JP2004000128A - 造血器腫瘍細胞検出方法および造血器腫瘍細胞検出キット - Google Patents
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Abstract
【課題】分子生物学的知見を利用して、造血器腫瘍細胞の高感度かつ高特異的に検出する造血器腫瘍細胞検出方法および検出キットを提供する。
【解決手段】造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を定量するとともに、上記検体試料から得られるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認する。これによって、一つの遺伝情報により造血器腫瘍細胞の有無を２段階で確認するため、非常に高い特異性で造血器腫瘍細胞を検出することができる。
【選択図】 なし
【解決手段】造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を定量するとともに、上記検体試料から得られるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認する。これによって、一つの遺伝情報により造血器腫瘍細胞の有無を２段階で確認するため、非常に高い特異性で造血器腫瘍細胞を検出することができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、造血器腫瘍細胞検出方法および該検出方法に好適に用いられる造血器腫瘍細胞検出キットに関するものであり、特に、例えば、悪性リンパ腫や白血病等に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子産物の発現減少あるいは消失またはこれをコードするＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することによって、造血器腫瘍細胞を高感度かつ高特異的に検出できる検出方法および検出キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）における悪性リンパ腫や白血病等の造血器腫瘍（血液系の腫瘍）には、難治性で極めて予後の悪いものから比較的予後のよいものまで様々な種類が知られている。この造血器腫瘍の治療には、各種化学療法や放射線療法、あるいは免疫療法といった種々の療法がすでに実用化されているが、このような治療の結果、ほぼ腫瘍細胞が退縮したとしても、わずかに腫瘍細胞が生存していれば造血器腫瘍の再発は免れない。
【０００３】
上記造血器腫瘍の診断は、従来では、複数の診断手法を併用することにより総合的に実施されている。具体的には、末梢血や各種生検材料を用いて、組織染色や免疫染色等による形態学的な観察や組織学的な観察が実施されたり、さらには、種々の分子生物学的解析や染色体解析等も実施されたりしている。また、上記造血器腫瘍の診断では、判定までにかなりの時間を要する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来の各診断手法は、それ単独では造血器腫瘍細胞を高感度、高特異的、かつ迅速に検出できるものではない。それゆえ、これら従来の診断手法では、複数を併用して総合的に判断しなければ造血器腫瘍を診断することができない。
【０００５】
つまり、従来の診断手法を使用する限り、複数の診断手法を併用しなければならないため、診断の煩雑化を招くだけでなく時間がかかり、造血器腫瘍細胞検出感度も特異性も高くないことから、医師の専門的な判断が診断に大きな比重を占めることになる。そのため、従来では、造血器腫瘍の診断技術は、実質的に医療現場での利用に限られており、各々の疾患者には対応できるが、集団検診による造血器腫瘍の早期発見・早期治療を目的としては利用されていない。
【０００６】
造血器腫瘍細胞をより高感度かつ高特異的に実施するには、造血器腫瘍細胞に特異的であり、かつ広い範囲の造血器腫瘍に見られる感度の高いマーカーを用いることが考えられる。このようなマーカーを用いれば、造血器腫瘍の早期発見・診断を容易かつ迅速に実施することができ、医療上、悪性リンパ腫や白血病等の早期治療や再発予防に応用することが可能となるだけでなく、臨床検査産業や医薬品産業等にも利用可能な診断技術とすることができ、産業の発展に寄与することが可能となる。しかしながら、このようなマーカーは現在までのところ知られていない。
【０００７】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、分子生物学的知見を利用して、迅速且つ簡便に造血器腫瘍細胞を高感度かつ高特異的に微量の患者検体から検出し造血器腫瘍の早期発見・診断および早期治療を容易にし、集団検診にも適用可能な造血器腫瘍細胞検出方法および検出キットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、広い範囲の悪性の造血器腫瘍では、プロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質の発現抑制が極めて高頻度で見られ、しかも悪性度の高い造血器腫瘍において、上記ＳＨＰ１蛋白質の発現抑制の傾向が強くなることを見出し、ＳＨＰ１遺伝子産物およびこれをコードするＳＨＰ１遺伝子の双方をマーカーとして用いることで、造血器腫瘍細胞の高感度、高特異的、かつ短時間に検出でき、かつ産業上利用できる造血器腫瘍細胞検出技術を実現し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法は、上記の課題を解決するために、（１）造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方の発現量を定量するＳＨＰ１遺伝子産物定量工程、（２）上記検体試料から得られる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認するＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程、および（３）上記検体試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失（ＬＯＨ）の有無を確認するＳＨＰ１遺伝子ＬＯＨ確認工程、の少なくとも一方を含むことを特徴としている。
【００１０】
上記ＳＨＰ１遺伝子産物の発現抑制は、悪性の造血器腫瘍細胞に極めて高頻度で見られるのに対し、正常な血液細胞にはこの現象が見られない。また、上記ＳＨＰ１蛋白質の発現抑制は、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化によるものである。さらに、ＤＮＡメチル化によるＳＨＰ１遺伝子の転写抑制の前後には、ＳＨＰ１遺伝子の一つの対立遺伝子が喪失している。
【００１１】
上記方法によれば、上記知見を利用して、検体試料から得られるＳＨＰ１遺伝子のメチル化を確認し、造血器腫瘍細胞の存在を検出することで、悪性の造血器腫瘍細胞の存在の有無をスクリーニングし、一方検体試料中のＳＨＰ１遺伝子産物、具体的にはＳＨＰ１蛋白質、またはＳＨＰ１ｍＲＮＡ、あるいはその両方の発現を定量する。
【００１２】
すなわち、上記方法では、ＳＨＰ１遺伝子の不活性化を、遺伝子ＤＮＡの修飾とｍＲＮＡと蛋白質と対立遺伝子の喪失という最大で四重のマーカーを用いて判定できることになる。すなわち、ＳＨＰ１遺伝子の発現低下という一つの造血器腫瘍細胞特異的な現象を４段階で確認することができるため、非常に高い特異性で造血器腫瘍細胞を検出することができる。
【００１３】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法の好ましい一例としては、上記ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程に、上記検体試料から得られた遺伝子試料を、シトシンを含む塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素で処理する遺伝子切断試行段階と、上記メチル化感受性制限酵素で処理された遺伝子に対して、上記ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識切断される塩基配列を含む領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲ法を実施する遺伝子増幅試行段階と、増幅された特定のサイズの遺伝子の量を確認する遺伝子増幅量確認段階とが含まれる検出方法を挙げることができる。
【００１４】
上記方法によれば、メチル化感受性制限酵素を用いて検体試料から得られた遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の切断を試みることでメチル化の有無を区別し、さらにＰＣＲを用いて増幅してから、得られる特定サイズのＰＣＲ産物の量を確認する。それゆえ、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても高い検出感度で、しかも高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００１５】
上記検出方法においては、上記プライマーが、さらに、配列番号１または２に示す塩基配列に含まれる部分塩基配列、またはこの部分塩基配列と相補性を有するポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００１６】
また、上記検出方法においては、上記遺伝子増幅量確認段階では、電気泳動法を用いて特定サイズの遺伝子の量を確認することが好ましい。
【００１７】
さらに、上記検出方法においては、上記遺伝子切断試行段階では、メチル化感受性制限酵素として、同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素が知られている制限酵素を用いることが好ましい。
【００１８】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法の好ましい他の一例としては、上記ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程に、上記検体試料から得られる遺伝子試料を、重亜硫酸塩で処理する遺伝子修飾段階と、重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のメチル化シトシンの有無を判定するメチル化シトシン含有判定段階とが含まれる検出方法を挙げることができる。
【００１９】
上記方法によれば、重亜硫酸塩を用いて検体試料から得られた遺伝子試料を処理すると、塩基配列中のシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンは変換されない。そのため、遺伝子修飾段階後のＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中にシトシンが含まれるか否かを判定するのみで、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、簡素なメカニズムで高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２０】
上記検出方法においては、上記メチル化シトシン含有判定段階では、ＰＣＲによりメチル化シトシンを検出する方法、遺伝子の塩基配列の決定によりメチル化シトシンを検出する方法、またはメチル化シトシンを含む塩基配列を識別する方法による遺伝子の処理のうち、少なくとも何れかが用いられても好ましい。
【００２１】
上記方法によれば、少なくともＰＣＲを用いることで、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても高い検出感度で高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２２】
上記検出方法においては、上記遺伝子修飾段階では、重亜硫酸塩として、重亜硫酸ナトリウムが用いられることが好ましい。また、上記遺伝子修飾段階では、重亜硫酸塩とともに尿素が併用されてもよい。
【００２３】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法においては、上記何れの例の検出方法であっても、上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、ＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体を用いてＳＨＰ１蛋白質を定量すると好ましい。具体的には、上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、酵素抗体法（免疫組織化学法、免疫細胞化学法、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法）またはウエスタンブロッティング法によりＳＨＰ１蛋白質が定量されると好ましい。
【００２４】
上記方法によれば、抗原抗体反応を利用してＳＨＰ１蛋白質を定量することになるので、簡素なメカニズムで高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２５】
あるいは、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法においては、上記何れの例の検出方法であっても、上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部を検出するポリヌクレオチドを用いてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出することにより、ＳＨＰ１ｍＲＮＡを定量しても好ましい。具体的には、上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、ノーザンブロッティング法、逆転写ＰＣＲ法、リアルタイム逆転写ＰＣＲ法、またはＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によりＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現が検出されると好ましい。
【００２６】
上記方法によれば、ＳＨＰ１遺伝子産物としてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡによりＳＨＰ１遺伝子産物を定量することになるので、ＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡと相同性を有するオリゴペプタイドをプローブやプライマーとして利用することで、簡素なメカニズムで高特異的かつ高感度に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２７】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法の好ましいさらに他の一例としては、異型接合性喪失の有無の確認は、上記ＳＨＰ１遺伝子を挟み込む２つのマイクロサテライト・マーカーの少なくとも一方、または、上記ＳＨＰ１遺伝子中か、その近辺に存在する単一塩基多型のような遺伝子多型を、ＰＣＲを用いたフラグメント解析することにより実施される方法を挙げることができる。このとき用いられる検体試料は、造血器細胞を含む検体試料であればよい。また、対照としては、血液学的完全寛解後に得られる検体を用いてもよいし、他の正常組織細胞を用いてもよい。
【００２８】
上記の方法によれば、マイクロサテライト・マーカーまたは単一塩基多型（ＳＮＰ）等の遺伝子多型の異型接合性喪失をＰＣＲにより確認することによって、ＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失を確認しているので、簡素なメカニズムでより確実に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２９】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出キットの好ましい一例としては、造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、（１）造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体、および、（２）シトシンを含む塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素と、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識切断される塩基配列を含む領域を増幅するＰＣＲ用のプライマーと、上記ＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性及びメチル化陰性対照ＤＮＡとのうち、少なくとも一方を含む構成を挙げることができる。
【００３０】
あるいは、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出キットの好ましい他の一例としては、造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、（１）上記ＳＨＰ１抗体、および（２）遺伝子処理レベルまで精製された重亜硫酸塩と、該重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無の判定用プライマー、および、（３）配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部と相同性を持つＰＣＲ用のプライマーのうち、少なくとも何れか一つを含む構成を挙げることができる。
【００３１】
さらには、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出キットの好ましいさらに他の一例としては、造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子を挟み込む２つのマイクロサテライト・マーカーの少なくとも一方の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーを含む構成を挙げることができる。
【００３２】
上記造血器腫瘍細胞検出キットにおいては、さらに、ＰＣＲ用試薬、および、制限酵素反応用試薬の少なくとも一方を含むことが好ましい。
【００３３】
上記何れの構成であっても、前述した造血器腫瘍細胞検出方法を実施するために好ましい薬剤や標本等が含まれている。そのため、上記検出キットを用いることで、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法を容易かつ迅速に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
〔実施の形態１〕
本発明における実施の一形態について図１ないし図２４に基づいて説明すれば以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３５】
本発明は、造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なプロモーターからのプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子産物すなわちＳＨＰ１蛋白質とｍＲＮＡとを定量するとともに、上記検体試料から得られる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認することで、上記検体試料中から造血器腫瘍細胞を検出する技術である。
【００３６】
本発明で、造血器腫瘍細胞を検出するためのマーカーとして用いられるＳＨＰ１遺伝子は、染色体１２ｐ１３に存在し、図１〜図１０および配列番号１に示す塩基配列をゲノムＤＮＡ（ワイルドタイプ）のセンス鎖とし、図１１〜図２０および配列番号２に示す塩基配列をアンチセンス鎖とする１６のエキソン（図および配列表中大文字で示す領域）を有する遺伝子である。そのｃＤＮＡは、図２１および配列番号３に示す塩基配列を有する約１．８ｋｂのサイズを有している。なお、ＳＨＰ１遺伝子はＳＨ−ＰＴＰ１，ＰＴＰ１Ｃ、ＨＣＰ、ＨＣＰＨ、ＰＴＰＮ６、ＨＰＴＰ１Ｃ、ＳＨＰ−１Ｌと同一の遺伝子である。
【００３７】
上記ＳＨＰ１遺伝子にコードされているＳＨＰ１蛋白質は、分子量６８ｋＤで、各種造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）であり、図２２に示すように、Ｎ末端側にタンデム構造となる２つのＳＨ２（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ ２）領域（２７０アミノ酸残基）と、２４６アミノ酸残基のＰＴＰａｓｅドメインと、９３アミノ酸残基のＣ末端側領域とを有する構造となっている。また、図２３および配列番号４に示すアミノ酸配列を有している。
【００３８】
ヒトの造血器腫瘍、例えば悪性リンパ腫や白血病では、多くの種類で９０％以上の高い頻度でＳＨＰ１蛋白質の強い発現抑制が見られる（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５９， Ｎｏ．４， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００１：１４９５−１５０５等参照）。このように悪性の造血器腫瘍細胞では、上記ＳＨＰ１蛋白質の発現抑制が極めて高頻度で見られるのに対し、正常な血液細胞にはこの現象が見られない。
【００３９】
本発明者らは、上記ＳＨＰ１蛋白質の発現抑制が、上記ＳＨＰ１遺伝子がメチル化されることによる転写異常を原因とすることを独自に見出した。
【００４０】
例えば、図２４に示すように、図１〜図１０および配列番号１に示すゲノムＤＮＡ（ワイルドタイプ）のセンス鎖（１８１塩基〜２１６０塩基まで例示）において、１００１塩基〜１１６３塩基のエキソン（図中大文字）の前にプロモーター領域が存在するが、この近傍にシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とが並ぶＣＧ配列が多く存在しＣｐＧ島（ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ）を形成している（図２４中ではＣＧ配列を太字の網掛けで示す）。正常な造血器細胞では、このＣｐＧ島のシトシンはメチル化されていないが、例えば悪性のリンパ腫細胞では、上記ＣＧ配列のシトシンの多くがメチル化されている。勿論、このＣＧ配列におけるシトシンのメチル化はセンス鎖のみならずアンチセンス鎖にも同じように生じる。
【００４１】
上記ＣｐＧ島におけるＣＧ配列の高度なメチル化は、ＳＨＰ１遺伝子のＤＮＡからｍＲＮＡの転写を阻害し、その結果、ＳＨＰ１蛋白質の生産が抑制される。この現象は、上述したように造血器腫瘍細胞では極めて高頻度に見られる。しかも、各種造血器腫瘍患者の完全寛解期には、ＳＨＰ１遺伝子におけるＤＮＡのメチル化が完全に消失し、分子生物学上の知見と臨床上の知見との間に非常に高い相関関係が見られる。それゆえ、メチル化によるＳＨＰ１遺伝子の発現抑制が、造血器腫瘍細胞の発症機構の中で重要な役割を果たしていることが推測される。そこで本発明では、上記ＳＨＰ１遺伝子の発現抑制という現象を、造血器腫瘍細胞のマーカーとして利用する。
【００４２】
さらに、本発明者らは、悪性リンパ腫や白血病等の疾患が発症する際に、上述した、ＤＮＡメチル化によってＳＨＰ１遺伝子の転写抑制が生じる前後に、ＳＨＰ１遺伝子の一つの対立遺伝子が喪失することも独自に見出した。そこで、ＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失を確認することによって、ＳＨＰ１遺伝子の対立遺伝子の喪失を確認することが可能となる。それゆえ、ＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失も造血器腫瘍細胞のマーカーとして利用することができる。
【００４３】
悪性リンパ腫や白血病において、ＳＨＰ１遺伝子には、高頻度のＤＮＡメチル化、高頻度の異型接合性喪失、ＳＨＰ１遺伝子の発現の低下または消失が検出され、さらには、外来ＳＨＰ１遺伝子導入が血球系の細胞の増殖を抑制する傾向にある。これにより、ＳＨＰ１遺伝子が癌抑制遺伝子の一つであることが強く示唆される。
【００４４】
そこで、本発明では、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程で、上記検体試料から得られるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認し、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程にて、造血器細胞を含む検体試料中に含まれるＳＨＰ１蛋白質およびｍＲＮＡの少なくとも一方を定量し、さらに、ＳＨＰ１遺伝子ＬＯＨ確認工程で、ＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失を確認するという三つの工程を利用する。これら工程は単独で用いられても良いし、双方ともに用いられても良い。さらに、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、ＳＨＰ１蛋白質のみ定量されても良いし、ＳＨＰ１ｍＲＮＡのみ検出されても良いし、双方ともに検出されてもよい。
【００４５】
これによって、例えば、まず、検体試料中のＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することでスクリーニングし、その後、検体試料のＳＨＰ１遺伝子産物の発現をＳＨＰ１ｍＲＮＡおよびＳＨＰ１蛋白質の少なくとも一方で定量することで、悪性の造血器腫瘍細胞の有無を確認することで造血器腫瘍細胞の存在を確定するという検出プロセスを実施することができる。
【００４６】
したがって、本発明では、ＳＨＰ１遺伝子の発現を、遺伝子ＤＮＡの修飾とｍＲＮＡと蛋白質と対立遺伝子の喪失という最大で四重のマーカーを用いて判定できることになる。すなわち、ＳＨＰ１遺伝子の発現低下という一つの造血器腫瘍細胞特異的な現象を３段階で確認することができるため、非常に高い特異性で造血器腫瘍細胞を検出することができる。
【００４７】
また、上述したように、本発明におけるＳＨＰ１遺伝子を導入することで、血球系の細胞の増殖を抑制する傾向にあることも確認されている。それゆえ、ＳＨＰ１遺伝子は、遺伝子治療に用いることも可能であり、例えば、腫瘍細胞にＳＨＰ１遺伝子の発現ベクターをトランスフェクトすることにより、腫瘍細胞の増殖を抑制することが期待できる。
【００４８】
本発明で用いられる検体試料は、末梢血あるいは骨髄液等の造血器細胞を含む検体試料であればどのような検体試料であっても特に限定されるものではない。本発明における造血器細胞とは、各種血液細胞を含むが、特に好ましくは各種白血球が挙げられる。より具体的には、リンパ球（Ｔ細胞・Ｂ細胞）、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球並びにマクロファージ、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞等を挙げることができる。あるいは造血幹細胞やリンパ球幹細胞であってもよい。
【００４９】
したがって、本発明で用いられる検体試料には、上記造血器細胞が含まれている血液や骨髄液あるいは体液等をヒトから採取し、これをそのまま検体試料として用いてもよいし、採取した血液や体液に対して従来公知の処理を施すことによって、分子生物学的な分析を実施し易い分析用検体試料としてもよい。
【００５０】
本発明が適用可能な造血器腫瘍としては、具体的には、例えば、慢性骨髄性白血病、フィラデルフィア染色体ポジティブ（＋（９；２２）（ｑｑ３４；ｑ１１），ＢＣＲ／ＡＢＬ）慢性骨髄性白血病、慢性好中球白血病、慢性好酸球白血病／高好酸球症候群、慢性突発性骨髄繊維症、真性多血症、本態性血小板増加症、その他分類できない骨髄増殖性疾患等の各種骨髄増殖性疾患；
慢性骨髄性単球白血病、非定型慢性骨髄性白血病、幼年性骨髄性単球白血病等の骨髄異型性／骨髄増殖性疾患；
環状鉄芽球を伴う難治性貧血、環状鉄芽球を伴わない難治性貧血、多系列異形成を伴う難治性血球減少症（骨髄異型性症候群）、過剰芽球５ｑ−症候群を伴う難治性貧血（骨髄異型性症候群）、その他分類できない骨髄異型性症候群等の骨髄異型性症候群；
再発性細胞遺伝学的転座を伴う急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（例えば、＋（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を伴うＡＭＬ、ＡＭＬ１（ＣＢＦ−α）／ＥＴＯ、急性前骨髄性白血病（＋（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１１−１２）を伴うＡＭＬおよびその変形、ＰＭＬ／ＲＡＲ−α））、異常な骨髄好酸球（ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）あるいは＋（１６；１６）（ｐ１３；ｑ１１）、ＣＢＦβ／ＭＹＨ１１Ｘ）を伴うＡＭＬ、１１ｑ２３（ＭＬＬ）異常を伴うＡＭＬ、前骨髄異型性症候群を伴いかつ多系列異形成を伴うＡＭＬ、前骨髄異型性症候群を伴いかつ多系列異形成を伴わないＡＭＬ、治療に関係するＡＭＬおよび骨髄異型性症候群（アルキル化剤に関係する治療、エピポドフィロトキシンに関係する治療、あるいはその他のタイプの治療）、他に部門に属さないＡＭＬ（低分化型、成熟を伴わないもの、成熟を伴うもの、急性骨髄性単球白血病、急性単球白血病、急性赤芽球白血病、急性巨核球白血病、急性好塩基球白血病、骨髄繊維症を伴う急性汎骨髄過剰増殖症）、急性二形質性白血病等の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；
前駆体Ｂ細胞性腫瘍（前駆体Ｂ−リンパ芽球性白血病／リンパ腫（前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病）、成熟（末梢）Ｂ細胞性腫瘍（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁領域Ｂ細胞リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、毛状細胞白血病、形質細胞性骨髄腫（形質細胞腫）、ＭＡＬＴ型節外辺縁型Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁型Ｂ細胞リンパ腫（＋／− 単球型Ｂ細胞）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（縦隔大細胞Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫）、Ｂｕｒｋｉｔｔ リンパ腫／Ｂｕｒｋｉｔｔ細胞白血病）等のＢ細胞性腫瘍；
前駆体Ｔ細胞性腫瘍（前駆体Ｔ−リンパ芽球性白血病／リンパ腫（前駆体Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病）、成熟（末梢）Ｔ細胞性腫瘍（Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞顆粒リンパ球白血病、侵攻型ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞リンパ腫・白血病（ＨＴＬＶ１＋）、鼻型節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾型γ−δＴ細胞リンパ腫、皮下蜂窩織炎様Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫／Ｓｅｚａｒｙ症候群、退形成性大型細胞リンパ腫（Ｔ／ヌル細胞、原発性皮膚未分化型）、他に部門に属さない末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球Ｔ細胞リンパ腫）等のＴ細胞およびＮＫ細胞性腫瘍；
節性リンパ球優勢ホジキンリンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫（結節硬化ホジキンリンパ腫（等級１および２）、リンパ球リッチ古典的ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球枯渇ホジキンリンパ腫）等のホジキンリンパ腫（ホジキン病）；
等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００５１】
本発明におけるＳＨＰ１遺伝子産物定量工程は、検体試料中のＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方を定量できる方法であれば特に限定されるものではないが、具体的には、ＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体を用いてＳＨＰ１蛋白質を定量する方法（蛋白質定量法）か、ＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出することにより、ＳＨＰ１ｍＲＮＡを定量する方法（ｍＲＮＡ定量法）を好適に用いることができる。
【００５２】
まず、上記蛋白質定量法のより具体的な手法としては、ＳＨＰ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法または酵素抗体法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（免疫組織化学法、免疫細胞化学法、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法）を挙げることができる。
【００５３】
上記蛋白質定量法で用いられるＳＨＰ１抗体は、図２２、図２３および配列番号４に示す構造を有するＳＨＰ１蛋白質の少なくとも一部の構造を抗原決定基として認識し、ＳＨＰ１蛋白質を免疫学的に確実に検出できる抗体であれば特に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。
【００５４】
上記ＳＨＰ１抗体は、従来公知の方法で製造してもよいし、市販のＳＨＰ１抗体を用いてもよい。ＳＨＰ１抗体の製造方法としては、例えば、モノクローナル抗体であれば、ＳＨＰ１蛋白質で免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスの骨髄細胞とを融合させてなるハイブリドーマにより産生する手法が挙げられる。また、上記ＳＨＰ１抗体がポリクローナル抗体であれば、ＳＨＰ１蛋白質で免疫したウサギの免疫血清から精製する手法が挙げられる。また、市販のＳＨＰ１抗体としては、＃ＳＨ−ＰＴＰ１（Ｄ−１１）：ｓｃ７２８９および＃ＳＨ−ＰＴＰ１（Ｃ−１９）：ｓｃ２８７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製）、＃ａｎｔｉ ＳＨＰＴＰ（０６１１７）および＃ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＳＨＰＴＰ（０５２８１） ）
（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製）等が挙げられる。
【００５５】
上記ＳＨＰ１抗体を用いた酵素抗体法（免疫組織化学法、免疫細胞化学法、ＥＬＩＳＡ法）は、従来公知の方法（例えば、『酵素抗体法』渡辺慶一・中根一穂編集、学際企画出版（昭和６１年）や、Ｂｒｏｗｎ Ｒ．Ｗ． ｅｔ ａｌ： Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌ． １９９；８（５）５１５−２０（１９９５）等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【００５６】
同様に、上記ＳＨＰ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法も、従来公知の方法（例えば、『実験操作ブロッティング法』日野嘉幸他編、ソフトサイエンス社（昭和６２年）や、Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６，４３５０，（１９７９） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【００５７】
上記蛋白質定量法を用いることで、抗原抗体反応を利用してＳＨＰ１蛋白質を定量することになる。そのため、簡素なメカニズムで高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００５８】
次に、上記ｍＲＮＡ定量法のより具体的な手法としては、配列番号３（図２１参照）に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部と相同性を有するポリヌクレオチドを用いてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する方法が挙げられ、より具体的には、ノーザンブロッティング法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを挙げることができる。
【００５９】
上記ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ、およびＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの何れの方法も従来公知の方法（例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ” ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ．（２００１）や、”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ” ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（２００１） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【００６０】
上記ノーザンブロッティング法やＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションでは、原理的には、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡの全長あるいはその一部をプローブとして用いることができる。また、ＲＴ−ＰＣＲやｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲでも、原理的には、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡの一部と相同性を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることができる。具体的には、例えば、後述する実施例３や実施例４に示すプライマーペアを用いることができる。
【００６１】
それゆえ、ｍＲＮＡ定量法では、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部と相同性を有するポリヌクレオチドを用いてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出すればよい。
【００６２】
上記ｍＲＮＡ定量法を用いることで、ＳＨＰ１遺伝子の転写産物であるＳＨＰ１ｍＲＮＡを定量することになるので、ＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡと相同性を有するポリヌクレオチドをプローブやプライマーとして利用することで、簡素なメカニズムで迅速、高特異的かつ高感度に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００６３】
本発明におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程は、検体試料から得られるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認できる方法であれば特に限定されるものではないが、本実施の形態では、例えば、遺伝子切断試行段階と、遺伝子増幅試行段階と、遺伝子増幅量確認段階とを含むメチル化感受性制限酵素を利用した方法（以下、説明の便宜上、制限酵素確認法と称する）を好適に用いることができる。
【００６４】
本実施の形態で用いられるメチル化感受性制限酵素とは、二本鎖ＤＮＡにおいて認識対象となる塩基配列にシトシンを含んでおり、かつ、この塩基配列中のシトシンがメチル化された場合には、該塩基配列の二本鎖ＤＮＡを切断できない制限酵素であれば特に限定されるものではない。
【００６５】
上記メチル化感受性制限酵素としては、具体的には、例えば、ＨｐａＩＩ、ＥａｇＩまたはＮａｅＩ等を挙げることができる。中でも、ＨｐａＩＩをより好ましく用いることができる。ＨｐａＩＩは、ＣＣＧＧの塩基配列を認識して二本鎖ＤＮＡ切断するエンドヌクレアーゼであるが、同じ塩基配列を認識して二本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素として、ＭｓｐＩが知られている。
【００６６】
上述したように、ＨｐａＩＩはメチル化されたＣＣＧＧの塩基配列の二本鎖ＤＮＡを切断できないが、ＭｓｐＩはメチル化の有無に関わらずＣＣＧＧの塩基配列を認識して二本鎖ＤＮＡを切断することが可能である。すなわち、ＭｓｐＩはメチル化非感受性制限酵素である。それゆえ、ＨｓｐＩＩとＭｓｐＩとを併用することで、後述するように、検体試料中のＳＨＰ１遺伝子の切断を確実に確認するためのコントロールとして利用することが可能になり、本実施の形態における制限酵素確認法の信頼性をより一層向上させることができる。
【００６７】
このように、本実施の形態における制限酵素確認法では、使用するメチル化感受性制限酵素と同じ塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素をコントロールとして使用することが好ましい。勿論、メチル化感受性およびメチル化非感受性制限酵素の組み合わせは上記ＨｓｐＩＩ・ＭｓｐＩに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００６８】
次に、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程、すなわち制限酵素確認法によるＳＨＰ１遺伝子のメチル化の確認について具体的に説明する。
【００６９】
まず、遺伝子切断試行段階として、造血器細胞を含む前記検体試料から得られた遺伝子試料を、シトシンを含む塩基配列を認識する上記メチル化感受性制限酵素で処理する。この段階では、メチル化感受性制限酵素の処理により遺伝子試料中に含まれるＳＨＰ１遺伝子の切断を試みる。すなわち、前記検体試料中に含まれる造血器細胞が正常な細胞のみであれば、ＳＨＰ１遺伝子は切断されるが、造血器腫瘍細胞が含まれていれば、ＳＨＰ１遺伝子はＣＧ配列がメチル化されているため切断されない。
【００７０】
前記検体試料から遺伝子試料を調製する方法は従来公知の方法を用いることができ特に限定されるものではない。また、調製された遺伝子試料は、ＳＨＰ１遺伝子を含んでいればよく、制限酵素処理やＰＣＲ等を阻害しない限り他の成分が含まれていても良い。それゆえ、前記検体試料中に含まれる造血器細胞やその他の細胞から抽出される各種ＤＮＡやＲＮＡの混合物であればよい。また、メチル化感受性制限酵素による処理についても特に限定されるものではなく、該メチル化感受性制限酵素の種類や調製された遺伝子試料の状態等に応じて、適宜条件等を設定すればよい。
【００７１】
次に、遺伝子増幅試行段階として、上記メチル化感受性制限酵素で処理された遺伝子試料に対して、上記ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識切断される塩基配列を含む領域を増幅するプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。この段階では、メチル化感受性制限酵素で処理した制限酵素処理物を、上記プライマーを用いてＰＣＲ処理することにより、ＳＨＰ１遺伝子のみの増幅を試みる。正常なＳＨＰ１遺伝子のみであれば、プライマーペアに挟まれる領域が切断されているためＳＨＰ１遺伝子は増幅できないが、メチル化されているＳＨＰ１遺伝子が含まれていれば、上記プライマーペアに挟まれる領域は切断されていないためＳＨＰ１遺伝子が増幅される。
【００７２】
上記遺伝子増幅試行段階で用いられる上記プライマーとしては、メチル化感受性制限酵素に認識される塩基配列を含む領域を増幅するポリヌクレオチドであればよい。それゆえプライマーの設計条件等についても特に限定されるものではない。基本的には、本実施の形態で用いられるプライマーペアは、メチル化感受性制限酵素に認識される上記塩基配列を含む領域の少なくとも外側に位置し、配列番号１または２（図１〜図１０および図１１〜図２０参照）に示すＳＨＰ１遺伝子の塩基配列に含まれる部分塩基配列、またはこの部分塩基配列と相補性を有するポリヌクレオチドであればよく、その場所やサイズ等については特に限定されるものではない。
【００７３】
次に、遺伝子増幅量確認段階として、増幅された遺伝子の量を確認する。この段階では、ＳＨＰ１遺伝子が増幅されたか否かを確認する。ＳＨＰ１遺伝子が増幅されれば、元の検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれていることになる。
【００７４】
上記遺伝子増幅量確認段階で用いられるＳＨＰ１遺伝子の有無の確認方法としては特に限定されるものではないが、電気泳動法を用いてマーカーと比較することにより遺伝子の増幅量を確認する手法が最も一般的で確立された手法であるため好ましく用いることができる。また、電気泳動後に得られたＤＮＡバンドをメンブレンにブロッティングして検出してもよい。
【００７５】
上記遺伝子増幅量確認段階で用いられるＳＨＰ１遺伝子の有無の確認方法としては特に限定されるものではないが、検体試料と同時にメチル化陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡを用いて反応を行った後電気泳動法を用いて遺伝子の増幅量を確認する手法が最も一般的で確立された手法であるため好ましく用いることができる。また、電気泳動後に得られたＤＮＡバンドをメンブレンにブロッティングして検出してもよい。
【００７６】
上記ＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡは、ＳＨＰ１遺伝子を用いたものであればよく、特に限定されるものではない。具体的には、メチル化感受性制限酵素またはメチル化非感受性制限酵素により処理することで得られる、増幅量を比較できる程度の濃度を有するＤＮＡ溶液を挙げることができる。
【００７７】
さらに、制限酵素確認法によるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程では、コントロールとして、メチル化感受性制限酵素による処理と並行して、同一の検体試料をメチル化非感受性制限酵素で処理して、それを遺伝子増幅量確認段階で確認すると好ましい。すなわち、上記遺伝子切断試行段階では、メチル化感受性制限酵素として、同一の塩基配列を認識するメチル化非感受制限酵素が知られている制限酵素を用いることが非常に好ましい。これによって、制限酵素確認法によるＳＨＰ１遺伝子のメチル化の確実性を高めることができる。
【００７８】
本発明におけるＳＨＰ１サテライトＬＯＨ確認工程は、造血器細胞を含む検体試料において、この検体試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失（Ｌｏｓｓｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，ＬＯＨと略す）の有無を確認することができる方法であれば特に限定されるものではないが、具体的には、ＳＨＰ１遺伝子を挟み込むマイクロサテライト・マーカー、または、上記ＳＨＰ遺伝子中か、その近辺に存在する単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）のような遺伝子多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）について、ＰＣＲを用いたフラグメント解析によってＬＯＨを確認する方法を好適に用いることができる。
【００７９】
上記ＳＨＰ１遺伝子の両側に存在するマイクロサテライト・マーカーや、ＳＨＰ１遺伝子中またはその近辺に存在する遺伝子多型については、特に限定されるものではなく、どのようなマーカーを用いてもよいが、具体的には、例えば、Ｄ１２Ｓ３３６マーカーおよびＤ１２Ｓ３５６マーカーを挙げることができる。これらマーカーの塩基配列は、インターネット・ゲノム・データベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ．／）から得られる。これらマーカーのうち、Ｄ１２Ｓ３５６マーカーはテロメア側に存在し、ＳＨＰ１遺伝子から約４．４ｃＭの距離にある。一方、Ｄ１２Ｓ３５６マーカーはセントロメア側に存在し、ＳＨＰ１遺伝子から約２．４ｃＭの距離にある。
【００８０】
検体試料におけるＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨ（異型接合性喪失）の確認に際しては、ＳＨＰ１サテライトＬＯＨ確認工程で用いられる検体試料は、造血器細胞を含む検体試料となっていればよい。また、ＬＯＨの具体的な方法は特に限定されるものではないが、後述する実施例６に示すように、ＰＣＲ反応によって上記各マーカーの少なくとも一方の全長またはその一部を検出するマイクロサテライト解析を行えばよい。このときのＰＣＲ反応他の条件も特に限定されるものではなく、ＰＣＲ用のプライマーとしては、例えば、Ｄ１２Ｓ３３６マーカーまたはＤ１２Ｓ３５６マーカーの少なくとも一部を検出できるようなプライマーであればよく、その他の条件についても適切な条件を適宜設定すればよい。
【００８１】
本発明におけるＳＨＰ１サテライトＬＯＨ確認工程で用いられる検体試料は、造血器細胞を含む検体試料であれば特に限定されるものではない。また、対照として用いる検体試料も特に限定されるものではなく、血液学的完全寛解後に得られる検体を用いてもよいし、他の正常組織細胞を用いてもよい。
【００８２】
このように、マイクロサテライト・マーカーやＳＮＰ等の遺伝子多型を利用してＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨを確認することで、簡素なメカニズムでより確実に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００８３】
なお、本実施の形態では、ＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨを、マイクロサテライト・マーカーや遺伝子多型を利用して確認した例を挙げているが、本発明はこれに限定されるものではなく、ＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨが確認できる方法であればどのような方法でもよいことは言うまでもない。
【００８４】
次に、本実施の形態にかかる検出方法の好ましい一例について、より具体的に説明する。
【００８５】
まず、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程により、前述した手法を用いて検体試料中に含まれるＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方を定量する。このプロセスで定量されたＳＨＰ１蛋白質が、標準よりも大幅に減少していたり、ほとんどＳＨＰ１遺伝子産物が発現していなかったりした場合には、検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれている可能性が高くなる。
【００８６】
次に、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程で、前記制限酵素確認法により、検体試料から調製した遺伝子試料中のＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認する。以下の説明では、メチル化感受性制限酵素として前記ＨｐａＩＩを用いた例を挙げる。ＨｐａＩＩは、前述したようにＣＣＧＧの塩基配列を認識するが、同じ塩基配列を、メチル化非感受性制限酵素ＭｓｐＩも認識するため、好ましく用いられる。
【００８７】
そこで、遺伝子切断試行段階では、上記検体試料から得られた遺伝子試料を、ＨｐａＩＩで処理する。同時に、同一の遺伝子試料をＭｓｐＩで処理すると好ましい。これによって、ＣＣＧＧ塩基配列が切断されるというポジティブコントロールを得ることができる。
【００８８】
次に、遺伝子増幅試行段階に移行するが、このステップでは、先に、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列（配列番号１および２、図１〜図１０および図１１〜図２０参照）から、ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩの認識部位（ＣＣＧＧ）を挟んでＰＣＲ用のプライマーを設定する。具体的には、例えば、後述する実施例１や実施例２に示すプライマーペアを用いる。
【００８９】
上記のようなプライマーを用いて、ＨｐａＩＩで処理された遺伝子試料に対してＰＣＲを実施し、遺伝子増幅量確認段階で、例えば電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅量を確認する。遺伝子試料中に、メチル化されたＳＨＰ１遺伝子があれば、ＨｐａＩＩは切断できないので、ＰＣＲにより目的のサイズのＰＣＲ産物が検出できる。一方、メチル化されたＳＨＰ１遺伝子が無ければ、ＨｐａＩＩによりＤＮＡが切断されＰＣＲ産物は検出できない。
【００９０】
このように、上記制限酵素確認法を用いれば、メチル化感受性制限酵素を用いて検体試料から得られた遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の切断を試み、さらにＰＣＲを用いて増幅してから、得られるＰＣＲ産物の増幅量を確認することができる。それゆえ、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することが可能である。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても迅速に高い検出感度で、しかも高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００９１】
なお、本実施の形態で説明した上記検出方法には、他の工程（プロセス）や他の段階（ステップ）が含まれていてもよいことは言うまでも無い。例えば、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程において、制限酵素反応やＰＣＲ反応を円滑に進めるために、得られた遺伝子試料等を精製する精製段階が含まれていてもよい。
【００９２】
本発明には、上述した造血器腫瘍細胞検出方法だけでなく、該検出方法を実施するための検出キットが含まれる。具体的には、前記ＳＨＰ１抗体、前記メチル化感受性制限酵素、前記各プライマー、前記ＳＨＰ１遺伝子陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡ等を含む構成を挙げることができる。特に、（１）上記ＳＨＰ１抗体、および（２）メチル化感受性制限酵素と、ＰＣＲ用プライマーと、前記ＳＨＰ１遺伝子陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡとの組み合わせに分けた場合には、（１）および（２）の少なくとも一方が含まれていると好ましい。また、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程とＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程の順番はどちらが先であっても良い。
【００９３】
さらに、上記検出キットには、必要に応じて、他の各種試薬類が含まれていてもよい。例えば、ヌクレオチドモノマー、ポリメラーゼ、バッファー等のＰＣＲ反応用試薬、および、バッファー等の制限酵素反応用試薬の少なくとも一方が含まれていてもよい。
【００９４】
より具体的に、各工程または段階ごとに用いられる試薬等について説明する。まず、遺伝子産物定量工程では、蛋白質定量法の場合、酵素抗体法およびウエスタンブロッティング法の何れであっても、ＳＨＰ１抗体およびその検出試薬が少なくとも用いられる。また、ｍＲＮＡ定量法の場合、ＲＴ−ＰＣＲ法やｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合、ＳＨＰ１ｃＤＮＡ検出用プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応試薬が少なくとも用いられる。
【００９５】
次に、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程では、メチル化感受性制限酵素によりメチル化を確認するため、まず、遺伝子切断試行段階にて、メチル化感受性制限酵素、メチル化非感受性制限酵素、およびこれらの反応試薬が少なくとも用いられる。次に、遺伝子増幅試行段階では、プライマー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応試薬、システム検討用ＳＨＰ１遺伝子メチル化陽性ＤＮＡが少なくとも用いられる。次に、遺伝子増幅量確認段階では、ＳＨＰ１遺伝子メチル化陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡを用いた反応産物を電気泳動のコントロールとして少なくとも使用することができる。
【００９６】
このように、本発明にかかる検出キットでは、前述した造血器腫瘍細胞検出方法を実施するために好ましい薬剤や標本等が含まれている。そのため、上記検出キットを用いることで、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法を容易かつ簡素に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【００９７】
〔実施の形態２〕
本発明における実施の他の形態について図２５ないし図４７に基づいて説明すれば以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。また、説明の便宜上、実施の形態１と重複する説明は適宜省略する。
【００９８】
前記実施の形態１では、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程に、メチル化感受性制限酵素を用いる制限酵素確認法を用いたが、本発明は、これに限定されるものではなく、本実施の形態では、例えば、遺伝子修飾段階とメチル化シトシン含有判定段階とを含む、重亜硫酸塩を用いてＤＮＡを修飾する方法（以下、説明の便宜上、ＤＮＡ修飾法と称する）を好適に用いることができる。
【００９９】
ＤＮＡを重亜硫酸塩（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で処理すると、シトシンはウラシルに変換される。具体的には、図２５に示すように、シトシンが重亜硫酸塩によりスルホン化（Ｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎ）され、さらに加水分解により脱アミノ化（Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）され、さらに、アルカリ存在下での脱スルホン化（Ａｌｋａｌｉ ｄｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎ）により、ウラシルに変換される。このウラシルはＰＣＲ後、チミンに置き変わる。これに対して、メチル化されたシトシン（５’−メチルシトシン）は重亜硫酸塩によって変換されない。そこで、本実施の形態では、この重亜硫酸塩処理後の塩基配列の違いを利用して、後述するように、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化の有無を検出する。
【０１００】
次に、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程、すなわちＤＮＡ修飾法によるＳＨＰ１遺伝子のメチル化の確認について具体的に説明する。
【０１０１】
まず、遺伝子修飾段階として、造血器細胞を含む前記検体試料から得られた遺伝子試料を重亜硫酸塩で処理する。この段階では、上述したように、メチル化されていないシトシンのみがウラシルに変換されるので、例えば、それゆえ、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理すると、図２６に示すように、メチル化された（図中円で囲んだＭで示す）シトシンはシトシンのままで残存するが、メチル化されていないシトシンはウラシル（Ｕ）に変換される。
【０１０２】
上記遺伝子修飾段階で用いられる重亜硫酸塩としては、特に限定されるものではないが、例えば、重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５、メタ重亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムまたはピロ亜硫酸ナトリウムともいう）を好適に用いることができる。さらに、重亜硫酸化合物とともに尿素が併用されてもよい。
【０１０３】
次に、メチル化シトシン含有判定段階として、重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無を判定する。重亜硫酸塩処理物中のＳＨＰ１遺伝子にシトシンが含まれているということは、処理前のＳＨＰ１遺伝子には、メチル化されたシトシンが含まれていることになる。それゆえ、シトシンが存在すれば、元の検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれていることになる。
【０１０４】
上記メチル化シトシン含有判定段階で実施される、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無を判定する方法としては特に限定されるものではないが、具体的には、１）メチル化シトシンをＰＣＲにより検出する方法、２）メチル化シトシンを遺伝子の塩基配列の決定により検出する方法、または、３）メチル化シトシンを含む塩基配列を識別する方法のうち、少なくとも何れかの手法を好ましく用いることができる。
【０１０５】
より具体的には、まず、１）メチル化シトシンをＰＣＲにより検出する方法としては、メチル化特異的ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）を挙げることができる。
【０１０６】
上記メチル化特異的ＰＣＲ法は、メチル化されたＤＮＡに特異的でかつＣＧ配列を含む塩基配列をプライマーとして設定する。メチル化されたシトシンが存在していればＰＣＲにより増幅が可能となり、それゆえメチル化されたＳＨＰ１遺伝子を検出することができる。
【０１０７】
上記メチル化特異的ＰＣＲ法は、従来公知の方法（例えば、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ９８２１−９８２６， （１９９６） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。なお、ＤＮＡの精製過程ではエタノール沈澱法やＧｌａｓｓｂｅａｄｓ法を用いた方法等を用いることができ、また、蛍光ラベルしたプライマーを用いれば、ＰＣＲの検出を容易にすることができる。
【０１０８】
次に、２）遺伝子の塩基配列の決定によりメチル化シトシンを検出する方法、すなわちＳＨＰ１遺伝子のシークエンシングでは、ＣＧ配列を含まない領域にプライマーを設定しＰＣＲを実施する。得られるＰＣＲ産物の中には、メチル化をされているもの（ＣＧ配列のままで存在）とメチル化されていないもの（ＴＧ配列に変換されている）が含まれている可能性がある。これをシークエンシングすることにより、ＣＧ配列すなわちメチル化の存在を検討する。
【０１０９】
上記ＳＨＰ１遺伝子のシークエンシングも、従来公知の方法（例えば、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， １８２７−１８３１ （１９９２） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。なお、上記プライマーとしては、メチル化されたＤＮＡに特異的な配列（ＣＧ配列を含む）を有するプライマーを用いることも可能である。
【０１１０】
この方法もＰＣＲを用いているので、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することが可能である。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても高い検出感度で高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。また、シークエンシングを利用することにより具体的な配列を決定するので、メチル化の程度をより明確化することも可能となる。
【０１１１】
次に、３）シトシンを含む塩基配列を識別する方法としては、Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ法、重亜硫酸塩ＳＳＣＰ法、メチルライト法、蛍光溶解曲線分析法、ＣＯＢＲＡ法等を挙げることができる。
【０１１２】
上記Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法は、メチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施する方法である。ただし、プライマーに挟まれた領域でのメチル化の有無が判らないので、検出したいＣＧ配列に隣接するポリヌクレオチドを作成しＰＣＲ産物とアニールさせる。放射性同位元素の存在下でＤＮＡを合成した時に、３２Ｐ−ｄＣＴＰを取り込めば、そこはＣＧ配列であるためメチル化されているシトシンが存在することになる。一方、ＤＮＡを合成した時に、３２Ｐ−ｄＴＴＰを取り込めば、そこはＴＧ配列であるためメチル化はされていなかったことになる。
【０１１３】
上記Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ法は、従来公知の方法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２５， ２５２９−２５３１， （１９９７） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【０１１４】
上記重亜硫酸塩ＳＳＣＰ（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＳＳＣＰ）法も、メチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施する方法であるが、プライマーに挟まれた領域でのメチル化の有無が判らない。そこで、ＰＣＲ産物を１本鎖ＤＮＡに変性後、ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ）法を用いて電気泳動し、１本鎖ＤＮＡの移動度の違いから、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化の程度を判定する。
【０１１５】
上記重亜硫酸塩ＳＳＣＰ法も、従来公知の方法（例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１， ９０４−９０８， （２０００） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【０１１６】
他に、メチルライト（Ｍｅｔｈｙｌ−ｌｉｇｈｔ）法や、蛍光溶解曲線分析（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭｅｌｔｉｎｇ Ｃｕｒｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）法等も挙げられる。これら方法も、何れもメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施する方法であるが、プライマーに挟まれた領域でのメチル化の有無が判らない。そこで、内側の調べたい領域について、メチル化特異的なポリヌクレオチドを作成し、このメチル化特異的ポリヌクレオチドが１本鎖にしたＰＣＲ産物とどの程度アニール（２本鎖重合）反応するかを検討することにより、上記ＰＣＲ産物中のメチル化の量を判定する。
【０１１７】
上記メチルライト法は、具体的には、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（８）， Ｅ３２， （２０００） 等の文献に開示されている方法を、上記蛍光溶解曲線分析は、具体的には、例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７， １１８３−１１８９， （２００１） 等の文献に開示されている方法を好適に用いることができる。
【０１１８】
上述した各方法は、ＰＣＲを用いているので、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することが可能である。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても高い検出感度で高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【０１１９】
上記ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ、あるいは、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ＰＣＲ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ等とも称される）では、例えば、ＣＧＣＧ配列がメチル化を受けていると、重亜硫酸処理後もＣＧＣＧ配列のままで残存するが、メチル化されていないとＴＧＴＧ配列に変換される。そこで、上記ＣＧＣＧ配列のみを切断する制限酵素等を利用することで、電気泳動ゲル上のバンドパターンを解析して、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化の有無を判定および定量化することができる。
【０１２０】
上記ＣＯＢＲＡ法も、従来公知の方法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，２５３２−２５３４， （１９９７） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。勿論、この方法でもＰＣＲが用いられるので、上述したＰＣＲによる利点が得られるだけでなく、制限酵素処理と電気泳動とを用いるので、バンドパターンの解析さえ明確化しておれば、容易にＳＨＰ１遺伝子のメチル化を確認することができるという利点もある。
【０１２１】
このように、本実施の形態におけるＤＮＡ修飾法では、メチル化シトシン含有判定段階でＰＣＲを用いているが、このＰＣＲで用いるプライマーの設計方法について以下に説明する。
【０１２２】
上述したように、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理するとシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンは変換されずに保存される。ここで、細胞内でメチル化を受ける可能性のあるシトシンは、５’配列側からＣＧと並ぶＣＧ配列（５’−ＣＧ−３’）のシトシン（Ｃ）のみである。そのため、重亜硫酸塩処理により、上記ＣＧ配列以外のシトシンは全てチミン（Ｔ）に変換されてしまう。そこで、全てのＣＧ配列がメチル化を受けたものとしてＳＨＰ１遺伝子の塩基配列を変換し、プライマーを設定する。なお、ＤＮＡ中のウラシルはチミンとして認識され、ＰＣＲによりチミンに置換されることになる。
【０１２３】
まず、プライマーを計画するＤＮＡ鎖に関する条件を設定する。ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列において、センス鎖またはアンチセンス鎖の何れも、上記ＣＧ配列のみがメチル化を受けたとして、その他の塩基配列におけるシトシンが全てチミンに変換された配列を想定する。
【０１２４】
具体的には、図２７〜図３６および配列番号５に示す塩基配列が、図１〜図１０および配列番号１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ（ワイルドタイプ）のセンス鎖に対応する、重亜硫酸塩処理後の塩基配列（以下、説明の便宜上、センス鎖変換配列とする）であり、図３７〜図４６および配列番号６に示す塩基配列が、図１１〜図２０および配列番号２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ（ワイルドタイプ）のアンチセンス鎖とするに対応する、重亜硫酸塩処理後の塩基配列（以下、説明の便宜上、アンチセンス鎖変換配列とする）である。これらセンス鎖変換配列とアンチセンス鎖変換配列とは、重亜硫酸塩処理により相補的ではなくなる。
【０１２５】
なお、図２７〜図３６および配列番号５、並びに、図３７〜図４６および配列番号６の塩基配列は、ＣＧ配列が１００％メチル化されていると想定した場合に、重亜硫酸塩処理を受けたものとしての塩基配列であり、実際には細胞中で１００％のメチル化が生じるとは考えられないため、本発明において検出し得る可能性としての塩基配列として例示する。
【０１２６】
そして、（Ｉ）上記センス鎖変換配列に対して、フォワードプライマー（ＦＷプライマー）およびリバースプライマー（ＲＶプライマー）を作成するか、あるいは、（ＩＩ）上記アンチセンス鎖変換配列に対して、ＦＷプライマーおよびＲＶプライマーを作成する。この場合、同じ場所でもプライマー配列はそれぞれ異なる。
【０１２７】
次に、プライマーを計画する領域に関する条件を設定する。（ｉ）メチル化されたＤＮＡのみを直接ＰＣＲで増幅するために、ＣＧ配列を含む塩基配列に対してプライマーを作成するか、（ｉｉ）メチル化されたもの、されていないものを区別なくＰＣＲで増幅するために、ＣＧ領域を含まない配列に対してプライマーを作成する。なお、（ｉｉ）の場合は、後でシークエンシングかその他の方法を実施し、メチル化を判定する。
【０１２８】
したがって、ＤＮＡ修飾法で用いられるプライマーの設計には、上記ＤＮＡ鎖に関する条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）と、領域に関する条件（ｉ）および条件（ｉｉ）とを掛け合わせた４通りの設計方法がある。
【０１２９】
ここで、（ｉ）の場合、プライマーの場所が都合良くメチル化を受けていれば検出されるが、その場所ではなく近隣領域のみメチル化を受けているような場合には、メチル化が存在するのにも関わらず検出不可能となる。そこで、（ｉｉ）のように、メチル化の有無に関わらずＰＣＲで増幅後、各プライマーに囲まれた領域内のメチル化、すなわちＣＧ配列の有無を検定することで、確実にＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子のメチル化の判定には、検出用のプライマーの場所のみならず、遺伝子配列の情報そのものが重要となる。
【０１３０】
また、ＣＧ配列がメチル化されていないと、重亜硫酸塩処理によりＴＧ配列に変換されるが、このＴＧ配列を含む塩基配列に対して作成されるプライマー（Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）は、メチル化を受けていないＤＮＡの存在を証明するコントロールとして用いることができる。また、重亜硫酸塩処理が不十分な場合には、シトシンがウラシルに変換されていないワイルドタイプのＳＨＰ１遺伝子が混入することになる。そこで、重亜硫酸塩処理が十分完全になされたか否かのコントロールとして、ワイルドタイプの塩基配列を有するプライマー（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｐｒｉｍｅｒ）を用いることができる。
【０１３１】
なお、上述したメチル化シトシン含有判定段階では、ＰＣＲにより増幅された遺伝子の確認に、前記実施の形態１における遺伝子増幅量確認段階と同様の方法、例えば、電気泳動法を用いてマーカーと比較することにより遺伝子の増幅量を確認したり、さらに電気泳動後に得られたＤＮＡバンドをメンブレンにブロッティングしたりする手法が挙げられる。勿論、これら手法に限定されるものではなく、また、上記電気泳動法やブロッティングの方法についても従来公知の手法を好適に用いることができ、特に限定されるものではない。
【０１３２】
換言すれば、本実施の形態におけるＤＮＡ修飾法によるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程でも、前記実施の形態１における制限酵素確認法による場合と同様、遺伝子増幅量確認段階が含まれていても良い。
【０１３３】
次に、本実施の形態にかかる検出方法の好ましい一例について、より具体的に説明する。
【０１３４】
まず、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程により、前述した手法を用いて検体試料中に含まれるＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方を定量する。このプロセスで定量されたＳＨＰ１蛋白質が、標準よりも大幅に減少していたり、ほとんどＳＨＰ１遺伝子産物が発現していなかったりした場合には、検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれている可能性が高くなる。
【０１３５】
次に、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程で、前記ＤＮＡ修飾法により、検体試料から調製した遺伝子試料中のＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認する。具体的には、遺伝子修飾段階にて、例えば重亜硫酸ナトリウムを用いて、上記検体試料から得られた遺伝子試料をで処理する。
【０１３６】
次に、遺伝子増幅試行段階に移行するが、このステップでは、前述したプライマーの設計方法に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーを設定する。
【０１３７】
具体的には、メチル化特異的ＰＣＲでは、図４７（ａ）に示すように、例えば、２３塩基対のワイルドタイプＤＮＡ（図中上がセンス鎖で下がアンチセンス鎖）を想定し、ワイルドタイプＤＮＡのＣＧ配列に１００％メチル化があるとする。この場合、重亜硫酸塩処理すると、図４７（ｂ）に示すように、センス鎖とアンチセンス鎖は相補的ではなくなる。そこで、図４７（ｃ）または（ｄ）に示すように、センス鎖またはアンチセンス鎖に対してＦＷプライマーおよびＲＶプライマーを作成する。
【０１３８】
なお、上記メチル化特定ＰＣＲにおいては、ＰＣＲ用プライマーとして、具体的には、例えば、後述する実施例４や実施例５に示すプライマーペアを用いる。上記のようなプライマーを用いて、重亜硫酸ナトリウムで処理された遺伝子試料に対してメチル化特異的ＰＣＲを実施し、例えば電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅量を確認する。
【０１３９】
このように、上記ＤＮＡ修飾法を用いれば、重亜硫酸塩を用いて検体試料から得られた遺伝子試料を処理すると、塩基配列中のシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンは変換されない。そのため、遺伝子修飾段階後のＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中にシトシンが含まれるか否かを判定するのみで、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、単純なメカニズムで迅速かつ高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【０１４０】
次に、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程により、前述した手法を用いて検体試料中に含まれるＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方を定量する。このプロセスで定量されたＳＨＰ１遺伝子産物が、標準よりも大幅に減少していたり、ほとんど発現していなかったりした場合には、検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれている可能性が高くなる。
【０１４１】
なお、本実施の形態で説明した上記検出方法には、前記実施の形態１の検出方法と同様に、他の工程（プロセス）や他の段階（ステップ）が含まれていてもよいことは言うまでも無い。
【０１４２】
本発明には、上述した造血器腫瘍細胞検出方法だけでなく、該検出方法を実施するための検出キットが含まれる。具体的には、遺伝子処理レベルまで精製された重亜硫酸塩と前記プライマー、および前記ＳＨＰ１抗体を含む構成を挙げることができる。つまり、本発明にかかる検出キットでは、上記重亜硫酸塩、プライマー、およびＳＨＰ１抗体を、（１）上記ＳＨＰ１抗体、（２）重亜硫酸塩と、該重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無の判定用プライマー、および（３）配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーに分けた場合、（１）、（２）および（３）のうち、少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。
【０１４３】
さらに、上記検出キットには、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部と相同性を持つノーザンブロッティング用プローブ、または、シトシンを含む塩基配列を認識する制限酵素およびＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性及びメチル化陰性対照ＤＮＡを用いた電気泳動用マーカーが含まれていてもよく、さらには、ヌクレオチドモノマー、ポリメラーゼ、バッファー等のＰＣＲ反応用試薬、および、バッファー等の制限酵素反応用試薬の少なくとも一方が含まれていてもよい。
【０１４４】
より具体的に、各工程または段階ごとに用いられる試薬等について説明する。まず、遺伝子産物定量工程では、前記実施の形態１で例に挙げたものと同様であるのでその説明は省略する。
【０１４５】
次に、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程では、重亜硫酸塩処理によりメチル化を確認するため、まず、遺伝子修飾段階にて、各種重亜硫酸塩等の試薬が少なくとも用いられる。次に、メチル化シトシン含有判定段階では、メチル化シトシンをＰＣＲにより検出する方法を用いる場合には、メチル化配列特異的プライマー、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応試薬が少なくとも用いられる。また、遺伝子の塩基配列の決定によりメチル化シトシンを検出する方法、あるいはシトシンを含む塩基配列を認識する方法では、各具体的な方法に応じて公知の試薬類を用いる。
【０１４６】
このように、本実施の形態にかかる検出キットでも、前記実施の形態１の検出キットと同様、前述した造血器腫瘍細胞検出方法を実施するために好ましい薬剤や標本等が含まれている。そのため、上記検出キットを用いることで、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法を容易かつ簡素に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【０１４７】
なお、本発明は、上述した各実施の形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても、本発明の技術的範囲に含まれることはいうまでもない。
【０１４８】
【実施例】
以下、図４８ないし図５２に基づいて、本発明の具体的な実施例について説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１４９】
〔実施例１〕
ナチュラルキラー細胞リンパ腫を含む検体試料を用い、Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６，４３５０，（１９７９）に開示されている方法にしたがってウエスタンブロッティングを実施した。なお、ＳＨＰ１抗体として＃ＳＨ−ＰＴＰ１（Ｄ−１１）：ｓｃ７２８９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製）を用いた（ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程・蛋白質定量法）。
【０１５０】
その後、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程に移行した。まず、メチル化感受性制限酵素としてＨｐａＩＩを用いて、上記検体試料から調製した遺伝子試料を３７℃４時間で処理した（遺伝子切断試行段階）。
【０１５１】
次に、ＨｐａＩＩで処理した遺伝子試料をＰＣＲで増幅した（遺伝子増幅試行段階）。このとき用いたプラーマ−ペアは、配列番号７および図４８（ａ）に示す１９塩基のプライマーＲＥＰ−Ｓ１と、配列番号８および図４８（ｂ）に示す２０塩基のプライマーＲＥＰ−ＡＳ１との組み合わせとした。このプライマーペアを用いた場合、配列番号９および図４８（ｃ）に示すように、ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖の配列（配列番号１および図１〜図１０参照）における、７４４１塩基から７５６６塩基までの１２６塩基の塩基配列が検出される。
【０１５２】
なお、図４８（ｃ）におけるカッコ内の「＃（番号）」は、上記ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖における塩基の位置を示しており、下線部はプライマーＲＥＰ−Ｓ１およびＲＥＰ−ＡＳ１の対応位置、並びにＨｐａＩＩの認識切断部位の位置を示している。また、プライマーＲＥＰ−ＡＳ１は、上記ＲＥＰ−ＡＳ１の下線部の領域におけるアンチセンス鎖の配列に対してデザインされたものである。
【０１５３】
その後、アガロースゲルで電気泳動してから、得られたＤＮＡバンドをナイロンメンブレンにブロッティングしてＳＨＰ１遺伝子の増幅を確認した（遺伝子増幅量確認工程）。
【０１５４】
次に、Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６，４３５０，（１９７９）に開示されている方法にしたがってウエスタンブロッティングを実施した。なお、ＳＨＰ１抗体として＃ＳＨ−ＰＴＰ１（Ｄ−１１）：ｓｃ７２８９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製）を用いた（ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程・蛋白質定量法）。
【０１５５】
上記ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程とＳＨＰ１遺伝子産物定量工程との結果から検体試料中の造血器腫瘍細胞を検出した。
【０１５６】
〔実施例２〕
遺伝子増幅試行段階で、プライマーペアとして、配列番号１０および図４９（ａ）に示す２１塩基のプライマーＲＥＰ−Ｓ２と、配列番号１１および図４９（ｂ）に示す２１塩基のプライマーＲＥＰ−ＡＳ２との組み合わせを用いた以外は、前記実施例１と同様にして検体試料中の造血器腫瘍細胞の有無を検出した。
【０１５７】
上記プライマーペアを用いた場合、配列番号１２および図４９（ｃ）に示すように、ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖の配列（配列番号１および図１〜図１０参照）における、６８５８塩基から７０８４塩基までの２２７塩基の塩基配列を検出することができる。
【０１５８】
なお、図４９（ｃ）におけるカッコ内の「＃（番号）」も、上記ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖における塩基の位置を示しており、下線部はプライマーＲＥＰ−Ｓ２およびＲＥＰ−ＡＳ２の対応位置、並びにＨｐａＩＩの認識切断部位の位置を示している。また、プライマーＲＥＰ−ＡＳ２は、上記ＲＥＰ−ＡＳ２の下線部の領域におけるアンチセンス鎖の配列に対してデザインされたものである。
【０１５９】
〔実施例３〕
ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ定量法を用いてＳＨＰ１遺伝子産物定量工程を実施した以外は、前記実施例１と同様にして検体試料中の造血器腫瘍細胞の有無を検討した。
【０１６０】
すなわち、前記検体試料から全細胞内のＲＮＡを調製してから逆転写酵素により逆転写した。その後、ＳＨＰ１特異的プライマーペアを用いてＰＣＲにより増幅した。上記ＳＨＰ１特異的プライマーペアとしては、配列番号１３および図５０（ａ）に示す２３塩基のプライマーＳＨＰ−ＰＦ１と、配列番号１４および図５０（ｂ）に示す２５塩基のプライマーＳＨＰ−ＰＲ１との組み合わせを用いた。
【０１６１】
〔実施例４〕
ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ定量法を用いてＳＨＰ１遺伝子産物定量工程を実施した以外は、前記実施例３（すなわち前記実施例１）と同様にして検体試料中の造血器腫瘍細胞の有無を検討した。上記ＳＨＰ１特異的プライマーペアとしては、配列番号１５および図５１（ａ）に示す２０塩基のプライマーＳＨＰ−ＬＦ１と、配列番号１６および図５１（ｂ）に示す２０塩基のプライマーＳＨＰ−ＬＲ１を用いた。
【０１６２】
〔実施例５〕
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ９８２１−９８２６， （１９９６） に開示されている方法にしたがってメチル化特異的ＰＣＲを用いてＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程を実施した以外は、前記実施例１と同様にして検体試料中の造血器腫瘍細胞の有無を検討した。なお、重亜硫酸塩としては、重亜硫酸ナトリウムを用いた。
【０１６３】
また、上記メチル化特異的ＰＣＲにおけるプライマーペアとしては、配列番号１７および図５２（ａ）に示す２４塩基のプライマーＭＦ２と、配列番号１８および図５２（ｂ）に示す２１塩基のプライマーＭＲ２との組み合わせを用いることができる。このプライマーペアを用いた場合、配列番号１９および図５２（ｃ）に示すように、ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖の配列（配列番号１および図１〜図１０参照）における、７０３７塩基から７１９５塩基までの１５９塩基の塩基配列を検出することができる。
【０１６４】
なお、図５２（ｃ）におけるカッコ内の「＃（番号）」は、上記ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖における塩基の位置を示しており、下線部はプライマーＭＦ２およびＭＲ２の対応位置を示している。ただし、上記各プライマーはメチル化されているＤＮＡのみを検出できるように設計されているので、その塩基配列は、上記下線部の塩基配列とは少し異なっている。また、プライマーＭＲ２は、上記ＭＲ２の下線部の領域におけるアンチセンス鎖の配列に対してデザインされたものである。
【０１６５】
〔実施例６〕
検体試料として、診断用の骨髄（ＢＭ）検体と、ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）患者の末梢血（ＰＢ）検体とを用いた。ＡＬＬ患者から得られたＢＭ検体は少なくとも７０％の比で芽細胞を含んでいた。また、これら検体試料に対する対照試料は、化学療法によって達成された血液学的完全寛解の後に得られた。
【０１６６】
上記検体試料を用いてマイクロサテライト解析を行った。このときのＰＣＲ反応では、５’側のプライマーを、５’−ｉｏｄｏａｃａｔａｍｉｄｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルし、反応系は、１０ｐｍｏｌのそれぞれのプライマー、４０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１×ＰＣＲバッファー、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰと、０．５ｕｎｉｔのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む２０μｌの系とした。得られたＰＣＲ産物は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）にかけ、Ｇｅｎｅｓｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ ３．７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析を行った。
【０１６７】
その結果、図５３（ａ）・（ｂ）に示すように、Ｄ１２Ｓ３３６マーカーおよびＤ１２Ｓ３５６マーカーによってＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨの有無を確認できることがわかった。本実施例の結果では、これらマーカーのうちテロメア側のＤ１２Ｓ３５６マーカーでは、有意な結果が得られた１９症例中１５例（７９％）にＬＯＨが認められた。また、セントロメア側のＤ１２Ｓ３３６マーカーでは、１６症例中６例（３８％）にＬＯＨが認められた。
【０１６８】
上記何れの実施例の結果も、検体試料から十分に造血器腫瘍細胞を検出することができた。それゆえ、本発明は、複数の診断手法を併用しなくても造血器腫瘍細胞を容易かつ迅速に検出することができることがわかった。
【０１６９】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法は、造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なＳＨＰ１蛋白質およびそのｍＲＮＡの少なくとも一方を定量するＳＨＰ１遺伝子産物定量工程と、上記検体試料から得られる、上記ＳＨＰ１蛋白質をコードするＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認するＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程と、上記検体試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失（ＬＯＨ）の有無を確認するＳＨＰ１遺伝子ＬＯＨ確認工程とを含む方法である。
【０１７０】
また、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出キットの好ましい一例としては、（１）造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体、および（２）シトシンを含む塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素と、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識される塩基配列を含む領域を増幅するＰＣＲ用のプライマーと、上記ＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性及びメチル化陰性対照ＤＮＡとのうち、少なくとも一方を含む構成か、あるいは、（１）造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体、（２）遺伝子処理レベルまで精製された重亜硫酸塩と、該重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無の判定用プライマー、および（３）配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーのうち、少なくとも何れか一つを含む構成か、または、造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子を挟み込む２つのマイクロサテライト・マーカーの少なくとも一方の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーを含む構成を挙げることができる。
【０１７１】
本発明の方法または構成によれば、ＳＨＰ１遺伝子の発現を、遺伝子ＤＮＡの修飾とｍＲＮＡと蛋白質と対立遺伝子の喪失という最大で四重のマーカーを用いて判定できることになる。すなわち、ＳＨＰ１遺伝子の発現低下という一つの造血器腫瘍細胞特異的な現象を４段階で確認することができるため、非常に高い特異性で造血器腫瘍細胞を検出することができる。よって、本発明を用いることで、造血器細胞を含む微量の検体試料から造血器腫瘍細胞を容易かつ迅速に検出することができる。
【０１７２】
それゆえ、本発明における悪性リンパ腫・白血病の高感度検出法を用いると、一般集団検診による造血器腫瘍の早期発見、診断および治療後のモニタリングや再発の早期発見が可能になり、これら疾患を発症した家族等血縁者における発症危険度の予測等に本発明を利用することも可能となる。その結果、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となるという効果を奏する。
【０１７３】
【配列表】
＜４００＞ １９
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子ゲノムＤＮＡのセンス鎖の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図２】図１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３】図１・図２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４】図１〜図３に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図５】図１〜図４に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図６】図１〜図５に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図７】図１〜図６に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図８】図１〜図７に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図９】図１〜図８に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１０】図１〜図９に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１１】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図１２】図１１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１３】図１１・図１２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１４】図１１〜図１３に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１５】図１１〜図１４に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１６】図１１〜図１５に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１７】図１１〜図１６に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１８】図１１〜図１７に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１９】図１１〜図１８に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図２０】図１１〜図１９に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図２１】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示す塩基配列図である。
【図２２】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１蛋白質の概略構造を示す模式図である。
【図２３】図２２に示すＳＨＰ１蛋白質のアミノ酸配列を示すアミノ酸配列図である。
【図２４】図１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ（センス鎖）において、ＣｐＧ島でメチル化されるＣＧ配列の部位を示す塩基配列図である。
【図２５】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられる重亜硫酸処理にて、シトシンがウラシルに変換される過程を示す化学反応説明図である。
【図２６】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられる重亜硫酸処理により、シトシンがウラシルへ変換され、メチル化されたシトシンが変換されない状態を示す模式図である。
【図２７】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子ゲノムＤＮＡのセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図２８】図２７に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図２９】図２７・２８に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３０】図２７〜図２９に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３１】図２７〜図３０に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３２】図２７〜図３１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３３】図２７〜図３２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３４】図２７〜図３３に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３５】図２７〜図３４に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３６】図２７〜図３５に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３７】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子ゲノムＤＮＡのアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図３８】図３７に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３９】図３７・図３８に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４０】図３７〜図３９に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４１】図３７〜図４０に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４２】図３７〜図４１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４３】図３７〜図４２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４４】図３７〜図４３に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４５】図３７〜図４４に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４６】図３７〜図４５に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４７】（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ本発明で用いられるメチル化特異的ＰＣＲのステップを示す模式図である。
【図４８】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例１において用いられるＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図であり、（ｃ）は、（ａ）・（ｂ）で用いられるＰＣＲ用プライマーが認識するＳＨＰ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ・センス鎖）の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図４９】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例２において用いられるＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図であり、（ｃ）は、（ａ）・（ｂ）で用いられるＰＣＲ用プライマーが認識するＳＨＰ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ・センス鎖）の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図５０】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例３において用いられるＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図である。
【図５１】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例４において用いられるｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図である。
【図５２】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例５において用いられるメチル化特異的ＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図であり、（ｃ）は、（ａ）・（ｂ）で用いられるメチル化特異的ＰＣＲ用プライマーが認識するＳＨＰ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ・センス鎖）の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図５３】（ａ）は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を示す図であり、（ｂ）は、ＡＬＬ患者におけるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失の解析結果の一つの典型的なデータを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、造血器腫瘍細胞検出方法および該検出方法に好適に用いられる造血器腫瘍細胞検出キットに関するものであり、特に、例えば、悪性リンパ腫や白血病等に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子産物の発現減少あるいは消失またはこれをコードするＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することによって、造血器腫瘍細胞を高感度かつ高特異的に検出できる検出方法および検出キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）における悪性リンパ腫や白血病等の造血器腫瘍（血液系の腫瘍）には、難治性で極めて予後の悪いものから比較的予後のよいものまで様々な種類が知られている。この造血器腫瘍の治療には、各種化学療法や放射線療法、あるいは免疫療法といった種々の療法がすでに実用化されているが、このような治療の結果、ほぼ腫瘍細胞が退縮したとしても、わずかに腫瘍細胞が生存していれば造血器腫瘍の再発は免れない。
【０００３】
上記造血器腫瘍の診断は、従来では、複数の診断手法を併用することにより総合的に実施されている。具体的には、末梢血や各種生検材料を用いて、組織染色や免疫染色等による形態学的な観察や組織学的な観察が実施されたり、さらには、種々の分子生物学的解析や染色体解析等も実施されたりしている。また、上記造血器腫瘍の診断では、判定までにかなりの時間を要する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来の各診断手法は、それ単独では造血器腫瘍細胞を高感度、高特異的、かつ迅速に検出できるものではない。それゆえ、これら従来の診断手法では、複数を併用して総合的に判断しなければ造血器腫瘍を診断することができない。
【０００５】
つまり、従来の診断手法を使用する限り、複数の診断手法を併用しなければならないため、診断の煩雑化を招くだけでなく時間がかかり、造血器腫瘍細胞検出感度も特異性も高くないことから、医師の専門的な判断が診断に大きな比重を占めることになる。そのため、従来では、造血器腫瘍の診断技術は、実質的に医療現場での利用に限られており、各々の疾患者には対応できるが、集団検診による造血器腫瘍の早期発見・早期治療を目的としては利用されていない。
【０００６】
造血器腫瘍細胞をより高感度かつ高特異的に実施するには、造血器腫瘍細胞に特異的であり、かつ広い範囲の造血器腫瘍に見られる感度の高いマーカーを用いることが考えられる。このようなマーカーを用いれば、造血器腫瘍の早期発見・診断を容易かつ迅速に実施することができ、医療上、悪性リンパ腫や白血病等の早期治療や再発予防に応用することが可能となるだけでなく、臨床検査産業や医薬品産業等にも利用可能な診断技術とすることができ、産業の発展に寄与することが可能となる。しかしながら、このようなマーカーは現在までのところ知られていない。
【０００７】
本発明は上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、分子生物学的知見を利用して、迅速且つ簡便に造血器腫瘍細胞を高感度かつ高特異的に微量の患者検体から検出し造血器腫瘍の早期発見・診断および早期治療を容易にし、集団検診にも適用可能な造血器腫瘍細胞検出方法および検出キットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、広い範囲の悪性の造血器腫瘍では、プロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質の発現抑制が極めて高頻度で見られ、しかも悪性度の高い造血器腫瘍において、上記ＳＨＰ１蛋白質の発現抑制の傾向が強くなることを見出し、ＳＨＰ１遺伝子産物およびこれをコードするＳＨＰ１遺伝子の双方をマーカーとして用いることで、造血器腫瘍細胞の高感度、高特異的、かつ短時間に検出でき、かつ産業上利用できる造血器腫瘍細胞検出技術を実現し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法は、上記の課題を解決するために、（１）造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方の発現量を定量するＳＨＰ１遺伝子産物定量工程、（２）上記検体試料から得られる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認するＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程、および（３）上記検体試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失（ＬＯＨ）の有無を確認するＳＨＰ１遺伝子ＬＯＨ確認工程、の少なくとも一方を含むことを特徴としている。
【００１０】
上記ＳＨＰ１遺伝子産物の発現抑制は、悪性の造血器腫瘍細胞に極めて高頻度で見られるのに対し、正常な血液細胞にはこの現象が見られない。また、上記ＳＨＰ１蛋白質の発現抑制は、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化によるものである。さらに、ＤＮＡメチル化によるＳＨＰ１遺伝子の転写抑制の前後には、ＳＨＰ１遺伝子の一つの対立遺伝子が喪失している。
【００１１】
上記方法によれば、上記知見を利用して、検体試料から得られるＳＨＰ１遺伝子のメチル化を確認し、造血器腫瘍細胞の存在を検出することで、悪性の造血器腫瘍細胞の存在の有無をスクリーニングし、一方検体試料中のＳＨＰ１遺伝子産物、具体的にはＳＨＰ１蛋白質、またはＳＨＰ１ｍＲＮＡ、あるいはその両方の発現を定量する。
【００１２】
すなわち、上記方法では、ＳＨＰ１遺伝子の不活性化を、遺伝子ＤＮＡの修飾とｍＲＮＡと蛋白質と対立遺伝子の喪失という最大で四重のマーカーを用いて判定できることになる。すなわち、ＳＨＰ１遺伝子の発現低下という一つの造血器腫瘍細胞特異的な現象を４段階で確認することができるため、非常に高い特異性で造血器腫瘍細胞を検出することができる。
【００１３】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法の好ましい一例としては、上記ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程に、上記検体試料から得られた遺伝子試料を、シトシンを含む塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素で処理する遺伝子切断試行段階と、上記メチル化感受性制限酵素で処理された遺伝子に対して、上記ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識切断される塩基配列を含む領域を増幅するプライマーを用いてＰＣＲ法を実施する遺伝子増幅試行段階と、増幅された特定のサイズの遺伝子の量を確認する遺伝子増幅量確認段階とが含まれる検出方法を挙げることができる。
【００１４】
上記方法によれば、メチル化感受性制限酵素を用いて検体試料から得られた遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の切断を試みることでメチル化の有無を区別し、さらにＰＣＲを用いて増幅してから、得られる特定サイズのＰＣＲ産物の量を確認する。それゆえ、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても高い検出感度で、しかも高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００１５】
上記検出方法においては、上記プライマーが、さらに、配列番号１または２に示す塩基配列に含まれる部分塩基配列、またはこの部分塩基配列と相補性を有するポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００１６】
また、上記検出方法においては、上記遺伝子増幅量確認段階では、電気泳動法を用いて特定サイズの遺伝子の量を確認することが好ましい。
【００１７】
さらに、上記検出方法においては、上記遺伝子切断試行段階では、メチル化感受性制限酵素として、同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素が知られている制限酵素を用いることが好ましい。
【００１８】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法の好ましい他の一例としては、上記ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程に、上記検体試料から得られる遺伝子試料を、重亜硫酸塩で処理する遺伝子修飾段階と、重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のメチル化シトシンの有無を判定するメチル化シトシン含有判定段階とが含まれる検出方法を挙げることができる。
【００１９】
上記方法によれば、重亜硫酸塩を用いて検体試料から得られた遺伝子試料を処理すると、塩基配列中のシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンは変換されない。そのため、遺伝子修飾段階後のＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中にシトシンが含まれるか否かを判定するのみで、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、簡素なメカニズムで高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２０】
上記検出方法においては、上記メチル化シトシン含有判定段階では、ＰＣＲによりメチル化シトシンを検出する方法、遺伝子の塩基配列の決定によりメチル化シトシンを検出する方法、またはメチル化シトシンを含む塩基配列を識別する方法による遺伝子の処理のうち、少なくとも何れかが用いられても好ましい。
【００２１】
上記方法によれば、少なくともＰＣＲを用いることで、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても高い検出感度で高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２２】
上記検出方法においては、上記遺伝子修飾段階では、重亜硫酸塩として、重亜硫酸ナトリウムが用いられることが好ましい。また、上記遺伝子修飾段階では、重亜硫酸塩とともに尿素が併用されてもよい。
【００２３】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法においては、上記何れの例の検出方法であっても、上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、ＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体を用いてＳＨＰ１蛋白質を定量すると好ましい。具体的には、上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、酵素抗体法（免疫組織化学法、免疫細胞化学法、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法）またはウエスタンブロッティング法によりＳＨＰ１蛋白質が定量されると好ましい。
【００２４】
上記方法によれば、抗原抗体反応を利用してＳＨＰ１蛋白質を定量することになるので、簡素なメカニズムで高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２５】
あるいは、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法においては、上記何れの例の検出方法であっても、上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部を検出するポリヌクレオチドを用いてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出することにより、ＳＨＰ１ｍＲＮＡを定量しても好ましい。具体的には、上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、ノーザンブロッティング法、逆転写ＰＣＲ法、リアルタイム逆転写ＰＣＲ法、またはＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によりＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現が検出されると好ましい。
【００２６】
上記方法によれば、ＳＨＰ１遺伝子産物としてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡによりＳＨＰ１遺伝子産物を定量することになるので、ＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡと相同性を有するオリゴペプタイドをプローブやプライマーとして利用することで、簡素なメカニズムで高特異的かつ高感度に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２７】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法の好ましいさらに他の一例としては、異型接合性喪失の有無の確認は、上記ＳＨＰ１遺伝子を挟み込む２つのマイクロサテライト・マーカーの少なくとも一方、または、上記ＳＨＰ１遺伝子中か、その近辺に存在する単一塩基多型のような遺伝子多型を、ＰＣＲを用いたフラグメント解析することにより実施される方法を挙げることができる。このとき用いられる検体試料は、造血器細胞を含む検体試料であればよい。また、対照としては、血液学的完全寛解後に得られる検体を用いてもよいし、他の正常組織細胞を用いてもよい。
【００２８】
上記の方法によれば、マイクロサテライト・マーカーまたは単一塩基多型（ＳＮＰ）等の遺伝子多型の異型接合性喪失をＰＣＲにより確認することによって、ＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失を確認しているので、簡素なメカニズムでより確実に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００２９】
本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出キットの好ましい一例としては、造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、（１）造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体、および、（２）シトシンを含む塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素と、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識切断される塩基配列を含む領域を増幅するＰＣＲ用のプライマーと、上記ＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性及びメチル化陰性対照ＤＮＡとのうち、少なくとも一方を含む構成を挙げることができる。
【００３０】
あるいは、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出キットの好ましい他の一例としては、造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、（１）上記ＳＨＰ１抗体、および（２）遺伝子処理レベルまで精製された重亜硫酸塩と、該重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無の判定用プライマー、および、（３）配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部と相同性を持つＰＣＲ用のプライマーのうち、少なくとも何れか一つを含む構成を挙げることができる。
【００３１】
さらには、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出キットの好ましいさらに他の一例としては、造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子を挟み込む２つのマイクロサテライト・マーカーの少なくとも一方の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーを含む構成を挙げることができる。
【００３２】
上記造血器腫瘍細胞検出キットにおいては、さらに、ＰＣＲ用試薬、および、制限酵素反応用試薬の少なくとも一方を含むことが好ましい。
【００３３】
上記何れの構成であっても、前述した造血器腫瘍細胞検出方法を実施するために好ましい薬剤や標本等が含まれている。そのため、上記検出キットを用いることで、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法を容易かつ迅速に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
〔実施の形態１〕
本発明における実施の一形態について図１ないし図２４に基づいて説明すれば以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３５】
本発明は、造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なプロモーターからのプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子産物すなわちＳＨＰ１蛋白質とｍＲＮＡとを定量するとともに、上記検体試料から得られる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認することで、上記検体試料中から造血器腫瘍細胞を検出する技術である。
【００３６】
本発明で、造血器腫瘍細胞を検出するためのマーカーとして用いられるＳＨＰ１遺伝子は、染色体１２ｐ１３に存在し、図１〜図１０および配列番号１に示す塩基配列をゲノムＤＮＡ（ワイルドタイプ）のセンス鎖とし、図１１〜図２０および配列番号２に示す塩基配列をアンチセンス鎖とする１６のエキソン（図および配列表中大文字で示す領域）を有する遺伝子である。そのｃＤＮＡは、図２１および配列番号３に示す塩基配列を有する約１．８ｋｂのサイズを有している。なお、ＳＨＰ１遺伝子はＳＨ−ＰＴＰ１，ＰＴＰ１Ｃ、ＨＣＰ、ＨＣＰＨ、ＰＴＰＮ６、ＨＰＴＰ１Ｃ、ＳＨＰ−１Ｌと同一の遺伝子である。
【００３７】
上記ＳＨＰ１遺伝子にコードされているＳＨＰ１蛋白質は、分子量６８ｋＤで、各種造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）であり、図２２に示すように、Ｎ末端側にタンデム構造となる２つのＳＨ２（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ ２）領域（２７０アミノ酸残基）と、２４６アミノ酸残基のＰＴＰａｓｅドメインと、９３アミノ酸残基のＣ末端側領域とを有する構造となっている。また、図２３および配列番号４に示すアミノ酸配列を有している。
【００３８】
ヒトの造血器腫瘍、例えば悪性リンパ腫や白血病では、多くの種類で９０％以上の高い頻度でＳＨＰ１蛋白質の強い発現抑制が見られる（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１５９， Ｎｏ．４， Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００１：１４９５−１５０５等参照）。このように悪性の造血器腫瘍細胞では、上記ＳＨＰ１蛋白質の発現抑制が極めて高頻度で見られるのに対し、正常な血液細胞にはこの現象が見られない。
【００３９】
本発明者らは、上記ＳＨＰ１蛋白質の発現抑制が、上記ＳＨＰ１遺伝子がメチル化されることによる転写異常を原因とすることを独自に見出した。
【００４０】
例えば、図２４に示すように、図１〜図１０および配列番号１に示すゲノムＤＮＡ（ワイルドタイプ）のセンス鎖（１８１塩基〜２１６０塩基まで例示）において、１００１塩基〜１１６３塩基のエキソン（図中大文字）の前にプロモーター領域が存在するが、この近傍にシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とが並ぶＣＧ配列が多く存在しＣｐＧ島（ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ）を形成している（図２４中ではＣＧ配列を太字の網掛けで示す）。正常な造血器細胞では、このＣｐＧ島のシトシンはメチル化されていないが、例えば悪性のリンパ腫細胞では、上記ＣＧ配列のシトシンの多くがメチル化されている。勿論、このＣＧ配列におけるシトシンのメチル化はセンス鎖のみならずアンチセンス鎖にも同じように生じる。
【００４１】
上記ＣｐＧ島におけるＣＧ配列の高度なメチル化は、ＳＨＰ１遺伝子のＤＮＡからｍＲＮＡの転写を阻害し、その結果、ＳＨＰ１蛋白質の生産が抑制される。この現象は、上述したように造血器腫瘍細胞では極めて高頻度に見られる。しかも、各種造血器腫瘍患者の完全寛解期には、ＳＨＰ１遺伝子におけるＤＮＡのメチル化が完全に消失し、分子生物学上の知見と臨床上の知見との間に非常に高い相関関係が見られる。それゆえ、メチル化によるＳＨＰ１遺伝子の発現抑制が、造血器腫瘍細胞の発症機構の中で重要な役割を果たしていることが推測される。そこで本発明では、上記ＳＨＰ１遺伝子の発現抑制という現象を、造血器腫瘍細胞のマーカーとして利用する。
【００４２】
さらに、本発明者らは、悪性リンパ腫や白血病等の疾患が発症する際に、上述した、ＤＮＡメチル化によってＳＨＰ１遺伝子の転写抑制が生じる前後に、ＳＨＰ１遺伝子の一つの対立遺伝子が喪失することも独自に見出した。そこで、ＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失を確認することによって、ＳＨＰ１遺伝子の対立遺伝子の喪失を確認することが可能となる。それゆえ、ＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失も造血器腫瘍細胞のマーカーとして利用することができる。
【００４３】
悪性リンパ腫や白血病において、ＳＨＰ１遺伝子には、高頻度のＤＮＡメチル化、高頻度の異型接合性喪失、ＳＨＰ１遺伝子の発現の低下または消失が検出され、さらには、外来ＳＨＰ１遺伝子導入が血球系の細胞の増殖を抑制する傾向にある。これにより、ＳＨＰ１遺伝子が癌抑制遺伝子の一つであることが強く示唆される。
【００４４】
そこで、本発明では、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程で、上記検体試料から得られるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認し、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程にて、造血器細胞を含む検体試料中に含まれるＳＨＰ１蛋白質およびｍＲＮＡの少なくとも一方を定量し、さらに、ＳＨＰ１遺伝子ＬＯＨ確認工程で、ＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失を確認するという三つの工程を利用する。これら工程は単独で用いられても良いし、双方ともに用いられても良い。さらに、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、ＳＨＰ１蛋白質のみ定量されても良いし、ＳＨＰ１ｍＲＮＡのみ検出されても良いし、双方ともに検出されてもよい。
【００４５】
これによって、例えば、まず、検体試料中のＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することでスクリーニングし、その後、検体試料のＳＨＰ１遺伝子産物の発現をＳＨＰ１ｍＲＮＡおよびＳＨＰ１蛋白質の少なくとも一方で定量することで、悪性の造血器腫瘍細胞の有無を確認することで造血器腫瘍細胞の存在を確定するという検出プロセスを実施することができる。
【００４６】
したがって、本発明では、ＳＨＰ１遺伝子の発現を、遺伝子ＤＮＡの修飾とｍＲＮＡと蛋白質と対立遺伝子の喪失という最大で四重のマーカーを用いて判定できることになる。すなわち、ＳＨＰ１遺伝子の発現低下という一つの造血器腫瘍細胞特異的な現象を３段階で確認することができるため、非常に高い特異性で造血器腫瘍細胞を検出することができる。
【００４７】
また、上述したように、本発明におけるＳＨＰ１遺伝子を導入することで、血球系の細胞の増殖を抑制する傾向にあることも確認されている。それゆえ、ＳＨＰ１遺伝子は、遺伝子治療に用いることも可能であり、例えば、腫瘍細胞にＳＨＰ１遺伝子の発現ベクターをトランスフェクトすることにより、腫瘍細胞の増殖を抑制することが期待できる。
【００４８】
本発明で用いられる検体試料は、末梢血あるいは骨髄液等の造血器細胞を含む検体試料であればどのような検体試料であっても特に限定されるものではない。本発明における造血器細胞とは、各種血液細胞を含むが、特に好ましくは各種白血球が挙げられる。より具体的には、リンパ球（Ｔ細胞・Ｂ細胞）、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球並びにマクロファージ、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞等を挙げることができる。あるいは造血幹細胞やリンパ球幹細胞であってもよい。
【００４９】
したがって、本発明で用いられる検体試料には、上記造血器細胞が含まれている血液や骨髄液あるいは体液等をヒトから採取し、これをそのまま検体試料として用いてもよいし、採取した血液や体液に対して従来公知の処理を施すことによって、分子生物学的な分析を実施し易い分析用検体試料としてもよい。
【００５０】
本発明が適用可能な造血器腫瘍としては、具体的には、例えば、慢性骨髄性白血病、フィラデルフィア染色体ポジティブ（＋（９；２２）（ｑｑ３４；ｑ１１），ＢＣＲ／ＡＢＬ）慢性骨髄性白血病、慢性好中球白血病、慢性好酸球白血病／高好酸球症候群、慢性突発性骨髄繊維症、真性多血症、本態性血小板増加症、その他分類できない骨髄増殖性疾患等の各種骨髄増殖性疾患；
慢性骨髄性単球白血病、非定型慢性骨髄性白血病、幼年性骨髄性単球白血病等の骨髄異型性／骨髄増殖性疾患；
環状鉄芽球を伴う難治性貧血、環状鉄芽球を伴わない難治性貧血、多系列異形成を伴う難治性血球減少症（骨髄異型性症候群）、過剰芽球５ｑ−症候群を伴う難治性貧血（骨髄異型性症候群）、その他分類できない骨髄異型性症候群等の骨髄異型性症候群；
再発性細胞遺伝学的転座を伴う急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（例えば、＋（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）を伴うＡＭＬ、ＡＭＬ１（ＣＢＦ−α）／ＥＴＯ、急性前骨髄性白血病（＋（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１１−１２）を伴うＡＭＬおよびその変形、ＰＭＬ／ＲＡＲ−α））、異常な骨髄好酸球（ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）あるいは＋（１６；１６）（ｐ１３；ｑ１１）、ＣＢＦβ／ＭＹＨ１１Ｘ）を伴うＡＭＬ、１１ｑ２３（ＭＬＬ）異常を伴うＡＭＬ、前骨髄異型性症候群を伴いかつ多系列異形成を伴うＡＭＬ、前骨髄異型性症候群を伴いかつ多系列異形成を伴わないＡＭＬ、治療に関係するＡＭＬおよび骨髄異型性症候群（アルキル化剤に関係する治療、エピポドフィロトキシンに関係する治療、あるいはその他のタイプの治療）、他に部門に属さないＡＭＬ（低分化型、成熟を伴わないもの、成熟を伴うもの、急性骨髄性単球白血病、急性単球白血病、急性赤芽球白血病、急性巨核球白血病、急性好塩基球白血病、骨髄繊維症を伴う急性汎骨髄過剰増殖症）、急性二形質性白血病等の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；
前駆体Ｂ細胞性腫瘍（前駆体Ｂ−リンパ芽球性白血病／リンパ腫（前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病）、成熟（末梢）Ｂ細胞性腫瘍（Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁領域Ｂ細胞リンパ腫（＋／−絨毛リンパ球）、毛状細胞白血病、形質細胞性骨髄腫（形質細胞腫）、ＭＡＬＴ型節外辺縁型Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁型Ｂ細胞リンパ腫（＋／− 単球型Ｂ細胞）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大型Ｂ細胞リンパ腫（縦隔大細胞Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫）、Ｂｕｒｋｉｔｔ リンパ腫／Ｂｕｒｋｉｔｔ細胞白血病）等のＢ細胞性腫瘍；
前駆体Ｔ細胞性腫瘍（前駆体Ｔ−リンパ芽球性白血病／リンパ腫（前駆体Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病）、成熟（末梢）Ｔ細胞性腫瘍（Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞顆粒リンパ球白血病、侵攻型ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞リンパ腫・白血病（ＨＴＬＶ１＋）、鼻型節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾型γ−δＴ細胞リンパ腫、皮下蜂窩織炎様Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫／Ｓｅｚａｒｙ症候群、退形成性大型細胞リンパ腫（Ｔ／ヌル細胞、原発性皮膚未分化型）、他に部門に属さない末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球Ｔ細胞リンパ腫）等のＴ細胞およびＮＫ細胞性腫瘍；
節性リンパ球優勢ホジキンリンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫（結節硬化ホジキンリンパ腫（等級１および２）、リンパ球リッチ古典的ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球枯渇ホジキンリンパ腫）等のホジキンリンパ腫（ホジキン病）；
等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００５１】
本発明におけるＳＨＰ１遺伝子産物定量工程は、検体試料中のＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方を定量できる方法であれば特に限定されるものではないが、具体的には、ＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体を用いてＳＨＰ１蛋白質を定量する方法（蛋白質定量法）か、ＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出することにより、ＳＨＰ１ｍＲＮＡを定量する方法（ｍＲＮＡ定量法）を好適に用いることができる。
【００５２】
まず、上記蛋白質定量法のより具体的な手法としては、ＳＨＰ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法または酵素抗体法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（免疫組織化学法、免疫細胞化学法、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法）を挙げることができる。
【００５３】
上記蛋白質定量法で用いられるＳＨＰ１抗体は、図２２、図２３および配列番号４に示す構造を有するＳＨＰ１蛋白質の少なくとも一部の構造を抗原決定基として認識し、ＳＨＰ１蛋白質を免疫学的に確実に検出できる抗体であれば特に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。
【００５４】
上記ＳＨＰ１抗体は、従来公知の方法で製造してもよいし、市販のＳＨＰ１抗体を用いてもよい。ＳＨＰ１抗体の製造方法としては、例えば、モノクローナル抗体であれば、ＳＨＰ１蛋白質で免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスの骨髄細胞とを融合させてなるハイブリドーマにより産生する手法が挙げられる。また、上記ＳＨＰ１抗体がポリクローナル抗体であれば、ＳＨＰ１蛋白質で免疫したウサギの免疫血清から精製する手法が挙げられる。また、市販のＳＨＰ１抗体としては、＃ＳＨ−ＰＴＰ１（Ｄ−１１）：ｓｃ７２８９および＃ＳＨ−ＰＴＰ１（Ｃ−１９）：ｓｃ２８７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製）、＃ａｎｔｉ ＳＨＰＴＰ（０６１１７）および＃ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＳＨＰＴＰ（０５２８１） ）
（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製）等が挙げられる。
【００５５】
上記ＳＨＰ１抗体を用いた酵素抗体法（免疫組織化学法、免疫細胞化学法、ＥＬＩＳＡ法）は、従来公知の方法（例えば、『酵素抗体法』渡辺慶一・中根一穂編集、学際企画出版（昭和６１年）や、Ｂｒｏｗｎ Ｒ．Ｗ． ｅｔ ａｌ： Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌ． １９９；８（５）５１５−２０（１９９５）等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【００５６】
同様に、上記ＳＨＰ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法も、従来公知の方法（例えば、『実験操作ブロッティング法』日野嘉幸他編、ソフトサイエンス社（昭和６２年）や、Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６，４３５０，（１９７９） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【００５７】
上記蛋白質定量法を用いることで、抗原抗体反応を利用してＳＨＰ１蛋白質を定量することになる。そのため、簡素なメカニズムで高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００５８】
次に、上記ｍＲＮＡ定量法のより具体的な手法としては、配列番号３（図２１参照）に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部と相同性を有するポリヌクレオチドを用いてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出する方法が挙げられ、より具体的には、ノーザンブロッティング法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを挙げることができる。
【００５９】
上記ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ、ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ、およびＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの何れの方法も従来公知の方法（例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ” ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ．（２００１）や、”Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ” ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（２００１） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【００６０】
上記ノーザンブロッティング法やＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションでは、原理的には、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡの全長あるいはその一部をプローブとして用いることができる。また、ＲＴ−ＰＣＲやｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲでも、原理的には、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡの一部と相同性を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることができる。具体的には、例えば、後述する実施例３や実施例４に示すプライマーペアを用いることができる。
【００６１】
それゆえ、ｍＲＮＡ定量法では、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部と相同性を有するポリヌクレオチドを用いてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出すればよい。
【００６２】
上記ｍＲＮＡ定量法を用いることで、ＳＨＰ１遺伝子の転写産物であるＳＨＰ１ｍＲＮＡを定量することになるので、ＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡと相同性を有するポリヌクレオチドをプローブやプライマーとして利用することで、簡素なメカニズムで迅速、高特異的かつ高感度に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００６３】
本発明におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程は、検体試料から得られるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認できる方法であれば特に限定されるものではないが、本実施の形態では、例えば、遺伝子切断試行段階と、遺伝子増幅試行段階と、遺伝子増幅量確認段階とを含むメチル化感受性制限酵素を利用した方法（以下、説明の便宜上、制限酵素確認法と称する）を好適に用いることができる。
【００６４】
本実施の形態で用いられるメチル化感受性制限酵素とは、二本鎖ＤＮＡにおいて認識対象となる塩基配列にシトシンを含んでおり、かつ、この塩基配列中のシトシンがメチル化された場合には、該塩基配列の二本鎖ＤＮＡを切断できない制限酵素であれば特に限定されるものではない。
【００６５】
上記メチル化感受性制限酵素としては、具体的には、例えば、ＨｐａＩＩ、ＥａｇＩまたはＮａｅＩ等を挙げることができる。中でも、ＨｐａＩＩをより好ましく用いることができる。ＨｐａＩＩは、ＣＣＧＧの塩基配列を認識して二本鎖ＤＮＡ切断するエンドヌクレアーゼであるが、同じ塩基配列を認識して二本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素として、ＭｓｐＩが知られている。
【００６６】
上述したように、ＨｐａＩＩはメチル化されたＣＣＧＧの塩基配列の二本鎖ＤＮＡを切断できないが、ＭｓｐＩはメチル化の有無に関わらずＣＣＧＧの塩基配列を認識して二本鎖ＤＮＡを切断することが可能である。すなわち、ＭｓｐＩはメチル化非感受性制限酵素である。それゆえ、ＨｓｐＩＩとＭｓｐＩとを併用することで、後述するように、検体試料中のＳＨＰ１遺伝子の切断を確実に確認するためのコントロールとして利用することが可能になり、本実施の形態における制限酵素確認法の信頼性をより一層向上させることができる。
【００６７】
このように、本実施の形態における制限酵素確認法では、使用するメチル化感受性制限酵素と同じ塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素をコントロールとして使用することが好ましい。勿論、メチル化感受性およびメチル化非感受性制限酵素の組み合わせは上記ＨｓｐＩＩ・ＭｓｐＩに限定されるものではないことは言うまでもない。
【００６８】
次に、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程、すなわち制限酵素確認法によるＳＨＰ１遺伝子のメチル化の確認について具体的に説明する。
【００６９】
まず、遺伝子切断試行段階として、造血器細胞を含む前記検体試料から得られた遺伝子試料を、シトシンを含む塩基配列を認識する上記メチル化感受性制限酵素で処理する。この段階では、メチル化感受性制限酵素の処理により遺伝子試料中に含まれるＳＨＰ１遺伝子の切断を試みる。すなわち、前記検体試料中に含まれる造血器細胞が正常な細胞のみであれば、ＳＨＰ１遺伝子は切断されるが、造血器腫瘍細胞が含まれていれば、ＳＨＰ１遺伝子はＣＧ配列がメチル化されているため切断されない。
【００７０】
前記検体試料から遺伝子試料を調製する方法は従来公知の方法を用いることができ特に限定されるものではない。また、調製された遺伝子試料は、ＳＨＰ１遺伝子を含んでいればよく、制限酵素処理やＰＣＲ等を阻害しない限り他の成分が含まれていても良い。それゆえ、前記検体試料中に含まれる造血器細胞やその他の細胞から抽出される各種ＤＮＡやＲＮＡの混合物であればよい。また、メチル化感受性制限酵素による処理についても特に限定されるものではなく、該メチル化感受性制限酵素の種類や調製された遺伝子試料の状態等に応じて、適宜条件等を設定すればよい。
【００７１】
次に、遺伝子増幅試行段階として、上記メチル化感受性制限酵素で処理された遺伝子試料に対して、上記ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識切断される塩基配列を含む領域を増幅するプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。この段階では、メチル化感受性制限酵素で処理した制限酵素処理物を、上記プライマーを用いてＰＣＲ処理することにより、ＳＨＰ１遺伝子のみの増幅を試みる。正常なＳＨＰ１遺伝子のみであれば、プライマーペアに挟まれる領域が切断されているためＳＨＰ１遺伝子は増幅できないが、メチル化されているＳＨＰ１遺伝子が含まれていれば、上記プライマーペアに挟まれる領域は切断されていないためＳＨＰ１遺伝子が増幅される。
【００７２】
上記遺伝子増幅試行段階で用いられる上記プライマーとしては、メチル化感受性制限酵素に認識される塩基配列を含む領域を増幅するポリヌクレオチドであればよい。それゆえプライマーの設計条件等についても特に限定されるものではない。基本的には、本実施の形態で用いられるプライマーペアは、メチル化感受性制限酵素に認識される上記塩基配列を含む領域の少なくとも外側に位置し、配列番号１または２（図１〜図１０および図１１〜図２０参照）に示すＳＨＰ１遺伝子の塩基配列に含まれる部分塩基配列、またはこの部分塩基配列と相補性を有するポリヌクレオチドであればよく、その場所やサイズ等については特に限定されるものではない。
【００７３】
次に、遺伝子増幅量確認段階として、増幅された遺伝子の量を確認する。この段階では、ＳＨＰ１遺伝子が増幅されたか否かを確認する。ＳＨＰ１遺伝子が増幅されれば、元の検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれていることになる。
【００７４】
上記遺伝子増幅量確認段階で用いられるＳＨＰ１遺伝子の有無の確認方法としては特に限定されるものではないが、電気泳動法を用いてマーカーと比較することにより遺伝子の増幅量を確認する手法が最も一般的で確立された手法であるため好ましく用いることができる。また、電気泳動後に得られたＤＮＡバンドをメンブレンにブロッティングして検出してもよい。
【００７５】
上記遺伝子増幅量確認段階で用いられるＳＨＰ１遺伝子の有無の確認方法としては特に限定されるものではないが、検体試料と同時にメチル化陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡを用いて反応を行った後電気泳動法を用いて遺伝子の増幅量を確認する手法が最も一般的で確立された手法であるため好ましく用いることができる。また、電気泳動後に得られたＤＮＡバンドをメンブレンにブロッティングして検出してもよい。
【００７６】
上記ＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡは、ＳＨＰ１遺伝子を用いたものであればよく、特に限定されるものではない。具体的には、メチル化感受性制限酵素またはメチル化非感受性制限酵素により処理することで得られる、増幅量を比較できる程度の濃度を有するＤＮＡ溶液を挙げることができる。
【００７７】
さらに、制限酵素確認法によるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程では、コントロールとして、メチル化感受性制限酵素による処理と並行して、同一の検体試料をメチル化非感受性制限酵素で処理して、それを遺伝子増幅量確認段階で確認すると好ましい。すなわち、上記遺伝子切断試行段階では、メチル化感受性制限酵素として、同一の塩基配列を認識するメチル化非感受制限酵素が知られている制限酵素を用いることが非常に好ましい。これによって、制限酵素確認法によるＳＨＰ１遺伝子のメチル化の確実性を高めることができる。
【００７８】
本発明におけるＳＨＰ１サテライトＬＯＨ確認工程は、造血器細胞を含む検体試料において、この検体試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失（Ｌｏｓｓｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ，ＬＯＨと略す）の有無を確認することができる方法であれば特に限定されるものではないが、具体的には、ＳＨＰ１遺伝子を挟み込むマイクロサテライト・マーカー、または、上記ＳＨＰ遺伝子中か、その近辺に存在する単一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）のような遺伝子多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）について、ＰＣＲを用いたフラグメント解析によってＬＯＨを確認する方法を好適に用いることができる。
【００７９】
上記ＳＨＰ１遺伝子の両側に存在するマイクロサテライト・マーカーや、ＳＨＰ１遺伝子中またはその近辺に存在する遺伝子多型については、特に限定されるものではなく、どのようなマーカーを用いてもよいが、具体的には、例えば、Ｄ１２Ｓ３３６マーカーおよびＤ１２Ｓ３５６マーカーを挙げることができる。これらマーカーの塩基配列は、インターネット・ゲノム・データベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ．／）から得られる。これらマーカーのうち、Ｄ１２Ｓ３５６マーカーはテロメア側に存在し、ＳＨＰ１遺伝子から約４．４ｃＭの距離にある。一方、Ｄ１２Ｓ３５６マーカーはセントロメア側に存在し、ＳＨＰ１遺伝子から約２．４ｃＭの距離にある。
【００８０】
検体試料におけるＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨ（異型接合性喪失）の確認に際しては、ＳＨＰ１サテライトＬＯＨ確認工程で用いられる検体試料は、造血器細胞を含む検体試料となっていればよい。また、ＬＯＨの具体的な方法は特に限定されるものではないが、後述する実施例６に示すように、ＰＣＲ反応によって上記各マーカーの少なくとも一方の全長またはその一部を検出するマイクロサテライト解析を行えばよい。このときのＰＣＲ反応他の条件も特に限定されるものではなく、ＰＣＲ用のプライマーとしては、例えば、Ｄ１２Ｓ３３６マーカーまたはＤ１２Ｓ３５６マーカーの少なくとも一部を検出できるようなプライマーであればよく、その他の条件についても適切な条件を適宜設定すればよい。
【００８１】
本発明におけるＳＨＰ１サテライトＬＯＨ確認工程で用いられる検体試料は、造血器細胞を含む検体試料であれば特に限定されるものではない。また、対照として用いる検体試料も特に限定されるものではなく、血液学的完全寛解後に得られる検体を用いてもよいし、他の正常組織細胞を用いてもよい。
【００８２】
このように、マイクロサテライト・マーカーやＳＮＰ等の遺伝子多型を利用してＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨを確認することで、簡素なメカニズムでより確実に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００８３】
なお、本実施の形態では、ＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨを、マイクロサテライト・マーカーや遺伝子多型を利用して確認した例を挙げているが、本発明はこれに限定されるものではなく、ＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨが確認できる方法であればどのような方法でもよいことは言うまでもない。
【００８４】
次に、本実施の形態にかかる検出方法の好ましい一例について、より具体的に説明する。
【００８５】
まず、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程により、前述した手法を用いて検体試料中に含まれるＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方を定量する。このプロセスで定量されたＳＨＰ１蛋白質が、標準よりも大幅に減少していたり、ほとんどＳＨＰ１遺伝子産物が発現していなかったりした場合には、検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれている可能性が高くなる。
【００８６】
次に、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程で、前記制限酵素確認法により、検体試料から調製した遺伝子試料中のＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認する。以下の説明では、メチル化感受性制限酵素として前記ＨｐａＩＩを用いた例を挙げる。ＨｐａＩＩは、前述したようにＣＣＧＧの塩基配列を認識するが、同じ塩基配列を、メチル化非感受性制限酵素ＭｓｐＩも認識するため、好ましく用いられる。
【００８７】
そこで、遺伝子切断試行段階では、上記検体試料から得られた遺伝子試料を、ＨｐａＩＩで処理する。同時に、同一の遺伝子試料をＭｓｐＩで処理すると好ましい。これによって、ＣＣＧＧ塩基配列が切断されるというポジティブコントロールを得ることができる。
【００８８】
次に、遺伝子増幅試行段階に移行するが、このステップでは、先に、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列（配列番号１および２、図１〜図１０および図１１〜図２０参照）から、ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩの認識部位（ＣＣＧＧ）を挟んでＰＣＲ用のプライマーを設定する。具体的には、例えば、後述する実施例１や実施例２に示すプライマーペアを用いる。
【００８９】
上記のようなプライマーを用いて、ＨｐａＩＩで処理された遺伝子試料に対してＰＣＲを実施し、遺伝子増幅量確認段階で、例えば電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅量を確認する。遺伝子試料中に、メチル化されたＳＨＰ１遺伝子があれば、ＨｐａＩＩは切断できないので、ＰＣＲにより目的のサイズのＰＣＲ産物が検出できる。一方、メチル化されたＳＨＰ１遺伝子が無ければ、ＨｐａＩＩによりＤＮＡが切断されＰＣＲ産物は検出できない。
【００９０】
このように、上記制限酵素確認法を用いれば、メチル化感受性制限酵素を用いて検体試料から得られた遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の切断を試み、さらにＰＣＲを用いて増幅してから、得られるＰＣＲ産物の増幅量を確認することができる。それゆえ、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することが可能である。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても迅速に高い検出感度で、しかも高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【００９１】
なお、本実施の形態で説明した上記検出方法には、他の工程（プロセス）や他の段階（ステップ）が含まれていてもよいことは言うまでも無い。例えば、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程において、制限酵素反応やＰＣＲ反応を円滑に進めるために、得られた遺伝子試料等を精製する精製段階が含まれていてもよい。
【００９２】
本発明には、上述した造血器腫瘍細胞検出方法だけでなく、該検出方法を実施するための検出キットが含まれる。具体的には、前記ＳＨＰ１抗体、前記メチル化感受性制限酵素、前記各プライマー、前記ＳＨＰ１遺伝子陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡ等を含む構成を挙げることができる。特に、（１）上記ＳＨＰ１抗体、および（２）メチル化感受性制限酵素と、ＰＣＲ用プライマーと、前記ＳＨＰ１遺伝子陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡとの組み合わせに分けた場合には、（１）および（２）の少なくとも一方が含まれていると好ましい。また、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程とＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程の順番はどちらが先であっても良い。
【００９３】
さらに、上記検出キットには、必要に応じて、他の各種試薬類が含まれていてもよい。例えば、ヌクレオチドモノマー、ポリメラーゼ、バッファー等のＰＣＲ反応用試薬、および、バッファー等の制限酵素反応用試薬の少なくとも一方が含まれていてもよい。
【００９４】
より具体的に、各工程または段階ごとに用いられる試薬等について説明する。まず、遺伝子産物定量工程では、蛋白質定量法の場合、酵素抗体法およびウエスタンブロッティング法の何れであっても、ＳＨＰ１抗体およびその検出試薬が少なくとも用いられる。また、ｍＲＮＡ定量法の場合、ＲＴ−ＰＣＲ法やｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合、ＳＨＰ１ｃＤＮＡ検出用プライマーおよびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応試薬が少なくとも用いられる。
【００９５】
次に、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程では、メチル化感受性制限酵素によりメチル化を確認するため、まず、遺伝子切断試行段階にて、メチル化感受性制限酵素、メチル化非感受性制限酵素、およびこれらの反応試薬が少なくとも用いられる。次に、遺伝子増幅試行段階では、プライマー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応試薬、システム検討用ＳＨＰ１遺伝子メチル化陽性ＤＮＡが少なくとも用いられる。次に、遺伝子増幅量確認段階では、ＳＨＰ１遺伝子メチル化陽性およびメチル化陰性対照ＤＮＡを用いた反応産物を電気泳動のコントロールとして少なくとも使用することができる。
【００９６】
このように、本発明にかかる検出キットでは、前述した造血器腫瘍細胞検出方法を実施するために好ましい薬剤や標本等が含まれている。そのため、上記検出キットを用いることで、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法を容易かつ簡素に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【００９７】
〔実施の形態２〕
本発明における実施の他の形態について図２５ないし図４７に基づいて説明すれば以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。また、説明の便宜上、実施の形態１と重複する説明は適宜省略する。
【００９８】
前記実施の形態１では、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程に、メチル化感受性制限酵素を用いる制限酵素確認法を用いたが、本発明は、これに限定されるものではなく、本実施の形態では、例えば、遺伝子修飾段階とメチル化シトシン含有判定段階とを含む、重亜硫酸塩を用いてＤＮＡを修飾する方法（以下、説明の便宜上、ＤＮＡ修飾法と称する）を好適に用いることができる。
【００９９】
ＤＮＡを重亜硫酸塩（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で処理すると、シトシンはウラシルに変換される。具体的には、図２５に示すように、シトシンが重亜硫酸塩によりスルホン化（Ｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎ）され、さらに加水分解により脱アミノ化（Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）され、さらに、アルカリ存在下での脱スルホン化（Ａｌｋａｌｉ ｄｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎ）により、ウラシルに変換される。このウラシルはＰＣＲ後、チミンに置き変わる。これに対して、メチル化されたシトシン（５’−メチルシトシン）は重亜硫酸塩によって変換されない。そこで、本実施の形態では、この重亜硫酸塩処理後の塩基配列の違いを利用して、後述するように、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化の有無を検出する。
【０１００】
次に、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程、すなわちＤＮＡ修飾法によるＳＨＰ１遺伝子のメチル化の確認について具体的に説明する。
【０１０１】
まず、遺伝子修飾段階として、造血器細胞を含む前記検体試料から得られた遺伝子試料を重亜硫酸塩で処理する。この段階では、上述したように、メチル化されていないシトシンのみがウラシルに変換されるので、例えば、それゆえ、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理すると、図２６に示すように、メチル化された（図中円で囲んだＭで示す）シトシンはシトシンのままで残存するが、メチル化されていないシトシンはウラシル（Ｕ）に変換される。
【０１０２】
上記遺伝子修飾段階で用いられる重亜硫酸塩としては、特に限定されるものではないが、例えば、重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５、メタ重亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムまたはピロ亜硫酸ナトリウムともいう）を好適に用いることができる。さらに、重亜硫酸化合物とともに尿素が併用されてもよい。
【０１０３】
次に、メチル化シトシン含有判定段階として、重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無を判定する。重亜硫酸塩処理物中のＳＨＰ１遺伝子にシトシンが含まれているということは、処理前のＳＨＰ１遺伝子には、メチル化されたシトシンが含まれていることになる。それゆえ、シトシンが存在すれば、元の検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれていることになる。
【０１０４】
上記メチル化シトシン含有判定段階で実施される、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無を判定する方法としては特に限定されるものではないが、具体的には、１）メチル化シトシンをＰＣＲにより検出する方法、２）メチル化シトシンを遺伝子の塩基配列の決定により検出する方法、または、３）メチル化シトシンを含む塩基配列を識別する方法のうち、少なくとも何れかの手法を好ましく用いることができる。
【０１０５】
より具体的には、まず、１）メチル化シトシンをＰＣＲにより検出する方法としては、メチル化特異的ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）を挙げることができる。
【０１０６】
上記メチル化特異的ＰＣＲ法は、メチル化されたＤＮＡに特異的でかつＣＧ配列を含む塩基配列をプライマーとして設定する。メチル化されたシトシンが存在していればＰＣＲにより増幅が可能となり、それゆえメチル化されたＳＨＰ１遺伝子を検出することができる。
【０１０７】
上記メチル化特異的ＰＣＲ法は、従来公知の方法（例えば、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ９８２１−９８２６， （１９９６） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。なお、ＤＮＡの精製過程ではエタノール沈澱法やＧｌａｓｓｂｅａｄｓ法を用いた方法等を用いることができ、また、蛍光ラベルしたプライマーを用いれば、ＰＣＲの検出を容易にすることができる。
【０１０８】
次に、２）遺伝子の塩基配列の決定によりメチル化シトシンを検出する方法、すなわちＳＨＰ１遺伝子のシークエンシングでは、ＣＧ配列を含まない領域にプライマーを設定しＰＣＲを実施する。得られるＰＣＲ産物の中には、メチル化をされているもの（ＣＧ配列のままで存在）とメチル化されていないもの（ＴＧ配列に変換されている）が含まれている可能性がある。これをシークエンシングすることにより、ＣＧ配列すなわちメチル化の存在を検討する。
【０１０９】
上記ＳＨＰ１遺伝子のシークエンシングも、従来公知の方法（例えば、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， １８２７−１８３１ （１９９２） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。なお、上記プライマーとしては、メチル化されたＤＮＡに特異的な配列（ＣＧ配列を含む）を有するプライマーを用いることも可能である。
【０１１０】
この方法もＰＣＲを用いているので、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することが可能である。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても高い検出感度で高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。また、シークエンシングを利用することにより具体的な配列を決定するので、メチル化の程度をより明確化することも可能となる。
【０１１１】
次に、３）シトシンを含む塩基配列を識別する方法としては、Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ法、重亜硫酸塩ＳＳＣＰ法、メチルライト法、蛍光溶解曲線分析法、ＣＯＢＲＡ法等を挙げることができる。
【０１１２】
上記Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法は、メチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施する方法である。ただし、プライマーに挟まれた領域でのメチル化の有無が判らないので、検出したいＣＧ配列に隣接するポリヌクレオチドを作成しＰＣＲ産物とアニールさせる。放射性同位元素の存在下でＤＮＡを合成した時に、３２Ｐ−ｄＣＴＰを取り込めば、そこはＣＧ配列であるためメチル化されているシトシンが存在することになる。一方、ＤＮＡを合成した時に、３２Ｐ−ｄＴＴＰを取り込めば、そこはＴＧ配列であるためメチル化はされていなかったことになる。
【０１１３】
上記Ｍｓ−ＳｎｕＰＥ法は、従来公知の方法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２５， ２５２９−２５３１， （１９９７） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【０１１４】
上記重亜硫酸塩ＳＳＣＰ（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ＳＳＣＰ）法も、メチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施する方法であるが、プライマーに挟まれた領域でのメチル化の有無が判らない。そこで、ＰＣＲ産物を１本鎖ＤＮＡに変性後、ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ）法を用いて電気泳動し、１本鎖ＤＮＡの移動度の違いから、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化の程度を判定する。
【０１１５】
上記重亜硫酸塩ＳＳＣＰ法も、従来公知の方法（例えば、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１， ９０４−９０８， （２０００） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。
【０１１６】
他に、メチルライト（Ｍｅｔｈｙｌ−ｌｉｇｈｔ）法や、蛍光溶解曲線分析（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭｅｌｔｉｎｇ Ｃｕｒｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）法等も挙げられる。これら方法も、何れもメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを実施する方法であるが、プライマーに挟まれた領域でのメチル化の有無が判らない。そこで、内側の調べたい領域について、メチル化特異的なポリヌクレオチドを作成し、このメチル化特異的ポリヌクレオチドが１本鎖にしたＰＣＲ産物とどの程度アニール（２本鎖重合）反応するかを検討することにより、上記ＰＣＲ産物中のメチル化の量を判定する。
【０１１７】
上記メチルライト法は、具体的には、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８（８）， Ｅ３２， （２０００） 等の文献に開示されている方法を、上記蛍光溶解曲線分析は、具体的には、例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７， １１８３−１１８９， （２００１） 等の文献に開示されている方法を好適に用いることができる。
【０１１８】
上述した各方法は、ＰＣＲを用いているので、検体試料から微量のＳＨＰ１遺伝子さえ得られれば、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することが可能である。そのため、検体試料中に造血器腫瘍細胞がごく微量しか存在していなくても高い検出感度で高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【０１１９】
上記ＣＯＢＲＡ法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ、あるいは、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ＰＣＲ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ等とも称される）では、例えば、ＣＧＣＧ配列がメチル化を受けていると、重亜硫酸処理後もＣＧＣＧ配列のままで残存するが、メチル化されていないとＴＧＴＧ配列に変換される。そこで、上記ＣＧＣＧ配列のみを切断する制限酵素等を利用することで、電気泳動ゲル上のバンドパターンを解析して、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化の有無を判定および定量化することができる。
【０１２０】
上記ＣＯＢＲＡ法も、従来公知の方法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５，２５３２−２５３４， （１９９７） 等の文献に開示されている方法）を好適に用いることができ、その具体的な工程や試薬類、条件等は特に限定されるものではない。勿論、この方法でもＰＣＲが用いられるので、上述したＰＣＲによる利点が得られるだけでなく、制限酵素処理と電気泳動とを用いるので、バンドパターンの解析さえ明確化しておれば、容易にＳＨＰ１遺伝子のメチル化を確認することができるという利点もある。
【０１２１】
このように、本実施の形態におけるＤＮＡ修飾法では、メチル化シトシン含有判定段階でＰＣＲを用いているが、このＰＣＲで用いるプライマーの設計方法について以下に説明する。
【０１２２】
上述したように、ＤＮＡを重亜硫酸塩処理するとシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンは変換されずに保存される。ここで、細胞内でメチル化を受ける可能性のあるシトシンは、５’配列側からＣＧと並ぶＣＧ配列（５’−ＣＧ−３’）のシトシン（Ｃ）のみである。そのため、重亜硫酸塩処理により、上記ＣＧ配列以外のシトシンは全てチミン（Ｔ）に変換されてしまう。そこで、全てのＣＧ配列がメチル化を受けたものとしてＳＨＰ１遺伝子の塩基配列を変換し、プライマーを設定する。なお、ＤＮＡ中のウラシルはチミンとして認識され、ＰＣＲによりチミンに置換されることになる。
【０１２３】
まず、プライマーを計画するＤＮＡ鎖に関する条件を設定する。ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列において、センス鎖またはアンチセンス鎖の何れも、上記ＣＧ配列のみがメチル化を受けたとして、その他の塩基配列におけるシトシンが全てチミンに変換された配列を想定する。
【０１２４】
具体的には、図２７〜図３６および配列番号５に示す塩基配列が、図１〜図１０および配列番号１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ（ワイルドタイプ）のセンス鎖に対応する、重亜硫酸塩処理後の塩基配列（以下、説明の便宜上、センス鎖変換配列とする）であり、図３７〜図４６および配列番号６に示す塩基配列が、図１１〜図２０および配列番号２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ（ワイルドタイプ）のアンチセンス鎖とするに対応する、重亜硫酸塩処理後の塩基配列（以下、説明の便宜上、アンチセンス鎖変換配列とする）である。これらセンス鎖変換配列とアンチセンス鎖変換配列とは、重亜硫酸塩処理により相補的ではなくなる。
【０１２５】
なお、図２７〜図３６および配列番号５、並びに、図３７〜図４６および配列番号６の塩基配列は、ＣＧ配列が１００％メチル化されていると想定した場合に、重亜硫酸塩処理を受けたものとしての塩基配列であり、実際には細胞中で１００％のメチル化が生じるとは考えられないため、本発明において検出し得る可能性としての塩基配列として例示する。
【０１２６】
そして、（Ｉ）上記センス鎖変換配列に対して、フォワードプライマー（ＦＷプライマー）およびリバースプライマー（ＲＶプライマー）を作成するか、あるいは、（ＩＩ）上記アンチセンス鎖変換配列に対して、ＦＷプライマーおよびＲＶプライマーを作成する。この場合、同じ場所でもプライマー配列はそれぞれ異なる。
【０１２７】
次に、プライマーを計画する領域に関する条件を設定する。（ｉ）メチル化されたＤＮＡのみを直接ＰＣＲで増幅するために、ＣＧ配列を含む塩基配列に対してプライマーを作成するか、（ｉｉ）メチル化されたもの、されていないものを区別なくＰＣＲで増幅するために、ＣＧ領域を含まない配列に対してプライマーを作成する。なお、（ｉｉ）の場合は、後でシークエンシングかその他の方法を実施し、メチル化を判定する。
【０１２８】
したがって、ＤＮＡ修飾法で用いられるプライマーの設計には、上記ＤＮＡ鎖に関する条件（Ｉ）および条件（ＩＩ）と、領域に関する条件（ｉ）および条件（ｉｉ）とを掛け合わせた４通りの設計方法がある。
【０１２９】
ここで、（ｉ）の場合、プライマーの場所が都合良くメチル化を受けていれば検出されるが、その場所ではなく近隣領域のみメチル化を受けているような場合には、メチル化が存在するのにも関わらず検出不可能となる。そこで、（ｉｉ）のように、メチル化の有無に関わらずＰＣＲで増幅後、各プライマーに囲まれた領域内のメチル化、すなわちＣＧ配列の有無を検定することで、確実にＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子のメチル化の判定には、検出用のプライマーの場所のみならず、遺伝子配列の情報そのものが重要となる。
【０１３０】
また、ＣＧ配列がメチル化されていないと、重亜硫酸塩処理によりＴＧ配列に変換されるが、このＴＧ配列を含む塩基配列に対して作成されるプライマー（Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）は、メチル化を受けていないＤＮＡの存在を証明するコントロールとして用いることができる。また、重亜硫酸塩処理が不十分な場合には、シトシンがウラシルに変換されていないワイルドタイプのＳＨＰ１遺伝子が混入することになる。そこで、重亜硫酸塩処理が十分完全になされたか否かのコントロールとして、ワイルドタイプの塩基配列を有するプライマー（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｐｒｉｍｅｒ）を用いることができる。
【０１３１】
なお、上述したメチル化シトシン含有判定段階では、ＰＣＲにより増幅された遺伝子の確認に、前記実施の形態１における遺伝子増幅量確認段階と同様の方法、例えば、電気泳動法を用いてマーカーと比較することにより遺伝子の増幅量を確認したり、さらに電気泳動後に得られたＤＮＡバンドをメンブレンにブロッティングしたりする手法が挙げられる。勿論、これら手法に限定されるものではなく、また、上記電気泳動法やブロッティングの方法についても従来公知の手法を好適に用いることができ、特に限定されるものではない。
【０１３２】
換言すれば、本実施の形態におけるＤＮＡ修飾法によるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程でも、前記実施の形態１における制限酵素確認法による場合と同様、遺伝子増幅量確認段階が含まれていても良い。
【０１３３】
次に、本実施の形態にかかる検出方法の好ましい一例について、より具体的に説明する。
【０１３４】
まず、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程により、前述した手法を用いて検体試料中に含まれるＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方を定量する。このプロセスで定量されたＳＨＰ１蛋白質が、標準よりも大幅に減少していたり、ほとんどＳＨＰ１遺伝子産物が発現していなかったりした場合には、検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれている可能性が高くなる。
【０１３５】
次に、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程で、前記ＤＮＡ修飾法により、検体試料から調製した遺伝子試料中のＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認する。具体的には、遺伝子修飾段階にて、例えば重亜硫酸ナトリウムを用いて、上記検体試料から得られた遺伝子試料をで処理する。
【０１３６】
次に、遺伝子増幅試行段階に移行するが、このステップでは、前述したプライマーの設計方法に基づいて、ＰＣＲ用のプライマーを設定する。
【０１３７】
具体的には、メチル化特異的ＰＣＲでは、図４７（ａ）に示すように、例えば、２３塩基対のワイルドタイプＤＮＡ（図中上がセンス鎖で下がアンチセンス鎖）を想定し、ワイルドタイプＤＮＡのＣＧ配列に１００％メチル化があるとする。この場合、重亜硫酸塩処理すると、図４７（ｂ）に示すように、センス鎖とアンチセンス鎖は相補的ではなくなる。そこで、図４７（ｃ）または（ｄ）に示すように、センス鎖またはアンチセンス鎖に対してＦＷプライマーおよびＲＶプライマーを作成する。
【０１３８】
なお、上記メチル化特定ＰＣＲにおいては、ＰＣＲ用プライマーとして、具体的には、例えば、後述する実施例４や実施例５に示すプライマーペアを用いる。上記のようなプライマーを用いて、重亜硫酸ナトリウムで処理された遺伝子試料に対してメチル化特異的ＰＣＲを実施し、例えば電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅量を確認する。
【０１３９】
このように、上記ＤＮＡ修飾法を用いれば、重亜硫酸塩を用いて検体試料から得られた遺伝子試料を処理すると、塩基配列中のシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化されたシトシンは変換されない。そのため、遺伝子修飾段階後のＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中にシトシンが含まれるか否かを判定するのみで、ＳＨＰ１遺伝子のメチル化を検出することができる。そのため、単純なメカニズムで迅速かつ高特異的に造血器腫瘍細胞を検出することが可能となる。
【０１４０】
次に、ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程により、前述した手法を用いて検体試料中に含まれるＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方を定量する。このプロセスで定量されたＳＨＰ１遺伝子産物が、標準よりも大幅に減少していたり、ほとんど発現していなかったりした場合には、検体試料中に造血器腫瘍細胞が含まれている可能性が高くなる。
【０１４１】
なお、本実施の形態で説明した上記検出方法には、前記実施の形態１の検出方法と同様に、他の工程（プロセス）や他の段階（ステップ）が含まれていてもよいことは言うまでも無い。
【０１４２】
本発明には、上述した造血器腫瘍細胞検出方法だけでなく、該検出方法を実施するための検出キットが含まれる。具体的には、遺伝子処理レベルまで精製された重亜硫酸塩と前記プライマー、および前記ＳＨＰ１抗体を含む構成を挙げることができる。つまり、本発明にかかる検出キットでは、上記重亜硫酸塩、プライマー、およびＳＨＰ１抗体を、（１）上記ＳＨＰ１抗体、（２）重亜硫酸塩と、該重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無の判定用プライマー、および（３）配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーに分けた場合、（１）、（２）および（３）のうち、少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。
【０１４３】
さらに、上記検出キットには、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部と相同性を持つノーザンブロッティング用プローブ、または、シトシンを含む塩基配列を認識する制限酵素およびＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性及びメチル化陰性対照ＤＮＡを用いた電気泳動用マーカーが含まれていてもよく、さらには、ヌクレオチドモノマー、ポリメラーゼ、バッファー等のＰＣＲ反応用試薬、および、バッファー等の制限酵素反応用試薬の少なくとも一方が含まれていてもよい。
【０１４４】
より具体的に、各工程または段階ごとに用いられる試薬等について説明する。まず、遺伝子産物定量工程では、前記実施の形態１で例に挙げたものと同様であるのでその説明は省略する。
【０１４５】
次に、本実施の形態におけるＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程では、重亜硫酸塩処理によりメチル化を確認するため、まず、遺伝子修飾段階にて、各種重亜硫酸塩等の試薬が少なくとも用いられる。次に、メチル化シトシン含有判定段階では、メチル化シトシンをＰＣＲにより検出する方法を用いる場合には、メチル化配列特異的プライマー、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応試薬が少なくとも用いられる。また、遺伝子の塩基配列の決定によりメチル化シトシンを検出する方法、あるいはシトシンを含む塩基配列を認識する方法では、各具体的な方法に応じて公知の試薬類を用いる。
【０１４６】
このように、本実施の形態にかかる検出キットでも、前記実施の形態１の検出キットと同様、前述した造血器腫瘍細胞検出方法を実施するために好ましい薬剤や標本等が含まれている。そのため、上記検出キットを用いることで、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法を容易かつ簡素に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。
【０１４７】
なお、本発明は、上述した各実施の形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても、本発明の技術的範囲に含まれることはいうまでもない。
【０１４８】
【実施例】
以下、図４８ないし図５２に基づいて、本発明の具体的な実施例について説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１４９】
〔実施例１〕
ナチュラルキラー細胞リンパ腫を含む検体試料を用い、Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６，４３５０，（１９７９）に開示されている方法にしたがってウエスタンブロッティングを実施した。なお、ＳＨＰ１抗体として＃ＳＨ−ＰＴＰ１（Ｄ−１１）：ｓｃ７２８９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製）を用いた（ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程・蛋白質定量法）。
【０１５０】
その後、ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程に移行した。まず、メチル化感受性制限酵素としてＨｐａＩＩを用いて、上記検体試料から調製した遺伝子試料を３７℃４時間で処理した（遺伝子切断試行段階）。
【０１５１】
次に、ＨｐａＩＩで処理した遺伝子試料をＰＣＲで増幅した（遺伝子増幅試行段階）。このとき用いたプラーマ−ペアは、配列番号７および図４８（ａ）に示す１９塩基のプライマーＲＥＰ−Ｓ１と、配列番号８および図４８（ｂ）に示す２０塩基のプライマーＲＥＰ−ＡＳ１との組み合わせとした。このプライマーペアを用いた場合、配列番号９および図４８（ｃ）に示すように、ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖の配列（配列番号１および図１〜図１０参照）における、７４４１塩基から７５６６塩基までの１２６塩基の塩基配列が検出される。
【０１５２】
なお、図４８（ｃ）におけるカッコ内の「＃（番号）」は、上記ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖における塩基の位置を示しており、下線部はプライマーＲＥＰ−Ｓ１およびＲＥＰ−ＡＳ１の対応位置、並びにＨｐａＩＩの認識切断部位の位置を示している。また、プライマーＲＥＰ−ＡＳ１は、上記ＲＥＰ−ＡＳ１の下線部の領域におけるアンチセンス鎖の配列に対してデザインされたものである。
【０１５３】
その後、アガロースゲルで電気泳動してから、得られたＤＮＡバンドをナイロンメンブレンにブロッティングしてＳＨＰ１遺伝子の増幅を確認した（遺伝子増幅量確認工程）。
【０１５４】
次に、Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６，４３５０，（１９７９）に開示されている方法にしたがってウエスタンブロッティングを実施した。なお、ＳＨＰ１抗体として＃ＳＨ−ＰＴＰ１（Ｄ−１１）：ｓｃ７２８９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．製）を用いた（ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程・蛋白質定量法）。
【０１５５】
上記ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程とＳＨＰ１遺伝子産物定量工程との結果から検体試料中の造血器腫瘍細胞を検出した。
【０１５６】
〔実施例２〕
遺伝子増幅試行段階で、プライマーペアとして、配列番号１０および図４９（ａ）に示す２１塩基のプライマーＲＥＰ−Ｓ２と、配列番号１１および図４９（ｂ）に示す２１塩基のプライマーＲＥＰ−ＡＳ２との組み合わせを用いた以外は、前記実施例１と同様にして検体試料中の造血器腫瘍細胞の有無を検出した。
【０１５７】
上記プライマーペアを用いた場合、配列番号１２および図４９（ｃ）に示すように、ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖の配列（配列番号１および図１〜図１０参照）における、６８５８塩基から７０８４塩基までの２２７塩基の塩基配列を検出することができる。
【０１５８】
なお、図４９（ｃ）におけるカッコ内の「＃（番号）」も、上記ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖における塩基の位置を示しており、下線部はプライマーＲＥＰ−Ｓ２およびＲＥＰ−ＡＳ２の対応位置、並びにＨｐａＩＩの認識切断部位の位置を示している。また、プライマーＲＥＰ−ＡＳ２は、上記ＲＥＰ−ＡＳ２の下線部の領域におけるアンチセンス鎖の配列に対してデザインされたものである。
【０１５９】
〔実施例３〕
ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ定量法を用いてＳＨＰ１遺伝子産物定量工程を実施した以外は、前記実施例１と同様にして検体試料中の造血器腫瘍細胞の有無を検討した。
【０１６０】
すなわち、前記検体試料から全細胞内のＲＮＡを調製してから逆転写酵素により逆転写した。その後、ＳＨＰ１特異的プライマーペアを用いてＰＣＲにより増幅した。上記ＳＨＰ１特異的プライマーペアとしては、配列番号１３および図５０（ａ）に示す２３塩基のプライマーＳＨＰ−ＰＦ１と、配列番号１４および図５０（ｂ）に示す２５塩基のプライマーＳＨＰ−ＰＲ１との組み合わせを用いた。
【０１６１】
〔実施例４〕
ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ定量法を用いてＳＨＰ１遺伝子産物定量工程を実施した以外は、前記実施例３（すなわち前記実施例１）と同様にして検体試料中の造血器腫瘍細胞の有無を検討した。上記ＳＨＰ１特異的プライマーペアとしては、配列番号１５および図５１（ａ）に示す２０塩基のプライマーＳＨＰ−ＬＦ１と、配列番号１６および図５１（ｂ）に示す２０塩基のプライマーＳＨＰ−ＬＲ１を用いた。
【０１６２】
〔実施例５〕
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ９８２１−９８２６， （１９９６） に開示されている方法にしたがってメチル化特異的ＰＣＲを用いてＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程を実施した以外は、前記実施例１と同様にして検体試料中の造血器腫瘍細胞の有無を検討した。なお、重亜硫酸塩としては、重亜硫酸ナトリウムを用いた。
【０１６３】
また、上記メチル化特異的ＰＣＲにおけるプライマーペアとしては、配列番号１７および図５２（ａ）に示す２４塩基のプライマーＭＦ２と、配列番号１８および図５２（ｂ）に示す２１塩基のプライマーＭＲ２との組み合わせを用いることができる。このプライマーペアを用いた場合、配列番号１９および図５２（ｃ）に示すように、ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖の配列（配列番号１および図１〜図１０参照）における、７０３７塩基から７１９５塩基までの１５９塩基の塩基配列を検出することができる。
【０１６４】
なお、図５２（ｃ）におけるカッコ内の「＃（番号）」は、上記ＳＨＰ１遺伝子のセンス鎖における塩基の位置を示しており、下線部はプライマーＭＦ２およびＭＲ２の対応位置を示している。ただし、上記各プライマーはメチル化されているＤＮＡのみを検出できるように設計されているので、その塩基配列は、上記下線部の塩基配列とは少し異なっている。また、プライマーＭＲ２は、上記ＭＲ２の下線部の領域におけるアンチセンス鎖の配列に対してデザインされたものである。
【０１６５】
〔実施例６〕
検体試料として、診断用の骨髄（ＢＭ）検体と、ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）患者の末梢血（ＰＢ）検体とを用いた。ＡＬＬ患者から得られたＢＭ検体は少なくとも７０％の比で芽細胞を含んでいた。また、これら検体試料に対する対照試料は、化学療法によって達成された血液学的完全寛解の後に得られた。
【０１６６】
上記検体試料を用いてマイクロサテライト解析を行った。このときのＰＣＲ反応では、５’側のプライマーを、５’−ｉｏｄｏａｃａｔａｍｉｄｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルし、反応系は、１０ｐｍｏｌのそれぞれのプライマー、４０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１×ＰＣＲバッファー、２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰと、０．５ｕｎｉｔのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む２０μｌの系とした。得られたＰＣＲ産物は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１００ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）にかけ、Ｇｅｎｅｓｃａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ ３．７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析を行った。
【０１６７】
その結果、図５３（ａ）・（ｂ）に示すように、Ｄ１２Ｓ３３６マーカーおよびＤ１２Ｓ３５６マーカーによってＳＨＰ１遺伝子のＬＯＨの有無を確認できることがわかった。本実施例の結果では、これらマーカーのうちテロメア側のＤ１２Ｓ３５６マーカーでは、有意な結果が得られた１９症例中１５例（７９％）にＬＯＨが認められた。また、セントロメア側のＤ１２Ｓ３３６マーカーでは、１６症例中６例（３８％）にＬＯＨが認められた。
【０１６８】
上記何れの実施例の結果も、検体試料から十分に造血器腫瘍細胞を検出することができた。それゆえ、本発明は、複数の診断手法を併用しなくても造血器腫瘍細胞を容易かつ迅速に検出することができることがわかった。
【０１６９】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法は、造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なＳＨＰ１蛋白質およびそのｍＲＮＡの少なくとも一方を定量するＳＨＰ１遺伝子産物定量工程と、上記検体試料から得られる、上記ＳＨＰ１蛋白質をコードするＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認するＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程と、上記検体試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失（ＬＯＨ）の有無を確認するＳＨＰ１遺伝子ＬＯＨ確認工程とを含む方法である。
【０１７０】
また、本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出キットの好ましい一例としては、（１）造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体、および（２）シトシンを含む塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素と、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識される塩基配列を含む領域を増幅するＰＣＲ用のプライマーと、上記ＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性及びメチル化陰性対照ＤＮＡとのうち、少なくとも一方を含む構成か、あるいは、（１）造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体、（２）遺伝子処理レベルまで精製された重亜硫酸塩と、該重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無の判定用プライマー、および（３）配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーのうち、少なくとも何れか一つを含む構成か、または、造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子を挟み込む２つのマイクロサテライト・マーカーの少なくとも一方の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーを含む構成を挙げることができる。
【０１７１】
本発明の方法または構成によれば、ＳＨＰ１遺伝子の発現を、遺伝子ＤＮＡの修飾とｍＲＮＡと蛋白質と対立遺伝子の喪失という最大で四重のマーカーを用いて判定できることになる。すなわち、ＳＨＰ１遺伝子の発現低下という一つの造血器腫瘍細胞特異的な現象を４段階で確認することができるため、非常に高い特異性で造血器腫瘍細胞を検出することができる。よって、本発明を用いることで、造血器細胞を含む微量の検体試料から造血器腫瘍細胞を容易かつ迅速に検出することができる。
【０１７２】
それゆえ、本発明における悪性リンパ腫・白血病の高感度検出法を用いると、一般集団検診による造血器腫瘍の早期発見、診断および治療後のモニタリングや再発の早期発見が可能になり、これら疾患を発症した家族等血縁者における発症危険度の予測等に本発明を利用することも可能となる。その結果、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となるという効果を奏する。
【０１７３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子ゲノムＤＮＡのセンス鎖の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図２】図１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３】図１・図２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４】図１〜図３に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図５】図１〜図４に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図６】図１〜図５に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図７】図１〜図６に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図８】図１〜図７に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図９】図１〜図８に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１０】図１〜図９に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１１】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図１２】図１１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１３】図１１・図１２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１４】図１１〜図１３に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１５】図１１〜図１４に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１６】図１１〜図１５に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１７】図１１〜図１６に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１８】図１１〜図１７に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図１９】図１１〜図１８に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図２０】図１１〜図１９に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図２１】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示す塩基配列図である。
【図２２】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１蛋白質の概略構造を示す模式図である。
【図２３】図２２に示すＳＨＰ１蛋白質のアミノ酸配列を示すアミノ酸配列図である。
【図２４】図１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡ（センス鎖）において、ＣｐＧ島でメチル化されるＣＧ配列の部位を示す塩基配列図である。
【図２５】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられる重亜硫酸処理にて、シトシンがウラシルに変換される過程を示す化学反応説明図である。
【図２６】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられる重亜硫酸処理により、シトシンがウラシルへ変換され、メチル化されたシトシンが変換されない状態を示す模式図である。
【図２７】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子ゲノムＤＮＡのセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図２８】図２７に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図２９】図２７・２８に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３０】図２７〜図２９に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３１】図２７〜図３０に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３２】図２７〜図３１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３３】図２７〜図３２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３４】図２７〜図３３に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３５】図２７〜図３４に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３６】図２７〜図３５に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３７】本発明にかかる造血器腫瘍細胞検出方法で用いられるＳＨＰ１遺伝子ゲノムＤＮＡのアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図３８】図３７に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図３９】図３７・図３８に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４０】図３７〜図３９に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４１】図３７〜図４０に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４２】図３７〜図４１に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４３】図３７〜図４２に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４４】図３７〜図４３に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４５】図３７〜図４４に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４６】図３７〜図４５に示すＳＨＰ１遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるアンチセンス鎖に対して、重亜硫酸塩処理した後の塩基配列の続きを示す配列図である。
【図４７】（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ本発明で用いられるメチル化特異的ＰＣＲのステップを示す模式図である。
【図４８】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例１において用いられるＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図であり、（ｃ）は、（ａ）・（ｂ）で用いられるＰＣＲ用プライマーが認識するＳＨＰ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ・センス鎖）の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図４９】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例２において用いられるＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図であり、（ｃ）は、（ａ）・（ｂ）で用いられるＰＣＲ用プライマーが認識するＳＨＰ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ・センス鎖）の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図５０】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例３において用いられるＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図である。
【図５１】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例４において用いられるｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図である。
【図５２】（ａ）・（ｂ）は、本発明の実施の一例である実施例５において用いられるメチル化特異的ＰＣＲ用プライマーを示す塩基配列図であり、（ｃ）は、（ａ）・（ｂ）で用いられるメチル化特異的ＰＣＲ用プライマーが認識するＳＨＰ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ・センス鎖）の塩基配列を示す塩基配列図である。
【図５３】（ａ）は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を示す図であり、（ｂ）は、ＡＬＬ患者におけるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失の解析結果の一つの典型的なデータを示す図である。
Claims (17)
- （１）造血器細胞を含む検体試料中に含まれる、造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれるＣｐＧ島のメチル化を確認するＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程、
（２）上記検体試料から得られるＳＨＰ１蛋白質およびＳＨＰ１ｍＲＮＡの少なくとも一方の発現量を定量するＳＨＰ１遺伝子産物定量工程、および、
（３）上記検体試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の異型接合性喪失（ＬＯＨ）の有無を確認するＳＨＰ１遺伝子ＬＯＨ確認工程、
の少なくとも何れかを含むことを特徴とする造血器腫瘍細胞検出方法。 - 上記ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程には、
上記検体試料から得られた遺伝子試料を、シトシンを含む塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素で処理する遺伝子切断試行段階と、
上記メチル化感受性制限酵素で処理された遺伝子に対して、上記ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識切断される塩基配列を含む領域を増幅するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を実施する遺伝子増幅試行段階と、
増幅された特定のサイズの遺伝子の量を確認する遺伝子増幅量確認段階とが含まれることを特徴とする請求項１に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。 - 上記プライマーが、さらに、配列番号１または２に示す塩基配列に含まれる部分塩基配列、またはこの部分塩基配列と相補性を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 上記遺伝子増幅量確認段階では、電気泳動法を用いて特定サイズの遺伝子の量を確認することを特徴とする請求項２または３に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 上記遺伝子切断試行段階では、制限酵素として、メチル化感受性制限酵素を用いることを特徴とする請求項２、３または４に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 上記ＳＨＰ１遺伝子メチル化確認工程には、
上記検体試料から得られる遺伝子試料を、重亜硫酸塩で処理する遺伝子修飾段階と、
重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれる、ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のメチル化シトシンの有無を判定するメチル化シトシン含有判定段階とが含まれることを特徴とする請求項１に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。 - 上記メチル化シトシン含有判定段階では、ＰＣＲによりメチル化シトシンを検出する方法、遺伝子の塩基配列の決定によりメチル化シトシンを検出する方法、またはメチル化シトシンを含む塩基配列を識別する方法のうち、少なくとも何れかが用いられることを特徴とする請求項６に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 上記遺伝子修飾段階では、重亜硫酸塩として、重亜硫酸ナトリウムが用いられることを特徴とする請求項６または７に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、ＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体を用いてＳＨＰ１蛋白質を定量することを特徴とする請求項１ないし８の何れか１項に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、酵素抗体法またはウエスタンブロッティング法によりＳＨＰ１蛋白質が定量されることを特徴とする請求項９に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部を検出するポリヌクレオチドを用いてＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出することにより、ＳＨＰ１ｍＲＮＡを定量することを特徴とする請求項１ないし８の何れか１項に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 上記ＳＨＰ１遺伝子産物定量工程では、ノーザンブロッティング法、逆転写ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、またはＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によりＳＨＰ１遺伝子のｍＲＮＡの発現が検出されることを特徴とする請求項１１に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 異型接合性喪失の有無の確認は、上記ＳＨＰ１遺伝子を挟み込む２つのマイクロサテライト・マーカーの少なくとも一方、または、上記ＳＨＰ遺伝子中か、その近辺に存在する単一塩基多型のような遺伝子多型を、ＰＣＲを用いたフラグメント解析により実施されることを特徴とする請求項１ないし１２の何れか１項に記載の造血器腫瘍細胞検出方法。
- 造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、
（１）造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体、および
（２）シトシンを含む塩基配列を認識するメチル化感受性制限酵素と、
ＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中に含まれ、上記メチル化感受性制限酵素に認識される塩基配列を含む領域を増幅するＰＣＲ用のプライマーと、上記ＳＨＰ１遺伝子のメチル化陽性及びメチル化陰性対照ＤＮＡとのうち、少なくとも一方を含むことを特徴とする造血器腫瘍細胞検出キット。 - 造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、
（１）造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１蛋白質を抗原とするＳＨＰ１抗体、
（２）遺伝子処理レベルまで精製された重亜硫酸塩と、該重亜硫酸塩で処理された遺伝子試料に含まれるＳＨＰ１遺伝子の塩基配列中のシトシンの有無の判定用プライマー、および
（３）配列番号３に示すＳＨＰ１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーのうち、少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする造血器腫瘍細胞検出キット。 - 造血器細胞を含む検体試料から造血器腫瘍細胞を検出するために用いられ、
造血器細胞に特異的なプロテインチロシンホスファターゼＳＨＰ１遺伝子を挟み込む２つのマイクロサテライト・マーカーの少なくとも一方の全長またはその一部を検出するＰＣＲ用のプライマーを含むことを特徴とする造血器腫瘍細胞検出キット。 - さらに、ＰＣＲ用試薬、および、制限酵素反応用試薬の少なくとも一方を含むことを特徴とする請求項１４、１５または１６に記載の造血器腫瘍細胞検出キット。
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