WO2005073392A1

WO2005073392A1 - グルコシル基の転移方法

Info

Publication number: WO2005073392A1
Application number: PCT/JP2005/001088
Authority: WO
Inventors: Tomoyuki Nishimoto; Michio Kubota; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
Priority date: 2004-01-28
Filing date: 2005-01-27
Publication date: 2005-08-11
Also published as: GB2425533B; US20070154996A1; JP2005210925A; GB2425533A; GB0616296D0

Abstract

　酵素反応を利用してグルコシル転移ポリアルコール、グルコシル転移グルクロン酸、及びグルコシル転移グルコース６位糖質誘導体を生成する新規な方法を提供することを課題とし、この課題を、構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、イノシトール、リビトール、エリスリトール及びグリセロールから選ばれる１種又は２種以上のポリアルコール、グルクロン酸及び／又はその塩、及び／又は、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースから選ばれる１種又は２種以上のグルコース６位糖質誘導体とにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするポリアルコール、グルクロン酸、及びグルコース６位糖質誘導体へのグルコシル基の転移方法を提供することにより解決する。

Description

明細書

ダルコシル基の転移方法

技術分野

[0001] 本発明は、ポリアルコール、グルクロン酸及び/又はその塩（以下、本明細書では「グルクロン酸及び Z又はその塩」を単に「グルクロン酸」と略称する。）、及びダルコ一ス 6位糖質誘導体にダルコシノレ基を転移する新規な方法、より詳細には、トレハロースホスホリラーゼの作用を利用してポリアルコール、グルクロン酸、及びグルコース 6 位糖質誘導体にダルコシノレ基を転移する新規な方法に関するものである。

背景技術

[0002] 近年、オリゴ糖をはじめとする諸種の糖質が有する機能が続々と明らかになりつつある。これに伴って、機能性糖質に対する要望は多様化し、より優れた機能を有する糖質や、全く新規な機能を有する糖質、例えば、食品'化粧品'医薬品以外の分野でも利用できる有用な機能を有する糖質などの実用化を望む声が高まっている。斯界においては、斯カる要望に応えるベぐ新規な又は希少な各種糖質の工業的製造を目的とした新規な方法の確立を目指した研究と、その新規な方法で製造された糖質の機能を解析する研究が精力的に進められている。

[0003] 糖質の一種であるポリアルコール（一般に、「糖アルコール」もしくは「多価アルコーノレ」とも呼ばれている。）、グノレクロン酸、及びグルコース 6位糖質誘導体は、低う食性、難消化性、ミネラルとの塩形成など食品素材として優れた機能を有することから、それらの関連化合物、例えば、ダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移ダルクロン酸、ダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体などを製造し、それらの機能の解析を進めることにより、より優れた機能や新規な機能を有する糖質が実用化できる可能十生がある。

[0004] ダルコシル転移ポリアルコールの製造方法に関しては、例えば、スクロースホスホリラーゼ、コージビオースホスホリラーゼ及び α—ダルコシダーゼなどによるダルコシル基の転移作用を利用した方法が特開平 5-91891号公報、特開 2002— 65293号公報、特開平 2-163092号公報に、また、糖転移グノレクロン酸の製造方法に関しては、例えば、；3—ガラクトシダーゼによる乳糖からのガラクトシル基の転移反応を利用した方法が特開平 6-253879号公報に開示されている。さらに、ダルコシル転移ダルコース 6位糖質誘導体の製造方法に関しては、例えば、スクロースホスホリラーゼ、コージビオースホスホリラーゼ、ひ—ダルコシダーゼ、デキストランスクラーゼ、シクロマノレトデキストリングルカノトランスフェラーゼなどによるグノレコシノレ基の転移作用を利用した製造方法が様々提案されている。これらの方法による製造物は、用いられる酵素の基質特異性の違いから、糖組成や含まれる個々の糖質の構造などの点でそれぞれに特徴を有し、したがって、これらの製造物が発揮する機能も当然異なるものと考えられる。しかしながら、本発明者等は、糖質に対する要望が多様化している現状を考慮すると、現在までに提案されているダルコシル転移ポリアルコール、糖転移酸性糖、グノレコシノレ転移オリゴ糖の製造方法の種類は、その要望に応えるのになぉ不十分であり、さらに多様な製造方法の提供が必要であるという結論に達した。そして、従来の、ダルコシル転移ポリアルコール、糖転移酸性糖、ダルコシル転移グルコース 6 位糖質誘導体の製造方法の場合とは全く異なる酵素を用いてダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移グルクロン酸、及びダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体を生成する方法が提供されれば、より優れた機能や新規な機能を有する糖質の多様な製造方法の確立に大きく貢献できると考えた。

発明の開示

[0005] 斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、酵素を利用してダルコシノレ転移ポリアルコーノレ、ダルコシル転移ダルクロン酸、及びダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体を生成する新規な方法を提供することにある。

[0006] 上記の課題を解決するために、本発明者等は、まず、ポリアルコールへの糖転移活性を有することが想定される公知の糖関連酵素を対象として、代表的なポリアルコールのひとつであるソルビトールにダルコシル基を転移する作用の有無を検討した。し力しながら、ここで検討した範囲では、上記の課題を解決する新規な方法を確立し得る酵素を見出すには至らなかった。そこで本発明者等は次に、ポリアルコールへの糖転移活性を有することが想定されるか否かに関わらずにさらに幅広い酵素群を対象として、ソルビトール以外の諸種のポリアルコールにダルコシル基を転移する作用の有無を検討した。その結果、同じ特許出願人による特開平 10-304881号公報においてトレハロースホスホリラ一ゼがソルビトールにダルコシル基を転移しなかったことが記載されており、この事実から一般的に該酵素はポリアルコールにグノレコシノレ基を転移する作用を有しないと考えられてきたところ、全く意外なことに、該酵素は、イノシトールをはじめとするポリアルコールには顕著にダルコシル基を転移する作用を有することが判明した。

[0007] さらに、グルコースの 6位が酸化した酸性糖であるグルクロン酸や、グルコースの 6 位にダルコシノレ基や他の糖残基が結合したオリゴ糖 (グノレコース 6位糖質誘導体）へのダルコシル基の転移を検討した結果、トレハロースホスホリラ一ゼがグルクロン酸やイソマルトースをはじめとするグルコース 6位糖質誘導体にも顕著にグノレコシノレ基を転移する作用を有することが判明した。そして、反応規模を拡大してトレハロースホスホリラーゼの反応によるポリアルコール、グルクロン酸、及びグルコース 6位糖質誘導体へのダルコシル基の転移反応を行ったところ、これら反応が、ダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移グルクロン酸及びダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体の工業的規模での製造に有利に利用できることが確認された。本発明は、以上の本発明者等による独自の研究成果に基づいて為されたものである。

[0008] すなわち、本発明は、構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、イノシトール、リビトール、エリスリトール及びグリセロールから選ばれる 1種又は 2種以上のポリアルコーノレ、グルクロン酸、及び/又はイソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマノレトトリオース及びイソパノースから選ばれる 1種又は 2種以上のグルコース 6位糖質誘導体とにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするポリアルコール、グノレクロン酸、及びグノレコース 6位糖質誘導体へのグノレコシノレ基の転移方法を提供することにより上記課題を解決するものである。

[0009] 本発明の転移方法は、従来のダルコシル転移方法に比べ、高効率で副生成物が少ないという特徴を有しており、本方法によれば、従来知られていなかった又は稀少とされてきたダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移ダルク口ン酸及びダルコシノレ転移グノレコース 6位糖質誘導体を工業的規模で製造することが可能である。発明を実施するための最良の形態 [0010] 本発明のポリアルコール、グルクロン酸及びグルコース 6位糖質誘導体へのダルコシル基の転移方法（以下、単に「本発明の転移方法」又は「当該転移方法」とレ、う場合がある。）はトレハロースホスホリラーゼを利用することを特徴とする。本発明でいうトレハロースとは、ひ— D—ダルコシルひ— D—ダルコシドで表される二糖を意味する。本発明でいうトレハロースホスホリラ一ゼとは、この二糖トレハロースを、無機リン酸及び /又はその塩の存在下で加リン酸分解して D—グルコース及び β _D—グノレコース— 1 リン酸及び Z又はその塩 (以下、本明細書では、不都合が生じない限り、「 — D—グルコース— 1リン酸及び/又はその塩」を単に「 j3— D—グノレコース— 1リン酸」と略称する。）を生成する反応ならびにこの逆反応を触媒する酵素を意味する。本発明で利用できるトレハロースホスホリラ一ゼは、このように定義され、下記に詳述する本発明で用いるポリアルコールの 1種又は 2種以上、グルクロン酸、及び Z又は、グルコース 6 位糖質誘導体の 1種又は 2種以上にダルコシノレ基を転移する作用を有するものである限り起源や調製方法などは特定のものに限定されない。例えば、同じ特許出願人による特開平 10-304881号公報に開示された、サーモアナエロビゥム 'ブロッキィ（ ATCC 35047)起源の天然型ならびに組換え型の該酵素はいずれも本発明に有利に利用できる。また、同公報に開示された同酵素をコードする DNAに蛋白質工学的手法を適用して得られる変異酵素も、所期の転移作用を実質的に消失していないものである限り本発明に利用できる。さらには、所期の転移作用を有している限り、他の微生物由来のトレハロースホスホリラーゼ、例えば、特開平 8— 131157号公報に開示されてレ、るプレシオモナス（Plesiomonas)属微生物起源のトレハロースホスホリラーゼなどを用いることも有利に実施できる。

[0011] 本発明でいうポリアルコールとは、分子中に 2個以上の水酸基を有するアルコール

、通常、多価アルコール又は糖アルコールとも呼ばれる化合物を意味する。本発明でダルコシル基の受容体となるポリアルコールは、イノシトール、リビトーノレ、エリスリトール及びグリセロールから選ばれる 1種又は 2種以上であり、その調製方法やその存在形態には特に制限はない。例えば、市販品を含む、天然より単離された調製品、酵素的又は化学的に調製ないしは合成された調製品、さらには、本発明の転移方法における酵素反応の進行や当該転移方法による生成物の利用に悪影響を及ぼさない範囲で、該ポリアルコール以外の夾雑物質を含んでいる調製品や、以上のような調製品を組み合わせてなる組成物であってもよい。なお、イノシトールには、ミオイノシトール、 D—イノシトール、 L一イノシトール等の立体異性体が存在する。これらイノシトール異性体はレ、ずれも本発明に有利に利用できるけれども、これらのうちでミオイノシトールはグノレコシル転移生成物の生成割合が比較的高レ、のでこの発明に特に有用である。

[0012] 本発明でいうグルクロン酸とは、グルコースの 6位がカルボキシル基に酸化された構造を有する酸性糖を意味し、その調製方法やその存在形態には特に制限はない。例えば、市販品を含む、天然より単離された調製品、酵素的又は化学的に調製ないしは合成された調製品、さらには、本発明の転移方法における酵素反応の進行や当該転移方法による生成物の利用に悪影響を及ぼさなレ、範囲で、該グルクロン酸以外の夾雑物質を含んでレ、る調製品や、以上のような調製品を組み合わせてなる組成物であってもよい。

[0013] 本発明でいうグルコース 6位糖質誘導体とは、グルコース分子の 6位が他の糖質と結合した誘導体を意味する。本発明でダルコシル基の受容体となるグルコース 6位糖質誘導体は、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースから選ばれる 1種又は 2種以上であり、その調製方法やその存在形態には特に制限はない。例えば、市販品を含む、天然より単離された調製品、酵素的又は化学的に調製ないしは合成された調製品、さらには、本発明の転移方法における酵素反応の進行や当該転移方法による生成物の利用に悪影響を及ぼさない範囲で、該グルコース 6位糖質誘導体以外の夾雑物質を含んでいる調製品や、以上のような調製品を組み合わせてなる組成物であってもよい。

[0014] 本発明の転移方法で用いる、構成糖としてグルコースを含む糖化合物とは、トレハロースホスホリラーゼの作用によるダルコシル転移反応にぉレ、てダルコシル基供与体となる、構成糖としてグノレコースを含有するグノレコースの誘導体、オリゴ糖ならびにその誘導体を意味する。斯かる糖化合物の調製方法や存在形態に特に制限はなぐ例えば、市販品を含む、天然より単離された調製品、酵素的又は化学的に調製ないしは合成された調製品、さらには、本発明の転移方法における酵素反応の進行や当該転移方法による生成物の利用に悪影響を及ぼさない範囲で、斯かる糖化合物以外の夾雑物質を含んでいる調製品や、以上のような調製品を組み合わせてなる組成物であってもよい。斯カる糖ィ匕合物として比較的望ましいものは β _D_グルコース— 1リン酸である。 —D—グノレコース— 1リン酸を酵素的に調製するには、例えば、トレハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用させたり、マノレトースにマノレトースホスホリラーゼ (オリエンタル酵母株式会社販売等）を作用させたり、グノレコースがひ _1， 2結合で連結してなるコージビオースやコージトリオースなどのコージオリゴ糖にコージピオースホスホリラーゼ（同じ特許出願人による特開平 10—304882号に記載のもの等）を作用させることなどにより j3 _D—グノレコース— 1リン酸を生成させ、これを、必要に応じて常法により所望のレベルにまで精製すればよい。また、本発明においては、酵素の作用を受けて /3 _D_グルコース— 1リン酸を生成しうる、構成糖としてグノレコース含む以上のようなオリゴ糖類をそのまま利用することもできる。例えば、トレハロースを利用する場合、トレハロースホスホリラーゼの作用による i3 _D_グルコース— 1リン酸の生成と、生成した i3 _D_グルコース— 1リン酸からのポリアルコール、グルクロン酸、及び/又はグルコース 6位糖質誘導体へのダルコシノレ基の転移反応とが同時に進行することとなる。また、マルトース及び/又はコージオリゴ糖を利用する場合には、それぞれから β _D_グルコース一 1リン酸を生成する上述のマルトースホスホリラーゼ及び/又はコージビオースホスホリラーゼを本発明の転移方法を行う反応系に共存させれば、所期の転移反応を進行させることができる。

上述のような、トレハロースホスホリラーゼとともに、ポリアルコール、グルクロン酸、及び/又はグルコース 6位糖質誘導体、及び構成糖としてグルコースを含む糖化合物（以下、ポリアルコール、グノレクロン酸、グノレコース 6位糖質誘導体及び構成糖としてグノレコースを含む糖ィ匕合物のレ、ずれか又は二者又はすベてを指して「基質」とレ、う場合がある。）を、通常は水溶液中で混合し、用いるトレハロースホスホリラーゼの酵素学的性質に応じて適宜選ばれる条件下で保持すれば、トレハロースホスホリラ一ゼの作用によりポリアルコール、グルクロン酸及び Z又はグルコース 6位糖質誘導体にグノレコシル基を転移させることができる。同じ特許出願人による特開平 10—304881 号公報に開示されたトレハロースホスホリラ一ゼを利用する場合、該酵素が完全には失活しない条件、すなわち、温度は、通常、 70°C以下、望ましくは、 65°C以下が好適であり、 pHは、通常、 pH4. 0乃至 9. 0、望ましくは、 pH5. 0乃至 7. 5が好適である。反応混合物中の基質の濃度は所期の反応が進行する限り特に制限はなぐ例えば、ポリアルコールと構成糖としてグノレコースを含む糖ィ匕合物とを、それぞれ、通常、 0. 1乃至 40質量％、望ましくは、 0. 2乃至 20質量％の範囲とし、両者の比を、通常、 1 : 0. 1乃至 400、望ましくは、 1 : 1乃至 100、さらに望ましくは、 1 : 2乃至 50の範囲とするのが好適である。なお、構成糖としてグノレコースを含む糖ィ匕合物として、トレハロース、マルトース及び/又はコージビオースを用レ、、必要に応じて、マルトースホスホリラーゼ及び/又はコージビオースホスホリラーゼを併用する場合には、適宜の濃度の無機リン酸及び/又はその塩、例えば、リン酸二水素ナトリウムなどを適宜の濃度、通常、 0. 5乃至 100mM、望ましくは、 1乃至 50mMの範囲で共存させるのが好適である。また、マルトースホスホリラ一ゼ及び Z又はコージビオースホスホリラーゼを併用する場合には、併用する酵素の酵素学的性質を考慮して、使用する全ての酵素が、ずれも完全には失活しなレ、条件を選定するのが望ましレ、。トレハロースホスホリラーゼの使用量に関しては、反応混合物中の基質の乾燥重量換算での総量 lgに対し、通常、 0. 1乃至 500単位、望ましくは、 0. 5乃至 200単位とするのが好適である。なお、ここでいうトレハロースホスホリラーゼ活性の 1単位とは、同じ特許出願人による特開平 10-304881号公報に記載の方法にしたがって、 pH5. 5、 60°Cでトレハロースを基質として反応させたとき、 1分間当たり 1 z molの D—グルコースを生成する酵素量を意味する。以上のような反応混合物を用いて反応させる時間は、反応の進行の度合いに応じて適宜選択することができ、通常、 2乃至 200時間、望ましくは、 4乃至 100時間が好適である。

一般に、酵素的に糖質を製造する場合には、その反応温度は可能な限り高く設定することが望ましい。これにより、反応中の雑菌汚染を防いだり、反応速度を高めたり、基質濃度を高めることができ、その結果、目的とする反応をより効率的に進行させることができることなどがその理由である。本発明の転移反応を実施する場合にも同様であり、反応温度は、通常、常温以上、望ましくは、 40°C以上、より望ましくは、 50°C 以上とするのが好適である。したがって、本発明の転移方法の実施においては、このような好適な温度条件下で利用できる温度安定性、例えば、至適 pHの条件下で 60 °Cで 1時間保持したときに本来の活性を、通常、 80%以上、望ましくは、 85%以上、より望ましくは、 90%以上保持する温度安定性を有するトレハロースホスホリラーゼを利用することが望ましい。同じ特許出願人による特開平 10—304881号公報に開示されたトレハロースホスホリラ一ゼはこのような望ましい温度安定性を有するので、本発明の実施にとりわけ有用である。

以上のような本発明の転移方法を実施すると、反応混合物中にダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移ダルク口ン酸及び Z又はダルコシル転移ダルコース 6位糖質誘導体が生成する。この発明でレ、うダルコシル転移ポリアルコールとはポリアルコールとダルコシル基が共有結合した糖化合物全般を意味する。また、この発明でいぅグノレコシル転移ダルクロン酸とはグノレクロン酸とグノレコシル基が共有結合した糖化合物を意味する。さらに、この発明でレ、うダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体とはグルコース 6位糖質誘導体とダルコシノレ基が共有結合した糖ィヒ合物全般を意味する。本発明の転移方法により生成するダルコシノレ転移ポリアルコールは、構成単位として、ポリアルコールとともに 1個のグノレコシル基を含む。また、本発明の転移方法により生成するダルコシノレ転移グノレクロン酸は、構成単位として、グルクロン酸とともに 1個のグノレコシル基を含む。本発明の転移方法により生成するダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体は、グノレコース 6位糖質誘導体の分子中にダルコシル基が存在しない場合、 1個のダルコシノレ基を含み、該分子中に 1個又は 2個以上のダルコシノレ基が存在する場合、そのグルコース 6位糖質誘導体のグノレコース基以外に 1個のダルコシル基を含む。また、本発明の転移方法により生成するダルコシノレ転移ポリアルコール、ダルコシル転移グルクロン酸、又はダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体における構成単位どうしの結合様式には、トレハロースホスホリラーゼ以外の酵素を用いる転移方法の場合には通常見出されない、本発明に特徴的な結合様式が含まれる場合がある。例えば、当該転移反応で用いるポリアルコールが炭素数 6の環状ポリアルコールのイノシトールである場合、生成するダルコシル転移ポリアルコーノレは、構成単位どうしの結合様式としてひ— 1 , ダルコシド結合を含む場合がある以上のような本発明の転移方法で生成するダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移ダルクロン酸、及び/又はダルコシル転移ダルコース 6位糖質誘導体は、目的に応じて、反応混合物そのままの状態で、あるいは、慣用の方法により所望のレベルにまで精製した状態で諸種の用途に利用することができる。したがって、本発明の転移方法は、ダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移グルクロン酸、グルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体、及び Z又はこれらダルコシル転移生成物含有物の製造方法における一工程として有利に実施できる。本発明は斯かるダルコシノレ転移ポリアルコール、ダルコシル転移ダルク口ン酸、ダルコシル転移ダルコース 6位糖質誘導体、及び/又はこれらダルコシル転移生成物含有物の製造方法を提供するものでもあり、当該製造方法は、本発明の転移方法を実施する工程と、この工程で生成したダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移ダルク口ン酸、ダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体、及び/又はこれらダルコシノレ転移生成物含有物を採取する工程を含んでなる。生成したダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移グノレクロン酸、グノレコシル転移グルコース 6位糖質誘導体、及び/又はこれらグノレコシル転移生成物含有物は、目的に応じて、慣用の方法、例えば、活性炭処理等による脱色、イオン交換樹脂処理等による脱塩、けい藻土等の助剤を用いる濾過、ィォン交換樹脂等を用いるクロマトグラフィー、エバポレーター等を用いる濃縮、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などの乾燥、水'アルコール等の適宜の溶媒中で行う結晶化などから選ばれる適宜の工程を経て採取することができる。以上のような本発明の製造方法により製造される製品は、目的に応じて、ダルコシル転移ポリアルコール、グノレコシル転移ダルクロン酸、又はグノレコシノレ転移グノレコース 6位糖質誘導体を結晶等の純粋な状態から他の成分を含む組成物に至るまでの諸種の純度で含む、粉末状、結晶粉末状、顆粒状、ブロック状、シラップ状など適宜の形状で提供される。本発明の製造方法により製造される製品は、本発明で用いられるポリアルコール、ダルクロン酸、又はグルコース 6位糖質誘導体と同様に、例えば、甘味料、難消化性甘味料、低う食性甘味料、保湿剤、澱粉老化防止剤、整腸剤、ミネラル吸収促進剤などとして健康食品 '飲料を含む飲食品分野、化粧品分野、医薬品分野、飼料分野などの諸種の分野で有利に利用することができる。また、本発明の方法で製造される製品は、その機能性を解析するための研究用試薬として利用することもでき、斯かる解析の結果に基づいて、本発明の製造方法によるダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移ダルクロン酸、グノレコシノレ転移グルコース 6位糖質誘導体、及び/又はこれらグノレコシノレ転移生成物含有物は、例えば、防腐剤、保存剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、生体機能調節剤などの各種機能剤の一成分として上記のような諸種の分野で利用できる。

[0019] 以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。

実施例 1

[0020] <ポリアルコールへのダルコシル基の転移 >

[0021] <実施例 1一 1 :トレハロースホスホリラ一ゼの調製 >

同じ特許出願人による特開平 10-304881号公報に記載された方法にしたがって、サーモアナエロビゥム 'ブロッキィ（ATCC 35047)を、トレハロースを炭素源として含む培地中で 401の培養規模で培養した。引き続き上記公報に記載の方法にしたがつて、培養物より採取した菌体を超音波破砕し、その破砕物上清を採取した。上記公報に記載のトレハロースホスホリラーゼ活性の測定法に供して、この菌体破砕物上清力 Sトレハロースホスホリラーゼ活性を示すことを確認した。

[0022] 上記の菌体破砕物上清を UF膜濃縮し、 1ml当り約 30単位のトレハロースホスホリラーゼ活性を有する酵素液 360mlを得た。このうち 300mlを、引き続き上記公報に記載の方法にしたがって、『DEAE—トヨパールゲル』 (東ソ一株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー、『ブチノレトヨノく一ノレ 650ゲノレ』（東ソ一株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、及び『ウルトロゲル AcA44』（セプラコル社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供し、 7. 5% (wZv)ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一のバンドを示すトレハロースホスホリラーゼの精製標品を得た。得られた精製標品の比活性は蛋白質 mg当り約 78単位であった。

[0023] <実施例 1一 2：トレハロースホスホリラ一ゼの作用によるポリアルコールへのダルコシル基の転移 >

下記表 1に示すポリアルコール（レ、ずれも試薬級）のいずれかを濃度 1 % (w/v)で、試薬級 -D—グルコース一 1リン酸を濃度 1 · 4% (w/v)で、実施例 1一 1で得たトレハロースホスホリラーゼを lml当り 1単位で、及び、酢酸緩衝液（ρΗ6· 0)を濃度 50 mMで含む水溶液を調製し、これを 50°Cで 24時間保持して反応させた。反応後、各溶液より一部を採取し、これを乾固した後、ピリジンに溶解して、ガスクロマトグラフィ一（以下、「GC」と略記する。）により分析した。 GCにおいて、分析カラムは『2。/₀シリコン〇V_17/クロモゾルブ』（ジ一'エル'サイエンス株式会社製）を充填したステンレスカラム（内径 3mm X長さ 2m)を用いた。キャリアーガスとして窒素ガスを用い、流量は 40ml/分とした。分析カラムの温度は、試料注入後カラムオーブンを 160°C から 320°Cまで毎分 7. 5°Cの速度で昇温するべく制御した。検出には水素炎イオン化検出器を用いた。また、トレハロースホスホリラーゼを含まないこと以外は上記の反応溶液と同じ組成の溶液を調製し、上記と同じ条件で保持した後に、それぞれ同条件での GCにより分析して、未反応のポリアルコール、ならびに j3 _D_グルコース— 1 リン酸のクロマトグラムのパターンを確認した。反応溶液の分析により得たクロマトダラムにおける新たなピークの有無によりポリアルコールへのダルコシル基の転移が起こつたか否かを判定した。また、ダルコシル転移ポリアルコールの生成量は、本 GC分析条件下におけるダルコシル転移ポリアルコールのピーク面積力未反応のポリアルコールを含む全てのピークの面積の合計値に占める割合に基づいて評価し、 60% 以上のものを「+ + +」と、 30%以上 60%未満のものを「+ +」と、そして 0%を越え 3

0%未満のものを「十」として三段階で表した。それらの結果を、グノレコシル転移ポリアルコールの GCにおける保持時間とともに表 1に示す。

[表 1]

* ：グルコシル基の転移が起こらなかったことを意味する。表 1に示すとおり、また、同じ特許出願人による特開平 10-304881号公報に記載されているとおり、ソルビトールに実施例 1_1で調製したサーモアナエロビゥム 'ブロッキイ起源のトレハロースホスホリラ一ゼを作用させた場合にはグノレコシノレ基の転移は認められな力つた。これとは対照的に、他のポリアルコールであるミオイノシトール、エリスリトール、リビトール及びグリセロールに対しては、上記トレハロースホスホリラ一ゼの作用によってレ、ずれもダルコシル基が転移したことが確認された。これらのポリアノレコーノレのうち、ミオイノシトールに対しては「+ +」と、ダルコシル基の転移が特に顕著であった。さらに、ミオイノシトールに対するダルコシル基の転移物としては、 GCにおいて 2つのピーク（GCの保持時間として 15. 4分及び 16. 6分）が認められたことから、 2種類のグノレコシル転移ミオイノシトールが生成することがわ力た。

[0026] それぞれの反応液より、ダルコシノレ転移ポリアルコールを、イオン交換樹脂を用いる調製用の高速液体クロマトグラフィーを含む糖質精製のための慣用の方法により、 G C分析において他の夾雑物のピークが観察されなレ、、実質的に単一のピークとして確認されるレベルにまで精製した。これらの精製標品を、ドウドロフ、『ザ 'ェンザィムズ (The Enzymes)』、第 5卷、アカデミック 'プレス社（1961年）、 229乃至 236頁に記載の方法に準じて、亜砒酸存在下でトレハロースホスホリラーゼを作用させ分解し、その分解物を上記の GCにしたがって分析したところ、いずれのクロマトグラムにおレ、ても、ポリアルコールと D—グルコースに相当するピーク力モル比に換算してほぼ 1 : 1に相当する面積比で確認された。この結果は、ここで得た精製標品が、いずれも、ポリアルコールとダルコシル基が 1： 1のモル比で結合したダルコシル転移ポリアルコールであることを意味している。なお、ミオイノシトールから生成した 2種類のダルコシル転移ポリアルコールとも、ミオイノシトールとダルコシル基が 1： 1のモル比で結合したダルコシル転移ポリアルコールであることから、ミオイノシトールへのダルコシル基の転移反応においては、互いに結合様式の異なる 2種類のグノレコシル転移ポリアルコールが生成してレ、ることを示してレ、る。

[0027] <実施例 1—3 :トレハロースホスホリラ一ゼの作用によるグルクロン酸及びグルコース

6位糖質誘導体へのダルコシル基の転移 >

下記表 2に示すグルクロン酸及びグルコース 6位糖質誘導体（レ、ずれも試薬級）のレ、ずれかを濃度 1 % (w/v)で、試薬級 /3—D—グルコース一 1リン酸を濃度 1. 4% (w /v)で、実施例 1—1で得たトレハロースホスホリラーゼを lml当り 1単位で、及び、酢酸緩衝液 (pH6. 0)を濃度 50mMで含む水溶液を調製し、これを 50°Cで 24時間保持して反応させた。反応後、実験例 1 - 2に記載の方法で GC分析し、実験例 1 - 2と同様に、ダルコシル転移生成物の生成量を、その GC分析におけるダルコシル転移生成物のピーク面積が、未反応のグノレクロン酸若しくはグノレコース 6位糖質誘導体のピークを含む全てのピークの面積の合計値に占める割合に基づいて評価し、 60% 以上のものを「+ + +」と、 30。/。以上 60。/。未満のものを「+ +」と、そして 0%を越え 3 0%未満のものを「 +」として三段階で表した。その結果を表 2に示す。

[表 2]

[0029] 表 2に示すとおり、グルクロン酸と、グルコース 6位糖質誘導体であるイソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースのいずれに対しても、トレハロースホスホリラーゼの作用によってダルコシル基が転移したことが確認された。とりわけ、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノース、即ち、還元末端側にグルコース残基を有し、且つ、そのダルコ一ス残基の 6位に糖質が結合したグルコース 6位糖質誘導体に対しては「 + + +」と評価され、グノレクロン酸の場合の「十」に比べてグノレコシノレ基の転移が顕著であった。加えて、トレハロースホスホリラ一ゼの作用により生成するダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体は、上記いずれのグルコース 6位糖質誘導体の場合でも実質的に 1 種類であり、本ダルコシノレ転移方法によれば、副生成物をほとんど生成しないという利点があることも判明した。

[0030] それぞれの反応液より、ダルコシル転移グルクロン酸若しくはダルコシル転移ダルコース 6位糖質誘導体を、ォクタデシルシリカゲルを用いる調製用の高速液体クロマトグラフィーを含む糖質精製のための慣用の方法により、上記の GCにおいて実質的に単一のピークとして確認されるレベルにまで精製した。これらの精製標品を、亜砒酸存在下でトレハロースホスホリラーゼを作用させ分解し、その分解物を GC分析したところ、いずれのクロマトグラムにおいても、グルクロン酸若しくはグルコース 6位糖質誘導体と D—グノレコースに相当するピーク力モル比に換算してほぼ 1 : 1に相当する面積比で確認された。また、これら精製標品の還元カをソモギー ·ネルソン法で測定したところ、いずれも非還元性であることが判明した。これらの結果は、ここで得た精製標品が、いずれも、グルクロン酸若しくはグルコース 6位糖質誘導体とダルコシル基が 1： 1のモル比で結合し、グルクロン酸の場合はその 1位がダルコシル基と結合し、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースの場合はそれらの還元末端グルコースの 1位がダルコシル基と結合したダルコシル転移グノレコース 6位糖質誘導体であることを意味している。

実施例 2

[0031] <ダルコシル転移ミオイノシトール含有シラップの製造 >

β _D_グルコース— 1リン酸を 2% (w/v)、ミオイノシトールを 10% (w/v)、及び、実施例 1—1の方法で得たトレハロースホスホリラ一ゼを 1単位 Zml含み、 pHを 6. 0 に調整した水溶液を、 60°Cで 72時間保持してミオイノシトールへのグノレコシル基の転移反応を行った。その後、反応液を常法により脱色 *脱塩し、イオン交換樹脂を用レ、るカラムクロマトグラフィーにより分画した。各画分の一部を常法により分析し、上記の反応で生成したいずれかのグノレコシノレ転移ミオイノシトールの固形分当たりの含量が、反応液における場合と比較して相対的に高まった画分を合一した。合一した画分を濃縮して、固形分濃度約 72%のダルコシノレ転移ミオイノシトール含有シラップを得た。本シラップの一部を実施例 1-2に記載の GCで分析し、その結果得られたクロマトグラムにおけるピーク面積に基づいて計算したところ、本シラップにおける固形物質量当たりの全ダルコシル転移ミオイノシトールの含量は約 60%と見積もられた。

[0032] 本品は、甘味料、難消化性甘味料、低う食性甘味料、保湿剤、澱粉老化防止剤、整腸剤などとして、健康食品 ·飲料を含む飲食品分野、飼料 ·餌料分野、化粧品分野、医薬品分野などの諸種の分野で有利に利用できる。実施例 3

[0033] <ダルコシル転移グルクロン酸含有シラップの製造 >

トレハロースを 20% (w/v)、リン酸二カリウム—クェン酸緩衝液（pH6. 0)を 10mM 、グノレクロン酸ナトリウム塩を 2% (wZv)、及び、実施例 1—1の方法で得たトレハロースホスホリラーゼを 20単位/ ml含む水溶液を調製し、これを 55°Cで 96時間保持してグノレクロン酸へのダルコシノレ基の転移反応を行った。その後、反応液を常法により脱色し、イオン交換樹脂へ吸着させた後、希塩酸にて溶出し、イオン交換樹脂を用レ、るカラムクロマトグラフィーにより分画した。各画分の一部を常法により分析し、ダルコシル転移グルクロン酸含有画分を合一した。合一した画分を中和した後濃縮して、固形分濃度約 60%のダルコシノレ転移グルクロン酸含有シラップを得た。本シラップの一部を実施例 1一 2に記載の GCで分析し、その結果得られたクロマトグラムにおけるピーク面積に基づいて計算したところ、本シラップにおける固形物質量当たりのグルコシル転移ダルクロン酸の含量は約 70 %と見積もられた。

[0034] 本品は、酸味料、甘味料、保湿剤、ミネラル安定化剤などとして、健康食品 '飲料を含む飲食品分野、、飼料'餌料分野、化粧品分野、医薬品分野などの諸種の分野で有利に利用できる。

実施例 4

[0035] <ダルコシル転移イソマルトース含有シラップの製造 >

トレハロースを 20% (w/v)、リン酸二カリウム一クェン酸緩衝液（ρΗ6· 0)を 5mM、イソマルトースを 20% (w/v)、及び、実施例 1_1の方法で得たトレハロースホスホリラーゼを 10単位/ ml含む水溶液を調製し、これを 60°Cで 72時間保持してイソマルトースへのダルコシル基の転移反応を行った。その後、反応液を常法により脱色 ·脱塩し、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより分画した。各画分の一部を常法により分析し、上記の反応で生成したグノレコシノレ転移イソマルトースの固形分当たりの含量が、反応液における場合と比較して相対的に高まった画分を合一した。合一した画分を濃縮して、固形分濃度約 72%のグノレコシル転移イソマルトース含有シラップを得た。本シラップの一部を実施例 1一 2に記載の GCで分析し、その結果得られたクロマトグラムにおけるピーク面積に基づいて計算したところ、本シラップにおける固形物質量当たりのダルコシノレ転移イソマルトースの含量は約 50%と見積もられた。

[0036] 本品は、甘味料、難消化性甘味料、杭う食性甘味料、保湿剤、澱粉老化防止剤、整腸剤などとして、健康食品 '飲料を含む飲食品分野、化粧品分野、医薬品分野、飼料分野などの諸種の分野で有利に利用できる。

産業上の利用可能性

[0037] 以上説明したとおり、本発明は、トレハロースホスホリラ一ゼがイノシトール、リビトーノレ、エリスリトール、グリセロール、グルクロン酸、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースに極めて効率的にダルコシル基を転移する作用を有するという、本発明者等による全く独自の発見に基づくものである。本発明の転移方法によれば、従来知られていなかった、又は従来稀少とされてきたダルコシル転移ポリアルコール、ダルコシル転移グルクロン酸、及びダルコシル転移グノレコース 6位糖質誘導体を工業的規模で製造することが可能である。本発明の転移方法を利用して製造されるグノレコシノレ転移ポリアルコール含有物、ダルコシル転移グルクロン酸含有物、及びダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体含有物は、健康食品 ·飲料を含む飲食品分野、飼料 ·餌料分野、化粧品分野、医薬品分野、研究用試薬分野などの諸種の分野で有利に利用できる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。

Claims

請求の範囲

[1] 構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、イノシトール、リビトール、エリスリトール及びグリセロール力、ら選ばれる 1種又は 2種以上のポリアルコールとにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするポリアルコールへのダルコシル基の転移方法。

[2] 構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、グノレクロン酸及び Z又はその塩とにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルクロン酸及び/又はその塩へのダルコシル基の転移方法。

[3] 構成糖としてグルコースを含む糖化合物と、イソマルトース、ゲンチビオース、メリビオース、イソマルトトリオース及びイソパノースから選ばれる 1種又は 2種以上のダルコース 6位糖質誘導体とにトレハロースホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルコース 6位糖質誘導体へのダルコシル基の転移方法。

[4] 構成糖としてグルコースを含む糖化合物が、 i3 _D グルコース 1 リン酸及び/ 又はその塩であるか、又はトレハロースである請求項 1乃至 3のいずれかに記載のグノレコシル基の転移方法。

[5] トレハロースホスホリラ一ゼ力 pH7. 0、 60°Cの条件下で 1時間保持したときトレハロースをカロリン酸分解する活性を 80%以上保持する温度安定性を有するものである請求項 1乃至 4のいずれかに記載のダルコシル基の転移方法。

[6] トレハロースホスホリラーゼカ S、サーモアナエロビゥム 'ブロッキィ起源の天然型もしくは組換え型酵素である請求項 1乃至 5のいずれかに記載のダルコシノレ基の転移方法

[7] 請求項 1、 4乃至 6のいずれかに記載のポリアルコールへのダルコシル基の転移方法によりダルコシル転移ポリアルコールを生成させる工程と、生成したダルコシル転移ポリアルコール及び z又はダルコシル転移ポリアルコール含有物を採取する工程とを含むダルコシル転移ポリアルコール及び/又はダルコシル転移ポリアルコール含有物の製造方法。

[8] 生成したダルコシル転移ポリアルコール及び/又はダルコシル転移ポリアルコール含有物を、脱色、脱塩、濾過、濃縮、クロマトグラフィー、乾燥及び結晶化から選ばれる 1種又は 2種以上を含む工程を経て採取する請求項 7記載のダルコシル転移ポリアルコール及び/又はダルコシル転移ポリアルコール含有物の製造方法。

[9] 請求項 2、 4乃至 6のいずれかに記載のグルクロン酸及び/又はその塩へのダルコシノレ基の転移方法によりグノレコシノレ転移グノレクロン酸及び Z又はその塩を生成させる工程と、生成したグノレコシノレ転移グノレクロン酸及び Z又はその塩、及び Z又はグルコシル転移グルクロン酸及び z又はその塩含有物を採取する工程とを含むダルコシル転移ダルク口ン酸及び/又はその塩、及び/又はダルコシル転移ダルク口ン酸及び/又はその塩含有物の製造方法。

[10] 生成したダルコシル転移グルクロン酸及び/又はその塩、及び/又はダルコシノレ転移ダルクロン酸及び Z又はその塩含有物を、脱色、脱塩、濾過、吸着、イオン透析

、濃縮、クロマトグラフィー、乾燥及び結晶化から選ばれる 1種又は 2種以上を含むェ程を経て採取する請求項 9記載のダルコシル転移ダルクロン酸及び Z又はその塩、及び/又はダルコシノレ転移グノレクロン酸及び/又はその塩含有物の製造方法。

[11] 請求項 3乃至 6のいずれかに記載のグルコース 6位糖質誘導体へのダルコシル基の転移方法によりグノレコシノレ転移グノレコース 6位糖質誘導体を生成させる工程と、生成したグノレコシノレ転移グノレコース 6位糖質誘導体及び/又はグノレコシル転移ダルコース 6位糖質誘導体含有物を採取する工程とを含むグノレコシノレ転移グノレコース 6位糖質誘導体及び/又はダルコシル転移グルコース 6位糖質誘導体含有物の製造方法。

[12] 生成したダルコシノレ転移グノレコース 6位糖質誘導体及び/又はグノレコシノレ転移グルコース 6位糖質誘導体含有物を、脱色、脱塩、濾過、吸着、イオン透析、濃縮、クロマトグラフィー、乾燥及び結晶化から選ばれる 1種又は 2種以上を含む工程を経て採取する請求項 11記載のグノレコシノレ転移グノレコース 6位糖質誘導体及び Z又はグノレコシル転移グルコース 6位糖質誘導体含有物の製造方法。