WO2005100240A1

WO2005100240A1 - Dnaの脱アミノ化のための組成物及びメチル化dnaの検出方法

Info

Publication number: WO2005100240A1
Application number: PCT/JP2004/017782
Authority: WO
Inventors: Hikoya Hayatsu; Kazuo Negishi; Masahiko Shiraishi
Original assignee: Toyobo Co Ltd; National Cancer Center Japan
Current assignee: Toyobo Co Ltd; National Cancer Center Japan
Priority date: 2004-04-08
Filing date: 2004-11-30
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2006-10-08
Also published as: US20080070240A2; JPWO2005100240A1; US20070178466A1

Abstract

　（１）6.2Mより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物、（２）（１）の亜硫酸塩組成物を用いるDNAの脱アミノ化方法、（３）（１）の亜硫酸塩組成物を用いるメチル化DNAの検出方法、及び（４）（１）の亜硫酸塩組成物を含んでなるDNAの脱アミノ化用又はメチル化DNAの検出用キット。

Description

明細書

DNAの脱アミノィ匕のための組成物及びメチルイ匕 DNAの検出方法技術分野

[0001] 本発明は、 DNAの脱アミノ化用組成物及び DNAの脱ァミノ化方法に関する。更に、試料中のメチルイ匕 DNAの検出方法に関する。

背景技術

[0002] ゲノム DNAのメチルイ匕は真核生物における遺伝子の発現を制御することが知られている。このため、メチル化 DNAの検出により、重要な遺伝情報が得られ得る。

[0003] 中でも、 5—メチルシトシンは、真核生物のゲノムにおいて存在する唯一の生理的修飾塩基であり、 DNAメチルイ匕の異常により遺伝性疾患やがんが起こることも知られている。従って、ゲノム中の特定塩基配列のシトシンのメチルイ匕状態の検出は、特に重要である。

[0004] しかし、 5—メチルシトシンは、シトシンと同じくグァニンと相補的塩基対を形成するため、そのままでは配列決定や PCRにより検出することは極めて困難である。

[0005] この問題を解決する手段としてもっとも良く使われる方法は、ゲノム DNAと亜硫酸塩とを反応させ、シトシンを脱ァミノ化し、その後のアルカリ加水分解によりゥラシルに変化させる方法である。 5—メチルシトシンはこの試薬との反応性が非常に低い（例えば、 Hayatsuら、 Biochemistry, Vol.9, p.2858- 2865 (1970)を参照）。したがってこのような処理を行ったのちに塩基配列決定を行うと、シトシンはチミンと判断され、 5—メチルシトシンの位置だけがシトシンと判定されるため、 5—メチルシトシンの位置の同定が可能となる（例えば、 Formmerら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.89, p.1827-1831 ( 1992)参照)。

[0006] ここで、 DNAと亜硫酸塩との反応条件は、 4.9Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液 (pH5) 中で、 50°C、 12時間から 16時間とすることが一般的である（例えば、 Eadsら、 Methods in Molecular Biology, Vol.200, p.71-85 (2002)参照）。し力し、このような長時間の反応は、メチルイ匕シトシンの検出が迅速に行えない原因の 1つとなっていた。

[0007] 一方、近年ライフサイエンス関連産業やバイオ関連産業の発展に伴い、 DNAに関する大量の情報処理や遺伝情報の迅速な取得が要請されるようになってきて、る。

[0008] 従って、 DNAの脱アミノ化を迅速に行!、、メチル化 DNAの検出を迅速に行う方法の開発が望まれていた。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明の主な課題は、 DNAの脱ァミノ化反応を迅速に行ヽ、試料中のメチルイ匕

DNAを短時間で検出する方法を提供することである。より詳細には、シトシンの脱アミノ化反応を迅速に行ヽ、試料中のメチルイ匕シトシンを短時間で検出する方法を提供することである。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは上記課題を解決するため、鋭意研究した結果、 DNAを高ヽ亜硫酸濃度の亜硫酸塩溶液と反応させることにより、極めて短時間でシトシンの脱ァミノ化反応が進むことを見出し、更に検討を重ねて、本発明を完成するに到った。

[0011] 即ち、本発明は、以下の、亜硫酸塩組成物、 DNAの脱ァミノ化方法、メチル化 DNA の検出方法、並びに DNAの脱アミノ化用又はメチルイ匕 DNAの検出用キットに関する。

[0012] 項 1 : 6.2Mより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物。

[0013] 更に詳細には、 6.2Mより大きい亜硫酸濃度を有する DNAの脱アミノ化用又はメチル化 DNAの検出用亜硫酸塩組成物である。別言すると、 DNAの脱ァミノ化のため又はメチルイ匕 DNAの検出のための、 6.2Mより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物の使用に関する発明である。

[0014] 項 2 : 6.2Mより大きく 10M以下である亜硫酸濃度を有する項 1記載の亜硫酸塩組成物。

[0015] 項 3 :pHが 5.0から 5.6である項 1又は 2に記載の亜硫酸塩組成物。

[0016] 項 4 : 2種以上の亜硫酸塩を含有する項 1一 3のいずれか〖こ記載の亜硫酸塩組成物。

[0017] 項 5：亜硫酸のアンモ-ゥム塩及びナトリウム塩からなる群力選ばれる 2種以上の亜硫酸塩を含有する項 1一 4のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物。

[0018] 項 6 :亜硫酸アンモ-ゥム、亜硫酸水素アンモ-ゥム及び亜硫酸水素ナトリウムを含有する項 1一 5のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物。

[0019] 項 7：下記工程を有する DNAの脱ァミノ化方法：

(1) 1本鎖 DNAを含有する試料を、 6.2Mより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物で処理する工程、

(2) (1)で処理した試料をアルカリ処理する工程。

より詳細には、工程（1)における亜硫酸塩組成物は、項 1一 6のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物である。

[0020] 項 8：工程（1)の前に下記工程 (0)を有する項 7に記載の DNAの脱ァミノ化方法：

(0)試料中の二本鎖 DNAを一本鎖 DNAに変性する工程。

[0021] 項 9 :工程（1)における DNAがシトシンを含んでなる DNAである、項 7— 8のいずれかに記載の DNAの脱ァミノ化方法。

[0022] 項 10 :工程（1)における亜硫酸塩組成物力 6.2Mより大きく 10M以下の亜硫酸濃度を有する亜硫酸組成物である項 7— 9のいずれかに記載の DNAの脱ァミノ化方法

[0023] 項 11 :工程（1)が、 pHの範囲が 5— 5.6程度で処理する工程である、項 7— 10のいずれかに記載の DNAの脱ァミノ化方法。

[0024] 項 12 :工程（1)力 60— 95°C程度の温度で、 5— 60分程度処理する工程である項 7 一 11の、ずれかに記載の DNAの脱ァミノ化方法。

[0025] 好ましくは、工程（1)力 70— 90°C程度の温度で、 5— 60分程度処理する工程である項 7— 11の、ずれかに記載の DNAの脱ァミノ化方法である。

[0026] 項 13：以下の工程を有するメチル化 DNAの検出方法：

(a) 1本鎖 DNAを含有する試料を、 6.2Mより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物で処理した後、アルカリ処理して、脱ァミノ化処理する工程、

(b) (a)で得られた試料中のメチル化 DNAを検出する工程。

[0027] より詳細には、工程 (a)は、項 7— 12のいずれかに記載の方法で脱ァミノ化処理する工程である。

[0028] 項 14：工程（a)における DNAがシトシンを含んでなる DNAであり、工程 (b)が（a)で得られた試料中のメチル化シトシンを検出する工程である項 13に記載のメチルイ匕 DNAの検出方法。

[0029] 項 15：工程 (b) 1S 塩基配列決定、 DNAチップまたは制限酵素の、ずれかの手段を用いて、試料中のメチルイ匕シトシンを検出する工程である、項 14に記載のメチルイ匕 DNAの検出方法。

[0030] より詳細には、工程 (b)は、（i)試料中の DNAを PCRにて増幅後、塩基配列決定によりシトシンとチミンの存在位置を同定する手段、（ii)試料中の DNAを PCRにて増幅後、シトシンがチミンに変化した場合に DNAにハイブリダィゼーシヨンするプローブと、シトシンがチミンに変化しな、場合にハイブリダィゼーシヨンするプローブを固定ィ匕した DNAチップを用いて、シトシンとチミンを同定する手段、または、（iii)試料中の DNAを PCRにて増幅後、シトシンがチミンに変化することにより、 DNAを切断する制限酵素及び Z又は切断しなくなる制限酵素を用いて、 DNAの切断の有無により、シトシンとチミンを判定する手段のいずれかを用いて、試料中のメチル化シトシンを検出する工程である。

[0031] 項 16 :工程 (b)が、試料 DNA中のシトシンがゥラシルに変換された場合に核酸増幅できる少なくとも 1つのプライマー、及びシトシンがゥラシルに変換されない場合に核酸増幅できる少なくとも 1つのプライマーを用いて、試料中の DNAを増幅させ、増幅の有無により、 5—メチルシトシンとゥラシルの存在位置を同定する手段によりメチル化シトシンを検出する工程である項 14に記載のメチルイ匕 DNAの検出方法。

[0032] 項 17：項 1に記載の亜硫酸塩組成物を含んでなる DNAの脱アミノ化用キット。

[0033] より詳細には、項 1一 6のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物を含んでなる DNAの脱アミノ化用キットである。

[0034] 好ましくは、更に DNAの検出手段を含むキットである。又は、更に DNAの増幅用プライマーを含む DNAの脱アミノ化用キットである。

[0035] 項 18：項 1に記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるメチルイ匕 DNAの検出用キット。

[0036] より詳細には、項 1一 6のいずれかに記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるメチルイ匕 DNAの検出用キットである。

[0037] 好ましくは、更に DNAの検出手段を含むメチルイ匕 DNAの検出用キットである。又は、更に DNAの増幅用プライマーを含むメチル化 DNAの検出用キットである。 [0038] 発明を実施するための形餱

以下、本発明を詳細に説明する。

[0039] 新硫酸塩組成物

本発明の態様の一つは、高、亜硫酸濃度を示す亜硫酸塩組成物である。本発明における亜硫酸には、化学式で表して、 H SO , HSO―, SO一などが含ま

2 3 3 3

れる。本発明の好ましい形態である酸性条件下では、ほとんどが重亜硫酸イオン（

HS0―)として存在する。

3

[0040] 本発明の亜硫酸塩組成物における亜硫酸濃度は、 6.2Mより大きぐ好ましくは 8M 以上である。また、好ましくは 10M以下である。濃度が低すぎると DNAの脱アミノィ匕反応速度が低下する傾向がある。一方、濃度が高すぎると結晶が析出しやすい。

[0041] 本発明の亜硫酸塩組成物における pHは、 DNAの脱ァミノ化反応の最適 pHとほぼ同一であることが好ましい。従って、本発明の亜硫酸塩組成物における pHの範囲は、好ましくは 4.0— 6.0程度、更に好ましくは 5.0— 5.6程度である。

[0042] よって、本発明の亜硫酸塩組成物の最も好ましい態様は、亜硫酸濃度が 8M以上 10 M以下であって、かつ pHが 5.0— 5.6の場合である。

[0043] このような高い亜硫酸濃度の本発明の亜硫酸塩組成物は、 2種以上の亜硫酸塩を含有して!/、ることが好まし!/、。

[0044] 亜硫酸塩の種類としては、亜硫酸のナトリウム塩、アンモニゥム塩、カリウム塩などが挙げられる。

[0045] 具体的には、亜硫酸水素ナトリウム（NaHSO )、亜硫酸ナトリウム (Na SO )、亜硫酸

3 2 3 アンモニゥム（（NH ) S〇）、亜硫酸水素アンモニゥム（(NH )HS0 )、亜硫酸カリウム（

4 2 3 4 3

K SO )などが挙げられる。

2 3

[0046] 中でも、溶解度及び pHの調製に関する理由により、亜硫酸ナトリウム塩及び亜硫酸アンモ-ゥム塩カもなる群力選ばれる 2種以上の亜硫酸塩を組合せて用いることが好ましい。

[0047] 更には、亜硫酸水素アンモ-ゥム、亜硫酸アンモ-ゥム及び亜硫酸水素ナトリウムを組合せて用いることが好ま、。

[0048] 本発明の亜硫酸塩組成物の調製法は特に限定されな!ヽが、例えば、亜硫酸水素アンモ-ゥム、亜硫酸アンモ-ゥム及び亜硫酸水素ナトリウムの組合せの場合には、亜硫酸水素アンモ-ゥム溶液に亜硫酸水素ナトリウム及び亜硫酸アンモ-ゥムの粉末を添加し、 5分から 40分程度、更に好ましくは 10— 20分程度、 50— 95°C、好ましくは

70— 90°Cで、加温することが好ましい。

[0049] 本発明の亜硫酸塩組成物は、 DNAの脱アミノ化用又はメチルイ匕 DNAの検出用として好適に用いられる。

[0050] DNAの脱ァミノ化方法

本発明の態様の一つは、 DNAの脱ァミノ化方法である。

[0051] 本発明の DNAの脱アミノィ匕方法は、（1)一本鎖 DNAを含有する試料を、上記本発明の亜硫酸塩組成物で処理する工程、及び、（2) (1)で処理した試料をアルカリ処理する工程を有する。

[0052] 試料が二本鎖 DNAを含有する場合は、更に、試料中の二本鎖 DNAを一本鎖 DNA に変性する工程を、（1)の工程の前に含めてもよい。

[0053] さらに、高分子 DNA、例えば、ゲノム DNAを処理する場合には、変性する工程の前に、 DNAを制限酵素で切断し、断片化する工程を適宜加えてもよい。

[0054] 二本鎖 DNAを一本鎖 DNAに変性する方法としては、例えば、熱処理、アルカリ処理等があげられる。熱処理の条件は、特に限定されないが、例えば、 95— 100°C程度で 5分から 10分程度処理する。アルカリ処理の条件も特に限定されないが、例えば、 0.2N以上のアルカリで、約 30°C— 42°Cで、 20分から 60分程度で処理する。このうち、約 0.3Nの水酸ィ匕ナトリウムを用いて、 30— 37°C程度で 30分程度処理する方法が好ましい。

[0055] (1)の工程においては、 6.2Mより大きぐ好ましくは 8M以上、また 10M以下である亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物を用いることが好まし、。濃度が低すぎると脱アミノ化反応速度が低下する。一方、濃度が高すぎると結晶が析出しやすくなる。

[0056] また亜硫酸塩組成物による試料の処理は、 5.0— 5.6程度の pHの範囲で行うことが好ましい。 pHが低すぎても、高すぎても脱ァミノ化率が低下する。

[0057] 処理の温度は 60— 95°C程度、更に好ましくは 70°C力 90°C程度であることが好ましい。温度が低すぎると亜硫酸塩が析出し、反応が進みにくい。また温度が高すぎると、 DNAの分解が急速に進行し、後の解析に支障がでる可能性がある。

[0058] 処理時間は、 5分力 60分程度であることが好ましい。時間が短すぎると脱ァミノ化が不充分になる。一方、長すぎると DNAの分解等、試料の損傷が起こりやすくなる。

[0059] (1)の工程は、亜硫酸濃度が高いほど速く進行する傾向がある。そのため、（1)の工程の際は、試料と亜硫酸塩組成物以外の不要な溶液を入れることはできるだけ避けることが好ましい。

[0060] (2)の工程におけるアルカリ処理は、核酸に結合した亜硫酸基が脱離できる処理であれば特に限定されない。例えば試料に水酸ィ匕ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、アンモニァ及び Z又はトリス等をカ卩えて、 PH9.0以上にし、 10分から 120分程度処理することがあげられる。中でも、試料に 0.2N程度の水酸ィ匕ナトリウムをカ卩えて、 10分程度処理することが好ましい。

[0061] 本発明の対象とする試料の種類は特に限定されず、血液、がん細胞、培養細胞等を含む各種細胞や組織に適用し得る。 DNAの種類も限定されず、例えば、プラスミド DNA、ゲノム DNA等に適用し得る。 DNAの由来も特に限定されず、例えば、ヒト、マウスを含む各種動物、酵母、細菌等に適用し得る。

[0062] 本発明の DNAの脱アミノィ匕方法は、特にシトシンを含んでなる DNAの脱ァミノ化に好適に用いられる。具体的には、（1)シトシンを含んでなる一本鎖 DNAを含有する試料を、上記本発明の亜硫酸塩組成物で処理する工程、及び、（2) (1)で処理した試料をアルカリ処理して、シトシンをゥラシルに変換する工程を有する DNAの脱アミノィ匕方法として用い得る。

[0063] メチル化 DNAの檢出方法

本発明の態様の一つは、メチルイ匕 DNAの検出方法である。

[0064] 本発明のメチルイ匕 DNAの検出方法は、以下の工程を有する。

(b) (a)で得られた試料中のメチル化 DNAを検出する工程。

[0065] (a)の工程は、具体的には、上記本発明の DNAの脱ァミノ化方法に従って、 DNAを脱ァミノ化する工程である。亜硫酸塩組成物の亜硫酸濃度は、好ましくは、 8M以上である。また、 10M以下であることが好ましい。また、亜硫酸組成物による処理は、 pH の範囲が 5— 5.6程度で行うことが好ましい。また処理温度は、 60— 95°C、更には、 70 一 90°Cであることが好ましい。また処理時間は、 10— 60分程度であることが好ましい。

[0066] また、（a)の工程においては、更に、試料中の二本鎖 DNAを一本鎖 DNAに変性する処理を行ってもよい。さら〖こ、高分子 DNA、例えば、ゲノム DNAを処理する場合には、変性する工程の前に、 DNAを制限酵素で切断し、断片化する工程を適宜加えてちょい。

[0067] 本発明の検出方法は、メチル化 DNAのうち、特にメチルイ匕シトシンの検出に好適に用いられる。具体的には、（a)シトシンを含んでなる一本鎖 DNAを含有する試料を、本発明の亜硫酸塩組成物で処理した後、アルカリ処理して、 DNAを脱ァミノ化し、 DNA中のシトシンをゥラシルに変換する工程、 (b) (a)で処理した試料中のメチルイ匕シトシンを検出する工程を有する方法として用、得る。

(b)の工程において、メチルイ匕シトシンの検出は、例えば、塩基配列決定、 DNAチップまたは制限酵素を用いる手段により行うことができる。

[0068] 具体的に、塩基配列決定を用いる手段とは、（i)試料中の DNAを PCRにて増幅後、塩基配列決定によりシトシンとチミンの存在位置を同定する手段である。 DNAチップを用いる手段とは、（ii)試料中の DNAを PCRにて増幅後、シトシンがチミンに変化した場合に DNAにハイブリダィゼーシヨンするプローブと、シトシンがチミンに変化しな!ヽ場合にハイブリダィゼーシヨンするプローブを固定化した DNAチップを用いて、シトシンとチミンを同定する手段である。また、制限酵素を用いる手段とは、（iii)試料中の DNAを PCRにて増幅後、シトシンがチミンに変化することにより、 DNAを切断する制限酵素及び Z又は切断しなくなる制限酵素を用いて、 DNAの切断の有無により、シトシンとチミンを判定する手段である。

[0069] また、（b)の工程においては、（iv)試料 DNA中のシトシンがゥラシルに変換された場合に核酸増幅できる少なくとも 1つのプライマー、及びシトシンがゥラシルに変換されない場合に核酸増幅できる少なくとも 1つのプライマーをそれぞれ用いて該試料を増幅反応させ、増幅の有無により、シトシンとチミンを判定する手段を用いて、メチルイ匕シトシンの検出を行ってもよい。 [0070] 、ずれの手段にお、ても、 PCRのような DNA増幅法を介する方法が好まし!/、。

[0071] キット

本発明の態様の一つは、 DNAの脱アミノ化用キット、又は、メチルイ匕 DNAの検出用キットである。

[0072] 本発明のキットは、上記本発明の亜硫酸塩組成物を含むことを特徴とする。

[0073] 本発明のキットには、更に、 DNAの脱ァミノ化、又はメチル化 DNAの検出のための適当な検出手段や、 DNA精製手段、標識手段、試薬等を、適宜含めることができる。また、 PCR等に用い得る DNAの増幅用プライマーを含めることもできる。

[0074] 検出手段としては、各種プライマー、プローブ、制限酵素、蛍光色素及び Z又は各種媒体等が挙げられる。

[0075] 本発明のキットは、上記本発明の DNAの脱ァミノ化方法及びメチル化 DNAの検出方法の実施に、特に好適に用いることができる。

発明の効果

[0076] 本発明の高い亜硫酸濃度の亜硫酸塩組成物を用いることにより、 DNAの脱アミノィ匕処理を短時間で行うことができる。

[0077] 従来は、 DNAの脱ァミノ化処理に 12— 16時間程度の長時間を要し、メチル化 DNA の検出を迅速に行うことが困難であった。しかし、本発明によれば、 DNAの脱アミノィ匕を短時間で行うことができ、更にメチル化 DNAの検出を迅速に行うことも可能になる。

[0078] 特に、本発明によって、シトシンからゥラシルへの変換を短時間で行うことが可能になり、更にメチルイ匕シトシンの検出を迅速に行うことが可能となる。

[0079] 本発明は、遺伝情報の取得や DNA関連技術の開発など種々の技術に利用できる。例えば、メチル化 DNAの異常は、がんなどの種々の疾患と関連していることが報告されているが、本発明によるメチル化 DNAの迅速な検出により、診断や遺伝子検査などが大幅に効率化される。また、メチル化 DNAの研究ツールとしても、本発明は有用である。

[0080] このように、本発明は、医療を含むライフサイエンス産業やバイオ関連産業の推進に大きく寄与するものである。

図面の簡単な説明 [図 1]図 1は、亜硫酸塩組成物を用いて処理した試料における脱アミノ化率をシトシンの残存量で示した図面である。參は、 2' デォキシシチジンを 9Mの亜硫酸水素ナトリゥムーアンモ -ゥム溶液を用いて 70°Cで処理した場合を表す。◊は、 2'—デォキシシチジンを 5.3Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液を用いて 70°Cで処理した場合を表す。□ は 5—メチルー 2，一デォキシシチジンを 9Mの亜硫酸水素ナトリウム—アンモ-ゥム溶液を用、て 70°Cで処理した場合を表す。▲は 5—メチルー 2 ' デォキシシチジンを 9Mの亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム溶液を用いて 90°Cで処理した場合を表す。

[図 2]図 2は、 DNAの脱ァミノ化反応の pH依存性を示した図面である。

[図 3]図 3は、サケ睾丸 DNA試料を HPLCで分析した結果を示した図面である。図 3a は本発明の亜硫酸塩組成物で処理した試料、図 3bは未処理の試料の分析結果である。図 3中、 Cは 2' デォキシシチジンを表す。 Uは、 2'—デォキシゥリジンを表す。 mCは 5—メチルー 2' デォキシシチジンを表す。 Gは 2'—デォキシグアノシンを表す。 T はチミジンを表す。 Aは 2 'ーデォキシアデノシンを表す。

[図 4]図 4は、 MCF-7細胞における CDH1遺伝子の亜硫酸塩処理による解析に関する図面である。図 4 (A)は増幅させたゲノム領域を示す。図 4 (B)は増幅させた領域の配列を示す。太文字は CpGジヌクレオチドを示す。図 4 (C)は亜硫酸処理したゲノム DNAを段階希釈した時の PCR増幅結果を示す。 aは従来法 (3.6M亜硫酸濃度の亜硫酸塩組成物を用いて 55°Cで 20時間）で処理したものである。 bは本発明の亜硫酸塩組成物を用いて 90°Cで 20分処理したものである。 cは、本発明の亜硫酸塩組成物を用いて 70°Cで 40分処理したものである。レーン 1では 500ng、レーン 2では 50ng、レーン 3では 5ng、レーン 4では 500pg、レーン 5では 50pgの DNAを铸型として使用した。図 4 (D)はプラスミドクローンの塩基配列分析結果を示す。各列は個々のプラスミドクローンを示す。〇及び參はそれぞれチミン及びシトシンを示す。ポジション 2のドットサークルは、このポジションが MCF-7細胞ではへテロ接合体であるためカウントして!/ヽな!、。矢印は CpGヌクレオチドにおけるシトシンの位置を示す。

[図 5]図 5は、 MCF-7細胞における RASSF1A遺伝子の亜硫酸塩処理による解析に関する図面である。図 5 (A)は増幅させたゲノム領域を示す。図 5 (B)は増幅させた領域の配列を示す。太文字は CpGジヌクレオチドを示す。相補鎖を铸型として使用したため、相補鎖のメチルイ匕シトシンの位置はグァニン残基として示される。図 5 (C)は亜硫酸処理したゲノム DNAを段階希釈した時の PCR増幅結果を示す。 aは従来法 (3.6M 亜硫酸濃度の亜硫酸塩組成物を用いて 55°Cで 20時間）で処理したものである。 bは本発明の亜硫酸塩組成物を用いて 90°Cで 20分で処理したものである。 cは、本発明の亜硫酸塩組成物を用いて、 70°Cで 40分処理したものである。レーン 1では 500ng、レーン 2では 50ng、レーン 3では 5ng、レーン 4では 500pg、レーン 5では 50pgの DNAをテンプレートとして使用した。図 5 (D)はプラスミドクローンの塩基配列分析結果を示す。各列は個々のプラスミドクローンを示す。〇及び參はそれぞれチミン及びシトシンを示す。矢印は CpGヌクレオチドにおけるシトシンの位置を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0082] 以下、実施例及び実験例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

[0083] [測定方法]

0— A. 新硫酸濃度の測定

亜硫酸濃度の測定は、塩酸溶液中で亜硫酸塩から二酸化硫黄が生成し、生成した二酸ィ匕硫黄の量に依存して、 276nmの吸光度 (A )が変化することを利用して行つ

276

た。

[0084] 吸光度測定用のキュベット（lxlx4cm、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）に 3ml の 0. IN塩酸 (和光純薬工業株式会社製)をいれた。蒸留水にて希釈した亜硫酸塩溶液 30 1を、該キュベットにカ卩えて、ノラフイルムで蓋をして、 3回転倒攪拌した後に、分光光度計（日立計測器サービス株式会社製、モデル U-2800)を用いて、 276nmの吸光度を測定した。

[0085] 0.2mMから 3mMに希釈した亜硫酸ナトリウム (和光純薬工業株式会社製)溶液を標準液として同様に吸光度を測定し、標準液と試料の吸光度値から試料の亜硫酸濃度を算出した。

[0086] この方法にて市販の 50%亜硫酸水素アンモニゥム (和光純薬工業株式会社製)の亜硫酸濃度を測定したところ、 6.0Mから 6.2Mであった。

[0087] Q-B.溶解度の沏 I定亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、及び亜硫酸アンモ-ゥム 1水和物（いずれも和光純薬工業株式会社製)の溶解度は、次のように測定した。

[0088] 30°C又は 70°Cにて、 10mlの蒸留水に、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸アンモ-ゥム 1水和物を加え、溶解しなくなるまで添加して溶液を調製し、その時の質量、体積及び pHを測定した。また各溶液について、上記 0— Aの方法に従つて、亜硫酸濃度を測定した。

[0089] 表 1に、測定値、及び、それらから計算した濃度を示す。

表中の濃度において、計算値とは溶解した各亜硫酸塩の質量と分子量から計算した亜硫酸濃度 (M (mol/l) )を表す。また、測定値とは上記 0— Aの方法に従って測定した亜硫酸濃度 (M)を表す。

[0090] [表 1]

m 計籌健鑭定艟

«1»*»^トリウム 30°C 0.4§ S,2 S，0 4.4

W⁹C 0.61 6.5 5.9 4,5 還雄ナウム 30。C 0.20 1.6 1.5 10.3

7ΰ⁹€ 0.2S 2.1 2*1 10,5 ¾¾Τ: ¾：ゥム 30^eC 0.51 3.5 3.5 8.5

4.6 4.3 8.2

[0091] 70°Cでの溶解度は、亜硫酸水素ナトリウムで 5.9M、亜硫酸ナトリウムで 2.1M、亜硫酸アンモニゥム 1水和物で 4.3Mであった。

[0092] [実施例 1]

1 A.高濃度新硫酸塩溶液の調製

5.0mlの 50%亜硫酸水素アンモ-ゥム溶液に 2.08gの亜硫酸水素ナトリウム及び 0.67gの亜硫酸アンモ-ゥムをカ卩えて 70°Cで 5分間攪拌して、溶解した。得られた溶液の pHは 5.4、亜硫酸濃度は 10Mであった。この溶液の pH及び亜硫酸濃度は 70°C、 4 時間でも変化な力つた。

[0093] 以下、得られた溶液を、亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム混合溶液とも称する。

[0094] 1 B. 2 ' デォキシシチジン及び 5—メチルー 2 ' デォキシシチジンの脱アミノ化反]^ の ¾平

脱ァミノ化反応物の定量は Sonoらの文献（Sonoら、 J.Am.Chem.Soc.、 Vol.96, p.4745-4749, (1973) )に記載の方法に従った。

[0095] 2，一デォキシシチジン又は 5—メチルー 2，ーデォキシシチジン（シグマ社製）を、それぞれ 0.2Mになるように蒸留水に溶解した溶液を調製した。

[0096] 2' デォキシシチジン溶液 25 μ 1に、 0— Βに従って作成した 5.9Μの亜硫酸水素ナトリウム溶液 (反応終濃度は 5.9 X 250+ (250 + 25) 約 5.3Μになる）、又は実施例 1で調製した 10Mの亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム溶液 (反応終濃度は 10.0 X 250 ÷ (250 + 25) 約 9.0Μになる）をそれぞれ 250 μ 1加えて、 0から 10分間処理し、 500 μ 1の冷水を加えて反応を停止した。 75 1の反応液を 5mlの 0.2Μリン酸ナトリウム緩衝液 (PH7.2)と混合して室温で 40分放置した後に分光光度計（日立計測器サービス株式会社社製、モデル U-2800)にて 270nmの吸光度を測定した。

[0097] 未反応試料 (亜硫酸溶液処理をして、な、同濃度の 2 ' デォキシシチジン溶液)の吸光度は 0.8であった。 9Mの亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム溶液のみの吸光度は 0.05であった。未反応試料の吸光度を 100%とし、反応試料の吸光度の減少から、脱ァミノ化反応産物を定量した。

[0098] 5—メチルー 2，一デォキシシチジンについては、 277nmの吸光度を測定する以外、上記 2，一デォキシシチジン溶液の場合と同様の測定定量を行った。 [0099] 図 1に脱ァミノ化反応の結果を示す。

[0100] 70°C、 pH5.4の条件で処理した場合に、デォキシシチジンの半分がデォキシゥリジンに変換する時間 (t )は、 5.3Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液を用いた場合は 3分で

1/2

あった。一方、 9Mの亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム混合溶液を用いた場合は、 1.8分であった。

[0101] t (亜硫酸濃度 5.3Mの亜硫酸水素ナトリウム溶液を用いた場合) Zt (亜硫酸濃

1/2 1/2 度 9Mの亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム混合溶液を用いた場合）は 1.7であり、これは濃度比（9.0Z5.3)と一致する。すなわち脱ァミノ化反応速度が亜硫酸の濃度に依存することを示していた。

[0102] また 10Mの亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム溶液を段階希釈して、 2Mから 9Mの濃度で反応させて脱ァミノ化反応処理を行ったところ、脱ァミノ化反応の速度が亜硫酸塩濃度依存的であることがわ力つた。

[0103] また、 5—メチルー 2，一デォキシシチジンを 9Mの亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム混合溶液で処理した場合の脱アミノ化率 (5—メチルー 2—デォキシシチジンが脱ァミノ化されてチミンに変換した割合）は、 70°C、 10分間の処理条件で 16%、 90°C、 10分間の処理条件で 23%であった。

[0104] 1一脱アミノ化 ]^の温度存件

1 Bと同様の方法にて、 9M亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム溶液 (pH5.4)を用いて、 90°C、 50°C、 37°Cで処理した場合における、デォキシシチジンの t を測定した

1/2

。その結果、それぞれ 1分以下、 5分及び 17分であった。

[0105] 1 D. 100%脱ァミノ化時間の測定

以下の手順に従って、 2，一デォキシシチジンが完全に 2，ーデォキゥリジンに変換する時間を測定した。

[0106] (測定方法）

0.2Mの 2，一デォキシシチジン溶液 25 μ 1に、 1 Αで調製した 10Mの亜硫酸水素ナトリウムーアンモ -ゥム溶液 (反応終濃度 9M)を 250 1カ卩えて、種々の時間処理した後、 500 μ 1の冷水を加えて反応を停止した。 75 μ 1の反応液を 5mlの 0.2Μリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.2)と混合して室温で 40分放置した。 [0107] 次いで、上記処理後の試料 10 1を、以下に示す HPLC分析に供して 2'—デォキシシチジンと 2，ーデォキゥリジン量を測定した。

[0108] (HPLC分析）

HPLC分析システム（日立計測器サービス株式会社製）にウルトラスフエアー ODS4.6mm X 25cmカラム（ベックマンコールター社製）を接続した。緩衝液 A ( lOOmMリン酸カリウム緩衝液 (pH7.0) )、及び緩衝液 B (90%メタノール、 ImMリン酸力リウム緩衝液 (PH7.0) )を調製した。 HPLCシステムのプログラムは流速 0.7ml/分、緩衝液濃度プロファイルは、 100%A: 0分、 100%A: 5分、 85%A: 25分、 55%A: 35分、 0%A: 60分とした。

[0109] この条件における 2' デォキシシチジンの溶出時間は 19分、 2'—デォキゥリジンは 22分、 5—メチルー 2，一デォキシシチジンは 25分、 2，ーデォキシグアノシンで 26分、チミジンは 28分、 2，ーデォキシアデノシンは 32分であった。濃度はチャート面積力も算出した。

[0110] (測定結果）

測定の結果、 9M亜硫酸水素ナトリウムアンモ-ゥム溶液 (pH5.4)を用いて脱ァミノ化処理を行う場合、 2' デォキシシチジンが完全に（100%)、 2'—デォキゥリジンに変換する時間は、 70°Cで 30分、 90°Cで 8分であることがわかった。

[0111] 1 R. 脱アミノ化 ]^の nHfe存件

50%亜硫酸水素アンモ-ゥム溶液に、任意の割合の亜硫酸水素ナトリウムと亜硫酸ナトリウムを溶解させ、 pH4.0から 6.0の 7M亜硫酸塩溶液を調製した。この溶液を用いて、 1 Bの記載と同様の方法にて、 2-デォキシシチジンの脱アミノ化率を測定した

。反応時間は 5分、温度は 60°Cとした。

[0112] その結果、図 2に示すように至適 pHは 5.0から 5.6であった。

[0113] [実施例 2]ゲノム DNAの脱ァミノ化反応

サケ睾丸 DNA (シグマ社製)を 1.6mg/mlになるように滅菌水で溶解した。この溶液

50 μ 1に 3Ν水酸ィ匕ナトリウム（和光純薬社製）を 5 μ 1加えて、 30°C、 30分間処理して、二本鎖 DNAを一本鎖 DNAに変性した。

[0114] 得られた溶液に 550 1の 10M亜硫酸アンモ-ゥムーナトリウム溶液 (pH5.4)を加えて良く混合後、 90°C、 10分間反応させた (亜硫酸塩の終濃度は 9M)。

[0115] 次いで、反応液を TE緩衝液（10mM Tris— HCl (pH8)、 ImM EDTA)で緩衝ィ匕したセフアデックス G- 50カラム（ φ 15x40mm、バイオラッドェコノパック 10、バイオラッド社製）にアプライし、脱塩操作を行った。 UVモニタリングにより DNA画分を回収し、回収した DNA画分の 2.5倍の体積の冷エタノール（和光純薬社製）、回収した DNA画分の 10分の 1倍の体積の 3M酢酸ナトリウム（pH5.2)をカ卩えて DNAを沈澱させた。

[0116] 遠心操作によって沈澱した DNAを分離回収した後、 100 μ 1の滅菌水に溶解した。

90 μ 1の試料に、 11 μ 1の 2Ν水酸化ナトリウムを添カ卩して 10分間処理し、試料 DNA中のシトシンを脱ァミノ化してゥラシルに変換させた。

[0117] 処理後の液に、 30 1の 3Μ酢酸ナトリウム（ρΗ5.2)、 70 1の滅菌水及び 500 1の冷エタノール (和光純薬製)をカ卩えて、 20°Cで 1時間放置した。沈澱した DNAを回収して 40 1の滅菌水に溶解した。 1の DNA溶液に 1.5 /z 1の反応緩衝液（0.1M塩化マグネシゥム、 0.2M Tris— HCl (pH8) )、 10 gの DNase I (ロシュ社製）を加えて 37。C、 2 時間処理した後、 0.4ユニットのへビ毒フォスフォジエステラーゼ (Worthington社製）を追カ卩し、さらに 90分間反応させた。次いで 0.2ユニットのフォスフォジエステラーゼと 2ユニットのアルカリフォスファターゼ（プロメガ社製）を添カ卩して 90分間処理することによって DNAをヌクレオシドに分解した。分解反応物をエタノール沈澱操作によって蛋白質や未反応物と分離した後、溶液を吸引乾燥した。 30 ^ 1の滅菌水に溶解後、上記 1 D記載の HPLC分析の方法でヌクレオシド量を測定した。

[0118] 図 3に HPLC分析のチャートを、表 2に各ヌクレオシドの比率を示した。

[0119] [表 2]

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LB ' 82 'ZZ II»^#T ' Ό 漏 rn'iz m* z ez t €S^#6i @o*o

a S O D

[0120] 表 2中、 Cは 2'—デォキシシチジンを表す。 Uは、 2'—デォキシゥリジンを表す。 mCは 5—メチルー 2'—デォキシシチジンを表す。 Gは 2'—デォキシグアノシンを表す。 Tはチミジンを表す。 Aは 2'—デォキシアデノシンを表す。

9Mの亜硫酸アンモ-ゥム—ナトリウム溶液中、 90°C、 10分間処理した時のゲノム DNA 中のシトシンの脱アミノ化率（シトシンからゥラシルへの変換率）は 99.6%であった。また 5—メチルシトシンの変換率は 10%以下であった。さらに他の塩基の変換は認められな力つた。 70°C及び 37°Cで同様の脱ァミノ化率が得られる反応時間は、それぞれ 16分と 170分であった。

[0121] [実施例 3] 9M重亜硫酸塩組成物処理後の DNAが PCRの铸型として使えるかどうかの検討

1 μ gの制限酵素 Seal (NEB社製)で処理した pUC119 (タカラバイオ社製)を、 50 1 の 0.3N水酸ィ匕ナトリウム溶液中で 37°C、 30分間処理して 1本鎖 DNAに変性した。処理液に 500 1の 10Mアンモ-ゥムーナトリウム亜硫酸溶液 (pH5.4)を加えて良く混合してミネラルオイルを重層し、 70°Cまたは 90°Cで、 5分から 40分間反応させた。反応液 130 /z lを抜き取り、氷冷した等量の滅菌水と混合した。取扱い説明書にしたがって、 Wizard DNA Clean-UPシステム（プロメガ社製）を用いて DNAを精製し、 90 μ 1の滅菌水に溶解した。 11 1の 2Ν水酸ィ匕ナトリウム溶液を添加して 37°C、 10分間処理した。 10 gの酵母 tRNA (シグマ社製）をキャリア一としてエタノール沈澱操作により DNA を回収し、 100 μ 1の ΤΕ緩衝液（10mM Tris— HCl (pH8.0)、 ImM EDTA)に溶解した。

[0122] この溶液 1 μ 1をサンプルとして、配列表の配列番号 1及び 2に示す 2種類のプライマ一、 AmpliTaq DNAポリメラーゼ（アプライドバイオシステム社製）を用いて 50 μ 1の反応系で PCRを行った。サイクル条件は 95°C、 3分後 95°C、 30秒→57°C、 30秒→70°C、 3分を 30サイクルで行い、その他の条件は取扱い説明書にしたがった。 PCR後、 1 1 の試料をァガロースゲル電気泳動で分析し、増幅量を確認した。

[0123] その結果、未処理の DNAと、 70°Cまたは 90°Cで 5分力 40分間処理した試料の、 PCRにおける DNAの増幅量はほぼ同じであった。このことは亜硫酸処理した DNAが PCRの铸型として使用できな、までに切断などの損傷を受けてはヽな、ことを示している。さらに 70°C、 20分処理したサンプルと 90°C、 10分処理した試料の PCR産物を BigDyeTM Terminator Cycle Sequencingキット（アプライドバイォシステム社製）、 ABI モデル 3700オートシーケンサー（アプライドバイォシステム社製）を用いて塩基配列決定を行ったところ、シトシンがチミンに変化して、た。

[0124] [実施例 4]高分子 DNAの脱ァミノ化及びメチル化 DNAの検出

MCF-7細胞において、 CDH1遺伝子と RASSF1A遺伝子の CpG島はそれぞれ非メチルイ匕、又はメチル化されていることが報告されている（Koizumeら、 Nucleic Acids Res. ,30,4770- 4780,2002及び、 Dammannら、 Cancer Res., 61,3105- 3109,2001等参照)。そこで、 9Mの亜硫酸塩組成物の処理後、これらの CpG島のメチルイ匕状態が再現されるかを調べた。

[0125] 4-A. 新硫酸処理 MCF-7ゲノム DNAの調製

ヒト乳ガン細胞 MCF-7細胞から得たゲノム DNAを、制限エンドヌクレアーゼ TSP509I で消化した。フエノールークロロホルム処理及びエタノール沈殿処理を行って、乾燥後、 DNAを 45 1の滅菌水に溶解し、更に 3N水酸化ナトリウム 5 1カ卩えて、 37°C、 30分間処理して 1本鎖 DNAに変性した。 1本鎖に変性した DNA溶液に 10M亜硫酸塩組成物 565 μ 1 (90°C)、 545 1 (70°C)を加えて、 90°Cで 20分、又は、 70°Cで 40分処理した。反応後、取扱い説明書にしたがって、 Wizard DNA Clean-UPシステム（プロメガ社製)を用いて DNAを精製し、 90 1の滅菌水に溶解した。 11 1の 2N水酸ィ匕ナトリウム溶液を添カ卩して 37°C、 10分間処理した。 10 /z gの酵母 tRNA (シグマ社製）をキャリア一としてエタノール沈澱操作により DNAを回収し、 16 1の TE緩衝液（10mM Tris— HCl (pH7.5)、 ImM EDTA)に溶解した。

[0126] 比較のために、従来の方法でも処理した。すなわち、上記と同様に消化した

MCF-7DNA4 μ gを 0.3Ν水酸化ナトリウム溶液 50 μ 1中にて 37°Cで 30分処理して一本鎖に変性した後、 4M亜硫酸ナトリウム/ ImMヒドロキノン溶液 500 1と混合させ、ミネラルオイルで重層し、暗所で、 20時間、 55°Cで処理した。反応後、取扱い説明書にしたがって、 Wizard DNA Clean-UPシステム（プロメガ社製）を用いて DNAを精製し、 90 1の滅菌水に溶解した。 11 1の 2N水酸ィ匕ナトリウム溶液を添カ卩して 37°C、 10分間処理した。 10 gの酵母 tRNA (シグマ社製）をキャリア一としてエタノール沈澱操作により DNAを回収し、 16 μ 1の ΤΕ緩衝液（10mM Tris— HCl (pH7.5)、 ImM EDTA)に溶解した。

[0127] 4-B. MCF-7細朐における CDH1遣伝子の解析

まず、 MCF-7細胞における CDH1遺伝子のメチルイ匕状態を解析した。亜硫酸塩組成物で処理した後の試料を铸型として、図 4B (又は配列表の配列番号 3)に示される配列 280塩基対の断片を増幅した。 PCR解析は、以下の手順で行った。

[0128] (PCR解析）

亜硫酸塩組成物で処理後の MCF-7DNAを、酵母 tRNA1.25mg/mlを含む TE ( 10mM Tris-HCl(pH7.5)/lmM EDTA(pH8.0))で段階的に希釈した。 95°Cで 3分間ィンキュペートした後、 Ampli Taq DNAポリメラーゼ Stoffelフラグメントをカ卩えて、第 1段階の増幅を 95°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 30秒の条件で 20サイクル行った。反応は、 Koizumeらの文献（Nucleic Acids Res., 30,p.4770- 4780ズ 2002》に従った。铸型 DNAは、 500ng、 50ng、 5ng又は 500pgの量で使用した。また PCRプライマーは表 3又は配列表の配列番号 4 (CDH1-L1)及び配列番号 5 (CDH1-R1)に示す配列を用いた。次いで、第 1段階の PCR反応液 2 1、 PCRプライマーとして、表 3又は配列表の配列番号 6 (CDH1-L2)及び配列番号 7 (CDH1-R2)に示す配列を用いて 30サイクル行う以外は上述したのと同様の条件で、 semi-nested PCRを行った。

[0129] [表 3] ene Name of primers Sequence (5' to 3')^a Positions (accession no.)

CDH1 CDH1-L1 ATTTAGTGGAATTAGAATAGTGTAGGTTTT (791—820, L34545)

CDH1-R1 CTACAACTCCAAAAACCCATAACTAAC (1139-1165, L34545)

CDH1-L2 cggaattcTTAGTAATTTTAGGTTAGAGGG (837-858, L34545)

CDH1-R2 cgggatcCTACAACTCCAAAAACCCATAACTAAC (1139-1165, L34545)

RASSF1A RASSF1A-L1 cggaattcGTTTTGGTAGTTTAATGAGTTTAGGTTTTTT (18092-18122, AC002481)

RASSF1A-R1 ACCCTCTTCCTCTAACACAATAAAACTAACC (17741-17771, AC002481 )

RASSF1A-R2 cgggatCCCCACAATCCCTACACCCAAAT (17918-17940, AC002481)

[0130] a:小文字は、制限エンドヌクレアーゼのために導入された配列を示す。

[0131] (測定結果）

初めに、どの程度の量の DNAが铸型として用い得るかについて調べた。従来の方法で処理した MCF-7DNAを铸型として使用した場合（図 4C, a,レーン 2)、 9Mの重亜硫酸組成物で 90°Cで 20分（図 4C, b,レーン 2)及び 70°Cで 40分（図 4C, c,レーン 2)処理した MCF-7DNAを使用した場合、ずれも 50ngの DNAを適用した際、明瞭な PCR産物が検出された。

[0132] 次いで、各実験において 500ngの DNAをテンプレートとして使用して得られた PCR 産物のクローンを作成し、 12個のプラスミドクローンを採集して、それらのヌクレオチド配列を解析した。解析した鎖は増幅領域に 106のシトシン残基を含んでおり、そのうち 29が CpG部位にあった。

[0133] 従来の方法で処理した MCF-7 DNAの場合、解析した 12のプラスミドにおける全てのシトシン残基がゥラシルに変換された。 9M亜硫酸塩組成物を用いて 90°Cで 20分又は 70°Cで 40分処理した MCF-7DNAをテンプレートとして使用した場合も、ほとんど同様の結果が得られた。

[0134] これらの結果は、 9Mの亜硫酸塩組成物を用いて高い温度でヒトゲノム DNAを処理することにより、シトシン力ゥラシルへの変換を迅速に行うことを可能にすることを示している。

[0135] 4-C. MCF-7細朐における RASSF1A遣伝子の解析

次!、で、 MCF-7細胞における RASSF1A遺伝子の CpG島のメチル化状態を解析した。亜硫酸塩組成物で処理した後の試料を铸型として、図 5B (又は配列表の配列番号 8)に示される配列 151塩基対の断片を増幅した。

[0136] (PCR解析）

次に示す点以外は、上記 4-Bと同様の方法で PCR解析を行った。第 1段階 PCRブライマ一として、表 3又は配列表の配列番号 9 (RASSF1A-L1)及び配列番号 10 ( RASSF1A-R1)に示す配列を用いた。 semi-nested PCRにおいては、第一段階 PCR 反応液を 6 1使用した。 PCRプライマーとしては、表 3又は配列表の配列番号 9 ( RASSF1A-L1)及び配列番号 11 (RASSF1A-R2)に示す配列を使用した。

[0137] (測定結果）

従来の方法で処理した MCF-7 DNAを铸型として使用した場合、 PCR産物は 50ng の DNAを適用したときに検出された（図 5C,a,レーン 2)。し力し、 9M亜硫酸塩組成物を用いて 90°Cで 20分又は 70°Cで 40分処理した MCF-7DNAを铸型として使用した場合、 PCR産物は、 500ngの DNAを適用した際にのみ検出された。

[0138] これらの結果は、 9M亜硫酸塩組成物を用いて高温で処理することによる DNA分解の状態は、ヌクレオチド配列によって変化することを示唆している。

[0139] 解析した鎖は増幅した領域に 48のシトシンを含み、そのうち 16が CpG部位にあった。従来の方法で MCF-7DNAを処理したとき、解析した 12のプラスミドクローン全てにおいて、非 CpG部位におけるほとんど全てのシトシンがゥラシルに変換された。対照的に、 CpG部位におけるほとんどのシトシンが変換されな力つた。 9M亜硫酸塩組成物で、 90°Cで 20分又は 70°Cで 40分処理した MCF-7DNAを铸型として用いた場合も同様の結果が得られた。

[0140] 上記実施例の結果から明らかなように、本発明の高い亜硫酸濃度の亜硫酸塩組成物を用いてゲノム DNAを処理することにより、シトシンからゥラシルへの変換が短時間に行われ、一方で、 5—メチルシトシンのほとんどは変化しないことがわかった。

[0141] 従来は、シトシンからゥラシルへの変換処理に 12— 16時間程度の長時間の処理を要していた力本発明によって、シトシンカもゥラシルへの変換が短時間に行われ、さらにメチルイ匕シトシンの検出も迅速に行えることがわかった。

Claims

請求の範囲

[I] 6.2Mより大きい亜硫酸濃度を有する亜硫酸塩組成物。

[2] 6.2Mより大きく 10M以下の亜硫酸濃度を有する請求項 1記載の亜硫酸塩組成物。

[3] pHが 5.0から 5.6である請求項 1に記載の亜硫酸塩組成物。

[4] 2種以上の亜硫酸塩を含有する請求項 1に記載の亜硫酸塩組成物。

[5] 亜硫酸のアンモ-ゥム塩及びナトリウム塩力なる群力選ばれる 2種以上の亜硫酸塩を含有する請求項 1に記載の亜硫酸塩組成物。

[6] 亜硫酸アンモ-ゥム、亜硫酸水素アンモ-ゥム及び亜硫酸水素ナトリウムを含有する請求項 1に記載の亜硫酸塩組成物。

[7] 下記工程を有する DNAの脱ァミノ化方法：

(2) (1)で処理した試料をアルカリで処理する工程。

[8] 工程（1)の前に下記工程 (0)を有する請求項 7に記載の DNAの脱ァミノ化方法：

(0)試料中の二本鎖 DNAを一本鎖 DNAに変性する工程。

[9] 工程（1)における DNAがシトシンを含んでなる DNAである、請求項 7に記載の DNAの脱ァミノ化方法。

[10] 工程（1)における亜硫酸塩組成物力 6.2Mより大きく 10M以下の亜硫酸濃度を有する亜硫酸組成物である請求項 7に記載の DNAの脱ァミノ化方法。

[II] 工程（1)力 pHの範囲が 5— 5.6程度で処理する工程である請求項 7に記載の DNA の脱ァミノ化方法。

[12] 工程（1)力 60— 95°C程度の温度で、 5— 60分程度処理する工程である請求項 7に記載の DNAの脱ァミノ化方法。

[13] 以下の工程を有するメチル化 DNAの検出方法：

(b) (a)で得られた試料中のメチル化 DNAを検出する工程。

[14] 工程 (a)における DNAがシトシンを含んでなる DNAであり、工程 (b)が（a)で得られた試料中のメチルイ匕シトシンを検出する工程である請求項 13に記載のメチル化 DNAの検出方法。

[15] 工程 (b) 1S 塩基配列決定、 DNAチップまたは制限酵素の、ずれかを用いて試料中のメチルイ匕シトシンを検出する工程である、請求項 14に記載のメチルイ匕 DNAの検出方法。

[16] 工程 (b) iS DNAのシトシンがゥラシルに変換された場合に核酸増幅できる少なくとも 1つのプライマー、及びシトシンがゥラシルに変換されな、場合に核酸増幅できる少なくとも 1つのプライマーを用いて、試料中の DNAを増幅させ、増幅の有無により、 5- メチルシトシンとゥラシルの存在位置を同定する手段によりメチルイ匕シトシンを検出する工程である請求項 14記載のメチル化 DNAの検出方法。

[17] 請求項 1に記載の亜硫酸塩組成物を含んでなる DNAの脱アミノ化用キット。

[18] 請求項 1に記載の亜硫酸塩組成物を含んでなるメチル化 DNAの検出用キット。