)。
[0145] 前記サル QRFP43及び QRFP26の合成は、それぞれ Novabuochem社より販売 されている、 NovaSyn (登録商標） TGR resinを出発原料とし、 Pioneer™ペプチド 合成機を用いて HATUを縮合試薬とした Fmoc法によって縮合し、得た resinに TF A/thioanisole/ethandithiol/m - cresol ( 95/2. 5/1. 5ZDを加え室温で 1時間 30分振盪した後、榭脂をろ過除去した。このろ液に冷却したエーテルを加え、 粗 Pyr - Asp - Glu - Gly— Ser— Glu - Ala - Asp - Asp - Phe - Leu - Pro - Al a— Gly— Gly— Val— Lys— Ala— Ser— Gly— Pro— Leu— Gly— Asn— Leu— A la— Glu— Glu— Leu— Asn— Gly— Tyr— ¾er— Arg— Lys— Lys— Gly— Lrly— Phe - S er - Phe - Arg - Phe - NHを（QRFP43)、及び粗 Ala— Ser— Gly— Pr
2
o— Leu— Gly— Asn— Leu— Ala— Glu— Glu— Leu— Asn— Gly— Tyr— Ser— Arg - Lys - Lys - Gly - Gly - Phe -Ser- Phe - Arg - Phe - NH (QRFP26)
2
を沈殿として得た。さらに、粗ペプチドを YMC— Pack ODS— AQ、 S— 5、 120A カラム（20 X 250mm)を用いた逆相分取 HPLC (A液： 0. 1%TFA水、 B液： 0. 1% TF Aァセトニトリル、 A/B : 95/5— 2min、 73 27〜58 42— 15min直線型濃 度勾配溶出、流速 lOmlZmin)で精製し目的物を含む分画を回収、凍結乾燥する ことにより目的物を得た。
[0146] 実施例 7 (サル QRFP43又は QRFP26刺激によるサル GPR103又はヒト GPR103遺伝子発 現 CHO細胞における細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性の検出）
実施例 1で得られたサル GPR103遺伝子又はヒト GPR103遺伝子を保持した pEF lZV5—HisBプラスミドベクター及びインサートを持たない同ベクター（mock)を、 C HO細胞にトランスフエクシヨンし、その培地に最終濃度が 2mgZmlなるように Genet icin (インビトロジェン社)を添加し発現細胞を選択した。その後、サル又はヒト GPR1 03遺伝子発現細胞については限界希釈法にて単一クローン化し、以下の試験に供 した。また実施例 6で示された方法で合成されたサル QRFP43及び QRFP26を以 下の試験に供した。
[0147] それぞれの細胞を 24時間培養後、 96— wellのポリ—D—リジン塗布済み黒色培 養プレート（ベタトンデッキンソン社）に 2. 5 X 104cellsZwellの細胞数で播種し、二 晚培養した。細胞の培地を除去し、 10%Fetal bovine serum (シグマ社）を含む DMEMZF— 12 (インビトロジェン社）に 4 μ Μの Fluo4— AM (Morecular Probe s社)、 0. 04%Pluronic acid (Morecular Probes社)及び 2. 5mMの Probenec id (シグマ社）を添カ卩したものをカ卩え、 37°Cで 1時間インキュベーションした。 Hank' s
Balanced Salt Solution (HBSS)に 20mMの HEPES (シグマ社）、 2. 5mM の Probenecid (シグマ社） 0. 5%ゥシ血清アルブミン（シグマ社）を添カ卩したものを p H7. 4に水酸ィ匕ナトリウム水溶液で調整しアツセィバッファ一として用意した。細胞を アツセィバッファーで洗浄して過剰な Fluo4を除去し、 FLIPR (モレキュラーデバイス 社）にセットした。アツセィバッファーに溶解した各種濃度のサル QRFP43又は QRF P26も同じく FLIPRにセットした後、サンプルを細胞に添加し、励起光の照射によつ て発生する細胞内カルシウムイオン濃度に依存した蛍光量の変化を測定した。
[0148] サル QRFP43又は QRFP26添加直前の蛍光量と添加後の最大値の差を蛍光変 化量とし、 Prism Version 4. 00 (グラフパッド社）を用いて各種濃度のペプチド（タ ンパク質）による蛍光変化量をグラフ化し、 50%有効濃度を求めた。
[0149] その結果、サル QRFP43は濃度依存的にサル又はヒト GPR103遺伝子発現 CHO 細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させることが示され、その 50%有効濃度 はそれぞれ 69nM、 58nMであった（図 5)。また、同時に測定したサル QRFP26の 細胞内カルシウム濃度上昇活性の 50%有効濃度はそれぞれサル GPR103遺伝子 発現 CHO細胞に対しては 9. 2nM、ヒト GPR103遺伝子発現 CHO細胞に対しては 1. 7nMであった（図 6)。一方、 mockベクターをトランスフエタトした細胞では各々の サル QRFPによる細胞内カルシウムイオン濃度の変化は見られな力つた（図 5及び図 6)。
[0150] このように、サル QRFP43及び QRFP26は GPR103のァゴ-ストとしての特性を示 すことが明らかとなった。
[0151] 実施例 8
(ラット及びマウスに対するヒト QRFP43の投与）
SDラット、 C57BLマウスに QRFPを投与した後、摂食量の測定をした。
[0152] SDラット（9— 12週齢）は麻酔下、第 3脳室にガイド力-ユーレ（26ゲージ）を挿入し
、歯科用レジンで固定した。ガイド力-ユーレの位置はブレダマ（bregma)より後方 2
. 2mm,正中線上、頭蓋表面より深さ 8mmとした。
[0153] C57BLマウス（9— 12週齢）は麻酔下、側脳室にガイド力-ユーレ（27ゲージ）を揷 入し、歯科用レジンで固定した。ガイド力-ユーレの位置は、ブレダマより後方 0. 4m m、右へ 0. 8mm、頭蓋表面より深さ lmmとした。
[0154] 2週間程度の回復期間をおいた後、マイクロシリンジに接続した内針 (33ゲージ)を ガイド力-ユーレに揷入し、人工脳脊髄液に溶解した QRFP (ラットは 100マイクログ ラム Zhead、マウスは 10又は 30マイクログラム Zhead、）を脳室内に投与し、 2時間 の摂食量を測定した。
[0155] 図 7はヒト QRFP43をラットに第 3脳室内投与した後、 2時間の摂食量を示し、図 8 はヒト QRFP43をマウスに側脳室内投与した後、 2時間の摂食量を示している。図 7 及び図 8に示すとおり、 QRFPを投与しな力つた動物と投与した動物を比較すると、 投与後の摂食量が有意に増加した。従って、 QRFPとその受容体である GPR103が 摂食量の調節に関与することが確認できた。なお、 QRFPの代わりに人工脳脊髄液（ aCSF)のみ投与した場合の摂食量をリファレンスとした。
[0156] ラットの試験には t—検定を使用し、有意差があると認められた (pく 0. 001)。マウ スの試験には ANOVA followed by BonferroniZDunを使用し、人工骨髄液 投与群と比較し QRFP投与の ヽずれの群も有意差を認めた (p< 0. 01)。
[0157] 実施例 9
(obZobマウスにおける GPR103及び QRFPの発現）
obZobマウス 14匹及び C57BLZ6Jマウス 10匹から各々、視床下部を摘出し、 IS OGEN (-ツボンジーン社）を用いトータル RNAを抽出し、 Reverse Transcriptio n Reagents (アプライドバイオシステムス社）を用いて cDN Aの合成を行った。 100 マイクロリットルの逆転写反応液にはランダムへキサマー及び 2マイクロリットルのトー タル RNAを含む。同時に逆転写酵素を除!ヽた他は逆転写反応液と同組成のネガテ イブコントローノレを用意した。
[0158] マウス GPR103及びマウス preproQRFPの mRNAの検出、定量は、リアルタイム 定量 PCR法にて行った（ABI PRISM 7900HT Sequence Detection Syst em (アプライドバイォシステムス社)を添付のマニュアルに従 、使用）。プライマー及 びプローブは以下のものを使用した。
mGPR103F： TCTTTGGCAACTCTCTGGTCATC (配列番号 43)
mGPR103R： CAGAAGAAGGCAATGAGCAGATC (配列番号 44)
mGPR103T:TGCGCACCGTCACCAACATCTTC (配列番号 45)
mQRFPF： TCTCCCTCTGAGTGCCTGCT (配列番号 46)
mQRFPR： GCCTGTGCTGTGGATTTTGA (配列番号 47)
mQRFPT： CAGACATCGGTGACATCGGAGCCA (配列番号 48)。
[0159] GPR103mRNAの定量には mGPR103F、 mGPR103Rの両プライマー及び FA Mで標識したプローブ mGPR103Tを使用した。また、 preproQRFP mRNAの定 量には mQRFPF、 mQRFPRの両プライマー及び FAMで標識した TaqManプロ一 ブ mQRFPTを使用した。内部標準として beta— actinを採用した（FEBS Lett. 2001 Sep 7 ; 505 ）：136— 40)。
[0160] TaqMan Universal PCR master mix (アプライドバイオシステムス社）を用い て各プライマーが 900nM、各 TaqManプローブが 250nM、 0. 25マイクロリットルの 上記で合成した cDNAを含む 10マイクロリットルの反応溶液を調製した。上記には b eta— actinを定量するための TaqManプローブとプライマーを含み、さらに GPR10 3又は preproQRFPを定量するための TaqManプローブとプライマーが含まれる。了 クチンに対する相対量は検量線を用いて算出した。
[0161] その結果、図 9及び図 10に示すとおり、正常なマウスである C57BLZ6Jと比較して obZobマウスの視床下部で GPR103及び preproQRFPの mRNAの発現の増加が 観察された。 obZobマウスはレブチン不全であり、肥満及び過食を呈することが広く 知られている。つまり、 GPR103及び preproQRFPの発現にレプチンが抑制的に働 くことが示唆された。また、 GPR103及び preproQRFPがレプチン不全による肥満、 過食の病態惹起に強く関与すると結論された。
産業上の利用可能性
[0162] 以上説明したように、本発明の GPR103及びこれを用いた化合物の評価方法によ れば、ヒト以外の霊長類及びラットの GPR103遺伝子及びタンパク質とこれらの配列 に関する情報を得ることが可能となり、ヒトの医薬を標的とした GPR103のモデルシス テムの構築が可能となる。また、本発明の化合物の評価方法によれば、 GPR103の 生理機能に関与する疾病に対して、治療薬や診断薬となる化合物の評価、開発が 可能とな
る。

Claims

請求の範囲
[I] 配列番号 1又は 3に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
[2] 配列番号 1又は 3に記載の塩基配列力 なる単離された核酸。
[3] 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質をコードする単離された 核酸。
[4] 配列番号 1に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズする核酸力もなるサル GPR103遺伝子。
[5] 配列番号 3に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズする核酸力もなるラット GPR103遺伝子。
[6] 請求項 1〜3のいずれか一項に記載の核酸又は請求項 4〜5のいずれか一項に記 載の遺伝子を含む発現ベクター。
[7] 請求項 6に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
[8] 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
[9] 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列力もなる単離されたタンパク質。
[10] 配列番号 2又は 4に記載のアミノ酸配列において 1又は 2以上のアミノ酸の置換、欠 失、付加又は挿入があるアミノ酸配列を含有し、 GPR103タンパク質の活性を有する 単離されたタンパク質。
[II] 請求項 8〜 10のいずれか一項に記載のタンパク質に対する抗体。
[12] GPR103遺伝子を導入し、 GPR103タンパク質を発現する細胞を調製する工程と 該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該 GPR103タンパク質に対する該被検化合物の特異的結合を検出する工程と、を 含むことを特徴とする化合物の評価方法。
[13] GPR103遺伝子を導入し、 GPR103タンパク質を発現する細胞を調製する工程と 該細胞に被検化合物を接触させる工程と、
該接触により生じた細胞内情報伝達物質の活性を測定する工程と、
該活性と被検化合物を接触させない場合の該細胞内情報伝達物質の活性とを比 較する工程と、を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
[14] 被検化合物を、 GPR103タンパク質に接触させる工程と、
該接触による該タンパク質の活性の変化を検出する工程と、を含むことを特徴とす る化合物の評価方法。
[15] 請求項 12〜 14のいずれか一項に記載の化合物の評価方法によって選択されたこ とを特徴とする化合物。
[16] 前記 GPR103がサル GPR103であることを特徴とする請求項 12〜14のいずれか 一項に記載の化合物の評価方法。
[17] 配列番号 5に記載の塩基配列を含む単離された核酸。
[18] 配列番号 5に記載の塩基配列からなる単離された核酸。
[19] 配列番号 5に記載の塩基配列を有する核酸とストリンジ ントな条件下でハイブリダ ィズする核酸カゝらなるサル QRFP遺伝子。
[20] 配列番号 6に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする単離された核酸。
[21] 配列番号 6に記載のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
[22] 配列番号 6に記載のアミノ酸配列力 なる単離されたタンパク質。
[23] 配列番号 6に記載のアミノ酸配列において 1又は 2以上のアミノ酸の置換、欠失、付 加又は挿入があるアミノ酸配列を含有し、 GPR103のリガンドタンパク質活性を有す る単離されたタンパク質。
[24] 配列番号 49又は 50に記載のアミノ酸配列力もなるタンパク質。
[25] 請求項 21〜24のいずれか一項に記載のタンパク質に対する抗体。
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