WO2005078456A1 - Verfahren zur bestimmung der bildung von endothelinen zu zwecken der medizinischen diagnostik, sowie antikörper und kits für die durchführung eines solchen verfahrens - Google Patents

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Andreas Bergmann
Joachim Struck
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Definitions

  • the invention relates to methods for determining the formation of endothelins in severe diseases by determining peptide fragments of the corresponding pro-endothelin, in particular a relatively long-lived C-terminal partial peptide of prepro-endothelin-1, in the circulation (whole blood, plasma or serum ) for the purpose of medical diagnostics, in particular in the context of sepsis diagnostics, cardiac diagnostics and e.g. also in cancer diagnosis and / or in general in the context of the diagnosis of such disease states in which endotheline play an important role in the course of the disease.
  • endothelin is used in the context of the present application, this term stands primarily for endothelin-1 (ET-1). A corresponding statement, however, is often also valid for other isoforms of endothelins, which is why a restriction to endothelin-1 often does not appear to be necessary and the invention is also intended to extend to other endothelins in a broader sense.
  • diagnosis is basically used as a simplifying generic term, which is also intended to include, in particular, prognostics / early prognostics and follow-up therapy monitoring.
  • the determinations are carried out in particular by means of specific immunodiagnostic methods, in particular by means of immunoassays of a type in which at least one labeled antibody is used (sandwich assay; co-operative assay, e.g. according to the SPALT or SPART principle).
  • Endothelin-1 (ET-1), a 21 amino acid peptide, is the most potent vasoconstrictor known. Since its discovery in 1988 by Yanagisawa and colleagues [27; Figures in square brackets refer to the attached literature list], biosynthesis, mode of action and association with diseases have been extensively investigated and summarized in current review articles [1, 1, 12, 17, 24]. There are three isoforms of endothelin (endothelin-1, endothelin-2, endothelin-3) encoded by different genes, of which endothelin-1 is present in the greatest concentrations and is the most effective. Endothelin-1 is synthesized in endothelial cells, in the lungs, in the heart, in the kidneys and in the brain.
  • the primary translation product of the human endothelin-1 gene is a 212 amino acid peptide, prepro-endothelin-1 (SEQ ID NO: 1).
  • the signal peptidase removes a short N-terminal signal sequence (amino acids 1-17) of the prepro-endothelin.
  • the resulting pro-endothelin is then processed by the protease furin on dibasic amino acid pairs to form a biologically inactive, 38-amino acid peptide big-endothelin (SEQ ID NO: 3), from which finally using endothelin-covering enzymes (ECEs) the mature, biologically active endothelin-1 (SEQ ID NO: 2) is formed.
  • Endothelin works by binding to specific receptors that are localized on muscle cells, myocytes and fibroblasts. This bond leads to calcium efflux, activation of phospholipase C and inhibition of Na / K ATPase. In addition to the vasoconstrictive effect, endothelin also has growth-regulating properties.
  • cardiovascular diseases [1] including pulmonary hypertension [21], atherosclerosis [13], congestive heart failure [25], heart attack [20]), sepsis and septic shock [11, 22, 23], cancer [2, 3 , 15, 18], among others.
  • the immunoassays used to measure endothelin in plasma samples (see the overview in [17]) belonged in particular to the type of radioimmunoassay (with labeled endothelin-1 as a competitor) or to the EIA / ELISA type and aimed exclusively at determining the endothelin from or on the determination of an endothelin immunoreactivity.
  • RIA-type assays have a lower specificity and also detect related peptides containing the endothelin sequence.
  • endothelin-1 (ET-1) has an extremely short residence time in the circulation and that it is removed from the circulation after only 1-2 minutes [6]. Since endothelin-1 is considered stable in blood and plasma [6], the most important reason for the short residence time is its distribution in other tissues and its fast and viewed high affinity binding to receptors. As a result, significantly higher endothelin-1 concentrations could be determined in certain tissues and body fluids than, for example, in plasma [1, 7]. In view of these circumstances, the validity of the determination of ET-1 in plasma samples was questioned [17].
  • ET-1 endothelin
  • big ET-1 the so-called big endothelin
  • SEQ ID NO: 3 The determination of the ET-1 precursor, the so-called big endothelin
  • this "big endothelin” was therefore determined instead of the actual endothelin.
  • assays of the sandwich type were used for its specific determination, which enable a reliable differentiation of the big-endothelin-1 from the processed ET-1 and other endothelins [4, 8, 10]. They showed that in certain diseases the elevated ET immunoreactivities can be attributed to big ET.
  • the selective measurement of the big-ET-1 is only a gradual improvement, but not an actual solution to the problem, because big endothelin can also be quickly processed into endothelin in the blood circulation [1, 5, 9]. It also has a relatively short biological half-life (20-25 minutes) [10], and consequently a measured value for the big endothelin that can be determined in plasma also only represents an instantaneous plasma concentration and does not reflect the actually physiologically effective concentrations Endothelin.
  • ET-1 which is physiologically formed under the conditions of a disease but is already processed and bound in tissues or to receptors, is not detected in the determination of big ET-1 in plasma. The total amount of physiologically active endothelin is therefore also underestimated when measuring big endothelin.
  • the present invention has set itself the task of developing a determination method which enables the endogenous formation of big endothelin and endothelin, i.e. reflects the total physiological concentration and thus the effect of endothelin more reliably than the previous determinations of ET or big-ET in plasma.
  • ET ET 1
  • / or its precursors in various disease states, in particular in sepsis or other disease states in which increased values for endothelin play a role
  • ET or big-ET is not determined for diagnostic purposes in a whole blood, plasma or serum sample of a human patient, but rather a comparatively long-lived prepro or pro-endothelin partial peptide which contains the ET or does not contain big ET sequences, in particular a C-terminal partial peptide which at least contains the amino acids 168-212 of the pre-proET-1.
  • Claim 1 relates to the teaching of the present invention. Advantageous and currently preferred embodiments of the invention can be found in the subclaims.
  • the invention is based on experimental investigations by the applicant, in which it was able to show that those parts of the prepro-endothelin which are not direct precursors of the endothelin comprise long-lived peptides suitable for measurement purposes, which are measured reliably in blood samples and with a high clinical value can be.
  • Endothelin-1 is formed physiologically by processing the larger precursor molecule prepro-endothelin (SEQ ID NO: 1) or the secreted pro-endothelin obtained therefrom.
  • prepro-endothelin SEQ ID NO: 1
  • pro-endothelin obtained therefrom.
  • further peptides have to be formed in primarily stoichiometric amounts, which, however, have never been the subject of scientific studies before and nothing is known about their possible further processing and stability.
  • cleavage product could thus represent the desired method for determining the physiological endothelin concentration or production, which is referred to in the claims as determining the "formation of endothelin".
  • This term refers to the fact that - assuming only one, namely the only known pathway of formation of endothelin-1 from prepro-endothelin - the physiological concentrations of endothelin-1 formed in connection with a disease only the amount of the previously processed Prepro-endothelins or pro-endothelins can correspond.
  • the partial peptides formed in addition to big endothelin or endothelin in the same stoichiometric concentration represent stable "metabolic slugs" that are neither bound to receptors nor distributed in tissues, they must be found in the circulation.
  • the "determination / measurement of the formation of endothelin” can also be regarded as a measurement of "secretory activity” or "secretory pro-endothelin production”.
  • the peptide fragments to be determined are identified as "long-lived".
  • long-lived means that such peptide fragments in whole blood and a plasma obtained therefrom are not subject to any further rapid proteolytic cleavage and, compared to the rate of binding of the endothelin to receptors and the proteolytic cleavage of fragments, at a significantly slower rate from the Circulation or Metabolism to be removed.
  • the information about the secretory activities which have already expired is stored for a period of time which is at least suitable for unproblematic measurement.
  • the amount of "long-lived" fragments that can be measured after a certain time corresponds to the amount released originally, minus just an amount equal to the physiological half-life of the peptide fragment to be measured is linked in the circulation.
  • the measurable concentration of a peptide fragment that is long-lived in the above sense reflects the previous physiological production of the precursor cumulatively, again only reduced by the concentration reduction that occurred in the same period of the peptide fragment according to its physiological clearance rate.
  • the active endothelin, or its predecessor big-endothelin can be processed or removed from the circulation long ago in the same period and, for example, bound to receptors and therefore no longer measurable.
  • a constant concentration over longer periods means that education and clearance are 'in balance'. If the concentration drops, this may indicate that the secretion of the precursor molecule (eg proendothelin) has ceased, for example because the molecular stores are exhausted, and the changes in concentration that can be observed are only determined by the clearance speed.
  • the results of the measurement of a long-lived peptide fragment without a known physiological function thus provide both quantitatively and qualitatively different results than a measurement of a rather short-lived active peptide or its likewise relatively short-lived precursor.
  • FIG. 1 shows a typical standard curve for the presently preferred sandwich assay with two antibodies, which is described in more detail in the experimental section and bind to amino acid sequences which correspond to positions 168-181 and 200-212 of prepro-endothelin-1, for determining a C-terminal pro Endothelin peptide sequence in human plasma;
  • FIG. 2 is a diagram which shows that when EDTA plasma samples from septic and cardiological patients are stored at room temperature for 12 hours, there is no significant loss of immunoreactivity in an assay according to FIG. 1;
  • FIG. 3a shows the measurement of plasmas from 5 groups of human patients with various diseases / diagnoses, compared with the measurements for apparently healthy people; the dotted line shows the maximum value found in healthy people (line for 100% specificity related to healthy Controls);
  • FIG. 3b shows a representation corresponding to FIG. 3a, for four further groups of patient plasmas
  • the method according to the invention relates to the determination of a relatively long-lived peptide fragment of pro-endothelin-1, which does not contain the amino acid sequences of endothelin-1 or its precursor big-endothelin, in whole blood, plasma or serum samples, ie in the circulation of patients, for the indirect determination of the formation of endothelins, in particular endothelin-1, in the case of serious diseases.
  • the particular peptide fragment is a C-terminal fragment to which two antibodies bind that bind to peptides with amino acid sequences corresponding to positions 168-181 and 200-212 of prepro-endothelin-1.
  • Non-competitive sandwich immunoassays have a number of advantages over competitive immunoassays, including the fact that they can be designed better than solid-phase assays (heterogeneous assays), can be more robust in terms of manageability, and measurement results with a higher one Can deliver sensitivity and are also better suited for automation and series measurement.
  • sandwich immunoassays recognize only those molecules or peptides in which both binding sites for the antibodies used for sandwich formation are on the same molecule available.
  • the antibodies which can be used can in principle be any suitable monoclonal and / or polyclonal antibodies, although polyclonal antibodies which have been purified from affinity are currently preferred.
  • the antibodies are particularly preferably obtained by immunizing an animal, in particular sheep, with an antigen which contains a synthetic peptide sequence which corresponds to a short amino acid sequence of prepro-endothelin-1 and has an additional cysteine residue at the N-terminus.
  • the following experimental section describes in particular antibodies or their use in an assay, which bind to the amino acid sequences 161-181 and 200-212.
  • additional antibodies were also used in the course of the investigations, which bind to positions 184-203 and 136-148 accordingly. The supplementary results obtained with these additional antibodies during measurements are only discussed in general terms in this application.
  • the method is carried out as a heterogeneous sandwich immunoassay, in which one of the antibodies is attached to any solid phase, for example the walls of coated test tubes (for example made of polystyrene, coated tubes; CT) or on microtiter plates, for example made of polystyrene , or is immobilized on particles, for example magnetic particles, while the other antibody carries a residue which is a directly detectable label or enables a selective link to a label and serves to detect the sandwich structures formed.
  • a delayed or subsequent immobilization using suitable solid phases is also possible.
  • all labeling techniques that can be used in assays of the type described can be used, including labels with radioisotopes, enzymes, fluorescence, chemiluminescence or bioluminescence labels and directly optically detectable color markings, such as gold atoms and dye particles, such as are used in particular for so-called point-of-care (POC) or rapid tests for determination in whole blood samples.
  • POC point-of-care
  • the two antibodies can also have parts of a detection system of the type described below in connection with homogeneous assays.
  • the method according to the invention can also be designed as a homogeneous method in which the sandwich complexes formed from the two antibodies and the peptide fragment to be detected remain suspended in the liquid phase.
  • detection techniques can be designed in particular as fluorescence amplification or quenching detection methods.
  • a particularly preferred method of this type relates to the use of detection reagents to be used in pairs, as described, for example, in US Pat. No. 4,822,733, EP-Bl-180 492 or EP-Bl-539 477 and the prior art cited therein.
  • the determination method according to the invention can also be carried out particularly advantageously in the context of a so-called multiparameter diagnosis, both in the field of cardiac diagnosis as well as sepsis and cancer diagnosis.
  • Other parameters determined here are, for example, the cardinal parameters ANP, BNP, proANP, proADM or proBNP or sepsis parameters, which e.g.
  • anti-ganglioside antibodies are selected from the group consisting of anti-ganglioside antibodies, the proteins procalcitonin, CA 125, CA 19-9, S100B, SlOOA proteins, LASP-1, soluble cytokeratin fragments, in particular CYFRA 21, TPS and / or soluble cytokeratin 1 fragments (sCYlF), the peptides inflammin and CHP, other peptide prohormones, glycine-N-acyltransferase (GNAT), carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS 1) and the C-reactive protein (CRP) or fragments from that.
  • the multiparameter determinations mentioned provide for the measurement results for several parameters to be determined simultaneously or in parallel, and e.g. with the help of a computer program that also uses diagnostically significant parameter correlations.
  • the invention will hereinafter be described by a description of the preparation of the preferred assay components, the implementation of a preferred embodiment of a sandwich-type assay and the results obtained by using such an assay, the determination of a C-termian peptide fragment in EDTA plasmas from control persons, and of sepsis, heart and cancer patients explained in more detail.
  • NSVKSSFHDPKLKGKPSRER SEQ ID NO: 6
  • the MBT m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • Sheep were immunized with these conjugates according to the following scheme: Each sheep was initially given 100 ⁇ ⁇ _ conjugate (mass specification based on the peptide content of the conjugate) and then 4 ⁇ l conjugate each 4 weeks (Mass data based on the peptide content of the conjugate).
  • the peptide-specific antibodies were prepared from the antisera which had been obtained beginning with the fourth month after the immunization.
  • the peptides PCT15 and PCW14 were first coupled to SulfoLink Gel (see instructions for use "SulfoLink Kit” from PIERCE, Rockford, IL, USA). 5 mg of peptide per 5 ml of gel were offered for coupling.
  • the peptide columns were first washed three times alternately with 10 ml elution buffer r (50 mM citric acid, pH 2.2) and binding buffer (100 mM sodium phosphate, 0.1% Tween, pH 6.8). 100 ml of the antisera were filtered through 0.2 ⁇ m and the existing column material was added. For this purpose, the gel was rinsed out of the column quantitatively with 10 ml of binding buffer. The incubation was carried out overnight at room temperature with swirling. The batches were transferred quantitatively into empty columns (NAP 25, Pharmacia, emptied). The runs were discarded. The mixture was then washed protein-free with 250 ml of binding buffer (protein content of the wash eluate ⁇ 0.02 A280 nm).
  • Elution buffer was added to the washed columns and 1 ml fractions became collected.
  • the protein content of each fraction was determined using the BCA method (see work instructions from PIERCE, Rockford, IL, USA). Fractions with protein concentrations> 0.8 mg / ml were pooled. After protein determination of the pools using the BCA method, yields of 97 mg were found for the anti-PCT15 antibody 0407-pAk and 60 mg for the anti-PCW14 0410-pAk antibody.
  • the anti-PCW14 0410-pAk antibody was treated as follows:
  • chemiluminescent labeling of the antibody 67 ⁇ l of the antibody solution were mixed with 10 ⁇ l MA70 acridinium NHS ester (1 mg / ml; HOECHST Behring) and incubated for 15 minutes at room temperature. Then 423 ⁇ l of 1 M glycine were added and incubated for a further 10 minutes. The labeling approach was then buffered in a 1 ml mobile phase A (50 mM potassium phosphate, 100 mM NaCl, pH 7.4) using a NAP-5 gel filtration column (Pharmacia) according to the work instructions and thereby freed from low-molecular components.
  • MA70 acridinium NHS ester 1 mg / ml; HOECHST Behring
  • a gel filtration HPLC (column: Waters Protein Pak SW300) was carried out to remove the last residues of labels not bound to antibodies.
  • the sample was applied and chromatographed with solvent A at a flow rate of 1 ml / min.
  • the wavelengths 280 nm and 368 nm were measured with a flow photometer.
  • the absorption ratio 368 nm / 280 nm as a measure of the degree of labeling of the antibody was 0.10 at the peak.
  • Retention time 8-10 min were collected and in 3 ml of 100 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, 5% bovine serum albumin, 0.1% sodium azide, pH 7.4.
  • the anti-PCT15 antibody 0407-pAk was treated as follows:
  • Irradiated 5 ml polystyrene tubes (from Greiner) were coated with purified antibody as follows: The antibody was dissolved in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.8 at a concentration of 6. Diluted 6 ⁇ g / ml. 300 ⁇ l of this solution were pipetted into each tube. The tubes were incubated at 22 ° C for 20 hours. The solution was suctioned off. Then each tube was filled with 4.2 ml of 10 mM sodium phosphate, 2% Karion FP, 0.3% Bovine Serum Albumin, pH 6.5. After 20 hours the solution was suctioned off. Finally, the tubes were dried in a vacuum dryer.
  • an assay buffer of the following composition was prepared: 100 mM sodium phospha, 150 mM NaCl, 5% bovine serum albumin (BSA), 0.1% non-specific sheep IgG, 0.1% sodium azide, pH 7.4
  • Measurement samples were EDTA plasmas from apparently healthy people, from patients with sepsis and from patients with various cardiovascular diseases. 50 ⁇ l standards or samples and 200 ⁇ l assay buffer were pipetted into the test tubes. It was incubated for two hours at 22 ° C. with shaking. The mixture was then washed 4 times with 1 ml of washing solution (0.1% Tween 20) per tube and allowed to drain. Then 200 ⁇ l assay buffer containing 1 million RLU (relative light units) of the MA70-labeled antibody were pipetted. It was incubated for two hours at 22 ° C. with shaking.
  • RLU relative light units
  • the mixture was then washed 4 times with 1 ml of washing solution (0.1% Tween 20) per tube, drained and the chemiluminescence bound to the tube was measured in a luminometer (company BERTHOLD, LB952T; Basisreagenzien BRAHMS AG).
  • C-terminal pro-endothelin or Ct-pro-endothelin The analyte that can be measured with the developed sandwich immunoassay (antibodies against positions 168-181 and 200-212) is referred to below as C-terminal pro-endothelin or Ct-pro-endothelin.
  • a typical standard curve for the developed test is shown in FIG. 1. With the test, Ct-pro-endothelin concentrations of well below 50 pg / ml could still be determined.

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Abstract

In Vitro-Verfahren zur Bestimmung der Bildung von Endothelinen bei schweren Erkrankungen, insbesondere Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Entzündungen, Sepsis und Krebs, in Vollblut, Plasma oder Serum eines menschlichen Patienten zu Zwecken der Medizinischen Diagnostik, bei den man relativ langlebige Peptidframente der prozessierten primären Präpro- bzw. Pro-Endotheline bestimmt, die weder das eigentliche biologisch aktive Endothelin noch dessen unmittelbaren Vorläufer big-Endothelin enthalten, insbesondere ein C-terminales Peptidfragment.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Bildung von Endothelinen zu Zwecken der medizinischen Diagnostik, sowie Antikörper und Kits für die Durchführung eines solchen Verfahrens
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der Bildung von Endothelinen bei schweren Erkrankungen durch Bestimmung von Peptidfragmenten des entsprechenden Pro-Endothelins , insbesondere eines relativ langlebigen C-terminalen Teilpep- tids des Präpro-Endothelins-1 , in der Zirkulation (Vollblut, Plasma bzw. Serum) für Zwecke der medizinischen Diagnostik, und zwar insbesondere in Rahmen der Sepsisdiagnostik, der Kardialdiagnostik und z.B. auch in der Krebsdiagnostik und bzw. generell im Rahmen der Diagnostik solcher Krankheits- zustände, bei denen Endotheline eine wichtige Rolle für den Verlauf der Erkrankung spielen.
Wenn im Rahmen der vorliegenden Anmeldung einfach von "Endothelin" gesprochen wird, steht dieser Begriff in erster Linie für Endothelin-1 (ET-1) . Eine entsprechende Aussage ist jedoch häufig auch für andere Isoformen von Endothelinen gültig, weshalb eine Beschränkung auf Endothelin- 1 häufig nicht erforderlich erscheint und sich die Erfindung in einem weiteren Sinne auch auf andere Endotheline erstrecken soll. In dieser Beschreibung wird dabei der Begriff "Diagnostik" grundsätzlich als vereinfachender Oberbegriff verwendet, der insbesondere auch Prognostik/Frühprognostik und therapiebegleitende Verlaufskontrolle einschließen soll.
Die Bestimmungen erfolgen insbesondere mittels spezifischer immundiagnostischer Verfahren, insbesondere mittels Immuno- assays eines Typs, bei dem mit mindestens einem markierten Antikörper gearbeitet wird (Sandwichassay; ko petitiver Assay, z.B. nach dem SPALT oder SPART-Prinzip) .
Endothelin-1 (ET-1) , ein 21 Aminosäuren umfassendes Peptid, ist der stärkste bekannte Vasokonstriktor . Seit seiner Entdeckung im Jahr 1988 durch Yanagisawa und Kollegen [27; Zahlenangaben in eckigen Klammern beziehen sich auf die beigefügte Literaturliste] sind Biosynthese, Wirkungsweise und Assoziation mit Krankheiten umfangreich untersucht worden und in aktuellen Review-Artikeln zusammengefaßt [1, 1 , 12, 17, 24] . Es existieren drei, von unterschiedlichen Genen kodierte Isoformen von Endothelin (Endothelin-1, Endothelin-2 , Endothelin-3) , wovon Endothelin-1 in den größten Konzentrationen vorliegt und am wirksamsten ist. Endothelin- 1 wird in Endothelzellen, in der Lunge, im Herz, in der Niere und im Gehirn synthetisiert. Das primäre Translationsprodukt des humanen Endothelin- 1 Gens ist ein 212 Aminosäuren umfassendes Peptid, Präpro-Endothelin-1 (SEQ ID NO:l) . Im Sekretionsprozess wird durch die Signalpeptidase eine kurze N-terminale Signalsequenz (Aminosäuren 1-17) des Präpro-Endothelins entfernt. Das dabei erhaltene Pro-Endo- thelin wird anschließend durch die Protease Furin an dibasi- schen Aminosäurepaaren zu einem biologisch inaktiven, 38 Aminosäuren umfassenden Peptid big-Endothelin (SEQ ID NO : 3 ) prozessiert, woraus schließlich mittels Endothelin-coverting enzymes (ECEs) das reife, biologisch wirksame Endothelin-1 (SEQ ID NO: 2) gebildet wird. Endothelin wirkt über die Bindung an spezifische Rezeptoren, die auf Muskelzellen, Myozyten und Fibroblasten lokalisiert sind. Diese Bindung führt zum Efflux von Calcium, Aktivierung von Phospholipase C und Inhibierung der Na/K ATPase . Neben der vasokonstrikti- ven Wirkung hat Endothelin auch wachstumsregulierende Eigenschaften.
Angesichts der nachweisbaren und zu vermutenden zahlreichen und gravierenden physiologischen Wirkungen von Endothelinen, insbesondere Endothelin-1, wurden seit dem Zeitpunkt seiner Identifizierung verschiedene Assays zu seiner immundiagnostischen Bestimmung entwickelt und zu Messungen von Endothelin (en) insbesondere in humanen Plasmen eingesetzt. Die Ergebnisse derartiger Bestimmungen sind Gegenstand zahlreicher Veröffentlichungen.
Erhöhte Plasmakonzentrationen von Endothelin- 1 und big-Endo- thelin sind für verschiedene Krankheitsbilder beschrieben worden [17] . Dazu zählen kardiovaskuläre Erkrankungen [1] (u.a. Pulmonary Hypertension [21], Atherosclerosis [13], Congestive heart failure [25], Herzinfarkt [20]), Sepsis und septischer Schock [11, 22, 23], Krebs [2, 3, 15, 18], u.a..
Die zu den Messungen von Endothelinen in Plasmaproben verwendeten Immunoassays (vgl. die Übersicht in [17]) gehörten insbesondere zum Typ der Radioimmunoassays (mit markiertem Endothelin- 1 als Kompetitor) oder zum EIA/ELISA-Typ und zielten ausschließlich auf die Bestimmung des Endothelins ab bzw. auf die Bestimmung einer Endothelin- Immunreaktivität . Assays vom RIA-Typ weisen dabei eine geringere Spezifität auf und erfassen auch die Endothelin-Sequenz enthaltende verwandte Pe tide .
Es wurde jedoch festgestellt, dass Endothelin-1 (ET-1) eine extrem kurze Verweildauer in der Zirkulation aufweist und dass es bereits nach 1-2 min aus dem Kreislauf entfernt wird [6] . Da Endothelin-1 in Blut und Plasma als stabil gilt [6] , wird als wichtigster Grund für die kurze Verweildauer seine Verteilung in andere Gewebe und seine schnelle und hochaffine Bindung an Rezeptoren angesehen. In bestimmten Geweben und Körperflüssigkeiten konnten folglich deutlich höhere Endothelin-1-Konzentrationen ermittelt werden als z.B. im Plasma [1, 7] . Die Validität der Bestimmung von ET-1 in Plasmaproben wurde angesichts dieser Umstände in ernste Zweifel gezogen [17] . Es ist nämlich anzunehmen, dass für die physiologischen Wirkungen des Endothelins (ET-1) nicht die in einer Plasmaprobe ermittelbaren momentanen, u.U. nur einen Durchgangszustand widerspiegelnden ET-1-Konzentratio- nen wichtig sind, sondern dass die Summe aller im Organismus vorhandenen freien und gebundenen, z.B. gewebe- und rezeptorgebundenen physiologischen ET-1-Konzentrationen von viel größerer Relevanz sind.
Die Bestimmung des ET- 1 -Vorlaufers, des sogenannten big- Endothelins ("big ET-1"; SEQ ID NO: 3) weist gegenüber der Bestimmung von ET-1 den Vorteil auf, dass die Verweildauer von "big-ET-1" in der Zirkulation deutlich höher ist als die des daraus freigesetzten ET-1. In einer Reihe von Untersuchungen wurde daher anstelle des eigentlichen Endothelins dieses "big-Endothelin" bestimmt. Zu seiner spezifischen Bestimmung wurden insbesondere Assays vom Sandwichtyp verwendet, die eine sichere Unterscheidung des big-Endothelins- 1 vom prozessierten ET-1 und anderen Endothelinen ermöglichen [4, 8, 10] . Sie zeigten, dass bei bestimmten Erkrankungen die erhöht gemessenen ET- Immunreaktivitäten auf big-ET zurückgeführt werden können.
Die selektive Messung des big-ET-1 stellt nur eine graduelle Verbesserung, jedoch keine tatsächliche Lösung des Problems dar, denn auch big-Endothelin kann in der Blutzirkulation schnell zu Endothelin prozessiert werden [1, 5, 9] . Es hat damit ebenfalls eine relativ kurze biologische Halbwertszeit (20-25 Minuten) [10] , und folglich repräsentiert ein Messwert für das im Plasma bestimmbares big-Endothelin ebenfalls nur eine momentane Plasmakonzentration und spiegelt nicht die tatsächlich physiologisch wirksamen Konzentrationen an Endothelin wider. Unter den Bedingungen einer Erkrankung physiologisch gebildetes, jedoch bereits prozessiertes und in Geweben bzw. an Rezeptoren gebundenes ET-1 wird bei der Bestimmung von big-ET-1 in Plasma nicht erfaßt. Die Gesamtmenge an physiologisch aktivem Endothelin wird daher auch bei einer Messung von big-Endothelin unterschätzt. Der Versuch einer ergänzenden spezifischen Messung des bei der enzymatisehen Spaltung des big-ET-1 neben ET-1 gebildeten C- terminalen Peptidfragments des big-ET-1 (mit den Aminosäuren 74-90 des Präpro-Endothelins bzw. den Aminosäuren 22-38 des big-Endothelins) ergab, dass dieses Peptid noch weniger stabil ist als ET-1 und sich daher für Messungen nicht eignet [10] .
Für die Bemessung von Bereichen des Pro-Endothelin außerhalb des big-Endothelin ist aus dem Stand der Technik lediglich ein kommerzieller kompetitiver Test bekannt (N-terminaler Bereich 18-50, kommerziell erhältlich bei Phoenix Pharmaceu- ticals; Anwendung für die Sepsisdiagnostik beschrieben in WO00/22439) . Zur Stabilität und Natur des mit diesem Assay zu bemessenden Analyten sind keine Informationen veröffentlicht.
Die vorliegende Erfindung hat es sich zur Aufgabe gemacht, ein Bestimmungsverfahren zu entwickeln, das die endogene Bildung von big-Endothelin und Endothelin, d.h. die gesamte physiologische Konzentration und damit Wirkung des Endothelins, verläßlicher widerspiegelt als die bisherigen Bestimmungen von ET bzw. big-ET in Plasma.
Ein solches Verfahren soll valide und routinetauglich sein und zuverlässige Werte für die physiologische Produktion von ET (ET-1) und/oder seinen Vorläufern bei verschiedenen Krankheitszuständen, insbesondere bei Sepsis oder anderen Krankheitszuständen, bei denen erhöhte Werte für Endothelin eine Rolle spielen, liefern können. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass zu Diagnosezwecken in einer Vollblut-, Plasma- oder Serumprobe eines humanen Patienten nicht ET oder big-ET bestimmt wird, sondern ein vergleichsweise langlebiges Präpro- bzw. Pro- Endothelin-Teilpeptid, das die ET- bzw. big-ET-Sequenzen nicht enthält, insbesondere ein C-terminales Teilpeptid, das die Aminosäuren 168-212 des pre-proET-1 wenigstens enthält.
Anspruch 1 betrifft die Lehre der vorliegenden Erfindung. Vorteilhafte und derzeit bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind den Unteransprüchen zu entnehmen.
Die Erfindung beruht auf experimentellen Untersuchungen der Anmelderin, in denen sie zeigen konnte, dass solche Teile des Präpro-Endothelins, die keine direkten Vorläufer des Endothelins darstellen, für Messzwecke geeignete langlebige •Peptide umfassen, die in Blutproben zuverlässig und mit einer hohen klinischen Wertigkeit gemessen werden können.
Endothelin-1 wird physiologisch durch Prozessierung des größeren Vorläufermoleküls Präpro-Endothelin (SEQ ID NO:l) bzw. des daraus erhaltenen sekretierten Pro-Endothelins gebildet. Bei einer solchen Prozessierung müssen neben big- Endothelin (und daraus Endothelin) in primär stöchiometri- schen Mengen weitere Peptide entstehen, die bisher jedoch noch nie Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen waren und über deren mögliche weitere Prozessierung und Stabilität nichts bekannt geworden ist. Am Beginn der Untersuchungen der Anmelderin stand die Hoffnung, dass sich zeigen könnte, dass sich wenigstens eines der hypothetischen weiteren Peptid-Spaltprodukte in Blutproben (Vollblut- , Plasma- oder Serumproben) finden und als relativ stabil erweisen würde und das daher geeignet sein könnte, als Maß für die physio- logische Bildung von Endothelinen unabhängig von einer aktuellen in Plasma messbaren Endothelin-Konzentration zu dienen.
Die Bemessung eines solchen Spaltprodukts könnte somit die gesuchte Methode zur Bestimmung der physiologischen Endothelin-Konzentration bzw. -Produktion darstellen, die in den Ansprüchen als Bestimmung der "Bildung von Endothelinen" bezeichnet wird. Mit diesem Begriff wird darauf verwiesen, dass - unter der Annahme nur eines, nämlich des einzigen bekannten Bildungswegs von Endothelin- 1 aus Präpro-Endo- thelin - die im Zusammenhang mit einer Erkrankung gebildeten physiologischen Konzentrationen des Endothelins-1 nur der Menge des vorher prozessierten Präpro-Endothelins bzw. Pro- Endothelins entsprechen können. Stellen die neben big-Endothelin bzw. Endothelin in gleicher stöchiometrischer Konzentration gebildeten Teilpeptide stabile "Stoffwechselschlak- ken" dar, die weder an Rezeptoren gebunden werden noch in Geweben verteilt werden, müssen sie sich in der Zirkulation wiederfinden. Ohne damit zwingend einen bestimmten physio- logsichen Mechanismus implizieren zu wollen, kann daher die "Bestimmung/Messung der Bildung von Endothelinen" auch als Messung "der sekretorischen Aktivität" bzw. der "sekretorischen Pro-Endothelin-Produktion" angesehen werden.
In dieser Anmeldung werden die zu bestimmenden Peptidfrag- mente als "langlebig" gekennzeichnet. Mit diesem Begriff ist gemeint, dass die Verweildauer der zu bestimmenden Peptid- fragment in der Zirkulation (im Vollblut) erheblich länger ist als die des Endothelins bzw. der big-Endothelin-Fragmente. Insbesondere ist mit "langlebig" gemeint, dass solche Peptidfragmente in Vollblut und einem daraus gewonnenen Plasma keiner weiteren raschen proteolytischen Spaltung unterliegen und, verglichen mit der Geschwindigkeit der Bindung des Endothelins an Rezeptoren und der proteolytischen Spaltung spaltbarer Fragmente, mit einer deutlich langsameren Geschwindigkeit aus der Zirkulation bzw. dem Stoffwechsel entfernt werden.
Aufgrund der genannten längeren Stabilität oder "Langlebig- kiet" ist in der Anwesenheit derartiger Fragmente die Information über die bereits abgelaufenen sekretorischen Aktivitäten für einen Zeitraum gespeichert, der wenigstens für eine unproblematische Messung geeignet ist. Nimmt man z.B. an, dass die Endothelin-Vorläufer im Sinne einer einzigen kurzzeitigen Ausschüttung freigesetzt werden, entspricht die nach einer gewissen Zeit messbare Menge an "langlebigen" Fragmenten der ursprünglich ausgeschütteten Menge, vermindert nur um eine Menge, die mit der physiologischen Halbs- wertzeit des zu messenden Peptidfragments in der Zirkulation verknüpft ist. Nimmt man andererseits z.B. eine mehr oder weniger kontinuierliche Produktion des Endothelin-Vorläufers während des Krankheitsgeschehens an, spiegelt sich in der messbaren Konzentration eines im obigen Sinne langlebigen Peptidfragments die zurückliegende physiologische Produktion des Vorläufers kumulativ wieder, wiederum nur vermindert um die im gleichen Zeitraum erfolgte Konzentrationsverminderung des Peptidfragments nach Maßgabe seiner physiologischen Clearance-Geschwindigkeit . Das aktive Endothelin, oder sein Vorläufer big-Endothelin, können im gleichen Zeitraum längst prozessiert bzw. aus der Zirkulation entfernt und z.B. an Rezeptoren gebunden und damit nicht mehr messbar sein. Je langlebiger ein Peptidfragment ist, bzw. je geringer seine Clearance-Geschwindigkeit ist, desto geringer ist der Ein- fluss des Messzeitpunkts auf die Korrektheit der Bestimmung der o.g. "Bildung" eines Biomarkers, d.h. des Endothelins. Eine über längere Zeiträume konstante Konzentration bedeutet in diesem Bild, dass sich Bildung und Clearance die Waage 'halten. Sinkt die Konzentration, so kann das darauf hindeuten, dass die Sekretion des Vorläufermoleküls (z.B. des Proendothelins) aufgehört hat, z.B. weil die molekularen Speicher erchöpft sind, und die zu beobachtenden Konzentrationsveränderungen nur noch durch die Clearance-Ge- schwinsdigkeit bestimmt werden. Die Ergebnisse der Messung eines langlebigen Peptidfragments ohne bekannte physiologische Funktion liefert somit sowohl quantitativ als auch qualitativ andere Ergebnisse als eine Messung eines eher kurzlebigen aktiven Peptids oder seines ebenfalls relativ kurzlebigen Vorläufers.
Die nachfolgend näher beschriebenen Untersuchungen der Anmelderin zeigten, dass der oben beschrieben Ansatz im Falle der Bestimmung der Bildung von Endothelinen fruchtbare Ergebnisse liefert.
Die durchgeführten Untersuchungen und die signifikantesten Ergebnisse dieser Untersuchungen werden nachfolgend genauer erläutert, wobei auf Figuren Bezug genommen wird.
Dabei zeigen:
Figur 1 eine typische Standardkurve für den im experimentellen Teil genauer beschriebenen derzeit bevorzugten Sandwichassay mit zwei Antikörpern, die an Aminosäuresequenzen binden, die den Positionen 168-181 und 200-212 des Präpro-Endothelins-1 entsprechen, zur Bestimmung einer C-terminalen Pro- Endothelin-Peptidsequenz in humanem Plasma;
Figur 2 ein Diagramm, das zeigt, dass bei der Lagerung von EDTA-Plasmaproben von septischen und kardiologi- schen Patienten bei Raumtemperatur über 12 Stunden kein nennenswerter Verlust der Immunreaktivität in einem Assay gemäß Figur 1 eintritt;
Figur 3a die Messung von Plasmen von 5 Gruppen von menschlichen Patienten mit verschiedenen Erkrankungen/ - Diagnosen, gegenübergestellt den Messungen für augenscheinlich Gesunde; die punktierte Linie zeigt den maximalen bei Gesunden gefundenen Wert an (Linie für 100% Spezifität, bezogen auf gesunde Kontrollen) ;
Figur 3b eine Figur 3a entsprechende Darstellung, für vier weitere Gruppen von Patientenplasmen;
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft in seinem allgemeinsten Aspekt die Bestimmung eines relativ langlebigen Peptid- fragments des Pro-Endothelins-1 , das die Aminoäuresequenzen des Endothelins-1 bzw. seines Vorläufers big-Endothelin nicht enthält, in Vollblut-, Plasma- bzw. Serumproben, d.h. in der Zirkulation von Patienten, zur indirekten Bestimmung der Bildung von Endothelinen, insbesonder von Endothelin-1 , bei schweren Erkrankungen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das bestimmte Peptidfragment ein C-terminales Fragment, an das zwei Antikörper binden, die an Peptide mit Aminosäuresequenzen binden, die den Positionen 168-181 und 200-212 des Präpro-Endothelins-1 entsprechen.
Für die praktische Umsetzung der Erfindung sind besonders bevorzugt nicht -kompetitive Sandwichassays, z.B. der Art, —=w-is--e-r-für d±e__weitergehenden vertiefenden Untersuchungen verwendet wurde und nachfolgend genauer beschrieben wird, vorgesehen .
Nicht -kompetitive Sandwich- Immunoassays (Zweiseiten- Immunoassays) haben gegenüber kompetitiven Immunoassays eine Reihe von Vorteilen, zu denen gehört, dass sie besser als Fest- phasenassays (heterogene Assays) ausgelegt werden können, in der Handhabbarkeit robuster sein können, Meßergebnisse mit einer höheren Sensititivät liefern können und sich auch besser für eine Automatisierung und Serienmessung eignen. Außerdem können sie im Vergleich mit kompetitiven Immunoassays, die mit nur einem Typ von Antikörper arbeiten, auch zusätzliche Aussagen liefern, indem Sandwich- Immunoassays nur solche Moleküle bzw. Peptide erkennen, bei denen beide Bindungsstellen für die für die Sandwichbildung verwendeten Antikörper auf dem gleichen Molekül vorhanden sind. Die verwendbaren Antikörper können grundsätzlich beliebige geeignete monoklonale und/oder polyklonale Antikörper sein, wobei jedoch derzeit affinatsgereinigte polyklonale Antikörper bevorzugt werden.
Besonders bevorzugt werden die Antikörper durch Immunisierung eines Tiers, insbesondere Schafs, mit einem Antigen erhalten, das eine synthetische Peptidsequenz enthält, die einer kurzen Aminosäurensequenz des Präpro-Endothelins-1 entspricht und einen zusätzlichen Cysteinrest am N-Terminus aufweist. Im nachfolgenden experimentellen Teil werden insbesondere Antikörper bzw. deren Verwendung in einem Assay beschrieben, die an die Aminosäuresequenzen 161-181 und 200- 212 binden. Es wurden jedoch im Rahmen der Untersuchungen auch zusätzliche Antikörper eingesetzt, die entsprechend an die Positionen 184-203 und 136-148 binden. Die mit diesen weiteren Antikörpern bei Messungen erhaltenen ergänzenden Ergebnisse werden in dieser Anmeldung nur pauschal diskutiert .
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren als heterogener Sandwich- Immunoassay durchgeführt, bei dem einer der Antikörper an eine beliebige Festphase, beispielsweise die Wände beschichteter Teströhrchen (z.B. aus Polystyrol ,- "Coated Tubes"; CT) oder an Mikrotiterplatten, zum Beispiel aus Polystyrol, oder an Partikel, beispielsweise Magnetpartikel immobilisiert ist, während der andere Antikörper einen Rest trägt, der ein direkt nachweisbares Label darstellt oder eine selektive Verknüpfung mit einem Label ermöglicht und der Detektion der gebildeten Sandwich-Strukturen dient. Auch eine zeitlich verzögerte bzw. nachträgliche Immobilisierung unter Verwendung geeigneter Festphasen ist möglich.
Grundsätzlich können alle in Assays der beschriebenen Art verwendbaren Markierungstechniken angewandt werden, zu denen Markierungen mit Radioisotopen, Enzymen, Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder Biolumineszenz-Labeln und direkt optisch detektierbaren Farbmarkierungen, wie beispielsweise Goldatomen und Farbstoffteilchen, wie sie insbesondere für sog. Point-of-Care (POC) oder Schnelltests zur Bestimmung in Vollblutproben verwendet werden, gehören. Die beiden Antikörper können auch im Falle heterogener Sandwich- Immunoassays Teile eines Nachweissystems der nachfolgend im Zusammenhang mit homogenen Assays beschriebenen Art aufweisen.
Es liegt somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung, das erfindungsgemäße Verfahren auch als Schnelltest auszugestalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner als homogenes Verfahren ausgestaltet werden, bei dem die aus den beiden Antikörpern und dem nachzuweisenden Peptidfragment gebildeten Sandwichkomplexe in der flüssigen Phase suspendiert bleiben. In einem solchen Fall ist es bevorzugt, beide Antikörper mit Teilen eines NachweisSystems zu markieren, das dann, wenn beide Antikörper in einen einzigen Sandwich integriert werden, eine Signalerzeugung oder Signalauslösung ermöglicht. Derartige Techniken sind insbesondere als Fluo- reszenzverstärkungs- oder Fluoreszenzlöschungs-Nachweisver- fahren ausgestaltbar. Ein besonderes bevorzugtes derartiges Verfahren betrifft die Verwendung von paarweise einzusetzenden Nachweisreagenzien, wie sie beispielsweise beschrieben sind in US-A-4 822 733, EP-Bl-180 492 oder EP-Bl-539 477 und dem darin zitierten Stand der Technik. Sie ermöglichen eine Messung, die selektiv nur Reaktionsprodukte erfaßt, die beide Markierungskomponenten in einem einzigen Immunkomplex enthalten, direkt in der Reaktionsmischung. Als Beispiel ist auf die unter den Marken TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) bzw. KRYPTOR® angebotene Technologie zu verweisen, die die Lehren der o.g. Anmeldungen umsetzt.
Es zeigte sich bei den Untersuchungen der Anmelderin, dass die erfindungsgemäße Bestimmung des C-terminalen Peptid- fragments des Präpro-Endothelins-1 hochinteressante und relevante Meßergebnisse liefert. Diese Aussage gilt, wie nachfolgend gezeigt wird, nicht nur für die Sepsisdiagno- stik, sondern auch für die Kardialdiagnostik und die Krebsdiagnostik.
Es wird ferner davon ausgegangen, dass das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren besonders vorteilhaft auch im Rahmen einer sogenannten Multiparameterdiagnostik durchgeführt werden kann, und zwar sowohl auf dem Gebiet der Kardialdiagnostik als auch der Sepsis- und der Krebsdiagnostik. Weitere dabei bestimmte Parameter sind beispielsweise die Kardi- alparameter ANP, BNP, proANP, proADM oder proBNP oder Sepsisparameter, die z.B. aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Anti-Gangliosid-Antikörpern, den Proteinen Procalcitonin, CA 125, CA 19-9, S100B, SlOOA-Proteinen, LASP-1, löslichen Cytokeratin-Fragmenten, insbesondere CYFRA 21, TPS und/oder löslichen Cytokeratin-1 -Fragmenten (sCYlF) , den Peptiden Inflammin und CHP, anderen Peptid-Prohormonen, der Glycin-N-Acyltransferase (GNAT) , der Carbamoylphosphat Synthetase 1 (CPS 1) und dem C-reaktiven Protein (CRP) oder Fragmenten davon. Bei den genannten Multiparameter-Bestim- mungen ist vorgesehen, die Messergebnisse für mehrere Parameter gleichzeitig oder parallel zu bestimmen und z.B. mit Hilfe eines Computerprogramms, das auch diagnostisch signifikante Parameterkorrelationen nutzt, auszuwerten.
Nachfolgend wird die Erfindung durch eine Beschreibung der Herstellung der bevorzugten Assay-Komponenten, der Durchführung einer bevorzugten Ausführungsform eines Assays vom Sandwich-Typ und der unter Verwendung eines solchen Assays erhaltenen Ergebnisse der Bestimmung eines C-termianlen Peptidfragments in EDTA-Plasmen von Kontrollpersonen, und von Sepsis-, Herz- und Krebspatienten näher erläutert.
Experimenteller Teil
A. Materialien und Methoden 1. Peptidsynthesen
Abgeleitet von der bekannten Aminosäuresequenz des humanen Präpro-Endothelin-1 (SEQ ID NO:l) wurden drei Bereiche ausgewählt (Pos. 168-181, 184-203, 200-212). Jeweils ergänzt um einen N-terminalen Cystein-Rest wurden diese Bereiche nach Standardverfahren als lösliche Peptide chemisch synthetisiert, gereinigt, mittels Massenspektrometrie und Reversed Phase HPLC qualitätskontrolliert und in Aliquots lyophilisiert (Firma JERINI AG, Berlin, Deutschland) . Die Aminosäuresequenzen der Peptide lauten:
Peptid PCT15 (168-181 + N-terminales Cystein)
CRSSEEHLRQTRSET (SEQ ID NO: 4)
Peptid PCW14 (200-212, + N-terminales Cystein)
CSRERYVTHNRAHW (SEQ ID NO: 5)
Peptid PNR20 (184-203; + N-terminales Cystein)
NSVKSSFHDPKLKGKPSRER (SEQ ID NO: 6)
Desweiteren wurde als Standard zur Eichung der Assays folgendes Peptid synthetisiert:
Standard Peptid PSW44 (169-212) SSEEHLRQTRSETMRNSVKSSFHDPKLKGKPSRERYVTHNRAHW (SEQ ID NO: 7)
2. Konjugation und Immunisierung
Mittels MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid Ester) wurden die Peptide PCT15 und PCW14 an das Trägerprotein KLH (Keyhole limpet hemocyanin) konjugiert (s. Arbeitsanleitung "NHS-Esters-Maleimide Crosslinkers" , Firma PIERCE, Rockford, IL, USA) . Mit diesen Konjugaten wurden Schafe nach folgendem Schema immunisiert: Jedes Schaf erhielt initial 100 μ<_ Kon- jugat (Massenangabe bezogen auf den Peptid-Anteil des Kon- jugats) und anschließend 4-wöchentlich je 50 μg Konjugat (Massenangabe bezogen auf den Peptid-Anteil des Konjugats) . Beginnend mit dem vierten Monat nach Beginn der Immunisierung wurden 4 -wöchentlich je Schaf 700 ml Blut abgenommen und daraus durch Zentrifugation Antiserum gewonnen. Konjugationen, Immunisierungen und Gewinnung von Antiseren wurden von der Firma MicroPharm, Carmarthenshire, UK, durchgeführt .
3. Reinigung der Antikörper
In einem 1-Schritt Verfahren wurden aus den Antiseren, die beginnend mit dem vierten Monat nach der Immuniserung gewonnen worden waren, die Peptid-spezifischen Antikörper präpariert .
Dazu wurden zunächst die Peptide PCT15 und PCW14 an Sulfo- Link Gel gekoppelt (s. Arbeitsanleitung "SulfoLink Kit" Firma PIERCE, Rockford, IL, USA) . Dabei wurden zur Kopplung je 5 mg Peptid pro 5 ml Gel angeboten.
Die Affinitätsreinigung von Peptid-spezifischen Antikörpern aus Schaf Antiseren gegen beide Peptide wurde wie folgt durchgeführt :
Die Peptid-Säulen wurden zunächst drei mal im Wechsel mit je 10 ml Elutionspuff r (50 mM Citronensäure, pH 2.2) und Bindungspuffer (100 mM Natriumphosphat, 0.1% Tween, pH 6.8) gewaschen. 100 ml der Antiseren wurden über 0,2 μm filtriert und mit dem vorhandenen Säulenmaterial versetzt. Dazu wurde das Gel quantitativ mit 10 ml Bindungspuffer aus der Säule gespült. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur unter Schwenken. Die Ansätze wurden quantitativ in Leersäulen (NAP 25, Pharmacia, entleert) überführt . Die Durchläufe wurden verworfen. Anschließend wurde mit 250 ml Bindungspuffer proteinfrei (Proteingehalt des Wascheluats < 0,02 A280 nm) gewaschen. Auf die gewaschene Säulen wurde Elutionspuffer gegeben, und es wurden Fraktionen ä 1 ml gesammelt. Von jeder Fraktion wurde der Proteingehalt mittels der BCA-Methode (s. Arbeitsanleitung Firma PIERCE, Rockford, IL, USA) bestimmt. Fraktionen mit Proteinkonzentrationen > 0.8 mg/ml wurden gepoolt. Nach Proteinbestimmung der Pools mittels der BCA-Methode ergaben sich Ausbeuten von 97 mg für den anti-PCT15 Antikörper 0407-pAk und 60 mg für den anti-PCW14 0410-pAk Antikörper.
4. Markierung
Der anti-PCW14 0410-pAk Antikörper wurde wie folgt behandelt:
Über eine NAP-5 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) wurden 500 μl des gereinigten Antikörpers in 1 ml 100 mM Kalium- - Phosphatpuffer (pH 8,0) nach Arbeitsanleitung umgepuffert. Die Proteinkonzentationsbestimmung der Antikörperlösung ergab einen Wert von 1,5 mg/ml.
Zur Chemilumineszenzmarkierung des Antikörpers wurden 67 μl der Antikörperlösung mit 10 μl MA70-Akridinium-NHS-Ester (1 mg/ml; Firma HOECHST Behring) versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 423 μl 1 M Glycin zugesetzt und weitere 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurde der Markierungsanastz über eine NAP-5 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) in 1 ml Laufmittel A (50 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl , pH 7.4) nach Arbeitsanleitung umgepuffert und dabei von niedermolekularen Bestandteilen befreit . Zur Abtrennung letzter Reste nicht an Antikörper gebundenen Labels wurde eine Gelfiltrations-HPLC durchgeführt (Säule: Waters Protein Pak SW300) . Die Probe wurde aufgetragen und bei einer Flußrate von 1 ml/min mit Laufmittel A chromatographiert . Mit einem Duchflußphotometer wurden die Wellenlängen 280 nm und 368 nm gemessen. Das Absorptionsverhältnis 368 nm/280 nm als Maß für den Markierungsgrad des Antikörpers betrug am Peak 0.10. Die monomeren Antikörper enthaltenden Fraktionen
(Retentionszeit 8-10 min) wurden gesammelt und in 3 ml 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl , 5% Bovines Serum Albumin, 0.1% Natrium Azid, pH 7.4, gesammelt.
5. Kopplung
Der anti-PCT15 Antikörper 0407-pAk wurde wie folgt behandelt:
Bestrahlte 5 ml Polystyrolröhrchen (Firma Greiner) wurden mit gereinigtem Antikörper wie folgt beschichtet: Der Antikörper wurde in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7 , 8 zu einer Konzentration von 6 . 6 μg/ml verdünnt. In jedes Röhrchen wurden 300 μl dieser Lösung pipettiert. Die Röhrchen wurden 20 Stunden bei 22 °C inkubiert. Die Lösung wurde abgesaugt. Dann wurde jedes Röhrchen mit 4.2 ml 10 mM Natriumphosphat, 2% Karion FP, 0.3% Bovines Serum Albumin, pH 6.5 befüllt. Nach 20 Stunden wurde die Lösung abgesaugt. Schließlich wurden die Röhrchen in einem Vakuumtrockner getrocknet .
B. Durchführung und Auswertung des Immunoassays
Es wurde ein Assaypuffer folgender Zusammensetzung hergestellt: 100 mM Natriumphospha , 150 mM NaCl, 5% Bovines Serum Albumin (BSA) , 0.1% unspezifische Schaf IgG, 0.1% Natriumazid, pH 7.4
Als Standardmaterial diente das o.g. chemisch synthetisierte Peptid (Peptid PSW44) , das den Positionen 169-212 von Prä- pro-Endothelin-1 entspricht. Dieses wurde seriell in Pfer- denormalserum (Firma SIGMA) verdünnt. Den so hergestellten Standards wurden Konzentrationen gemäß der Einwaage an Peptid zugeschrieben.
Meßproben waren EDTA-Plasmen von augenscheinlich Gesunden, von Patienten mit Sepsis und von Patienten mit verschiedenen Herz-Kreis1auf-Erkrankungen . In die Teströhrchen wurden 50 μl Standards bzw. Proben sowie 200 μl Assaypuffer pipettiert. Es wurde zwei Stunden bei 22°C unter Schütteln inkubiert. Dann wurde 4 x mit je 1 ml Waschlösung (0.1% Tween 20) pro Röhrchen gewaschen und abtropfen gelassen. Dann wurden 200 μl Assaypuffer, enthaltend 1 Million RLU (relative light units) des MA70-markier- ten Antikörpers, pipettiert. Es wurde zwei Stunden bei 22 °C unter Schütteln inkubiert. Dann wurde 4 x mit je 1 ml Waschlösung (0.1% Tween 20) pro Röhrchen gewaschen, abtropfen gelassen und die am Röhrchen gebundene Chemilumineszenz in einem Luminometer (Firma BERTHOLD, LB952T; Basisreagenzien BRAHMS AG) vermessen.
Unter Verwendung der Software MultiCalc (Spline Fit) wurden die Konzentrationen der Proben an der Standardkurve abgelesen .
C. Ergebnisse
Der mit dem entwickelten Sandwichimmunoassay (Antikörper gegen die Positionen 168-181 und 200-212) bemessbare Analyt wird im Folgenden als C-terminales-Pro-Endothelin oder Ct-Pro-Endothelin bezeichnet. Eine typische Standardkurve für den entwickelten Test ist in Figur 1 gezeigt. Mit dem Test ließen sich noch Ct-Pro-Endothelin-Konzentrationen von deutlich unterhalb 50 pg/ml bestimmen.
Zur Prüfung der Frage, ob bei einer Messung des C-terminalen Peptidfragments mit Problemen aufgrund einer unzureichenden Stabilität in einer Probe bzw. Messlösung gerechnet werden muß, wurden 5 Sepsis-Plasmen jeweils frisch und nach einer 12 stündige Lagerung bei Raumtemperatur vermessen. Die Ergebnisse sind in Figur 2 zusammengefaßt. Sie zeigen, dass nach der 12tägigen Lagerung die Immunreaktivität mit noch ca. 93% der anfänglich gemessenen Immunreaktivität nahezu unverändert war. Diese nachgewiesene Stabilität ist unter Handhabungsgesichtspunkten für die Diagnostik ein großer Vorteil Mit dem Test wurden Plasmen von kardiologischen sowie septischen Patienten vermessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Figuren 3a und 3b gezeigt. Für alle untersuchten kardiologischen Krankheitsbilder wurden gegenüber normalen Kontrollen erhöhte Werte gefunden. Ebenfalls erhöhte Werte fanden sich für Patienten mit SIRS (systemic inflammatory response syndrome) und septische Bedingungen. Die diagnostische Sensitivität (bei gegebener 100% Spezifität bezogen auf gesunde Kontrollen) erhöhte sich dabei mit dem Schweregrad der Erkrankung: Sepsis 32,3%, schwere Sepsis 65,5%, und septischer Schock 75%.
Wurden die Proben mit einem modifizierten Assay gemessen, bei dem einer der Antikörper des o.g. Sandwichassays durch einen Antikörper ersetzt war, der die Aminosäuren 184-203 des Präpro-Endothelins-1 erkannte, wurden erwartungsgemäß im wesentlichen identische Ergebnisse erhalten.
Dagegen konnten dann, wenn einer der verwendeten Antikörper eine Aminosäuresequenz erkannte, die näher in Richtung des N-Terminus des Präpro-Endothelins lokalisiert ist (32-52 oder 136-148), keine gegenüber Gesunden erhöhte Messwerte erhalten werden. Das deutet darauf hin, dass Pro-Endothelin als solches nicht in den vermessenen Plasmaproben vorhanden war und nicht nur unter Bildung von big-Endothelin proteoly- tisch prozessiert wird, sondern dass auch die dabei frelge- setzet C-terminale Sequenz 93-212 noch weiter gespalten wird, wobei mindestens eine solche Spaltstelle im Bereich der Aminosäuren 149-167 liegen muss. Diese Aussage gilt für die Plasmen von Patienten mit den untersuchten Erkrankungen. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass bei anderen Patientengruppen z.B. das gesamte C-terminale Fragment 93-212 erhalten bleibt und seine selektive Messung diagnostisch relevante Ergebnisse liefern kann. Literaturliste Akte 4295
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Claims

Patentansprüche
1. In vitro-Verfahren zur Bestimmung der Bildung von Endothelinen bei schweren Erkrankungen, insbesondere Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Entzündungen, Sepsis und Krebs, in Vollblut, Plasma oder Serum eines menschlichen Patienten zu Zwecken der medizinischen Diagnostik, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bildung von Endothelin- 1 (SEQ ID NO: 2) und big-Endothelin- 1 (SEQ ID NO: 3) dadurch bestimmt, dass man solche C-terminalen Fragmente des Präpro-Endothelins-1 (SEQ ID NO:l) bestimmt, die von Antikörpern erkannt werden, die an Peptide binden, die Peptidsequenzen im Bereich der Aminosäuren 93 bis 212 des Präpro-Endothelins-1 entsprechen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung in der biologischen Flüssigkeit mit Hilfe eines Immunoassays erfolgt, der mit mindestens einem markierten Antikörper, der spezifisch nur das zu bestimmende Peptidfragment erkennt, arbeitet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunoassay ein kompetitiver Immunoassay oder ein Sandwich- Immunoassay ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man solche C-terminalen Fragmente des Präpro-Endothelins-1 bestimmt, die von Antikörpern erkannt werden, die an Peptide binden, die Peptidsequenzen im Bereich der Aminosäuren 168 bis 212 (SEQ ID NO: 7) des Präpro-Endothelins-1 entsprechen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Bestimmung eines C-terminalen Fragments mit den Aminosäuren 168 bis 212 (SEQ ID NO: 7) des Präpro-Endothe- lins-1 Paare von Antikörpern verwendet, die an zwei unterschiedliche Peptidsequenzen binden, die ausgewählt sind aus Peptidsequenzen mit den Aminosäuren 168-181, 184-203 und 200-212 des Präpro-Endothelins-1.
6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Verfahren zur quantitativen oder zur semiquantitativen Bestimmung der zu bestimmenden Peptidfragmente ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es ein immunchromatographischer Point-of-Care-Test oder ein anderer Schnelltest ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bestimmung verwendeten Antikörper monoklonale und/oder affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Antikörper verwendet werden, die durch Immunisierung eines Tiers mit einem Antigen erhalten wurden, das ein synthetisches Peptid enthält, das ausgewählt ist aus den Peptiden (SEQ ID NO:4), (SEQ ID NO:5) und (SEQ ID NO:6).
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung zwei Antikörper verwendet werden, von denen einer markiert ist und der andere an eine Festphase gebunden ist oder selektiv an eine Festphase gebunden werden kann.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung zwei Antikörper verwendet werden, die beide in der flüssigen Reaktionsmischung disper- giert vorliegen, wobei an den ersten Antikörper eine erste Markierungskomponente gebunden ist, die Teil eines auf Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Löschung oder -Verstärkung beruhenden Markierungssystems ist, und an den zweiten Antikörper die zweite Markierungskomponente dieses Markierungs- systems gebunden ist, so dass nach Bindung beider Antikörper an das nachzuweisende Peptidfragment ein messbares Signal erzeugt wird, das eine Detektion der gebildeten Sandwichkomplexe in der Messlösung ermöglicht.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungssystem Seltenerdkrypate oder -chelate in Kombination mit einem Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz- Farbstoff, insbesondere von Cyanintyp, umfaßt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 123, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Diagnose, für die Bestimmung der Schweregrads und für die Prognostik sowie zur verlaufsbegleitenden Therapiekontrolle von Sepsis angewandt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es im Rahmen einer Multiparameter-Bestimmung durchgeführt wird, bei der gleichzeitig mindestens ein weiterer für die Sepsisdiagnostik relevanter Parameter bestimmt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die weitere (n) für die Sepsisdiagnostik relevante (n) Parameter aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Anti-Gangliosid-Antikörpern, den Proteinen Procalcitonin, CA 125, CA 19-9, S100B, SlOOA-Proteinen, LASP-1, löslichen Cytokeratin-Fragmenten, insbesondere CYFRA 21, TPS und/oder löslichen Cytokeratin-1-Fragmenten (sCYlF) , den Peptiden Inflammin und CHP, Fragmenten der Prohormone pro-ANP, pro-BNP oder pro-ADM, der Glycin-N-Acyltransferase
(GNAT) , der Carbamoylphosphat Synthetase 1 (CPS 1) und dem C-reaktiven Protein (CRP) oder Fragmenten davon.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es auf dem Gebiet der Kardialdiagnostik angewandt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es im Rahmen einer Multiparameter-Bestimmung durchge- führt wird, bei der gleichzeitig weitere für die Kardialdia- gnostik relevante Parameter bestimmt werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es auf dem Gebiet der Krebsdiagnostik angewandt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es im Rahmen einer Multiparameter-Bestimmung durchgeführt wird, bei der gleichzeitig weitere für die Krebsdiagnostik relevante Parameter bestimmt werden.
20. Antikörper, die spezifisch an Peptide binden, die aus den Aminosäuresequenzen bestehen, die den Aminosäuren 168- 181, 184-203 und 200-212 des Präpro-Endothelins-1 entsprechen.
21. Antikörper nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sind.
22. Kit zur Durchfühunge eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens umfaßt : (a) einen ersten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 20 und 21, (b) einen zweiten, anderen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 20 und 21, wobei einer der Antikörper markiert ist und der andere immobilisiert oder immo- biliserbar ist, sowie (c) ein Standardpeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens die Aminosäuren 168-203 oder 168-212 des Präpro-Endothelins umfaßt.
23. Kit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der immobilisierte Antikörper an die Wände eines Teströhrchens immobilisiert vorliegt (CT) .
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