WO2005075453A1 - リンカー化合物及びリガンド複合体、並びにそれらの製造方法 - Google Patents

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WO2005075453A1
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Yasuo Suda
Akio Arano
Shoichi Kusumoto
Michael Sobel
Masahiro Wakao
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Japan Science And Technology Agency
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D339/00—Heterocyclic compounds containing rings having two sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D339/02—Five-membered rings
    • C07D339/04—Five-membered rings having the hetero atoms in positions 1 and 2, e.g. lipoic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the present invention relates to a linker compound capable of immobilizing a sugar chain such as an oligosaccharide on a protein analysis support such as a surface plasmon resonance sensor chip, and a method of introducing a sugar chain into the linker compound.
  • the present invention relates to a ligand complex, a ligand carrier, and a production method thereof.
  • a surface plasmon resonance (hereinafter, referred to as SPR) method is known. That is, a ligand complex containing an oligosaccharide simulating a part of a sugar chain is immobilized on the sensor chip surface, and the oligosaccharide is immobilized on the sensor chip. Identify substances such as proteins that interact specifically with sugar. This allows a correct evaluation of the biological activity based on the structure of the oligosaccharide.
  • the present inventors have obtained a linker compound having in its molecule a site that can be immobilized on the sensor chip surface and a site that can introduce an oligosaccharide chain.
  • a ligand conjugate obtained by introducing one or two units of oligosaccharide chains is obtained. Then, by using this ligand complex, the oligosaccharide chain is ligated on the sensor chip. (See, for example, Patent Document 1, Non-Patent Document 1, etc.).
  • Patent Document 1 JP-A-2003-836969 (published on March 19, 2003)
  • Non-Patent Document 1 "The 79th Annual Meeting of the Nippon Dani Kaikai Lecture Proceedings II", The Nippon Dani Gakkai, March 15, 2001, p. 1042
  • Patent Document 1 With the ligand conjugates described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1, it is possible to arrange oligosaccharide sugar chains two-dimensionally on the sensor chip surface, but the sequence is reproducible. The technical problem that it is difficult to obtain well remains.
  • the oligosaccharide chain of one ligand conjugate has one unit or two units.
  • the above-mentioned ligand conjugate is obtained by binding one or two oligosaccharide chains to one linker compound. Therefore, in order to observe the biological activity of the oligosaccharide chain, when arranging the ligand complex on the surface of the sensor chip, the concentration of the ligand complex is increased to assemble the sugar chains as ligands. It is necessary to assemble 3 or more oligosaccharide chains on the chip surface.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to control the distance between sugar chains on the surface of a sensor chip and arrange oligosaccharides two-dimensionally with good reproducibility.
  • An object of the present invention is to provide a novel linker compound, a novel ligand complex in which a sugar molecule is introduced into the linker compound, a ligand carrier, and a method for producing these. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems. As a result, the present inventors have found that a surface plasmon resonance (SPR) sensor chip having a site into which three or more sugar molecules can be introduced, By using a novel linker compound having a site capable of binding to a support for protein analysis such as a carrier for affinity chromatography, a sugar molecule of 3 units or more can be reproducibly and two-dimensionally applied to the support. It has been found that they can be arranged.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the other linker compound has a problem in that the length of the alkyl group that forms a part of the linker is not sufficient and the oligosaccharide chain to be immobilized is large because of the steric hindrance of the oligosaccharide chain.
  • a metal sulfur bond is not formed efficiently.
  • the present inventors further introduced an oligoethylene oxide group into a part of the linker to minimize non-specific hydrophobic interaction and to reduce the amount of non-specific hydrophobic interaction up to the disulfide group used for metal bonding.
  • the present inventors have found that the length can be easily adjusted and a metal-sulfur bond can be efficiently formed, and the present invention has been completed.
  • the linker compound according to the present invention has the general formula (1) [0015] [Formula 11]
  • X has an aromatic amino group at a terminal and is in the main chain. It may have a carbon-nitrogen bond and have a structure that is a hyperbranched structure site comprising three or more hydrocarbon-derived chains.
  • linker compound according to the present invention has the general formula (2)
  • n is an integer of 1 or more and 6 or less
  • X is a hydrocarbon having an aromatic amino group at a terminal and optionally having a carbon-nitrogen bond in a main chain.
  • the derivative chain may have a structure that is a hyperbranched structure site containing three or more chains.
  • the hydrocarbon-derived chain refers to a hydrocarbon chain composed of carbon and hydrogen, in which some carbon or hydrogen may be replaced by another atom or substituent. And That is, the hydrocarbon-derived chain has an aromatic amino group at a terminal, and a part of a carbon-carbon bond (C-C bond), which is a main chain structure of the hydrocarbon chain, has a carbon-nitrogen bond (C -N bond), carbon oxygen bond (CO bond), and amide bond (CO-NH bond).
  • the linker compound has an aromatic amino group as a site into which a sugar molecule can be easily introduced. Since the aromatic amino group is contained in each hydrocarbon-derived chain, three or more units of sugar molecules can be introduced into the linker compound. It also has an S—S bond as a site that can be immobilized on the protein analysis support.
  • three or more sugar molecules can be aggregated and introduced into the support via the linker compound.
  • three or more sugar molecules can be arranged on the surface of the support with good reproducibility. This makes it possible to observe the interaction between the sugar molecule and the protein on the surface of the support, and to evaluate the biological activity of the sugar molecule with good reproducibility.
  • the linker compound has an oligoethylene dioxide group in a part of the linker, the analyte to be analyzed is more hydrophobic than in a case where the linker has an alkyl group in a part of the linker. And the possibility of causing non-specific interaction can be greatly reduced.
  • the linker since the linker is partially composed of oligoethylene dioxide, it is easy to adjust the length from the disulfide group used for metal binding to the oligosaccharide chain bound to the amino terminal. Can be. As a result, a metal-sulfur bond can be formed efficiently without the disulfide group being affected by the oligosaccharide chain.
  • m 1 , m, m °, m 4 , p 1 , ⁇ are each independently an integer of 1 or more and 6 or less).
  • X of the linker compound has three or more hydrocarbon-derived chains, it is possible to introduce three or more units of sugar molecules onto the support via the linker compound. is there . Therefore, it is possible to obtain a sequence of sugar molecules with good reproducibility by controlling the spacing between sugar units of 3 units or more on the surface of the support, and thus to evaluate the biological activity of sugar molecules with good reproducibility. become.
  • the ligand conjugate of the present invention is characterized in that a sugar molecule is introduced into an aromatic amino group of one of the above linker compounds.
  • R ′ is hydrogen (H) or R.
  • R is the formula (6-1) or the formula (6-6)
  • the compound is an oligosaccharide-derived compound selected from Further, the ligand complex is specifically represented by the general formula (7) [0031] [Formula 17]
  • R is hydrogen (H) or R.
  • R is preferably an oligosaccharide selected from the formulas (6-1) and (6-6).
  • the sugar molecules can be assembled and fixed.
  • one ligand conjugate has three or more sugar molecules, it is possible to use one ligand conjugate without assembling the ligand conjugates on the surface of the support.
  • three or more units of sugar molecules can be aggregated. Therefore, the biological activity of the sugar molecule can be measured with good reproducibility.
  • a plurality of sugar molecules can be two-dimensionally arranged on the surface of the support with good reproducibility. Therefore, by using a support for protein analysis to which the ligand complex of the present invention is immobilized, the biological activity of the sugar molecule can be evaluated with good reproducibility.
  • the method for producing a linker compound according to the present invention provides thiotate acid and an amine having three or more branched chains whose aromatic amino terminal is protected by a protective group.
  • the method has an SS bond as a site that can be immobilized on the protein analysis support, and an aromatic amino group as a site into which a sugar molecule can be easily introduced.
  • the linker compounds of the invention can be obtained.
  • a method for producing a ligand conjugate of the present invention is characterized in that a reductive amination reaction is performed using the above-mentioned linker compound and a sugar molecule.
  • the ligand conjugate of the present invention can be obtained by simply introducing a sugar molecule into a linker compound by a reductive amination reaction.
  • sugar molecule any type of sugar molecule having a reducing end can be used.
  • sugar molecule examples include those represented by the general formula (8)
  • the method for introducing a sugar molecule of the present invention is characterized in that in order to solve the above-mentioned problems, a solution containing the ligand complex is brought into contact with a metal on the surface of a support.
  • the S—S bond of the linker compound contained in the ligand complex is converted into a bond with a metal on the surface of the support, and a sugar chain as a ligand is formed on the surface of the support.
  • a sugar chain as a ligand is formed on the surface of the support.
  • the sugar molecules bound to the linker compound can be arranged on the surface of the support by a simple method of bringing the solution containing the ligand complex into contact with the support.
  • the ligand carrier of the present invention is characterized in that the ligand complex is fixed on a support having a metal on the surface.
  • the ligand complex can be firmly immobilized on the surface of the support via the metal-sulfur bond, so that a plurality of sugar molecules can be arranged on the surface of the support with good reproducibility. Can be provided. Therefore, the use of the above ligand carrier makes it possible to reproducibly observe the interaction between the sugar molecule contained in the ligand complex and a substance such as a protein that interacts with the sugar molecule. Quantitative evaluation of biological activity becomes possible.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a synthesis route for a linker compound (a conjugate compound 15) according to the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a synthesis route of a ligand conjugate (a conjugate 17) according to the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding behavior of bFGF to a chip on which Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc is immobilized in the presence of heparin!
  • FIG. 4 is a graph showing the inhibitory rate of heparin on the interaction of bFGF binding to a chip on which Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc is immobilized, respectively.
  • FIG. 5 (a) is a graph showing the total reflection infrared absorption statistic of Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glc in which the mixing ratio in the solution was changed.
  • FIG. 5 (b) is a graph showing the total reflection infrared absorption spectrum of Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc with a different mixing ratio in the solution.
  • FIG. 6 (a) is a graph showing the relative strength of sulfate groups on the chip with respect to the mixing ratio of Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glc in the solution.
  • FIG. 6 (b) is a graph showing the relative strength of sulfate groups on the chip with respect to the mixing ratio of Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc in the solution.
  • FIG. 7 (a) A graph showing the result of observing the binding interaction of h-vWF by the SPR method when the mixing ratio of Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc and Mono-Glc is 100Z0.
  • FIG. 7 (b) is a graph showing the results of observing the binding interaction of h-vWF by SPR method when the mixing ratio of Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glc and Mono-Glc is 100Z0.
  • FIG. 7 (c) A graph showing the results of observing the binding interaction of h-vWF by the SPR method when the mixing ratio of Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc and Mono-Glc is 100Z0.
  • FIG. 8 (a) is a graph showing the result of observing the binding interaction of h-vWF by SPR method when the mixing ratio of Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc and Mono-Glc is 20Z80.
  • FIG. 8 (c) A graph showing the results of observing the binding interaction of h-vWF by the SPR method when the mixing ratio of Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc and Mono-Glc is 20Z80.
  • FIG. 9 (a) is a graph in which the amount of binding obtained from the results shown in FIGS. 7 (a) and 8 (a) is plotted for each h-vWF concentration.
  • FIG. 9 (b) is a graph in which the amount of binding obtained from the results shown in FIGS. 7 (b) and 8 (b) is plotted for each h-vWF concentration.
  • FIG. 9 (c) is a graph in which the amount of binding obtained from the results shown in FIGS. 7 (c) and 8 (c) is plotted for each concentration of h-vWF.
  • FIG. 14 is a schematic view showing one example of a synthesis route of a ligand conjugate (a conjugate 27) according to the present invention.
  • FIG. 15 is a schematic diagram showing an example of a synthesis route for a linker compound (a compound 32) according to the present invention.
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing an example of a synthesis route for H N-TEG-NHBoc (Compound 30).
  • FIG. 17 is a schematic diagram showing an example of a synthesis route of a ligand conjugate (a conjugated product 34) according to the present invention.
  • the linker compound of the present invention comprises a support for protein analysis, such as a carrier for surface plasmon resonance (SPR) sensor chip affair-take mouth chromatography, and a sugar such as an oligosaccharide (hereinafter referred to as a sugar molecule). ) Is used to immobilize sugar molecules on the support. Therefore, it is necessary that the linker compound has, in the molecule, a site that can be fixed to the support and a site that can easily introduce a sugar molecule.
  • a support for protein analysis such as a carrier for surface plasmon resonance (SPR) sensor chip affair-take mouth chromatography
  • a sugar such as an oligosaccharide
  • the above-described SPR affair-take mouth chromatography aims to specify and separate substances such as proteins that specifically interact with sugar molecules. Therefore, the above linker compound must have no non-specific interaction with substances such as proteins.
  • the linker compound of the present invention may be used as a site that can be fixed to the above-mentioned support, as shown in the general formula (1) or (2), a disulfide bond (SS bond) have.
  • the sulfur (S) of the disulfide bond forms a metal-sulfur bond with a metal such as gold (Au) coated on the surface of a support for protein analysis, and can be strongly bonded to the support. .
  • the linker compound is used to arrange a plurality of sugar molecules two-dimensionally on the surface of a support for protein analysis and to control the distance between sugar chains of individual sugar molecules.
  • the amino group (one NH group) of the above-mentioned aromatic amino group can be reduced with a sugar molecule such as an oligosaccharide.
  • the reaction becomes a reactive group for introducing a sugar molecule into the linker compound. That is, the aldehyde group (one CHO group) or ketone group (one CRO group, R is a hydrocarbon group) generated by the equilibrium in the sugar molecule reacts with the amino group of the linker compound. Then, by successively reducing the Schiff base formed by this reaction, a sugar molecule can be easily introduced into the aromatic amino group.
  • X in the general formula (1) or the general formula (2) has a plurality of aromatic amino groups into which a sugar molecule can be introduced by containing three or more hydrocarbon-derived chains as described above. It has a structure that is probably a divergent site. Since a sugar molecule such as an oligosaccharide is introduced into each aromatic amino group contained in the hyperbranched moiety, a linker having a structure represented by the general formula (1) or (2) is provided. Through one compound, a plurality of sugar molecules can be two-dimensionally arranged with good reproducibility on the surface of a support for protein analysis.
  • the linker compound of the present invention has an oligoethylene oxide between a disulfide group and an aromatic amino group, as shown in the general formula (1) or (2).
  • I have.
  • a, b, d, and e may be each independently an integer of 0 or more and 6 or less.
  • n is not limited as long as it is an integer of 1 to 6.
  • X is a group in which two hydrocarbon-derived chains form one nitrogen ( A structure having two bifurcated structures bonded to N) may be provided.
  • the two nitrogens in the two-branched structure are linked to one nitrogen (N), for example, via CO--CH to form a branched structure.
  • X is a hyperbranched site with four hydrocarbon-derived chains Will have a structure.
  • m 1 , m 2 , m 3 , and m 4 are not limited as long as they are integers of 1 or more and 6 or less. It may be the same integer.
  • m 1 to m 4 are preferably the same integer, and particularly preferably 2 in terms of simplicity in producing the compound having the multi-branched site.
  • p 1 and p 2 are not particularly limited as long as they are integers of 1 or more and 6 or less, and may be different integers or the same integer.
  • p 1 and p 2 are preferably 1 and particularly preferably 1 from the viewpoint of simplicity of production.
  • X having four hydrocarbon-derived chains represented by the general formula (3) may have a structure having oligoethylene oxide in each of the hydrocarbon-derived chains.
  • an oligoethylene oxide is placed between CH and NH of each hydrocarbon-derived chain.
  • It may be a structure having a side.
  • X is, as shown in the general formula (4), the three hydrocarbon-derived chains are linked to one carbon (C) at the terminal opposite to the aromatic amino group.
  • a structure having a coupled three-branch structure may be provided.
  • the above-mentioned carbon having a three-branched structure is bonded to one nitrogen (N) via, for example, -C-N- to form a branched structure.
  • N nitrogen
  • X has a structure that is a hyperbranched site having three hydrocarbon-derived chains.
  • q 1 , q, and q 3 are not limited as long as they are integers of 0 or more and 6 or less. All may be the same integer. Above all, in view of the production time of the ease of compound having the multi-the q 1 one q 3 is preferably is preferably tool particularly 2 be mutually the same integer. Further, r 1 , r 2 , and r 3 are not limited as long as they are integers of 0 or more and 6 or less, and may be mutually different integers, or some or all of them may be the same integers. Among these, from the viewpoint of simplicity of production, the above-mentioned r 1 -r 3 are preferably the same integer, and particularly preferably 1.
  • u 1 , u 2 , and u 3 are not limited as long as they are integers of 0 or more and 6 or less, and may be mutually different integers, or some or all may be the same integers.
  • the above u 1 —u 3 are preferably the same integer, and particularly preferably 1.
  • t 1 , t 2 , and t 3 are not limited as long as they are integers of 0 or more and 6 or less, and may be different integers, or some or all may be the same integers.
  • t 1 , t 2 , and t 3 are integers of 1 to 6 It is preferable that From the viewpoint of simplicity of production, the above-mentioned t 1 -t 3 are preferably mutually the same integer, particularly preferably 4.
  • X has a structure that is a multi-branched portion in which a plurality of the hydrocarbon-derived chains are bonded to form a branched structure by atoms such as carbon and nitrogen.
  • the plurality of hydrocarbon-derived chains contained in X is preferably the same, but may have different structures as long as they have an aromatic amino group at the terminal. .
  • the linker compound having the structure represented by the general formula (1) or the general formula (2) has an S--S bond capable of binding to a support for protein analysis, It has an amino group capable of binding to a sugar molecule such as an oligosaccharide chain. Therefore, the linker compound is immobilized on the support for protein analysis by a metal-sulfur bond such as an Au—S bond, so that the sugar molecule is firmly attached to the support via the linker compound. It can be easily and easily combined.
  • the linker compound has a multi-branched site, and has an aromatic amino group at each end of the multi-branched site. Therefore, by using a ligand complex (described later) in which a sugar molecule is introduced into the linker compound, sugar molecules can be efficiently assembled on the surface of the support. In addition, since it has a hyperbranched site, when a ligand complex containing a linker compound is bound to the surface of a support, it is possible to two-dimensionally arrange a plurality of sugar molecules with good reproducibility. it can.
  • the above-mentioned linker compound can substantially ignore the influence of non-specific interaction with a protein. Therefore, by using the linker compound of the present invention, the biological activity of the sugar molecule can be evaluated with good reproducibility.
  • the linker compound has an oligoethylene oxide between the disulfide group and the aromatic amino group as shown in the general formula (1) or (2). .
  • non-specific hydrophobic interactions can be minimized, and the length of the metal bond to the disulfide group can be easily adjusted to form a metal sulfur bond efficiently. Can do.
  • the linker compound is produced by the following production method. That is, the above-mentioned linker compound is subjected to a condensation reaction between a thioexoacid and an aminy conjugate containing a multi-branched structure having three or more branched chains whose aromatic amino group terminals are protected by protective groups. It is produced by deprotecting the protecting group at the terminal of the aromatic amino group.
  • the thiotate acid is represented by the following general formula (10)
  • the amine compound is not particularly limited as long as it contains a branched chain having an aromatic amino group terminal protected by a protecting group.
  • the amine compound corresponds to a multibranched site of the linker compound described above. Including the structure to do.
  • the above-mentioned branched chain has the same structure as that of the above-mentioned hydrocarbon derivative chain except that it has an aromatic amino group terminal protected by a protecting group instead of the aromatic amino group contained in the above-mentioned hydrocarbon derivative chain.
  • the above-mentioned branched chain is a hydrocarbon chain composed of carbon and hydrogen, in which a part of carbon and hydrogen may be replaced by another atom or substituent. More specifically, the branched chain has an aromatic amino group terminal protected by a protecting group, and a part of a carbon-carbon bond (C-C bond) which is a main chain structure of a hydrocarbon chain. It may be replaced by a carbon-nitrogen bond (C-N bond) or a carbon-oxygen bond (C-O bond).
  • the protecting group is a substituent introduced so that the amino group of the aromatic amino group is not reacted by the condensation reaction.
  • a protecting group is not particularly limited as long as it is not affected when the protecting group of the secondary amino group is deprotected.
  • the protecting group include a t-butoxycarbol group (a COOC (CH) group; a Boc group).
  • aminy conjugate examples include the following general formula (11)
  • the above-mentioned linker compound has a structure in which an oligoethylene oxide is provided in a part of the linker as described above, in the production method, a substance containing the oligoethylene oxide structure is used as a raw material. It is preferable to use them.
  • this raw material include bis [2- (2-hydroxyethoxy) ethyl] ether (compound 1 of the example) and compounds having different molecular weights.
  • Commercially available polyethylene glycol (Mw: 200, 300, 400, 600, 1000) manufactured by Sigma, among which the degree of polymerization is completely controlled, that is, the length is controlled. It is preferred to use bis [2- (2-hydroxyethoxy) ethyl] ether (Compound 1 of the example) because it has a modified structure.
  • the “ligand complex” shall mean a compound obtained by introducing a sugar molecule into an aromatic amino group of the linker compound.
  • the amino group of the linker compound reacts with the aldehyde group or ketone group generated by the equilibrium in the sugar molecule, and the Schiff base formed by this reaction is subsequently reduced, whereby the aroma is obtained.
  • a sugar molecule can be introduced into an aromatic amino group. That is, by the reductive amination reaction, the linker compound and the sugar molecule are bonded.
  • the sugar molecule contained in the ligand conjugate of the present invention is not particularly limited as long as it is a reducing sugar having a reducing end, and any kind can be used.
  • Specific examples of the sugar molecules include monosaccharides such as glucose, galactose, and mannose; and oligosaccharides such as maltose and ratatose, in which the number of linked sugars is a disaccharide-to-ten-saccharide, and sulfated oligosaccharides described below. And monosaccharides and oligosaccharides that have a sugar number of 11 or more, and include polysaccharides such as heterophosphorus, chondroitin sulfate, and heparan sulfate.
  • a sulfated polysaccharide heparin known to have anticoagulant activity has the following general formula (8)
  • GlcNS6S-IdoA2S Having a specific partial disaccharide structure (referred to as "GlcNS6S-IdoA2S") represented by the following formula, wherein glucose is introduced into a hydroxyl group at the reducing end of the sulfated oligosaccharide.
  • the above oligosaccharides and polysaccharides may be monooligosaccharides having the same monosaccharide molecular force, or complex saccharides composed of various monosaccharide molecules or derivatives thereof, which may be single polysaccharides.
  • Complex polysaccharides containing monosaccharide molecules, derivatives thereof, and oligosaccharides may also be used.
  • any of the above sugar molecules may be various natural sugars obtained by isolation and purification from the natural world, or artificially synthesized sugars.
  • the ligand conjugate of the present invention has a structure represented by the general formula (5).
  • the ligand conjugate having the structure represented by the general formula (5) is represented by the general formula (2), and X has the structure represented by the general formula (3). It is obtained by introducing a sugar molecule into a linker compound.
  • the saccharide molecule is not limited as long as it is a reducing saccharide having a reducing terminal, but is preferably selected from the general formula group (9) and the general formula (12). Since X represented by the general formula (3) has a structure having four hydrocarbon-derived chains, the ligand complex having the structure represented by the general formula (5) Is a compound in which four or more sugar molecules are bonded to the above linker compound.
  • m 1 - m 4 are formula (3) m 1 in - similarly to m 4, is not limited as long as 1 to 6.
  • the integers differ by an integer from one another Some or all of them may be the same integer.
  • n is not particularly limited as long as it is an integer of 1 or more and 6 or less.
  • R ′ may be a compound derived from hydrogen (H) or an oligosaccharide.
  • the ligand conjugate of the present invention has a structure represented by the general formula (7).
  • the ligand conjugate having the structure represented by the general formula (7) is X is obtained by introducing a sugar molecule into a linker compound having the structure represented by the general formula (4), wherein X is represented by the general formula (1).
  • the sugar molecule is not limited as long as it is a reducing sugar having a reducing end, but is preferably selected from general formula group (9) and general formula (12). Since X represented by the general formula (7) has a structure having three hydrocarbon-derived chains, the ligand complex having the structure represented by the general formula (7) Is a compound in which three or more sugar molecules are bonded to the above linker compound.
  • the ligand complex contains a linker compound and a sugar molecule
  • the ligand complex can be formed on the surface of the support for protein analysis by the S-S bond in the linker compound. It can be bonded to a metal by a metal sulfur (S) bond, for example, a gold sulfur (Au—S) bond.
  • S metal sulfur
  • Au—S gold sulfur
  • a ligand carrier by, for example, two-dimensionally arranging a plurality of sugar molecules on the surface of a support for protein analysis with good reproducibility, and using the ligand carrier. This makes it possible to evaluate the biological activity of the sugar molecule with good reproducibility.
  • a metal such as Cu, Ag, and Pt can be used as the metal on the surface of the support.
  • Au is preferably used as the metal on the surface of the support.
  • the above-mentioned ligand complex has oligoethylene oxide in a part of the linker.
  • non-specific hydrophobic interactions can be minimized, and the length up to the disulfide group used for metal bonding can be easily adjusted, so that metal-sulfur bonds can be formed efficiently.
  • the present invention also includes a ligand carrier obtained by immobilizing the ligand complex of the present invention on the surface of the support via a metal-sulfur bond.
  • This ligand carrier is not limited to the use of protein analysis, and can be used for analysis of substances other than proteins in order to examine the interaction with sugar molecules.
  • each S atom of the S--S bond of the ligand complex is formed on the surface of the support.
  • the ligand complex is introduced to the surface of the support by binding to the metal by a metal-sulfur bond.
  • a support for protein analysis is added to the ligand complex solution at a predetermined time.
  • the solvent used for the ligand complex solution is not particularly limited.
  • the immersion time may be about 0.5 hours to 12 hours, and the injection concentration may be about 1 ⁇ -ImM.
  • the ligand complex of the present invention since the ligand complex of the present invention has an SS bond, it can be easily immobilized on the surface of a support for protein analysis, and can be immobilized on the support. Sugar molecules can be easily introduced.
  • the ligand carrier of the present invention can be used for analyzing interaction between a sugar molecule and another substance such as a protein. Specifically, the above-mentioned ligand carrier can be applied to SPR measurement, affinity-take mouth chromatography, and the like.
  • a ligand carrier obtained by immobilizing the ligand complex of the present invention is used on a support on which a metal thin film such as a gold thin film is deposited, and the ligand carrier and the protein are brought into contact with each other. If the resonance angle is measured using a plasmon resonance device, the binding behavior between the ligand carrier and the protein can be observed.
  • the support (sensor chip) used for the SPR measurement for example, glass, plastic, or the like can be used, and glass is particularly preferably used.
  • the contact between the ligand carrier and the protein may be performed, for example, by flowing a solution of the protein in a running buffer to the surface of the ligand carrier. Examples of the running buffer include a phosphate buffer solution.
  • the ligand carrier of the present invention has the ligand complex described above, a plurality of sugar molecules are two-dimensionally arranged on the support surface with good reproducibility. Therefore, the biological activities of sugar molecules can be observed with good reproducibility, the structure of sugar molecules can be elucidated, and the biological activity of sugar molecules can be quantified. Evaluation can be performed.
  • a sensor chip having a sugar chain immobilized thereon as the ligand carrier of the present invention can be used, for example, for the following SPR measurement. That is, the first sensor chip in which the first sugar molecule is immobilized on the surface of the support, and the second sugar molecule having a terminal structure different from that of the first sugar molecule are immobilized on the surface of the support. The difference between the detection result of the SPR measurement obtained by using the first sensor chip and the detection result of the SPR measurement obtained by using the second sensor chip using the second sensor chip And the interaction of sugar molecules can be observed.
  • These sensor chips may use a ligand complex having different sugar molecules immobilized thereon.
  • the sugar molecules to be compared include, for example, ratatose and glucose, maltose and glucose, kojibiose and glucose, and the like. Although two sensor chips are used here, more sensor chips having different types of sugar molecules to be introduced may be used. In addition, the terminus of the sugar molecule is the side not fixed to the sensor chip.
  • the SPR measurement a protein or the like that specifically acts on the first sugar molecule is used, the measurement conditions are kept constant, and the SPR measurement is applied to the two sensor chips, and the resonance angle of the two is observed. By detecting the difference between the two resonance angles, it can be measured as a specific interaction between a sugar molecule and a protein or the like.
  • the substance whose interaction with a sugar molecule is observed is not limited to a protein.
  • the force simultaneously measured by two types of sensor chips is not limited to this.
  • the force may be measured by measuring two or more types of sensor chips, or may not be measured simultaneously.
  • a sensor chip in which a sugar molecule is not introduced into at least one sensor chip may be used.
  • one obtained by fixing only one linker compound may be used.
  • the measurement can be performed using at least two sensor chips in which a ligand conjugate having the same structure except for the sugar molecule is immobilized.
  • the difference in the magnitude of the interaction measured in the above is observed as being due to the sugar molecule. Therefore, by using the above measurement method, it is possible to reduce the non-specific interaction between a portion other than the sugar molecule and another substance and to observe the specific interaction between the sugar molecule and another substance. Can be. [0098] ⁇ Example>
  • linker compounds according to the present invention that is, in the general formula (2), n is 4, X is represented by the general formula (3), and p 1 and p 2 are 1
  • a linker compound having a structure in which m 1 , m 2 , m 3 , and m 4 are 2 was synthesized by the following procedure.
  • Figure 1 shows the process of synthesizing this linker compound (Compound 15).
  • the numbers attached to the respective compounds correspond to the numbers described in FIG.
  • an ester compound (compound 3) was synthesized in a yield of 40%.
  • the compound 3 was reacted with p-toluenesulfuryl chloride in the presence of pyridine in DMAP in dichloromethane to give a tosyl compound (compound 4) in a yield of 78%.
  • Compound 4 was reacted with sodium azide compound in N, N-dimethylformamide to give an azide form (a compound 5) in a yield of 90%.
  • the NMR ⁇ vector was measured using a JEOL-JNM-Lambda-500 NMR spectrometer, a JEOL JNM-GSX400 NMR spectrometer and a JEOL EX-270 NMR spectrometer. Chemical shifts were expressed as ⁇ values using tetramethylsilane as a reference substance in the case of CDC1.
  • CD 0D and DMSO-d are expressed as ⁇ values based on the chemical shift of the remaining solvent protons.
  • Mass spectrometry was measured using AppliedBiosystems, Mariner TM.
  • ATR-FT-IR measurement a device equipped with a one-time reflection ATR accessory device (MIRacle Ge prism) on Shimadzu, IRPrestige-21 was used. The same sensor chip used for SPR measurement was used for ATR-FT-IR measurement.
  • Silica gel 60 No. 9385 (Merck) was used for medium pressure ram silica gel chromatography, and Silica gel 60 F254 (Merck) was used for thin layer silica gel chromatography.
  • the anhydrous dichloromethane used was distilled under a nitrogen stream using calcium hydride as a desiccant.
  • Other dehydrated solvents were purchased and used from Kanto-Danigaku Co., Ltd.
  • the other reagents and solvents were basically of special grade.
  • the azide compound 5 (614 mg, 2.01 mmol) was dissolved in 24 ml of methanol, and 4.3 ml of IN NaOH was added at 0 ° C under light shielding, followed by stirring at room temperature for 21 hours.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the concentrated residue was diluted with chloroform.
  • the organic layer was washed once with saturated saline and dried over anhydrous magnesium sulfate. The drying agent was removed by filtration and concentrated under reduced pressure to obtain Compound 6 (549 mg, yield: 90%) as a colorless liquid.
  • N-Bocaminobenzoic acid derivative (3.33 g, 14.0 mmol) and HOBt (1.93 g, 14.3 mmol) were suspended in anhydrous dichloromethane (60 ml), and the mixture was stirred at 0 ° C for 15 minutes under an argon atmosphere.
  • a solution of EDC-HC1 (2.87 g, 15.0 mmol) dissolved in anhydrous dichloromethane (30 ml) was heated and stirred for 50 minutes.
  • Diethylenetriamine (0.79 ml, 7.00 mmol) was added to this solution, and the mixture was stirred overnight at room temperature under light shielding to obtain white crystals.
  • the white crystals were collected by filtration and recrystallized from methanol to give Compound 10 (3.53 g, yield: 92.9%) as white crystals.
  • the compound 12 is an n-force by general formula (11) is p 1, p 2 is 1, Amini that m 1, m 2, m 3 , m 4 has a structure which is 2 It is a dagger.
  • n 4 in the general formula (2)
  • X is represented by the general formula (3)
  • p 1 and p 2 are 1
  • m 1 and m 2 , m 3 , and m 4 are 2.
  • n 4
  • p 1 and p 2 are 1, m 1 , m 2 , m 3 , m 4 was 2
  • R ′ was hydrogen (H)
  • R was a ligand conjugate having a structure derived from an oligosaccharide represented by the general formula (12), which was synthesized by the following procedure.
  • Figure 2 shows the chemical reaction formula for this synthesis.
  • the compound 17 was subjected to 1 H-NMR (400 MHz, DO) measurement by the method described in Example 1.
  • This compound 17 is a compound represented by the general formula (5), wherein n is 4, p 1 and p 2 are 1, m 1 , m 2 , m 3 , and m 4 are 2, and R Is a hydrogen (H), and R is an oligosaccharide-derived compound represented by the general formula (6-3).
  • Another ligand complex is a ligand complex described in JP-A-2004-157108, which is a ligand complex represented by the following general formula (14).
  • this ligand complex is referred to as “Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glc”. JP 2004-157108 is not disclosed as of the priority date of the present application.
  • Example 3-1 the specific interaction between the chip having the disaccharide structure (GlcNS6S-IdoA2S) represented by the general formula (8) immobilized thereon and the heterozygous protein was determined. To confirm, an inhibition experiment was performed. That is, whether an inhibitor that inhibits the binding between the helin-binding protein and the GlcNS6S-IdoA2S structure was coexisted, and it was examined whether or not the binding of the henin-binding protein to the chip was inhibited.
  • bFGF heparin-binding protein
  • FGF-2 vascular endothelial cells and fibroblasts
  • heparin analogues on the cell surface Interacts with heparan sulfate, which is a quality substance, and expresses biological activity. It has been reported that the minimum binding unit required for binding to bFGF is a pentasaccharide represented by the following general formula (15) (references: M. Maccarana, B. Casu & U. Lindahl, J. Biol. Chem. 268, 8857, 1993).
  • the above structure includes a structure in which the 6th position of dalcosamine is sulfated.
  • bFGF was selected as a protein for observing the interaction with the GlcNS6S-IdoA2S structure.
  • Fig. 3 shows the binding behavior of bFGF to a chip on which Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc was immobilized. From this figure, it was confirmed that the binding of bFGF to the chip on which Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc was immobilized was reduced in a concentration-dependent manner to the concentration of H-. That is,
  • IC 2.5 for the chip on which Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc was immobilized.
  • the IC value of the chip immobilized with Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc is the IC value of the other two types of chips.
  • a linker compound in which Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glc or Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc is bound to a molecule having no sugar chain (a non-sugar chain linker-linking compound, hereinafter referred to as Mono-Glc )
  • Mono-Glc a linker compound in which Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glc or Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc is bound to a molecule having no sugar chain
  • FIG. 5B shows the total reflection spectrum of Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glc
  • FIG. 5 (b) shows the total reflection spectrum of Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc when the mixing ratio in the solution was changed.
  • Example 3-3 Examination of influence of relative density of sugar chain on interaction with h-vWF] Subsequently, relative density of sulfated disaccharide, which is a ligand on the chip surface, was determined by comparing protein with protein. The effect on the interaction with was examined. Here, the interaction with human plasma-derived vWF (hereinafter referred to as h-vWF) was analyzed.
  • h-vWF human plasma-derived vWF
  • Tri-GlcNS6S—IdoA2S—Glc ⁇ Tetra—GlcNS6S—IdoA2S—Glc) and Mono—Glc were mixed at 100/0 and 20/80, respectively.
  • Interaction with vWF was observed by the SPR method.
  • the procedure of measurement by the SPR method will be described.
  • SPR670 manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd.
  • 2 nm chromium was deposited as an adhesive layer on a 13 x 20 x 0.7 mm glass substrate, and a 50 nm gold thin film was deposited thereon (manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd.).
  • the sample was placed in a UV ozone cleaner (NL-UV253, manufactured by Japan Laser Electronics Co., Ltd.) and irradiated with ultraviolet rays for 30 minutes to wash the chip surface with ozone.
  • UV ozone cleaner NL-UV253, manufactured by Japan Laser Electronics Co., Ltd.
  • Mono-GlcNS6S-IdoA2S-GlcZMono-Glc was dissolved in methanol solution (0. ImM), 50 ⁇ l of this solution was taken into a PTFE cell, and sealed with parafilm. The PTFE cell equipped with the chip was gently shaken overnight at room temperature on a Bio Dancer (New Brunswick Scientific).
  • the chip was washed six times with methanol, washed once with water, and then again once with methanol and then water. After air drying, it was mounted on the SPR670 sensor chip cartridge. After the chip surface was sufficiently equilibrated with a running buffer, the gold film was irradiated with a laser beam, and the change in surface plasmon resonance angle observed at that time was observed.
  • a running buffer an isotonic phosphate buffer solution (PBS) having a pH of 7.4 was used. All SPR measurements were performed at a temperature of 25 ° C.
  • bFGF was manufactured by STRATHMANN BIOTEC AG (Recombiant Human FGF-basic, MW; 17000, Lot No .; 471120), and h-vWF was A product of CALBIOCHEM (von Willebrand Factor, Human Plasma, MW; 270000 (converted to Monomer Unit), Lot No .; B41632) was used.
  • Figures 7 (a)-(c) show the above three ligand complexes (Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc,
  • FIGS. 9 (a) and 9 (c) show plots of the binding amount at which the strength was also obtained for each concentration of h-vWF.
  • (a) is for Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc
  • (b) is for
  • FIG. 9 also shows the results of calculating the curve force and the dissociation constant (K) of each graph.
  • h-vWF adopts a multimeric structure, so that there are multiple henolin-binding domains, and the dissociation rate is remarkably slowed by the effect, and the difference in distance between sugar chains is reflected in the dissociation constant. It was thought that it was not done.
  • Example 3-4 Investigation of the Effect of the Relative Density of Sugar Chains on the Interaction with Proteins
  • Escherichia coli derived from Escherichia coli having only A1 / lepe moiety having one henolin binding domain
  • rhvWF-Al recombinant human vWF partial protein
  • FIGS. 10 to 12 show the results of measuring the binding interaction with the chip by changing the rhvWF-Al concentration.
  • FIG. 10 (b) shows the case where Mono-GlcNS6S-IdoA2S-GlcZ was used.
  • Table 1 summarizes the dissociation constant, association constant, association rate constant, and dissociation rate constant calculated from these results.
  • the dissociation constant K & 710 and the binding constant: 1 ⁇ (k
  • binding rate constant k
  • dissociation rate constant k
  • Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glc has a sugar chain cluster structure in which the distance between sulfated oligosaccharide chains is controlled in the molecule, so that the density of sugar chains immobilized on the chip is relatively reduced. It is thought that it is hard to be affected by this. [0167] In other words, in the interaction with rhvWF-Al, in the chip in which Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc was immobilized, the binding strength decreased when the relative sugar chain immobilization density on the chip was reduced. It was confirmed that it would. In contrast, Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glc and
  • FIG. 13 shows the process of synthesizing this linker compound (I-Rid Compound 26).
  • FIG. 14 shows a process of synthesizing a ligand complex (compound 27) from the linker compound (compound 26).
  • the numbers appended to the respective compounds correspond to the numbers shown in FIGS.
  • the JOEL-Delta600 Spectrometer was used for NMR spectrum measurement. Chemical shifts are expressed as ⁇ values with reference to tetramethylsilane (0.00 ppm) for CDC1.
  • FIG. 15 shows a process of synthesizing the linker compound (the compound 32).
  • FIG. 16 shows a process of synthesizing the compound 30 used in the process of synthesizing the linker one compound (the compound 32).
  • FIG. 17 shows a process of synthesizing a ligand conjugate (compound 34) from the linker compound (diagonal compound 32).
  • the numbers added to the respective compounds correspond to the numbers shown in FIGS. 15, 16, and 17. Hit.
  • the JOEL-Delta600 Spectrometer was used for NMR spectrum measurement. Chemical shifts are expressed as ⁇ values with reference to tetramethylsilane (0.00 ppm) for CDC1.
  • the linker compound of the present invention has an aromatic amino group terminal as a site into which three or more sugar molecules can be introduced.
  • it has an S—S bond as a site that can be bonded to a support for protein analysis such as a carrier for surface plasmon resonance (SPR) sensor chip perforated-mouth chromatography.
  • a disulfide group and an aromatic amino group are used so that nonspecific hydrophobic interaction can be minimized and the length up to the disulfide group used for metal bonding can be easily adjusted. And oligoethylene oxide between them.
  • the use of the linker compound has an effect that three or more units of sugar molecules can be two-dimensionally arranged with good reproducibility on the surface of the support.
  • the linker compound reproduces the biological activities of sugar molecules when observing the interactions between sugar molecules and proteins. It is possible to evaluate sexually. Furthermore, a metal sulfur bond can be efficiently formed.
  • the ligand conjugate of the present invention is obtained by introducing a sugar molecule into the above linker compound.
  • a linker compound capable of controlling the distance between sugar chains on the sensor chip surface and two-dimensionally arranging oligosaccharides with good reproducibility, and a sugar molecule in the linker compound
  • the ligand complex to be introduced can be obtained.
  • the linker compound and the ligand complex are very useful for practical use of an oligosaccharide chip and for general use.

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Abstract

　本発明は、非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジスルフィド基までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属−硫黄結合を形成することができる新規なリンカー化合物、および、新規なリガンド複合体、リガンド担持体、ならびにこれらの製造方法を提供する。 　リンカー化合物は、下記一般式（１） 【化１】 （式中、ａ，ｂ，ｄ，ｅは、それぞれ独立して、０以上６以下の整数）にて表される構造を備えている。上記Ｘは、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、３鎖以上含んでなる多分岐構造部位である構造を備えている。また、リガンド複合体は、上記リンカー化合物に糖分子が導入されてなるものである。

Description

明 細 書
リンカ一化合物及びリガンド複合体、並びにそれらの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、表面プラズモン共鳴のセンサチップ等のタンパク質分析用の支持体に オリゴ糖等の糖鎖を固定することが可能なリンカ一化合物、及び該リンカ一化合物に 糖鎖を導入してなるリガンド複合体、リガンド担持体、並びにこれらの製造方法に関 するものである。
背景技術
[0002] 生体内に存在する種々の糖鎖は、生物の活動や生命を維持するためのメカニズム の中で重要な役割を果たしている。このような糖鎖の機能を精密に解明するために は、糖鎖の複雑な構造に基づいてそれらの機能を解析する必要がある。糖鎖の機能 解析には、構造が解明されているオリゴ糖を用いて、糖鎖の構造を一部ずつ再現し、 これによつて糖鎖全体の構造と機能との関係を明らかにする手法が用いられる。
[0003] 上記糖鎖の機能解析の手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴 (以下、 SPRと 記載する）法が知られている。すなわち、糖鎖の一部を模擬したオリゴ糖を含んでな るリガンド複合体をセンサチップ表面上に固定ィ匕し、それによつてオリゴ糖が固定ィ匕 されてなるセンサチップを用いて、オリゴ糖と特異的に相互作用するタンパク質等の 物質を特定する。これにより、オリゴ糖の構造に基づく生物活性の正しい評価を行うこ とがでさる。
[0004] ところが、オリゴ糖は、 1分子だけでは活性がそれほど高くないため、オリゴ糖の生 物活性を評価する場合には、オリゴ糖鎖をセンサチップ上に集合化させることが必要 となる。つまり、集合ィ匕したオリゴ糖鎖を用いて、タンパク質との相互作用を解析する ことにより、オリゴ糖鎖の生物活性の評価を行うことが可能になる。
[0005] そこで、本発明者らは、これまでに、センサチップ表面に固定可能な部位及びオリ ゴ糖鎖を導入可能な部位を分子内に有するリンカ一化合物を得、このリンカ一化合 物に 1単位又は 2単位のオリゴ糖鎖を導入してなるリガンド複合体を得て 、る。そして 、このリガンド複合体を用いることによって、センサチップ上に、オリゴ糖鎖魏合ィ匕し て導入することができることを見出している (例えば、特許文献 1、非特許文献 1等を 参照)。
[0006] 〔特許文献 1〕特開 2003— 836969号公報（2003年 3月 19日公開）
〔非特許文献 1〕「日本ィ匕学会第 79回春季年会 講演予稿集 II」、社団法人日本ィ匕 学会、 2001年 3月 15日、 p. 1042
し力しながら、上記特許文献 1や非特許文献 1に記載のリガンド複合体では、オリゴ 糖の糖鎖をセンサチップ表面に 2次元的に配列させることは可能であるが、その配列 を再現性よく得ることが困難であるという技術的課題が残されている。
[0007] すなわち、上記のように、センサチップ表面に複数分子のオリゴ糖鎖を集合化させ 、オリゴ糖鎖の生物活性を解析する場合には、オリゴ糖の糖鎖の集合ィ匕状態を同一 にし、オリゴ糖鎖とタンパク質との間の相互作用を再現性よく観測することが求められ る。特に、オリゴ糖鎖の生物活性を観測するためには、センサチップ表面に 3単位以 上のオリゴ糖鎖^^合ィ匕し、これらのセンサチップ上にて再現性よく 2次元的に配列 させること〖こよって、オリゴ糖鎖の生物活性を再現性よく評価することが重要になる。
[0008] ところが、上記非特許文献 1に記載のリガンド複合体では、 1つのリガンド複合体が 有するオリゴ糖鎖は 1単位又は 2単位となっている。言い換えれば、上記のリガンド複 合体は、 1つのリンカ一化合物に対して、 1つ又は 2つのオリゴ糖鎖が結合してなるも のである。そのため、オリゴ糖鎖の生物活性を観測するためには、上記リガンド複合 体をセンサチップ表面に配列させる際に、リガンド複合体濃度を高めてリガンドである 糖鎖同士を集合化させることによって、センサチップ表面上に 3単位以上のオリゴ糖 鎖を集合化させる必要がある。
[0009] このような手法によってオリゴ糖鎖を集合化させた場合、オリゴ糖の糖鎖間を所定の 間隔にて制御してオリゴ糖の配列を再現性よく得ることは困難である。それゆえ、上 記従来のリガンド複合体では、オリゴ糖の生物活性を再現性よく観測することができ ず、糖の構造の解明や、オリゴ糖の生物活性の評価を行う場合に困難を伴う可能性 がある。
[0010] 本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、その目的は、セン サチップ表面上の糖鎖間距離を制御し、オリゴ糖を再現性よく 2次元的に配列し得る 新規なリンカ一化合物、及び、該リンカ一化合物に糖分子が導入されてなる新規なリ ガンド複合体、リガンド担持体、並びにこれらの製造方法を提供することにある。 発明の開示
[0011] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 3単位以上の 糖分子を導入可能な部位を有し、かつ、表面プラズモン共鳴 (SPR)のセンサチップ ゃァフィ-テイク口マトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体に結合可能な 部位を有する新規なリンカ一化合物を用いることによって、上記支持体に 3単位以上 の糖分子を再現性よく 2次元的に配列させることができることを見出した。
[0012] なお、本願発明者らは、先出願（出願番号:特願 2003— 190568、公開番号:特開 2004-157108 (公開曰： 2004年 6月 3曰）、本願の優先曰（2004年 2月 5曰 )の時 点で未公開）において、上記の問題点を解決することを目的として見出された他のリ ンカー化合物を開示している。し力しながら、この他のリンカ一化合物は、疎水性が 非常に強いタンパク質などを分析する際に、リンカ一部のアルキル基と非特異的に 結合相互作用してしまうという問題点がある。また、この他のリンカ一化合物は、リンカ 一部を形成しているアルキル基の長さが十分ではなぐ固定ィ匕するオリゴ糖鎖が大き い場合には、オリゴ糖鎖類の立体障害のために効率よく金属 硫黄結合が形成しな いという問題点を有して 、る。
[0013] そこで、本願発明者らは、さらに、リンカ一部にオリゴエチレンォキシド基を導入し、 非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジスルフイド基 までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属 硫黄結合を形成することができ ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
[0014] すなわち、本発明にかかるリンカ一化合物は、上記の課題を解決するために、一般 式 (1) [0015] [化 11]
Figure imgf000006_0001
•(1)
(式中、 a, b, d, eは、それぞれ独立して、 0以上 6以下の整数）にて表される構造を 備え、上記 Xが、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素 -窒素結合を有 して 、てもよ!/、炭化水素誘導鎖を、 3鎖以上含んでなる多分岐構造部位である構造 を備えて 、ることを特徴として 、る。
[0016] また、本発明にかかるリンカ一化合物は、一般式（2)
[0017] [化 12]
0 ―、CH2GH20 )n CH2C― X (2)
Figure imgf000006_0002
(式中、 nは 1以上 6以下の整数）にて表される構造を備え、上記 Xが、末端に芳香族 アミノ基を有するとともに主鎖に炭素 窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖 を、 3鎖以上含んでなる多分岐構造部位である構造を備えて 、るものでもよ 、。
[0018] ここで上記炭化水素誘導鎖とは、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の 炭素や水素が、他の原子や置換基に置き換わって 、てもよ 、ものを指すものとする。 すなわち、上記炭化水素誘導鎖とは、末端に芳香族アミノ基を有し、炭化水素鎖の 主鎖構造である炭素 -炭素結合 (C - C結合)の一部が、炭素 -窒素結合 (C - N結合 )、炭素 酸素結合 (C O結合)、アミド結合 (CO - NH結合）に置き換わっていてもよ いものを指す。 [0019] 上記の構成によれば、上記リンカ一化合物は、糖分子を簡便に導入できる部位とし て、芳香族アミノ基を有している。上記芳香族ァミノ基は、各炭化水素誘導鎖に含ま れているので、上記リンカ一化合物には、 3単位以上の糖分子を導入することができ る。また、上記タンパク質分析用の支持体に固定可能な部位として、 S— S結合を有し ている。
[0020] 従って、上記リンカ一化合物を介して、上記支持体に 3単位以上の糖分子を集合 化させて導入することができる。また、 3単位以上の糖分子が 1つのリンカ一化合物に 導入されているので、上記支持体表面に、 3単位以上の糖分子を再現性よく配列さ せることができる。これにより、上記支持体表面上にて、糖分子とタンパク質との相互 作用の観測が可能になるとともに、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可 會 になる。
[0021] さらに、上記リンカ一化合物は、リンカ一部にオリゴエチレンジォキシド基を有してい るため、リンカ一部にアルキル基を有している場合に比べ、疎水性の高い分析対象 物と非特異的な相互作用を起こす可能性を大幅に低下させることができる。また、上 記リンカ一部がオリゴエチレンジォキシドで構成されていることによって、金属結合に 供されるジスルフイド基力ゝらァミノ末端に結合するオリゴ糖鎖までの長さを容易に調節 することができる。これによつて、ジスルフイド基がオリゴ糖鎖の影響を受けることなぐ 効率よく金属 -硫黄結合を形成することができる。
[0022] 上記一般式（1)または一般式（2)で表される構造を備えて 、るリンカ一化合物にお いて、上記 Xは、一般式（3)
[化 13]
Figure imgf000008_0001
(式中、 m1, m , m°， m4， p1, ρΊま、それぞれ独立して、 1以上 6以下の整数）にて表 される構造を備えて 、ることが好まし V、。
また、上記一般式（1)または一般式 (2)で表される構造を備えてレ、るリンカ一化合 物において、上記 Xは、一般式 (4)
[0025] [化 14]
Figure imgf000009_0001
(式中、 q1, q2, q3,
Figure imgf000009_0002
r , r , t2, t3, u , u , u3は、それぞれ独立して、 0以上 6以 下の整数）にて表される構造を備えて 、ることが好ま 、。
[0026] 上記リンカ一化合物の Xは、上記炭化水素誘導鎖を 3鎖以上有しているので、この リンカ一化合物を介して、上記支持体上に 3単位以上の糖分子の導入が可能である 。そのため、上記支持体表面にて 3単位以上の糖分子間の間隔を制御して、糖分子 の配列を再現性よく得ることができるので、糖分子の生物活性を再現性よく評価する ことが可能になる。
[0027] また、本発明のリガンド複合体は、上記の課題を解決するために、上記した 、ずれ かのリンカ一化合物の芳香族ァミノ基に、糖分子を導入してなるものであることを特徴 としている。
[0028] そして、上記リガンド複合体が、具体的には、一般式 (5) [化 15]
Figure imgf000010_0001
(式中、 m1, m2, m3, m4, n, p1, p2は、それぞれ独立して、 1以上 6以下の整数。 R' は水素 (H)または R。）にて表される構造を備え、上記 Rが式 (6—1)ないし式 (6—6)
[化 16]
Figure imgf000011_0001
(6-1) (6— 2)
Figure imgf000011_0002
(6-3)
Figure imgf000011_0003
(6— 4) (6-5)
から選択されるオリゴ糖由来化合物であることが好ましい。 また、上記リガンド複合体が、具体的には、一般式 (7) [0031] [化 17]
Figure imgf000012_0001
(式中、 a, b, d, e, q1, q2, q3, r , r , r ,
Figure imgf000012_0002
t2, t3, u , u , u3は、それぞれ独立して 、 0以上 6以下の整数。ただし、 bが 0のときは t1, t2および t3は 0ではなぐ t1, t2および t3が 0のときは bは 0ではない。また、 R'は水素（H)または R。 )にて表される構造を備 え、上記 Rが上記式 (6— 1)な 、し式 (6— 6)力も選択されるオリゴ糖であることが好まし い。
[0032] 上記リガンド複合体を用いることにより、上記タンパク質分析用の支持体表面に 3単 位以上または 4単位以上 (一般式 (5)または一般式 (7)に示される構造を備えて!/、る リガンド複合体を用いた場合)の糖分子を集合ィ匕して固定ィ匕することができる。このよ うに、一つのリガンド複合体が 3単位以上の糖分子を有しているので、上記リガンド複 合体同士を上記支持体表面に集合ィヒすることなぐ一つのリガンド複合体を用いるこ とで、 3単位以上の糖分子を集合化させることができる。そのため、糖分子の生物活 性を再現性よく測定することが可能になる。また、上記支持体表面に 2次元的に複数 の糖分子を再現性よく配列することができる。従って、本発明のリガンド複合体が固 定されてなるタンパク質分析用の支持体を用いることによって、糖分子の生物活性を 再現性よく評価することが可能になる。
[0033] また、本発明のリンカ一化合物の製造方法は、上記の課題を解決するために、チォ タト酸と、芳香族ァミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を 3鎖以上有する ァミン化合物との縮合反応を行うステップと、上記芳香族ァミノ基末端の保護基を脱 保護するステップとを含んで 、ることを特徴として 、る。 [0034] 上記の方法によれば、上記タンパク質分析用の支持体に固定可能な部位としての S-S結合と、糖分子を簡便に導入できる部位としての芳香族ァミノ基とを有している、 本発明のリンカ一化合物を得ることができる。
[0035] また、本発明のリガンド複合体の製造方法は、上記の課題を解決するために、上記 のリンカ一化合物と、糖分子とを用いて、還元アミノ化反応を行うことを特徴としている
[0036] 上記の方法によれば、還元アミノ化反応により、リンカ一化合物に簡便に糖分子を 導入して、本発明のリガンド複合体を得ることができる。
[0037] なお、上記糖分子としては、還元末端を有するあらゆる種類の糖分子を用いること ができる。
[0038] 上記糖分子として、具体的には、一般式 (8)
[0039] [化 18]
Figure imgf000013_0001
にて表されるへノリン部分二糖構造を有する硫酸ィ匕オリゴ糖を用いることが好まし ヽ
[0040] また、上記糖分子として、具体的には、群（9)
[0041] [化 19]
Figure imgf000014_0001
力も選択されるオリゴ糖の少なくとも 1つを用いることが好ましい。
[0042] また、本発明の糖分子の導入方法は、上記の課題を解決するために、上記リガンド 複合体を含む溶液と、支持体表面の金属とを接触させることを特徴として!ヽる。
[0043] 上記の方法によれば、上記リガンド複合体に含まれるリンカ一化合物の S— S結合を 、上記支持体表面の金属との結合に変換し、支持体表面にリガンドである糖鎖を固 定することができる。従って、リガンド複合体を含む溶液と支持体とを接触させるという 簡便な方法で、リンカ一化合物に結合した糖分子を支持体の表面に配列させること ができる。
[0044] また、本発明のリガンド担持体は、上記の課題を解決するために、上記リガンド複合 体を、表面に金属を有する支持体上に、固定ィ匕させてなることを特徴としている。
[0045] 上記の構成によれば、金属 硫黄結合を介して、支持体表面にリガンド複合体を強 固に固定することができるので、支持体表面に複数の糖分子を再現性よく配列させ てなるリガンド担持体を提供することができる。従って、上記リガンド担持体を用いれ ば、リガンド複合体に含まれる糖分子と、該糖分子と相互作用するタンパク質等の物 質との相互作用を再現性よく観測することができるので、糖分子の生物活性の定量 的な評価が可能になる。
[0046] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十 分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白にな るだろう。
図面の簡単な説明
[図 1]本発明にかかるリンカ一化合物 (ィ匕合物 15)の合成経路の一例を示す模式図 である。
[図 2]本発明にかかるリガンド複合体 (ィ匕合物 17)の合成経路の一例を示す模式図で ある。
[図 3]へパリン共存下にお!/、て、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップへ の bFGFの結合挙動を示すグラフである。
[図 4]Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcゝ Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcゝ
Tetra- GlcNS6S-IdoA2S-Glcをそれぞれ固定化したチップへの bFGFの結合相互作 用に対するへパリンの阻害率を示すグラフである。
[図 5(a)]溶液中の混合比を変えた Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glcの全反射赤外吸収スぺ タトルを示すグラフである。
[図 5(b)]溶液中の混合比を変えた Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glcの全反射赤外吸収ス ベクトルを示すグラフである。
[図 6(a)]溶液中の Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glcの混合比に対するチップ上の硫酸基の 相対強度を示すグラフである。
[図 6(b)]溶液中の Tetra- GlcNS6S-IdoA2S-Glcの混合比に対するチップ上の硫酸基 の相対強度を示すグラフである。
[図 7(a)]Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcと Mono- Glcとの混合比が 100Z0の場合の h-vWFの結合相互作用を、 SPR法によって観測した結果を示すグラフである。
[図 7(b)]Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcと Mono- Glcとの混合比が 100Z0の場合の h- vWF の結合相互作用を、 SPR法によって観測した結果を示すグラフである。
[図 7(c)]Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcと Mono- Glcとの混合比が 100Z0の場合の h-vWFの結合相互作用を、 SPR法によって観測した結果を示すグラフである。
[図 8(a)]Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcと Mono- Glcとの混合比が 20Z80の場合の h-vWFの結合相互作用を、 SPR法によって観測した結果を示すグラフである。
[図 8(b)]Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcと Mono- Glcとの混合比が 20Z80の場合の h- vWF の結合相互作用を、 SPR法によって観測した結果を示すグラフである。
[図 8(c)]Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcと Mono- Glcとの混合比が 20Z80の場合の h-vWFの結合相互作用を、 SPR法によって観測した結果を示すグラフである。
[図 9(a)]図 7 (a)および図 8 (a)に示す結果から得られた結合量を、 h-vWFの濃度ごと にプロットしたグラフである。
[図 9(b)]図 7 (b)および図 8 (b)に示す結果から得られた結合量を、 h-vWFの濃度ごと にプロットしたグラフである。
[図 9(c)]図 7 (c)および図 8 (c)に示す結果から得られた結合量を、 h-vWFの濃度ごと にプロットしたグラフである。
[図 10(a)]Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glc/Mono- Glc= 100/0の場合において、 Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップと rhvWF-Alとの相互作用を測定し た結果を示すグラフである。
[図 10(b)]Mono-GlcNS6S-IdoA2S- Glc/Mono- Glc=50/50の場合において、 Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップと rhvWF-Alとの相互作用を測定し た結果を示すグラフである。
[図ll(a)]Tri-GlcNS6S-IdoA2S-GlcZMono-Glc = 100/0の場合にぉぃて、
Tri- GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップと rhvWF-Alとの相互作用を測定した 結果を示すグラフである。
[図 ll(b)]Tri- GlcNS6S- IdoA2S- GlcZMono- Glc=50/50の場合において、
Tri- GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップと rhvWF-Alとの相互作用を測定した 結果を示すグラフである。
[図 12(a)]Tetra-GlcNS6S-IdoA2S- GlcZMono- Glc= 100/0の場合において、 Tetra- GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップと rhvWF-Alとの相互作用を測定し た結果を示すグラフである。
[図 12(b)]Tetra-GlcNS6S-IdoA2S- Glc/Mono- Glc=50/50の場合において、 Tetra- GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップと rhvWF-Alとの相互作用を測定し た結果を示すグラフである。
圆 13]本発明にかかるリンカ一化合物 (ィ匕合物 26)の合成経路の一例を示す模式図 である。
[図 14]本発明にかかるリガンド複合体 (ィ匕合物 27)の合成経路の一例を示す模式図 である。
[図 15]本発明にかかるリンカ一化合物 (ィ匕合物 32)の合成経路の一例を示す模式図 である。
[図 16]H N-TEG-NHBoc (化合物 30)の合成経路の一例を示す模式図である。
2
[図 17]本発明にかかるリガンド複合体 (ィ匕合物 34)の合成経路の一例を示す模式図 である。
発明を実施するための最良の形態
[0048] 以下、本発明について詳細に説明する。
[0049] 本発明のリンカ一化合物は、表面プラズモン共鳴（SPR)のセンサチップゃァフィ- テイク口マトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体とオリゴ糖等の糖 (以下、 糖分子と記載する）との間に介在して、上記支持体上に糖分子を固定化するために 用いられる。そのため、上記リンカ一化合物は、上記支持体に固定可能な部位、及 び、糖分子を簡便に導入できる部位を分子内に有している必要がある。
[0050] また、上記 SPRゃァフィ-テイク口マトグラフィでは、糖分子と特異的に相互作用す るタンパク質等の物質を特定することや分離することを目的としている。そのため、上 記リンカ一化合物は、タンパク質等の物質との非特異的な相互作用を有していないも のでなければならない。
[0051] そこで、本発明のリンカ一化合物は、上記支持体に固定可能な部位として、前記一 般式（1)または一般式（2)にて示すように、ジスルフイド結合 (S— S結合)を有してい る。このジスルフイド結合の硫黄 (S)は、例えば、タンパク質分析用の支持体表面に コートされた金 (Au)などの金属と、金属 硫黄結合を形成し、上記支持体に強固に 結合することができる。
[0052] また、上記リンカ一化合物は、タンパク質分析用の支持体表面に 2次元的に複数の 糖分子を配列するとともに、個々の糖分子の糖鎖間の距離を制御するために、糖分 子を簡便に導入できる部位として、複数のアミノ基を含んでなる多分岐部位を有して いる。すなわち、本発明のリンカ一化合物の多分岐部位は、前記一般式（1)または 一般式（2)の Xで表される構造を備えている部位であり、該 Xは、前記したように、末 端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素 窒素結合やアミド結合を有してい てもよ 、炭化水素誘導鎖を 3鎖以上含んで 、る構造を備えて 、る。
[0053] 上記芳香族ァミノ基のアミノ基 (一 NH基）は、オリゴ糖等の糖分子との還元アミノィ匕
2
反応により、上記リンカ一化合物に糖分子を導入するための反応基となる。つまり、 糖分子中の平衡によって生じるアルデヒド基 (一 CHO基)又はケトン基 (一 CRO基、 R は炭化水素基)と、上記リンカ一化合物が有するアミノ基とが反応する。そして、この 反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族ァミノ基 に容易に糖分子を導入することができる。
[0054] 従って、前記一般式（1)または一般式（2)の Xは、上記のような炭化水素誘導鎖を 3鎖以上含むことにより、糖分子を導入可能な芳香族アミノ基を複数併せ持った多分 岐型部位である構造を備えて 、る。この多分岐型部位に含まれる各芳香族ァミノ基 に、オリゴ糖等の糖分子が導入されるので、前記一般式（1)または一般式 (2)にて表 される構造を備えているリンカ一化合物を介して、タンパク質分析用の支持体表面に 2次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することが可能になる。
[0055] さらに、本発明のリンカ一化合物は、前記一般式（1)または一般式 (2)に示すよう に、ジスルフイド基と、芳香族ァミノ基との間にオリゴエチレンォキシドを有している。こ れにより、非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジス ルフイド基までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属 -硫黄結合を形成する ことができる。なお、上記一般式（1)において、 a, b, d, eは、それぞれ独立して、 0以 上 6以下の整数であればよい。ただし、 bが 0の場合は、 Xの内部にオリゴエチレンォ キシドを有している必要がある。上記一般式（2)において、 nは、 1以上 6以下の整数 であれば限定されない。
[0056] 具体的には、上記 Xは、前記一般式（3)にて示すように、 2鎖の炭化水素誘導鎖が 、芳香族ァミノ基とは反対側の末端にて、 1つの窒素 (N)に結合した 2分岐構造を 2 つ有している構造を備えていてもよい。この場合、 2つの 2分岐構造の上記窒素が、 例えば CO— CH を介して、 1つの窒素 (N)に結合することによって分岐構造を形
2
成する。これにより、上記 Xは、 4鎖の炭化水素誘導鎖を備えた多分岐型部位である 構造を備えることになる。なお、上記一般式（3)において、 m1, m2, m3, m4は、 1以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよぐ一部あるいは 全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記多分岐部位を有する化合物の製造時 の簡便さの点から、上記 m1— m4は、互いに同じ整数であることが好ましぐ特に 2で あることが好ましい。また、 p1, p2は、 1以上 6以下の整数であれば特に限定されず、 互いに異なる整数であってもよぐ互いに同じ整数であってもよい。このうち、製造の 簡便性の点から、 p1, p2は、互いに同じ整数であることが好ましぐ特に 1であることが 好ましい。
[0057] なお、前記一般式（3)に示される 4鎖の炭化水素誘導鎖を備えた Xにお 、て、各炭 化水素誘導鎖中にオリゴエチレンォキシドを有する構造とすることもできる。例えば、 前記一般式 (4)のように、各炭化水素誘導鎖の CHと NHの間にオリゴエチレンォキ
2
シドを有する構造とすることができる。
[0058] また、上記 Xは、前記一般式 (4)にて示すように、 3鎖の炭化水素誘導鎖が、芳香 族ァミノ基とは反対側の末端にて、 1つの炭素（C)に結合した 3分岐構造を有してい る構造を備えていてもよい。この場合、 3分岐構造の上記炭素が、例えば- C-N-を 介して、 1つの窒素 (N)に結合することによって分岐構造を形成する。これにより、上 記 Xは、 3鎖の炭化水素誘導鎖を備えた多分岐型部位である構造を備えることになる
[0059] なお、上記一般式 (4)にお 、て、 q1, q , q3は、 0以上 6以下の整数であれば限定さ れず、互いに異なる整数であってもよぐ一部あるいは全てが同じ整数であってもよ い。このうち、上記多分岐部位を有する化合物の製造時の簡便さの点から、上記 q1 一 q3は、互いに同じ整数であることが好ましぐ特に 2であることが好ましい。また、 r1, r2, r3は、 0以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく 、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、製造の簡便性の点から、上 記 r1一 r3は、互いに同じ整数であることが好ましぐ特に 1であることが好ましい。また 、 u1, u2, u3は、 0以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であって もよぐ一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、製造の簡便性の点か ら、上記 u1— u3は、互いに同じ整数であることが好ましぐ特に 1であることが好ましい 。さらに、 t1, t2, t3は、 0以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数で あってもよぐ一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。ただし、前記一般式（1) において Xが当該一般式 (4)である場合、前記一般式（1)の bが 0のときは、 t1, t2, t3 は 1以上 6以下の整数であることが好ましい。製造の簡便性の点から、上記 t1一 t3は、 互!ヽに同じ整数であることが好ましく、特に 4であることが好まし 、。
[0060] このように、上記 Xは、炭素や窒素等の原子にて、上記炭化水素誘導鎖を複数結 合して分岐構造を形成している多分岐型部位である構造を備えている。なお、上記 X に含まれる複数の炭化水素誘導鎖は、すべて同じであることが好ましいが、末端に芳 香族アミノ基を有して 、れば、互 、に異なる構造であってもよ 、。
[0061] 以上のように、一般式（1)または一般式（2)にて表される構造を備えているリンカ一 化合物は、タンパク質分析用の支持体に結合可能な S— S結合と、オリゴ糖鎖等の糖 分子に結合可能なァミノ基とを有している。従って、例えば Au— S結合などの金属— 硫黄結合により上記リンカ一化合物が、タンパク質分析用の支持体上に固定される ので、上記リンカ一化合物を介して、上記支持体上に糖分子を強固にかつ簡単に結 合させることができる。
[0062] また、上記リンカ一化合物は、多分岐型部位を有し、該多分岐型部位の各末端に 芳香族アミノ基を有している。そのため、上記リンカ一化合物に糖分子を導入してな るリガンド複合体 (後述)を用いることにより、上記支持体表面に効率よく糖分子を集 合化させることができる。また、多分岐型部位を有しているので、リンカ一化合物を含 んでなるリガンド複合体を支持体表面に結合させた場合に、 2次元的に複数の糖分 子を再現性よく配列させることができる。
[0063] さらに、上記リンカ一化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほぼ 無視することができる。それゆえ、本発明のリンカ一化合物を用いることによって、糖 分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。
[0064] また、上記リンカ一化合物は、前記一般式（1)または一般式（2)に示すように、ジス ルフイド基と、芳香族ァミノ基との間にオリゴエチレンォキシドを有している。これによ つて、非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジスルフ イド基までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属 硫黄結合を形成すること ができる。
[0065] 上記リンカ一化合物は、以下に示す製造方法によって製造される。すなわち、上記 リンカ一化合物は、チォ外酸と、芳香族ァミノ基末端が保護基によって保護された分 岐鎖を 3鎖以上有する多分岐構造を含んでなるアミンィ匕合物との縮合反応を行い、 上記芳香族ァミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。
[0066] 上記チォタト酸は、下記一般式（10)
[0067] [化 20]
Figure imgf000021_0001
にて表される構造を備えて 、る。
[0068] また、上記アミン化合物は、保護基によって保護された芳香族ァミノ基末端を有す る分岐鎖を含んでいれば特に限定されるものではなぐ上記したリンカ一化合物の多 分岐部位に相当する構造を含んで 、ればよ 、。
[0069] 従って、上記分岐鎖は、上記した炭化水素誘導鎖に含まれる芳香族ァミノ基の代 わりに、保護基によって保護された芳香族ァミノ基末端を有する以外は、上記炭化水 素誘導鎖に含まれる構造を有していればよい。つまり、上記分岐鎖は、炭素及び水 素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が他の原子や置換基に置き換わつ ていてもよいものである。より具体的には、上記分岐鎖は、保護基によって保護され た芳香族ァミノ基末端を有するとともに、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素-炭素結 合 (C - C結合)の一部が炭素 -窒素結合 (C - N結合)、また炭素 -酸素結合 (C - O結 合）に置き換わっていてもよいものである。
[0070] また、上記保護基とは、芳香族ァミノ基のアミノ基が上記縮合反応によって反応しな いように導入される置換基である。このような保護基は、二級アミノ基の保護基を脱保 護する際に影響を受けないものであれば、特に限定されるものではない。上記保護 基としては、例えば、 t ブトキシカルボ-ル基 (一 COOC (CH )基; Boc基と記載す る）、ベンジル基、ァリルカルバメート基 (一 COOCH CH = CH
2 2、 Alloc基）等を挙げ ることがでさる。
[0071] 上記アミンィ匕合物としては、例えば、下記一般式（11)
[0072] [化 21]
H2N ~(CH2CH20)N- OH.-
Figure imgf000022_0001
•( 1 1 ) にて表される構造を備えている化合物を挙げることができる。なお、上記一般式（11) 中の n, m1— m4, p1, p2は、それぞれ独立して、 1以上 6以下の整数である。これらの ァミン化合物の合成方法については、後の実施例にて詳述する。
[0073] 上記チォタト酸とアミンィ匕合物との縮合反応により、チォタト酸のカルボキシル基 (一 COOH基）と、アミンィ匕合物のアミノ基 (一 NH基）とが縮合して、アミド結合が形成さ
2
れる。その後、芳香族ァミノ基末端の保護基を脱保護して、保護基を取り外し、芳香 族ァミノ基にすることによって、上記したリンカ一化合物を得ることができる。
[0074] なお、上記リンカ一化合物は、上述のようにリンカ一部分にオリゴエチレンォキシド を備えた構造となっているため、その製造方法においてはオリゴエチレンォキシド構 造を含んでなる物質を原料として用いることが好ましい。この原料としては、例えば、 ビス [2— (2—ヒドロキシエトキシ)ェチル]エーテル (実施例の化合物 1)、分子量の異な る市販のポリエチレングリコール（Mw: 200、 300、 400、 600、 1000) (Sigma社製）など を挙げることができ、この中でも特に、重合度が完全に制御された、すなわち、長さが 制御された構造を有するという理由で、ビス [2— (2—ヒドロキシエトキシ)ェチル]エー テル (実施例の化合物 1)を用いることが好ま 、。
[0075] 次に、本発明のリガンド複合体について説明する。ここで、「リガンド複合体」とは、 上記リンカ一化合物の芳香族ァミノ基に、糖分子が導入されてなるものを意味するも のとする。本発明のリガンド複合体においては、リンカ一化合物のァミノ基が、糖分子 中の平衡によって生じるアルデヒド基又はケトン基と反応し、この反応によって形成さ れたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族ァミノ基に糖分子を導入す ることができる。すなわち、この還元アミノ化反応により、上記リンカ一化合物と糖分子 とが結合する。
[0076] 本発明のリガンド複合体に含まれる糖分子としては、還元末端を有する還元糖であ れば、特に限定されることなくあらゆる種類のものを用いることができる。上記糖分子 として具体的には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース等の単糖類、結合し ている糖の数が 2糖一 10糖であるマルトース、ラタトース、後述する硫酸化オリゴ糖等 のオリゴ糖類、単糖類やオリゴ糖類が組み合わされて糖数が 11以上であるへノ《リン、 コンドロイチン硫酸、へパラン硫酸等の多糖類を挙げることができる。
[0077] また、上記オリゴ糖類として、抗血液凝固活性を有することで知られて ヽる硫酸化多 糖へパリン中の下記一般式 (8)
[0078] [化 22]
Figure imgf000023_0001
にて表される特定の部分二糖構造（「GlcNS6S— IdoA2S」と呼ぶ）を有する硫酸ィ匕 オリゴ糖、該硫酸ィ匕オリゴ糖の還元末端である水酸基にグルコースを導入してなる下 記一般式（12)
[0079] [化 23]
Figure imgf000024_0001
にて表される構造を備えているオリゴ糖を挙げることができる。
[0080] なお、上記オリゴ糖類や多糖類は、同一の単糖分子力もなる単一オリゴ糖ゃ単一 多糖であってもよぐ種々の単糖分子やその誘導体からなる複合糖質や、種々の単 糖分子やその誘導体、オリゴ糖類を含んでなる複合多糖類であってもよい。また、上 記糖分子は、いずれも、自然界から単離 ·精製して得られる種々の天然の糖であって もよぐ人工的に合成された糖であってもよい。
[0081] 具体的には、本発明のリガンド複合体は、前記一般式 (5)にて表される構造を備え ているものである。この一般式（5)にて表される構造を備えているリガンド複合体は、 前記一般式（2)にて表され、 Xが前記一般式（3)にて表される構造を備えているリン カー化合物に、糖分子を導入してなるものである。糖分子は、還元末端を有する還 元糖であれば限定されな 、が、一般式群 (9)や一般式（12)力 選択されるものであ ることが好ましい。一般式（3)にて表される Xは、 4鎖の炭化水素誘導鎖を有している 構造を備えているので、一般式（5)にて表される構造を備えているリガンド複合体は 、上記リンカ一化合物に 4単位以上の糖分子が結合したものである。なお、上記一般 式（5)において、 m1— m4は、一般式（3)中の m1— m4と同様に、 1以上 6以下の整数 であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよぐ一部あるいは全てが同じ整 数であってもよい。また、 nは 1以上 6以下の整数であれば特に限定されない。また、 R'は水素 (H)またはオリゴ糖由来化合物であればよい。
[0082] また、本発明のリガンド複合体は、前記一般式 (7)にて表される構造を備えているも のである。この一般式（7)にて表される構造を備えているリガンド複合体は、前記一 般式（1)にて表され、 Xが前記一般式 (4)にて表される構造を備えているリンカ一化 合物に、糖分子を導入してなるものである。糖分子は、還元末端を有する還元糖であ れば限定されな 、が、一般式群 (9)や一般式（12)力ら選択されるものであることが 好ましい。一般式（7)にて表される Xは、 3鎖の炭化水素誘導鎖を有している構造を 備えているので、一般式（7)にて表される構造を備えているリガンド複合体は、上記リ ンカー化合物に 3単位以上の糖分子が結合したものである。
[0083] 上記のリガンド複合体は、 、ずれもリンカ一化合物と糖分子とを含んでなって 、るの で、リンカ一化合物内の S— S結合にて、タンパク質分析用の支持体表面の金属と、 金属 硫黄 (S)結合、例えば金 硫黄 (Au— S)結合により結合することができる。これ により、この Au— S結合を介して、上記支持体表面に 3単位以上の糖分子を集合ィ匕し て固定化されてなるリガンド担持体を提供することができる。それゆえ、上記リガンド 複合体を用いることによって、例えばタンパク質分析用の支持体表面に 2次元的に複 数の糖分子を再現性よく配列してリガンド担持体を得、該リガンド担持体を用いること によって、糖分子の生物活性を再現性よく評価することが可能になる。なお、上記支 持体表面の金属としては、上記 Auの他、 Cu、 Ag、 Pt等の金属を用いることができる 力 特に Auを用いることが好ましい。
[0084] さらに、上記のリガンド複合体は、リンカ一部にオリゴエチレンォキシドを有している 。これにより、非特異的な疎水性相互作用を極力抑え、かつ、金属結合に供されるジ スルフイド基までの長さを容易に調整可能にして、効率よく金属 -硫黄結合を形成す ることがでさる。
[0085] このように、本発明のリガンド複合体を、金属 硫黄結合を介して支持体の表面に 固定ィ匕させてなるリガンド担持体も本発明に含まれる。このリガンド担持体はタンパク 質分析の用途に限定されず、糖分子との相互作用を調べるために、タンパク質以外 の物質の分析用として用いることもできる。
[0086] 上記リガンド担持体は、該リガンド複合体を含む溶液と表面に金属膜を有する支持 体とを接触させることにより、リガンド複合体の S— S結合の各 S原子が、支持体表面の 金属と金属 硫黄結合によって結合して、支持体表面に上記リガンド複合体が導入さ れる。具体的には、上記リガンド複合体溶液に、タンパク質分析用の支持体を所定時 間浸漬する、あるいは、上記支持体にリガンド複合体溶液を注入する（支持体表面に リガンド複合体溶液を流す)こと〖こよって、上記リガンド複合体に含まれるリンカ一化 合物の S— S結合を、上記支持体表面の金等との Au— S結合に変換して、支持体表 面に上記リガンド複合体を固定することができる。
[0087] リガンド複合体溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば
、メタノール、水、ジメチルァセトアミド (DMAc)や、これらの混合溶媒等を挙げること ができる。また、浸漬時間は、 0. 5時間一 12時間程度であればよぐ注入濃度は、 1 μ Μ— ImM程度であればよい。
[0088] このように、本発明のリガンド複合体は、 S— S結合を有して 、るので、タンパク質分 析用の支持体表面に簡単に固定化することができ、上記支持体上に糖分子を簡単 に導入することができる。
[0089] なお、上記のように支持体に糖分子を導入する方法も本発明に含まれる。
[0090] 本発明のリガンド担持体は、糖分子と、例えばタンパク質等の他の物質との相互作 用の分析に、利用可能である。具体的には、上記リガンド担持体は、 SPR測定、ァフ ィ-テイク口マトグラフィ等に適用することができる。
[0091] 例えば、タンパク質分析として、 SPR測定を行うには、以下のようにすればよい。す なわち、金薄膜等の金属薄膜を蒸着した支持体に、本発明のリガンド複合体を固定 化してなるリガンド担持体を用い、該リガンド担持体とタンパク質とを接触させ、常法 に従って、表面プラズモン共鳴装置を用いて共鳴角度を測定すれば、該リガンド担 持体とタンパク質との結合挙動を観測することができる。なお、 SPR測定に用いる上 記支持体 (センサチップ）としては、例えば、ガラス、プラスチック等を用いることができ 、特にガラスが好適に用いられる。また、リガンド担持体とタンパク質の接触は、例え ば、タンパク質をランニングバッファーに溶解した溶液を、該リガンド担持体の表面に 流入することにより行えばよい。このランニングバッファ一としては、例えば、リン酸緩 衝溶液等を挙げることができる。
[0092] 本発明のリガンド担持体は、上記リガンド複合体を有して!/、るので、支持体表面に 2 次元的に複数の糖分子が再現性よく配列されている。それゆえ、糖分子の生物活性 を再現性よく観測でき、糖分子の構造の解明や、糖分子の生物活性について定量 的な評価を行うことができる。
[0093] また、本発明のリガンド担持体として、糖鎖を固定ィ匕したセンサチップは、例えば、 以下のような SPR測定に使用することができる。すなわち、第 1の糖分子が支持体表 面に固定化されてなる第 1のセンサチップと、上記第 1の糖分子とは末端構造が異な る第 2の糖分子が支持体表面に固定化されてなる第 2のセンサチップとを用いて、第 1のセンサチップを用いて得られた SPR測定の検出結果と、第 2のセンサチップを用 いて得られた SPR測定の検出結果との差を検出し、糖分子の相互作用を観測するこ とができる。これらのセンサチップは、固定ィ匕される糖分子が異なっているリガンド複 合体を用いればよい。比較する糖分子には、例えば、ラタトースとグルコース、マルト ースとグルコース、コージビオースとグルコース等が挙げられる。ここでは、 2つのセン サチップを用いたが、これ以上の数の、導入される糖分子の種類が異なるセンサチッ プを用いてもよい。なお、糖分子の末端とは、センサチップに固定されていない側の ことである。
[0094] 上記 SPR測定では、第 1の糖分子に特異的に作用するタンパク質等を用いて、測 定条件を一定にして、上記 2つのセンサチップに作用させ、両者の共鳴角度を観測 する。この両者の共鳴角度の差を検出することで、糖分子とタンパク質等との特異的 な相互作用として測定することができる。
[0095] また、糖分子との相互作用を観測する物質は、タンパク質に限定はされない。
[0096] 上記では、 2つの種類のセンサチップを同時に測定した力 これに限定されることは なぐ 2種類以上のセンサチップを測定しても力まわないし、同時に測定しなくてもか まわない。また、少なくとも 1つのセンサチップに糖分子を導入していないものを用い てもよい。例えば、リンカ一化合物のみを固定ィ匕したものを用いてもよい。
[0097] 上記のような SPR測定を行うと、糖分子以外は同じ構造のリガンド複合体を固定ィ匕 した少なくとも 2つのセンサチップを用いて、測定をすることができるため、少なくとも 2 つのセンサチップで測定された相互作用の大きさの差は、糖分子に起因したものとし て観測される。従って、上記測定方法を用いれば、糖分子以外の部分と、他の物質と の非特異的な相互作用を低減させ、糖分子と他の物質との特異的な相互作用を観 柳』することができる。 [0098] <実施例 >
以下、本発明のリンカ一化合物およびリガンド複合体の合成について、より詳細に 説明する。また、本実施例では、合成した当該リガンド複合体と他のリガンド複合体と を用いて、その特性を比較検討するという実験も行った。それについても併せて説明 する。
[0099] 〔実施例 1：リンカ一化合物 (化合物 15)の合成〕
本発明にかかるリンカ一化合物の一つ、すなわち、前記一般式（2)にて、 nが 4であ り、 Xが前記一般式（3)にて表され、 p1, p2が 1であり、 m1, m2, m3, m4が 2である構 造を有するリンカ一化合物 (ィ匕合物 15)は以下の手順で合成した。図 1には、このリン カー化合物 (化合物 15)を合成する過程を示す。なお、本実施例 1の説明において、 各化合物に付記して 、る番号は図 1に記載の番号に相当する。
[0100] 図 1に示すように、先ず、原料として、ビス [2-(2-ヒドロキシエトキシ)ェチル]エーテル
(化合物 1)を用いて、ジクロロメタン中で BF -Et 0存在下ジァゾ酢酸ェチル (化合物
3 2
2)を反応させて、エステル体 (化合物 3)を収率 40%で合成した。次に、化合物 3を ジクロロメタン中で DMAP、ピリジン存在下 p-トルエンスルホユルク口リドと反応させ 、トシル体（化合物 4)を 78%の収率で得た。化合物 4に N, N—ジメチルホルムアミド 中アジィ匕ナトリウムを作用させ、収率 90%でアジド体 (ィ匕合物 5)を得た。
[0101] これをメタノール中 IN NaOHで加水分解し、カルボン酸誘導体 (化合物 6)を収 率 98%で得た。ジクロロメタン中で上記化合物 6と化合物 7を、 HOBtと EDC 'HClを 用いて縮合し、ジエステル誘導体 (ィ匕合物 8)を 80%の収率で得た。この化合物 8をメタ ノール中 0.6 N NaOHで加水分解することにより、ジカルボン酸誘導体 (化合物 9)を 収率 93%で得た。上記化合物 9とジァミン誘導体 (化合物 10)を FDPPと DIPEAを用 いて縮合し、化合物 11を収率 40%で得た。この化合物 11のアジド基を接触水素還 元して、収率 80%でァミン体 (化合物 12)へと導 ヽた。
[0102] その後、チォタト酸 (ィ匕合物 13)と縮合させ、化合物 14を収率 59%で得た。最後に、 この化合物 14に TFAを作用させることによって、 Boc基を脱保護し、 目的の芳香族ァ ミノ基を 4単位有するリンカ一化合物 (化合物 15)を収率 91%で得た。
[0103] 以下、上述の合成過程で得られる各化合物の合成方法についてより具体的に示す ととも〖こ、合成された各化合物について1 H— NMR ^ベクトルの測定と質量分析の測 定を行った結果を示す。また、リガンドである糖鎖のチップ上での相対濃度は全反射 FT-IR(ATR-FT-IR)を測定して求めた。それぞれ、以下のような手順で行った。
[0104] — NMR ^ベクトル、質量分析、 ATR- FT- IRの測定、および試薬等〕
ェ！！ー NMR ^ベクトルの測定には、 JEOL-JNM- Lambda- 500 NMR spectrometerと JEOL JNM-GSX400 NMR spectrometerと JEOL EX— 270 NMR spectrometerを用い た。化学シフトは、 CDC1 の場合テトラメチルシランを基準物質として δ値で表した。
3
CD 0Dおよび DMSO-dは残存する溶媒のプロトンの化学シフトを基準に δ値で表
3 6
した。質量分析は AppliedBiosystems, Mariner™を用いて測定した。 ATR- FT- IR測 定には、 Shimadzu, IRPrestige- 21に 1回反射 ATR付属装置 (MIRacle Geプリズム)を 搭載したものを用いた。 ATR-FT-IR測定のためのセンサチップは SPR測定の時と同 じものを使用した。中圧力ラムシリカゲルクロマトグラフィは Silica gel 60 No. 9385 (Merck)を使用し、薄層シリカゲルクロマトグラフィは Silica gel 60 F254 (Merck)を使 用した。無水ジクロロメタンは水素化カルシウムを乾燥剤に用いて窒素気流下蒸留し たものを使用した。その他の脱水溶媒は、関東ィ匕学株式会社製のものを購入して使 用した。それ以外の試薬及び溶媒は、基本的に特級のものを使用した。
[0105] (1)化合物 3の合成
ビス [2- (2-ヒドロキシエトキシ)ェチル]エーテル（ィ匕合物 1) (14.57 ml, 80 mmol)と BF
3
•Et 0(252 ml, 2 mmol)を無水ジクロロメタン 50 mlに溶解し、 0°Cでジァゾ酢酸ェチ
2
ル (ィ匕合物 2) (1.8 ml, 17.35 mmol)を滴下した後、室温で 70分間攪拌した。反応溶 液に飽和塩化アンモ-ゥム水溶液 20 mlを加え、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸 マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣を中圧分取クロマ トグラフィー（600 g、へキサン：酢酸ェチル = 1 : 3 )で精製して化合物 3(2.26 g,収 率: 47%)を無色液体として得た。
[0106] この化合物 3について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ 4.22
3
(2Η, q, J = 7.0, 14.2 Hz, CO CH ), 4.14 (2H, s, OCH CO), 3.75—3.62 (14H, m,
2 一 2 一 2
CH CH O X 3, HOCH CH ), 3.61 (2H, t, J = 4.4 Hz, HOCH ), 1.84 (1H, bs, OH 一 2 一 2 2 一 2 一 2 一
), 1.28 (3H, t, J = 7.3 Hz, CH CH )であった。また、上記化合物 3の ESI— MS ( positive)測定を行ったところ、 m/z 303.27〔(M+Na)+]であった。これによつて化合物 3 の構造を確認することができた。なお、この化合物 3の分子質量は C H 0 : 280. 1
12 24 7
5である。
[0107] (2)化合物 4の合成
上記のェチル体化合物 3(2.15 g, 7.66 mmol)と DMAP (41.7 mg, 337 mmol)を無 水ピリジン 8mlに溶解した。この溶液に 0°Cで P-トルエンスルホン酸クロリド（1.75 g, 9.19mmol)を無水ジクロロメタン 8 mlに溶解した溶液を滴下し、室温で 3時間攪拌し た。反応溶液にジクロロメタンと氷水を加えてジクロロメタンに抽出した。有機層を飽 和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で 1回ずつ洗浄し、無水硫酸マグネシ ゥムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣を中圧分取クロマトグラフ ィー（100 g、クロ口ホルム：アセトン = 4 : 1 )で精製して化合物 4(2.59 g,収率： 78%) を黄色液体として得た。
[0108] この化合物 4について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ 7.80
3
(2Η, d, J = 8.4 Hz, aromatic), 7.35 (2H, d, J = 8.4 Hz, aromatic), 4.21 (2H, q, CO
2
C一H ), 4.16 (2H, t, J = 4.8 Hz'TsOCH ), 4.14 (2H, s, OCH CO), 3.76—3.59 (14H, 2 一 2 一 2
m, CH CH O X 3, TsOCH CH ), 2.45 (3H, s, CH Ar), 1.28 (3H, t, J = 7.0 Hz, CH
― 2 一 2 2 一 2 一 3
CH )であった。また、上記化合物 4の ESI— MS (positive)測定を行ったところ、 m/z
2 ― 3
457.16[(M+Na)+]であった。これによつて化合物 4の構造を確認することができた。な お、この化合物 4の分子質量は C H 0 S :434. 16である。
19 30 9
[0109] (3)化合物 5の合成
上記のトシル体化合物 4(1.01 g, 2.31 mmol)とアジ化ナトリウム（1.53 g, 2.31 mmol) を無水ジメチルホルムアミド 50 mlに溶解し、遮光して 120°Cで窒素雰囲気下 10時 間攪拌した。反応溶液をクロ口ホルムで抽出し、水、飽和食塩水で有機層を 1回ずつ 洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残 渣を中圧分取クロマトグラフィー（10 g、クロ口ホルム：アセトン = 2 : 1 )で精製して 化合物 5(638 mg,収率: 90%)を黄色液体として得た。
[0110] この化合物 5について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ 4.22
3
(2Η, q, J = 7.3 Hz, CO CH ), 4.15 (2H, s, OCH CO Et), 3.75—3.63 (12H, m, OCH CH O), 3.69 (2H, m, N CH CH ), 3.39 (2H, t, J = 5.1 Hz, N CH ), 1.29 (3H, t, J = 一 2 3 2 ― 2 3 一 2
7.3 Hz, CO CH CH )であった。また、上記化合物 5の ESI— MS (positive)測定を行
2 2 一 3
つたところ、 m/z 328.14 [(M+Na)1であった。これによつて化合物 5の構造を確認する ことができた。なお、この化合物 5の分子質量は C H N O : 305. 16である。
12 23 3 6
[0111] (4)化合物 6の合成
上記のアジド体化合物 5(614 mg, 2.01 mmol)をメタノール 24 mlに溶解し、遮光下 0°Cで IN NaOH 4.3 mlを加えた後、室温で 21時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮 し、濃縮残渣にクロ口ホルムをカ卩えた後、 1 N HC1を pH = 2になるまで加え、クロロホ ルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で 1回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥 した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、化合物 6(549 mg,収率: 90%)を無色液体として 得た。
[0112] この化合物 6について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 S 6.19
3
(1H, bs, CO H), 4.16 (2H, s, OCH CO H), 3.75—3.64 (12H, m, OCH CH O), 3.68
2 一 2 2 一 2 ― 2
(2H, m, N CH CH ), 3.41 (2H, t, J = 5.1 Hz, N CH )であった。また、上記化合物 6
3 2 一 2 3 一 2
の ESI— MS (negative)測定を行ったところ、 m/z 328.14 [(M+Na)"]であった。これによ つて化合物 6の構造を確認することができた。なお、この化合物 6の分子質量は C H
10
N O : 277. 13である。
19 3 6
[0113] (5)化合物 7の合成
イミノニ酢酸 (10.0 g, 75.1 mmol)と BF - OEt (22 ml, 173 mmol)を無水メタノール
3 2
(50 ml)に溶解し、アルゴン雰囲気下にて 5時間還流した後、飽和炭酸水素ナトリウム 水溶液をカ卩えて中和し、クロ口ホルムで抽出した。 pHが 9になるまで水層にトリェチル アミンを加え、さらにクロ口ホルムで抽出し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて 乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、化合物 7(9.61 g,収率 : 79%)を黄色油 状物として得た。
[0114] この化合物 7について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ 3.74
3
(6Η, s, OMe), 3.48 (4H, s, CH N), 2.00 (1H, s, NH)であった。また、上記化合物 7の
2
ESI— MS (positive)測定を行ったところ、 m/z 162.1 [(M+H)"]であった。これによつて 、化合物 7の構造を確認することができた。なお、この化合物 7の分子質量は C H NO : 161. 07である。
2
[0115] (6)化合物 8の合成
上記化合物 6(0.35 g, 1.26 mmol)と EDC-HC1 (0.27 g, 1.39 mmol)と HOBt (0.19 g, 1.39 mmol)を無水ジクロロメタン 2 mlに溶解し、アルゴン雰囲気下、遮光して 0°C で 80分間攪拌した後、上記化合物 7(1.42 g, 6.83 mmol)を無水ジクロロメタン 1 mlに 溶解した溶液を加えて、室温で 17時間攪拌した。反応容液をクロ口ホルムで抽出し、 有機層を 10%クェン酸と、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とで 1回ずつ洗浄した。乾 燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を 行った。濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（50 g、クロ口ホルム：アセトン = 10： 1)で精製して、化合物 8(0.42 g,収率: 80%)を白色固体として得た。
[0116] この化合物 8について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ 4.23,
3
4.11 (4Η, s, s, CONCH ), 4.18 (2H, s, OCH CON), 3.69, 3.66 (4H, s, s, CO CH ),
一 2 ― 2 2 一 3
3.69-3.56 (12H, m, OCH CH O), 3.61 (2H, t, J = 5.1 Hz , N CH CH ), 3.32 (3H,
一 2 一 2 3 2 一 2
t, J = 5.0 Hz, N CH )であった。また、上記化合物 8の ESI— MS (positive)測定を行
3 ー2
つたところ、 m/z 443.17 [(M+Na)"]であった。これによつて化合物 8の構造を確認する ことができた。なお、この化合物 8の分子質量は C H N O :420. 19である。
16 28 4 9
[0117] (7)化合物 9の合成
上記化合物 8(398 mg, 947 μ mol)をメタノール (5 ml)に溶解し、 2 Nの NaOH (2.1 ml)をカ卩えて、 0°Cで 2. 5時間攪拌した後、 Dowex 50WX- 8 (H+form )を pH = 2にな るまでカ卩えて中和し、 Dowex 50WX-8を濾別して減圧濃縮を行った。減圧濃縮によ つて得られた濃縮残渣に水を加えて不溶物を濾別した後、減圧濃縮及び凍結乾燥 を行って、化合物 9(346 mg,収率: 93%)を白色固体として得た。
[0118] この化合物 9について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ 5.66
3
(2Η, bs, CO H x 2), 4.26 (2H, s, OCH CON), 4.24, 4.18 (4H, s, s, CONCH ),
2一 ― 2 一 2
3.71-3.63 (12H, m, OCH CH O), 3.67 (2H, m, J = 5.1 Hz, N CH CH ), 3.40 (3H, t,
一 2 一 2 3 2 ― 2
J = 4.9 Hz, N CH )であった。また、上記化合物 9の ESI— MS (negative)測定を行つ
3 一 2
たところ、 m/z 391.15 [(M- H)— ]であった。これによつて化合物 9の構造を確認すること ができた。なお、この化合物 9の分子質量は C H N O : 392. 15である。 [0119] (8)化合物 10の合成
N-Bocァミノ安息香酸誘導体 (3.33 g, 14.0 mmol)と、 HOBt (1.93 g, 14.3 mmol)と を無水ジクロロメタン (60 ml)に懸濁させ、アルゴン雰囲気下、 0°Cで 15分撹拌し、 EDC -HC1 (2.87 g, 15.0 mmol)を無水ジクロロメタン (30 ml)に溶解させた溶液をカロ えて、 50分撹拌した。この溶液にジエチレントリァミン (0.79 ml, 7.00 mmol)を加え、遮 光下、室温で終夜撹拌し、白色結晶を得た。この白色結晶を濾取した後、メタノール 力も再結晶して、化合物 10(3.53 g,収率: 92.9%)を白色結晶として得た。
[0120] この化合物 10について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ
3
7.77-7.74 (4Η, d, J = 8.67 Hz, aromatic), 7.50-7.48(4H, d, J =8.57 Hz, aromatic), 3.70-3.66 (4H, m, J = 5.19 Hz CONHCH ), 3.34—3.28 (4H, m, J = 5.61 Hz CH CH
■2 2
ONH), 1.53 (18H, s, CH )であった。また、上記化合物 10の ESI— MS (positive)測
2 一 3
定を行ったところ、 m/z 542.4 [(M+H)+]であった。これによつて化合物 10の構造を確 認することができた。なお、この化合物 10の分子質量は C H N O : 541. 29である
28 39 5 6
[0121] (9)化合物 11の合成
上記化合物 9(333 mg, 847 μ mol)とジイソプロピルェチルァミン（435 ml, 2.54 mmol),と FDPP (1.00 g, 2.60 mmol)とを無水ジメチルホルムアミド（5 ml)に溶解して 遮光してアルゴン雰囲気下 0°Cで 30分間攪拌した後、上記化合物 10(1.15 g, 2.11 mmol)を無水ジメチルホルムアミド（11 ml)に溶解してカ卩え、室温で 20時間攪拌した 。この反応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をクロ口ホルムで抽出し、水、有機 層を 10%クェン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で 1回ずつ洗浄して、乾燥剤とし て無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行つ た。減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（80 g,クロ 口ホルム：メタノール = 10： 1)で精製して、化合物 11(125 mg,収率： 59%)を白色固 体として得た。
[0122] この化合物 11について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ
3
8.18 (1H, bs, NHCOPh), 7.86 (2H, d, J = 8.4 Hz, aromatic), 7.80 (1H, bs, PhNH CO), 7.75-7.68 (8H, m, NHCOPh, aromatic, PhNHCO), 7.54 (1H, bs, PhNHCO), 7.48 (2H, d, J = 8.4 Hz, NHCOPh, aromatic), 7.42 (5H, m, aromatic, NHCOPh), 7.34 (2H, d, J = 8.8 Hz, aromatic), 7.28 (1H, bs, PhNHCO), 3.84 (4H, bs, CONCH
― 一 2
), 3.62-3.48 (20H, m, OCH CH O, NCH CH NH), 3.56 (2H, t, J = 5.1 Hz, N CH C
一 2 一 2 2 一 2 3 2
H ), 3.43 (2H, bs, OCH CON), 3.35—3.30 (4H, m, NCH CH NH), 3.26 (2H, t, J = 一 2 一 2 一 2 2
5.1 Hz, N CH ), 3.13, 2.98 (4H, bs, bs, NCH CH NH), 1.52, 1.50, 1.49 (36H, s, s,
3 一 2 一 2 2
s, t-butyl)であった。また、上記化合物 11の ESI— MS (positive)測定を行ったところ 、 m/z 1461.72 [(M+Na)"]であった。これによつて化合物 11の構造を確認することがで きた。なお、この化合物 11の分子質量は C H N 0 : 1438. 71である。
70 98 14 19
[0123] (10)化合物 12の合成
上記化合物 11(165 mg, 114 μ mol)をメタノール (12 ml)に溶解し、 5% Pd/C (55 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で 5時間攪拌した後、上記 Pd/Cを濾去して減圧濃 縮し、得られた濃縮残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィ（10 g,クロ口ホルム:メタノ ール = 7： 1)で精製して、化合物 12(128 mg,収率: 79%)を白色固体として得た。
[0124] この化合物 12について、 — NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ
3
7.78-7.68 (8Η, m, aromatic), 7.48 (8H, m, aromatic), 4.21, 4.10 (4H, bs, bs, CONC H ), 3.85 (2H, bs, OCH CON), 3.62—3.44 (26H, m, OCH CH O, NCH CH NH, NC 一 2 一 2 一 2 一 2 2 一 2
H CH NH), 3.50 (2H, t, J = 5.1 Hz, H NCH CH ), 2.76 (2H, t, J = 5.1 Hz, H NCH 一 2 2 2 2 一 2 2 一 2
CH ), 1.50 (36H, s, t-butyl)であった。また、上記化合物 12の ESI— MS (positive)測
2
定を行ったところ、 m/z 1413.74 [(M+H)"]であった。なお、この化合物 12の分子質量 は C H N O : 1412. 72である。
70 100 12 19
[0125] この化合物 12は、前記一般式（11)にて n力 であり、 p1, p2が 1であり、 m1, m2, m3 , m4が 2である構造を有するアミンィ匕合物である。
[0126] (11)化合物 14の合成
上記化合物 13 (チォタト酸）（3.4 mg, 16.6 imol)と HOBt (1.6 mg, 16.6 μ mol) EDC •HC1 (3.2 mg, 1.66 mol)とを無水ジメチルホルムアミド（2 ml)に溶解し、アルゴン 雰囲気下、 0°Cで遮光して攪拌した。次いで、上記化合物 12(23.5 mg, 16.6 ^ mol) を無水ジメチルホルムアミド（2 ml)に溶解して加え、室温で 22時間攪拌した。この反 応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をジクロロメタンで抽出し、有機層を 10%ク ェン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で 1回ずつ洗浄した。乾燥剤として無水硫酸 ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。濃縮残渣を 分取シリカゲルクロマトグラフィ（7 g、クロ口ホルム：メタノール = 10： 1)で精製して、 化合物 14(15.7 mg,収率： 59%)を白色固体として得た。
[0127] この化合物 14について1 H— NMR (400MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ
3
8.20, 8.00 (4Η, bs, bs, NHCOPh), 7.86 (2H, d, J = 8.8 Hz, aromatic), 7.77-7.72 (7H, m, COPhNH, aromatic), 7.53 (1H, bs, NHCOPh), 7.50-7.36 (10H, m, aromatic, J = 8.8 Hz, COPhNH), 7.27 (2H, bs, COPhNH, CONHCH ), 3.89 (4H,
2
bs, CONCH CO), 3.64-3.37 (26H, m, NCH CH NH, NCH CH NH, OCH CH O,
一 2 2 一 2 一 2 2 一 2 一 2
CONHCH , CONHCH CH ), 3.53 (1H, m, SSCH), 3.48 (2H, m, NCH CH NH),
2 2 2 2 2
3.32 (4H, m, OCH CON, NCH CH NH), 3.18, 2.85 (4H, bs, bs, NCH CH NH),
2 2 2 '2 2
3.17-3.04 (2H, m, C一H SSCH), 2.44-2.36 (1H, m, C一H CH SS), 2.16 (2H, m, CH CH
2 2 2 2
CH CONH), 1.89-1.81 (1H, m, C一H CH SS), 1.69-1.56 (4H, m, CH CH CH
2 ― 2 2 2 2 一 2 2
CONH, C一H CH CH CH CONH), 1.51, 1.50 (36H, s, s, t— butyl), 1.42—1.34 (2H, m,
2 2 2 2
C一H CH CH CONH)であった。また、上記化合物 14の ESI— MS (positive)測定を行 2 2 2
つたところ、 m/zl601.81〔(M+H)+]であった。これによつて化合物 14の構造を確認する ことができた。なお、この化合物 14の分子質量は C H N 0 S : 1600. 76である。
78 112 12 20 2
[0128] (12)リンカ一化合物 (化合物 15)の合成
上記化合物 14(60.3 mg, 31.2 μ mol)をジクロロメタン (1 ml)に溶解し、 TFA (3 ml) を加えて遮光下 0°Cで 1時間攪拌した後、減圧濃縮を行い、得られた残渣をメタノー ルに溶解して Dowex Marathon A (OH— form)を充填したカラム（1.0 cm Φ X 3.0 cm) に注入してイオン交換を行った。溶出液を減圧濃縮し、化合物 15(41.2 mg,収率： 91%)を白色固体として得た。
[0129] この化合物 15について、 — NMR (400MHz, DMSO— d )測定を行ったところ、
3
δ 8.19, 8.05 (4Η, m, m, NHCOPh), 7.82 (1H, bt, CONHCH ), 7.53 (8H, m,
一 一 2
aromatic), 6.51 (8H, dd, J = 8.4, 1.5 Hz, aromatic), 5.61—5.55 (8H, m, NH ), 4.24,
一 2
4.11 (4H, s, s, CONCH CO), 3.93 (2H, bs, OCH CON), 3.60—3.37 (31H, m, NCH
一 2 ― 2 2
CH NH, NCH CH NH, OCH CH O, CONHCH , CONHCH CH , SSCH), 3.19-3.06 (4H, m, CONHCH CH , CH SSCH), 2.42-2.32 (1H, m, CH CH SS), 2.04 (2H, m,
一 2 2 一 2 一 2 2
CH CH CH CONH), 1.87-1.78 (1H, m, CH CH SS), 1.64-1.45 (4H, m, CH CH CH
2 2 一 2 一 2 2 2 一 2
CONH, CH CH CH CH CONH), 1.34-1.28 (2H, m, CH CH CH CONH)であった。
2 一 2 2 2 2 一 2 2 2
また、上記化合物 15の ESI— MS (positive)測定を行ったところ、 m/z 623.27 〔(M+2Na)2+]であった。なお、この化合物 15の分子質量は C H N 0 S : 1200. 55
58 80 12 12 2
である。
[0130] この化合物 15は、前記一般式（2)にて nが 4であり、 Xが前記一般式（3)にて表され 、 p1, p2が 1であり、 m1, m2, m3, m4が 2である構造を有するリンカ一化合物である。
[0131] 〔実施例 2 :リガンド複合体 (ィ匕合物 17)の合成〕
実施例 1で得られたリンカ一化合物 15を用いて、前記一般式（5)にて、 nが 4であり 、 p1, p2が 1であり、 m1, m2, m3, m4が 2であり、 R'が水素（H)であり、 Rが前記一般 式（12)で表されるオリゴ糖由来の構造を有するリガンド複合体を以下の手順で合成 した。図 2には、この合成の化学反応式を示す。
[0132] 図 2に示すように、実施例 1にて得られたリンカ一化合物 15と、前記一般式（12)に て表される糖分子である化合物 16 (7当量）とを用いて還元アミノ化反応を行った。こ れによって、本発明のリガンド複合体の一例である化合物 17を収率 22%で得た。
[0133] 具体的には、上記リンカ一化合物 15(2.0 mg, 1.67 μ mol)と化合物 16(10 mg, 11.7 mmol)とを、水 100 mlとジメチルァセトアミド 400 mlと酢酸 10 mlとの混合溶媒に溶 解し、遮光下、封管中 37°Cで 25時間加熱した。 NaBH CN (3.51 mg, 50.2 mmol)を
3
酢酸 15 mlに溶解して反応溶液に加え、 37°Cで 6日間加熱した後、減圧濃縮して、 Sephadex G- 50 (1.6 cm Φ X 80 cm、 PBSに 0.3 Mの NaClをカ卩えた溶液）を用いて 精製した。精製によって得られた目的画分を減圧濃縮し、濃縮残渣を S印 hadex G-25 (1.6 cm Φ X 40 cm、水）を用いて脱塩した。脱塩により得られた目的画分を 減圧濃縮し、水に溶力して凍結乾燥を行い、化合物 17(1.7 mg,収率 : 22%)を白色粉 体として得た。
[0134] この化合物 17について、実施例 1に記載の方法で1 H— NMR (400MHz, D O)測
2 定を行ったところ、 δ 7.65-7.58(8H, m, aromatic), 6.78-6.67 (8H, m, aromatic), 5.37 (4H, bs, H-l"), 5.13 (4H, bs, J = 2.5 Hz), 4.52 (4H, bs, H- 5，）, 4.29 (10H, m, H-6a", H- 3，， CONCH CO), 4.19 (10H, m, H- 6b，，， H- 2，， CONCH CO), 4.05 (3H,
一 2 ― 2
m, Η-4'), 3.99-3.92 (14H, m, H- 2, H- 6a, H- 5", OCH CON), 3.87 (8H, m, H- 5,
一 2
NCH CH NH), 3.83 (8H, m, H— 3, NCH CH NH), 3.77-3.70 (8H, m, H— 4, NCH CH
2 一 2 2 一 2 2 一 2
NH), 3.71 (4H, t, J = 9.9 Hz, H— 3"), 3.64—3.50 (25H, m, H— 6b, NCH CH NH, OC
一 2 2
H CH O, CONHCH , CONHCH CH , SSCH), 3.54 (3H, s, OCH ), 3.45—3.19 (14H, 一 2 一 2 一 2 2 一 2 一 3
m, H-la, H-lb, NCH CH NH, CH SS), 3.34 (4H, t, J = 9.6 Hz, H- 4"), 3.24 (4H,
― 2 2 ― 2
dd, J = 3.4, 10.5 Hz, H— 2"), 2.35—2.28 (1H, m, CH CH SS), 2.27 (2H, bt, CH CH
一 2 2 2 一 2
CONHCH ), 1.89-1.84 (1H, m, CH CH SS), 1.56-1.46 (2H, m, CH CH CONH),
2 ― 2 2 ― 2 2
1.35-1.14 (2H, m, CH CH (CH ) CONH)であった。また、上記化合物 17の ESI— M
一 2 2 2 2
S (negative)測定を行ったところ、 m/z 1449.93 [(M- 10Na+7H)3"]であった。これによつ て化合物 17の構造を確認することができた。なお、この化合物 17の分子質量は C
134
H N Na 0 S :4572. 48である。
196 16 16 108 14
[0135] この化合物 17が、前記一般式（5)にて、 nが 4であり、 p1, p2が 1であり、 m1, m2, m3 , m4が 2であり、 R'が水素 (H)であり、 Rが一般式 (6—3)で表されるオリゴ糖由来化 合物である構造を有するリガンド複合体である。
[0136] 〔実施例 3：リガンドである糖鎖とタンパク質との相互作用の検証〕
本実施例では、実施例 2において得られた、前記一般式（5)にて、 nが 4であり、 p1 , p2が 1であり、 m1, m2, m3, m4が 2であり、 R'が水素（H)であり、 Rが一般式（6—3) で表されるオリゴ糖由来化合物である構造を有するリガンド複合体 (以下、このリガン ド複合体にっ 、ては、「Tetra-GlcNS6S-IdoA2S- Glc」と記載する）を用いて、タンパク 質との分子間相互作用につ 、て検証した。
[0137] 本実施例においては、比較のために本願発明者らが以前に見出した他の 2種類の リガンド複合体にっ 、ても同様の実験を行 ヽ、その相互作用につ ヽて比較検討した 。上記他の 2種類のリガンド複合体とは、具体的には、上記特許文献 1に記載のリガ ンド複合体であって、以下の一般式（13)で表されるリガンド複合体である。以下、こ のリガンド複合体については、「Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glc」と記載する。 [0138] [化 24]
Figure imgf000038_0001
••••(13)
[0139] また、他のリガンド複合体のもう一つは、特開 2004— 157108に記載のリガンド複合 体であって、以下の一般式（14)で表されるリガンド複合体である。以下、このリガンド 複合体については、「Tri- GlcNS6S-IdoA2S-Glc」と記載する。なお、上記特開 2004 -157108は、本願の優先日の時点で未公開である。
[0140] [化 25]
Figure imgf000038_0002
••••(14)
[0141] 〔実施例 3— 1：特異的相互作用の確認〕
先ず、実施例 3—1として、前記一般式 (8)にて表される二糖構造 (GlcNS6S-IdoA2S )を固定ィ匕したチップと、へノ^ン結合性タンパク質との特異的相互作用を確認する ため、阻害実験を行った。すなわち、へノ リン結合性タンパク質と GlcNS6S-IdoA2S構 造との結合を阻害するインヒビターを共存させて、へノ^ン結合性タンパク質のチップ への結合が阻害されるかどうかについて検討した。
[0142] 本実験では、インヒビターとしてへパリン (豚小腸由来、 Mw= 17600)を、へパリン結 合性タンパク質として bFGFを用いた。 bFGFは、 FGF-2とも呼ばれ、血管内皮細胞や 線維芽細胞に働いて、血管新生作用、肉芽形成促進作用を発揮することにより創傷 治癒を促進することが知られている。生体内では、細胞表面上にあるへパリン類似物 質であるへパラン硫酸と相互作用し、生物活性を発現させている。 bFGFとの結合に 必要な最小結合単位は、以下の一般式（15)にて表される 5糖であるということが報 告されている（参考文献： M. Maccarana, B. Casu & U. Lindahl, J. Biol. Chem. 268卷 、 8857頁、 1993年）。
[0143] [化 26]
Figure imgf000039_0001
••••(15)
[0144] 上記の構造には、ダルコサミンの 6位が硫酸ィ匕されて 、る構造が含まれて 、な!/、。
し力し、へパラン硫酸中の IdoA2S-GlcNS構造と bFGFとの会合において、不特定多 数の 6位硫酸ィ匕は必要な 、もの、活性部位の形成には必要であることが確認されて いる。そのため、 bFGFを、 GlcNS6S-IdoA2S構造との相互作用を観測するためのタン ノ ク質として選択した。
[0145] 次に、上述の Mono- GlcNS6S-IdoA2S-Glc、 Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glc、
Tetra- GlcNS6S-IdoA2S-Glcをそれぞれ固定化したチップを用いて、へパリン共存下 bFGFとの結合阻害実験を行った。すなわち、 200nMの bFGF溶液にへノ リンを、 3, 10, 100, 300, ΙΟΟΟηΜと濃度を変えて混合し、チップへ注入した。
[0146] 図 3には、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップへの bFGFの結合挙動 を示す。この図から、 Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップへの bFGFの結 合は、へノ^ンの濃度依存的に低下することが確認された。すなわち、
Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップへの bFGFの結合は、へパリンによつ て阻害されることが確認された。
[0147] 上記実験によって得られた 3種類のチップそれぞれのデータから、各チップにおけ る bFGFの結合の阻害率を算出した。その結果を図 4に示す。なお、上記阻害率は、 異なった濃度のへパリン共存下での最大角度変化量を、へパリンを共存させない場 合の最大角度変化量で割った値の百分率で示したものである。
[0148] 図 4に示すグラフから、 bFGFのチップへの結合阻害率が 50%の所を IC として定
50 義した。その結果、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップでは IC = 2. 5
50 nM、 Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップでは IC = 94nM
50 、
Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップでは IC = 71nMとなり、
50
Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップの IC 値は、他の 2種類のチップの
50
値と比較して、 1オーダー低ぐへノ^ンによる阻害効果を強く受けていることが確認 された。何れのチップにおいても阻害率がへパリンの濃度依存的に変化していること から、これらのチップはへノ リン結合性タンパク質である bFGFを特異的に認識してい ると結！^できる。
[0149] 〔実施例 3— 2：チップ表面の糖鎖の相対密度の検討〕
先ず、 Tri- GlcNS6S-IdoA2S- Glcあるいは Tetra- GlcNS6S-IdoA2S- Glcと、糖鎖を有 していない分子が結合したリンカ一化合物 (非糖鎖 リンカ一結合ィ匕合物、以下、 Mono-Glcと呼ぶ）とを溶液中で混合してチップへの固定ィ匕を行い、その混合比（仕 込み比）によるチップ上のリガンドである硫酸ィ匕ニ糖の密度変化にっ 、て、
ATR- FT- IR法を用いて検討した。溶液中の Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcある!/、は Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの割合は、 0, 25, 50, 75, 100%と変化させた。その 結果を図 5 (a)、（b)に示す。図 5 (a)が、溶液中の混合比を変えた
Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの全反射スペクトルであり、図 5 (b)が、溶液中の混合比を 変えた Tetra- GlcNS6S-IdoA2S- Glcの全反射スペクトルである。
[0150] 波数 (wavenumber) 1200—1303cm— 1の範囲に硫酸基由来の S = 0伸縮振動が観 測されたため、この領域の吸光度曲線を用いて多変量解析法により硫酸基の定量を 行 、、溶液中のリガンド複合体の混合比に対するチップ上の硫酸基の相対強度をプ ロットした。その結果を図 6 (a)、 (b)に示す。図 6 (a)力 溶液中の
Tri-GlcNS6S-IdoA2S-Glcの混合比に対するチップ上の硫酸基の相対強度を示すグ ラフであり、図 6 (b)が、溶液中の Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glcの混合比に対するチッ プ上の硫酸基の相対強度を示すグラフである。図 6 (a)、（b)に示す一次曲線の相関 係数は、それぞれ 0.9993、 0.9610であることから、リガンドである硫酸ィ匕ニ糖のチップ への固定ィ匕率 (チップ表面の糖鎖の密度）は何れも溶液中のリガンド複合体の存在 比に比例することが示された。
[0151] 〔実施例 3—3：糖鎖の相対密度が、 h-vWFとの相互作用に与える影響の検討〕 続いて、チップ表面のリガンドである硫酸ィ匕ニ糖の相対密度が、タンパク質との相 互作用に与える影響について検討した。ここでは、ヒト血漿由来 vWF (以下、 h-vWFと 呼ぶ）との相互作用につ 、て解析を行った。
[0152] 上記 3種の各リガンド複合体（Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glc、
Tri— GlcNS6S— IdoA2S— Glcゝ Tetra— GlcNS6S— IdoA2S— Glc)と Mono— Glcとの混合比を、 それぞれ 100/0、および、 20/80に変えて、 6種のチップを作成し、 h-vWFとの相互作 用を SPR法で観測した。ここで、 SPR法による測定の手順について説明する。
[0153] 測定には、 SPR670 (日本レーザー電子株式会社製)を用いた。また、センサチッ プには、 13 X 20 X 0. 7mmのガラス基盤に接着層として 2nmのクロムを蒸着し、さら にその上に 50nmの金薄膜を蒸着したもの（日本レーザー電子株式会社製)を用い、 UVオゾンクリーナー（日本レーザー電子株式会社製 NL-UV253)に入れて紫外線 を 30分間照射し、オゾンでチップ表面を洗浄した。
[0154] 次に、センサチップを専用の PTFEセル（日本レーザー電子株式会社製）に装着し た後、上記 6種の各チップをメタノール Z水 = 1Z1の混合溶液 (但し、
Mono- GlcNS6S- IdoA2S- GlcZMono- Glc混合の場合はメタノール溶液）に溶解し（0 . ImM)、この溶液を 50 μ 1取って PTFEセルに入れ、パラフィルムで密封した。この チップを装着した PTFEセルを、室温で Bio Dancer (New Brunswick Scientific社製） 上で終夜緩やかに振とうした。
[0155] このチップをメタノールで 6回洗浄し、水で 1回洗浄した後、もう一度メタノール、水 の順で 1回ずつ洗浄した。風乾後、 SPR670のセンサーチップカートリッジに取り付 けた。ランニングバッファーでチップ表面を十分平衡ィ匕した後、レーザー光を金膜に 照射し、その時観測される表面プラズモン共鳴角度変化を観察した。ランニングバッ ファーは、 pH7. 4の等張リン酸緩衝溶液 (PBS)を用いた。また、 SPR測定はすべて 25°Cの温度で行った。 bFGFは、 STRATHMANN BIOTEC AG社製（Recombiant Human FGF- basic, MW; 17000, Lot No.; 471120)のものを用い、 h- vWFは、 CALBIOCHEM社製（von Willebrand Factor, Human Plasma, MW; 270000 ( Monomer Unit換算）， Lot No.; B41632)を使用した。
[0156] この SPR測定を行う際に、 h- vWFの濃度を 10, 20, 40, 80, 160nMと変えながら、 各チップ上に注入すると、結合相互作用が観測され、 h-vWFがチップ上に固定ィ匕さ れている様子が観察された。この際、リガンドである硫酸ィ匕ニ糖を変性させずに h-vWFをチップ力も完全に解離させる解離剤が見つ力もな力つたため、解離定数 (K )の算出はチップ上の h-vWFの結合量から求めた。 h-vWFの結合量は、リガンド複
D
合体が固定ィ匕された状態をベースとし、濃度を変えて注入した h-vWFのセンサーグ ラムのカーブがほぼ一定になったところの差を用いた。
[0157] 図 7 (a)—（c)には、上記 3種の各リガンド複合体（Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glc、
Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glc、 Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glc)と Mono- Glcとの混合比が 1 OOZOの場合の結合相互作用を示す。（a)は Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合、（ b)は Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合、（c)は Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合で ある。また、図 8 (a)—（c)には、上記 3種の各リガンド複合体（
Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glc、 Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcゝ
Tetra- GlcNS6S-IdoA2S- Glc)と Mono- Glcとの混合比が 20Z80の場合の結合相互 作用を示す。（a)は Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合、（b)は
Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合、（c)は Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合である。
[0158] この結果力も得られた結合量を、 h-vWFの濃度ごとにプロットしたものを図 9 (a)一 ( c)に示す。 (a)は Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合、（b)は
Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合、（c)は Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcの場合である。 この図 9には、各グラフのカーブ力も解離定数 (K )を算出した結果も示している。
D
[0159] 図 9 (a)に示すように、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- GlcZMono- Glc=100/0、および、
Mono- GlcNS6S- IdoA2S- GlcZMono- Glc=20/80としてリガンドである硫酸化二糖を固 定ィ匕したチップを用いた場合には、解離定数はそれぞれ K =35nMおよび 41nMと
D
なった。図 9 (b)〖こ示すように、 Tri- GlcNS6S-IdoA2S- Glc/Mono- Glc=100/0、および 、 Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glc/Mono- Glc=20/80としてリガンドである硫酸化二糖を固 定ィ匕したチップを用いた場合には、解離定数はそれぞれ K = 27nMおよび 24nMと なった。さらに、 Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcto/Mono- Glc=100/0、および、
Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcto/Mono- Glc=20/80としてリガンドである硫酸化二糖を 固定ィ匕したチップを用いた場合には、解離定数はそれぞれ K = 32nMおよび 35η
D
Μとなった。
[0160] これらの結果から、アナライトとして h-vWFを用いた場合、リガンドである糖鎖のチッ プ上の存在比を変化させても親和性に与える影響は殆ど無 、ことがわかった。また、 糖鎖間距離が異なるリガンド複合体を固定ィ匕したチップを用いても、 h-vWFとの相互 作用にお 、て糖鎖間距離の差が解離定数の値に影響を与えな力つた。これは h-vWFが多量体構造をとつて 、るために複数のへノ リン結合性ドメインが存在し、そ の影響により解離速度が著しく遅くなり、糖鎖間距離の差が解離定数に反映されな かったものと考えられた。
[0161] 〔実施例 3-4 :糖鎖の相対密度が、タンパク質との相互作用に与える影響の検討〕 そこで、 1つのへノ リン結合性ドメインを有する A1/レープ部分のみを有する大腸菌 由来のリコンビナントヒト vWF部分タンパク質（以下、 rhvWF-Alと呼ぶ）を用いれば、 チップ上にクラスター化した糖鎖とタンパク質間の相互作用において、糖鎖間距離の 差が糖鎖 糖鎖結合性タンパク質間の相互作用に与える影響を検討できると考えて 、以下のような実験を行った。 rhvWF-Alは文献（M. A. Cruz, R. I. Handin & R. J. Wise, J. Biol. Chem. 268卷， 21238頁， 1993年）に従って調製した。
[0162] ここでは、リガンド複合体として上述の上記 3種の各リガンド複合体（
Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glc、 Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcゝ
Tetra- GlcNS6S-IdoA2S- Glc)、および、 Mono- Glcを用いて、上記 3種の各リガンド複 合体 ZMono-Glcの存在比を、それぞれ 100/0, 50/50と変えて作成したチップを用い た。 rhvWF-Al濃度を変化させてチップとの結合相互作用を測定した結果を図 10— 図 12に示す。なお、図 10 (a)は、 Mono-GlcNS6S-IdoA2S-Glc/Mono-Glc = 100/0 でチップを作成した場合であり、図 10 (b)は、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- GlcZ
Mono- Glc =50/50の場合である。また、図 11 (a)は、 Tri- GlcNS6S-IdoA2S- GlcZ Mono-Glc= 100/0でチップを作成した場合であり、図 11 (b)は、
Tri-GlcNS6S-IdoA2S-GlcZMono-Glc=50/50の場合でぁる。また、図 12 (a)は、 Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- GlcZMono- Glc= 100/0でチップを作成した場合であり、図 12 (b)は、 Tetra- GlcNS6S-IdoA2S-Glc/Mono-Glc = 50/50の場合である。
[0163] これらの結果から算出した解離定数、結合定数、結合速度定数、解離速度定数を 表 1にまとめて示す。なお、表 1において、解離定数: K & 710、結合定数:1^ (k
D d a A a
Zk )、結合速度定数: k、解離速度定数: kである。
d a d
[0164] [表 1]
Figure imgf000044_0001
[0165] 表 1に示すように、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップの場合は、
Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcや Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップと比べ て、解離定数の値は大きくなつた (K = 2. 60 M)。また、チップ上の糖鎖の固定
D
ィ匕密度を相対的に小さくすると解離定数の値はさらに大きくなつた (K = 3. 79 /z M
D
)。一方、 Tri- GlcNS6S-IdoA2S-Glcを固定化したチップでは、チップ上の固定化密度 を相対的に小さくした場合、若干の解離定数の値の増加が見られた (K = 1. 20 μ
D
M→l . Μ)。また、 Tetra- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップでは、チッ プ上の固定化密度を変化させても、解離定数はほとんど変わらな力つた (K = 0. 99
D
Μ→1. 00 ^ Μ) ο
[0166] また、表 1に示すように、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップの場合は 、他の 2つのリガンド複合体と固定したチップと比べて、 1オーダー高い解離速度定 数（k )を有することが確認された。このことから、 Tri- GlcNS6S-IdoA2S-Glcおよび d
Tetra-GlcNS6S-IdoA2S-Glcは、分子内で硫酸ィ匕オリゴ糖鎖間距離が制御された糖 鎖クラスター構造を有しているため、チップ上の糖鎖の固定化密度を相対的に低下 させてもその影響を受けにくいもとの考えられる。 [0167] つまり、 rhvWF- Alとの相互作用においては、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定 ィ匕したチップでは、チップ上の相対的な糖鎖固定化密度を低下させると、結合力が 低下してしまうことが確認された。これに対し、 Tri- GlcNS6S-IdoA2S-Glcや
Tetra- GlcNS6S-IdoA2S- Glcを固定化したチップでは、チップ上の相対的な糖鎖固 定化密度を低下させても、その結合力はあまり変化しないことがわ力つた。
[0168] 以上の結果から、硫酸ィ匕オリゴ糖鎖-糖鎖結合タンパク質間の相互作用にお 、て、 結合力を増大させるには、 Mono- GlcNS6S- IdoA2S- Glcを固定化したチップのように、 同じリガンド複合体構造を有する硫酸ィ匕オリゴ糖鎖をチップ上に 2次元的にクラスタ 一化させるだけでは不十分であり、 Tri- GlcNS6S- IdoA2S- Glcや
Tetra- GlcNS6S-IdoA2S- Glcのように、分子レベルで糖鎖間距離が制御されたクラス ター構造が必要であることが裏付けられた。
[0169] 〔実施例 4：リンカ一化合物 (化合物 26)およびリガンド複合体 (化合物 27)の合成〕 本発明にかかるリンカ一化合物の一つ、すなわち、前記一般式（1)にて、 aが 1、 b が 4、 dが 1、 eが 4であり、 Xが前記一般式 (4)にて表され、 q1, q2, q3が 2であり、
Figure imgf000045_0001
r2 , r3, t1, t2, t3, u1, u2, u3が 0である構造を有するリンカ一化合物 (ィ匕合物 26)、およ び前記一般式（7)にて表され、 aが 1、 b力 、 dが 1、 eが 4であり、 q1, q2, q3が 2であり 、 r1, r2, r3, t1, t2, t3, u1, u , u3が 0であり、 R，が水素（H)であり、 Rが一般式（6— 2 )である構造を有するリガンド複合体 (化合物 27)は以下の手順で合成した。図 13〖こ は、このリンカ一化合物 (ィ匕合物 26)を合成する過程を示す。また、図 14にはこのリン カー化合物 (化合物 26)からリガンド複合体 (化合物 27)を合成する過程を示す。な お、本実施例 4の説明において、各化合物に付記している番号は図 13および図 14 に記載の番号に相当する。
[0170] 〔測定方法、試薬等〕
ェ!! NMRスペクトルの測定には、 JOEL- Delta600 Spectrometerを用いた。化学シ フトは、 CDC1 の場合はテトラメチルシラン (0.00 ppm)を基準物質にして δ値で表し
3
た。 D 0の場合は DHO (4.65ppm)を基準物質にして δ値で表した。質量分析は
2
PerSeptive Biosystem Mariner Biospectrometry Workstationを用！/ヽて酒 J定し 7こ。中 圧シリカゲルカラムクロマトグラフィは、 Silicagel 60 (Merck, 0.040-0.063 mm)を用い て行った。薄層クロマトグラフィーは Precoated Silicagel 60 F254 (Merck, 0.5 mm)を 使用した。全ての試薬、脱水溶媒は関東ィ匕学株式会社製のものを購入して使用した
[0171] (1) N -TEG-Trivalent-CO'BU) (化合物 20)の合成（図 13参照）
3 3
0 N-Trivalent-CO'Bu) (ィ匕合物 18) (757 mg, 1.70 mmol)と塩化ニッケル 6水物（
2 3
NiCl ·6Η Ο) (80.8 mg, 0.340 mmol)をメタノール（20 ml)に溶解し、水素化ホウ素ナト
2 2
リウム (322 mg, 8.50 mmol)を 5回に分けて当量分ずつ加え、室温で 30分間攪拌した。 メタノールを濃縮除去した後、水とクロ口ホルムとを加えた。セライト濾過後、濾液をク ロロホルムで 3回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、乾燥 剤を濾去して減圧濃縮した。得られた濃縮残渣 (化合物 19)と N - TEG-COOH (ィ匕合
3
物 6) (441 mg, 1.70 mmol)を無水ジメチルホルムアミド（10 ml)に溶解し、室温、ァルゴ ン雰囲気下で DIEA(592 μ \, 3.40 mmol)、 HOAt (463 mg, 3.40 mmol)、 EDC 'HCl ( 652 mg, 3.40 mmol)を順に加え、 16時間攪拌した。反応液に水を加えた後、水相を 酢酸ェチルで 3回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム を用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣を シリカゲルカラムクロマトグラフィ— (50g、クロ口ホルム：アセトン = 50 : 1)で精製し、 N
3
-TEG-Trivalent-Co'Bu) (ィ匕合物 20)を無色の油状物として得た。収量は 839 mg(73
3
%)であった。
[0172] この化合物 20につ!/、て1 H- NMR ^ベクトル（600 MHz, CDC1 )測定を行ったところ、
3
δ 3.90 (s, 2H,— OCH CONH— ), 3.70-3.67 (m, 14H,— OCH CH O— X 3, N CH CH
2 2 2 3 2 2
0-), 3.39 (t, 2H, J = 4.8 Hz, N CH CH O— ), 2.21-2.18 (m, 6H,— CH CH CO- X 3),
3 2 2 2 2
2.00-1.96 (m, 6H, - CH CH CO- X 3), 1.43 (s, 27H, - CH X 9)であった。 ESI- MS (
2 2 3
positive)測定を行ったところ、 m/z 697.45〔(M+Na)+]であった。これらによって化合物 20の構造を確認することができた。なお、この化合物 20の分子質量は C H N O ：
32 58 4 11
676. 41である。
[0173] (2) TEG-Trivalent- O'BUu) (化合物 22)の合成（図 13参照）
3
上記化合物 20 (N -TEG-Trivalent- O'BU) ) (837 mg, 1.24 mmol)をメタノール（
3 3
10ml)に溶解し、 10% Pd/C (200 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で 1.5時間攪拌し た。上記 Pd/Cを濾去して濾液を減圧濃縮した。得られた濃縮残渣 (化合物 21)とチ ォクト酸（385 mg、 1.87 mmol)を無水ジメチルホルムアミド（10 ml)に溶解し、アルゴン 雰囲気下、室温で DIEA(325 μ \, 1.87 mmol)、 HOAt (254 mg, 1.87 mmol) , EDC - HC1 (358 mg, 1.87 mmol)を順にカ卩え、 13時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナト リウム水溶液を加えた後、水相を酢酸ェチルで 3回抽出した。有機相を飽和食塩水で 洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮 を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ (50g、クロ口ホルム:メ タノール = 30 : 1)で精製し、 TEG-Trivalent-Co'Bu) (化合物 22)を無色の油状物とし
3
て得た。収量は 1.05 g (99%)であった。
[0174] この化合物 22につ!/、て1 H- NMR ^ベクトル（600 MHz, CDC1 )測定を行ったところ、
3
δ 3.91 (s, 2H, -OCH CONH— ), 3.70—3.54 (m, 13H,— OCH CH O— X 3, CH CH(CH
2 2 2 2
- )(S- )), 3.55 (t, 2H, J = 5.5 Hz, - CONHCH CH O— ), 3.45 (q, 2H, J = 5.5 Hz,
2 2 2
-CONHCH CH 0-), 3.20-3.16 (m, 1H,— SCH (1H)- ), 3.14—3.09 (m, 1H,— SCH
2 2 2 2
(1H)-), 2.49-2.43 (m, 1H,—SCH CH (1H)— ), 2.22-2.17 (m, 8H,— CH CH CO— X 3,
2 2 2 2 一 NHCOCH CH -), 2.00-1.96 (m, 6H,— CH CH CO— X 3), 1.94—1.88 (m, 1H,
2 2 2 2
-SCH CH (1H)-), 1.74-1.62 (m 4H,— COCH CH CH CH -), 1.52— 1.41 (m, 2H,
2 2 2 2 2 2
-COCH CH CH CH -), 1.44 (s, 27H, - CH X 9)であった。これによつて化合物 22の
2 2 2 2 3
構造を確認することができた。
[0175] (3) TEG-Trivalent-(NHBoc) (化合物 25)の合成（図 13参照）
3
上記化合物 22 (TEG- Trivalent- (0¾ ) (500 mg, 0.587 mmol)をジクロロメタン/水
3
(2.2 ml, 10/1)に溶解し、 0°Cで TFA (2ml)を加え、同温で 1時間攪拌した。反応溶液 を濃縮後、トルエンで共沸した。得られた濃縮残渣 (ィ匕合物 23)と N-Boc-フエ-レン ジァミン（ィ匕合物 24) (612 mg, 2.94 mmol)を無水ジメチルホルムアミド（10 ml)に溶解 し、アルゴン雰囲気下、室温で DIEA(380 μ 1, 2.94 mmol)、 HOAt (400 mg, 2.94 mmol), EDC -HC1 (563 mg, 2.94 mmol)を順に加え、 19時間攪拌した。反応溶液に飽 和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた後、水相を AcOEtで 3回抽出した。有機相を飽 和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去し て減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ (50g、クロ 口ホルム：アセトン = 3 : 1)で精製し、 TEG- Trivalent- (NHBoc) (化合物 25)を淡黄色
3
の油状物として得た。収量は 230 mg (31%)であった。
[0176] この化合物 25について 1H-NMR ^ベクトル（600 MHz, CDC1 )測定を行ったところ、
3
δ 8.72 (bs, 3H, - NHCO- ), 7.56 (bs, 3H, aromatic), 7.22-7.10 (m, 6H, aromatic), 6.91 (bs, 3H,—NHCO—), 3.85 (s, 2H,— OCH CONH— ), 3.67-3.57 (m, 9H, ethylene
2
glycol chain, CH2CH(CH— )(S— )), 3.55—3.47 (m, 6H, ethylene glycol chain,
2
— CONHCH CH 0-), 3.38 (q, 2H, J = 5.2 Hz,— CONHCH CH O— ), 3.14 (ddd, 1H, J
2 2 2 2
= 5.5, 6.9, 12.4 Hz,— SCH (1H)- ), 3.08 (ddd, 1H, J = 6.9, 6.9, 12.4 Hz,— SCH
2 2
(1H)-), 2.43-2.35 (m, 7H,— CH CH CO— X 3,—SCH CH (1H)- ), 2.08 (t, 2H, J =
2 2 2 2
6.9 Hz, -NHCOCH CH -), 2.17-2.12 (m, 6H,— CH CH CO— X 3), 1.88— 1.83 (m,
2 2 2 2
1H, -SCH CH (1H)-), 1.65— 1.50 (m 4H,— COCH CH CH CH -), 1.50 (s, 27H,
2 2 2 2 2 2
- CH x 9), 1.46-1.29 (m, 2H, -COCH CH CH CH -)であった。これらによって化合
3 2 2 2 2
物 25の構造を確認することができた。
[0177] (4)リガンド複合体 TEG- Trivalent- (Mai) (化合物 27)の合成（図 13および図 14参
3
照）
上記化合物 25 (TEG- Trivalent- (0¾ ) (500 mg, 0.587 mmol)をジクロロメタン/水
3
(4.4 ml, 10/1)に溶解し、 0°Cで TFA (2 ml)を加え、同温で 1.5時間攪拌した。反応溶 液を濃縮後、トルエンで共佛した。得られた残渣 (化合物 26)は精製することなぐ次 の還元アミノ化反応に用いた。収量は 252 mgであった。
[0178] 以下、図 14にしたがって説明する。得られた残渣 (ィ匕合物 26) (12.1 mg, 8.88 μ mol)とマルトース（9.60 mg, 26.7 mol)をヂメチルァセトアミド /水（1:1, 600 μ ΐ)に溶 解し、 37°Cで 7時間放置した。反応液に酢酸 (30 1)とシァノ水素化ホウ素ナトリウム（ 5.58 mg, 88.8 /z mol)をカ卩え、 37°Cでさらに 70時間放置した。反応液を凍結乾燥した 後、得られた残渣は、分取高速液体クロマトグラフィー（ODSカラム、メタノール/水 = 50/50)によって精製した。リガンド複合体 TEG-Trivalent- (Mai) (ィ匕合物 27)は白色
3
の固体として得られた。
[0179] この化合物 27について1 H- NMR ^ベクトル（600 MHz、 D 0)測定を行ったところ、 δ
2
7.02 (dd, 3H, J = 7.6, 8.2 Hz, aromatic), 6.72 (s, 3H, aromatic), 6.60 (dd, 3H, J = 1.4, 7.6 Hz, aromatic), 6.44 (dd, 3H, J = 1.4, 8.2 Hz, aromatic), 4.91 (d, 3H, J = 3.4 Hz, H— 1， X 3), 3.82-3.73 (m, 8H, H— 2 X 3, H— 5 X 3,— OCH CONH— ), 3.73—
2
3.67 (m, 9H, H— 3 X 3, H— 5， X 3, H— 6a， X 3), 3.65 (dd, 3H, J = 2.1, 12.4 Hz, H— 6 X 3), 3.59 (dd, 3H, J = 4.8, 12.4 Hz, H— 6a X 3), 3.55 (dd, 3H, J = 5.5, 6.2 Hz, H— 4 X 3) 3.55 (dd, 3H, J = 9.6, 9.6 Hz, H— 3， X 3), 3.50—3.36 (m, 12H,—OCH CH O— X
2 2
3) , 3.45-3.40 (m, 3H, H— 6b X 3), 3.42—3.38 (m, 1H, CH CH(CH— )(S— )), 3.38 (dd,
2 2
3H, J = 3.4, 10.3 Hz, H— 2， X 3), 3.40 (t, 2H, J = 5.5 Hz,— CONHCH CH O— ), 3.25
2 2
(dd, 3H, J = 9.6, 9.6 Hz, H— 4， X 3), 3.15—3.10 (m, 5H, -CONHCH CH O— , H— la
2 2
X 3), 3.02 (dd, J = 8.2, 13.7 Hz, H- lb X 3), 3.01— 2.97 (m, 1H,— SCH (1H)- ), 2.96—
2
2.91 (m, 1H, -SCH (1H)— ), 2.29-2.25 (m, 6H, CH CH CO— X 3), 2.26-2.19 (m,
2 2 2
1H, -SCH CH (1H)-), 2.05-1.98 (m, 6H,— CH CH CO— X 3), 1.99 (t, 2H, J = 6.9
2 2 2 2
Hz,— NHCOCH CH -), 1.74—1.69 (m, 1H,—SCH CH (1H)- ), 1.50— 1.30 (m 4H,
2 2 2 2
— COCH CH CH CH -), 1.16— 1.10 (m, 2H,— COCH CH CH CH -)であった。
2 2 2 2 2 2 2 2
ESI-MS測定を行ったところ、 m/z 981.41〔(M+2Na)2+]であった。これらによって化合物 27の構造を確認することができた。なお、この化合物 27の分子質量は C H N O S
82 132 8 39 2
: 1916. 80である。
〔実施例 5：リンカ一化合物 (化合物 32)およびリガンド複合体 (化合物 34)の合成〕 本発明にかかるリンカ一化合物の一つ、すなわち、前記一般式（1)にて、 aが 4、 b が 0、 d力 、 eが 0であり、 Xが前記一般式 (4)にて表され、 q1, q2, q3が 2であり、
Figure imgf000049_0001
r2 , r3が 1であり、 t1, t2, t3が 4であり、 u1, u2, u3が 1である構造を有するリンカ一化合物 (ィ匕合物 32)、および前記一般式（7)にて表され、 aが 4、 b力 、 d力 0、 eが 0であり、 q q2, q3が 2であり、 r1, r2, r3が 1であり、 t1, t2, t3が 4であり、 u1, u , u3が 1であり、 R 'が水素 (H)であり、 Rが一般式 (6 - 2)である構造を有するリガンド複合体 (化合物 3
4)は以下の手順で合成した。図 15には、このリンカ一化合物 (ィ匕合物 32)を合成す る過程を示す。図 16には上記リンカ一化合物 (ィ匕合物 32)を合成する過程で用いら れる化合物 30の合成過程を示す。また、図 17にはこのリンカ一化合物 (ィ匕合物 32) からリガンド複合体 (化合物 34)を合成する過程を示す。なお、本実施例 5の説明に おいて、各化合物に付記している番号は図 15、図 16および図 17に記載の番号に相 当する。
[0181] 〔測定方法、試薬等〕
ェ!! NMRスペクトルの測定には、 JOEL- Delta600 Spectrometerを用いた。化学シ フトは、 CDC1 の場合はテトラメチルシラン (0.00 ppm)を基準物質にして δ値で表し
3
た。 D 0の場合は DHO (4.65ppm)を基準物質にして δ値で表した。質量分析は
2
PerSeptive Biosystem Mariner Biospectrometry Workstationを用 ヽて孭 U定し 7こ。中 圧シリカゲルカラムクロマトグラフィは、 Silicagel 60 (Merck, 0.040-0.063 mm)を用い て行った。薄層クロマトグラフィーは Precoated Silicagel 60 F254 (Merck, 0.5 mm)を 使用した。全ての試薬、脱水溶媒は関東ィ匕学株式会社製のものを購入して使用した
[0182] (D Trivalent-Co'Bu) (化合物 28)の合成（図 15参照）
3
0 N-Trivalent-Co'Bu) (ィ匕合物 18) (757 mg, 1.70 mmol)と NiCl ·6Η 0 (80.8 mg,
2 3 2 2
0.340 mmol)をメタノール（20 ml)に溶解し、 0°Cで水素化ホウ素ナトリウム（322 mg, 8.50 mmol)を 5回に分けて当量分ずつ加え、その後反応液を室温で 30分間攪拌した 。メタノールを濃縮して除去し、反応溶液に水とクロ口ホルムを加えた。セライト濾過後 、水相をクロ口ホルムで 3回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ た後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮した。得られた濃縮残渣 (化合物 19)とチォ外酸 (351 mg, 1.70 mmol)を無水ジメチルホルムアミド（10 ml)に溶解し、アルゴン雰囲気 下、室温で DIEA (592 μ 1, 3.40 mmol), HOAt (463 mg, 3.40 mmol), EDC -HC1 (652 mg, 3.40 mmol)を順にカ卩え、 16時間攪拌した。反応溶液に水をカ卩えた後、水相を酢 酸ェチルで 3回抽出した。有機相を飽和食塩水及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃 縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ (50g、へキサン:酢 酸ェチル = 3 : 1)で精製し、 Trivalent-CO'Bu) (化合物 28)を淡黄色の油状物として
3
得た。収量は 750 mg (73%)であった。
[0183] この化合物 28について 1H-NMR ^ベクトル（600 MHz, CDC1 )測定を行ったところ、
3
δ 5.91 (s, 1H, -CONH-), 3.57 (ddd, 1H, J = 6.2, 6.2, 12.4 Hz, CH CH(CH— )(S— )),
2 2
3.18 (ddd, 1H, J = 5.5, 5.5, 12.4 Hz,— SCH (1H)— ), 3.11 (ddd, 1H, J = 6.9, 7.6, 12.4 Hz,— SCH (1H)-), 2.46 (ddd, 1H, J = 6.2, 6.2, 12.4 Hz,— SCH CH (1H)- ), 2.22
2 2 2
(t, 8H, J = 7.6 Hz,— CH CH CO— X 3), 2.11 (dd, 2H, J = 6.9, 7.6 Hz,— COCH CH
2 2 2 2
CH CH -), 1.97 (t, 6H, J = 7.6 Hz,— CH CH CO— X 3), 1.91 (ddd, 1H, J = 6.9, 6.9,
2 2 2 2
12.4 Hz -SCH CH (1H)— ), 1.74-1.57 (m 4H, -COCH CH CH CH -), 1.51—1.38
2 2 2 2 2 2
(m, 2H, -COCH CH CH CH -), 1.43 (s, 27H, - CH X 9)であった。また13 C- NMR
2 2 2 2 3
(150 MHz, CDCl )測定を行ったところ、 δ 172.9, 172.1, 80.7, 57.3, 56.3, 40.2, 38.5,
3
37.2, 34.6, 30.0, 29.8, 28.9, 28.1, 25.3であった。これらによって化合物 28の構造を 確認することができた。
[0184] (2) N -TEG-NHBoc (ィ匕合物33)の合成（図16参照）
3
N -TEG-CO Et (化合物 5) (500 mg, 1.64 mmol)を 1,4-ジォキサン（6 ml)に溶解し、
3 2
0°Cで水酸ィ匕ナトリウム水溶液 (1 ml, 150 mg/ml)を反応液にカ卩え、同温で 3時間攪拌 した。 1,4-ジォキサンを濃縮除去した後、 5%硫酸水素カリウム水溶液とクロ口ホルム を加えた。水相をクロ口ホルムで 3回抽出し、有機相を無水硫酸ナトリウムを用いて乾 燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた残渣 (化合物 6)は精製 することなぐ次のカップリング反応に用いられた。収量は 435 mg(96%)であった。得 られた濃縮残渣と N-Boc-フエ-レンジァミン（ィ匕合物 24) (327 mg, 1.57 mmol)を無水 ジメチルホルムアミドに溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で DIEA (410 μ 1, 2.35 mmol), HOAt (320 mg, 2.35 mmol), EDC -HC1 (451 mg, 2.35 mmol)を j噴にカロえ、 14 時間攪拌した。反応溶液に水を加えた後、水相を酢酸ェチルで 3回抽出した。有機 相を飽和食塩水及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシゥ ムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（50g、トルエン：酢酸ェチル = 1 : 1)で精製し、 N
3
-TEG-NHBoc (化合物 33)を淡黄色の油状物として得た。収量は 597 mg(81%)であ つた o
[0185] この化合物 33について [ NMR ^ベクトル（600 MHz, CDCl )測定を行ったところ、
3
δ 8.81 (bs, 1H, - NHCO- ), 7.61 (s, 1H, aromatic), 7.35 (d, 1H, J = 6.9 Hz, aromatic), 7.26-7.20 (m, 2H, aromatic), 6.71 (bs, 1H, -NHCO-), 4.10 (s, 2H, - O CH CONH-), 3.78-3.70 (m, 8H, ethyleneglycol chain), 3.67—3.62 (m, 6H, ethylene glycol chain,— CONHCH CH O— ), 3.35 (t, 2H, J = 5.5 Hz,— CONHCH CH O— )で
2 2 2 2 あった。また、 13C- NMR (150 MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ 168.3, 152.6,
3
139.0, 138.0, 129.5, 114.5, 114.3, 109.8, 80.5, 71.2, 70.6, 70.6, 70.6, 70.5, 70.4, 70.2, 70.0, 50.6, 28.3であった。これらによって化合物 33の構造を確認することがで きた。
[0186] (3) Η Ν- TEG- NHBoc (化合物 30)の合成（図 16参照）
2
上記化合物 33 (N -TEG- NHBoc) (200 mg, 0.425 mmol)をメタノール（4ml)に溶解し
3
、 10% Pd/C (200 mg)を加え、水素雰囲気下、室温で 1.5時間攪拌した。上記 Pd/C を濾去した後、減圧濃縮した。得られた残渣 (ィ匕合物 30)は精製することなぐ次の反 応に用いた。収量は 174 mg (93%)であった。
[0187] (4) Trivalent-(TEG-NHBoc) (化合物 31)の合成（図 15参照）
3
上記化合物 28 (Trivalent- (0¾ ) (64.2 mg, 0.106 mmol)をジクロロメタン/水 (2.2
3
ml, 10/1)に溶解し、 0°Cで TFA(2ml)を加え、同温で 1時間攪拌した。反応液を濃縮 後、トルエンで共佛した。得られた濃縮残渣 (化合物 29)と H N-TEG-NHBoc (化合
2
物 30) (174 mg, 0.425 mmol)を無水ジメチルホルムアミド（3 ml)に溶解し、アルゴン雰 囲気下、室温で DIEA (92.6 μ 1, 0.532 mmol), HOAt (72.3 mg, 0.532 mmol), EDC - HC1 (102 mg, 0.532 mmol)を順に加え、 14時間攪拌した。反応溶液に水をカ卩えた後、 水相を酢酸ェチルで 3回抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネ シゥムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（50g、クロ口ホルム：メタノール = 30 : 1)で精製 し、 Trivalent-(TEG-NHBoc) (化合物 31)を淡黄色の油状物として得た。収量は 64.7
3
mg (36%)であった。
[0188] この化合物 31について 1H-NMR ^ベクトル（600 MHz, CDC1 )測定を行ったところ、
3
δ 8.88 (bs, 3H, -NHCO- X 3), 7.67 (bs, 3H, aromatic), 7.42 (bs, 3H, -NHCO- X 3), 7.31 (d, 3H, J = 7.7 Hz, aromatic), 7.27 (d, 3H, J = 8.2 Hz, aromatic), 7.22 (dd, 3H, J = 7.7, 8.2 Hz, aromatic), 6.63 (bt, 3H, J = 4.8 Hz, -NHCO- X 3), 4.11 (s, 6H, — OCH CONH- X 3), 3.78-3.58 (m, 36H, ethylene glycol chain), 3.57—3.49 (m, 1H,
2
CH CH(CH— )(S— )), 3.50 (t, 6H, J = 5.5 Hz, -CONHCH CH O— X 3), 3.36 (q, 6H, J = 5.2 Hz,— CONHCH CH O— X 3), 3.15 (ddd, 1H, J = 5.5, 6.9, 11.0 Hz,— SCH
2 2 2
(1H)-), 3.09 (ddd, 1H, J = 6.9, 6.9, 11.0 Hz,—SCH (1H)- ), 2.42 (ddd, 1H, J = 6.9,
2
6.9, 12.4 Hz, -SCH CH (1H)- ), 2.12—2.06 (m, 8H,— CH CH CO— X 3,— NHCOCH
2 2 2 2 2
CH CH -), 1.95— 1.88 (m, 6H,— CH CH CO- X 3), 1.87 (ddd, 1H, J = 6.9, 6.9, 12.4
2 2 2 2
Hz, -SCH CH (1H)-), 1.70-1.50 (m 4H,— COCH CH CH CH -), 1.50 (s, 27H,
2 2 2 2 2 2
— CH X 9), 1.48-1.33 (m, 2H, -COCH CH CH CH -)であった。また、 13C- NMR (150
3 2 2 2 2
MHz, CDC1 )測定を行ったところ、 δ 173.3, 172.8. 168.4, 152.8, 139.3, 137.8,
3
129.3, 114.5, 114.4, 110.1, 80.2, 71.1, 70.5, 70.4, 70.4, 70.3, 70.1, 70.1, 69.7, 57.3, 56.4, 40.1, 39.2, 38.3, 37.0, 34.5, 31.1, 30.5, 28.8, 28.3, 25.4であった。また 、 ESI-MS測定を行ったところ、 m/z 875.41〔(M+2Na)2+]であった。これらによって化合 物 31の構造を確認することができた。なお、この化合物 31の分子質量は C H N 0
81 128 10
S : 1704. 85である。
25 2
[0189] (5)リガンド複合体 Trivalent-(TEG-Mal) (化合物 34)の合成（図 16および図 17参
3
照）
上記化合物 31 (Trivalent-(TEG-NHBoc) ) (64.7 mg, 37.9 μ mol)をジクロロメタン/
3
水（2.2 ml, 10/1)に溶解し、 0°Cで TFA(2 ml)を加え、同温で 2.5時間攪拌した。反応 液を濃縮後、トルエンで共沸した。得られた残渣 (ィ匕合物 32)は精製することなぐ次 の還元アミノ化反応に用いた。収量は 70 mgであった。
[0190] 以下、図 17にしたがって説明する。得られた濃縮残渣 (ィ匕合物 32) (6.95 mg、 3.77
/z mol含有)とマルトース (4.07 mg, 11.3 mol)をジメチルァセトアミド /水（1:1, 400 μ 1)に溶解し、 37°Cで 13時間放置した。その後、酢酸（20 1)とシァノ水素化ホウ素ナト リウム（2.24 mg, 35.6 μ mol)を反応液にカ卩え、 37°Cで 59時間放置した。反応液を凍 結乾燥した後、得られた残渣を分取高速液体クロマトグラフィ（ODSカラム、メタノール Z水 = 50Z50) )によって精製し、 Trivalent-(TEG-Mal) (化合物 34)を白色固体とし
3
て得た。収量は 4.46 mg (50%)であった。
[0191] 化合物 34について 1H- NMR ^ベクトル（600 MHz、 D 0)測定を行ったところ、 δ
2
7.05 (dd, 3H, J = 7.6, 8.2 Hz, aromatic), 6.77 (s, 3H, aromatic), 6.63 (dd, 3H, J = 1.4, 7.6 Hz, aromatic), 6.47 (dd, 3H, J = 1.4, 8.2 Hz, aromatic), 4.92 (d, 3H, J = 3.4 Hz, H— 1， X 3), 4.01 (s, 6H,— OCH CONH- X 3), 3.81 (ddd, 3H, J = 2.1, 4.8,
2
7.6 Hz, H-2 X 3), 3.71 (ddd, 3H, J = 4.1, 7.6 Hz, H— 5 X 3), 3.74—3.68 (m, 9H, H— 3 X 3, H— 5， X 3, H— 6a， X 3), 3.65 (dd, 3H, J = 2.1, 12.4 Hz, H— 6 X 3), 3.64—3.60 (m, 3H, H-6a X 3), 3.64—3.42 (m, 36H, -OCH CH O- X 9), 3.56—3.52 (m, 6H, H- 4
2 2
X 3, H— 3， X 3), 3.47-3.43 (m, 3H, H— 6b X 3), 3.42—3.39 (m, 1H, CH CH(CH
2 2
— )(S— )), 3.38 (dd, 3H, J = 3.4, 9.6 Hz, H-2' X 3), 3.37 (t, 6H, J = 4.8 Hz,
— CONHCH CH 0- X 3), 3.26 (dd, 3H, J = 9.6, 9.6 Hz, H— 4， X 3), 3.15 (dd, 3H, J =
2 2
4.8, 13.7 Hz, H-la X 3), 3.14 (t, 6H, -CONHCH CH O— X 3), 3.06 (dd, J = 7.6,
2 2
13.7 Hz, H-lb X 3), 3.01 (ddd, 1H, J = 6.2, 6.2, 11.0 Hz,— SCH (1H)- ), 2.95 (ddd,
2
1H, J = 6.9, 6.9, 11.0 Hz,—SCH (1H)- ), 2.24 (ddd, 1H, J = 6.2, 6.2, 12.4 Hz,
2
-SCH CH (1H)-), 2.00 (t, 2H, J = 6.9 Hz,— NHCOCH CH -), 1.96— 1.92 (m, 6H,
2 2 2 2
CH CH CO- X 3), 1.77-1.69 (m, 7H, - CH CH CO- X 3, -SCH CH (1H)- ), 1.52—
2 2 2 2 2 2
1.32 (m 4H,— COCH CH CH CH -), 1.20— 1.14 (m, 2H,— COCH CH CH CH -)であ
2 2 2 2 2 2 2 2 つた。また ESト MS測定を行ったところ、 m/z 1214.57〔(M+2Na)2+]であった。これらによ つて化合物 34の構造を確認することができた。なお、この化合物 34の分子質量は C H N 0 S : 2283. 06である。
102 170 10 49 2
[0192] なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様ま たは実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのよう な具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に 記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。 産業上の利用の可能性
[0193] 本発明のリンカ一化合物は、以上のように、 3単位以上の糖分子を導入可能な部位 として、芳香族ァミノ基末端を有している。また、表面プラズモン共鳴 (SPR)のセンサ チップゃァフィ-テイク口マトグラフィの担体等のタンパク質分析用の支持体に結合可 能な部位として、 S— S結合を有している。さらに、非特異的な疎水性相互作用を極力 抑えることができ、かつ、金属結合に供されるジスルフイド基までの長さを容易に調整 することができるように、ジスルフイド基と芳香族ァミノ基との間にオリゴエチレンォキシ ドを有している。 [0194] それゆえ、上記リンカ一化合物を用いることによって、上記支持体表面上に、 3単位 以上の糖分子を再現性よく 2次元的に配列させることができるという効果を奏する。ま た、上記リンカ一化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響はほぼ無視 することができるので、糖分子とタンパク質との相互作用を観測する際に、糖分子の 生物活性を再現性よく評価することが可能になる。さらに、効率よく金属 硫黄結合を 形成することができる。
[0195] また、本発明のリガンド複合体は、上記リンカ一化合物に糖分子を導入してなるも のである。
[0196] それゆえ、上記リガンド複合体をタンパク質分析用の支持体表面に導入することに より、 2次元的に複数の糖分子を再現性よく配列することができるので、糖分子の生 物活性を再現性よく評価することが可能になるという効果を奏する。さらに、効率よく 金属 -硫黄結合を形成することができるという効果を奏する。
[0197] 本発明によれば、センサチップ表面上の糖鎖間距離を制御し、オリゴ糖を再現性よ く 2次元的に配列し得るリンカ一化合物、及び、該リンカ一化合物に糖分子が導入さ れてなるリガンド複合体を得ることができる。このリンカ一化合物およびリガンド複合体 は、オリゴ糖鎖チップの実用化と一般ィ匕のために非常に有用である。
[0198] オリゴ糖鎖を固定ィ匕したチップが糖鎖やタンパク質の機能解析のツールとして発展 すれば、オリゴ糖鎖が関与する生命現象の解明に貢献するだけでなぐ医薬品開発 における重要な技術となることが期待される。それゆえ、本発明の有用性は高いと考 えられる。

Claims

請求の範囲 [1] 一般式 (1)
[化 1]
Figure imgf000056_0001
(式中、 a, b, d, eは、それぞれ独立して、 0以上 6以下の整数）にて表される構造を 備え、
上記 Xが、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素-窒素結合を有して V、てもよ 、炭化水素誘導鎖を、 3鎖以上含んでなる多分岐構造部位である構造を備 えて 、ることを特徴とするリンカ一化合物。
一般式 (2)
[化 2]
Figure imgf000056_0002
(式中、 nは 1以上 6以下の整数）にて表される構造を備え、
上記 Xが、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素-窒素結合を有して V、てもよ 、炭化水素誘導鎖を、 3鎖以上含んでなる多分岐構造部位である構造を備 えて 、ることを特徴とする請求項 1に記載のリンカ一化合物。
上記 Xは、一般式（3)
[化 3]
Figure imgf000057_0001
(式中、 m1, m2, m3, m4, p1, p2は、それぞれ独立して、 1以上 6以下の整数）にて表 される構造を備えていることを特徴とする請求項 1または 2に記載のリンカ一化合物。 上記 Xは、一般式 (4)
[化 4]
Figure imgf000057_0002
(式中、 q1, q2, q3, r1, r , r , t1, t2, t3, u , u , u3は、それぞれ独立して、 0以上 6以 下の整数）にて表される構造を備えていることを特徴とする請求項 1または 2に記載の リンカ一化合物。
[5] 請求項 1な 、し 4の 、ずれか 1項に記載のリンカ一化合物の芳香族ァミノ基に、糖 分子を導入してなることを特徴とするリガンド複合体。
[6] 一般式 (5)
[化 5]
Figure imgf000058_0001
(式中、 m1, , m3, m4, n, p1, p2は、それぞれ独立して、 1以上 6以下の整数。 R' は水素 (H)または R。 )にて表される構造を備え、
上記 Rが式式（6— 1)な!ヽし式（6— 6)
[化 6]
Figure imgf000059_0001
(6— 1) (6-2)
Figure imgf000059_0002
(6-4) (6-5)
力 選択されるオリゴ糖由来化合物であることを特徴とするリガンド複合体, [7] 一般式 (7)
[化 7]
Figure imgf000060_0001
(式中、 a, b, d, e, q1, q , q ,
Figure imgf000060_0002
t , t , u , u , uは、それぞれ独立して 、 0以上 6以下の整数。ただし、 bが 0のときは t1, t2および t3は 0ではなぐ t1, t2および t3が 0のときは bは 0ではない。また、 R'は水素（H)または R。 )にて表される構造を備 え、
上記 Rが式（6— 1)な!ヽし式（6— 6)
[化 8]
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000061_0002
(6 - 3)
Figure imgf000061_0003
から選択されるオリゴ糖由来化合物であることを特徴とするリガンド複合体。
[8] 請求項 1な!、し 4の 、ずれか 1項に記載のリンカ一化合物の製造方法であって、 チォ外酸と、芳香族ァミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を 3鎖以上 有するアミンィ匕合物との縮合反応を行うステップと、
上記芳香族ァミノ基末端の保護基を脱保護するステップとを含んでいることを特徴 とするリンカ一化合物の製造方法。
[9] 請求項 1ないし 4のいずれか 1項に記載のリンカ一化合物と、糖分子とを用いて、還 元ァミノ化反応を行うことを特徴とするリガンド複合体の製造方法。 上記糖分子として、一般式 (8)
Figure imgf000062_0001
にて表されるへパリン部分二糖構造を有する硫酸化オリゴ糖を用いることを特徴とす る請求項 9に記載のリガンド複合体の製造方法。
上記糖分子として、群 (9)
[化 10]
Figure imgf000062_0002
力 選択されるオリゴ糖の少なくとも 1つを用いることを特徴とする請求項 9に記載のリ ガンド複合体の製造方法。
[12] 糖分子を支持体の表面に配列させる糖分子の導入方法であって、
請求項 5ないし 7のいずれか 1項に記載のリガンド複合体を含む溶液と表面に金属 を有する支持体とを接触させることを特徴とする糖分子の導入方法。
[13] 請求項 5ないし 7のいずれか 1項に記載のリガンド複合体を、表面に金属を有する 支持体上に固定化させてなることを特徴とするリガンド担持体。
PCT/JP2005/001726 2004-02-05 2005-02-04 リンカー化合物及びリガンド複合体、並びにそれらの製造方法 WO2005075453A1 (ja)

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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100740071B1 (ko) 2006-03-10 2007-07-16 한불화장품주식회사 리포익산 유도체 및 이를 함유한 피부외용제 조성물
JPWO2005077965A1 (ja) * 2004-02-18 2007-10-18 独立行政法人科学技術振興機構 糖鎖リガンド複合体、およびそのリガンド複合体を用いたタンパク質の分析方法
JP2011505572A (ja) * 2007-12-04 2011-02-24 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 標識粒子を用いた流体内分子測定方法
US9239329B2 (en) 2006-12-18 2016-01-19 Japan Science And Technology Agency Method of measuring interaction between biomaterial and sugar chain, method of evaluating biomaterial in sugar chain selectivity, method of screening biomaterial, method of patterning biomaterials, and kits for performing these methods
WO2017053769A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Triazole derivatives as p2y14 receptor antagonists
JP2019077686A (ja) * 2017-10-26 2019-05-23 国立大学法人 鹿児島大学 Ｔｌｒリガンド固定化ナノ粒子

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101100803B1 (ko) * 2009-04-24 2011-12-29 서울과학기술대학교 산학협력단 리포아마이드가 결합된 고분자화합물과 이의 제조방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003083969A (ja) * 2001-09-14 2003-03-19 Japan Science & Technology Corp リンカー化合物およびリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分析用の支持体
US20030059865A1 (en) * 2001-09-05 2003-03-27 Nelson Deanna Jean Oligo(ethylene glycoll)-terminated 1,2-dithiolanes and their conjugates useful for preparing self-assembled monolayers
JP2003190568A (ja) 2001-12-28 2003-07-08 Sun Corp 遊技場管理装置
JP2004157108A (ja) 2002-09-09 2004-06-03 Japan Science & Technology Agency リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3834607B2 (ja) 2000-06-28 2006-10-18 国立大学法人大阪大学 オリゴ糖鎖・フェニレンジアミン複合化合物の製造方法、オリゴ糖鎖集合化用リンカー化合物、リンカー化合物により集合化したオリゴ糖鎖・フェニレンジアミン複合化合物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030059865A1 (en) * 2001-09-05 2003-03-27 Nelson Deanna Jean Oligo(ethylene glycoll)-terminated 1,2-dithiolanes and their conjugates useful for preparing self-assembled monolayers
JP2003083969A (ja) * 2001-09-14 2003-03-19 Japan Science & Technology Corp リンカー化合物およびリガンド並びにオリゴ糖鎖の固定化方法および蛋白質分析用の支持体
JP2003190568A (ja) 2001-12-28 2003-07-08 Sun Corp 遊技場管理装置
JP2004157108A (ja) 2002-09-09 2004-06-03 Japan Science & Technology Agency リンカー化合物及びリガンド、並びにそれらの製造方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARANO A. ET AL: "Heparin Bubun Kozo o Yusuru Cluster-Ka Oligo-tosa Rigand no Gosei to Chip Technology eno Oyo.", THE CHEMICAL SOCIETY OF JAPAN KOEN YOKOSHU., vol. 82, 2002, pages 137, XP002991264 *
ARANO A. ET AL: "Ryusan Oligo-to o Shugoka Shite Koteika shita Sugar Chip no Chosei to SPR-ho eno Oyo.", THE JAPANESE SOCIETY OF CARBOHYDRATE RESEARCH NENKAI YOSHISHU., vol. 24, 2003, pages 127, XP002991263 *
See also references of EP1731517A4
SUDA Y. ET AL: "Oligo-tasa no Nano Level Kino Kaiseki System no Kaihatsu.", THE JAPANESE SOCIETY OF CARBOHYDRATE RESEARCH NENKAI YOSHITSU., vol. 24, 2003, pages 36, XP002991262 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2005077965A1 (ja) * 2004-02-18 2007-10-18 独立行政法人科学技術振興機構 糖鎖リガンド複合体、およびそのリガンド複合体を用いたタンパク質の分析方法
JP4800771B2 (ja) * 2004-02-18 2011-10-26 独立行政法人科学技術振興機構 糖鎖リガンド複合体、およびそのリガンド複合体を用いたタンパク質の分析方法
KR100740071B1 (ko) 2006-03-10 2007-07-16 한불화장품주식회사 리포익산 유도체 및 이를 함유한 피부외용제 조성물
WO2007105854A1 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Han-Bul Cosmetics Co., Ltd. Novel lipoic acid conjugated compounds and skin external applications containing thereof
US9239329B2 (en) 2006-12-18 2016-01-19 Japan Science And Technology Agency Method of measuring interaction between biomaterial and sugar chain, method of evaluating biomaterial in sugar chain selectivity, method of screening biomaterial, method of patterning biomaterials, and kits for performing these methods
JP2011505572A (ja) * 2007-12-04 2011-02-24 コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ 標識粒子を用いた流体内分子測定方法
WO2017053769A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Triazole derivatives as p2y14 receptor antagonists
US10683277B2 (en) 2015-09-25 2020-06-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Triazole derivatives as P2Y14 receptor antagonists
JP2019077686A (ja) * 2017-10-26 2019-05-23 国立大学法人 鹿児島大学 Ｔｌｒリガンド固定化ナノ粒子

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