WO2005087268A1 - 軸索再生促進剤 - Google Patents

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Toshihide Yamashita
Katsuhiko Hata
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Bioclues, Inc
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to an axon regeneration-promoting agent that can promote the regeneration of axons of nerve cells, particularly nerve cells of the central nervous system.
  • Non-Patent Document 1 Since the axons of the adult central nervous system can regenerate through the graft of peripheral nerves (Non-Patent Document 1), the main reason that the adult central nervous system does not regenerate is that It is suggested that there is a natural environment. To date, Nogo, myelin-binding glycoprotein (MAG), and oligodendrocyte-myelin glycoprotein (OMgp) have been identified as three major inhibitors of central nervous system regeneration. Nogo was identified as a corresponding antigen of the monoclonal antibody IN-1 (Non-patent Documents 2-4).
  • MAG myelin-binding glycoprotein
  • OMgp oligodendrocyte-myelin glycoprotein
  • Non-Patent Documents 5-8 which is known to play an important role in the formation and maintenance of the myelin sheath, was found to inhibit the growth of certain axon-like axons (Non-Patent Documents 9, 10).
  • OMgp Non Patent Literature 11
  • Nogo, MAG and OMgp are known to bind to NgR using p75 as a co-receptor, suggesting that they share a common signal transduction pathway (Non-patent Literature). 14-1 17).
  • Non-Patent Documents 18-22 Furthermore, it has been reported that even when a functional p75NTR was killed or soluble p75N-Fc was administered, regeneration of a damaged spinal cord was not promoted (Non-Patent Document 23).
  • Non-Patent Document 1 S. David, A.J.Aguayo, Science 214, 931-3 (Nov 20, 1981).
  • Non-Patent Document 2 M. S. Chen et al., Nature 403, 434-9 (Jan 27, 2000).
  • Non-Patent Document 3 T. GrandPre, F. Nakamura, T. Vartanian, S. M.
  • Non-Patent Document 4 p. Caroni, ME Schwab, Neuron 1, 85-96 (Mar, 1988).
  • Non-Patent Document 5 S. Carenini, D. Montag, H. Cremer, M. Schachner, R. Martini, Cell Tissue Res 287, 3-9 (Jan, 1997).
  • Non-patent document 7 N. Fujita et al, J Neurosci 18, 1970-8 (Mar 15, 1998).
  • Non-patent document 8 J. Marcus, JL Dupree, B. Popko, J Cell Biol 156, 567- 77 (Feb 4, 2002).
  • Non-Patent Document 9 G. Mukhopadhyay, P. Doherty, F.S.Walsh, P.R.
  • Non-Patent Document 10 and McKerracher et al "Neuron 13, 805-11 (Oct, 1994).
  • Non-Patent Document 11 D.D.Mikol, K. Stefansson, J Cell Biol 106, 1273-9 (Apr, 1988).
  • Non-Patent Document 12 V. Kottis et al., J Neurochem 82, 1566-9 (Sep, 2002).
  • Non-Patent Document 13 K. C. Wang et al., Nature 417, 941-4 (Jun 27, 2002).
  • Non-Patent Document 15 M. Domeniconi et al., Neuron 35, 283-90 (Jul 18, 2002).
  • Non-Patent Document 16 A. E. Fournier, T. GrandPre, S. M. Strittmatter,
  • Non-Patent Document 17 T. Yamashita, ⁇ . Higuchi, ⁇ . Tohyama, J Cell Biol 157, 565-70 (May 13, 2002).
  • Non-Patent Document 18 U. Bartsch et al., Neuron 15, 1375-81 (Dec, 1995).
  • Non-Patent Document 20 J. E. Kim, S. Li, T. GrandPre, D. Qiu, S. M.
  • Non-Patent Document 21 B. Zheng et al., Neuron 38, 213-24 (Apr 24, 2003).
  • Non-Patent Document 22 M. Simonen et al., Neuron 38, 201-11 (Apr 24, 2003).
  • Non-Patent Document 23 X. Song et al., J Neurosci 24, 542-6 (Jan 14, 2004).
  • Non-Patent Document 24 P.P.Monnier et al., Nature 419, 392-5 (Sep 26, 2002).
  • Non-Patent Document 25 B. K. Muller, D. G. Jay, F. Bonhoeffer, Curr Biol 6, 1497-502 (Nov 1, 1996).
  • Non-Patent Document 26 C. J. Woolf, S. Bloechlinger, Science 297, 1132-4 (Aug 16, 2002).
  • Non-Patent Document 27 B. Niederost, T. Oertle, J. Fritsche, R. A. McKinney, C. E. Bandtlow, J Neurosci 22, 10368-76 (Dec 1, 2002).
  • Non-Patent Document 28 M. Lehmann et al., J Neurosci 19, 7537-47 (Sep 1, 1999).
  • Non-Patent Document 29 P. Dergham et al., J Neurosci 22, 6570-7 (Aug 1, 2002).
  • Non-Patent Document 30 P.P.Monnier, A. Sierra, J.M.Schwab, S.
  • Non-Patent Document 31 M. Uehata et al., Nature 389, 990-4 (Oct 30, 1997).
  • Non-Patent Document 32 AA Habib et al, J Neurochem 70, 1704-11 (Apr, 1998).
  • Non-Patent Document 33 H. Liu, C.E.Ng, B.L.Tang, Neurosci Lett 328, 257-60 (Aug 16, 2002).
  • Non-Patent Document 34 A. B. Huber, O. Weinmann, C. Brosamle, T. Oertle, ME Schwab, J Neurosci 22, 3553-67 (May 1, 2002).
  • Non-Patent Document 35 D. Hunt, R.S.Coffin, P.N.Anderson, J Neurocytol 31, 93-120 (Feb, 2002).
  • Non-Patent Document 36 L. L. Jones, Y. Yamaguchi, W.B.Stallcup, M.H.Tuszynski, J Neurosci 22, 2792-803 (Apr 1, 2002).
  • Non-Patent Document 37 J. w.Fawcett, R.A.Asher, Brain Res Bull 49, 377-91 (Aug, 1999).
  • An object of the present invention is to provide a novel axon regeneration-promoting agent that can promote regeneration of central axons.
  • RGM retinal lid protrusions in chicken fetuses
  • RGM-like protein inhibitor such as an anti-RGM-like protein antibody or Y27632
  • the present invention provides an axon regeneration promoter containing an RGM-like protein inhibitor as an active ingredient.
  • said RGM-like protein inhibitor is an anti-RGM-like protein. It is a protein antibody.
  • the RGM-like protein inhibitor is Y27632.
  • the axon is a central nervous system axon.
  • the present invention relates to a method for identifying a candidate substance for promoting axonal regeneration, comprising: contacting a test substance with an RGM-like protein; A method comprising determining whether or not the ability inhibits the function of the above.
  • axon regeneration-promoting agent capable of promoting regeneration of central axons.
  • the axon regeneration-promoting agent of the present invention is effective for regeneration of axons of the central nervous system, and is expected to greatly contribute to the treatment of patients suffering from damage to the central nervous system such as the spinal cord.
  • SEQ ID NOS: 1 and 2 show the nucleotide sequence of the human RGM-like protein gene and the amino acid sequence encoded thereby.
  • the RGM-like protein has an activity of inhibiting axonal growth, and its expression increases when the spinal cord is damaged. Furthermore, in the following examples, it was confirmed that the inhibition of axonal growth by the RGM-like protein was not observed when the anti-RGM-like protein antibody was allowed to act on -euron. Therefore, substances that neutralize the axonal growth inhibitory activity of RGM-like proteins, such as anti-RGM-like protein antibodies, can be used as axonal regeneration promoters.
  • the axon regeneration promoter of the present invention contains an RGM-like protein inhibitor as an active ingredient.
  • RGM-like protein inhibitor means a substance that eliminates or at least significantly reduces the axonal growth inhibitory activity of RGM-like protein.
  • the axonal growth inhibitory activity of the RGM-like protein can be examined as described in the Examples below.
  • Particularly preferred as the RGM-like protein inhibitor of the present invention is an anti-RGM-like protein antibody.
  • anti-RGM-like protein antibody means an antibody capable of binding to an RGM-like protein by an antigen-antibody reaction.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • a polyclonal antibody that binds to an RGM-like protein can be used to immunize an animal using the RGM-like protein as a sensitizing antigen and obtain its serum power according to a method well known in the art.
  • Monoclonal antibodies that bind to the RGM-like protein can be obtained by immunizing an animal using the RGM-like protein as a sensitizing antigen, extracting the resulting immunocytes, and fusing with the myeloma cells according to methods well known in the art.
  • the antibody can be obtained by closing a hybridoma producing an antibody and culturing the hybridoma.
  • the monoclonal antibody of the present invention includes a recombinant antibody, a chimeric antibody, a CDR-grafted antibody produced by a transformant obtained by transforming an antibody produced by a hybridoma into an expression vector containing an antibody gene. Antibodies and fragments of these antibodies are included.
  • the recombinant antibody is obtained by cloning cDNA encoding the antibody from a hybridoma producing an anti-RGM-like protein antibody, inserting the cDNA into an expression vector, and transforming animal cells, plant cells, and the like. It can be produced by culturing a transformant.
  • a chimeric antibody is an antibody composed of the heavy and light chain variable regions of an antibody derived from one animal, and the heavy and light chain constant regions of an antibody derived from another animal.
  • Antibody fragments that can bind to RGM-like proteins include Fab, F (ab ') 2, Fab', scFv, diabodies, and the like.
  • Cells that produce antibodies that bind to the RGM-like protein can be obtained by methods well known in the art.
  • the animal is immunized using the RGM-like protein as a sensitizing antigen, and the obtained immune cells are removed and fused with myeloma cells, and the antibody-producing hybridoma is cloned. More specifically, first, an RGM-like protein serving as an antigen is produced. Since the commercially available brain cDNA library contains cDNA for the RGM-like protein, this gene can be easily obtained by PCR using the commercially available brain cDNA library as type III. An amplification product can be obtained, and this gene can be inserted into a suitable vector to produce an RGM-like protein recombinantly.
  • the RGM-like protein thus produced is administered subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to the animal as an antigen.
  • mammals such as mice, rats, horses, musters, egrets, and goats can be used.
  • the antigen is administered with an appropriate adjuvant, such as the ability to bind the antigen to the carrier protein and Freund's complete adjuvant.
  • a partial peptide of an RGM-like protein may be used as an antigen.
  • partial peptides from the 309th amino acid residue (hereinafter, referred to as “309aa”) to 322aa of the rat RGM-like protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 When chemically synthesized and used as an immunogen, it was found that a polyclonal antibody against this partial peptide had an activity to neutralize the axonal growth inhibitory activity of the RGM-like protein. Therefore, a neutralizing antibody against human RGM-like protein can be obtained using a polypeptide containing the corresponding region of the human gene as an immunogen.
  • Antigen is administered several times every 13 weeks.
  • the antibody titer is monitored by measuring the amount of immunoglobulin in the serum by ELISA or the like. After the antibody titer has risen sufficiently, the immune cells are removed from the animal. Preferably, spleen cells are used as immune cells.
  • Antibody-producing immune cells are fused with myeloma cells derived from the same mammal to produce hybridomas. Various myeloma cell lines suitable for producing hybridomas are commercially available. Fusion is performed according to methods well known in the art, for example, in the presence of PEG, and the fused cells are selected in HAT medium.
  • the culture supernatant is assayed by ELISA or other method to select hybridomas that produce antibodies that bind to the antigen.
  • hybridomas producing the desired antibody can be cloned by limiting dilution.
  • the obtained monoclonal antibody produced by the hybridoma is subjected to the axon growth assay described in the following example, and a hybridoma having an activity to neutralize the axonal growth inhibitory activity of the RGM-like protein is selected. Can be.
  • Monoclonal antibodies were obtained from the supernatant of the culture obtained by culturing the monoclonal antibody-producing cells, or from a mouse pretreated with 2,4,10,14-tetramethylpentadecane.
  • a mouse can be produced by intraperitoneally injecting a mouse with monoclonal antibody-producing cells, collecting ascites from the mouse 7 to 10 days after inoculation, centrifuging, and collecting the supernatant.
  • the monoclonal antibody can be purified by a conventional protein purification method such as salting out, ultrafiltration, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and HPLC. Preferably, affinity chromatography using a protein A column is performed.
  • the subclass of the purified monoclonal antibody can be determined by typing using a commercially available mouse monoclonal antibody isotyping kit.
  • the nucleotide sequence of the antibody gene encoding the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by analyzing the gene of the obtained monoclonal antibody-producing cell. Extract the total RNA from the monoclonal antibody-producing cells, use this as type II, and prepare a cDNA fragment using reverse transcriptase. Next, the V region of the antibody gene is amplified by PCR using appropriately designed primers, and the cDNA base sequence of this region is determined.
  • the specificity of the binding of the monoclonal antibody of the present invention can be confirmed using a method known in the art such as ELISA, RIA, immuno thin layer chromatography, BIAcore, and a fluorescent antibody method.
  • a two-fold dilution series of the monoclonal antibody of the present invention is added to a microplate on which the RGM-like protein is immobilized, incubated, then an enzyme-labeled secondary antibody is added, a substrate is added, and color is developed. Measure the absorbance.
  • a recombinant antibody can be produced by genetic recombination technology.
  • a gene encoding the antibody of the present invention is incorporated into an appropriate expression vector, and then introduced into host cells.
  • Escherichia coli, yeast, mammalian cells, insect cells, plant cells, and the like can be used as host cells, and mammalian cells, for example, CHO, COS, and BHK are particularly preferable.
  • Introduction of vectors into host cells is an example.
  • a method such as a calcium chloride method, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic liposome DOTAP (manufactured by Boehringer Mannheim), an electoral poration method, and a riboflex method.
  • a method such as a calcium chloride method, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using a cationic liposome DOTAP (manufactured by Boehringer Mannheim), an electoral poration method, and a riboflex method.
  • a chimeric antibody also comprises the heavy and light chain variable regions of an antibody derived from one animal (eg, a mouse) and the heavy and light chain constant regions of an antibody derived from another animal (eg, a human).
  • Chimeric antibodies can be obtained by cloning the cDNAs encoding the heavy and light variable regions of the antibody from a hybridoma producing a monoclonal antibody that binds to the RGM-like protein, while cloning antibodies derived from other animals. Recombinant production by cloning cDNAs encoding the heavy and light chain constant regions, inserting these in combination into an appropriate expression vector, and expressing in host cells. Can be.
  • CDR-grafted antibodies are antibodies in which the complementarity-determining regions (CDRs) of an antibody from one animal (eg, a mouse) are transplanted into the complementarity-determining regions of an antibody from another animal (eg, a human).
  • the genes encoding the CDR-grafted antibody are based on the gene sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of the hybridoma antibody producing a monoclonal antibody that binds to the RGM-like protein. Design the gene sequences encoding,, and 3 and replace the corresponding CDR1, 2, and 3 sequences in the vector containing the genes encoding the heavy and light chain variable regions of antibodies from other animals Can be obtained.
  • a CDR-grafted antibody can be produced recombinantly.
  • Antibody fragments such as Fab, F (ab ') 2, Fab', scFv, and diabody that can bind to the RGM-like protein can be obtained by combining the above-described anti-RGM-like protein monoclonal antibody of the present invention with papain or tripe. It can be produced by treating with an enzyme such as syn or the like, or introducing an expression vector into which a gene encoding these has been incorporated into a host cell to obtain a transformant.
  • Y27632 (Non-patent Document 31), which is known as a serine / threonine kinase Rho kinase inhibitor.
  • Y27632 had an activity to neutralize the axonal growth inhibitory activity of the RGM-like protein.
  • Y27632 has the following chemical structure.
  • the axon regeneration-promoting agent of the present invention includes, as RGM-like protein inhibitors, antisense oligonucleotides, ribozymes, molecules that cause RNA interference (RNAi) (eg, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA) and the like. May be included. These nucleic acids can bind to the RGM-like protein gene or mRNA encoding the RGM-like protein and inhibit its expression. General methods for controlling gene expression using antisense, ribozyme and RNAi techniques, or gene therapy methods for expressing exogenous genes in this manner, are well known in the art.
  • RNAi RNA interference
  • the antisense oligonucleotide refers to a nucleic acid molecule having a sequence complementary to mRNA encoding an RGM-like protein or a derivative thereof. Antisense oligonucleotides specifically bind to mRNA and inhibit protein expression by inhibiting transcription and Z or translation. Binding may be by Watson'Crick or Houdastine base pair complementarity or by triplex formation.
  • a ribozyme refers to the RNA structure of one or more RNAs having catalytic properties. Ribozymes generally exhibit endonuclease, ligase or polymerase activity. Various secondary ribozymes are known, such as hammerhead and hairpin ribozymes.
  • RNA interference is a method of silencing a target gene using double-stranded RNA molecules.
  • RGM-like protein inhibitor can be administered as it is, but is usually used as a medicament. It is formulated using the carrier used.
  • the carrier used in the preparation any of those commonly used in the field of preparations can be used.
  • physiological saline / phosphate buffered saline is preferably used for preparing an injection.
  • commonly used additives such as emulsifiers and osmotic pressure regulators may be included.
  • the administration route of the axon regeneration-promoting agent of the present invention is preferably parenteral administration, and particularly preferably is directly injected into a nerve injury site.
  • the dose is appropriately selected according to the type and route of administration of the RGM-like protein inhibitor, the degree of nerve damage, and the like.
  • the dose of the RGM-like protein inhibitor is usually 1 mg to 20 mg, preferably 5 mg to 10 mg for anti-RGM-like protein antibody, and 20 mg to 100 mg, preferably 30 mg to 50 mg for Y27632. is there.
  • the dose is usually about 10 times the above dose.
  • the present invention provides a method for identifying a candidate substance for an axon regeneration promoter.
  • the method includes contacting a test substance with an RGM-like protein and determining whether the test substance is capable of inhibiting the function of the RGM-like protein.
  • Inhibition of RGM-like protein function includes binding to RGM-like protein and inhibiting the normal functioning of RGM-like protein, particularly inhibiting the ability to promote axonal regeneration, and RGM-like protein And inhibiting the binding of to its receptor.
  • the ability of the test substance to bind to the RGM-like protein or to inhibit the binding of the RGM-like protein to its receptor neodinin is well known to those skilled in the art, such as, but not limited to, gel shift assay.
  • Rho activity may be measured by contacting a test substance with the RGM-like protein in the presence of neogenin, which is a receptor for the RGM-like protein. Since Rho activity increases when RGM-like protein binds to neogenin, if no increase in Rho activity is observed in the presence of the test substance, it is considered that the test substance inhibits the function of the RGM-like protein.
  • neogenin which is a receptor for the RGM-like protein
  • Substances identified by these assays as inhibiting the function of RGM-like proteins are considered to be candidate axon regeneration promoters.
  • the candidate substance has an axonal regeneration-promoting effect by measuring and comparing the axon growth of neurons in the presence and absence of this candidate substance using the known axon growth assay. It can be determined whether or not force is applied. Specific examples of such an access method are described in the following examples.
  • a BLAST search of the GenBank database was performed using the amino acid sequence of- ⁇ bird RGM (Non-Patent Document 24) as a query.
  • a rat cDNA with accession No. power M_218791 (Rattus norvegicus) was identified. Since the deduced amino acid sequence showed 79% homology with- ⁇ avian RGM protein, XM_218791 was named rat RGM-like protein.
  • Full-length rat RGM-like protein cDNA was isolated by PCR from a mature rat brain cDNA library. The base sequence of the forward primer used is
  • Non-Patent Document 24 the native rat RGM was predicted to start at 152aa,
  • HA-RGM vector was prepared in pSecTag2-Hygro (Invitrogen) using HA (hemagglutin) as a signal peptide of pSecTag2 (Invitrogen) and 152-431aa of a rat RGM-like protein. This operation was specifically performed as follows. First, BamHI-HAtag- (cDNA corresponding to RGM-like protein 152-431aa) -Xhol fragment was prepared by PCR using full-length rat RGM-like protein cDNA as type III.
  • the fragment and pSecTag2-Hygro (manufactured by Invitrogen) were digested with two kinds of restriction enzymes (BamHI and Xhol), and after ligation of both, they were transformed into E. coli. All PCR amplified fragments were confirmed by DNA sequencing.
  • RGM-like protein-expressing cells were generated according to the manufacturer's instructions.
  • RGM-like protein-expressing cells were generated according to the manufacturer's instructions.
  • two types of restriction enzymes Nel and Xhol
  • an HA-RGM fragment containing a signal peptide was generated from the P SecTag2 vector, and
  • leader / HA / RGM and pOG44 were cotransfected into Flp-in CHO cells and grown in a medium containing Hygromycin II (500 ⁇ g / ml, Invitrogen) for 2 weeks to achieve stable HA.
  • -RGM expressing cells were generated.
  • HA-RGM expression was confirmed by Western blot and immunocytochemistry ( Figure 2).
  • Cerebellar granule cells from postnatal day 8 (P8) pups were separated by trypsinization (0.25% trypsin in PBS, 37 ° C, 15 min), resuspended in serum-containing medium, triturated, and washed with PBS. Washed three times.
  • -euron was plated on confluent monolayers of RGM-CHO cells or control CHO cells in chamber slides.
  • ROCK Ra kinase
  • 10 ⁇ l of ⁇ 27632 manufactured by Elfide, Osaka
  • RGM-CHO in serum-free DMEM / F12 with or without 2.5 U / ml PI-PLC phosphatidylinositol-specific phospholipase C, Sigma
  • Confluent monolayers of cells or control CHO cells were incubated. The culture was centrifuged at 13,000 g for 10 minutes, and the supernatant was collected to remove floating cells. A part of the supernatant was subjected to Western blot analysis.
  • -Euron was plated on conditioned media on chamber slides coated with poly-L-lysine and incubated for 12 or 24 hours.
  • a partial peptide of the RGM-like protein (309-322aa) was synthesized and used as an immunogen to obtain anti-rat RGM-like protein @ egret antiserum. This was subjected to affinity purification and used at a concentration of 1 ⁇ g / ml for immunization and immunity plotting and immunity plotting, and at a concentration of 10 g / ml for neutralizing antibody assay.
  • the sections were fixed with 4% (w / v) paraformaldehyde for 1 hour at room temperature, washed three times with PBS, and washed in PBS containing 5% goat serum (GS) and 0.1% Triton X-100 (trade name). Blocked at room temperature for 1 hour. Sections were incubated overnight at 4 ° C with the primary antibody, washed three times with PBS, and incubated with a fluorescein-conjugated secondary antibody (1: 1000; Molecular Probes) for 1 hour at room temperature.
  • Anti-rat RGM-like protein polyclonal antibody (1 ⁇ g / ml), anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) monoclonal antibody (1: 1000, manufactured by Sigma), anti-myelin Z oligodendrocyte-specific protein ( MOSP) monoclonal antibody (1: 500;
  • GFAP anti-glial fibrillary acidic protein
  • MOSP anti-myelin Z oligodendrocyte-specific protein
  • Cerebellar granule-euron was plated on poly L-lysine coated chamber slides in conditioned medium induced by PI-PLC treatment of control CHO cells or RGM-CHO cells.
  • An anti-rat RGM-like protein antibody (10 / z g / ml) was added to a conditioned medium induced by PI-PLC treatment of RGM-CHO cells. After incubation for 24 hours, growth assays were performed as described above.
  • Control protease CHO cells or RGM with 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0.5% Brij-58 (Sigma) containing protease inhibitor cocktail tablets (Roche Diagnostics, Manheim, Germany) -CHO cells were lysed.
  • the cell lysate was clarified by centrifugation at 13000 g at 4 ° C for 10 minutes, the supernatant was recovered, and the protein concentration was normalized using a Bio-Rad DC protein assay kit (trade name). Equal amounts of protein were boiled for 5 minutes in a sample buffer containing 12% -mercaptoethanol and subjected to SDS-PAGE.
  • the conditioned medium was treated similarly except for the lysis buffer treatment.
  • the protein was transferred to a PVDF membrane and blocked for 1 hour at room temperature in PBS containing 5% skim milk and 0.05% Tween 20 (trade name).
  • the membrane was plotted overnight with anti-rat RGM-like protein polyclonal antibody (1 g / ml) or anti-HA monoclonal antibody (1: 1000, Sigma).
  • an ECL chemiluminescence system (trade name, manufactured by Amersham Biosciences) and an HRP (radish peroxidase) -conjugated secondary antibody (1: 1000; manufactured by Cell Signaling Technology) were used.
  • Fig. 3 shows the results of axonal growth assay performed by plating cerebellar granule-euron on confluent monolayers of rat RGM-like protein expressing CHO cells or control CHO cells. Shown in 1.
  • Fig. 1 when cerebellar granule-Euron was cultured on CHO cells expressing RGM-like protein, the axon length was significantly shorter than that of the control.
  • the axon growth promoter of the present invention Y27632
  • was added to the medium the axons grew to the same extent as the control, and the axons grew significantly compared to when cultured on RGM-like protein-expressing CHO cells. The cord grew.
  • RGM-like protein in the form of a solution inhibits axonal growth. Prior to the test, it was confirmed by immunostaining using an anti-HA antibody that the HA-RGM-like protein was released into the medium by treating the medium with PI-PLC. In addition, GPI (glycosylphosphatidylinositol) -binding protein is released from the membrane by PI-PLC. As described above, the RGM-like protein was highly homologous to- ⁇ avian RGM and was predicted to be a GPI-binding protein.
  • HA-RGM-like protein was detected by immunostaining only in the medium of RGM-like protein-expressing CHO cells that had been treated with P-to-PLC. HA-RGM-like protein was not detected in the CHO cell medium. From this, it was confirmed that the RGM-like protein was a GPI-binding protein and was released into solution by PI-PLC treatment.
  • FIG. 2 shows the axon length of -euron treated with each conditioned medium.
  • axonal growth was significantly inhibited only by -Euron treated with PI-PLC-treated medium from CHO cells expressing RGM-like protein. This indicates that the RGM-like protein has an inhibitory effect on axonal growth.
  • the axon length varied with the presence or absence of P-to-PLC treatment. This indicates that the Pto PLC treatment itself does not affect force axon growth.
  • the above-mentioned peptide used as an immunogen was added to the anti-RGM-like protein antibodies at a concentration of 10 g / ml, and the resulting peptide was used to injure adult rat normal or normal spinal cord. Immunohistochemical staining of fresh frozen sections showed no staining. From these results, it was confirmed that the prepared anti-RGM-like protein antibody has specificity for RGM-like protein (reacts with antigen-antibody).
  • Fresh frozen sections were prepared from adult rats and immunohistochemically stained. This immunohistochemical staining was specifically performed as follows. First, fresh frozen sections were sufficiently dried at room temperature. The cells were fixed with a phosphate-buffered 4% paraformaldehyde solution for 1 hour, followed by blocking for 1 hour, primary antibody treatment at 4 ° C for 1 hour, and secondary antibody treatment for 1 hour at room temperature. As a blocking solution, a solution prepared by adding 10% goat serum and 0.1% tritonX to 0.1 M phosphate buffered saline was used.
  • the primary antibody solution a solution prepared by adding 1 ⁇ g / ml of anti-RGM-like protein to the above-mentioned blocking solution was used.
  • a secondary antibody solution goat serum 10% and fluorescein-conjugated secondary antibody (1: 1000; manufactured by Molecular Probes) were used in 0.1 M phosphate buffered saline. The results showed that RGM-like protein was constantly expressed in both white matter and gray matter.
  • RGM-like protein-pile-MOSP myelin-Z oligodendrocyte-specific protein
  • RGM-like protein is expressed in oligodendrocytes and their processes in white matter It was shown that.
  • RGM-like proteins are localized in the cell body of Tujl (neuron-specific j8 tubulin III protein) -positive-Euron cells, and unlocalized forces on axons of these cells in white matter. I got it.
  • Tujl neuroon-specific j8 tubulin III protein
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • RGM-like protein is centered at the injury site and cranial and caudal to the injury site. Detected in white matter. In the central area, the tissue structure appeared normal 6 hours after injury. After 1 to 3 days of injury where regression changes begin to be observed, immune responses to RGM-like proteins were also observed on the site of injury and in the ectopic extracellular matrix. This extracellular immunoreactivity may be due to regression of RGM-like protein expressing cells.
  • anti-GFAP-anti-RGM-like protein, anti-MOSP-anti-RGM-like protein, and anti-Tujl-anti-RGM-like protein were used.
  • GFAP-positive and RGM-like protein-positive, MOSP-positive and RGM-like protein-positive, or Tujl-positive and RGM-like protein-positive were not observed.
  • these cells include, for example, microglia, macrophages, oligodendrocyte precursors, fibroblasts, pial cells, and Z or Schwann cells. It may be other types of cells that make up glial scars, such as.
  • RGM-like proteins are strongly expressed in oligodendrocytes.
  • MOSP-expressing cells expressed the RGM-like protein, and RGM-like protein-positive and MOSP-negative cells were not observed. These cells in white matter are likely to be the same cells observed at the center of the injury site. Thus, RGM-like protein is upregulated in response to spinal cord injury in the center of the injury site and adjacent white matter.
  • control animals 8, 22.3 Osmotic minipump (200 ⁇ L solution, 0.5 ⁇ L / hour) filled with anti-RGM-like protein antibody (8 animals, 22.3 ⁇ g / kg -day, 2 weeks) prepared in Example 1 , 14 days) (Durect Corp., Cupertino, CA, USA).
  • the minipump is placed subcutaneously on the back of the animal, and a silicone tube connected to the outlet of the minipump is placed subdurally at the hemisection of the spinal cord so that the tape is immediately adjacent to the head of the injury site. placed.
  • the tube was sewn and fixed to the spinous process immediately below the laminectomy site. Next, the muscle and skin layers were sutured. Hand pressure was applied to the bladder at least twice daily until bladder function was restored.
  • Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) motor evaluation criteria Basso, DM, Beattie, MS, & Bresnahan, J. Shi., A sensitive and reliable locomotor rating scale ror open field testing in rats.J Neurotrauma 12, 1-21 ( 1995, we assessed behavioral recovery in an open-field environment for seven weeks after injury, and quantified blindly.
  • Fig. 4 shows the BBB score of the rats to which the anti-RGM-like protein antibody or the control antibody was administered after the time shown in the figure after the hemitomy of the dorsal side of the central thoracic thorax. .
  • the mean standard deviation of 6 or 8 rats in each group is shown. * Indicates that the group to which the anti-RGM-like protein antibody was administered was significantly different from the control group during the week. *: P ⁇ 0.05 for control.
  • the integrity of the dorsal CST was examined in some of the rats previously tested by injecting BDA into the sensory motor cortex.
  • the sample from the injured rat to which the anti-RGM-like protein antibody was administered (Fig. 5b) showed a completely different pattern of labeling than the sample from the control rat (Fig. 5a).
  • rats to which no anti-RGM-like protein antibody was administered at the proximal end of the injury site, the main CST was disrupted cranially to the injury (Fig. 5a, c). This basic pattern reflects that axonal regeneration does not normally occur in the central nervous system.
  • a and b are representative photographs of BDA-labeled CST fibers, and the cranial side is shown on the left side.
  • Figure 9 shows antegradely labeled CST fibers 10 weeks after injury in the spinal cord to which control IgG (a) or anti-RGM-like protein antibody (b) was administered (RGM-like protein is referred to as "RGMa" in Figs. 5 and 6). Described). The center of the injury site is indicated by an asterisk.
  • c-g are photographs of the areas enclosed by squares in Figs. 5a and 5b observed at higher magnification.
  • h is another section of the same animal as b, showing regenerated fibers 2.6 mm from the center of the injury site (arrow) on the lower limb side.
  • the scale bar has a and b forces of 00 m, c—00 m, g and h are 200 m.
  • Triton X-100 (trade name), 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 500 mM NaCl and 10 mM MgCl, 10 ⁇ g / ml leptin and 10 ⁇ g / ml aprotune
  • the cells were lysed with 50 mM Tris (pH 7.5) containing Cell lysate, 13000g, 4 ° C, 10 minutes
  • the mixture was clarified by centrifugation, and the supernatant was incubated with 20 ⁇ g of GST-Rho binding region of Rhotekin beads (trade name, manufactured by Upstate Biotech) at 4 ° C. for 45 minutes.
  • Wash buffer 1% Triton X-100 (trade name), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl, 10 g / ml each of Reubepti
  • Rho was detected by Western blot using a monoclonal antibody to RhoA (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA).
  • RhoA activity in neurons was measured. RhoA activity was measured 30 minutes after the addition of each conditioned medium to the cerebellum-eurong of a 7-day-old rat (Fig. 6). As shown in Fig. 6, activation of Rho was observed in RON-cultured CHO cells expressing RGM-like protein in PI-PLC-treated medium compared to RON cultured in control CHO-cell culture medium. . This result indicates that the RGM-like protein activates Rho.
  • the axon regeneration-promoting agent of the present invention is effective for regeneration of a damaged central nervous system, and is useful as a therapeutic agent for patients having a damaged central nervous system.
  • FIG. 1 shows the results of axonal growth assays performed by plating cerebellar granules-euron on a confluent single cell layer of rat RGM-like protein-expressing CHO cells or control CHO cells.
  • the vertical axis indicates the average length of the longest axon for each neuron. Data are the mean standard deviation of three experiments. “*” Indicates p ⁇ 0.01 compared to the control, and “**” indicates p ⁇ 0.01 (Student's test) compared to RGM.
  • FIG. 2 is a view showing the axon length of -euron treated with each conditioned medium.
  • the vertical axis shows the average length of the longest axon for each neuron.
  • Data are the mean standard deviation of three experiments. “*” Indicates p ⁇ 0.01 compared to the axon length of -EURON cultured in conditioned medium of PI-PLC-treated control CHO cells.
  • FIG. 3 RGM-like protein with or without added anti-RGM-like protein polyclonal antibody
  • Fig. 2 shows the results of axonal growth atherosclerosis of cerebellar granule-euron cultured in a protein-containing medium. The vertical axis indicates the average length of the longest axon for each neuron. Data are the mean standard deviation of three experiments. “*” Indicates p ⁇ 0.01 compared to control, “**” indicates p compared to RGM.
  • FIG. 4 shows BBB scores of rats to which anti-RGM-like protein antibody or control antibody was administered after the hemisection of the dorsal side of the central thoracic vein after the indicated time had elapsed.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of an eastern blot in which the activity of Rho in rat cerebellum-euron treated with an RGM-like protein was measured.

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Abstract

　RGM様タンパク質阻害剤を有効成分として含有する軸索再生促進剤が開示される。RGM様タンパク質阻害剤には、抗RGM様タンパク質抗体、Y27632等のRGM様タンパク質阻害剤、およびRGM様タンパク質の転写または翻訳を阻害しうるアンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ等が含まれる。本発明の軸索再生促進剤は，中枢神経の軸索の再生に有効であり，交通事故や脳血管障害等により脊髄等の中枢神経系に損傷を受けた患者の治療等に寄与する。

Description

明 細 書
軸索再生促進剤
技術分野
[0001] 本発明は，神経細胞，特に，中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進すること ができる軸索再生促進剤に関する。
背景技術
[0002] 脊髄等の中枢神経が交通事故等に起因する傷害あるいは脳血管障害等で損傷を 受けると，神経機能は失われたまま再生することはできない。末梢神経が再生するの とは対照的である。中枢神経は，損傷すると再生できないので，中枢神経を損傷する としばしば部分的又は完全な麻痺が起きる。したがって，損傷した中枢神経を再生さ せることは医療分野における重要な課題である。
[0003] もっとも，成人の中枢神経の軸索が，末梢神経のグラフトを介して再生し得る（非特 許文献 1)ことから，成人の中枢神経が再生しない主な原因は，神経細胞を取り巻く 局所的な環境にあることが示唆される。これまでに，中枢神経の再生を阻害する 3つ の主な阻害物質として， Nogo,ミエリン結合糖タンパク質 (MAG)及び乏突起神経膠細 胞-ミエリン糖タンパク質 (OMgp)が同定されている。 Nogoは，モノクローナル抗体 IN-1の対応抗原として同定された (非特許文献 2— 4)。ミエリン鞘の形成及び維持に 重要な役割を果たすことが知られている MAG (非特許文献 5— 8)は，ある種の-ユー ロン力もの軸索の成長を阻害することが見出された (非特許文献 9, 10)。成人中枢 神経の白質中の主たるピーナツァグルチュン 結合ポリペプチドである OMgp (非特 許文献 11)は，軸索成長の第 3の阻害物質として同定された (非特許文献 12, 13)。 Nogo, MAG及び OMgpは， p75をコレセプターとして NgRに結合することが知られてお り，このことは，これらが共通の信号伝達経路を共有していることを示唆している（非 特許文献 14一 17)。
[0004] これらの阻害物質を排除ないし阻害することにより，軸索を再生することが研究され た。し力しながら，これらの阻害物質のそれぞれをノックアウトしたマウスを用いた研究 により，これらの阻害物質を排除しただけでは中枢神経の軸索が再生されないことが わ力つた (非特許文献 18— 22)。さらに，機能的な p75NTRを枯渴させたり，可溶性 p75N-Fcを投与しても，損傷した脊髄の再生が促進されな力つたことが報告されて!ヽ る (非特許文献 23)。
[非特許文献 1] S. David, A. J. Aguayo, Science 214, 931-3 (Nov 20, 1981).
[非特許文献 2] M. S. Chen et al.， Nature 403, 434-9 (Jan 27, 2000).
[非特許文献 3] T. GrandPre, F. Nakamura, T. Vartanian, S. M.
Strittmatter, Nature 403, 439-44 (Jan 27, 2000).
[非特許文献 4] p. Caroni, M. E. Schwab, Neuron 1, 85-96 (Mar, 1988).
[非特許文献 5] S. Carenini, D. Montag, H. Cremer, M. Schachner, R. Martini, Cell Tissue Res 287, 3-9 (Jan, 1997).
[非特許文献 6] M. Fruttiger, D. Montag, M. Schachner, R. Martini, Eur J Neurosci 7, 511—5 (Mar 1, 1995).
[非特許文献 7] N. Fujita et al, J Neurosci 18, 1970-8 (Mar 15, 1998). [非特許文献 8] J. Marcus, J. L. Dupree, B. Popko, J Cell Biol 156, 567-77 (Feb 4, 2002).
[非特許文献 9] G. Mukhopadhyay, P. Doherty, F. S. Walsh, P. R.
Crocker, M. T. Filbin, Neuron 13, 757-67 (Sep, 1994).
[非特許文献 10] し McKerracher et al" Neuron 13, 805—11 (Oct, 1994).
[非特許文献 11] D. D. Mikol, K. Stefansson, J Cell Biol 106, 1273—9 (Apr, 1988).
[非特許文献 12] V. Kottis et al., J Neurochem 82, 1566—9 (Sep, 2002).
[非特許文献 13] K. C. Wang et al., Nature 417, 941—4 (Jun 27, 2002).
[非特許文献 14] Wang, J. A. Kim, R. Sivasankaran, R. Segal
He, Nature 420, 74-8 (Nov 7, 2002). [非特許文献 15] M. Domeniconi et al., Neuron 35, 283-90 (Jul 18, 2002).
[非特許文献 16] A. E. Fournier, T. GrandPre, S. M. Strittmatter,
Nature 409, 341—6 Can 18, 2001).
[非特許文献 17] T. Yamashita, Η. Higuchi, Μ. Tohyama, J Cell Biol 157, 565-70 (May 13, 2002).
[非特許文献 18] U. Bartsch et al., Neuron 15, 1375-81 (Dec, 1995).
[非特許文献 19] C. J. Woolf, Neuron 38, 153-6 (Apr 24, 2003).
[非特許文献 20] J. E. Kim, S. Li, T. GrandPre, D. Qiu, S. M.
Strittmatter, Neuron 38, 187—99 (Apr 24, 2003).
[非特許文献 21] B. Zheng et al., Neuron 38, 213-24 (Apr 24, 2003).
[非特許文献 22] M. Simonen et al., Neuron 38, 201-11 (Apr 24, 2003).
[非特許文献 23] X. Song et al., J Neurosci 24, 542-6 (Jan 14, 2004).
[非特許文献 24] P. P. Monnier et al., Nature 419, 392—5 (Sep 26, 2002).
[非特許文献 25] B. K. Muller, D. G. Jay, F. Bonhoeffer, Curr Biol 6, 1497-502 (Nov 1, 1996).
[非特許文献 26] C. J. Woolf, S. Bloechlinger, Science 297, 1132—4 (Aug 16, 2002).
[非特許文献 27] B. Niederost, T. Oertle, J. Fritsche, R. A. McKinney, C. E. Bandtlow, J Neurosci 22, 10368—76 (Dec 1, 2002).
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[非特許文献 29] P. Dergham et al., J Neurosci 22, 6570-7 (Aug 1, 2002).
[非特許文献 30] P. P. Monnier, A. Sierra, J. M. Schwab, S.
Henke-Fahle, B. K. Mueller, Mol Cell Neurosci 22, 319—30 (Mar, 2003).
[非特許文献 31] M. Uehata et al., Nature 389, 990-4 (Oct 30, 1997). [非特許文献 32] A. A. Habib et al, J Neurochem 70, 1704—11 (Apr, 1998).
[非特許文献 33] H. Liu, C. E. Ng, B. L. Tang, Neurosci Lett 328, 257-60 (Aug 16, 2002).
[非特許文献 34] A. B. Huber, O. Weinmann, C. Brosamle, T. Oertle, M. E. Schwab, J Neurosci 22, 3553—67 (May 1, 2002).
[非特許文献 35] D. Hunt, R. S. Coffin, P. N. Anderson, J Neurocytol 31, 93-120 (Feb, 2002).
[非特許文献 36] L. L. Jones, Y. Yamaguchi, W. B. Stallcup, M. H. Tuszynski, J Neurosci 22, 2792—803 (Apr 1, 2002).
[非特許文献 37] J. w. Fawcett, R. A. Asher, Brain Res Bull 49, 377-91 (Aug, 1999).
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は，中枢神経の軸索の再生を促進することができる，新規な軸索再 生促進剤を提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本願発明者らは，鋭意研究の結果，脊髄の白質及び灰白質中に，ニヮトリ胎児に おいて，網膜蓋体の突起の形成に関与する RGM(repulsive guidance molecule) (非 特許文献 24及び 25)と相同性を有するタンパク質 (本明細書及び特許請求の範囲 において「RGM様タンパク質」と呼ぶ）が発現しており，脊髄を損傷すると，該タンパク 質の発現が増大することを見出した。さらに，該タンパク質が中枢神経の軸索の成長 を阻害する活性を有することを見出した。そして，抗 RGM様タンパク質抗体や Y27632 のような， RGM様タンパク質阻害剤で RGM様タンパク質を処理することにより， RGM 様タンパク質の軸索成長阻害活性が消失することを見出し， RGM様タンパク質阻害 剤を軸索成長促進剤として利用できることに想到し，本発明を完成した。
[0008] すなわち，本発明は， RGM様タンパク質阻害剤を有効成分として含有する軸索再 生促進剤を提供する。好ましくは，前記 RGM様タンパク質阻害剤は，抗 RGM様タン ノ ク質抗体である。また好ましくは，前記 RGM様タンパク質阻害剤は， Y27632である [0009] 好ましくは，前記軸索は，中枢神経系の軸索である。
[0010] 本発明の別の観点においては，本発明は，軸索再生促進剤の候補物質を同定す る方法であって，試験物質を RGM様タンパク質と接触させ，前記試験物質が RGM様 タンパク質の機能を阻害する力否かを判定することを含む方法を提供する。
発明の効果
[0011] 本発明によれば，中枢神経の軸索の再生を促進することができる，新規な軸索再 生促進剤が提供された。本発明の軸索再生促進剤は，中枢神経の軸索の再生に有 効であり，脊髄等の中枢神経系に損傷を受けた患者の治療等に大いに寄与すると 期待される。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 上記の通り，本願発明者らは先に， -ヮトリ胎児において RGM様タンパク質が脊髄 の白質及び灰白質中に発現していることを見出した。ヒトにおいては、 -ヮトリ胎児 RGM様タンパク質と相同性を有する遺伝子が脳で発現されて!ヽることが確認された。 ヒトの RGM様タンパク質の遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配 列番号 1及び 2に示す。また、ラットの RGM様タンパク質の遺伝子の塩基配列及びそ れがコードするアミノ酸配列を配列番号 3及び 4に示す。
[0013] 下記実施例において具体的に記載するように， RGM様タンパク質は軸索の成長を 阻害する活性を有し，また，脊髄が損傷すると，その発現が増大する。さらに，下記 実施例にお 、て，抗 RGM様タンパク質抗体を-ユーロンに作用させることにより， RGM様タンパク質による軸索成長阻害が見られなくなることが確認された。従って， 抗 RGM様タンパク質抗体のような， RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性を中和す る物質は，軸索再生促進剤として用いることができる。
[0014] 従って，本発明の軸索再生促進剤は， RGM様タンパク質阻害剤を有効成分として 含有する。ここで， 「RGM様タンパク質阻害剤」とは， RGM様タンパク質の軸索成長阻 害活性を消失又は少なくとも有意に減少させる物質を意味する。 RGM様タンパク質 の軸索成長阻害活性は，後述する実施例に記載の通りに調べることができる。 [0015] 本発明の RGM様タンパク質阻害剤として特に好ましいものは抗 RGM様タンパク質 抗体である。本明細書において， 「抗 RGM様タンパク質抗体」とは， RGM様タンパク 質と抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味する。抗体はモノクローナル抗体であ つてもポリクローナル抗体であってもよ 、。
[0016] RGM様タンパク質に結合するポリクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知 られる方法にしたがって， RGM様タンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し， その血清力も得ることができる。 RGM様タンパク質に結合するモノクローナル抗体は， 当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって， RGM様タンパク質を感作抗 原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ ,抗体を産生するハイブリドーマをクローユングし，このハイプリドーマを培養すること により得ることができる。
[0017] 本発明のモノクローナル抗体には，ハイプリドーマにより産生される抗体にカ卩えて， 抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子 組換え抗体，キメラ抗体， CDR移植抗体，およびこれらの抗体の断片等が含まれる。
[0018] 遺伝子組み換え抗体は，抗 RGM様タンパク質抗体を生産するハイプリドーマから 抗体をコードする cDNAをクローユングし，これを発現ベクター中に挿入して，動物 細胞，植物細胞などを形質転換し，この形質転換体を培養することにより製造するこ とができる。キメラ抗体とは，ある動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可 変領域と，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成 される抗体である。 RGM様タンパク質に結合しうる抗体断片としては， Fab, F(ab')2, Fab', scFv,ディアボディー等があげられる。
[0019] 抗体産生細胞の作製
RGM様タンパク質に結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく 知られる方法により取得することができる。 RGM様タンパク質を感作抗原として用いて 動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生 するハイプリドーマをクローユングする。より詳細には，まず、抗原となる RGM様タンパ ク質を製造する。市販の脳 cDNAライブラリーに RGM様タンパク質の cDNAが含まれて いるので，市販の脳 cDNAライブラリーを铸型とした PCRにより、容易にこの遺伝子の 増幅産物を得ることができ、この遺伝子を適当なベクターに挿入して、組換え的に RGM様タンパク質を生成することができる。次に、このようにして製造した RGM様タン ノ^質を抗原として，動物の皮下，静脈内または腹腔内に投与する。免疫動物として は，マウス，ラット，ノ、ムスター，ゥサギ，ャギ等の哺乳動物を用いることができる。好ま しくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させる力，フロインド完全アジュバント等の適 当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは、抗原として RGM様タンパク質の 部分ペプチドを用いてもょ 、。
[0020] 下記実施例では，配列番号 4に示すアミノ酸配列を有するラット RGM様タンパク質 の第 309番目のアミノ酸残基（以下， 「309aa」のように記載)から 322aaまでの部分べ プチドをィ匕学合成して免疫原として用いたところ、この部分ペプチドに対するポリクロ ーナル抗体が， RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性の中和活性を有することが 見出された。したがって、ヒト遺伝子の対応する領域を含むポリペプチドを免疫原とし て用いて、ヒト RGM様タンパク質に対する中和抗体を得ることができる。
[0021] 抗原の投与は， 1 3週間毎に数回行う。血清中の免疫グロブリンの量を ELISA法 などにより測定することにより，抗体価をモニターする。十分に抗体価が上昇した後， この動物から免疫細胞を取り出す。免疫細胞としては好ましくは脾臓細胞を用いる。 抗体産生免疫細胞と，同種の哺乳動物に由来する骨髄腫細胞とを融合させてハイ プリドーマを作製する。ノ、イブリドーマを作製するのに適した各種の骨髄腫細胞株が 市販されている。融合は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，例 えば PEGの存在下で行い， HAT培地で融合細胞を選択する。培養上清を ELISA 法などによりアツセィして，抗原と結合する抗体を産生するハイプリドーマを選択する 。次に，限界希釈法により目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローユングす ることができる。さらに、得られたノヽイブリドーマの産生するモノクローナル抗体につい て，下記実施例に記載する軸索成長アツセィを行い， RGM様タンパク質の軸索成長 阻害活性を中和する活性を有するハイプリドーマを選択することができる。
[0022] モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の 上清から，またはあら力じめ 2, 4, 10, 14ーテトラメチルペンタデカンで前処理したマ ウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後 7日から 10日目にマウ スの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モ ノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過， ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，ァフィ-ティークロマトグラフィー， HPLC等 の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテイン Aカラムによるァフィユティー クロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウス モノクローナル抗体ァイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定するこ とがでさる。
[0023] 杭体遺伝子の塩某配列の解析
本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノ クローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクロ一 ナル抗体産生細胞力ゝら全 RNAを抽出し，これを铸型としてリバーストランスクリプター ゼを用いて cDNA断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いて PC Rにより抗体遺伝子の V領域を増幅し，この領域の cDNAの塩基配列を決定する。
[0024] 杭 ：の特虽件の確認
本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は， ELISA, RIA,免疫薄層クロマト グラフィー， BIAcore,蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて 確認することができる。例えば， RGM様タンパク質を固定ィ匕したマイクロプレートに， 2 倍希釈系列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識 二次抗体を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定 する。
[0025] 組換え型抗体
本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を 用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗 RGM様タンパク質モノ クローナル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発 現ベクターに組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺 乳動物細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例え ば， CHO, COS, BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例 えば塩化カルシウム法，リン酸カルシウム法， DEAEデキストラン法，カチオン性リポソ ーム DOTAP (ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクト口ポーレーシヨン 法，リボフヱクシヨンなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を 培養し，抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。
[0026] キメラ抗体
キメラ抗体とは，ある動物 (例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽 鎖可変領域と，他の動物 (例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定 常領域力も構成される抗体である。キメラ抗体は， RGM様タンパク質に結合するモノ クローナル抗体を生産するハイプリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可 変領域をコードする cDNAをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖 定常領域および軽鎖定常領域をコードする cDNAをクローユングし，これらを組み合 わせて適当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換 え的に製造することができる。
[0027] CDR移植杭体
CDR移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域 (CDR)を別 の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。 CDR移植抗 体をコードする遺伝子は， RGM様タンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産 するハイプリドーマ力 クローユングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領 域の遺伝子配列に基づいて，それぞれ CDR1, 2, 3をコードする遺伝子配列を設計 し，他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺 伝子を含むベクター中の対応する CDR1, 2, 3の配列と置き換えることにより得ること ができる。例えば，マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するよ うに設計した数個のプライマーを用いて， PCR法により合成することができる。あるい は，合成 DNAを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細 胞中で発現させることにより， CDR移植抗体を組換え的に製造することができる。
[0028] 杭体断片
RGM様タンパク質に結合しうる Fab, F(ab')2, Fab', scFv,ディアボディー等の抗体 断片は，上述の本発明の抗 RGM様タンパク質モノクローナル抗体をパパイン，トリプ シン等の酵素で処理するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現べク ターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。
[0029] RGM様タンパク質阻害剤の他の例としては，セリン/スレオニンキナーゼ Rhoキナー ゼ阻害剤として知られて ヽる Y27632 (非特許文献 31)を挙げることができる。下記実 施例において， Y27632は， RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性を中和する活性 を有することが確認された。なお， Y27632は次の化学構造を有する。
[0030] [化 1]
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[0031] さらに，本発明の軸索再生促進剤は， RGM様タンパク質阻害剤として，アンチセン スオリゴヌクレオチド，リボザィム， RNA干渉 (RNAi)を引き起こす分子（例えば， dsR NA, siRNA, shRNA, miRNA)等を含むものであってもよい。これらの核酸は， RGM様タンパク質遺伝子または RGM様タンパク質をコードする mRNAに結合しその 発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザィム技術および RNAi技術を用い て遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現さ せる遺伝子治療方法は当該技術分野にぉ 、てよく知られて 、る。
[0032] アンチセンスオリゴヌクレオチドとは， RGM様タンパク質をコードする mRNAと相補 的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチ ドは， mRNAと特異的に結合し，転写および Zまたは翻訳を阻害することによりタン パク質の発現を阻害する。結合はワトソン 'クリックまたはフーダスティーン型の塩基対 相補性によるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよい。
[0033] リボザィムとは，触媒的特性を有する 1またはそれ以上の RNAの RNA構造を表す 。リボザィムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す 。種々の二次構造のリボザィム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプの リボザィムが知られている。 RN A干渉 (RNAi)とは，二本鎖 RN A分子を用いて標的 遺伝子をサイレンシングする手法を 、う。
[0034] RGM様タンパク質阻害剤は，そのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で 用いられる担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用さ れるいずれのものをも用いることができ，例えば，注射剤の調製には生理食塩水ゃリ ン酸緩衝生理食塩水等が好ましく用いられる。さらに，乳化剤や浸透圧調節剤等の 常用される添加剤を含めてもよい。
[0035] 本発明の軸索再生促進剤の投与経路は，非経口投与が好ましく，特に，神経の損 傷部に直接注射することが好ま 、。
[0036] 投与量は， RGM様タンパク質阻害剤の種類や投与経路，神経損傷の程度等に応 じて適宜選択されるが，損傷部位に直接投与する場合，成人 1日， 1損傷部位当たり の RGM様タンパク質阻害剤の投与量は抗 RGM様タンパク質抗体の場合，通常， lmg 一 20mg,好ましくは， 5mg— 10mgであり， Y27632の場合，通常， 20mg— lOOmg,好ま しくは， 30mg— 50mgである。直接投与以外の非経口投与，例えば静脈注射等では， 通常，上記投与量の 10倍程度である。
[0037] 別の観点においては，本発明は，軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法を 提供する。この方法は，試験物質を RGM様タンパク質と接触させ，この試験物質が RGM様タンパク質の機能を阻害する力否かを判定することを含む。 RGM様タンパク 質の機能の阻害には、 RGM様タンパク質に結合して RGM様タンパク質の正常な機能 の発揮を阻害すること、特に軸索の再生を促進する能力を阻害すること、ならびに RGM様タンパク質とそのレセプターとの結合を阻害することが含まれる。試験物質が RGM様タンパク質と結合する能力、あるいは RGM様タンパク質とそのレセプターであ るネオジ ニンとの結合を阻害する能力は，当業者によく知られる結合アツセィ，例え ば，限定されないが，ゲルシフトアツセィ，放射性標識競合アツセィ，クロマトグラフィ 一による分画などにより判定することができる。また、 RGM様タンパク質のレセプター であるネオジェニンの存在下で試験物質を RGM様タンパク質と接触させ、 Rho活性を 測定してもよ 、。 RGM様タンパク質がネオジェニンと結合すると Rho活性が上昇する ため、試験物質の存在下で Rho活性の上昇が見られない場合には、その試験物質は RGM様タンパク質の機能を阻害して 、ると考えらる。
[0038] これらのアツセィにより， RGM様タンパク質の機能を阻害するものとして同定された 物質は，軸索再生促進剤の候補物質であると考えられる。次に，当該技術分野にお いて知られる軸索成長アツセィ法を用いて，この候補物質の存在下および非存在下 において，ニューロンの軸索の成長を測定して比較することにより，この候補物質が 軸索再生促進効果を有する力否かを判定することができる。このようなアツセィ方法 の具体例は下記の実施例に記載されて 、る。
[0039] 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎とな る出願である日本特許出願 2004— 68849号および 2004— 273041号の明細書お よび図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
[0040] 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の 範囲を制限するものではな 、。
実施例 1
[0041] RGM様タンパク皙のクローニング
-ヮトリ RGM (非特許文献 24)のアミノ酸配列をクエリーとして用いて， GenBankデー タベースの BLAST検索を行なった。その結果， accession No. 力 ¾M_218791 (Rattus norvegicus)であるラット cDNAが同定された。推定アミノ酸配列が-ヮトリ RGMタンパク質と 79%の相同性を示したので， XM_218791をラット RGM様タンパク質と 命名した。完全長ラット RGM様タンパク質 cDNAは，成熟ラット脳 cDNAライブラリーか ら PCRにより単離した。用いたフォワードプライマーの塩基配列は
agtggtaacaggccgagctggatgg (配列番号 5)リバースプライマーの塩基配列は ccacaaccttgtcgcgtgcactaat (配列番号 6)であり， 95°C30秒の変性工程， 55°C30秒の アニーリング工程，及び 72°C, 3分 30秒の伸長工程力 成るサイクルを 25回繰り返し た。コードされるタンパク質は 431個のアミノ酸残基力も成る。非特許文献 24に基づ き，ネイティブのラット RGMが 152aaから始まることが予測されたので，
pSecTag2(Invitrogen社製）のシグナルペプチドに HA (へマグルチュン)及びラット RGM 様タンパク質の 152— 431aaを用いて， pSecTag2- Hygro(Invitrogen社製）中に HA-RGMベクターを作製した。この操作は具体的に次のようにして行なった。まず， 完全長ラット RGM様タンパク質 cDNAを铸型として， BamHI-HAtag- (RGM様タンパク 質の 152— 431aaにあたる cDNA) - Xholの断片を PCRにより作成した。次に，作成した 断片と pSecTag2- Hygro (Invitrogen社製）を 2種類の制限酵素（BamHI及び Xhol)で 切断し，両者のライゲーシヨンをおこなった後，大腸菌に形質転換した。全ての PCR 増幅断片は， DNAシーケンシングにより確認した。
[0042] RGM様タンパク質- CHO細胞の生成
Flp-In System (商品名， Invitrogen社製)を用い，製造者の指示通りに RGM様タン パク質発現細胞を生成した。 2種類の制限酵素（Nhel及び Xhol)を用いて， PSecTag2 ベクターから，シグナルペプチドを含む HA- RGM断片を生成し，これを
pcDNA5FRT(Invitrogen社製)に連結した。この構築物 (pcDNA5FRT/Ig κ
leader/HA/RGM)及び pOG44を Flp- in CHO細胞に共トランスフエタトし，ハイグロマ イシン Β(500 μ g/ml, Invitrogen社製）を含む培地中で 2週間増殖させることにより安 定に HA-RGMを発現する細胞が生成された。 HA- RGMの発現は，ウェスタンブロット 及び免疫細胞化学（図 2)により確認した。
[0043] 軸索成長アツセィ
生後 8日（P8)の仔ラットからの小脳顆粒細胞を，トリプシン処理 (PBS中 0.25%トリプシ ン， 37°C, 15分間）により分離し，血清含有培地に再懸濁し，粉砕し， PBSで 3回洗 浄した。共存培養アツセィのために，チャンバースライド中の RGM-CHO細胞又は対 照 CHO細胞のコンフルーェント単細胞層上に-ユーロンをプレートした。 ROCK(Rho キナーゼ）を阻害するために， 10 μ Μの Υ27632 (大阪のゥエルフアイド社製）を培養物 に添カ卩した。培養物を，血清フリーの DMEM/F12培地中で 24時間増殖させた。
[0044] 可溶性 RGMアツセィのために， 2.5 U/mlの PI-PLC (フォスファチジルイノシトール特 異的ホスフオリパーゼ C, Sigma社製）を含む又は含まない血清フリー DMEM/F12中 で RGM-CHO細胞又は対照 CHO細胞のコンフルーェント単細胞層をインキュベート した。培養物を 13000gで 10分間遠心後，上清を回収することにより浮遊細胞を除去 した。上清の一部をウェスタンプロット分析に供した。ポリ L-リジンをコートしたチャン バースライド上のコンディションド培地上に-ユーロンをプレートし， 12時間又は 24時 間インキュベートした。軸索アツセィのために，細胞を 4%(w/v)パラホルムアルデヒドで 固定し，ニューロンに特異的な j8チューブリン IIIタンパク質を認識するモノクローナル 抗体 (Tujl, 1:1000, Covance Research Products, Inc., アメリカの Denver)をで免 疫染色した。次いで， j8チューブリン III陽性-ユーロンのそれぞれについて最長の突 起 (軸索)の長さを測定した。
[0045] 脊髄損傷
麻酔した (ペントバルビタールナトリウム， 40 mg/kg)雌 Wistarラット (200— 250g)に， 脊椎レベル T10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。 No.llブレードを用いて脊 髄を切断することにより後索，皮質脊髄路及び後角の一部の損傷部位を作出した。 次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで， 1日に少なくとも 2 回，腹腔に圧力を加えて膀胱を圧迫した。
[0046] 抗ラット RGM様タンパク質抗体の産牛.
RGM様タンパク質の部分ペプチド (309-322aa)をィ匕学合成し，これを免疫原として 用いて抗ラット RGM様タンパク質ゥサギ抗血清を得た。これをァフィ-ティ精製し，免 疫組織ィ匕学及び免疫プロットのためには 1 μ g/mlの濃度で， 中和抗体アツセィのため には 10 g/mlの濃度で用いた。
[0047] 組織調製及び免痔組織化学
免疫組織化学のために，未損傷脊髄又は損傷後 6時間， 1日， 3日若しくは 7日の 脊髄から新鮮な凍結組織を得た。ジェチルエーテルで深く麻酔した後，頭部切除し ，脊髄を取り出し， Tissue Tek OCT (商品名）中に包埋し，直ちにドライアイス上で - 80°Cで凍結した。一連の傍矢状切片をクライオスタツト上で 18 mの位置で切断し， APS coating Superfrost-Plus slide (商品名，大阪の松浪硝子工業社製）上にマウ ントした。切片を 4%(w/v)パラホルムアルデヒドで室温， 1時間固定し， PBSで 3回洗浄 し， 5%ャギ血清 (GS)及び 0.1% Triton X- 100(商品名）を含む PBS中で，室温， 1時間 ブロックした。切片を一次抗体と共に 4°Cで一夜インキュベートし， PBSで 3回洗浄し， フルォレツセイン結合二次抗体 (1:1000; Molecular Probes社製）と共に室温， 1時間 インキュベートした。抗ラット RGM様タンパク質ポリクローナル抗体 (1 μ g/ml),抗神経 膠線維酸性タンパク質 (GFAP)モノクローナル抗体 (1:1000, Sigma社製），抗ミエリン Z乏突起神経膠細胞特異的特異的蛋白 (MOSP)モノクローナル抗体 (1 :500;
Chemicon社製)又は βチューブリン IIIタンパク質を認識するモノクローナル抗体 (Tujl, 1:1000, Covance社製)を一次抗体として用いた。試料を共焦点走査電子顕 微鏡（ドイツ国 Jenaの Carl Zeiss社製)で調べた。抗ラット RGM様タンパク質抗体の特 異性を調べるために，対照及び脊髄損傷 (SCI)切片を，ラット RGM様タンパク質特異 的ペプチド (309-322aa)の存在下で染色した。組織は， 10 g/mlの該ペプチドを添カロ することにより全く染色されなくなった (データ示さず)。
[0048] 中和抗体アツセィ
対照 CHO細胞又は RGM- CHO細胞の PI-PLC処理により誘導されたコンディション ド培地中のポリ L-リジンコートチャンバースライド上に小脳顆粒-ユーロンをプレート した。 RGM-CHO細胞の PI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地に抗ラット RGM様タンパク質抗体 (10 /z g/ml)を添カ卩した。 24時間インキュベート後，成長アツセ ィを上記と同様に行なった。
[0049] ウェスタンブロットアツセィ
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤 （ドイツ国 Manheimの Roche Diagnostics社製)を 含む， 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10%グリセロール， 0.5% Brij-58 (Sigma社製)で対照 CHO細胞又は RGM-CHO細胞を溶解した。細胞溶解物 を 13000g, 4°C, 10分間の遠心で清澄化し，上清を回収し， Bio-Rad DC protein assay kit (商品名）を用いてタンパク濃度を正規ィ匕した。 12% -メルカプトエタノール を含む試料バッファ一中で，等量のタンパク質を 5分間煮沸し， SDS-PAGEにかけた 。溶解バッファー処理を除き，コンディションド培地も同様に処理した。タンパク質を PVDF膜に転写し， 5%スキムミルク及び 0.05% Tween 20(商品名）を含む PBS中で， 室温， 1時間ブロックした。抗ラット RGM様タンパク質ポリクローナル抗体 (1 g/ml)又 は抗 HAモノクローナル抗体 (1:1000, Sigma社製）で膜を一夜プロットした。検出のた めに, ECL chemiluminescence system (商品名, Amersham Biosciences干土製)及 び HRP (セィヨウヮサビペルォキシダーゼ) -結合二次抗体 (1:1000; Cell Signaling Technology社製）を用いた。
[0050] 腿
索成長アツセィ
小脳顆粒-ユーロンを，ラット RGM様タンパク質発現 CHO細胞又は対照 CHO細胞 のコンフルーェント単細胞層上にプレートして行なった軸索成長アツセィの結果を図 1に示す。図 1に示すように， RGM様タンパク質発現 CHO細胞上で小脳顆粒-ユーロ ンを培養した場合には，軸索長さが対照に比べて有意に短力つた。一方，本発明の 軸索成長促進剤である Y27632を培地に添加した場合には，対照と同程度に軸索が 成長し， RGM様タンパク質発現 CHO細胞上で培養した場合に比べ，有意に軸索が 成長された。
[0051] 溶液の形態にある RGM様タンパク質が軸索成長を阻害するか否かを調べた。試験 に先立ち，培地を PI- PLCで処理することにより， HA-RGM様タンパク質が培地に遊 離されることを抗 HA抗体を用いた免疫染色により確認した。なお， PI-PLCにより， GPI (グリコシルホスファチジルイノシトール)-結合タンパク質が膜から遊離される。 RGM様タンパク質は，上記の通り-ヮトリ RGMと相同性が高く， GPI-結合タンパク質 であると予測されたため， Pト PLC処理を行なった。その結果， Pト PLC処理を行なつ た RGM様タンパク質発現 CHO細胞の培地においてのみ，免疫染色により HA-RGM 様タンパク質が検出され，対照 CHO細胞の培地及び Pト PLC処理を行なわな力つた RGM様タンパク質発現 CHO細胞の培地中には， HA-RGM様タンパク質は全く検出さ れなかった。このことから， RGM様タンパク質は， GPI-結合タンパク質であり， PI-PLC 処理により溶液中に遊離されることが確認された。
[0052] 各コンディションド培地で処理した-ユーロンの軸索長さを図 2に示す。図 2に示す ように， RGM様タンパク質発現 CHO細胞を PI- PLC処理した培地で処理した-ユーロ ンのみ，軸索の成長が有意に阻害された。これは， RGM様タンパク質が，軸索の成 長を阻害する作用を有していることを示している。また，対照の CHO細胞の培地では , Pト PLC処理の有無により軸索長さは変わらな力つた。このことは， P卜 PLC処理自体 力 軸索成長に影響を与えないことを示している。
[0053] RGM様タンパク質の脊髄中での分布
試験に先立ち，作製した抗 RGM様タンパク質抗体が RGM様タンパク質に対して特 異性を有するカゝ否かの確認試験を行なった。抗 HA抗体又は作製した抗 RGM様タン パク質抗体を用い， PI- PLC処理を行なった RGM様タンパク質発現 CHO細胞の培地 についてウェスタンプロットを行なった。その結果，抗 HA抗体を用いた場合も，作製し た抗 RGM様タンパク質抗体を用いた場合も，全く同じ位置 (約 35Kダルトン）にバンド が検出され，対照では検出されな力つた。さらに，抗 RGM様タンパク質抗体を作製す る際に，免疫原として用いた上記ペプチドを 10 g/mlの濃度で抗 RGM様タンパク質 抗体に添加し，それを用いて成熟ラットの損傷脊髄又は正常脊髄の新鮮な凍結切片 の免疫組織染色を行なうと，全く染色されなくなった。これらのことから，作製した抗 RGM様タンパク質抗体が， RGM様タンパク質に対して特異性を有する (抗原抗体反 応する）ことが確認された。
[0054] RGM様タンパク質の分布を調べるために，成熟ラットから新鮮な凍結切片を調製し ,免疫組織染色を行なった。この免疫組織染色は具体的に次のようにして行なった。 まず，新鮮凍結切片を室温にて十分に乾燥させた。リン酸緩衝 4%パラホルムアルデ ヒド溶液で 1時間固定し，ブロッキング操作を 1時間，次に一次抗体処理を 4°Cにて一 晚行い，二次抗体処理を室温にて 1時間行った。ブロッキング溶液として 0.1Mリン酸 緩衝食塩水の中にャギ血清 10%, tritonX 0.1%を添カ卩したものを用いた。一次抗体液 として上記のブロッキング溶液に抗 RGM様タンパク質を 1 μ g/mlを添カ卩したものを用 いた。二次抗体液として 0.1Mリン酸緩衝食塩水の中にャギ血清 10%とフルォレツセィ ン結合二次抗体（1:1000; Molecular Probes社製）を用いた。その結果， 白質及び 灰白質の両方において， RGM様タンパク質が恒常的に発現していることがわ力つた。
[0055] 抗 RGM様タンパク質-杭- MOSP (ミエリン Z乏突起神経膠細胞特異的タンパク質） で二重染色することにより， RGM様タンパク質は乏突起神経膠細胞及び白質中のそ の突起中で発現していることが示された。さらに， RGM様タンパク質は， Tujl (ニューロ ン特異的 j8チューブリン IIIタンパク質)-陽性-ユーロンの細胞体に局在化しており， 白質中のこれらの細胞の軸索には局在化していな力つた。抗ラット RGM様タンパク質 抗体及び抗星状細胞マーカー GFAP (神経膠線維酸性タンパク質)で二重免疫組織 化学染色を行なったところ，これらが共に局在化している部位は全くな力つた。このこ とは， RGM様タンパク質が星状細胞中に存在しないことを示している。総合すると， RGM様タンパク質は，ニューロン及び星状細胞により発現され，脊髄中におけるその 発現パターンは Nogo又は OMgpに類似して 、る。
[0056] 脊髄損傷後の RGM様タンパク皙発現
RGM様タンパク質の発現は，損傷部位の中心並びに損傷部位の頭側及び尾側の 白質中において検出された。中心領域では，損傷 6時間後には，組織構造は正常に 見えた。退行変化が観察され始める損傷 1日一 3日後には， RGM様タンパク質に対 する免疫反応は，損傷部位上及び異所性細胞外マトリックス中にも観察された。この 細胞外免疫反応性は， RGM様タンパク質発現細胞の退行に起因するものカゝもしれな い。中心領域における RGM様タンパク質発現細胞を特徴付けるために，抗 GFAP-抗 RGM様タンパク質，抗 MOSP-抗 RGM様タンパク質，及び抗 Tujl-抗 RGM様タンパク 質を用い，損傷 7日後の組織について二重標識実験を行なったところ，二重標識細 胞（すなわち， GFAP陽性及び RGM様タンパク質陽性， MOSP陽性及び RGM様タン パク質陽性，又は Tujl陽性及び RGM様タンパク質陽性）は観察されな力つた。中枢 神経系への損傷が，グリア細胞性瘢痕をもたらすことを考慮すると，これらの細胞は， 例えば小グリア細胞，マクロファージ，乏突起神経膠前駆細胞，線維芽細胞，軟膜細 胞及び Z又はシュワン細胞などの，グリア細胞性瘢痕を構成する他の種類の細胞で あるかちしれない。
[0057] 中心領域に隣接する白質中では， RGM様タンパク質 免疫陽性細胞及び免疫反 応性の強度は， 6時間後までほとんど変化しな力つた。し力しながら，術後 1日ないし 3日において，それらは連続的に増大した。 7日後には，無傷の脊髄に比べて有意 にその密度が高くなつた。白質中の RGM様タンパク質発現細胞を特徴付けるために ,損傷 7日後の組織について二重標識実験を行なった。抗 RGM様タンパク質ー抗 GFAP及び抗 RGM様タンパク質ー抗 Tujlを用いて二重染色を行なったところ，二重標 識細胞は観察されな力つた。これにより，これらの細胞は星状細胞でも-ユーロンでも な!ヽことが確認された。 RGM様タンパク質及び MOSPで二重染色を行なったところ， 二重染色された細胞が検出された。このことは，脊髄損傷後， RGM様タンパク質が乏 突起神経膠細胞中で強く発現されることを示している。最終的に，全ての MOSP発現 細胞が RGM様タンパク質を発現することが確認され， RGM様タンパク質陽性で MOSP 陰性細胞は観察されな力つた。白質中のこれらの細胞は，損傷部位の中心で観察さ れた細胞と同じであると考えられる。従って， RGM様タンパク質は，損傷部位の中心 及びそれに隣接する白質において，脊髄の損傷に応答して発現が増大する。
[0058] 抗 RGM様タンパク質抗体による. RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性の中和 結果を図 3に示す。図 3中， 「*」は， RGMが対照に対して有意に短いことを示して おり， 「**」は， RGM+抗 RGM力 RGMに対して有意に長くなつていることを示している 。図 3に示すように，抗 RGM様タンパク質抗体を添加すると， RGM様タンパク質による 軸索成長阻害活性は有意に中和された。これにより，抗 RGM様タンパク質ポリクロー ナル抗体が，軸索成長促進剤として利用可能であることが確認された。
実施例 2
[0059] 1.方法
(1) 外科的施術
麻酔した（ペントバルビタールナトリウム， 40mg/kg)雄 Wistarラット（200— 250g)に， 脊椎レベル T9/10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。 No. l lブレードを用いて 脊髄の背側の部分を 1.8mmの深さに切った。組織学的検査により，全ての動物にお いて，これらの損傷は，後柱中の全ての背側の皮質脊髄路 (CST)線維及び外側皮 質脊髄路を切断し， 中心管を超えて延びていた。この脊髄半側切断の直後，対照抗 体 (8匹， 22.3
Figure imgf000021_0001
·日， 2週間）又は実施例 1で作製した抗 RGM様タンパク質抗体（ 8匹， 22.3 μ g/kg -日， 2週間）を満たした浸透圧ミニポンプ（200 μ L溶液， 0.5 μ L/ 時間， 14日間送達）（米国カリフォルニア州 Cupertinoの Durect Corp.)を装着した。 該ミニポンプは，動物の背中の皮下に置き，ミニポンプの出口に接続されたシリコー ン製チューブは，脊髄半側切断部位の硬膜下に，テイッブが損傷部位の頭側の直近 傍に来るように置いた。該チューブは，椎弓切除術部位の直下肢側の棘突起に縫い つけて固定した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで， 少なくとも 1日 2回，手で腹圧を加えて膀胱を圧迫した。
[0060] (2) 組織調製及び免疫組織化学
組織調製及び免疫組織化学は，実施例 1と同様に行った。
[0061] (3) CSTの順行性標識
損傷 8週間後，下行 CST線維を，ピオチンデキストランァミン (BDA,生理食塩液中 10%,皮質当り 3.5 /z L,分子量 10000,米国オレゴン州 Eugeneの Molecular Probes社 )を，麻酔下，左右の運動皮質に注射した (座標：ブレダマの 2mm後方，ブレダマの 2mm側方，深さ 1.5mm)。各注射において，マイクロリツターシリンジに装着した内径 15 一 20 μ mのガラス毛管を介して， 0.25 μ Lの BDAを 30秒間に亘つて注入した。合計で , 6匹の対照，及び 8匹の SCI後抗 RGM様タンパク質抗体投与ラットについて検査し 比較した。 BDA注射 14日後， PBS及び次いでパラホルムアルデヒドを灌流して動物を 殺した。損傷部位を通る脊髄のクリオスタツト切片を傍矢状に切った (50 ;ζ πι)。損傷 部位の頭側及び下肢側の横断切片を採取した。切片は， 0.5%ゥシ血清アルブミン（ BSA)含有 PBSで 1時間ブロッキングし，次いで， 0.15% BSA含有 PBS中 Alxa Fluor 488- (商品名）結合ストレプトアビジン（1:400, Molecular Probes社）と共に 1日間イン キュペートした。損傷部位の中心から，最も下肢側に延びた， BDA検出 CST線維まで の距離を測定した。
[0062] (4) 行動試験
Basso- Beattie-Bresnahan(BBB)運動評価基準 (Basso, D.M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.し., A sensitive and reliable locomotor rating scale ror open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995》により，損傷後 7週間に 亘り，開放フィールド環境下で行動回復を評価した。盲検的に定量を行った。
[0063] 2.結
(1) RGM様タンパク質の中和による機能的改善
上記の通り，内発性の RGM様タンパク質が，損傷された中枢神経系の軸索の再生 の阻害剤として働くのカゝ否かを評価した。ラットの脊髄の背側 2/3を，脊椎レベル Th9/10において切除することにより，主皮質脊髄路及び外側皮質脊髄路を切除した 。抗 RGM様タンパク質中和抗体又は対照としての IgGを浸透圧ミニポンプにより，胸 部の損傷部の近傍の硬膜下に設置したカテーテルを介して送達した。対照群と処置 群では，損傷の深さに有意差はな力つた。運動動作を監視した。脊髄を損傷しない 擬似手術を施したラットでは， Basso- Beattie- Bresnahan(BBB)運動スコアが満点であ つた。全てのラットは，損傷 1日後には，ほぼ完全に対麻痺状態であった（図 4)。その 後， BBBスコアにより評価される運動行動を部分的に徐々に回復した。脊髄損傷後 4 週間までは，抗 RGM様タンパク質抗体投与動物と対照動物の間に BBBスコアの差は なかった。注目すべきことに，手術の 6週間後から 7週間後の間の運動動作は，抗 RGM様タンパク質抗体を投与されたラットの方が，対照ラットよりも有意に優れていた 。従って，抗 RGM様タンパク質抗体は，脊髄損傷ラットの治療に有効である。
[0064] なお，図 4は，抗 RGM様タンパク質抗体又は対照抗体を投与したラットの，中央胸 部背側の半側切除術後，図示の時間が経過した後の BBBスコアを示すものである。 各群 6匹又は 8匹のラットの平均士標準偏差を示す。 *は，抗 RGM様タンパク質抗体 を投与した群が，その週において，対照群とは有意に異なることを示している。 *:対 照に対して p〈0.05。
[0065] (2) RGM様タンパク質阻害による軸索再生促進
上記の通り，先に試験したラットの一部について， BDAを知覚 運動皮質に注入す ることにより，背側 CST (皮質脊髄路)の完全性を調べた。抗 RGM様タンパク質抗体を 投与した損傷ラットからの試料 (図 5b)は，対照ラットからの試料 (図 5a)と比較して全く 異なったパターンの標識ィ匕を示した。抗 RGM様タンパク質抗体を投与しなかったラッ トにおいては，損傷部位の基端部では，主 CSTは損傷より頭側において途絶してい る（図 5a,c)。この基本的なパターンは，中枢神経系では，軸索の再生が通常起こらな いことを反映している。対照的に，抗 RGM様タンパク質抗体を投与したラットでは，標 識した CSTから出芽した多数の線維が観察された (図 5b,d)。出芽した軸索は， 白質 よりも灰白質中によりょく延びていた。このタイプの多数の線維は，該抗体を投与した 全ての損傷動物において観察された。これは， BDAの取り込みの程度が異なることに 起因するものではあり得ない。なぜなら，損傷部位よりも頭側の背側 CST中の線維の 総数は，抗体投与動物と対照動物の間で差が見られな力つた力 である。両群のラ ットについて，損傷部位を通る縦断面を観察すると，中和抗体を投与されたラットでは , CST線維の退縮がより少なく，多数の側枝 CSTが出芽していた（図 5a,b,i)。抗 RGM 様タンパク質投与ラットにおいて，典型的な不規則的曲折成長を示す再生線維は， 損傷部位のレベルにおける組織橋 (tissue bridge)にお 、て高頻度に見られた（図 5d,f)。これらの再生線維は，背側の白質および損傷瘢痕内に向力つて，かつ，嚢胞 に沿って成長した（図 5f,h)。注目すべきことに，多くの軸索が損傷組織を横切り，穴 の周囲に成長するか又は損傷の中心部内に成長して!/、た。中和抗体を投与された ラットの損傷部位における CST線維を高倍率で顕微鏡観察すると，シナプス様腫脹 に類似した形態を示していた。一方，対照ラットでは， BDAが検出されな力つた（図 5e ) o抗体投与ラットでは，軸索の束は，損傷組織を通って 3.5mmまで成長し，損傷部位 から下肢側に 5mmも延びて ヽるものもあり，多数の標識化線維が観察された（図 5g,h,j) 0一方，対照ラットでは，線維は観察されな力つた。これらの線維の多くは，直 線的な弾道ではなく，分枝及び蛇行を伴っていた。再生線維の最も下肢側において ,主管力も出芽する多くの分枝が観察された。従って，抗 RGM様タンパク質抗体投与 は， CST軸索の再生を促進する。
[0066] なお，図 5中， a,bは， BDA標識した CST線維の代表的な写真であり，頭側を左側に 示す。対照 IgG(a)又は抗 RGM様タンパク質抗体 (b)を投与した脊髄の，順行的に標識 した，損傷 10週間後の CST線維を示す（図 5及び 6において RGM様タンパク質を「 RGMa」と記載)。損傷部位の中心を星印で示す。図 5中， c一 gは，図 5の a及び bの， 四角で囲んだ領域を，より高倍率で観察した写真である。抗 RGM様タンパク質抗体 を投与したラットでは，増加した側枝 CST線維が，頭側に出芽し (d),損傷部位におい て再生線維が見られる (f,矢印）が，対照 IgGを投与したラットでは対応する領域にお いてこれらは観察されな力つた (c, e)。 hは bと同一の動物の別の切片であり，損傷部 位の中心（矢印）から 2.6mm下肢側における再生線維を示す。スケールバーは， aと b 力 00 m, c— 00 m, gと hが 200 mである。 iは，抗 RGM様タンパク質抗体又 は IgG (n=6— 8Z群）を投与したラットにおける，脊髄損傷 10週間後の， BDA検出主 CST線維の損傷部位中心からの距離を示す。 *：対照に対し， pく 0.01。抗 RGM様タ ンパク質抗体は，損傷した主 CSTの退縮を抑制することを示す。 jは，抗 RGM様タンパ ク質抗体又は IgG (n=6— 8Z群）を投与したラットにおける，脊髄損傷 10週間後の， 最も下肢側の BDA検出 CST線維の損傷部位中心からの距離を示す。 *：対照に対し , p〈0.01。
実施例 3
[0067] 1. 方法
(1) GTP- RhoAの親和性沈殿
1% Triton X- 100 (商品名）， 0.5%デォキシコール酸ナトリウム， 0.1% SDS, 500mM NaCl 及び 10 mM MgCl , 10 μ g/mlのロイぺプチン及び 10 μ g/mlのァプロチュン
2
を含む 50mM Tris (pH7.5)で細胞を溶解した。細胞溶解物を， 13000g, 4°C, 10分 間遠心して清澄化し，上清を， Rhotekin beads (商品名， Upstate Biotech社製)の 20 μ gの GST- Rho結合領域と共に 4°Cで 45分間インキュベートした。洗浄バッファー (1% Triton X- 100 (商品名）， 150mM NaCl, 10 mM MgCl ,各 10 g/mlのロイべプチ
2
ン及びァプロチュンを含む 50mM Tris (pH7.5))でビーズを 4回洗浄した。 RhoAに対 するモノクローナル抗体 (米国カリフォルニア州 Santa Cruz の Santa Cruz Biotech 社製)を用いたウェスタンプロットにより，結合された Rhoを検出した。
[0068] 2.結果
(2) GTP- RhoAの親和性沈降
ニューロン中の RhoA活性を測定した。生後 7日のラットの小脳-ユーロンに各コン ディションド培地を添カ卩し 30分経過した時点で， RhoAの活性を測定した（図 6)。図 6 に示すように， RGM様タンパク質発現 CHO細胞を PI- PLC処理した培地で培養した- ユーロンでは，対照の CHO細胞の培地で培養した-ユーロンに比較し， Rhoの活性 化が認められた。この結果は， RGM様タンパク質が Rhoを活性ィ匕することを示してい る。
産業上の利用可能性
[0069] 本発明の軸索再生促進剤は，損傷した中枢神経の再生に有効であり， 中枢神経系 を損傷した患者のための治療剤として有用である。
図面の簡単な説明
[0070] [図 1]小脳顆粒-ユーロンを，ラット RGM様タンパク質発現 CHO細胞又は対照 CHO細 胞のコンフルーェント単細胞層上にプレートして行なった軸索成長アツセィの結果を 示す図である。縦軸は，ニューロンごとの最長の軸索の平均長さを示す。データは， 3回の実験の平均士標準偏差である。「*」は対照と比較して pく 0.01, 「**」は RGMと 比較して p〈0.01(Studentの検定）を示す。
[図 2]各コンディションド培地で処理した-ユーロンの軸索長さを示す図である。縦軸 は，ニューロンごとの最長の軸索の平均長さを示す。データは， 3回の実験の平均士 標準偏差である。「*」は， PI- PLC処理した対照 CHO細胞のコンディションド培地中 で培養した-ユーロンの軸索長さに比較して p〈0.01であることを示す。
[図 3]抗 RGM様タンパク質ポリクローナル抗体を添カ卩した又は添カ卩しな 、， RGM様タ ンパク質含有培地中で培養した小脳顆粒-ユーロンの軸索成長アツセィの結果を示 す。縦軸は，ニューロンごとの最長の軸索の平均長さを示す。データは， 3回の実験 の平均士標準偏差である。「*」は対照と比較して p〈0.01, 「**」は RGMと比較して pく
0.01(Studentの検定）を示す。対照と RGM+抗 RGMの間に有意差はなかった。
圆 4]抗 RGM様タンパク質抗体又は対照抗体を投与したラットの，中央胸部背側の半 側切除術後，図示の時間が経過した後の BBBスコアを示す図である。
圆 5]中央胸部背側の半側切除術を行 ヽ，抗 RGM様タンパク質抗体又は対照抗体を 投与したラットの，脊髄の顕微鏡写真及び再生皮質脊髄路 (CST)線維の損傷中心 部からの距離を示す図である。
[図 6]RGM様タンパク質で処理したラット小脳-ユーロン中の活性ィ匕 Rhoを測定したゥ エスタンブロットの結果を示す図である。

Claims

請求の範囲
[1] RGM様タンパク質阻害剤を有効成分として含有する軸索再生促進剤。
[2] 前記 RGM様タンパク質阻害剤が，抗 RGM様タンパク質抗体である請求項 1記載の 軸索再生促進剤。
[3] 前記 RGM様タンパク質阻害剤が， Y27632である請求項 1記載の軸索再生促進剤。
[4] 前記軸索が，中枢神経系の軸索である請求項 1ないし 3のいずれ力 1項に記載の 軸索再生促進剤。
[5] 軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質を RGM様タンパク 質と接触させ，前記試験物質が RGM様タンパク質の機能を阻害するか否かを判定す ることを含む方法。
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