WO2005100391A1 - Diagnose entzündlicher darmerkrankungen, insbesondere colitis ulcerosa - Google Patents

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WO2005100391A1
WO2005100391A1 PCT/EP2005/003978 EP2005003978W WO2005100391A1 WO 2005100391 A1 WO2005100391 A1 WO 2005100391A1 EP 2005003978 W EP2005003978 W EP 2005003978W WO 2005100391 A1 WO2005100391 A1 WO 2005100391A1
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goblet cell
antigen
goblet
cell antigen
antibodies
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PCT/EP2005/003978
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Winfried STÖCKER
Swantje Köhler
Lars Komorowski
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Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag
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    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS

Definitions

  • the present invention relates to goblet cell antigen, a method for the detection of antibodies against goblet cell antigen, which is suitable for the diagnosis of inflammatory bowel diseases, especially ulcerative colitis, and a kit for the diagnosis of inflammatory bowel diseases, and monoclonal antibodies against goblet cell antigen.
  • a serological examination provides first indications of the presence and extent of inflammation.
  • an increase in the typical inflammation parameters such as blood sedimentation rate, C-reactive protein and leukocyte count, is found.
  • the clinical symptoms make it easy to diagnose an inflammatory bowel disease. It is important to differentiate IBD such as ulcerative colitis and Crohn's disease from other diseases with a similar clinical picture.
  • An infection with typical diarrhea pathogens pathogenic Escherichia coli, Salmonella etc. can be excluded by a bacteriological stool examination.
  • Celiac disease or sprue is also a chronic diarrhea. However, this is caused by an intolerance of the small intestine to the cereal protein gluten in combination with the enzyme transglutaminase and is characterized by an atrophy of the small intestinal mucosa. Because celiac disease sometimes causes symptoms of an inflammatory bowel disease but cannot be treated with medication, an accurate diagnosis is very important. In celiac disease, gluten works together with transglutaminase as an allergen, which triggers an antigen-antibody reaction that leads to the destruction of the small intestinal mucosa. With the help of a biopsy from the small intestine and a serological examination for autoantibodies against endomysium and gliadin by means of indirect immunofluorescence, a safe demarcation is possible.
  • Abdominal sonography is a relatively simple diagnostic measure. This method can be used to identify thickening of the intestinal wall and complications such as abscesses and fistulas (especially in Crohn's disease).
  • sonography only makes a small contribution to the diagnosis.
  • X-ray examination with contrast medium is much more meaningful, but is pushed into the background due to the radiation exposure.
  • Other imaging techniques that can be used are computer tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), which also enable changes in the area of the intestine to be displayed.
  • ulcerative colitis there is superficial inflammation, which is characterized by a uniform spread and an abortion, as well as the formation of crypt abscesses.
  • a transmural inflammatory reaction is typical for Crohn's disease, in which segmental, sharply defined foci and granulomas occur. In most cases, a clear diagnosis can therefore be made using the biopsy.
  • colonoscopy is recommended to be examined annually in order to be able to take suitable therapeutic measures as quickly as possible if cancer develops.
  • Another branch of diagnostics that is rarely used by gastroenterologists is the serological examination of autoantibodies using an indirect immunofluorescence test (IIFT). This takes advantage of the fact that patients with Crohn's disease or ulcerative colitis develop specific autoantibodies.
  • IIFT indirect immunofluorescence test
  • the IIFT can detect antibodies against exocrine pancreas with a prevalence of 39%, which do not occur in patients with ulcerative colitis. Titers above 1:10 are pathognomic for Crohn's disease. Pancreatic tissue of suitable primates serves as the substrate, in the positive case "a reticulated-granular, sometimes also dripping fluorescence" can be seen (Stöcker et al., 1987, Scand J Gastroenterol, 22: 41-52).
  • Antibodies against Saccharomyces cerevisiae can be found in indirect immunofluorescence in 70% of patients with Crohn's disease and 8% of samples from healthy blood donors. The occurrence of these antibodies is independent of the development of the anti-pancreatic antibodies. A combination of both tests can be used to measure 80% of Crohn's disease patients.
  • ulcerative colitis Due to the difficulties described, different results have been achieved and published in the past. The investigation of these antibodies is therefore hardly used for ulcerative colitis diagnosis, although the predictive value of a positive result is almost 100% and ulcerative colitis can be clearly demonstrated with a positive test for anti-goblet cell antibodies. A combination of the detection of anti-goblet cell antibodies and pANCA could even affect 83% of those affected Patients ⁇ The diagnosis of ulcerative colitis is made serologically.
  • the cell line HT29 was shown to switch irreversibly through differentiation to different intestinal epithelial cells through the replacement of glucose with galactose in the culture medium (Huet at al., 1987, JCB-105: 345-357).
  • a subclone, HT29-18N2 was shown to have some of its other properties in addition to the morphology of goblet cells, such as stimulability by carbachol, which triggers mucus secretion.
  • the cell line HT29-18N2 is said to differ from.
  • Goblet cells differ, for example in their growth properties or in the formation of intraepithelial lumens (Phillips et al., 1988, Gastroenterology 94: 1390-1403).
  • the antigen recognized by the antibodies should have a molecular weight of> 200 kDa, - consist of a single polypeptide chain and be recognized by the antibodies in both ' native and reduced form'. No further identification of this antigen was made.
  • the cell line HT29-18N2 when grown in glucose-containing (3.0 g / 1), protein-free medium (eg Protein Free Hybridoma Medium II, PFHM II, Invitrogen) predominantly as filled with secretory granules Goblet cell grows which, in contrast to the HT29 cell line, form individual layers (Phillips et al., 1995, In Vitro Cell Dev Biol 31: 421-423). These cells also form a series of glycoproteins, so-called mucins, some of which be secreted.
  • protein-free medium eg Protein Free Hybridoma Medium II, PFHM II, Invitrogen
  • goblet cell antigen is therefore made available which, by expression by the cell line HT29-, which is differentiated into goblet cells by expression in protein-free medium, such as, for example, in WO8802774 or WO9808934, or in PFHM II medium (Protein Free Hybridoma Medium Invitrogen). 18N2 is available and can be detected with anti-goblet cell antibodies from ulcerative colitis patients.
  • the goblet cell antigen can be expressed, for example, by the cell line HT29-18N2 differentiated into goblet cells.
  • This cell line has been widely used in research and is therefore readily available, e.g. from T. Phillips, (University of Missouri, Columbia, USA), Euroimmun (Euroimmun AG, Seekamp 31, 23560 Lübeck, Germany), BL Rodriguez (Departamehto de Genetica, CNIC, Havana, Cuba), RA Finkelstein (University of Missouri, Columbia, USA), JA Beni.tez (Morehouse School of Medicine, Atlanta, USA), A. Frey. (For ⁇ Research Center Borstel, 23845 Borstel, Germany). D.
  • a culture of HT29-18N2 cells in PFHM II is particularly suitable for differentiation into goblet cells which express the goblet cell antigen.
  • the cells can also be sown in a protein-containing medium (e.g. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 10% (v / v) fetal calf serum (FKS) together, the change to PFHM II leads to a change in the morphology- of goblet cells.
  • the cells are added to the least. '2 days, more preferably at least 4, 7, 10, or cultured for 14 days in the absence of protein.
  • the cell line HT29-18N2 is differentiated by the cell line HT29 in the absence of glucose by the method of Huet et al. available (Huet et al., 1987, ibid).
  • the HT-29 cells are a cell line of a human colon adenocarcinoma, which e.g. can be obtained from the DSMZ (German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH, accession number ACC299).
  • the adherent, epithelioid cells grow multilayered and in large colonies.
  • the development of these undifferentiated precursors of intestinal wall cells can be influenced by the type of cultivation. If glucose in the medium is replaced by galactose, the cells should differentiate into enterocytes (approx. 90%) and goblet cells (approx. 10%) within a period of approx. 1 to 2 weeks (Huet et al., 1987, ibid). After the in the publication by Huet et al.
  • the methods shown can be used to obtain further subclones with the properties of the HT29-18N2 clone from the mother cell line, ie also the expression of the Bec er cell antigen.
  • Goblet cell antigen can also be obtained from such cell lines under suitable culture conditions.
  • daughter cell lines (HT29-MTX, HT29-FU, HT29-5M21, HT29-5F7) with some properties of goblet cells can be obtained from the HT29 cell line by culture in the presence of methotrexate and / or 5-fluorouracil, e.g. the production of mucins typical of goblet cells (Lesuffleur et al., 1991, Int J Cancer, 49: 731-737, Leteurtre, 2004, Biol Cell, 96, 145-151).
  • Goblet cell antigen can also be obtained from this or analog cell lines using suitable culture conditions.
  • the goblet cell antigen is particularly suitable for the diagnosis of ulcerative colitis, since it is specifically recognized by antibodies from the serum of approximately 28% of ulcerative colitis patients. Since not all ulcerative colitis patients have antibodies against goblet cell antigen (Stöcker et al., 1987, To identify the goblet cell antigen according to the invention, sera from ulcerative colitis patients tested positive for reactivity with goblet cell antigen (see, for example, example 1) or antibodies of a sufficient number of ulcerative colitis patients, if appropriate in a combined form, must therefore be tested, for example on primate intestine. be used. Anti-goblet cell antibodies from ulcerative colitis patients correspond to anti-goblet cell-positive serum from ulcerative colitis patients. If necessary, antibodies from positively tested serum can be purified before use as a positive control, eg via a protein A or G column.
  • the goblet cell antigen according to the invention is preferably not detectable with antibodies from Crohn's disease patients. Furthermore, it is preferably not detectable with antibodies from patients with other autoimmune diseases (other than ulcerative colitis). In the experiments carried out to date, no cross-reactivity of antibodies from patients with Crohn's disease or other autoimmune diseases with the goblet cell antigen has been shown. The presence of the antibodies against the goblet cell antigen is therefore specific for ulcerative colitis.
  • both the cells and the culture supernatant contain the goblet cell antigen. It is therefore partially extracellularly localized. These results explain the localization of immunofluorescence, for example in the case of primate intestine, in which cloudy, out of focus fluorescence can be seen in a plane above the goblet cells (Stöcker et al., 1987, ibid).
  • the location within the cells can only be clarified with this method because the associated fluorescence is covered by the fluorescence above.
  • the location can, however, be shown with a confocal laser scanning microscope that is able to block out the interfering fluorescence.
  • the goblet cell antigen is expressed by the cell line HT29-18N2 differentiated into goblet cells in PFHM II.
  • the antigen is preferably purified, in particular isolated, and is purified from the cell culture supernatant of the cell line HT29-18N2 differentiated into goblet cells in PFHM II.
  • a particularly simple but sufficient method for purifying the antigen is the separation of the culture supernatant from the cells. Purification can be accomplished by removing small proteins and low molecular medium components such as biotin, e.g. by ultrafiltration or gel filtration. become.
  • the antigen is preferably separated from these components by ultrafiltration with a filter with an exclusion size of at least 5 kDa, in particular at least 100 kDa, and remains in the retentate.
  • the antigen is preferred by ion exchange chromatography, particularly preferably by anion exchange chromatography at a pH> 5.0, preferably at a pH> 7.5, by elution with at least 150 mM NaCl, preferably by elution with at least 200 mM NaCl, separated from other substances.
  • Goblet cell antigen purified by anion exchange chromatography was characterized by various methods. When examined by SDS-PAGE and Western blot with anti-goblet cell-positive serum from ulcerative colitis patients, under non-reducing conditions only one single band was found in the goblet cell-antigen-positive fractions, which was above the uppermost band of the marker ( 185 kDa). The goblet cell antigen therefore preferred, measured in non-reducing SDS-PAGE, an apparent molecular mass that is greater than 185 kDa. In contrast, under reducing conditions, the sera do not react with the goblet cell antigen. The epitopes recognized in the target antigen are therefore probably primarily of a conformational nature, since they appear to be, at least partially, dependent on the three-dimensional structure of the antigen and / or contain disulfide bridges.
  • the goblet cell antigen has a very high molecular mass.
  • agarose gel electrophoresis with a separation range of approximately 100 to> 2000 kDa had to be carried out.
  • the mobility of the goblet cell antigen under these conditions is below that of human IgM (not reduced, molecular weight approx. 950 kDa, L. Stryer, Biochemie, Spektrum Verlag, 4th edition 1995, p.395). However, the mobility is above that of the non-reduced mucin MUC5AC.
  • the apparent molecular mass of the non-reduced goblet cell antigen in agarose gel electrophoresis is therefore between 950 kDa and that of the non-reduced MUC5AC (> 2000 kDa, see J. Bara et al., Biochem J, 15, 185-193). The apparent molecular mass can therefore be estimated to be greater than 1000 kDa.
  • the goblet cell antigen appears to make up the largest amount of the protein present.
  • Two additional protein bands are detectable, one of the contaminating proteins being the mucin MUC5AC, which is recognized by a monoclonal anti-MUC5AC antibody.
  • the further contaminating protein appears to have an apparent molecular mass in the unreduced state corresponding to that of unreduced IgM (approx. 950 kDa), since it has a mobility similar to unreduced human IgM in the agarose gel.
  • Western blot using lectins bound a protein of the same mobility from different lectins.
  • the goblet cell antigen is therefore preferred with at least one or all lectins PHA-L (Phaseolus. Vulgaris-leukoagglutinin), PHA-E (Phaseolus vulgaris-erythroagglutinin), RCA (Ricinus communis-agglutinin), Con A (Concanavalin A), LCA (Lens culinaris agglutinin), PSA (Pisum sativum agglutinin) and AAL (Aleuria aurantia lectin).
  • the goblet cell antigen was not with the lectins SNA (Sambucus nigra lectin), HHL (Hippeastrum hybrid lectin), MAL I (Maackia amurensis lectin I), SBA (soybean agglutinin), DBA (Dolichus biflorus agglutinin ), UEA I (Ulex europaeus agglutinin), SJA (Sophora japonica agglutinin), PNA (peanut agglutinin), WGA (wheat germ agglutinin), GSL I (Griffonia simplicifolia lectin I), PTL I (Psophocarpus tetragonolobus), L WGA s + b (Wheat germ agglutinin, succinylated and biotinylated) detectable.
  • the contaminating proteins from the anion exchange chromatography preparation however, all
  • the antigen comprises galactose, glucose, mannose, N-acetyl-galactosamine and / or fucose (see Table 1, below).
  • the subject of the invention is also not or only partially glycosylated goblet cell antigen which is bound by anti-goblet cell positive serum.
  • the lectins bind to the glycans that are not affected by the reduction even after the goblet cell antigen has been reduced.
  • the mobility of the detected components is significantly increased compared to the unreduced goblet cell antigen, ' the band with the previous mobility disappears completely when reduced.
  • the goblet cell antigen comprises several peptide chains which are connected to one another in the native state with disulfide bridges. With a reducing SDS-PAGE it was therefore possible to determine the apparent molecular mass of glycosylated proteins which appear to be components of the goblet cell antigen. This indicates that the goblet cell antigen comprises one or more glycosylated proteins with a molecular weight of 52-54, 56, 66 and / or 80 kDa.
  • the goblet cell antigen comprises one or more proteins of apparent molecular masses of 56, 66, and / or 80 kDa.
  • the goblet cell antigen comprises N- and O-glycosidically bound glycans. Furthermore, the partly detectable via lectins, terminal carbohydrates partly by removing specific glycosidases and exposing the underlying carbohydrates. In a preferred form, the glycans of the goblet cell antigen are therefore partially or completely removed by chemical or enzymatic methods.
  • a further purification of the goblet cell antigen is possible using standard methods, for example size fractionation by means of gel filtration or HPLC.
  • purification with the aid of affinity chromatography with antisera from the blood of ulcerative colitis patients or with the aid of the lectins binding to the goblet cell antigen is particularly preferred.
  • Those skilled in the art will find further methods for purifying and isolating the goblet cell antigen from culture supernatant or from cells, such as, for example, filtration, chromatography, electrophoresis and centrifugation methods or combinations thereof.
  • the DNA sequence coding for it can be determined with known methods using the purified antigen. For example, _ the sequencing of the purified protein fragments of the goblet cell antigen the synthesis of degenerate primers with which e.g. the cDNA coding for goblet cell antigen can be identified from the HT29-18N2 cells cultured in PFHM II. It is also possible to screen a cDNA expression bank with antibodies generated against goblet cell antigen or with antibodies from ulcerative colitis patients or to search in suitable databases.
  • Cloning the cDNA into an expression vector allows recombinant expression of the antigen.
  • the protein can be expressed in various systems, for example bacterial systems such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, in yeasts such as Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris or other eukaryotic cells such as 293, CHO, COS or insect cells. Expression in eukaryotic cells, preferably a eukaryotic cell line, is preferred, since glycosylation of the protein and necessary further processing can take place here. Different expression vectors for the respective systems are known.
  • the goblet cell antigen is expressed as a fusion protein, e.g. as an Ig fusion protein or using an attachment for protein purification, e.g. of a polyhistidine appendix (His tag).
  • a recombinant antigen is accordingly used. The methods mentioned are e.g. in Lott Jeff and Zorbas (bioanalytics, 1998, spectrum academic publisher, Heidelberg, Berlin) or Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • only the parts of the antigen to which the antibodies of ulcerative colitis patients bind are expressed, e.g.
  • Such parts can include both individual reactive subregions of the antigen and fusion proteins from several reactive subregions of the antigen or fusion proteins from one or more reactive subregions of the antigen and sequences not belonging to the goblet cell antigen.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody which recognizes goblet cell antigen.
  • a preferred method for obtaining such an antibody is to immunize a mouse with purified goblet cell antigen. After approximately 2 weeks, the spleen is removed and the spleen cells are fused with myeloma cells under the influence of polyethylene glycol (PEG). These lack the enzyme HPRT, so that they cannot survive in HAT selection medium. Myeloma cells fused only with spleen cells survive the culture in the selection medium. The hybridoma cells formed are cloned and tested for the production of antibodies using the method according to the invention. , The method for producing monoclonal antibodies is described in detail, for example, in Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • a particularly preferred method comprises the humanization of the monoclonal antibody obtained in this way. This is done by isolating the associated cDNA from the hybridoma cells and replacing the sequence coding for the F c part of the monoclonal antibody with a corresponding human sequence.
  • the hybrid sequence formed in this way can be converted into a suitable expression vector and expressed in a suitable expression system and purified therefrom using known methods.
  • a recombinant antibody is accordingly used.
  • the methods mentioned are, for example, in Lott Jeff and Zorbas (bioanalytics, 1998, spectrum academic publisher, Heidelberg, Berlin) or Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory . Press, Cold Spring Harbor, NY).
  • Another preferred method for obtaining a monoclonal antibody according to the invention is the isolation of specific human B-lymphocytes from inflamed intestinal tissue from ulcerative colitis patients with anti-goblet cell-positive serum.
  • lymphocytes can be obtained by excision of the affected intestinal area and cultivation of the cells contained, in particular the B lymphocytes, in a suitable medium.
  • B-lymphocytes Further isolation of specific B-lymphocytes can be carried out by sorting the cells obtained in a fluorescence-assisted cell sorter (FACS) with the aid of a B-lymphocyte-specific antibody labeled with a fluorophore, for example anti-CD20, for identification of B lymphocytes and / or the purified goblet cell antigen labeled with a second fluorophore for the identification of specific B lymphocytes.
  • FACS fluorescence-assisted cell sorter
  • An alternative possibility is to create a phage display library based on the cDNAs of the antibodies from the cells obtained in this way.
  • a human recombinant antibody is accordingly used. The methods mentioned are e.g. in Eggena et al. , 1996, J Immunol, 156: 4005-4001.
  • Another preferred method for obtaining a monoclonal antibody according to the invention is the screening of a phage display library which is based on randomized cDNAs from human antibodies, for example the HuCAL Gold library from MorphoSys, for binding to the purified goblet cell antigen with one of the inventive method.
  • a phage display library which is based on randomized cDNAs from human antibodies, for example the HuCAL Gold library from MorphoSys, for binding to the purified goblet cell antigen with one of the inventive method.
  • an F ab fragment specific for the goblet cell antigen can first be obtained.
  • a human recombinant F ab fragment is accordingly used. This can be changed into a complete human immunoglobulin by complementing it with a cDNA coding for the F c part. Complete immunoglobulins can also be obtained directly from other libraries.
  • the methods mentioned are described in the technical description of the HuCAL Gold library from MorphoSys.
  • the invention therefore also relates to monoclonal antibodies which are produced using such processes and bind to goblet cell antigen which is bound by anti-goblet cell-positive serum.
  • kits for the diagnosis of inflammatory bowel diseases are provided within the scope of the invention, the goblet cell antigen and e.g. includes instructions for diagnosing inflammatory bowel disease.
  • the kit preferably also comprises the monoclonal antibody, so that no positive sera from ulcerative colitis patients have to be used as a positive control for carrying out the method according to the invention.
  • a method for the detection of antibodies against goblet cell antigen in which a biological sample is brought into contact with an antigen and the binding of antibodies to the antigen is detected, the antigen being expressed by the cell line HT29-18N2 differentiated into goblet cells in PFHM II and is detectable with anti-goblet cell antibodies from ulcerative colitis patients.
  • the goblet cell antigen described above is used for the method.
  • the method is particularly suitable for the diagnosis of ulcerative colitis, since the antigen is specifically recognized by antibodies from the serum of approximately 28% of ulcerative colitis patients.
  • the sample to be tested for antibodies against goblet cell antigen is a biological sample, generally a blood or serum sample. It is preferably a sample from a patient with an inflammatory bowel disease in whom ulcerative colitis could be present. However, it can also be, for example, the supernatant of a hybridoma or a phage display library.
  • ELISA or blot e.g. a western blot or dot blot.
  • test strips can also be used. Such tests are generally based on a sandwich solid phase immunoassay in which goblet cell antigen is coupled to a test field or in a line on the test strip.
  • the test strip is e.g. in contact with a blood sample or diluted patient serum that may contain anti-goblet cell antigen antibodies.
  • Secondary anti-human immunoglobulin antibodies of the appropriate specificity e.g. conjugated with gold conjugate or with an enzyme such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase only collect in the test field if antibodies were contained in the sample. If necessary, the result must be made visible with a chromogenic substrate.
  • the invention further relates to a method for the detection of antibodies against goblet cell antigen, in which a sample is brought into contact with a cell line differentiated into goblet cells in protein-free medium and derived from the HT29 cell line, and the binding of antibodies to the antigen.
  • the culture conditions used for this purpose have already been described in detail above.
  • the goblet cell antigen according to the invention expressed by the cells under these culture conditions reacts specifically with anti-goblet cell antibodies from ulcerative colitis patients. It is therefore not detectable with antibodies from Crohn's disease patients, preferably also not with antibodies from patients with other autoimmune diseases.
  • the cell line HT29-18N2 which is differentiated into goblet cells in protein-free medium, is preferred.
  • Carrying out the method according to the invention with the cells described allows the detection of the binding of the antibodies to the antigen with indirect or direct immunofluorescence.
  • This method is currently the standard method for the detection of goblet cell antigen (Stöcker et al., 1984, 1987, ibid) using intestinal tissue, so that a comparison of the methods is particularly possible.
  • This comparison shows that the cells with anti-goblet cell-positive sera show cloudy, indistinctly limited fluorescence in a plane above the cells, which closely resembles the reaction of the same sera to primate and human fetal intestines.
  • the predictive value of detection of antibodies against goblet cell antigen is 100%.
  • a method for the diagnosis of inflammatory bowel diseases is made available, in which one detects these antibodies with the methods according to the invention, whereby ulcerative colitis is diagnosed by the detection of antibodies against goblet cell antigen.
  • the present invention provides such a test system for anti-goblet cell antigen.
  • a combination of the four tests would make endoscopy superfluous in many cases.
  • a differential diagnosis can already be made serologically by examining the antibodies against goblet cell antigen, pancreatic secretions, Saccharomyces cerevisiae and pANCA.
  • the invention also relates to the use of goblet cell antigen for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of ulcerative colitis.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition, preferably for the treatment of ulcerative colitis, which comprises goblet cell antigen, optionally with a pharmaceutically suitable carrier and / or auxiliary substances.
  • a patient's body fluid is brought into contact with the antigen.
  • body fluid is e.g. Blood or intestinal contents or the secretion of the patient's mucous membrane understood.
  • Goblet cell antigen is preferably coupled to an inert matrix, e.g. Silica gel or an indigestible carbohydrate such as alginate, cellulose, pectin, carrageen or the like.
  • This conjugate is then brought into contact with a body fluid of a patient with anti-goblet cell antibodies in order to attach the anti-goblet cell antibodies contained in this body fluid to the conjugate to tie.
  • the invention therefore also relates to the use of goblet cell antigen for the ex vivo removal of anti-goblet cell antibodies from the blood of ulcerative colitis patients.
  • an inert matrix with coupled goblet cell antigen in tablet form can be introduced into the intestine throughout the stomach, ie in an enteric-resistant formulation.
  • Preferred - is also the coupling of a cytotoxin to the goblet cell antigen. After administration in ulcerative colitis patients with anti-goblet cell antibodies, the conjugate binds to the specific B lymphocytes and destroys them or induces apoptosis in them.
  • the cytotoxin is preferably specific for B lymphocytes.
  • a pharmaceutical composition comprising the goblet cell antigen can also be used to induce tolerance to the goblet cell antigen.
  • the goblet cell antigen is preferred for this purpose with anti-inflammatory cytokines, such as e.g. Formulated TGF- ⁇ or IL-10 that can induce regulatory T cells (Chen et al., 2003, J. Exp. Med., 198, 1875-86).
  • cytokines such as e.g. Formulated TGF- ⁇ or IL-10 that can induce regulatory T cells (Chen et al., 2003, J. Exp. Med., 198, 1875-86).
  • Suitable adjuvants as well as other methods for inducing tolerance are known in the art, e.g. the blocking of costimulatory signals or the administration of the antigen in the context of tolerogenic autologous dendritic cells (Xiao et al., 2003, BioDrugs, 17, 103-11).
  • C, D Representation of the anti-MUC2 antibody by indirect immunofluorescence on intestine prim. adult (C: 200x magnification, D: 400x magnification).
  • A Silver gel of the fractions of a preparation from human adult intestinal tissue. 1 ⁇ l of the indicated fractions were applied in each case. The samples were obtained by centrifugation at increasing revolutions per minute.
  • B, C Western blot of the fractions of the intestinal preparation, incubated with a mixture of anti-goblet cell positive sera (B) and blood donor sera (C) (l: homogenate, 2: supernatant 1, 3: sediment 1, 4: supernatant 2 , 5: sediment 2, 6: supernatant 3, 7: sediment 3, 8: supernatant 4, 9: sediment 4, 10: supernatant 5, 11: sediment 5).
  • B anti-goblet cell positive sera
  • C blood donor sera
  • biotinylated lectins bind to a streptavidin-coated and BSA-blocked plate. Existing in the sample. Antigens are bound via their carbohydrate moiety and detected by reaction with primary antibodies of the serum and POD-labeled secondary antibodies of the conjugate specifically '.
  • A, B Representation of autoantibodies against goblet cells (A), a blood donor serum (B), of anti-MUC2 antibodies (C) and of anti-MUC5AC antibodies (D) by indirect immunofluorescence on HT29-18N2 cells after differentiation to goblet cells in PFHM II medium (200x magnification).
  • A Representation of the reactivity of anti-goblet cell-positive sera (serum 1 to 3) compared to blood donor sera (BS 1 to 4) and the anti-MUC5AC antibody by dot blot.
  • the samples were concentrated with a filter with an exclusion size of 100 kDa and the medium was exchanged for PBS. 2 ⁇ l of sample were applied in each case. These are cell culture supernatants from different culture bottles (A, B and C) that were obtained at different times after the start of differentiation.
  • A Reactivity of various starting substrates (cells and cell culture supernatant) with anti-goblet cell antibodies from sera from ulcerative colitis patients (CU, dark) and blood donor sera (BS, light) in an ELISA.
  • Equal amounts of a sample of a chromatography fraction positive for goblet cell antigen were used under reducing (left lane in each case) and non-reducing (right lane in each case) conditions for agarose gel electrophoresis.
  • the Western blot was stained with anti-goblet cell positive sera (1st and 2nd strips from the left), blood donor sera (3rd and 4th strips from the left) and anti-MUC5AC antibody (right strip).
  • the sample of the chromatography fraction was labeled with FITC and examined under reducing (lane 2) and non-reducing (lane 3) conditions.
  • An unlabeled, non-reduced sample is used for comparison, detected with anti-goblet cell antigen-positive serum (lane 4) or anti-MUC5AC antibody (lane 5) and non-reduced human IgM (lane 1).
  • A Agarose gel electrophoresis / Western blot of the chromatography fraction under non-reducing conditions, strip 1 (from left to right): anti-goblet cell-positive serum; Lanes 2 and 3: blood donor sera; Lane 4: SNA, lane 5: PHA-L, lane 6: PHA-E; Strip 7: HHL; Lane 8: RCA; Lane 9: MAL I; Strip 10: Con A; Lane 11: SBA; Lane 12: DBA; Lane 13: UEA I; Lane 14: SJA; Lane 15: PNA; Strip 16: WGA; Lane 17: LCA; Lane 18: GSL I; Lane 19: PSA; Lane 20: PTL I; Lane 21: AAL; Strip 22: WGA s + b.
  • strip 1 (from left to right): SNA; Lane 2: PHA-L; Lane 3: PHA-E; Lane 4: HHL, lane 5: RCA, lane 6: MAL I; Strip 7: Con A; Lane 8: SBA; Lane 9: DBA; Lane 10: UEA I; Lane 11: SJA; Lane 12: PNA; Lane 13: WGA; Lane 14: LCA; Lane 15: GSL I; Lane 16: PSA; Strip 17: PTL I; Lane 18: AAL; Strip 19: WGA s + b.
  • Lane 1 (left to right): SNA; Lane 2: PHA-L; Lane 3: PHA-E; Lane 4: HHL, lane 5: RCA, lane 6: MAL I; Strip 7: Con A; Lane 8: SBA; Lane 9: DBA;
  • A, B lectin blot after deglycosylation with N-glycosidase F left lane: sample of the chromatography preparation after N-glycosidase digestion; right lane: sample of the chromatography preparation without digestion, equal amounts of the sample in each case.
  • B Lane 1: marker; Lane 2: N-glycosidase F; Lane 5: PSA; Strip 6: AAL. Examples
  • the antigen sought can be detected by using anti-goblet cell-positive sera. Therefore, with the help of slides with sections of adult primate intestine, human fetal (from pathologically analyzed samples from excess material) and human adult intestine (from surgical resection material) sera from ulcerative colitis patients ' in immunofluorescence are examined for their reactivity with goblet cells. For example, specimens from the company EUROIMMUN together with associated auxiliary reagents are used for the examination.
  • the test is carried out according to standard methods, for example according to the instructions for the indirect immunofluorescence test from EUROIMMUN, only conjugates of the classes IgG and IgA being used. In this way, 200 sera of ulcerative colitis patients are examined, anti-goblet positive sera can control be used for further experiments as ⁇ positive.
  • anti-goblet cell-positive sera Show anti-goblet cell-positive sera, a cloudy, blurred 'fluorescence in a plane above the goblet cells.
  • non-specific background fluorescence can be seen in many sera. Blood donor sera and negative-reacting samples only show this background fluorescence, with different intensities depending on the serum.
  • goblet cell antigen-reactive sera of ulcerative colitis patients are referred to as anti-goblet cell-positive sera. Similar to that of Stöcker et al. Already shown (1987, ibid) 28% of the sera examined were anti-goblet cell-positive, thus leading to the fluorescence typical of goblet cell antigen.
  • Tissue sections from primate intestine, human fetal and adult intestine were examined, as described in Example 1, in indirect immunofluorescence with anti-goblet cell-positive sera for goblet cell antigen. The expression of other antigens was examined.
  • the conjugate FITC Fluorescein
  • the anti-MUC3 antibodies for the anti-MUC3 antibodies
  • FITC-labeled anti-rabbit antibodies also used in the IgG class.
  • the slides are washed after the serum incubation and then incubated with one of the monoclonal antibodies for 30 minutes at room temperature.
  • the anti-goblet cell-positive sera show the fluorescence typical of goblet cell antigen (FIGS. 1A and B).
  • the additionally tested monoclonal antibodies against mucins 2, 3 and 5AC, which are all expressed in the intestine have different patterns and localizations.
  • the anti-MUC2 antibody shows a granular fluorescence which is limited to the cytoplasm of the goblet cells (FIG. IC and D). After incubation with the anti-MUC 3 antibody, other intestinal structures react in addition to the goblet cells.
  • the anti-MUC5AC antibody which is the only one of the monoclonal antibodies used to react with the fully glycosylated antigen according to the manufacturer, shows, like the anti-MUC2 antibody, a beaker line-specific fluorescence pattern, the pattern after incubation with the anti-MUC5AC Antibody is similar to that after incubation with goblet cell positive sera. After incubation with the anti-MUC2 antibody, in addition to cytoplasmic localized fluorescence, membrane-associated fluorescence is also evident. With the help of double fluorescence with an anti-goblet cell positive serum and.
  • the anti-MUC2 antibody which is specific to Becherzeil, can be used to clarify the • location of the positive signal.
  • the anti-mouse antibody labeled via TRITC The anti-mouse antibody labeled via TRITC.
  • Detected anti-MUC 2 antibodies react - as described - with the cytoplasm of the goblet cells, the goblet cell-specific reaction of the serum made visible with FITC-labeled anti-human antibodies is on the level above (FIG. 1B).
  • the sample is then centrifuged at 21,250 ⁇ g and 4 ° C. for 30 minutes, the supernatant is removed and the sediment is resuspended in a volume of TNE buffer. If a layer of fat is visible after this ⁇ step, filter through glass wool.
  • the mixture is centrifuged for 60 minutes at 100,000 x g and 4 ° C.
  • the supernatant is filled, the sediment is resuspended in a volume of TNE buffer and then centrifuged for 60 minutes at 220,000 x g and 4 ° C. After the supernatant has been filled, the sediment is resuspended in a volume of TNE buffer.
  • the samples are examined in parallel under non-reducing and reducing (15.6 mM DTT, 1.25% iodoacetamide) conditions.
  • Invitrogen's Marker 12 or MultiMark is included as a marker.
  • the silver coloring is carried out using standard methods, for example according to. the Heukeshoven method (1988, Electrophoresis 9, 28-32) .- Results ' :
  • titer The dilution, determined by 'a dilution series in immunofluorescence, in which the corresponding anti-goblet positive serum just a Becherzeil-specific shows reaction is referred to as titer and used for a neutralization test with the samples of bowel preparation.
  • Fractions against an anti-goblet cell positive serum can be determined. Since all fields of the slide react with the same intensity and identical pattern, no statement can be made about the fraction in which the target antigen is present. Repeating the test - with increasing concentrations of the individual samples in the batch gives an identical result.
  • the fractions of the intestinal preparation are to be examined for the presence of the target antigen.
  • the proteins are transferred to a nitrocellulose membrane, for example by means of a blot apparatus from Hoefer using the wet blot method " .
  • the samples are applied to SDS-PAGE gels and, after transfer to nitrocellulose membranes, first stained with Ponceau S and then incubated with anti-goblet cell-positive or blood donor sera.
  • the nitrocellulose membrane is covered with Ponceau S solution for 10 minutes while shaking. After the incubation with aqua dest. decolorized again until the marker and colored proteins are clearly visible as red bands.
  • the membrane For the specific immunological detection with antibodies, the membrane, possibly cut into strips, is first blocked for 15 minutes with universal buffer (EUROIMMUN) with 3% (w / v) milk powder. The mixture is then incubated for 3 hours with control or patient sera (1: 500 in. Universal buffer with 3% (w / v) milk powder). Then it is washed three times for 5 minutes with universal buffer. In a second incubation step, the antibodies bound to the proteins in the positive case react with a conjugate solution (EUROIMMUN, diluted 1:10 in universal buffer) which contains alkaline phosphatase-labeled anti-human antibodies. Then wash as after the serum incubation. '(EUROIMMUN 4-Nitrobluetetrazoliumchlorid / Chlorobromo- indolylphosphate,) in a third step, then the bound antibody with NBT / BCIP substrate solution detected.
  • a conjugate solution (EUROIMMUN 4-Nitrobluet
  • lectin ELISA In the lectin ELISA, a MaxiSorb plate from Nunc is coated with streptavidin (100 ⁇ l of a 0.5 ⁇ g / ml solution in PBS, overnight at 4 ° C or 2 hours room temperature) and with 100 ⁇ l lectin dilution (1 ⁇ g / ml in PBS, see table 1) coated for 30 minutes at room temperature. The plate is then washed (three times with 300 ⁇ l washing buffer (EUROIMMUN or PBS-Tween).
  • streptavidin 100 ⁇ l of a 0.5 ⁇ g / ml solution in PBS, overnight at 4 ° C or 2 hours room temperature
  • 100 ⁇ l lectin dilution (1 ⁇ g / ml in PBS, see table 1
  • the plate is then washed (three times with 300 ⁇ l washing buffer (EUROIMMUN or PBS-Tween).
  • the plate is washed before incubating with 100 ⁇ l conjugate solution (EUROIMMUN) containing peroxidase-labeled anti-human antibodies for 30 minutes at room temperature the plate is incubated for 10 minutes with 100 ⁇ l substrate solution (EUROIMMUN) per reaction vessel at room temperature, and after the 10 minutes have passed, the reaction is carried out by adding 100 ⁇ l stop solution (EUROIMMUN) g stopped and the absorbance measured at 450 nm with a photometer (Tecan Spectra).
  • the scheme of a lectin ELISA is shown in FIG. 3.
  • the lectins RCA, PSA, LCA and SNA also show increased reactivities, which, however, can be found both in anti-goblet cell positive ' and blood donor sera as well as in the control. The reactions are therefore considered to be non-specific. Comparable results are also achieved when testing the other approaches. No sample of the preparation shows any specific reactivity with one of the lectins present.
  • the HT29-18N2 cells are a daughter cell line of the HT29 cells.
  • the protocol of the cultivation and the clone were originally developed by Prof. Dr. Tom Phillips, University of Missouri, Columbia (1988, Gastroenterology 94: 1390-1403) .. 1.7 x 10 4 cells / cm 2 are sown in plastic bottles and grown under standard conditions at 37 ° C with 5% CO 2 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Invitrogen) with the addition of 10% fetal calf serum (FCS) until confluence is reached. The cells are then harvested by adding trypsin / EDTA and sown again in plastic bottles in DMEgal medium. Since changing the composition of the medium results in a high death rate and a slower growth rate, the medium is changed every day.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FCS fetal calf serum
  • the DMEgal medium is glucose-free in the sense that it only contains residues of glucose from the FCS and this is in deficit compared to galactose. It consists of 8.3 g DME medium base (Sigma), 0.1% (w / v) galactose (Sigma), phenol red solution (8 mg / ml; Sigma), 0.37% (v / v) NaHC0 3 (Sigma) and 10% (v / v) dialyzed FKS (JRH Biosciences) together.
  • the cells When grown in DMEM, the cells are highly aggregated and grow in multiple layers in islands. An increased mortality rate can be observed after sowing in DMEgal. The surviving cells no longer grow in islands, but can be seen under the microscope as individual cells and differentiated from one another.
  • freeze cultures of 90% (v / v) FCS and 10% (v / v) DMSO are prepared from some of the cells, which are stored in nitrogen.
  • HT29-18N2 cells are cultivated in protein-containing DMEM (DMEM / 10% FCS). Unless otherwise stated, the designation HT29-18N2 cells in the following refers to cells after culture in protein-free medium PFHM II.
  • each of the half are of a cover glass with the biochip technology EUROIMMUN made slide, the other half is in the Western blot after disruption of the cells in TNE-T buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1% Triton X-100) tested by ultrasound.
  • TNE-T buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1% Triton X-100
  • the coverslip is rinsed twice with PBS. Excess liquid is drained on the pulp, before the cover glass is only rinsed in acetone (Merck) and then fixed in fresh acetone for 10 minutes at room temperature.
  • acetone Merck
  • the cover slip is overlaid twice with PBS, then the PBS is suctioned off and discarded. Liquid residues are drained off on pulp. Then the cover slip is first covered with 3.5% formaldehyde (Riedel de Haen) in PBS (the liquid is removed as in the previous step) and then fixed for 10 minutes with formaldehyde solution at room temperature.
  • 3.5% formaldehyde Rosin de Haen
  • the HT29-18N2 cells which are grown on cover glasses in DMEgal and fixed with acetone, formaldehyde or ethanol, are tested for their reactivity with goblet cell-positive sera and sera from blood donors using indirect immunofluorescence.
  • the use of ethanol and formaldehyde is not very suitable for fixing these cells on cover slips. In all fields of the slide, the cells detach during the incubation, so that it is difficult to make a statement about the reactivity of the cells with the sera used. An acetone fixation is therefore carried out for all subsequent experiments.
  • the anti-MUC2 antibody reacts with the cytoplasm of some cells and thus also shows a fluorescence pattern similar to that on intestinal tissue (FIG. 4C).
  • the anti-MUC3 antibody shows a uniform fluorescence of the cells, regardless of whether they have grown in DMEM or PFHM II and therefore also reacts with the undifferentiated cells.
  • the response of the anti-MUC5AC antibody is limited to the cells grown in PFHM II. In addition to a granular pattern, many cells show fluorescence in a plane above the cells, which can be visually distinguished from the anti-goblet cell-specific signal (FIG. 4D).
  • the medium from the cell culture bottles of the HT29-18N2 cells in PFHM II is e.g. over a gas wash bottle, collected, concentrated with 100 kDa cutoff (Vivaspin 100, VivaScience), exchanged for PBS and tested in an ELISA or dot blot.
  • the supernatants obtained from the cell culture are tested for specific reactions in the dot blot.
  • twice each 1 ul of the 'cell culture supernatant (after concentrating, with a 100 kDa cutoff and exchange of the medium against PBS) applied directly to a previously marked position of the nitrocellulose membrane.
  • the membrane is allowed to dry well in between and afterwards.
  • the subsequent incubation with various anti-goblet cell positive and blood donor sera corresponds essentially to a standard Western blot incubation, however the conjugate incubation is extended from 30 minutes to one hour.
  • the success of the differentiation is parallel to the anti MUC5AC antibody checked, all cell culture supernatants were positive.
  • the anti-goblet cell-positive sera show different levels of reactivity with the individual samples (FIG. 5A).
  • the concentration of the antigen appears to depend on the time the cells have grown in PFHM II.
  • the signal is present 2 days after switching the medium from DMEM to PFHM II, but of low intensity. The longer the cells have grown in 'PFHM II, the stronger it is. Reaction.
  • the anti-goblet cell-positive sera also react differently. The intensity appears to correlate with the titer in immunofluorescence.
  • the blood donor sera do not react with any of the cell culture supernatants.
  • the negative control which was incubated with universal buffer + 3% (w / v) milk powder instead of a serum dilution, also shows no reactivity.
  • the cell culture supernatants from the cell culture are separated due to different charges of the molecules. This is intended to purify the protein mixture contained in the samples in order to enable the development of a test based on the purest possible antigen (for ELISA, Western blot).
  • the column used is a POR ⁇ S HQ / M 20 ⁇ m from Applied Biosystems with a 16 mm diameter and 10 ml column volume.
  • a BioLogic Duo Flow from Biorad is used as the HPLC system. The flow rate is 10 ml / min. Fractions of 5 ml volume are collected.
  • the column is rinsed with 50 ml of water. This is followed by regeneration with 50 ml regeneration buffer (10% acetic acid and 1 M NaCl).
  • the column is first washed with 50 ml water, then with 10 ml elution buffer (25 mM Tris-HCl pH 8, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) and then with 80 ml equilibration buffer (25 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM PMSF) before the sample is applied (5 ml). From this point on, the fractions are collected. After the sample has been applied, 50 ml of equilibration buffer are added to the column.
  • Elution is carried out using a gradient consisting of three stages, each of which increases the concentration of chloride ions on the column. 75, 150 and 250 mM NaCl are used. The collected fractions are examined in the dot blot for their reactivity with anti-goblet cell positive and blood donor sera in order to be able to make a statement about the presence of the target antigen.
  • the anti-goblet cell-positive sera react with the application (A) and with the last fractions of the chromatography (FIG. 5B).
  • the blood donor sera react neither with the order nor with one of the fractions.
  • the reaction of the anti-goblet cell-positive sera is therefore to be assessed as specific.
  • the negative control which was incubated with universal buffer + 3% (w / v) milk powder instead of a serum dilution, shows no reactivity.
  • the plates are coated with the goblet cell antigen or the cell lysate overnight at 4 ° C. or for 2 hours at room temperature.
  • the cell lysate is made by freezing and thawing the cells in TNE-T buffer.
  • the ELISA is further carried out according to standard procedures, similar to the lectin ELISA described in Example 6. Results :
  • the approach with cell lysate shows little specific reaction.
  • the cell culture supernatant tested has an increased reactivity with the anti-goblet cell-positive sera, with a correlation between the level of absorbance and the titer of the corresponding serum in indirect immunofluorescence.
  • the sera with the highest titers determined in the immunofluorescence are also more reactive in the ELISA and lead to higher extinction values. Since the blood donor sera show no comparable reaction, the signal should be assessed as specific.
  • This experiment clearly shows that the purified goblet cell antigen is more suitable for detection in the ELISA than the cells themselves (FIG. 6A).
  • the fractions of the anion exchange chromatography which show a specific reactivity in the dot blot with anti-goblet cell-positive sera, are separated by means of SDS-PAGE, the gel electrophoresis under reducing (ie after reduction eg with mercaptoethanol or dithiothreitol) and non-reducing Conditions.
  • MultiMark is used as a marker.
  • a Western blot is carried out using anti-goblet cell-positive sera and as a control anti-MUC5AC antibodies. Results :
  • a band which is above the uppermost band of the marker (185 kDa) is detected under non-reducing conditions when incubated with .anti-goblet cell-positive sera (FIG. 7A). Even after incubation with the anti-MUC5AC antibody, a band can be seen which is both above the uppermost marker band and also the band which reacts with the anti-goblet cell-positive serum. So the scheinbare- molecular mass (or molecular weight) of goblet cell 'antigen is between 185 kDa and the apparent molecular mass of the non-reduced mucin MUC5AC (> 2000 kDa).
  • 1% (w / v) agarose and 357 mM bis-Tris-HCl buffer (pH 6.5) are briefly heated until the agarose has completely dissolved.
  • the mixture is placed in 10x10 cm empty cassettes (anamed Elektrophorese GmbH), the pockets being shaped with the aid of a comb (anamed Elektrophorese GmbH).
  • the agarose gel can be used analogously to the SDS-PAGE method.
  • the sample preparation is also identical in both cases.
  • the proteins can be transferred to a nitrocellulose membrane, as is known in the case of polyacrylamide gels.
  • the blot time can be selected a little shorter, e.g. with the wet blot method used only 45 minutes.
  • the fractions of the anion exchange chromatography which are positive for goblet cell antigen, are labeled with FITC and examined for their purity in agarose gel electrophoresis under reducing and non-reducing conditions. It is compared to a Western blot of unlabelled fractions.
  • 900 ⁇ l of the sample are mixed with 100 ⁇ l of 1 M NaHC0 3 solution and 2 mg of FITC (Sigma) dissolved in 40 ⁇ l of DMSO (Hybaid). This approach is incubated overnight with the exclusion of light at room temperature on a shaker (Eppendorf). The mixture is then concentrated with 10 kDa cutoff (Vivaspin 10, VivaScience) and washed several times with 1 ml PBS until the run is colorless.
  • the sample can be used in a Western blot after SDS gel electrophoresis.
  • the Western blot incubation procedure is similar to the standard western blot incubation, with the serum incubation being omitted and alkaline phosphatase-labeled anti-FITC antibodies (Sigma, 1: 10,000 in universal buffer) being used as conjugate.
  • Lectin western blots are carried out after agarose and polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing and reducing conditions.
  • lectins PHA-L, PHA-E, RCA, Con A, LCA, PSA and AAL see also Table 1 (Fig. 8A) which is at the same level as the band recognizable after incubation with anti-goblet cell positive sera.
  • the lectins SNA, HHL, MAL I, SBA, DBA, UEA I, SJA, PNA, WGA, GSL I, PLT I, WGA s + b show as little a reaction under the conditions used as sera from healthy blood donors.
  • agarose gel electrophoresis of an unreduced fraction of the goblet cell antigen is carried out after anion exchange chromatography. From this gel, the two areas lying below the job bag on the edge are separated using a clean scalpel. A Western blot with anti-goblet cell-positive serum is carried out with these two gel fragments in order to determine the position of the goblet cell antigen in the gel. After detection 'the area containing the goblet cell antigen is cut out of the remaining agarose gel, ' incubated for 10 minutes with NuPAGE sample buffer (Inivtrogen) under reducing conditions and placed in a pocket of a NuPAGE gel. After running the gel, a lectin blot is carried out as before with the lectin PHA-E which reacts most strongly with the goblet cell antigen.
  • NuPAGE sample buffer Inivtrogen
  • the goblet cell antigen thus comprises one or more paptid chains of 56, 66 and 88 kDa.
  • Sugar residues that are linked to the protein via an N-glycosidic bond can be split off with an N-glycosidase.
  • 80 ul of the sample are mixed with 10 ul 1% (w / v) SDS and incubated for 15 minutes at 37 ° C. Then, 7, 6 ul 10% (w / v) Triton X-100 and 4 ul N-glycosidase F (4 units, Röche AG) are added. After incubation 'at 37 ° C overnight, the sample can be used in gel electrophoresis.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Becherzell-Antigen, ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell-Antigen, ein darauf aufbauendes Verfahren zur Diagnose entzündlicher Darmerkrankungen und ein Kit zur Diagnose entzündlicher Darmerkrankungen, sowie monoklonale Antikörper gegen Becherzell-Antigen.

Description

Diagnose entzündlicher Darmerkrankungen , insbesondere Colitis ulcerosa
Die vorliegende Erfindung betrifft Becherzell-Antigen, ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell- Antigen, das zur Diagnose ' entzündlicher Darmerkrankungen, besonders -von Colitis ulcerosa, geeignet ist und ein Kit zur Diagnose entzündlicher Darmerkrankungen, sowie monoklonale Antikörper gegen Becherzell-Antigen.
Die Bedeutung von entzündlichen Darmerkrankungen hat in den letzten Jahren aufgrund einer steigenden Inzidenz vor allem in den westlichen Industrieländern zugenommen (Jeηss et al . , 1996, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. Informationen und Ratschläge, Serie Gesundheit Piper/ C & H.) . BESTÄΠGUNGSKOPC Colitis ulcerosa und Morbus Crohn sind chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) , die durch Entzündungen, die verschiedene Anteile des Gastrointestinaltrakts in unterschiedlichem Ausmaß betreffen können, gekennzeichnet sind. Die Entzündungsreaktion ist bei der Colitis ulcerosa im Gegensatz zu Morbus Crohn auf den Dickdarm beschränkt und gilt daher als wichtiges Unterscheidungsmerkmal.
Beide Erkrankungen zeichnen sich durch einen schubartigen Verlauf aus, bei dem sich aktive Krankheitsphasen mit zum Teil schwerer Symptomatik und nahezu beschwerdefreie Zeiträume, die Monate oder sogar Jahre dauern können, abwechseln. Colitis ulcerosa und Morbus Crohn sind durch eine ähnliche klinische Symptomatik gekennzeichnet. Therapie und für eine Linderung nötige Medikamente sind allerdings bei beiden Erkrankungen unterschiedlich. Daher kommt der Differentialdiagnose eine besondere Bedeutung zu.
Eine serologische Untersuchung gibt erste Hinweise über das Vorliegen und die Ausprägung einer Entzündung. Dabei wird in der Regel eine Erhöhung der typischen Entzündungsparameter, wie Blutsenkungsgeschwindigkeit, C-reaktives Protein und Leukozytenzahl, festgestellt.
Durch die klinischen Symptome (Durchfall und Bauchschmerzen) lässt sich relativ schnell die Diagnose einer entzündlichen Darmerkrankung stellen. Wichtig ist hier die Abgrenzung von CED wie Colitis ulcerosa und Morbus Crohn von anderen Erkrankungen mit ähnlichem klinischen Erscheinungsbild. Durch eine bakteriologische Stuhluntersuchung kann eine Infektion mit typischen Durchfallerregern (pathogene Escherichia coli, Salmonellen etc.) ausgeschlossen werden.
Auch bei der Zöliakie bzw. Sprue handelt es sich um eine chronische Durchfallerkrankung. Diese wird aber durch eine Unverträglichkeit des Dünndarms gegenüber dem Getreideeiweiß Gluten in Verbindung mit dem Enzym Transglutaminase verursacht und ist durch eine Atrophie der Dünndarmmucosa gekennzeichnet. Da die Zöliakie manchmal auch Symptome einer entzündlichen Darmerkrankung verursacht, mit Medikamenten aber nicht zu behandeln ist, ist eine genaue Diagnosestellung sehr wichtig. Das Gluten wirkt bei der Zöliakie zusammen mit der Transglutaminase als Allergen, das eine Antigen-Antikörper- Reaktion auslöst, die zur Zerstörung der Dünndarmschleimhaut führt. Mit Hilfe einer Biopsie aus dem Dünndarm und einer serologischen Untersuchung auf Autoantikörper gegen Endomysium und Gliadin mittels indirekter Immunfluoreszenz ist eine sichere Abgrenzung möglich.
Eine relativ einfache diagnostische Maßnahme stellt die Sono- graphie des Bauchraums dar. Mit dieser Methode lassen sich Verdickungen der Darmwand und Komplikationen wie Abszesse und Fisteln (v. a. beim Morbus Crohn) erkennen. Die Sonographie trägt aber nur in geringem Umfang zur Diagnosestellung bei. Viel aussagekräftiger, aber durch die Strahlenbelastung in den Hintergrund geraten, ist die röntgenologische Untersuchung mit Kontrastmittel. Weitere einsetzbare bildgebende Verfahren sind die Computertomographie (CT) und die Magnetresonanztomographie (MRT) , die ebenfalls die Darstellung von Veränderungen im Bereich des Darms ermöglichen.
Methode der Wahl für die Differentialdiagnose Colitis ulcerosa oder Morbus Crohn stellt immer noch die Koloskopie einschließlich einer Biopsie dar. Bei der Colitis ulcerosa liegt eine superfizielle Entzündung vor, die durch eine gleichmäßige Ausbreitung und eine aborale Zunahme sowie die Bildung von Kryptenabszessen gekennzeichnet ist. Für den Morbus Crohn ist eine transmurale Entzündungsreaktion typisch, bei der segmentale, scharf andig begrenzte Herde und Granulome auftreten. Über die Biopsie läßt sich daher in den meisten Fällen eine eindeutige Diagnose stellen. Da für Patienten mit Colitis ulcerosa ein erhöhtes Risiko für Dickdarmkrebs besteht, wird zu einer jährlichen Untersuchung des Dickdarms mittels Koloskopie geraten, um bei einer Carcinomentstehung möglichst schnell geeignete therapeutische Maßnahmen ergreifen zu können. Eine weitere Sparte der Diagnostik, die von Gastroenterologen nur selten in Anspruch genommen wird, stellt die serologische Untersuchung von Autoantikörpern mit Hilfe eines indirekten Immunfluoreszenztests (IIFT) dar. Hierbei macht man sich zunutze, daß Patienten mit Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa spezifische Autoantikörper entwickeln.
Im Falle des Morbus Crohn können mit dem IIFT Antikörper gegen exokrines Pankreas mit einer Prävalenz von 39% nachgewiesen werden, die bei Patienten mit Colitis ulcerosa nicht auftreten. Titer über 1:10 sind pathognomisch für Morbus Crohn. Als Substrat dient dabei Pankreasgewebe geeigneter Primaten, im positiven Fall ist „eine netzig-granuläre, manchmal auch tropfige Fluoreszenz" zu erkennen (Stöcker et al . , 1987, Scand J Gastroenterol, 22: 41-52).
In einer Studie wiesen 76% der Patienten mit Colitis ulcerosa und 7% der Patienten mit Morbus Crohn Antikörper gegen ein unbekanntes Antigen der Granulocyten auf. Ausstriche mit humanen Ethanol-fixierten Granulocyten zeigen bei einem positiven Ergebnis in der indirekten Immunfluoreszenz eine „glatte, zum Teil auch feingranuläre, perinukleäre Fluoreszenz des Zyto- plasma (pANCA)λ (Stöcker et al . , 1987, ibid) .
Bei 70% der Patienten mit Morbus Crohn und 8% der Proben gesunder Blutspender können Antikörper gegen Saccharomyces cere- visiae in der indirekten Immunfluoreszenz festgestellt werden. Das Auftreten dieser Antikörper ist unabhängig von der Entwicklung der Anti-Pankreas-Antikörper. Durch eine Kombination beider Tests können 80% der Morbus-Crohn-Patienten erfaßt werden .
1959 wurden in Seren von Patienten mit Colitis ulcerosa Autoantikörper gegen intestinale Becherzellen entdeckt (Broberger et al., 1959, J Exp Med, 110: 657-674), die für die charakteristische Abnahme dieser Zellen im Krankheitsverlauf verantwortlich sein könnten (Hayashi et al., 2001, Digestion 63: 28- 31) . In einer Studie konnten bei 28% der Patienten mit Colitis ulcerosa spezifisch Anti-Becherzell-Antikörper nachgewiesen werden (Stöcker et al . , 1987, ibid) . Die Bedeutung dieser Autoantikörper für die Pathogenese ist immer noch ungeklärt, ebenso wie die Struktur des Antigens . Eine Auf lärung der Antigenstruktur könnte nicht nur Einblicke in den Mechanismus der Erkrankung schaffen, sie könnte auch die Basis für die Entwicklung zielgerichteter Therapiemöglichkeiten sein.
Als Substrat für die diagnostische Untersuchung auf Autoantikörper gegen intestinale Becherzellen mittels IIFT ist humanfetales Darmgewebe ideal. Da die Verwendung ethisch umstritten ist und Rattengewebe zu irreführenden Ergebnissen führt (Stöcker et al . , 1984, Deutsche Medizinische Wochenschrift, 51/52: 1963-1969), wird jedoch in der Praxis in der Regel' Darmgewebe- geeigneter Primaten eingesetzt. Im positiven Fall ist eine wolkige, unscharf begrenzte Fluoreszenz in einer. Ebene oberhalb der Becherzellen, zu erkennen (Stöcker et al.', 1987, ibid) . Neben ethischen Bedenken und der knappen Verfügbarkeit solcher Substrate ergeben sich auch Schwierigkeiten bei der Zuverlässigkeit, wodurch eine sehr aufwendige und umfassende Qualitätskontrolle nötig wird, durch die jedoch keine 100%ig reproduzierbare Qualität zu gewährleisten ist,, da es sich um nicht beeinflußbares biologisches Gewebe handelt.- Häufige unspezifische Reaktionen erschweren die Bewertung der Ergebnisse-, so daß diese Diagnostik nur von wenigen Experten durchgeführt werden kann.
Aufgrund der beschriebenen Schwierigkeiten wurden in der Vergangenheit unterschiedliche Ergebnisse erzielt und publiziert. Die Untersuchung dieser Antikörper wird daher für die Colitis ulcerosa-Diagnostik kaum noch angewendet, obwohl der prädik- tive Wert ' eines positiven Ergebnisses bei nahezu 100% liegt und mit einem positiven Test auf Anti-Becherzell-Antikörper eine Colitis ulcerosa eindeutig nachgewiesen werden kann. Durch eine Kombination der Nachweise von Anti-Becherzell-Anti- körpern und pANCA könnte sogar bei 83% der betroffenen Patienten ■ die Diagnosestellung für Colitis ulcerosa serologisch erfolgen.
Die Entwicklung eines zuverlässigen, einfach auszuwertenden Testssystems basierend auf einer leichter zugänglichen, besser standardisierbaren Quelle der Zielstruktur für Anti- Becherzell-Antikörper, ist daher erforderlich, um eine auf der Untersuchung dieser Antikörpern basierende Diagnostik und anschließende spezifische Therapie der Colitis ulcerosa zu ermöglichen.
Dieses Problem wird durch den Gegenstand der Ansprüche 1 bis- 34 und insbesondere durch die Verwendung eines Becherzell- Antigens gelöst, das bei der Kultur von HT29-18N2-Zellen unter bestimmten' Kulturbedingungen erhältlich ist und spezifisch mit Anti-Becherzell-Antikörpern von Colitis ulcerosa-Patienten reagiert .
Es wurde . bereits früher versucht, Zellkultursysteme zu entwickeln, die einen spezifischen Nachweis von Antikörpern bei Colitis ulcerosa oder Morbus Crohn erlauben. Lee et al . (1999, Gut 44: 196-202) haben die drei Kolonkarzinom- Zelllinien Caco-2, HT29 und LS-180 auf ihre Eignung als Quelle der Zielstruktur für Anti-Becherzell-Antikörper für ein spezifisches Testsystem für den Nachweis von solchen Antikörpern untersucht. Die mit diesem System erhaltenen Ergebnisse' waren jedoch nicht spezifisch für Colitis ulcerosa- Patienten, sondern die untersuchten Zelllinien reagierten auch mit Antikörpern von Morbus Crohn-Patienten.
Des Weiteren wurde für die Zelllinie HT29 gezeigt, daß sie durch den Austausch von Glucose durch Galactose im Kulturmedium scheinbar irreversibel eine Differenzierung zu verschiedenen Darmepithelzellen durchläuft (Huet at al . , 1987, JCB-105: 345-357). Für einen Subklon, HT29-18N2, wurde gezeigt, daß er neben der Morphologie von Becherzellen auch einige ihrer sonstigen Eigenschaften aufweist, so z.B. die Stimulierbarkeit durch Carbachol, die Mucus-Sekretion auslöst. In anderen - Eigenschaften soll die Zelllinie HT29-18N2 sich jedoch von. Becherzellen unterscheiden, so etwa in ihren Wachstumseigenschaften oder in der Bildung intraepithelialer Lumina (Phillips et al . , 1988, Gastroenterology 94: 1390-1403).
Hibi et al. (1994, Gut 35: 224-230) haben versucht, die Zelllinie HT29-18N2 für die Diagnose inflammatorischer Darmerkrankungen einzusetzen, kamen jedoch nicht zu spezifischen Ergebnisse , da sowohl Seren von Patienten mit Colitis ulcerosa (je nach Methode 29-38%) als auch mit Morbus Crohn (33%) mit den verwendeten Zellen reagierten. Das von den Antikörpern erkannte Antigen soll ein Molekulargewicht von >200 kDa haben,- aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehen und sowohl in' nativer als auch in reduzierter - Form von den Antikörpern erkannt werden. Eine weitere Identifizierung dieses Antigens wurde nicht vorgenommen.
Des Weiteren wurde festgestellt, daß die Zelllinie HT29-18N2 bei der Kultur in Glucose-haltigem (3,0 g/1) , Protein-freiem Medium (z.B. Protein Free Hybridoma Medium II, PFHM II, Invitrogen) vorwiegend als mit sekretorischen Granula gefüllte Becherzelle wächst, die im Gegensatz zur Zelllinie HT29 Einzelschichten bilden (Phillips et al . , 1995, In Vitro Cell Dev Biol 31: 421-423). Diese Zellen bilden darüber hinaus eine Reihe von Glykoproteinen, sogenannten Mucinen, die z.T. sezerniert werden.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß bei der Kultur von HT29-18N2-Zellen in Abwesenheit von Protein ein Antigen exprimiert wird, das mit Anti-Becherzell-Antikörpern von Colitis ulcerosa-Patienten reagiert. Dieses Antigen wird im Weiteren als Becherzell-Antigen bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht erstmalig die gezielte Herstellung und die Aufreinigung von Becherzell-Antigen. Im Rahmen dieser Erfindung wird daher Becherzell-Antigen zur Verfügung gestellt, das durch Expression durch die in Proteinfreiem Medium, wie z.B. in WO8802774 oder WO9808934 offenbart, oder in PFHM II-Medium (Protein Free Hybridoma Medium Invitrogen) , zu Becherzellen differenzierte Zelllinie HT29- 18N2 erhältlich ist und mit .Anti-Becherzell-Antikörpern von Colitis ulcerosa-Patienten nachweisbar ist.
Das Becherzell-Antigen kann z.B. von der zu Becherzellen differenzierten Zelllinie HT29-18N2 exprimiert werden. Diese Zelllinie wurde in der Forschung schon vielfach verwendet und ist deshalb leicht erhältlich, z.B. von T. Phillips, (University of Missouri, Columbia, USA) , Euroimmun (Euroimmun AG , Seekamp 31, 23560 Lübeck, Deutschland), B.L. Rodriguez (Departamehto de Genetica, CNIC, Havanna, Kuba) , R.A. Finkel- stein (University of Missouri, Columbia, USA) , J.A. Beni.tez (Morehouse School of Medicine, Atlanta, USA) , A. Frey . (For¬ schungszentrum Borstel, 23845 Borstel, Deutschland), . D. Louvard (Institut Pasteur, 75724 Paris Cedex 15, Frankreich) , R.J. Nijm'an (Erasmus Medical Center, 3000 DR Rotterdam,. Niederlande) , K. Kobayashi (Veterans Affairs Medical Center, Denver, USA) oder T. Hibi (School of Medicine, Keio University, Japan) .
Für die Differenzierung zu Becherzellen, die das Becherzell- Antigen exprimieren, ist eine Kultur der HT29-18N2-Zellen in PFHM II (Protein Free Hybridoma Medium II, Invitrogen) besonders .geeignet. Die Aussaat der Zellen kann dabei auch in Protein-haltigem Medium stattfinden (z.B. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle' s Medium), 10% (v/v) Fötales Kälberserum (FKS) zusammen, der Wechsel zu PFHM II führt zur Veränderung der Morphologie- zu der von Becherzellen. Die Zellen werden mindestens. '2 Tage, besonders bevorzugt mindestens 4, 7, 10, oder 14 Tage in Abwesenheit von Protein kultiviert. Die Zelllinie HT29-18N2 ist durch Differenzierung der Zelllinie HT29 in Abwesenheit von Glucose nach dem Verfahren von Huet et al . erhältlich (Huet et al . , 1987, ibid).
Bei den HT-29 Zellen handelt es sich um eine Zelllinie eines humanen Kolon-Adenokarzinoms, die z.B. von der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Hinterlegungsnummer ACC299) zu beziehen ist. Die adhärenten, epitheloiden Zellen wachsen mehrschichtig und in großen Kolonien. Durch die Art der Kultivierung läßt sich die Entwicklung dieser undifferenzierten Vorläufer von Darmwandzellen beeinflussen. Ersetzt man Glucose im Medium durch Galactose, sollen sich die Zellen in einem Zeitraum von ca. 1 bis 2 Wochen zu Enterozyten (ca. 90%) und Becherzellen (ca. 10%) differenzieren (Huet et al . , 1987, ibid) . Nach dem in der Publikation von Huet et al . gezeigten Verfahren können aus der Mutterzelllinie weitere Subklone mit den Eigenschaften des HT29-18N2-Klons, also auch der Expression des Bec erzell- Antigens, erhalten werden. Auch aus solchen Zelllinien kann unter geeigneten Kulturbedingungen Becherzell-Antigen erhalten werden.
Weiterhin wurde gezeigt, daß sich aus der Zelllinie HT29 durch Kultur in Gegenwart von Methotrexat und/oder 5-Fluoruracil Tochterzelllinien (HT29-MTX, HT29-FU, HT29-5M21, HT29-5F7) mit einigen Eigenschaften von Becherzellen gewinnen lässt, so z.B. die Herstellung Becherzell-typischer Mucine (Lesuffleur et al., 1991, Int J Cancer, 49: 731-737, Leteurtre, 2004, Biol Cell, 96, 145-151) . Auch aus dieser oder analog gewonnenen Zelllinien kann unter Verwendung geeigneter Kulturbedingungen Becherzell-Antigen erhalten werden.
Das Becherzell-Antigen ist besonders zur Diagnose von Colitis ulcerosa geeignet, da es spezifisch von Antikörpern aus dem Serum von ca. 28 % der Colitis ulcerosa-Patienten erkannt wird. Da nicht alle Colitis ulcerosa-Patienten Antikörper gegen Becherzell-Antigen aufweisen (Stöcker et al . , 1987, ibid) , müssen zur Identifizierung des erfindungsgemäßen Becherzell-Antigens daher entweder z.B. auf Primatendarm positiv auf Reaktivität mit Becherzell-Antigen getestete Seren von Colitis ulcerosa-Patienten (siehe z.B. Beispiel 1) oder Antikörper hinreichend vieler Colitis ulcerosa-Patienten, gegebenenfalls in vereinigter Form, verwendet werden. Anti- Becherzell-Antikörper von Colitis ulcerosa-Patienten entsprechen Anti-Becherzell-positivem Serum von Colitis ulcerosa- Patienten. Gegebenenfalls können Antikörper aus positiv getestetem Serum vor der Verwendung als Positivkontrolle, z.B. über eine Protein A oder G-Säule, aufgereinigt werden.
Das erfindungsgemäße Becherzell-Antigen ist bevorzugt nicht mit Antikörpern von Morbus Crohn-Patienten nachweisbar. Weiterhin ist es bevorzugt auch nicht mit Antikörpern von Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen (außer Colitis ulcerosa) nachweisbar. In den bisher durchgeführten Versuchen wurde keine Kreuzreaktivtät von Antikörpern von Patienten mit Morbus Crohn oder anderen Autoimmunerkrankungen mit dem Becherzell-Antigen gezeigt. Die Anwesenheit der Antikörper gegen das Becherzell-Antigen ist also spezifisch für Colitis ulcerosa .
Es konnte gezeigt werden, daß sowohl die Zellen als auch der Kulturüberstand das Becherzell-Antigen enthalten. Es ist also z.T. extrazellulär lokalisiert. Diese Ergebnisse erklären die Lokalisation der Immunfluoreszenz, z.B. bei Primatendarm, bei denen eine wolkige, unscharf begrenzte Fluoreszenz in einer Ebene oberhalb der Becherzellen zu erkennen ist (Stöcker et al . , 1987, ibid). Die Lokalisation innerhalb der Zellen kann mit diesem Verfahren nur schlecht verdeutlicht werden, da die zugehörige Fluoreszenz von der darüber liegenden Fluoreszenz überdeckt wird. Die Lokalisation kann allerdings mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop gezeigt werden, daß in der Lage ist, die störende Fluoreszenz auszublenden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Becherzell-Antigen von der in PFHM II zu Becherzellen differenzierten Zelllinie HT29-18N2 exprimiert. Bevorzugt ist das Antigen aufgereinigt, insbesondere isoliert, und wird aus dem Zellkulturüberstand der in PFHM II zu Becherzellen differenzierten Zelllinie HT29-18N2 aufgereinigt .
Eine besonders einfache, aber ausreichende Methode zur' Auf- reinigung des Antigens ist die Trennung des Kulturüberstandes von den Zellen. Die Aufreinigung kann durch eine Entfernung kleiner Proteine und niedermolekularer Mediumbestandteile wie- etwa Biotin, z.B. durch Ultrafiltration oder Gelfiltration, verbessert. werden. Bevorzugt wird das Antigen durch Ultrafiltration mit einem Filter mit einer Ausschlußgröße -von mindestens 5 kDa, insbesondere von mindestens 100 kDa, von diesem Bestandteilen getrennt und verbleibt im Retentat.
Selbstverständlich kann eine weitere Aufreinigung des Antigens vorgenommen werden, z.B. durch eine Chromatographie. Bevorzugt wird das Antigen durch Ionenaustauschchromatographie, besonders bevorzugt durch eine Anionenaustauschchromatographie bei einem pH-Wert > 5,0, bevorzugt bei einem pH-Wert > 7,5, durch Elution mit mindestens 150 mM NaCl, bevorzugt durch Elution mit mindestens 200 mM NaCl, von anderen Substanzen getrennt.
Über Anionenaustauschchromatographie aufgereinigtes Becherzell-Antigen wurde mit verschiedenen Verfahren charakterisiert. Bei einer Untersuchung durch SDS-PAGE und Western Blot mit Anti-Becherzell-positivem Serum von Colitis ulcerosa- Patienten zeigt sich unter nicht-reduzierenden Bedingungen in den Becherzell-Antigen-positiven Fraktionen nur eine einzelne Bande, die oberhalb der obersten Bande des Markers (185 kDa) liegt. Das Becherzell-Antigen hat also bevorzugt, gemessen in nicht reduzierender SDS-PAGE, eine scheinbare molekulare Masse, die größer als 185 kDa ist. Unter reduzierenden Bedingungen hingegen reagieren die Seren nicht mit dem Becherzell-Antigen. Die im Zielantigen erkannten Epitope sind daher wahrscheinlich vor allem konformationeller Natur, da sie, zumindest partiell, abhängig von der dreidimensionalen Struktur des Antigens zu sein scheinen und/oder Disulfidbrücken enthalten.
Aus den Ergebnissen ergibt sich weiterhin, daß das Becherzell- Antigen eine sehr hohe molekulare Masse aufweist. Um Proteine dieser Größe differenziert darstellen zu können, mußten statt der in der Proteinbiochemie allgemein üblichen Polyacrylamid- gelelektrophoresen Agarosegelelektrophoresen mit einem Trennbereich von ca. 100 bis >2000 kDa durchgeführt werden.
Die Mobilität des Becherzell-Antigens liegt unter diesen Bedingungen unter der von humanem IgM (nicht reduziert, Molekulargewicht ca. 950 kDa, L. Stryer, Biochemie, Spektrum Verlag, 4. Auflage 1995, S.395). Die Mobilität liegt jedoch über der des nicht-reduzierten Mucins MUC5AC. Das scheinbare molekulare Masse des nicht reduzierten Becherzell-Antigens bei der Agarosegelelektrophorese liegt also zwischen 950 kDa und der des nicht reduzierten MUC5AC (>2000 kDa, siehe J. Bara et al . , Biochem J, 15, 185-193). Die scheinbare molekulare Masse kann deswegen auf größer als 1000 kDa geschätzt werden.
In der Präparation scheint das Becherzell-Antigen die größte Menge des vorliegenden Proteins auszumachen. Es sind zwei weitere Proteinbanden nachweisbar, wobei eines der verunreinigenden Proteine das Mucin MUC5AC ist, welches von einem monoklonalen anti-MUC5AC-Antikörper erkannt wird. Das weitere verunreinigende Protein scheint in nicht reduziertem Zustand eine scheinbare molekulare Masse entsprechend der von nicht reduziertem IgM (ca. 950 kDa) zu haben, da es im Agarosegel eine Mobilität ähnlich nicht reduziertem humanen IgM aufweist. Beim Western Blot unter Verwendung von Lektinen wurde ein Protein der gleichen Mobilität von verschiedenen Lektinen gebunden. Auch hier liegt der Schluß nahe, daß es sich um das Becherzell-Antigen handelt. Das Becherzell-Antigen ist daher bevorzugt mit mindestens einem oder allen Lektinen PHA-L (Phaseolus. vulgaris-Leukoagglutinin) , PHA-E (Phaseolus vulgaris-Erythroagglutinin) , RCA (Ricinus communis- Agglutinin) , Con A (Concanavalin A) , LCA (Lens culinaris- Agglutinin) , PSA (Pisum sativum-Agglutinin) und AAL (Aleuria aurantia Lektin) nachweisbar. Unter den verwendeten Bedingungen war das Becherzell-Antigen jedoch nicht mit den Lektinen SNA (Sambucus nigra Lektin) , HHL (Hippeastrum hybrid Lektin), MAL I (Maackia amurensis Lektin I), SBA (Sojabohnen- Agglutinin) , DBA (Dolichus biflorus-Agglutinin) , UEA I (Ulex europaeus-Agglutinin) , SJA (Sophora japonica-Agglutinin) , PNA (Peanut Agglutinin) , WGA (Wheat germ Agglutinin) , GSL I (Griffonia simplicifolia Lektin I) , PTL I (Psophocarpus tetragonolobus Lektin I) , WGA s+b (Wheat germ Agglutinin, succinyliert und biotinyliert) nachweisbar. Die verunreinigenden Proteine aus der Anionenaustauschchromato- graphie-Präparation scheinen hingegen sämtlich nicht mit den untersuchten Lektinen zu reagieren.
Aus der Spezifität der Lektine, die an das Becherzell-Antigen binden, ergibt sich, dass das Antigen Galactose, Glucose, Mannose, N-Acetyl-Galactosamin und/oder Fucose umfaßt .(s. Tabelle 1, unten) . Gegenstand der Erfindung ist jedoch auch nicht oder nur partiell glykosyliertes Becherzell-Antigen, das von Anti-Becherzell-positivem Serum gebunden wird.
Anders als das Anti-Becherzell-positive Serum binden die Lektine auch nach der Reduktion des Becherzell-Antigens an die durch die Reduktion unbeeinflussten Glykane. Die Mobilität der nachgewiesenen Bestandteile ist gegenüber dem nichtreduzierten Becherzell-Antigen deutlich erhöht,' die Bande mit der vorherigen Mobilität verschwindet bei Reduktion vollständig. Daher kann man davon ausgehen, daß das Becherzell-Antigen mehrere Peptidketten umfaßt, die im nativen Zustand mit Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Bei einer reduzierenden SDS-PAGE konnte daher eine Bestimmung der scheinbaren molekularen Masse von glykosylierten Proteinen, die Bestandteile des Becherzell-Antigens zu sein, scheinen, vorgenommen werden. Dies weist darauf hin, dass das Becherzell-Antigen ein oder mehrere glykosylierte Proteine des Molekulargewichts 52-54, 56, 66 und/oder 80 kDa umfaßt.
Durch Präparation des nicht-reduzierten Gesamtproteins aus einem Agarosegel an der Stelle der Bande, die nach dem Nachweis mit Anti-Becherzell-positivem Serum sichtbar wird, anschließende Reduktion gefolgt von SDS-PAGE und Western Blot. mit den an das Becherzell-Antigen bindenden Lektinen wird deutlich, dass an dieser Stelle nur Proteine der scheinbaren molekularen Massen 56, 66, und/oder 80 kDa zu finden sind. Die Proteine im Bereich entsprechend 52-54 kDa sind hingegen nicht enthalten.' Daraus kann geschlossen werden, daß das Becherzell- Antigen ein oder mehrere Proteine der scheinbaren molekularen Massen 56, 66, und/oder 80 kDa umfaßt.
Nach Spaltung mit N-Glycosidase F verringerte sich die scheinbare- molekulare Masse dieser Bestandteile zu einem geringen Teil, die Reaktivität mit den entsprechenden Lektinen blieb jedoch erhalten. Aus diesem Befund läßt sich ableiten, dass das Becherzell-Antigen N- und O-glykosidisch gebundene Glykane umfaßt. Weiterhin lassen sich die über die Lektine nachweisbaren, z.T. endständigen Kohlenhydrate z.T. durch spezifische Glycosidasen entfernen und die darunter liegenden Kohlenhydrate freilegen. In einer bevorzugten Form sind die Glykane des Becherzell-Antigens deshalb teilweise oder ganz durch chemische oder enzymatische Methoden entfernt.
Eine weitere Aufreinigung des Becherzell-Antigens, z.B. aus den positiven Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie, ist mit Standardverfahren möglich, beispielsweise Größen- fraktionierung mittels Gelfiltration oder HPLC. Besonders bevorzugt ist jedoch die Aufreinigung mit Hilfe einer Affinitätschromatographie mit Antiseren aus dem Blut von Colitis ulcerosa Patienten oder mit Hilfe der an das Becherzell-Antigen bindenden Lektine. Für den Fachmann ergeben sich weitere Verfahren zur Aufreinigung und Isolierung des Becherzell-Antigens aus Kulturüberstand oder aus Zellen, wie etwa Filtrations-, Chromatographie-, Elektrophorese- -und Zentrifugationsverfahren oder Kombinationen aus diesen. Solche Verfahren zur Aufreinigung von Proteinen sind z.B. in Lottspeich und Zorbas (Bioanalytik, 1998, Spektrum akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin) oder Sambrook et .al. (Molecular- cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben. Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch mit solchen Verfahren aufgereinigtes oder isoliertes Becherzell-Antigen, das von Anti-Becherzell-positivem Serum gebunden wird.
Mit bekannten Methoden läßt sich mit Hilfe des aufgereinigten Antigens die dafür kodierende DNA-Sequenz bestimmen. So erlaubt _ z.B. das Ansequenzieren der gereinigten Proteinfragmente des Becherzell-Antigens die Synthese von degenerierten Primern, mit denen in einer cDNA-Bank z.B. aus den in PFHM II kultivierten HT29-18N2-Zellen die cDNA, die für Becherzell-Antigen kodiert, identifiziert werden kann. Auch das Screening einer cDNA-Expressionsbank mit gegen Becherzell- Antigen generierten Antikörpern oder mit Antikörpern von Colitis ulcerosa-Patienten oder die Suche in geeigneten Datenbanken ist möglich.
Die Klonierung der cDNA in einen Expressionsvektor erlaubt eine rekombinante Expression des Antigens. Eine Expression des Proteins ist in verschiedenen Systemen möglich, z.B. bakteriellen Systemen wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis, in Hefen wie Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris oder anderen eukaryontischen Zellen, wie 293-, CHO-, COS- oder Insektenzellen. Bevorzugt ist die Expression in eukaryontischen Zellen, bevorzugt einer eukaryontischen Zelllinie, da hier eine Glykosilierung des Proteins sowie notwendige weitere Prozessierungen stattfinden können. Verschiedene Expressionsvektoren für die jeweiligen Systeme sind bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Becherzell- antigen als Fusionsprotein exprimiert, z.B. als Ig- Fusionsprotein oder unter Verwendung eines Anhangs zur Proteinaufreinigung, z.B. eines Polyhistidinanhangs (His-Tag) . In einer bevorzugten Ausführungsform wird demnach ein rekombinantes Antigen verwendet. Die erwähnten Methoden sind z.B. in Lottspeich und Zorbas (Bioanalytik, 1998, Spektrum akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin) oder Sambrook et al . (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsfrom werden nur die Teile des Antigens exprimiert, an die die Antikörper von Colitis ulcerosa-Patienten binden, um z.B. unspezifische Bindungen von Antikörpern von Patienten mit anderen Autoimmunkrankheiten zu vermeiden oder die Expression des Antigens zu optimieren. Solche Teile können sowohl einzelne reaktive Teilbereiche des Antigens umfassen als auch Fusionsproteine aus mehreren reaktiven Teilbereichen des Antigens oder Fusionsproteine aus einem oder mehreren reaktiven Teilbereichen des Antigens und nicht zum Becherzell- Antigen gehörenden Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein monoklonaler Antikörper, der Becherzell-Antigen erkennt. Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung eines solchen Antikörpers ist die Immunisierung einer Maus mit aufgereinigtem Becherzell-Antigen. Nach ca. 2 Wochen wird die Milz entnommen, und die Milzzellen werden unter Einwirkung von Polyethylenglykol (PEG) mit Myelomzellen verschmolzen. Diesen fehlt das Enzym HPRT, so daß sie in HAT- Selektionsmedium nicht überleben können. Nur mit Milzzellen fusionierte Myelomzellen überleben die Kultur in- dem Selektionsmedium. Die entstandenen Hybridom- zellen werden kloniert und mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die Produktion von Antikörpern getestet. , Im Detail ist das Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper z.B. in Sambrook et al . (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben.
Eine besonders bevorzugte Methode umfaßt die Humanisierung des so gewonnenen monoklonalen Antikörpers . Dies geschieht durch Isolierung' der zugehörigen cDNA aus den Hybridomazellen -und Austausch der für den Fc-Teil des monoklonalen Antikörpers kodierenden Sequenz durch eine entsprechende humane Sequenz . Die so entstandene hybride Sequenz kann in einen geeigneten Expressionsvektor überführt und in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert und aus diesem mit bekannten Methoden aufgereinigt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird demnach ein rekombinanter Antikörper verwendet. Die erwähnten Methoden sind z.B. in Lottspeich und Zorbas (Bioanalytik, 1998, Spektrum akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin) oder Sambrook et al . (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory. Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben.
Eine weitere bevorzugte Methode zur Gewinnung eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers ist die Isolierung von spezifischen humanen B-Lymphozyten aus entzündetem Darmgewebe von • Colitis ulcerosa-Patienten mit Anti-Becherzell- positivem Serum. Solche Lymphozyten lassen sich durch Exzision des betroffenen Darmbereichs und Kultivierung der enthaltenen Zellen, insbesondere der B-Lymphozyten, in einem geeigneten Medium gewinnen. Eine weitere Isolierung spezifischer B- Lymphozyten kann durch Sortierung der gewonnen Zellen in einem Fluoreszenz-assistierten Zellsortierer (FACS) unter Zuhilfenahme eines mit einem Fluorophor markierten, B-Lymphozyten- spezifischen Antikörpers, z.B. Anti-CD20, zur Identifizierung von B-Lymphozyten und/oder des aufgereinigten, mit einem zweiten Fluorophor markierten Becherzell-Antigens zur Identifizierung spezifischer B-Lymphozyten stattfinden. Diese lassen sich z.B. auf analoge Weise zu dem oben beschriebenen Verfahren in Hybridomazellen überführen und selektieren.
Eine alternative Möglichkeit besteht in der Erstellung einer Phage Display-Bibliothek basierend auf den cDNAs der Antikörper aus den so gewonnen Zellen. Nach einem Screening auf Bindung an das basierend auf dem erfindungsgemäßen Verfahren - aufgereinigte Becherzell-Antigen kann durch Isolierung' der für das spezifische Immunglobulin kodierenden cDNA, Überführung der cDNA in einen geeigneten Expressions-- vektor, Expression in einem geeigneten Expressionssystem und Aufreinigung des Antikörpers mit bekannten Methoden eine spezifischer monoklonaler Antikörper gewonnen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird demnach ein humaner rekombi- nanter Antikörper verwendet. Die erwähnten Methoden sind z.B. in Eggena et al . , 1996, J Immunol, 156: 4005-4001 beschrieben.
Eine weitere bevorzugte Methode zur Gewinnung eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers ist das Screening einer Phage Display-Bibliothek, die auf randomisierten cDNAs von humanen Antikörpern beruht, z.B. der HuCAL Gold-Bibliothek der Firma MorphoSys, auf Bindung an das aufgereinigte Becherzell-Antigen mit einem der der erfindungsgemäßen Verfahren.' Durch anschließende Überführung der zugehörigen cDNAs in einen geeigneten Expressionsvektor, Expression, in einem geeigneten Expressionssystem, Aufreinigung des Antikörpers mit bekannten Methoden und Screening auf erwünschte- Eigenschaften läßt sich zunächst ein für das Becherzell-Antigen spezifisches Fab-Fragment gewinnen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird demnach ein humanes rekombinantes Fab-Fragment verwendet. Dieses läßt sich durch Komplementierung mit einer für den Fc-Teil kodierenden cDNA zu einem vollständigen humanen Immunglobulin verändern. Mit anderen Bibliotheken sind analog auch direkt vollständige Immunglobuline zu erhalten. Die erwähnten Methoden sind in der technischen Beschreibung der HuCAL Gold-Bibliothek der Firma MorphoSys beschrieben.
Für den Fachmann ergeben sich weitere Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper. Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch mit solchen Verfahren hergestellte monoklonale Antikörper, die an Becherzell-Antigen binden, das von Anti-Becherzell-positivem Serum gebunden wird.
Weiterhin wird im Rahmen der Erfindung ein Kit zur Diagnose von entzündlichen Darmerkrankungen zur Verfügung gestellt, das Becherzell-Antigen sowie z.B. eine Anleitung zur Diagnose von entzündlichen Darmerkrankungen umfaßt. Bevorzugt umfaßt das Kit weiterhin auch den monoklonalen Antikörper, so daß als Positivkontrolle für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens keine positiven Seren von Colitis ulcerosa- Patienten verwendet werden müssen.
Im Rahmen dieser Erfindung wird auch ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell-Antigen zur Verfügung gestellt, bei dem man eine biologische Probe mit einem Antigen in Kontakt bringt und man die Bindung von Antikörper an das Antigen nachweist, wobei das Antigen durch Expression durch die in PFHM II zu Becherzellen differenzierte Zelllinie HT29-18N2 erhältlich und mit Anti-Becherzell- Antikörpern von Colitis ulcerosa-Patienten nachweisbar ist. Für das Verfahren wird das oben beschriebene Becherzell- Antigen eingesetzt.
Das Verfahren ist besonders zur Diagnose von Colitis ulcerosa geeignet, da das Antigen spezifisch von Antikörpern aus dem Serum von ca. 28 % der Colitis ulcerosa-Patienten erkannt wird. Die Probe, die auf Antikörper gegen Becherzell-Antigen untersucht werden soll, ist eine biologische Probe, im allgemeinen eine Blut- oder Serumprobe. Bevorzugt handelt es sich um eine Probe von einem Patienten mit einer entzündlichen Darmerkrankung, bei dem eine Colitis ulcerosa vorliegen könnte. Es kann sich jedoch auch z.B. um den Überstand eines Hybridoms oder eine Phage Display- Bibliothek handeln.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedene Methoden eingesetzt werden, um die Bindung der Antikörper an das Antigen nachzuweisen. Bevorzugt erfolgt dies mit einem ELISA oder Blot, z.B. einem Western Blot oder Dot Blot.
Darüber hinaus können auch Schnelltests zum qualitativen Nachweis von Antikörpern zum Ablesen einer Farbreaktion auf einem Teststreifen verwendet werden. Solche Tests basieren im allgemeinen auf einem Sandwich-Festphasen-Immunoassay, bei dem Becherzell-Antigen an ein Testfeld oder in einer Linie auf dem Teststreifen gekoppelt wird. Der Teststreifen wird z.B. mit einer Blutprobe oder verdünntem Patientenserum in Kontakt gebracht, die eventuell anti-Becherzell-Antigen-Antikörper enthält . Sekundäre anti-human-Immunglobulin-Antikörper der geeigneten Spezifität, z.B. mit Goldkonjugat oder mit einem Enzym wie Alkalischer Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase konjugiert, sammeln sich nur dann in dem Testfeld, wenn in der Probe Antikörper enthalten waren. Gegebenenfalls muß das Ergebnis noch mit einem chromogenen Substrat sichtbar gemacht werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell-Antigen, bei dem man eine Probe mit einer in Protein-freiem Medium zu Becherzellen differenzierten Zelllinie, die von der HT29-Zelllinie abgeleitet ist, in Kontakt bringt, und man die Bindung von Antikörper an das Antigen nachweist. Die dafür bevorzugt verwendeten Kulturbedingungen wurden oben bereits ausführlich beschrieben. Das unter diesen Kulturbedingungen von den Zellen exprimierte, erfindungsgemäße Becherzell-Antigen reagiert spezifisch mit Anti-Becherzell-Antikörpern von Colitis ulcerosa-Patienten . Es ist also nicht mit Antikörpern von Morbus Crohn-Patienten nachweisbar, bevorzugt auch nicht mit Antikörpern von Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen. Bevorzugt ist die in Protein-freiem Medium zu Becherzellen differenzierte Zelllinie die Zelllinie HT29-18N2.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den beschriebenen Zellen erlaubt den Nachweis der Bindung der Antikörper an das Antigen mit indirekter oder direkter Immunfluoreszenz. Dieses Verfahren ist im Moment das Standardverfahren zum Nachweis von Becherzell-Antigen (Stöcker et al . , 1984, 1987, ibid) unter Verwendung von Darmgewebe, so daß ein Vergleich der Methoden besonders gut möglich ist. Dieser Vergleich ergibt, daß die Zellen mit Anti-Becherzell-positiven Seren eine wolkige, unscharf begrenzte Fluoreszenz in einer Ebene oberhalb der Zellen zeigen, die der Reaktion der selben Seren auf Primaten- sowie human-fetalem Darm stark ähnelt.
Blutspender-Seren wiesen im Vergleich keine spezifische Reaktivität auf. Ein Vergleich der Sensitivität der Substrate in der indirekten Immunfluoreszenz zeigt, daß die HT29-18N2 Zelllinie als Substrat für die Diagnostik zur Erfassung der Anti-Becherzell-Antikörper besser geeignet ist als der Primatendarm. Unspezifische Reaktionen fehlen oder sind vernachlässigbar gering, so daß mit dem indirekten Immunfluoreszenztest mit HT29-18N2 Zellen als Substrat jederzeit vergleichbare und eindeutig auswertbare Ergebnisse bei der Diagnostik der Colitis ulcerosa erzielt werden können.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bisher ermittelte Prävalenz von Antikörpern gegen Becherzell-Antigen liegt bei ca. 28%. Dies stimmt mit bereits von Stöcker et al . (1987, ibid) ermittelten Werten überein. Auch Erkrankungen mit bewiesener Autoimmunpathogenese weisen in den meisten Fällen eine Prävalenz der entsprechenden Autoantikörper von weniger als 90% auf. Der relativ niedrige Prozentsatz der Anti-Becherzell-Antikörper bei Colitis ulcerosa könnte durch eine Neutralisation der zirkulierenden Antikörper durch Erythrozyten oder andere Zellen oder Strukturen bedingt sein: Es hat sich z.B. gezeigt, daß Patienten mit der Blutgruppe 0 nur eine Prävalenz von 19% zeigen, bei Patienten mit der Blutgruppe AB liegt sie dagegen bei 66%.
Der prädiktive Wert eines Nachweises von Antikörpern gegen Becherzell-Antigen liegt bei 100%. Im Rahmen der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Diagnose von entzündlichen Darmerkrankungen zur Verfügung gestellt, bei dem man mit den erfindungsgemäßen Verfahren diese Antikörper nachweist, wobei man durch' den Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell- Antigen eine Colitis ulcerosa diagnostiziert.
Für Anti-Pankreas-, Anti- Saccharomyces cerevisiae-Antikörper und pANCA- sind bereits zuverlässige Testsysteme etabliert worden, die vorliegende Erfindung stellt ein solches Testsystem für Anti-Becherzell-Antigen bereit. Eine Kombination der vier Tests würde in vielen Fällen eine Endoskopie überflüssig machen. Bei ca. 80% der Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kann somit serologisch bereits durch die Untersuchung der Antikörper gegen Becherzell- Antigen, Pankreassekret, Saccharomyces cerevisiae sowie pANCA eine Differentialdiagnose gestellt werden.
Gegenstand- der Erfindung ist auch die Verwendung von Becherzell-Antigen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Colitis ulcerosa. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, vorzugsweise zur Behandlung der Colitis ulcerosa, die Becherzell-Antigen umfaßt, gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch geeigneten- Trägermittel und/oder Hilfsstoffen. Bei der Behandlung der Colitis ulcerosa bringt man beispielsweise eine Körperflüssigkeit des Patienten in Kontakt mit dem Antigen.
Unter Körperflüssigkeit wird im Rahmen dieser Erfindung z.B. Blut oder- Darminhalt bzw. das Sekret der Schleimhaut des Patienten verstanden. Bevorzugt wird Becherzell-Antigen an eine inerte Matrix gekoppelt, z.B. Kieselgel oder ein für Menschen unverdauliches Kohlenhydrat wie Alginat, Cellulose, Pektin, Carrageen o.a.. Dieses Konjugat wird anschließend mit einer Körperflüssigkeit eines Patienten mit Anti-Becherzell- Antikörpern in Kontakt gebracht, um die in dieser Körperflüssigkeit enthaltenen Anti-Becherzell-Antikörper an das Konjugat zu binden.
Es gibt -verschiedene Möglichkeiten, die Körperflüssigkeit eines Patienten in Kontakt mit einer solchen Matrix ■ zu bringen. Eine Möglichkeit ist eine Hämodialyse zur Entfernung der Antikörper. Dabei wird Blut eines Colitis ulcerosa
Patienten .aus dem Körper entnommen und mit der konjugierten Matrix in -Kontakt gebracht. Anschließend wird das Blut von .dem Konjugat •getrennt und zurückgeführt, so daß die Anti- Becherzell-Antikörper aus der Körperflüssigkeit entfernt werden und sich nicht mehr am inflammatorischen Prozess beteiligen, können. Da ein Großteil der Anti-Becherzell- Antikörper- als IgG vorliegt, verringert die Entfernung der spezifischen Antikörper dieses Isotyps, die im Blut vorliegen, die Gesamtmenge an Antikörper deutlich. Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung von Becherzell-Antigen zur ex vivo Entfernung von Anti-Becherzell-Antikörpern aus dem Blut von Colitis ulcerosa-Patienten.
Neben einem solchen Kontakt ex vivo ist auch ein in vivo Kontakt möglich. Beispielsweise kann eine inerte Matrix mit gekoppeltem Becherzell-Antigen in Tablettenform magendurchgängig, also in einer magensaftresistenten Formulierung, in den Darm verbracht werden. Bevorzugt - ist weiter die Kopplung eines Zytotoxins an das Becherzell-Antigen. Nach der Verabreichung in Colitis ulcerosa-Patienten mit Anti-Becherzell-Antikörpern bindet das Konjugat an die spezifischen B-Lymphozyten und zerstört diese oder induziert in ihnen Apoptose. Bevorzugt ist das Zytotoxin für B-Lymphozyten spezifisch.
Alternativ kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Becherzell-Antigen umfaßt, auch zur Induktion von Toleranz' gegen das .Becherzell-Antigen verwendet werden. Bevorzugt wird das Becherzell-Antigen dafür mit antiinflammatorischen Zytoki- nen, wie z.B. TGF-ß oder IL-10 formuliert, die regulatorische T-Zellen induzieren können (Chen et al . , 2003, J. Exp. Med., 198, 1875-86) . Geeignete Adjuvantien sowie weitere Verfahren zur Induktion von Toleranz sind im Stand der Technik bekannt, z.B. die Blockade kostimulierender Signale oder die - Verabreichung des Antigens im Kontext tolerogener autologer dendritischer Zellen (Xiao et al . , 2003, BioDrugs, 17, 103-11) .
Die folgenden Versuche zeigen besondere Ausführungsformen der Erfindung. Zunächst wurde versucht, humanes oder Primaten- Darmgewebe zur Isolierung von Becherzell-Antigen einzusetzen. Dieses Gewebe ist, wie bereits in der Literatur bekannt, zum Nachweis von Anti-Becherzell-Antikörpern mittels indirekter Immunfluoreszenz geeignet. Es wurde jedoch festgestellt, .daß mit keinem der durchgeführten Versuche (Westernblot, Neutralisationstests, Lektin-ELISA) spezifische Reaktionen von einer oder mehreren Fraktionen einer Darmpräparation und den Anti-Becherzell-positiven Seren nachgewiesen werden können. Daher scheint das Darmgewebe unter den gegebenen Bedingungen für die Aufreinigung von Becherzell-Antigen und die Herstellung standardisierter, auf einer ELISA- oder Blot- Technik basierender Testsysteme nicht geeignet, zu sein. Analoge Ergebnisse wurden mit der unter Standardbedingungen (siehe Angaben zur Zelllinie der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen) kultivierten Zelllinie HT29 erzielt. Daher wurde in der Folge die HT29-18N2-Zellinie untersucht, von der überraschenderweise gezeigt werden konnte, daß sie unter den. oben beschriebenen Kulturbedingungen Becherzell- Antigen exprimiert. Mit dieser Zelllinie waren sowohl indirekte ■ Immunfluoreszenz als auch ELISA und Western Blot möglich, sodass sie zum Nachweis von Anti-Becherzell- Antikörpern- geeignet ist. Weiterhin kann mit Hilfe dieser Zellinie Becherzell-Antigen aufgereinigt werden.
Legende der Abbildungen:
Fig. 1:
Indirekte Immunfluoreszenz mit Darmgewebe
A: Darstellung von Autoantikörpern von Colitis ulcerosa- Patienten gegen intestinale Becherzellen (Anti-Becherzell- Antikörper) durch indirekte Immunfluoreszenz auf Intestinum human fetal (200fache Vergrößerung) .
B: Darstellung von Autoantikörpern gegen intestinale Becherzellen (FITC-markiert) und Anti-MUC2-Antikörpern (TRITC- markiert) durch indirekte Immunfluoreszenz auf Darm prim. adult (200fache Vergrößerung) .
C, D: Darstellung des Anti-MUC2-Antikörpers durch indirekte Immunfluoreszenz auf Intestinum prim. adult (C: 200fache Vergrößerung, D: 400fache Vergrößerung) .
Fig,
Fraktionierung von Darmgewebe
A: Silbergel der Fraktionen einer Präparation aus humanem adulten Darmgewebe. Aufgetragen wurden jeweils 1 μl der angegebenen Fraktionen. Die Proben wurden durch Zentrifugation mit steigenden Umdrehungszahlen pro Minute gewonnen.
B,C: Westernblot der Fraktionen der Darmpräparation, inkubiert mit einem Gemisch aus Anti-Becherzell-positive Seren (B) und Blutspender-Seren (C)(l: Homogenat, 2: Überstand 1, 3: Sediment 1, 4: Überstand 2, 5: Sediment 2, 6: Überstand 3, 7: Sediment 3, 8: Überstand 4, 9: Sediment 4, 10: Überstand 5, 11: Sediment 5) . Fic
Schematischer Aufbau eines Lektin-ELISA
Die biotinylierten Lektine binden an eine mit Streptavidin beschichtete und BSA blockierte Platte. In der Probe vorhandene. Antigene werden über ihren Kohlenhydratanteil gebunden und eine Reaktion mit Primär-Antikörpern aus dem Serum und POD-markierten Sekundär-Antikörpern aus dem Konjugat spezifisch' nachgewiesen.
Fig. 4:
Indirekte Immunfluoreszenz mit HT29-18N2-Zellen
A,B: Darstellung von Autoantikörpern gegen Becherzellen (A) , eines Blutspender-Serums (B) , von Anti-MUC2-Antikörpern (C) und von Anti-MUC5AC-Antikörpern (D) durch indirekte Immunfluoreszenz auf HT29-18N2 Zellen nach Differenzierung zu Becherzellen in PFHM II Medium (200fache Vergrößerung) .
Fiq,
Analyse von HT29-18N2 Zellkulturüberständen
A: Darstellung der Reaktivität Anti-Becherzell-positiver Seren (Serum 1 bis 3) verglichen mit Blutspender-Seren (BS 1 bis 4) sowie dem Anti-MUC5AC-Antikörper durch Dotblot.
Die Proben wurden mit einem Filter mit einer Ausschlußgröße von 100 kDa eingeengt und das Medium gegen PBS ausgetauscht. Aufgetragen wurden jeweils 2 μl Probe. Es handelt sich um Zellkulturüberstände verschiedener Kulturflaschen (A, B und C) , die zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Beginn der Differenzierung gewonnen wurden.
B: Darstellung der Reaktivität von Anti-Becherzell-positiven und Blutspender-Seren (BS-Seren) gegenüber Chromatographie- Fraktionen' eines HT-2918N2 Zellkulturüberstandes .
Aufgetragen wurden jeweils 5 μl der Fraktion. Der rechte Streifen zeigt die Reihenfolge der aufgetragenen Fraktionen' (A steht für Auftrag) . Die Negativ-Kontrolle wurde mit Puffer statt einer Serumverdünnung inkubiert.
Fig. 6:
Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell-Antigen im ELISA
A: Reaktivität verschiedener Ausgangssubstrate (Zellen und Zellkulturüberstand) mit Anti-Becherzell-Antikörpern aus Seren von Colitis ulcerosa-Patienten (CU, dunkel) und Blutspender- Seren (BS,-hell) im ELISA.
B: Reaktivität der Chromatographie-Fraktionen eines Zell- kulturüberstandes mit Anti-Becherzell-positiven und Blutspender-Seren im ELISA.
Fig. 7:
Charakterisierung von Becherzell-Antigen in SDS-PAGE /Western
Blot
A: SDS-PAGE / Western Blot der Chromatographie-Fraktionen unter reduzierenden/nicht reduzierenden Bedingungen Gleiche Mengen einer Probe einer für Becherzell-Antigen positiven Chromatographie-Fraktion wurden unter reduzierenden (jeweils linke Spur) und nicht-reduzierenden (jeweils rechte Spur) Bedingungen für SDS-PAGE verwendet. Der Western Blot wurde mit Anti-MUC5AC-Antikörper (mittlerer Streifen) und Anti-Becherzell-positivem Serum (rechter Streifen) gefärbt. Als Marker wurde MultiMark verwendet.
B: Agarosegelelektrophorese / Western Blot der Chromatographie-Fraktionen unter reduzierenden/nicht reduzierenden Bedingungen
Gleiche Mengen einer Probe einer für Becherzell-Antigen positiven Chromatographie-Fraktion wurden unter reduzierenden (jeweils linke Spur) und nicht-reduzierenden (jeweils rechte Spur) Bedingungen für eine Agarosegelelektrophorese verwendet. Der Western Blot wurde mit Anti-Becherzell-positiven Seren (1. und 2. Streifen von links), Blutspender-Seren (3. und 4. Streifen von links) und Anti-MUC5AC-Antikörper (rechter Streifen) gefärbt.
C: FITC-Markierung einer Becherzell-Antigen-positiven Chromatographie-Fraktion
Die Probe der Chromatographie-Fraktion wurde mit FITC markiert und unter reduzierenden (Bahn 2) und nicht-reduzierenden (Bahn 3) Bedingungen untersucht. Als Vergleich dienen eine unmarkierte, nicht-reduzierte Probe, nachgewiesen mit Anti- Becherzell-Antigen-positivem Serum (Bahn 4) bzw. Anti-MUC5AC- Antikörper (Bahn 5) sowie nicht-reduziertes humanes IgM (Bahn 1) •
Fig. 8:
Charakterisierung der Glykane von Becherzell-Antigen durch
Western Blot mit Lektinen
A: Agarosegelelektrophorese / Western Blot der Chromatographie-Fraktion unter nicht-reduzierenden Bedingungen Streifen 1 (von links nach rechts) : Anti-Becherzell-positives Serum; Streifen 2 und 3: Blutspender-Seren; Streifen 4: SNA, Streifen 5: PHA-L, Streifen 6: PHA-E; Streifen 7: HHL; Streifen 8: RCA; Streifen 9: MAL I; Streifen 10: Con A; Streifen 11: SBA; Streifen 12: DBA; Streifen 13: UEA I; Streifen 14: SJA; Streifen 15: PNA; Streifen 16: WGA; Streifen 17: LCA; Streifen 18: GSL I; Streifen 19: PSA; Streifen 20: PTL I; Streifen 21: AAL; Streifen 22: WGA s+b.
B: Agarosegelelektrophorese / Western Blot / Lektin-Blot der Chromatographie-Fraktion unter reduzierenden Bedingungen Streifen 1 (von links nach rechts): SNA; Streifen 2: PHA-L; Streifen 3: PHA-E; Streifen 4: HHL, Streifen 5: RCA, Streifen 6: MAL I; Streifen 7: Con A; Streifen 8: SBA; Streifen 9: DBA; Streifen 10: UEA I; Streifen 11: SJA; Streifen 12: PNA; Streifen 13: WGA; Streifen 14: LCA; Streifen 15: GSL I; Streifen 16: PSA; Streifen 17: PTL I; Streifen 18: AAL; Streifen 19: WGA s+b.
C: SDS-PAGE / Western Blot 7 Lektin-Blot der Chromatographie- Fraktion unter reduzierenden Bedingungen
Streifen 1 (von links nach rechts): SNA; Streifen 2: PHA-L; Streifen 3: PHA-E; Streifen 4: HHL, Streifen 5: RCA, Streifen 6: MAL I; Streifen 7: Con A; Streifen 8: SBA; Streifen 9: DBA;
Streifen 10 UEA I; Streifen 11: SJA; Streifen 12: PNA; Streifen 13 WGA; Streifen 14: LCA; Streifen 15: GSL I; Streifen 16 PSA; Streifen 17: PTL I; Streifen 18: AAL;
Streifen 19: WGA s+b.
D: Charakterisierung des Becherzell-Antigens nach Präparation aus einem Agarosegel linke Spur: Marker; rechte Spur: Becherzell-Antigen nach Präparation aus einem Agarosegel, Lektin-Blot mit PHA-E.
Fig. 9:
Charakterisierung der Glykane von Becherzell-Antigen nach Deglykosylierung
A, B: Lektin-Blot nach Deglykosylierung mit N-Glykosidase F linke Spur: Probe der Chromatographie-Präparation nach N- Glykosidase-Verdau; rechte Spur: Probe der Chromatographie- Präparation ohne Verdau, jeweils gleiche Mengen der Probe. A: Bahn 1: Marker; Bahn 2: N-Glykosidase F; Streifen 1: PHA- L; Streifen.2: PHA-E; Streifen 3: RCA; Streifen 4: LCA. B: Bahn 1: Marker; Bahn 2: N-Glykosidase F; Streifen 5: PSA; Streifen 6: AAL. Beispiele
Beispiel 1:
Identifizierung von Becherzell-positiven Seren von
Colitis ulcerosa-Patienten
Ein Nachweis des gesuchten Antigens ist durch die Verwendung von Anti-Becherzell-positiven Seren möglich. Daher werden mit Hilfe von Objektträgern mit Schnitten adultem Primatendarms, human fetalem (aus überschüssigem Material pathologisch analysierter Proben) und human adultem Darms (aus chriurgischem Resektionsmaterial) Seren von Colitis ulcerosa- Patienten ' in der Immunfluoreszenz auf ihre Reaktivität mit Becherzellen untersucht. Für die Untersuchung werden z.B. Objektträger der Firma EUROIMMUN samt zugehöriger Hilfsreagenzien benutzt.
Der Test wird nach Standardmethoden, z.B. gemäß der Anleitung für den indirekten Immunfluoreszenztest der Firma EUROIMMUN, durchgeführt, wobei ausschließlich Konjugate der Klassen IgG und IgA eingesetzt werden. Auf diese Weise werden 200 Seren von Colitis ulcerosa-Patienten untersucht, Anti-Becherzell- positive Seren können für weitere Versuche als ■ Positiv- Kontrolle eingesetzt werden.
Ergebnisse.:
Anti-Becherzell-positive Seren zeigen eine wolkige, unscharf begrenzte ' Fluoreszenz in einer Ebene oberhalb der Becherzellen. Zusätzlich ist bei vielen Seren eine unspezifische Hintergrundfluoreszenz zu erkennen. Blutspender-Seren und negativ reagierende Proben zeigen nur diese Hintergrundfluoreszenz, je nach Serum mit unterschiedlicher Intensität. In diesem ' Test auf Becherzell-Antigen reagierende Seren von Colitis ulcerosa-Patienten werden als Anti-Becherzell-positive Seren bezeichnet. Ähnlich wie von Stöcker et al . bereits gezeigt (1987, ibid) waren 28% der untersuchten Seren Anti-Becherzell-positiv, führten also zu der für Becherzell-Antigen typische Fluoreszenz .
Beispiel 2 :
Färbung von Becherzell-Antigen in Darmgewebe
Gewebeschnitte von Primatendarm, humanem fetalen und adultem Darm wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, in indirekter Immunfluoreszenz mit Anti-Becherzell-positiven Seren auf Becherzell-Antigen untersucht. Die Expression weiterer Anti- gene wurde untersucht.
Für die Detektion der weiterhin eingesetzten monoklonalen Antikörper gegen die Mucine MUC2 (Abcam Ltd) und MUC5AC (NeoMarkers, Inc.) werden als Konjugat FITC (Fluorescein) - markierte Anti-Maus-Antikörper der Klasse IgG und für die Anti-MUC3-Antikörper (Quartett GmbH) FITC-markierte AntiKaninchen-Antikörper ebenfalls der Klasse IgG eingesetzt. Bei einer Doppelfluoreszenz werden die Objektträger nach der Seruminkubation gewaschen und dann mit einem der monoklonalen Antikörper 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem anschließenden Waschschritt wird als Konjugat ein Gemisch aus Anti-Human-IgG-FITC (1:5 in PBS-Tween verdünnt) und Anti-Maus- IgG-TRITC (Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat) (1:200 in PBS- Tween verdünnt) eingesetzt.
Ergebnisse:
Auf allen eingesetzten Darmschnitten zeigt sich mit den Anti- Becherzell-positiven Seren die für Becherzell-Antigen typische Fluoreszenz (Fig. 1A und B) . Die zusätzlich getesteten monoklonalen Antikörper gegen die Mucine 2, 3 und 5AC, die alle im Darm exprimiert werden (Hayashi et al . , 2001, Digestion 63, 28-31), weisen unterschiedliche Muster und Lokalisationen auf. Der Anti-MUC2-Antikörper zeigt eine granuläre Fluoreszenz, die auf das Zytoplasma der Becherzellen begrenzt ist (Fig. IC und D) . Nach Inkubation mit dem Anti-MUC 3-Antikörper reagieren außer den Becherzellen noch andere Darmstrukturen. Der Anti- MUC5AC-Antikörper, der als einziger der verwendeten monoklonalen Antikörper nach Angaben des Herstellers mit dem vollständig glykosilierten Antigen reagiert, zeigt wie der Anti- MUC2-Antikörper ein Becherzeil-spezifisches Fluoreszenzmuster, wobei das Muster nach Inkubation mit dem Anti-MUC5AC- Antikörper dem nach der Inkubation mit Becherzell-positiven Seren ähnelt. Nach Inkubation mit dem Anti-MUC2-Antikörper zeigt sich neben einer zytoplasmatisch lokalisierten Fluoreszenz jedoch auch eine membranassoziierte. Mit Hilfe einer Doppelfluoreszenz mit einem Anti-Becherzell-positiven Serum und. dem Becherzeil-spezifischen Anti-MUC2-Antikörper kann die • Lokalisation des positiven Signals verdeutlicht werden. Der über TRITC-markierte Anti-Maus-Antikörper. nachgewiesene Anti-MUC 2-Antikörper reagiert - wie beschrieben - mit dem Zytoplasma der Becherzellen, die mit FITC-markierten Anti-Human-Antikörpern sichtbar gemachte Becherzellspezifische Reaktion des Serums befindet sich in der Ebene darüber (Fig. 1B) .
Beispiel 3:
Fraktionierung von Darmgewebe
Humaner adulter Darm wird im gefrorenen Zustand abgewogen und auf Eis mit etwa 3 Volumen TNE-T-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenyl ethylsulfonyl- fluorid) , 0,1% Triton X-100) überschichtet. Nach dem Auftauen wird das' Gewebe erst mit einer Schere zerschnitten, anschließend mit einem Miccra D-8 (ART - moderne Labortechnik) dreimal jeweils 1 Minute (Stufe C) unter Eiskühlung zerkleinert. .Zum Abkühlen der Probe wird zwischen den Schritten eine Pause- von je 5 Minuten eingelegt. Der Ansatz' wird 30 Minuten bei 500 x g und 4°C zentrifugiert, der Überstand abgefüllt und das Sediment in einem Volumen TNE- Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 M EDTA, 1 mM PMSF) resuspendiert. Danach folgt ein weiterer Zentrifuga- tionsschritt über 30 Minuten bei 2.000 x g und 4°C. Wieder wird der ' Überstand abgenommen und das Sediment in einem Volumen TNE-Puffer resuspendiert.
Anschließend wird die Probe 30 Minuten bei 21.250 x g und 4°C zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das Sediment in einem Volumen TNE-Puffer resuspendiert. Sollte nach diesem ■ Schritt eine Fettschicht sichtbar sein, wird durch Glaswolle filtriert .
Der Ansatz wird 60 Minuten bei 100.000 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird abgefüllt, das Sediment in einem Volumen TNE-Puffer resuspendiert und dann 60 Minuten bei 220.000 x g und 4°C zentrifugiert. Nachdem der Überstand abgefüllt ist, wird das Sediment in einem Volumen TNE-Puffer resuspendiert.
Nach der Homogenisierung und anschließenden Fraktionierung durch Ultrazentrifugation werden die einzelnen Überstände und Proben der jeweiligen Sedimente mit einer Gelelektrophorese (NuPage-Sy-stem, Invitrogen, unter Verwendung von, MES-Pufer) und einer Silberfärbung untersucht.
Die Proben werden parallel unter nicht-reduzierenden und reduzierenden (15,6 mM DTT, 1,25% Iodacetamid) Bedingungen untersucht-. Als Marker werden der Marker 12 bzw. der MultiMark von Invitrogen mitgeführt.
Die Silberfärbung wird mit Standardverfahren durchgeführt, z.B. nach . der Methode von Heukeshoven (1988, Electrophoresis 9, 28-32) .- Ergebnisse':
Fig. 2A zeigt das Ergebnis der Fraktionierung. Im Homogenat, das noch die gesamten Bestandteile des Darmgewebes enthält, lassen sich aufgrund der hohen Proteinkonzentration kaum einzelne Banden gegeneinander abgrenzen. Ähnliches gilt für die Überstände 1 und 2 und die Probe des Sediments 1. Bei dem Sediment 2 lassen sich bereits einzelne Banden erkennen. Ab dem 3. Zentrifugationsschritt ist die Abtrennung durch die Ultrazentrifugation deutlich sichtbar, es lassen sich einzelne Banden klar gegeneinander abgrenzen. In der Probe des Sediments 5 sind nur noch wenige Proteine, deren Molekulargewichte alle über der 14,4 kDa-Bande des Markers liegen, nachweisbar. Eine Abtrennung einzelner Gewebebestandteile ist zwar sichtbar, in Bezug auf das Zielantigen lassen sich aber keine Auffälligkeiten erkennen.
Beispiel 4 :
Untersuchung der Fraktionen im Neutralisationstest
Die durch' eine Verdünnungsreihe in der Immunfluoreszenz ermittelte Verdünnung, in der das entsprechende Anti-Becherzell- positive Serum gerade noch eine Becherzeil-spezifische Reaktion zeigt, wird als Titer bezeichnet und für einen Neutralisationstest mit den Proben der Darmpräparation eingesetzt.
Für den Neutralisationstest werden jeweils 100 μl eines Anti- Becherzell-positiven Serums (in PBS-Tween verdünnt, so daß ein grenzwertiger Titer erreicht wird, s.u.) mit unterschiedlichen Mengen von Fraktionen der Darmpräparation aus Beispiel 3 versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden die Ansätze 10 Minuten bei 13.000 Upm in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird statt der . Serumverdünnung für eine indirekte Immunfluoreszenz mit primärem humanen adulten Darmgewebe eingesetzt. Als Vergleich ' dient dabei ein Kontrollfeld, das nur mit der Ausgangsverdünnung des Serums inkubiert worden ist. Ergebnis :
Bei dem Test kann keine Neutralisationswirkung einer der
Fraktionen gegenüber einem Anti-Becherzell-positiven Serum ermittelt werden. Da alle Felder des Objektträgers mit gleicher Intensität und identischem Muster reagieren, kann keine Aussage darüber gemacht werden, in welcher Fraktion das Zielantigen vorhanden ist. Auch eine Wiederholung des Tests - mit steigenden Konzentrationen der einzelnen Proben im Ansatz ergibt ein identisches Ergebnis.
Beispiel 5 :
Untersuchung der Fraktionen im Western Blot
Mit Hilfe ■ eines spezifischen Nachweises mit Anti-Becherzell- positiven Seren im Westernblot sollen die Fraktionen der Darmpräparation auf die Anwesenheit des Zielantigens untersucht werden. Nach der Trennung durch SDS-Gelelektrophorese werden die Proteine, z.B. mittels einer Blotapparatur der Firma Hoefer im Wetblot-Verfahren, auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen".
Die Proben werden nach der Präparation auf SDS-PAGE-Gele aufgetragen und nach dem Transfer auf Nitrocellulose-Membranen erst mit Ponceau S gefärbt und dann mit Anti-Becherzell- positiven bzw. Blutspender-Seren inkubiert.
Für die Ponceau S-Färbung wird die Nitrocellulosemembran 10 Minuten unter Schütteln mit Ponceau S-Lösung bedeckt. Nach der Inkubation- wird mit Aqua dest. wieder entfärbt, bis der Marker und gefärbte Proteine als rote Banden deutlich sichtbar sind.
Für die spezifische immunologische Detektion mit Antikörpern wird die .Membran, ggf. in Streifen geschnitten, zuerst 15 Minuten mit Universalpuffer (EUROIMMUN) mit 3% (w/v) Milchpulver blockiert. Anschließend wird 3 Stunden mit Kontroll- oder Patientenseren (1:500 in. Universal-puffer mit 3% (w/v) Milchpulver) inkubiert. Dann wird dreimal jeweils 5 Minuten mit Universalpuffer gewaschen. In einem zweiten Inkubationsschritt reagieren -die im positiven Fall an die Proteine gebundenen Antikörper' mit einer Konjugat-Lösung (EUROIMMUN, 1:10 in Universalpuffer verdünnt) , die alkalische Phosphatase-markierte Anti-Human-Antikörper enthält. Anschließend wird wie nach der Seruminkubation gewaschen. In einem dritten Inkubationsschritt' werden dann die gebundenen Antikörper mit einer NBT/ BCIP- Substrat-Lösung (4-Nitrobluetetrazoliumchlorid / Chlorobromo- indolylphosphate, EUROIMMUN) nachgewiesen.
Ergebnisse:
Nach der- Ponceau S-Färbung läßt sich ein ähnliches Bandenmuster wie nach der Silberfärbung erkennen, wobei • die Intensität' vieler Banden aufgrund der niedrigeren Sensitivität des Ponceau S-Farbstoffs geringer ausfällt. Ebenso wie beim Silbergel sind keine Auffälligkeiten zu erkennen.
Nach der • Inkubation der Membranen mit Anti-Becherzell- positiven bzw. Blutspender-Seren sind auf beiden Westernblots Signale zu erkennen (Fig. 2B und C) . Besonders deutlich reagiert bei fast allen Proben eine Bande bei ca. 55 kDa, die auch mit der Ponceau S-Färbung nachzuweisen ist, hier allerdings eine eher schwache Intensität aufweist. Ein Vergleich der beiden Membranen zeigt jedoch, daß sich bei der Inkubation mit Anti-Becherzell-positiven Seren und Seren von Blutspendern identische. Bandenmuster ergeben. Damit sind diese Reaktionen als unspezifisch zu bewerten. Keine der markanten Banden der Ponceau S-Färbung reagiert mit den Seren in einer nachweisbaren Intensität. Auch durch diesen Test kann keine Aussage über das Vorhandensein des Zielantigens in einer -der Fraktionen, gemacht werden, da keine Anti-Becherzell-spezi- fische Reaktion nachgewiesen werden kann. Beispiel 6:
Untersuchung der Fraktionen im Lektin-ELISA
Beim Lektin-ELISA wird eine MaxiSorb-Platte der Firma Nunc mit Streptavidin beschichtet (100 μl einer 0,5 μg/ml Lösung in PBS, über Nacht 4°C oder 2 Stunden Raumtemperatur) und mit je 100 μl Lektin-Verdünnung (1 μg/ml in PBS, siehe Tabelle 1) 30 Minuten bei' Raumtemperatur beschichtet. Anschließend wird die Platte gewaschen (dreimal mit je 300 μl Waschpuffer (EUROIMMUN oder PBS-Tween) . Anschließend folgt eine Inkubation .mit je 100 μl Verdünnung der Fraktionen der Darmpräparation aus Beispiel 3 (1:100 in PBS) pro Vertiefung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach einem Waschschritt folgt eine- Blockierung mit je 200 μl 0,5% (w/v) BSA in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach wird die Platte gewaschen. Bei der Seruminkubation werden je 100 μl Serumverdünnung (1:100 in PBS) ' 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.. Die Platte wird gewaschen, bevor mit je 100 μl Konjugat-Lösung (EUROIMMUN) , die Peroxidase-markierte Anti- Human-Antikörper enthält, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Nach einem erneuten Waschschritt wird die Platte 10 Minuten mit je 100 μl Substrat-Lösung (EUROIMMUN) pro Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von je 100- μl Stopp-Lösung (EUROIMMUN) gestoppt und die Extinktion bei 450 nm mit einem Photometer (Tecan Spectra) gemessen. Das- Schema eines Lektin-ELISAs ist in Fig. 3 gezeigt.
Tabelle 1 : Auswahl der biotinylierten Lektine (Vectorlabs)
Figure imgf000040_0001
Ergebnisse-:
Die Untersuchung der Reaktivität von Lektinen mit den Proben der Darmpräparation führt je nach Lektin und Fraktion zu unterschiedlich hohen Extinktionswerten. Um eine Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Reaktionen zu ermöglichen, werden die Ansätze parallel mit Seren, die in der indirekten Immunfluoreszenz Anti-Becherzell-positiv getestet worden sind, und Seren von Blutspendern inkubiert. Bei den durchgeführten Tests ergeben sich für beide Ansätze bei jedem Lektin vergleichbare Extinktionswerte (Tabelle 2) . Bei -dem Überstand 1 zeigt z. B. das Lektin AAL eine erhöhte Reakti-' vität, die jedoch als unspezifisch zu betrachten ist, da Anti- Becherzell-positive und Blutspender-Seren und selbst die Negativ-Kontrolle, die statt einer mit Serumverdünnung mit PBS inkubiert ■ worden ist, ähnlich stark reagieren. Auch die Lektine RCA, PSA, LCA und SNA zeigen erhöhte Reaktivitäten, die allerdings sowohl bei Anti-Becherzell-positiven' und Blutspender-Seren als auch bei der Kontrolle zu finden sind.. Die Reaktionen sind damit als unspezifisch zu werten. Vergleichbare Ergebnisse werden auch bei der Testung der anderen Ansätze erzielt. Keine Probe der Präparation zeigt mit einem der vorhandenen Lektine eine spezifische Reaktivität.
Tabelle 2 :
Extinktionswerte (450 nm) eines Lektin-ELISA mit dem Überstand
1 der Darmpräparation
Figure imgf000042_0001
Beispiel 7 :
Kultur von HT29-18N2-Zellen
Bei den HT29-18N2-Zellen handelt es sich um eine Tochterzelllinie der HT29-Zellen. Das Protokoll der Anzucht und der Klon wurden ursprünglich von Prof. Dr. Tom Phillips, University of Missouri, Columbia entwickelt (1988, Gastroenterology 94: 1390-1403).. 1,7 x 104 Zellen/cm2 werden in Plastikflaschen ausgesät und unter Standardbedingungen bei 37 °C mit 5% C02 in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Invitrogen) mit Zusatz von 10% fetalem Kälberserum (FKS) angezogen, bis Konfluenz erreicht ist. Anschließend werden die Zellen durch Zugabe von Trypsin/ EDTA geerntet und in DMEgal-Medium erneut in Plastikflaschen ausgesät. Da die Änderung der Mediumzusammensetzung eine hohe Sterberate und eine verlangsamte Wachstumsrate zur Folge hat, wird das Medium jeden Tag gewechselt.
Das DMEgal-Medium ist Glucose-frei in dem Sinne, daß es nur Reste von Glucose aus dem FKS enthält und diese im Unterschuß gegenüber Galactose vorliegt. Es setzt sich aus 8,3 g DME medium base (Sigma) , 0,1% (w/v) Galactose (Sigma) , Phenolrot- Lösung (8 mg/ml; Sigma), 0,37% (v/v) NaHC03 (Sigma) und 10% (v/v) dialysiertes FKS (JRH Biosciences) zusammen.
Bei Anzucht in DMEM sind die Zellen stark aggregiert und wachsen mehrlagig in Inseln. Nach der Aussaat in DMEgal ist eine erhöhte Mortalitätsrate zu beobachten. Die überlebenden Zellen wachsen nicht mehr in Inseln, sondern sind unter dem Mikroskop als einzelne Zellen zu erkennen und gegeneinander abzugrenzen.
Nachdem erneut Konfluenz erreicht ist, werden von einem Teil der Zellen Gefrierkulturen in Einfriermedium (90% (v/v) FKS und 10% (v/v) DMSO) hergestellt, die in Stickstoff gelagert werden.
Die restlichen Zellen werden auf sterilen Deckgläsern (26x76 mm; 7,2xl06 Zellen/Deckglas) ausgesät. Um eine schnellere Wachstumsrate zu erreichen, wird das DMEgal gegen DMEM/10% FKS ausgetauscht. Nach 4 Tagen wird von DMEM/10% FKS auf DMEgal oder Protein-freies Medium, z.B. Protein Free Hybridoma Medium II (PFHM II, Invitrogen) umgestellt. Parallel werden HT29-18N2-Zellen in Protein-haltigem DMEM (DMEM/10%FKS) kultiviert. Soweit nicht anders erwähnt, bezieht sich die Bezeichnung HT29-18N2-Zellen im folgenden auf Zellen nach Kultur in Protein-freiem Medium PFHM II.
Nachdem eine gleichmäßige und ausreichende Zelldichte erreicht' ist, werden von jeweils der Hälfte eines Deckglases mit der Biochip-Technologie der Firma EUROIMMUN Objektträger gefertigt, die andere Hälfte wird im Westernblot nach Aufschluß der Zellen in TNE-T Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1% Triton X-100) mittels Ultraschall getestet.
Beispiel 8 :
Indirekte Immunfluoreszenz mit HT29-18N2-Zellen
Fixierung mit Aceton
Das Deckglas wird zweimal mit PBS gespült. Überschüssige Flüssigkeit lässt man auf Zellstoff ablaufen, bevor das Deckglas erst, in Aceton (Merck) gespült und anschließend in frischem Aceton 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert wird.
Fixierung mit Formaldehyd
Das Deckglas wird zweimal mit PBS überschichtet, dann wird das PBS abgesaugt und verworfen. Flüssigkeitsreste lässt man auf Zellstoff .ablaufen. Anschließend wird das Deckglas erst mit 3,5% Formaldehyd (Riedel de Haen) in PBS überschichtet (die Flüssigkeit wird wie im vorangegangenen Schritt wieder entfernt) und danach 10 Minuten mit Formaldehyd-Lösung bei Raumtemperatur fixiert .
Fixierung mit Ethanol
Der Ablauf gleicht der vorherigen Fixierung, wobei statt der
Formaldehyd-LÖsung 100% Ethanol (Merck) eingesetzt wird. Indirekte Immunfluoreszenz
Die fixierten Objektträger mit Zellen werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, gefärbt. Im Unterschied zu der Färbung der Gewebeschnitte werden Objektträger mit Zellen beim Waschen nur kurz in einer Küvette mit PBS/ 0,2% Tween gespült und dann in einer weiteren Küvette 5 Minuten in PBS-Tween inkubiert.
Objektträger mit verschieden kultivierten HT29-18N2-Zellen und Primatendarm (als Positivkontrolle) werden dann mit den Anti- Becherzell-positiven Seren, 288 Blutspender-Seren und einer Anzahl von Proben von Patienten mit gesicherter Colitis ulcerosa (57 Seren) bzw. Morbus Crohn (80 Seren) getestet. Dabei wird- nach der Standard-Inkubation mit veränderten Waschschritten inkubiert.
Ergebnisse':
Die auf Deckgläsern in DMEgal angezogenen und mit Aceton, Formaldehyd bzw. Ethanol fixierten HT29-18N2-Zellen werden in- der indirekten Immunfluoreszenz auf ihre Reaktivität mit Becherzell-positiven Seren und Seren von Blutspendern getestet. Der Einsatz von Ethanol und Formaldehyd ist für die Fixierung dieser Zellen auf Deckgläsern nur schlecht geeignet. Auf allen Feldern des Objektträgers lösen sich die Zellen während der Inkubation ab, sodass nur schlecht eine Aussage über die Reaktivität der Zellen mit den verwendeten Seren gemacht werden kann. Daher wird für alle folgenden Versuche, eine Aceton-Fixierung durchgeführt.
Die Inkubation von in Protein Free Hybridoma Medium II (PFHM II) gewachsenen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit Aceton fixierten Zellen mit Anti-Becherzell-positiven Seren zeigt eine .wolkige, unscharf begrenzte Fluoreszenz in einer Ebene oberhalb der fixierten Zellen (Fig. 4A) . Nach Inkubation der HT29-18N2 Zellen mit Blutspender-Seren weisen nur die Zellen selbst eine schwache, gleichmäßige Fluoreszenz auf (Fig. 4B) . Da nur Anti-Becherzell-positive Seren das wolkige Fluoreszenzmuster, das der Becherzell-positiven Reaktion von fixiertem Darmgewebe ähnelt, hervorrufen, ist die Reaktion als spezifisch zu betrachten. Je länger die Zellen in dem Hybridoma-Medium gewachsen sind, desto stärker ist das spezifische Signal. Nach einem Wachstum von 4 Tagen in PFHM II sind die Zellen für einen Nachweis des Antigens in der indirekten Immunfluoreszenz besonders gut geeignet. Parallel getestete, in DMEM/10%FKS oder DMEgal gewachsene Zellen zeigen keine spezifische Reaktivität.
Die in der indirekten Immunfluoreszenz parallel auf Primatendarm und HT29-18N2 Zellen getesteten 288 Seren von Blutspendern und Morbus Crohn-Patienten zeigen keine Becherzellspezifische Reaktivität. Der Vergleich der Substrate Primatendarm und Zelllinie zeigt, daß unspezifische Hintergrundfluoreszenzen, die bei einigen Seren die Diagnostik mittels Darm erschweren können, die Beurteilung der Zellen wesentlich weniger stört . Auch bei der Inkubation von Seren von Patienten mit Colitis ulcerosa lassen sich bei positiven Reaktionen die wolkigen Fluoreszenzmuster auf den Zellen wesentlich besser gegenüber dem Hintergrund abgrenzen.
Beim Vergleich der in verschiedenen Medien gewachsenen Zellen ist eine Veränderung der Größe und der Morphologie nach Umstellung auf PFHM II erkennbar. Durch eine Differenzierung scheinen die Zellen an Größe zuzunehmen, und das Zytoplasma wirkt wesentlich stärker strukturiert. Beispiel 9 :
Selektivität der Bindung von Anti-Becherzell- Antikörpern an Becherzell-Antigen aus HT29-18N2- Zellen
Es wurden weitere Antikörper in der indirekten Immunfluoreszenz auf der Zelllinie getestet. Der Anti-MUC2-Antikörper reagiert mit dem Zytoplasma einiger Zellen und zeigt damit ebenfalls ein ähnliches Fluoreszenzmuster wie auf Darmgewebe (Fig. 4C) . Der Anti-MUC3-Antikörper zeigt eine gleichmäßige Fluoreszenz der Zellen, unabhängig davon, ob sie in DMEM oder PFHM II gewachsen sind und reagiert daher auch mit den un- differenzierten Zellen. Die Reaktion des Anti-MUC5AC-Anti- körpers beschränkt sich auf die in PFHM II gewachsenen Zellen. Dabei zeigt sich außer einem granulären Muster in vielen Zellen eine Fluoreszenz in einer Ebene oberhalb der Zellen, die sich visuell von dem Anti-Becherzell-spezifischen Signal unterscheiden lässt (Fig 4D) .
Seren von Patienten mit definierten Erkrankungen, die mit Strukturen der für die Autoimmundiagnostik eingesetzten HEp-2 Zellen (Humane Epithelzellen) reagieren, werden getestet, um Aussagen über eine Abgrenzung unterschiedlicher Fluoreszenzmuster zu ermöglichen. Diese Seren enthalten Autoantikörper gegen Zellkerne (homogenes, granuläres und nukleoläres ANA- Muster) , die Kernmembran, Mitochondrien (AMA) , den Golgi- Apparat, Vimentin und Aktin (Zytoskelettstrukturen) sowie gegen das Antigen Jo-1. Diese Antikörper reagieren mit HT29- 18N2-Zellen, die entstehenden Fluoreszenzmuster lassen sich jedoch eindeutig von der Reaktion mit anti-Becherzell- Antikörpern unterscheiden. Diese Autoantikörper sind also nicht kreuzreaktiv mit Becherzell-Antigen. Beispiel 10: Sensitivität der Bindung von Anti-Becherzell- Antikörpern an Becherzell-Antigen von HT29-18N2- Zellen
Die in dieser Versuchsserie noch vorhandenen Serenkollektive von Patienten mit Colitis ulcerosa (57 Seren) sind für die Ermittlung' einer Prävalenz des Anti-Becherzell-Antikörpers ungeeignet, da aufgrund von früheren Studienzwecken vor allem positive Seren entfernt wurden und daher die Kollektive nicht mehr als repräsentativ gelten. Da die Seren im Hinblick auf Antikörper' gegen Becherzellen vorcharakterisiert sind und mit diesen Proben mit human-fetalem Darm als Substrat eine Prävalenz von 28% ermittelt werden konnte, kann ein Vergleich zwischen dem fetalen Darm, den HT29-18N2-Zellen und dem eingesetzten adulten Primatendarm erstellt werden.
Ergebnisse-: Von den 57 noch vorhandenen Seren von Colitis ulcerosa-, Patienten wurden 11 auf fetalem Darm positiv auf Antikörper gegen Becherzellen getestet (Tabelle 3) . Diese 11 Seren- reagieren .auch auf den HT29-18N2-Zellen Becherzell-spezifisch. Mit Hilfe ■ des adulten Primatendarms können nur 8 Seren mit Antikörpern gegen Becherzellen ermittelt werden. Die starke Ähnlichkeit des Fluoreszenzmusters sowie ein Vergleich der Sensitivität der Substrate in der indirekten Immunfluoreszenz zeigen damit, dass die HT-29 N2 Zelllinie als Substrat für .die Diagnostik zur Erfassung der Anti-Becherzell-Antikörper besser geeignet ist als der Primatendarm.
Tabelle 3 Vergleich .der Reaktivität von HT29-18N2 Zellen, human-fetalem und adulten Darm in der indirekten Immunfluoreszenz nach Inkubation' mit Patienten-Seren (1:10 in PBS-Tween).
Figure imgf000048_0001
Beispiel 11:
Aufreinigung von Becherzell-Antigen
Da die Immunfluoreszenz im positiven Fall eine Reaktion in einer Ebene oberhalb der Zellen zeigt, wird der Überstand der Zellkultur für weitere Tests eingesetzt. Das Medium aus den Zellkulturflaschen der HT29-18N2-Zellen in PFHM II wird, z.B. über eine' Gaswaschflasche, aufgefangen, mit 100 kDa Cutoff einkonzentriert (Vivaspin 100, VivaScience) , gegen PBS ausgetauscht und im ELISA oder Dotblot getestet.
Die aus der Zellkultur gewonnenen Überstände werden im Dotblot auf spezifische Reaktionen getestet. Hierbei werden zweimal je 1 μl des' Zellkulturüberstandes (nach Einkonzentrieren mit 100 kDa Cutoff und Austausch des Mediums gegen PBS) direkt auf eine vorher markierte Stelle der Nitrocellulose-Membran aufgetragen. Dazwischen und danach lässt man die Membran gut trocknen. Die nachfolgende Inkubation mit verschiedenen Anti- Becherzell-positiven und Blutspender-Seren entspricht " im Wesentlichen einer Standard-Westernblot-Inkubation, allerdings wird die Konjugat-Inkubation von 30 Minuten auf eine Stunde verlängert-. Der Erfolg der Differenzierung wird parallel mit dem Anti-MUC5AC-Antikörpers überprüft, wobei alle Zellkultur- überstände positiv waren.
Ergebnisse:
Die Anti-Becherzell-positiven Seren zeigen unterschiedlich starke Reaktivität mit den einzelnen Proben (Fig. 5A) . Die Konzentration des Antigens scheint dabei von der Zeit abhängig zu sein, die die Zellen in PFHM II gewachsen sind. 2 Tage nach der Umstellung des Mediums von DMEM auf PFHM II ist das Signal zwar vorhanden, aber von geringer Intensität. Je länger die Zellen in' PFHM II gewachsen sind, desto stärker ist die. Reaktion. ' Die Anti-Becherzell-positiven Seren reagieren ebenfalls unterschiedlich stark. Die Intensität scheint mit dem Titer in der Immunfluoreszenz zu korrelieren. Die Blutspender-Seren reagieren mit keinem der Zellkultur- überstände. Die Negativ-Kontrolle, die mit Universalpuffer + 3% (w/v) Milchpulver statt einer Serumverdünnung inkubiert worden ist, zeigt ebenfalls keine Reaktivität.
Beispiel 12 :
Chromatographische Aufreinigung des Becherzell- Antigens
Mit Hilfe einer Anionenaustauschchromatographie werden die Zellkulturüberstände aus der Zellkultur aufgrund unterschiedlicher Ladungen der Moleküle aufgetrennt. Damit soll eine Aufreinigung des in den Proben enthaltenen Protein- gemischs erreicht werden, um die Entwicklung eines Tests auf Grundlage des möglichst rein vorliegenden Antigens (für ELISA, Westernblot) zu ermöglichen.
Bei der verwendeten Säule handelt es sich um eine PORÖS HQ/M 20 μm von Applied Biosystems mit 16 mm Durchmesser und 10 ml Säulenvolumen. Als HPLC-Anlage wird eine BioLogic Duo Flow von Biorad verwendet. Die Flussrate beträgt 10 ml/min. Es werden Fraktionen von 5 ml Volumen gesammelt.
Zuerst wird die Säule mit 50 ml Wasser gespült. Dann folgt eine Regeneration mit 50 ml Regenerationspuffer (10% Essigsäure und 1 M NaCl) . Die Säule wird erst mit 50 ml Wasser, danach mit 10 ml Elutionspuffer (25 mM Tris-HCl pH 8, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) und anschließend mit 80 ml Äquilibrierungs- puffer (25 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM PMSF) gespült, bevor der Probenauftrag (5 ml) erfolgt. Ab diesem Zeitpunkt werden die Fraktionen gesammelt. Nach dem Probenauftrag werden 50 ml Äquilibrierungspuffer über die Säule gegeben. Eluiert wird über einen Gradienten, der aus drei Stufen besteht, bei denen jeweils die Konzentration der Chlorid-Ionen auf der Säule erhöht wird. Dabei werden 75, 150 und 250 mM NaCl eingesetzt. Die gesammelten Fraktionen werden im Dotblot auf ihre Reaktivität mit Anti-Becherzell-positiven und Blutspender- Seren untersucht, um eine Aussage über das Vorhandensein des Zielantigens machen zu können.
Ergebnisse :
Die Anti-Becherzell-positiven Seren reagieren mit dem Auftrag (A) und mit den letzten Fraktionen der Chromatographie (Fig. 5B) . Die -Blutspender-Seren reagieren weder mit dem Auftrag noch mit einer der Fraktionen. Somit ist die Reaktion der Anti-Becherzell-positiven Seren als spezifisch, zu werten. Die Negativ-Kontrolle, die mit Universalpuffer + 3% (w/v) Milchpulver statt einer Serum-Verdünnung inkubiert worden ist, zeigt keine Reaktivität.
Beispiel 13:
Nachweis von Anti-Becherzell-positiven Seren im ELISA mit Becherzell-Antigen
Durch Direktbeschichtung einer ELISA-Platte mit Becherzell- Antigen aus Zellkulturüberstand von HT29-18N2-Zellen und HT29- 18N2-Zellen (jeweils nach Kultur in Protein-freiem Medium) soll die Reaktivität der Fraktionen mit einem Gemisch aus Anti-Becherzell-positiven bzw. Blutspender-Seren getestet werden. Weiterhin werden die Fraktionen der Chromatographie zusätzlich zum Dotblot auch im ELISA getestet.
Die Platten werden über Nacht bei 4°C oder für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem Becherzell-Antigen oder dem Zelllysat beschichtet. Das Zelllysat wird durch Einfrieren und Auftauen der Zellen in TNE-T-Puffer hergestellt. Der ELISA wird weiter nach Standardverfahren, ähnlich dem in Beispiel 6 beschriebenen Lektin-ELISA, durchgeführt. Ergebnisse :
Der Ansatz mit Zelllysat zeigt nur geringe spezifische Reaktion. Der getestete Zellkulturüberstand weist eine erhöhte Reaktivität mit den Anti-Becherzell-positiven Seren auf, wobei sich eine Korrelation zwischen der Höhe der Extinktion und dem Titer des entsprechenden Serums in der indirekten Immunfluoreszenz abzeichnet. Die Seren mit den in der Immunfluoreszenz ermittelten höchsten Titern sind auch im ELISA im Vergleich reaktiver und führen zu höheren Extinktionswerten. Da die Blutspender-Seren keine vergleichbare Reaktion zeigen, ist das Signal als spezifisch zu bewerten. Bei diesem Versuch zeichnet sich deutlich ab, dass das aufgereinigte Becherzell- Antigen für einen Nachweis im ELISA besser geeignet ist als die Zellen selbst (Fig. 6A) .
Die im Dotblot mit Anti-Becherzell-positiven Seren ermittelten Werte für die Fraktionen der chromatographischen Auftrennung können im ELISA bestätigt werden (Fig. 6B) .
Beispiel 14 :
Charakterisierung des Becherzell-Antigens und
Nachweis im SDS-PAGE /Western Blot
Die Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie, die im Dotblot mit Anti-Becherzell-positiven Seren eine spezifische Reaktivität zeigen, werden mittels SDS-PAGE aufgetrennt, wobei die Gelelektrophorese unter reduzierenden (d.h . nach Reduktion z . B . mit Mercaptoethanol oder Dithiothreitol) und nicht- reduzierenden Bedingungen durchgeführt wird. Als Marker wird MultiMark verwendet . Es wird ein Western Blot durchgeführt, wobei Anti-Becherzell-positive Seren sowie als Kontrolle anti- MUC5AC-Antikörper verwendet werden . Ergebnisse :
Dabei wird unter nicht-reduzierenden Bedingungen bei Inkubation mit .Anti-Becherzell-positiven Seren eine Bande nachgewiesen, die oberhalb der obersten Bande des Markers (185 kDa) liegt (Fig. 7A) . Auch nach Inkubation mit dem anti-MUC5AC- Antikörper ist eine Bande zu erkennen, die sich sowohl oberhalb der obersten Marker-Bande als auch der mit dem Anti- Becherzell-positiven Serum reagierenden Bande befindet. Die scheinbare- molekulare Masse (bzw. das Molekulargewicht) von Becherzell'-Antigen liegt also zwischen 185 kDa und der scheinbaren molekularen Masse des nicht-reduzierten Mucins MUC5AC (>2000 kDa) . Die Ergebnisse deuten weiterhin darauf hin, dass die Präparation des Becherzell-Antigens nach der Anionenaustauschchromatographie mit MUC5AC verunreinigt ist. Dieser Versuch zeigt ebenfalls, dass ein Westernblot nach elektrophoretischer Auftrennung unter nicht-reduzierenden Bedingungen- eine geeignete Methode ist, um Anti-Becherzell- Antikörper. in einer Probe nachzuweisen.
Unter reduzierenden Bedingungen lassen sich weder das Becherzell-Antigen noch MUC5AC mit den Antikörpern nachweisen.
Beispiel 15 :
Charakterisierung des Becherzell-Antigens und
Nachweis in der Agarosegelelektrophorese /Western
Blot
Wegen der Größe des Antigens wird es weiterhin in der Agarosegelelektrophorese untersucht. Der optimale Trennbereich dieses. Verfahrens liegt bei ca. 100 bis 2000 kDa.
Für das Anfertigen eines Gels werden 1% (w/v) Agarose und 357 mM Bis-Tris-HCl-Puffer (pH 6,5) kurz erhitzt, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat. Das Gemisch wird in 10x10 cm Leerkassetten (anamed Elektrophorese GmbH) gegeben, wobei die Taschen mit Hilfe eines Kamms (anamed Elektrophorese GmbH) geformt werden. Nach dem Erkalten kann das Agarosegel analog zu dem SDS-PAGE Verfahren eingesetzt werden. Auch die Probenvorbereitung ist in beiden Fällen identisch.
Nach der Auftrennung der Proteine in der Gelelektrophorese können die Proteine, wie bei Polyacrylamidgelen bekannt, auf eine Nitrocelluloseme bran übertragen werden. Die Blot-Zeit kann dabei etwas kürzer gewählt werden, bei dem verwendeten Wetblot-Verfahren z.B. nur 45 Minuten.
Ergebnisse:
Bei der Auftrennung der Chromatographie-Fraktionen mittels Agarosegelelektrophorese und anschließendem Westernblot sind - ebenso wie bei der SDS-PAGE - unter reduzierenden Bedingungen keine Reaktivitäten des Becherzell-Antigens mit dem spezifischen Antikörper nachzuweisen (s. Fig. 7B) . Auch MUC 5AC kann nur unter nicht-reduzierenden Bedingungen nachgewiesen werden. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen ist nach Inkubation mit unterschiedlichen Anti-Becherzell- positiven Seren jeweils nur eine Bande zu erkennen. Diese befindet sich bei allen Seren auf der gleichen Höhe. Nach Inkubation mit dem anti-MUC5AC-Antikörper ist ein gefärbter Bereich oberhalb der nach Inkubation mit Anti-Becherzell- positiven Seren auftretenden Bande zu erkennen. Eine im Vergleich schwache Bande, die nur bei sehr hoher Konzentration des anti-MUC5AC-Antikörpers auftritt, ist auch unterhalb letzterer Position auszumachen. Blutspender-Seren zeigen keine Reaktivität . Beispiel 16:
Charakterisierung der Reinheit der Bec erzell-
Antigen-Präparation
Die für Becherzell-Antigen positiven Fraktionen der Anionen- austauschchromatographie werden mit FITC markiert und in der Agarosegelelektrophorese unter reduzierenden und nicht- reduzierenden Bedingungen auf ihre Reinheit untersucht. Es wird mit einem Westernblot unmarkierter Fraktionen verglichen. Für die Markierung werden 900 μl der Probe mit 100 μl 1 M NaHC03-Lösung und 2 mg FITC (Sigma) gelöst in 40 μl DMSO (Hybaid) versetzt. Dieser Ansatz wird unter Lichtabschluss über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Schüttler (Eppendorf) inkubiert. Danach wird der Ansatz mit 10 kDa Cutoff (Vivaspin 10, VivaScience) eingeengt und mehrfach mit jeweils 1 ml PBS gewaschen, bis der Durchlauf farblos ist.
Die Probe kann nach einer SDS-Gelektrophorese im Westernblot eingesetzt werden. Der Ablauf der Westernblot-Inkubation ähnelt der Standard-Westernblot-Inkubation, wobei die Serum- Inkubation entfällt und als Konjugat alkalische Phosphatase- markierte Anti-FITC-Antikörper (Sigma, 1:10.000 in Universalpuffer) eingesetzt werden.
Ergebnisse :
Bei den FITC-markierten Proben sind sowohl unter reduzierenden als auch nicht-reduzierenden Bedingungen - in jeweils unterschiedlichen Positionen - einzelne Banden zu erkennen. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen ist jeweils eine Bande zu erkennen, die sich auf gleicher Höhe mit der nach der Inkubation mit Anti-Becherzell-positiven Seren auftretenden Bande und oberhalb der IgM entsprechenden Bande befindet. Diese Bande, also das Becherzell-Antigen, scheint den Hauptprotein-Anteil der Präparation darzustellen. Die scheinbare molekulare Masse des Becherzell-Antigens scheint zwischen der von humanem IgM (etwa 950 kDa) und dem von nichtreduziertem MUC5AC (>2000 kDa) zu liegen. Zusätzlich sind sowohl auf der Höhe des nach Inkubation mit dem MUC5AC-Antikörper angefärbten Bereichs als auch auf der Höhe der dem IgM entsprechenden Bande Färbungen zu erkennen . Dieses Ergebnis bestätigt, dass die Becherzell-Antigen- Präparatio wahrscheinlich mit MUC5AC verunreinigt ist. Weiterhin könnte IgM oder ein Protein ähnlicher Größe in der Präparation vorliegen.
Unter reduzierenden Bedingungen sind nach Inkubation mit dem anti-FITC-Antikörper 3 Banden zu erkennen. Die oberste befindet sich am unteren Ende des mit dem MUC5AC-Antikörper angefärbten Bereichs . Zwei weitere Banden sind unterhalb der dem nicht-reduzierten IgM entsprechenden Bande zu erkennen.
Beispiel 17 :
Charakterisierung der Bindung des Becherzell-Antigens an Lektine
Es werden Lektin-Westernblots nach Agarose- und Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen durchgeführt.
Die Färbung von Westernblots mit Lektinen statt mit Antikörpern, oder Seren wird .analog durchgeführt, es wird jedoch für die Blockierung Universalpuffer (EUROIMMUN) mit 3% (w/v) BSA eingesetzt. Die biotinylierten Lektine und das entsprechende Konjugat (ExtrAvidin Alkaline Phosphatase- Konjugate,- Sigma) werden in Universalpuffer verdünnt (Lektine 1:2000, ExtrAvidin-Konjugat 1:5000) . Die Inkubationszeit beträgt jeweils 30 Minuten, bei der Substrat-Inkubation sind 3 Minuten ausreichend. Ergebnisse-:
Bei Untersuchung nicht-reduzierter Proben ist nach Agarosegelelektrophorese und Inkubation des Blots mit den Lektinen PHA-L, PHA-E, RCA, Con A, LCA, PSA und AAL (siehe aμch Tabelle 1) jeweils eine Bande zu erkennen (Fig. 8A) , die sich auf gleicher Höhe mit der nach Inkubation mit Anti-Becherzell- positiven Seren erkennbaren Bande befindet. Die Lektine SNA, HHL, MAL I, SBA, DBA, UEA I, SJA, PNA, WGA, GSL I, PLT I, WGA s+b zeigen unter den verwendeten Bedingungen ebensowenig eine Reaktion wie Seren gesunder Blutspender.
Bei Untersuchung reduzierter Proben ist mit den Lektinen PHÄ- L, PHA-E, RCA, Con A, LCA, PSA und AAL jeweils eine intensive Bande zu erkennen (Fig. 8B) , die bei allen Lektinen auf der gleichen Höhe liegt. Eine kleine, schwächer gefärbte Bande ist bei diesen Lektinen, bis auf PHA-L, zusätzlich sichtbar. Die Lektine SNA, HHL, MAL I, SBA, DBA, UEA I, SJA, PNA, WGA, GSL I, PLT I, WGA s+b zeigen keine Reaktion. ■ ■
Nach Auftrennung der reduzierten Proben im SDS-PAGE lassen sich mit den Lektinen PHA-L, PHA-E, RCA, Con A, LCA, PSA und AAL drei intensive Banden unterscheiden (Fig. 8C) , die eine molekulare Masse von etwas 56, 66 und 88 kDa zu haben scheinen. .Bei Inkubation mit PHA-E, Con A, LCA, PSA und AAL sind zusätzlich zwei nahe beieinander liegende Banden im Bereich der molekularen Massen 52-54 kDa zu erkennen.
Da die in der Becherzell-Antigen-Fraktion vorliegenden Proteine, .ausser dem Becherzell-Antigen selbst, unter nicht- reduzierenden Bedingungen nicht von den Lektinen gebunden werden, scheinen die unter reduzierenden Bedingungen nachgewiesenen Proteine Bestandteile des Becherzell-Antigens zu sein, und nicht Bestandteile der anderen Proteine. Beispiel 17 :
Präparation des Becherzell-Antigens aus einem Agarosegel und Analyse der Bindung an das Lektin PHA-E
Es wird wie- vorher eine Agarosegelelektrophorese einer nichtreduzierten Fraktion des Becherzell-Antigens nach Anionen- austauschchromatographie durchgeführt. Von diesem Gel werden die beiden unterhalb der Auftragstasche am Rand liegenden Bereiche mittels eines sauberen Skalpells abgetrennt. Mit diesen beiden Gelfragmenten wird ein Westernblot mit Anti- Becherzell-positivem Serum durchgeführt, um die Position des Becherzell-Antigens im Gel zu bestimmen. Nach erfolgter Detektion ' wird der Bereich, der das Becherzell-Antigen enthält, aus dem restlichen Agarosegel ausgeschnitten, ' 10 Minuten mit NuPAGE-Probenpuffer (Inivtrogen) unter reduzierenden Bedingungen inkubiert und in eine Tasche eines NuPAGE- Gels gelegt. Nach Lauf des Gels wird wie vorher ein Lektin- Blot mit dem am stärksten mit dem Becherzell-Antigen reagierenden Lektin PHA-E durchgeführt .
Ergebnis :
Nach Auftrennung der reduzierten Probe im SDS-PAGE lassen sich mit den Lektinen PHA-E drei intensive Banden unterscheiden (Fig. 8D) , die eine scheinbare molekulare Masse von etwa 56, 66 und 88. kDa zu haben scheinen. Die zusätzlichen zwei nahe beieinander liegenden Banden im Bereich der scheinbaren molekularen Massen 52-54 kDa sind nicht zu erkennen und scheinen deshalb nicht Bestandteil des Becherzell-Antigens' zu sein. Das Becherzell-Antigen umfasst also ein oder mehrere Paptidketten von 56, 66 und 88 kDa. Beispiel 18 :
Charakterisierung der Glykanstruktur des Becherzell- Antigens
Zuckerreste, die über eine N-glykosidische Bindung mit dem Protein verknüpft sind, können mit einer N-Glykosidase abgespalten werden . Dafür werden 80 μl der Probe mit 10 μl 1% (w/v) SDS versetzt und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert . Anschliessend werden 7 , 6 μl 10% (w/v) Triton X-100 und 4 μl N- Glykosidase F ( 4 Units , Röche AG) hinzugegeben . Nach einer Inkubation' bei 37 °C über Nacht kann die Probe in der Gelelektrophorese eingesetzt werden .
Ergebnis : .
Nach der Deglykosylierung der Proben mit N-Glykosidase F ist weiterhin eine Reaktivität mit den Lektinen PHA-L, PHA-E, RCA, LCA, PSA und AAL nachzuweisen (Con A wurde nicht untersucht) (Fig. 9A und B) . Entsprechend der unverdauten Probe sind jeweils mindestens drei intensiv gefärbte Banden, die bei allen Lektinen auf der gleichen Höhe liegen, zu erkennen, die jedoch jeweils knapp unterhalb der entsprechenden Bandenpositionen vor Verdau liegen. Entsprechend kleinere, zwei nahe- beieinander liegende Banden im Bereich der scheinbaren molekularen Massen von 52-54 kDa sind nicht zu erkennen. Die Intensität- der Reaktion hat durch den Verdau nur wenig abgenommen. Es scheinen also sowohl N- als auch O-glykosidisch verbundene Zuckerreste in dem Molekül vorzuliegen.

Claims

Patentansprüche
1. Becherzell-Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen bei Expression durch die in Protein-freiem Medium zu Becherzellen differenzierte Zelllinie HT29-18N2 erhältlich ist und mit Anti-Becherzell-Antikörpern von Colitis ulcerosa-Patienten nachweisbar ist.
2. Becherzell-Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die scheinbare molekulare Masse, gemessen in nicht reduzierender SDS-PAGE, größer als 185 kDa ist.
3. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die scheinbare molekulare Masse des nicht reduzierten Antigens bei der Agarosegelelektrophorese zwischen 950 kDa und 2000 kDa liegt.
4. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es mit mindestens einem der Lektine PHA-L, PHA-E, RCA, Con A, LCA, PSA und AAL nachweisbar ist.
5. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es mit den Lektinen PHA-L, PHA-E, RCA, Con A, LCA, PSA und AAL nachweisbar ist.
6. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es nicht mit den Lektinen SNA, HHL, MAL I, SBA, DBA, UEA I, SJA, PNA, WGA, GSL I, PTL I, WGA s+b nachweisbar ist.
7. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis , dadurch gekennzeichnet, daß es Galactose, N-Acetyl-Galactosamin und/oder Fucose umfaßt.
8. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es N- und O-glykosidisch gebundene Glykane umfaßt.
9. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Glykane teilweise oder ganz durch chemische oder enzymatische Methoden entfernt sind.
10. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das reduzierte Antigen ein oder mehrere glykosylierte Proteine des Molekulargewichts 56, 66 oder 80 kDa umfaßt.
11. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen nicht mit Antikörpern von Morbus Crohn-Patienten nachweisbar ist.
12. Becherzell-Antigen nach den Anprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einer eukaryotischen Zelllinie exprimiert ist.
13. Becherzell-Antigen nach den Anprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einer humanen Zelllinie exprimiert ist.
14. Becherzell-Antigen nach den Anprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einer humanen Kolonkarzinom-Zelllinie exprimiert ist.
15. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einer Zelllinie exprimiert ist, die von der Zelllinie HT29 abgeleitet ist.
16. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von der zu Becherzellen differenzierten Zelllinie HT29-18N2 exprimiert ist.
17. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen aufgereinigt ist.
18. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen aus dem Zellkultur- überstand der kultivierten Zelllinie aufgereinigt ist.
19. Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen aus der kultivierten Zelllinie aufgereinigt ist.
20. Monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 19 erkennt.
21. Kit zur Diagnose von entzündlichen Darmerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es Becherzell-Antigen gemäß den Ansprüchen 1 bis 19 und optional den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 20 umfaßt.
22. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell- Antigen, bei dem man eine biologische Probe mit dem Becherzell-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 19 in Kontakt bringt und man die Bindung von Antikörper an das Antigen nachweist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindung der Antikörper an das Antigen mit einem ELISA, Blot, Western Blot oder Dot Blot nachweist.
24. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell- Antigen, bei dem man eine Probe mit einer in Proteinfreiem . Medium zu Becherzellen differenzierten Zelllinie, die von der HT29-Zelllinie abgeleitet ist, in Kontakt bringt, und man die Bindung von Antikörper an das Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 19 nachweist.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die in Protein-freiem Medium zu Becherzellen differenzierte Zelllinie die Zelllinie HT29-18N2 ist.
26. Verfahren nach den Ansprüchen 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bindung der Antikörper an das Antigen mit indirekter oder direkter Immunfluoreszenz nachweist.
27. Verfahren zur Diagnose von entzündlichen Darmerkrankungen, bei dem man Proben von Patienten einem Verfahren nach den Ansprüchen 22 bis 26 unterzieht, wobei man durch Nachweis von Antikörpern gegen Becherzell-Antigen eine Colitis ulcerosa diagnostiziert.
28. Verwendung von Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der Colitis ulcerosa.
29. Verwendung von Becherzell-Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 19 zur ex vivo Entfernung von Anti-Becherzell- Antikörpern aus dem Blut von Colitis ulcerosa-Patienten.
30. Verwendung nach den Ansprüchen 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen an eine inerte Matrix gekoppelt ist.
31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die inerte Matrix Kieselgel, Alginat, Cellulose, Pektin oder Carrageen ist.
32. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen an ein Zytotoxin gekoppelt ist.
33. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytotoxin für B-Lymphozyten spezifisch ist.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Colitis ulcerosa, dadurch gekennzeichnet, daß sie Becherzell- Antigen nach den Ansprüchen 1 bis 19 umfaßt.
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