WO2005071105A1 - An essential hypertension associated gene and the detecting method and the usage thereof - Google Patents

An essential hypertension associated gene and the detecting method and the usage thereof Download PDF

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WO2005071105A1
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essential hypertension
detecting
gene
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Dongfeng Gu
Dongliang Ge
Hongfan Li
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Fu Wai Hospital Chinese Academy Of Medical Sciences
Sinogenomax Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a disease-related gene, and particularly to a gene related to essential hypertension.
  • the present invention also relates to a mutated ⁇ -1 adrenergic receptor gene, a detection method and use thereof.
  • the invention also relates to a method for predicting the relative risk of essential hypertension in vitro and a kit for detecting an ⁇ -1A adrenergic receptor gene.
  • the present invention finally relates to the application of the above-mentioned mutant gene, detection method, and method for predicting the relative risk of primary hypertension in vitro in the prevention, diagnosis, or treatment of primary hypertension. Background technique
  • Hypertension is a common and frequently-occurring disease that endangers human health. Coronary heart disease and stroke caused by it have become the leading cause of human death. There is an urgent need for effective methods and drugs that can prevent, diagnose or treat primary hypertension. Although humans have invested a lot of human and material resources in the research of hypertension, the pathogenesis of hypertension has not been fully clarified so far. Previous epidemiological and clinical studies have shown that hypertension has a clear tendency to cluster in families, indicating that hypertension is closely related to genetic factors. From the perspective of molecular biology, some gene structural abnormalities and / or abnormal expressions are the root cause of hypertension. Among them, gene mutation, gene translocation and abnormal gene regulation play a considerable role. It is now thought that abnormal renin gene, angiotensin, angiotensin-converting enzyme gene and proto-oncogene may be related to the formation of high blood pressure.
  • beta receptors There are two types of receptors that can bind to catecholamines (including norepinephrine, epinephrine, etc.).
  • ⁇ -adrenergic receptor a-adrenergic receptor
  • beta-adrenergic receptors beta-type adrenergic receptors or known as beta-type adrenergic receptors (referred to as beta receptors).
  • the smooth muscle effects produced by the combination of catecholamines and alpha receptors are mainly excitatory, including vasoconstriction, uterine contraction, iris radial muscle contraction, etc .; but there are also inhibitory, such as small intestinal relaxation; some effectors only have alpha receptors, Some have only beta receptors, and some have both alpha and beta receptors.
  • Alpha receptors are divided into 03 ⁇ 4 and (3 ⁇ 4) subtypes, which are determined according to the selective action of different receptor blockers.
  • prazosin can selectively block the receptor
  • yohimbine can selectively block the ⁇ 2 receptor
  • phentolamine has a blocking effect on both the receptor and the receptor, but the effect on the receptor is more than
  • the effect on the ⁇ 2 receptor is 3-5 times greater.
  • the alpha receptors of the presynaptic membrane are different from the alpha receptors of the posterior membrane, the former being an alpha 2 type and the latter being a type.
  • Alpha-1 adrenergic receptors are members of the G protein-coupled receptor superfamily, which activates mitosis and regulates growth and proliferation in a variety of cells.
  • ⁇ -1-ARs Alpha-1 adrenergic receptors
  • ⁇ -1A- adrenergic receptor ⁇ -1 ⁇ - adrenergic receptor; adrenergic, ⁇ -1 ⁇ , receptor, abbreviation: ADRA1A
  • -1C 'adrenoceptor ct-lC- adrenergic receptor; adrenergic ic, ct- 1C-, receptor
  • CX '-1 ⁇ adrenergic receptor 1 isoform ⁇ -1 ⁇ — adrenergic receptor i soform 1 ⁇ ' -1A adrenergic receptor 2 isoform ⁇ -1 ⁇ — adrenergic receptor isoform 2 ⁇ '-1A adrenal ⁇ -1A—adrenergic receptor isoform 3 ⁇ -1A adrenergic receptor isoform 3 -1A— adrenergic receptor isoform 4 -1A
  • Four transcripts were produced. These four transcripts encode proteins with different C-termini, but have similar binding characteristics to the 'gland'. An overview of selective shearing and expression, and the distribution of polymorphic positions in Chinese samples are shown in Figure 1.
  • the -1 ⁇ adrenergic receptor gene is currently identified on the human chromosome 8p22. At present, there are no mutations in the receptor gene, the relationship between the mutation in the receptor gene and essential hypertension, and the detection methods, kits, and their application prospects in forecasting and new drug development. Road. Summary of the invention
  • an object of the present invention is to provide a mutated ⁇ -1A adrenergic receptor gene. Another object of the present invention is to provide a method for detecting the alpha-1A adrenergic receptor gene of the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for predicting the risk of essential hypertension in an individual to be tested in vitro.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting a mutated ⁇ -1A adrenergic receptor gene in the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • Another object of the present invention is to provide the application of a method for detecting essential hypertension genes in the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • Another object of the present invention is to provide an in vitro method for detecting the presence of a primary hypertensive blood pressure-related gene in a test sample in the prevention, diagnosis or treatment of primary hypertension.
  • Another object of the present invention is to provide an in vitro method for predicting the risk of essential hypertension in a test subject in the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • Another object of the present invention is to provide an application of a kit for detecting ⁇ -1A adrenal pixel receptor gene in the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • the present invention provides a mutated oc -1 ⁇ adrenergic receptor gene, the nucleoside of the gene!
  • the naming principle of the C 2 547 / G polymorphic site is: In the sequence of the five exons of the ADRA1A gene shown in FIG. 1, C 2547 / G is at position 2547. In the entire genomic sequence including the intron, if the first nucleotide of the first exon is at position +1, the polymorphism is located at position +99522.
  • This polymorphism is located at position 1735 in the mRNA sequence of the ⁇ -1A adrenergic receptor type 4 isoform. ⁇ Use five exons hypothetical ligation sequences instead of naming the mRNA sequence to prevent confusion with the relative positions of polymorphisms in other mRNA isoforms. Position in the gene: This polymorphism is located in the 3 'untranslated region (UTR) of the a-1A adrenergic receptor mRNA type 4 isoform.
  • the polymorphic 5, flanking region (5, flanking region) is: "AACATTTTAGGAA", which can help find the C2547 / G locus.
  • the so-called "gene polymorphism” refers to the differences in the nucleotide sequences of individual genes in a population.
  • the polymorphic site in the present invention is a single nucleotide polymorphism (SNP) site, that is, a single nucleotide in a genomic sequence is changed; the difference in nucleotide sequence can Reflected at the DNA level or the RNA level, the ⁇ -1 A adrenergic receptor gene polymorphism of the present invention can be reflected at the DNA 7 level, the RNA? Level, preferably the leg A level, and more preferably the genomic DNA.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the ADRA1A gene is confirmed to be a related gene of essential hypertension.
  • the human chromosome region 8p22 in which ADRA1A is located and the human protozoa are obtained in 148 Han hypertension families.
  • Example 2 Scientific evidence for the linkage between essential hypertension and blood pressure levels, see Example 2; By comparing the frequency distribution of the C2547 / G polymorphism in 503 cases and 504 controls, the C2547 / G polymorphic G allele is derived The distribution of genes in the cases was significantly higher than in the control group (see Example 3); the relative risk of primary hypertension in C2547 / G polymorphic G allele carriers was significantly increased in 1007 subjects (see also Example 4); C2547 / G polymorphic G allele carriers had significantly higher systolic and diastolic blood pressure levels than C / C genotype carriers (see Example 5).
  • the present invention provides a method for detecting the mutant ⁇ -1A adrenergic receptor gene of the present invention.
  • Methods known to those skilled in the art can be used to detect the mutated cc-1A adrenaline receptor gene of the present invention.
  • direct sequencing of DNA can directly reveal sequence differences between a control gene and a gene carrying the mutation. The sensitivity of this method is greatly improved when used in combination with polymerase reaction (PCR). Act (Sanger et al., PNAS, 1977, 74: 5463-5467).
  • the nucleotide sequence may also be determined using a commercial sequencing kit or an automatic sequencer.
  • the conventional automated sequencing method uses radioactive or fluorescent labels to determine the nuclear ⁇ column.
  • Restriction fragment polymorphism analysis can also be used to detect polymorphic sites of the CC-1A adrenergic receptor gene sequence in vivo.
  • the method for detecting a polymorphic site of the ct-1A adrenergic receptor gene sequence in vitro is a combination of a polymerization reaction and a direct sequencing method.
  • RNA level corresponding to DNA The difference in the nucleotide sequence of the present invention is also reflected in the RNA level corresponding to DNA. Detection of RNA levels usually includes the following steps: (1) Extraction and purification of RM.
  • RM Extraction and purification of RM.
  • the RNA is separated from other cell components, such as DNA, proteins, and cell debris, by treating with an organic solvent such as phenol and chloroform and centrifuging. To avoid non-specific degradation, RNA purification should be performed as quickly as possible under denaturing conditions.
  • RNA end labeling To carry out the radioactive phosphate labeling of the 5 and 5 ends of RNA, there must be a 5, -hydroxyl, the cap structure must be removed with tobacco acid pyrophosphate and phosphatase, and the 5 and 5 end phosphorylated RNA must be alkaline ' ⁇ phosphoesterase Dephosphorize and inactivate this enzyme. 5.
  • Dephosphorylated RNA can be phosphorylated with T4 polynucleoside S kinase (PNK) with high specific activity.
  • PNK polynucleoside S kinase
  • PNK can transfer [ ⁇ - 32 P]-ATP [ ⁇ - 32 P]-phosphate to RNA 5, -End. Labeling the 3, -terminus of RNA [5, -32 P]-pCp is generally linked to the 3, -terminus of RNA using T4 RNA ligase. (3) RNA sequence determination. The use of RNase and S1-protected nuclease protection assays or chemical cleavage methods can detect sequence changes at specific locations, such as Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397- 4401 (1985)) 0 In addition, using a commercial sequencing kit can be measured directly RNA sequence. In the present invention, detection of position 1735 in the mRNA sequence of the type 4 isomer corresponding to the ⁇ -1A adrenergic receptor gene C2547 / G site is preferred.
  • the invention provides a method for detecting genes related to essential hypertension by the body. After a large number of experimental studies, the present invention proves that the ⁇ -1 A adrenergic receptor gene of the present invention is a related gene of essential hypertension with conclusive solid face evidence.
  • the specific evidence is as follows: In 148 Chinese families of hypertension The scientific evidence of the linkage between the human chromosomal region 8p22 in which ADRA1A is located and human essential hypertension and blood pressure levels is obtained, see Example 2; by comparing the C2547 / G polymorphism in 503 cases and 504 controls The frequency distribution shows that the distribution of C2547 / G polymorphic G alleles in cases is significantly higher than that of the control group (see Example 3); C2547 / G polymorphic G allele carriers occur in 1007 subjects The relative risk of essential hypertension was significantly increased (see Example 4); C2547 / G polymorphic G allele carriers had significantly higher systolic and diastolic blood pressure levels than those of C / C genotype carriers (see Implementation Example 5).
  • the present invention provides a method for detecting genes related to essential hypertension in vitro, which method comprises detecting a polymorphism of an ⁇ -1A adrenergic receptor gene C2547 / G site.
  • any method for detecting the polymorphism at the C2547 / G site of the ⁇ -1A adrenergic receptor gene may be adopted, and preferably a combination of a polymerase chain reaction and a direct sequencing method.
  • the invention also provides a method for in vitro detection of the presence of genes related to essential hypertension in a test sample, the method comprising:
  • Samples containing the genes of the invention can be obtained from cells from a subject, such as cells from blood, urine, saliva, gastric juice, hair, biopsies and autopsy materials. Especially from blood.
  • the conventional method known in the art can be used to extract the ⁇ -1A adrenergic receptor gene of the present invention.
  • C2547 / G site polymorphism can be detected by any method known to those skilled in the art for detecting ⁇ -1A adrenergic receptor gene C2547 / G site polymorphism, preferably polymerase chain reaction Combined with direct sequencing.
  • a person in the blood of an individual to be tested is first extracted, and an oc-lA adrenergic receptor gene fragment containing a C2547 / G polymorphic site is amplified by PCR, and the PCR is performed by direct sequencing. The amplified fragment was analyzed to determine whether the ⁇ -1A adrenergic receptor C2547 / G site was G.
  • the present invention further provides an in vitro method for the prediction of risk of essential hypertension test subject, the method comprising detecting in vitro a sample from an individual to be tested ⁇ _1 A adrenoceptor polymorphism C2547 / G sites,
  • the risk of primary hypertension in individuals carrying the G allele was significantly higher than that of individuals carrying the C allele.
  • the test individual is a Chinese Han nationality.
  • the method for detecting the polymorphism of the ⁇ -1A adrenergic receptor gene C2547 / G site can adopt any known detection method, preferably a combination of a polymerase chain reaction and a direct sequencing method.
  • the present invention proves that from the different aspects of the ADRA1A gene C2547 / G site, individuals carrying the G allele are at greater risk of developing essential hypertension than individuals carrying the C allele.
  • the risk of hypertension is significantly increased.
  • 148 Chinese families with hypertension have obtained scientific evidence that there is a linkage between the human chromosome region 8 ⁇ 22 in which ADRA1A is located and human essential hypertension and blood pressure levels.
  • Example 2 The frequency distribution of the C2547 / G polymorphic G allele in the cases and 504 controls was significantly higher than that in the control group (see Example 3); C2547 / G polymorphism in 1007 subjects G allele carriers have a significantly increased relative risk of developing essential hypertension (see Example 4); C2547 / G polymorphic G allele carriers have significantly higher systolic and diastolic blood pressure levels than C / C genotype carrier (Example 5).
  • the method of the present invention can be used alone, that is, detecting the polymorphism of the C2547 / G polymorphism in the sample from the individual to be tested, in order to predict in vitro that the individual is highly primary Blood pressure risk.
  • those skilled in the art know that the occurrence of essential hypertension and the result of multiple factors work together, so the present invention can also be achieved with other methods known in the art, such as Tacpan technology, SnaPshot technology, etc. Purpose of predicting the risk of hypertension in test subjects in vitro.
  • the present invention provides a kit for in vitro detection of the ⁇ -1A adrenergic receptor gene.
  • the kit may contain one or more containers, and the container is provided for detecting One or more components of the ADRA1A gene at a genetic locus. Depending on the specific detection method and polymorphism detection site, the kit may contain different components. At the same time, it can provide information about the manufacture, use, and sale of drugs or biological products that has been reviewed by government drug regulatory agencies.
  • a kit for detecting an ⁇ -1A adrenergic receptor gene in vitro is provided. The kit includes:
  • the primers for amplifying polymorphic sites can be designed according to the known nucleotide sequences of the present invention, usually 15 to 30 bases, and the GC content is about 45% to 50%. It can specifically bind to the template at the appropriate temperature, which can be designed using a special computer program, such as (Oligo 6.53 software). As shown in Example 1 of the present invention, this is a primer for amplifying the C-1547 / G site of the ex-1A adrenergic receptor gene:
  • the PCR amplified enzyme can be Tag DNA polymerization Enzymes, lenow fragments, Tth DNA polymerase, VENT DNA polymerase and other enzymes can be used for PCR amplification.
  • the reagents used to detect the C2547 / G site in the test j box vary according to the detection method.
  • the present invention provides a kit for detecting ⁇ -1A adrenergic receptor gene using PCR and direct sequencing.
  • the kit contains:
  • Reagent for detecting C2547 / G site polymorphism for example, ddNTP labeled with four fluorescent dyes, sequencing enzyme, dNTP.
  • the kit for detecting a cc-1A adrenergic receptor gene of a C2547 / G polymorphism can be used to detect a polymorphism of hypertension-related genes in vitro.
  • the invention provides an application of a mutated C-1A adrenergic receptor gene in the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension. Since the present invention shows that the mutant gene of the present invention is closely related to the occurrence and development of essential hypertension, the present invention can be used for the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • the present invention provides an application of a method for detecting a mutated ⁇ -1A adrenergic receptor gene in the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • the invention provides an application of a method for detecting genes related to essential hypertension in the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • the invention provides an in vitro method for detecting the presence of a gene related to essential hypertension in a sample to be tested, and the method is used for the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • the invention provides an application of a method for predicting the risk of primary hypertension in a test individual in vitro in the prevention, diagnosis or treatment of primary hypertension.
  • the invention provides an application of a kit for detecting the -1A adrenergic receptor gene in the prevention, diagnosis or treatment of essential hypertension.
  • Figure 1 shows the selective splicing of the ADRA1A gene. ⁇ Polymorphic position distribution in Chinese samples.
  • Figure 2 is a sequencing map of the ADRA1A gene C2547 / G polymorphic locus. Among them, Figure 2A shows the G / G genotype; Figure 2B shows the G / C genotype; and Figure 2C shows the C / C genotype. detailed description
  • a C2547 / G polymorphic amplified fragment (618 bp) was obtained using polymerase chain reaction (PCR). For each plate, 2 samples were added with the DNA template of the test sample, the control reaction, and the blank control reaction without the A sample. C2547 / G polymorphic primers and amplifications are shown in Tables 2 and 3.
  • Sequencing is performed on multiple models of DNA sequencing instruments using the recommended setting. Each plate was sequenced with 2 samples of DNA samples to be tested, a control sample, and a blank control sample without DNA samples.
  • the 3700 sequencer (PE company in the United States) can be used to easily and quickly read sequencing results.
  • flanking region (5, flanking region) "GCAAATA" can help find and read the C2547 / G polymorphic genotype.
  • the reverse sequencing result of the C2547 / G polymorphic site in Figure 2A is C, so the forward sequencing result at this site should be the G allele, and the The genotype should be the G / G genotype;
  • the C2547 / G polymorphic site in Figure 2B is bimodal, so the genotype of the test individual containing the gene should be the G / C genotype;
  • C2547 / G polymorphism in Figure 2C The result of the reverse sequencing of the genetic locus is G, so the forward sequencing result of the locus should be the C allele, and the genotype of the test individual containing the gene should be the C / C genotype.
  • Example 2 ADRAIA ⁇ chromosome region 8p22 and human essential hypertension; scientific evidence of a linkage between pressure levels
  • Example 1 The method in Example 1 was used to analyze the C2547 / G polymorphism in 1007 cases and controls, and further statistical analysis (using SAS software package, multiple logistic regression analysis), the results are shown in Table 8.
  • Example 1 The method in Example 1 was used to analyze the C2547 / G polymorphism in 525 men, and further statistical analysis (using SAS software package, multiple logist ic regression analysis), the results are shown in Table 9.
  • Table 9 Relative risk variable OR (% 95 CI) of C2547 / G polymorphisms to essential hypertension in 525 men P
  • BMI body mass index
  • triglycerides triglycerides
  • blood creatinine triglycerides
  • blood glucose values were adjusted using covariance analysis (SAS software package, ANC0VA analysis).
  • BMI body mass index
  • Covariance analysis was used to adjust BMI, triglycerides, blood creatinine, and blood glucose levels.
  • Kit for in vitro detection of alpha -1 alpha adrenergic receptor gene contains:
  • PCR amplification enzymes and corresponding buffers Tag DNA polymerase, 10X buffer, dNTP;

Description

一种原发性高血压相关基因及其检测方法和用途 技术领域
本发明涉及一种疾病相关基因， 特别地涉 发性高血压相关基因。 本发 明还涉及一种突变的 α -l 型肾上腺素受体基因及其检测方法和用途。 本发明 还涉及体外预测原发性高血压相对危险性的方法以及检测 α -1A 肾上腺素受体 基因的试剂盒。 本发明最后涉及上述突变基因、 检测方法、 体外预测原发性高 血压相对危险性的方法在原发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。 背景技术
高血压病是一种危害人类健康的常见多发病， 其引起的冠心病和脑卒现已 成为人类因病致死的首要病因。 目前迫切需要能够预防、 诊断或治疗原发性高 血压的有效方法和药物。 虽然人类为高血压的研究投入了大量的人力和物力 , ^i 今为止关于高血压的发病机理尚未完全阐明。 既往的流行病学和临床研究 表明高血压病具有明显的家族聚集倾向， 说明高血压病与遗传因素密切相关。 从分子生物学观点来看， 一些基因结构异常和 /或表达异常是高血压病的根本 原因， 其中基因突变、 基因移位和基因调控异常起着相当大的作用。 现人们认 为肾素基因异常、 血管紧张素、 血管紧张素转换酶基因和原癌基因可能与高血 压形成有关。
能与儿茶酚胺（包括去曱肾上腺素、 肾上腺素等）结合的受体有两类 ·， 一 类为 α型肾上腺素能受体或称为 α型腎上腺素受体 ( a- adrenergic receptor , 简称 α受体） ， 另一类为 β型肾上腺素能受体或称为 β型腎上腺素受体 (简称 β受体） 。 儿茶酚胺与 α受体结合产生的平滑肌效应主要是兴奋性的， 包括血 管收缩、 子宫收缩、 虹膜辐射状肌收缩等； 但也有抑制性的， 如小肠舒张； 有 的效应器仅有 α受体， 有的仅有 β受体， 有的 α和 β受体均有。 α受体区分为 0¾和（¾两个亚型， 是根据不同受体阻断剂的选择性作用来确定的。 如哌唑嗪 ( prazos in )可选择性阻断 受体， 而育亨宾（yohimbine )可选择性阻断 α2 受体； 酚妥拉明对 和 受体均有阻断作用， 但对 受体的作用比对 α2受体 的作用大 3- 5倍。 突触前膜的 α受体不同于后膜的 α受体， 前者为 α2型， 后者 为 型。
α - 1型肾上腺素受体 (α-1-ARs) 为 G蛋白耦联受体超家族成员， 可在多 种细胞中激活有丝分裂并调节生长和增殖。 目前发现有 3种 α - 1 型肾上腺素 受体亚型： a- 1A， -IB和 - 1D。 这些亚型均通过 G蛋白 Gq/11家族传导信号， 但不同亚型激活的方式不同。 其中 α - 1A 肾上月泉素受体 ( α-1Α- adrenergic receptor ; adrenergic, α-1Α , receptor , 缩写： ADRA1A ) , 另 >J名： -1C ' 上腺素受体 ( ct-lC- adrenergic receptor; adrenerg ic, ct- 1C- , receptor ) , 缩写： ADRA1C, ADRA1L1 )。 蛋白产物： 见表 1。
-1Α肾上腺素受体基因蛋白产物 4种异构体
中文 英文
CX ' - 1Α肾上泉素受体 1型异构体 α—1Α— adrenergic receptor i soform 1 α' -1A肾上腺素受体 2型异构体 α—1Α— adrenergic receptor isoform 2 α' - 1A肾上腺素受体 3型异构体 a— 1A— adrenergic receptor isoform 3 α -1A肾上腺素受体 4型异构体 a— 1 A— adrenergic receptor isoform 4 -1Α肾上腺素受体基因通过选择性剪切可产生 4种转录体。 这 4种转录 体编码的蛋白 C末端各异, 但与'腺体结合的特性相似。 选择性剪切和表达的概 况， 以及在中国人样本中的多态位置分布状况见图 1。
-1Α 肾上腺素受体基因目前确定定位在人类染色体 8p22。 目前 受体 基因变异， 受体基因变异与原发性高血压间的关系， 以及这些变异的检测方 法、 试剂盒及其在预测预报和新药开发中的应用前景， 国内外均没有专利或 4艮 道。 发明内容
针对上述问题， 本发明的一个目的是提供一种突变的 a -1 A 肾上腺素受体 基因。 本发明的另一个目的是提供一种检测本发明的吏变 α - 1 A 腎上腺素受体基 因的方法。
本发明的另一个目的是提供一种体夕卜检测原发性高血压相关基因的方法。 本发明的另一个目的是提供一种体夕卜检测待测样品中是否存在原发性高血 压相关基因的方法。
本发明的另一个目的是提供一种体外预测待测个体原发性高血压危险性的 方法。
本发明的另一个目的是提供一种体外检测 α -1Α 肾上腺素受体基因的试剂 本发明的另一个目的是提供本发明的突变的 α - 1 Α 肾上腺素受体基因在原 发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
本发明的另一个目的是提供检测突变 α -1 A 肾上月泉素受体基因的方法在原 发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
本发明的另一个目的是提供检测原发性高血压 ^目关基因的方法在原发性高 血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种体外检测待测样品中是否存在原发性高血 压相关基因的方法在原发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种体外预测待测个体原发性高血压危险性的 方法在原发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
本发明的另一目的是提供一种检测 α -1A 肾上月象素受体基因的试剂盒在原 发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。 通过大量的实验研究， 本发明提供一种突变的 oc -1 Α 肾上腺素受体基因， 该基因的核苷酉！^列与在 Genbank 中^己 ( UniGene: HS 520951, db—xref = "LocusID: 148 " ; db_xref= "MIM: 104221 " )的 α -1Α 肾上月泉素受体相比， 不同 之处在于 C2547/G多态性位点的等位基因为 G, 如 SEQ ID NO 1所示的序列为 α - 1A肾上腺素受体第 3外显子序列， C2547/G多态'生位点在该 列的第 266 位为 G,与 Genbank中登记的 α - 1A肾上腺素受体 ( Uni Gene: HS 520951, db—xref = "LocusID: 148 " ; db_xref= "MIM: 104221 " )的笫 3外显子序列的第 266位 ( C ) 是显著不同的。 C2547/G多态性位点的命名原则为： 在如图 1所示的 ADRA1A基 因 5个外显子相连后序列中， C2547/G处于第 2547位。 在包含内含子的整个基 因组序列中， 如果以第一外显子的第一个核苷酸为 +1位， 则该多态位于 +99522 位。 在 α - 1A紧上腺素受体 4型异构体的 mRNA序列中， 此多态位于第 1735位。 釆用 5个外显子假想连接序列， 而不采用 mRNA序列进行命名， 目的是为了防 止与其他 mRNA异构体中的多态的相对位置发生混淆。 在基因中的位置： 此多 态位于 a - 1A肾上腺素受体 mRNA 4型异构体的 3'非翻译区 （UTR ) 。 此多态的 5，侧翼序列（5，f lanking region )为： "AACATTTTAGGAA" , 可帮助查找 C2547/G 位点。
所谓 "基因多态性" 指的是在人群中， 各个体基因的核苷酸序列存在的差 异。本领域普通技术人员已知,本发明所述的多态性位点为单核苷酸多态性 (SNP) 位点，即基因组序列中单个核苷酸发生改变； 核苷酸序列的差异可以体现在 DNA 水平上或者 RNA水平上， 所以， 本发明的 α - 1 A肾上腺素受体基因多态性可以 体现在 DNA 7 平， RNA ? 平上， 优选腿 A水平，更优选基因组 DNA。
本发明通过大样本的统计分析， 以确凿的实 ^ 证了 ADRA1A基因为原发 性高血压的一个相关基因， 其中在 148个汉族高血压家系中得出了 ADRA1A所 在人类染色体区域 8p22 与人类原发性高血压间及血压水平间存在连锁的科学 证据， 参见实施例 2; 通过比较 C2547/G多态在 503个病例和 504个对照中的 频率分布， 得出 C2547/G多态 G等位基因在病例中的分布显著高于对照组 (参 见实施例 3 )； 在 1007名研究对象中 C2547/G多态 G等位基因携带者发生原发 性高血压的相对危险性显著升高（参见实施例 4 )； C2547/G多态 G等位基因 携带者的收缩压和舒张压水平均显著高于 C/C基因型携带者 (参见实施例 5 ) 。
本发明提供了一种检测本发明的突变 α - 1A 腎上腺素受体基因的方法。 可 以采用本领域技术人员已知的方法检测本发明的突变的 cc -lA 肾上腺素受^ ^基 因， 例如， 通过 DNA直接测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序 列差异。 当与聚合 式反应 ( PCR )结^吏用时， 这种方法的灵敏性大大提 法 ( Sanger 等人， PNAS , 1977 , 74： 5463-5467 ) 。 此夕卜， 核苷酸序列测定 也可用商业测序试剂盒或自动测序仪等。 常规的自动测序法用放射性标记或荧 光标记来确定核 Θ 列。 本领域技术人员已知， 可以用多种技术在 DNA水平上 体外检测 α - 1A 肾上腺素受体基因序列的多态性位点。 可以经与用放射性标记 的反义 RNA或 DNA探针与扩增后的 DNA序列杂交， 以鉴别,^突变。 也可以基于 已知的核苷酸顺序的改变， 合成正常的和突变的 PCR引物， 在 PCR反应的底物 中加入荧光标记的核苷酸， 根据反应产物中有无荧光出现， 确定在扩增所用的 引物中有无碱基变化， 从而检测突变。 也可以采用限制性片段多态性分析 ( RFLP )来体夕卜检测 CC -1A 肾上腺素受体基因序列的多态性位点。 在本发明的 一个实施方式中， 体外检测 ct -lA 肾上腺素受体基因序列的多态性位点的方法 为聚合 式反应与直接测序法相结合。
本发明的核苷酸序列的差异还体现在与 DNA相对应的 RNA水平上。 RNA水 平的检测通常包括以下步骤： （一） RM 的提取和纯化。 利用高浓度强变性剂 异硫氰西»可½破坏细胞结构， 使 RNA从细胞中释放出来， 同时异硫氰酸胍 和 β -巯基乙醇还能使细胞内各种 RNA酶失活。 细胞裂解后， 通过酚、 氯仿等 有机溶剂处理、 离心， 使 RNA 与其它细胞组分分离， 例如， DNA、 蛋白质和细 胞残片等。 为避免非特异性的降解， RNA的纯化要尽量快地在变性^牛下进行， 所有的材料和溶液都要严格消毒。 分子量较大的 RNA, 包括 mRNA通常都经过 反转录合成 cDNA, 然后分析其 cDNA核苷 列。 （二） RNA的末端标记。 要 对 RNA的 5，端进行放射性磷酸标记， 一定要有一个 5，-羟基， 帽子结构要用烟 草酸性焦磷酸醇和磷酸酶除去， 5，端磷酸化的 RNA要经碱 ' ±磯酸酯酶脱磷， 并 将此酶失活。 5，端脱磷的 RNA可以用高比活性的 T4多核苷 S 激酶 ( PNK )磷酸 化， PNK可以将 [ γ - 32P] - ATP的 [ γ - 32P] -磷酸转移到 RNA的 5，-末端。 对 RNA 的 3，-末端进行标记一般用 T4 RNA连接酶将 [5，- 32P] - pCp连接到 RNA的 3，-末 端。 （三） RNA序列测定。 用 RNA酶和 S1保护的核酸酶保护分析法或化学裂解 法可以检测特殊位置上的序列变化， （如 Cotton等， PNAS , 美国， 85: 4397- 4401 (1985) ) 0 此外， 也可以使用商业测序试剂盒直接进行 RNA序列测定。 在 本发明中优选与 α -1Α 肾上腺素受体基因 C2547/G位点^ "应的 4 型异构体的 mRNA序列中第 1735位进行检测。
本发明提供一种体夕卜检测原发性高血压相关基因的方法。 本发明经过大量 的实验研究， 以确凿的实脸证据证明了本发明的 α -1 A 肾上腺素受体基因为原 发性高血压的一个相关基因， 具体证据如下： 在 148个汉族高血压家系中得出 了 ADRA1A所在人类染色体区域 8p22与人类原发性高血压间及血压水平间存在 连锁的科学证据， 参见实施例 2; 通过比较 C2547/G多态在 503个病例和 504 个对照中的频率分布， 得出 C2547/G多态 G等位基因在病例中的分布显著高于 对照组 (参见实施例 3 )； 在 1007名研究对象中 C2547/G多态 G等位基因携带 者发生原发性高血压的相对危险性显著升高 (参见实施例 4 )； C2547/G多态 G 等位基因携带者的收缩压和舒张压水平均显著高于 C/C基因型携带者（参见实 施例 5 ) 。 从而, 本发明提供了一种体外检测原发性高血压相关基因的方法, 该方法包括检测 α -1Α腎上腺素受体基因 C2547/G位点多态性。 其中， 检测 α -1A 肾上腺素受体基因 C2547/G位点多态性的方法可以采用任何已知检测方 法， 优选为聚合酶链式反应与直接测序法相结合。
本发明还提供了一种体外检测待测样品中是否存在原发性高血压相关基因 的方法， 该方法包括：
1 )提取待测样品的 DNA, 针对 ct - 1A肾上腺素受体基因 C2547/G位点设计 引物进行 PCR扩增；
2 )对所述的 PCR产物进行分析；
3 )鉴定 α -1Α肾上腺素受体 C2547/G位点是否为 G。
含有本发明的基因的样品可以从来自试验者的细胞获得， 如来自血液、尿、 唾液、 胃液、 头发， 活组织检查和尸体解剖材料的细胞。 尤选来自血液。 可以 采用本领域已知的常规方法 ^ r液中提取本发明的 α - 1 Α肾上腺素受体基因。
可以采用任何本领域技术人员已知的检测 α - 1A 肾上腺素受体基因 C2547/G位点多态性的方法检测 C2547/G位点多态性， 优选为聚合酶链式反应 与直接测序法相结合。
在本发明的一个实施方式中，首先提取待测个体的血液中的 人， 利用 PCR 扩增包含 C2547/G多态性位点的 oc-lA肾上腺素受体基因片段， 利用直接测序 法对 PCR扩增片段进行分析， 鉴定 α - 1A肾上腺素受体 C2547/G位点是否为 G。
本发明还提供一种体外预测待测个体原发性高血压危险性的方法， 该方法 包括体外检测来自待测个体的样品中 α _1 A肾上腺素受体 C2547/G位点的多态 性， 其中携带 G等位基因个体患原发性高血压的危险性比携带 C等位基因的个 体患原发性高血压的危险性显著升高。 优选所述待测个体为中国汉族。 检测 α -1A 腎上腺素受体基因 C2547/G位点多态性的方法可以采用任何已知检测方 法， 优选为聚合酶链式反应与直接测序法相结合。
本发明通过大样本的统计分析， 从不同方面证明了对 ADRA1A基因 C2547/G 位点， 携带 G等位基因个体患原发性高血压的危险性比携带 C等位基因的个体 患原发性高血压的危险性显著升高。 其中在 148 个汉族高血压家系中得出了 ADRA1A所在人类染色体区域 8ρ22与人类原发性高血压间及血压水平间存在连 锁的科学证据， 参见实施例 2; 通过比较 C2547/G多态在 503个病例和 504个 对照中的频率分布， 得出 C2547/G多态 G等位基因在病例中的分布显著高于对 照组（参见实施例 3 )； 在 1007名研究对象中 C2547/G多态 G等位基因携带者 发生原发性高血压的相对危险性显著升高 （参见实施例 4 ) ； C2547 /G 多态 G 等位基因携带者的收缩压和舒张压水平均显著高于 C/C基因型携带者（实施例 5 ) 。
在本发明大样本的统计分析的 ^出上， 可以单独使用本发明的方法， 即检 测来自待测个体的样品中 C2547/G多态的多态性， 以体外预测待测个体原发性 高血压危险性。 同时， 本领域技术人员已知， 原发性高血压的发生、 发 ^^多 因素共同作用的结果,所以本发明也可以与本领域已知的其它方法，例如 Tacpan 技术、 SnaPshot技术等以达到体外预测待测个体患高血压危险性的目的。
另一方面， 本发明提供一种体外检测 α - 1A 肾上腺素受体基因的试剂盒， 所述试剂盒内可以装有一个或多个容器， 容器内装有用以检测含有 C2547/G多 态性位点的 ADRA1A基因的一种或多种组分。 按照具体检测方法及检测多态性 位点的不同， 试剂盒可含有不同组分。 与之同时提供的可以是经政府药物管理 机构审核的、 有关药品或生物制品制造、 使用及销售的信息。 在本发明 一个 实施方式中， 提供一种体外检测 α - 1A 肾上腺素受体基因的试剂盒， 该试剂盒 包含：
1 )扩增 C2547/G位点的引物；
2 ) PCR扩增酶及相应緩冲液；
3 )检测 C2547/G位点多态性的试剂。
本领域普通技术人员已知， 所述扩增多态性位点的引物， 可以依据本发明 已知的核苷酸序列设计， 通常为 15 30个碱基， GC含量为 45%- 50%左右， 在适 当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，例如 (： Ol igo 6. 53软件） 。 如本发明实施例 1所示， 才是供一种扩增 ex - 1A肾上腺素受体基因 C2547/G位点的引物：
引物 序列
正向 5' TGCTGACAGGACACATATCGG 3' ( SEQ ID NO 2 ) 反向 （同时是测序引物） 5' TTCAGTGCCCTTTGCTAAT 3' ( SEQ ID NO 3 ) 本领或普通技术人员已知， PCR扩增的酶可以为 Tag DNA聚合酶、 lenow 片段， Tth DNA聚合酶， VENT DNA聚合酶等能够用于 PCR扩增的酶。 试 j盒中 检测 C2547/G位点的试剂根据检测方法的不同而不同。 例如， 本发明提供一种 采用 PCR与直接测序相结^^外检测 α - 1A肾上腺素受体基因的试剂盒， 该试 剂盒含有：
1 ) 扩增 C2547/G位点的引物:
5， TGCTGACAGGACACATATCGG 3， ( SEQ ID NO 2 ) (正向）和
5' TTCAGTGCCCTTTGCTAAT 3， ( SEQ ID NO 3 ) (反向 （同时是测序引物） )； 2 ) PCR扩增酶及相应緩冲液： 例如 Tag DNA聚合酶， 10X緩冲液， dNTP;
3 ) 检测 C2547/G位点多态性的试剂：例如标记有四种荧光染料的 ddNTP， 测序酶， dNTP。 本发明的检测 C2547/G多态性的 cc -lA肾上腺素受体基因的试剂盒可以用 于体外检测高血压相关基因的多态性。
本发明提供一种突变的 C -1A 肾上腺素受体基因在原发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。 由于本发明以确凿的实^ i正明了本发明的突变基因与原 发性高血压的发生发展密切相关， 所以本发明可以用于原发性高血压的预防、 诊断或治疗。
本发明提供一种检测突变 α -1 A 肾上腺素受体基因的方法在原发性高血压 的预防、 诊断或治疗中的应用。
本发明提供一种检测原发性高血压相关基因的方法在原发性高血压的预 防、 诊断或治疗中的应用。
本发明提供一种体外检测待测样品中是否存在原发性高血压相关基因的方 法在原发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
本发明提供一种体外预测待测个体原发性高血压危险性的方法在原发性高 血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
本发明提供一种检测 -1A 肾上腺素受体基因的试剂盒在原发性高血压的 预防、 诊断或治疗中的应用。 附图说明
图 1为 ADRA1A基因的选择性剪切; ^中国人样本中的多态位置分布概况。 图 2为 ADRA1A基因 C2547/G多态位点基因型的测序图谱。 其中， 图 2Α显 示 G/G基因型； 图 2Β显示 G/C基因型； 图 2C显示 C/C基因型。 具体实施方式
为了更清楚地理解本发明， 现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。 实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。 实施例中未注明具体^牛的实 验方法为本领域熟知的常规方法和常规条件， 例如参见 Sambrook等人， 《分 子克隆： 实验手册》 （New York: Cold Spr ing Harbor Laboratory Pres s, 1989 ) 中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 1通过直接测序法快速检测 C2547/G多态
1. C2547/G多态扩增片断的获得
使用聚合酶链反应 (PCR)获得 C2547/G 多态扩增片断（618 bp)。 每板 PCR加待测样品 DNA模板、 对照反应以及不加讓 A样本的空白对照反应各 2例。 C2547/G多态扩增引物、 扩增" ^牛见表 2和表 3。
表 2 C2547/G多态检测引物 引物 序列
正向 5， TGCTGACAGGACACATATCGG 3， (SEQ ID NO 2 ) 反向 （同时是测序引物） 5' TTCAGTGCCCTTTGCTAAT 3， (SEQ ID NO 3) 表 3 C2547/G多态 PCR扩增体系和扩增 ^牛 扩增体系 扩增^牛
dNTP MIX 0.5 μΐ (10 mM)
引物各 0.5 μΐ (10 μΜ)
Taq 酶 0.25 μΐ (10 u/μΐ) ( Takara
5 min, 95。C, (40 s 94 °C, 30 公司）
25 μΐ s 62 °C, 1 rain 72 C; 30循
PCR buffer 2.5 μΐ
环）， 72 °C, 10 min
(Taq酶厂家轉， 10X)
赚模板 1.0 μΐ (50 ng/μΐ)
7j补至 25μ1 (19.75 μΐ )
2. 双脱氧核苷^ ^端终止法直接测序鉴定 C2547/G多态基因型
含有 C2547/G多态的 DNA片断扩增成功后， 首先使用商品 PCR产物纯化板 (例如: Millipore MultiScreen™ PCR, Millipore公司 )按照厂家推荐步骤 进行产物纯化。 纯化后的产物按照下列条件进行测序反应。 每板测序反应加待 测样品 DNA模板、对照反应以及不加 DNA样本的空白对照反应各 2例。 C2547/G 多态测序反应引物、 测序反应条件见表 4。 C2547/G多态测序反应扩增体系和扩增条件 扩增体系 扩增条件
测序反应预混液， 推荐量 （如： ΑΒΙ:
Bigdye™ 1. 2 μΐ )
测序反应 buffer IX 2 min, 96 °C, (10 s 96 °C, 5s
10 μΐ
测序引物 2. 5 mol 50V, 4 min 60°C; 35循环）
PGR产物 15 ng
水补至 10 μΐ 使用 75%和 70%的乙醇对测序反应产物进行纯化， 纯化步骤如下：
1.在每个样品管中加入 60 μ ΐ 75%乙醇， 轻微振动， 4000 rpm离心 30 min;
2.倒掉液体， 每管中加入 100 μ ΐ 70%乙醇， 4000 rpm 离心 10 min; 3.重复第 2步 1遍；
4.倒掉液体， 将样品管置于真空干燥泵中， 干燥 3- 5 min;
5.封好管口， 置于- 20 Ό冰箱中， 临测序前加入水（ 3700测序仪， 美国 PE 公司）或加样緩冲液（ 377测序仪， ABI美国应用生物系统公司）。
在多种型号的 DNA测序仪器上使用推荐 ^ t设置进行测序。 每板测序加待 测样品 DNA模板、 对照样本以及不加 DNA样本的空白对照样本各 2例。
3. C2547/G多态基因型的读取
采用 3700测序仪（美国 PE公司） ， 可方便快速地读取测序结果。
反向测序 5，侧翼序列 （5，f lanking region ) "GCAAATA" 可有助于找到 并读取 C2547/G多态基因型。
结果： 如图 2所示， 图 2A中 C2547/G多态位点反向测序结果为 C, 所以 该位点正向的测序结果应为 G等位基因， 而含有该基因的待测个体的基因型应 为 G/G基因型； 图 2B中 C2547/G多态位点为双峰， 所以含有该基因的待测个 体的基因型应为 G/C基因型； 图 2C中 C2547/G多态位点反向测序结果为 G, 所 以该位点正向的测序结果应为 C等位基因， 而含有该基因的待测个体的基因型 应为 C/C基因型。
(注： 由于测序为反向， 故读取的 C/C基因型在正向的基因序列中， 应是 G/G基因型； 反之亦然） 。 实施例 2 ADRAIA所^ 染色体区域 8p22与人类原发性高血压间; «ι 压水平间存在连锁的科学证据
方法：选取 148个汉族高血压家系，采用实施例 1中方法，采用 SAGE/SIBPAL2 软件进行连锁分析, 结果见表 5。
表 5在 148个汉族高血压家系 8p22与人类血压水平间的连锁 收缩压 舒张压
同 β SE Ρ β SE P
D8S261 520 0. 6688 0. 2328 0. 0021 0. 4792 0. 2723 0. 0395
D8S282 423 0. 0170 0. 2365 0. 4714 0. 0471 0. 4360
D8S1145 477 0. 2230 0. 2072 0. 1411 0. 1988 0. 2476 0. 2112 结论： 如表 5所示， ADRAIA所在人类染色体区域 8p22与人类原发性高血 压间 t压水平间存在连锁。 实施例 3 C2547/G多态在病例对照样本中的频率分布
1. 病例对照样本临床特征描述, 参见表 6。
表 6 病例对照样本临床特征描述
Figure imgf000013_0001
数值为均值士标准差。 NS, 无统计学意义； BMI, 体重指数。 2. C2547/G多态在病例对照样本中的频率分布
采用实施例 1中方法， 分别对上述病例（n=503 )和对照（n=504 )进行测 序分析， 并对结果进行统计分析， 结果见表 7。
表 7 C2547/G多态在病例对照样本中的频率分布
Figure imgf000014_0001
结果： 如表 7所示， C2547/G多态 G等位基因在病例中的分布显著高， 说 明 ADRA1 A基因为人类原发性高血压相关基因。 实施例 4 C2547/G多态对于原发性高血压的相对危险性
1. 研究对象中 C2547/G多态对于原发性高血压的相对危险性
采用实施例 1 中方法对 1007名病例和对照中 C2547/G多态进行分析， 并 进一步统计分析（使用 SAS软件包， 多元 logi s t ic回归分析） ， 结果见表 8。
表 8在 1007名研究对象中 C2547/G多态对于原发性高血压的相对危险性 又里 OR (°/o95 CI) P
BMI, kg/m2 1. 15 (1. 11 to 1. 19) <0. 001 甘油三酯， mmol /L 1. 20 (1. 04 to 1. 39) 0. 01
血月/ L酐， μιιιοΙ/L 1. 01 (1. 00 to 1. 02) 0. 02
唐， mmol /L 1. 12 (1. 03 tol. 22) <0. 001
C2547/G, 3. 86 (1. 63 to 9. 14) 0. 001
(G/G + G/C) vs C/C 结论： 如表 8所示， C2547/G多态 G等位基因携带者发生原发性高血压的 相对危险性显著升高。
2. 男性携带者发生原发性高血压的相对危险性
采用实施例 1中方法对 525名男性中 C2547/G多态进行分析， 并进一步统 计分析（使用 SAS软件包， 多元 logist ic回归分析） ， 结果见表 9。 表 9 在 525名男性中 C2547/G多态对于原发性高血压的相对危险性 变量 OR (%95 CI) P
^
腿， kg/m2 1. 13 (1. 08 to 1. 19) <0. 001
甘油三酯， 隱 ol/L NS
血肌酐， μηιο Ι/L 1. 02 (1. 00 to 1. 04) 0. 01
mrnol /L > - NS
5. 37 (1. 46 to 19. 79) 0. 006 结论： 如表 9所示， C2547/G多态 G等位基因男性携带者发生原发性高血 压的相对危险性升高尤其显著。 实施例 5 C2547/G多态与血压值间的相关性
1. 研究对象中 C2547/G多态与血压值间的相关性
采用国际标准方法（JVC VI, 美国国立卫生研究院）， 使用大小合适的袖带， 在静息状态下三次测量 1007 名研究对象中的血压值并取均值， 并进一步进行 与 C2547/G多态的统计分析， 结果如表 10所示。
表 10 在 1007名研究对象中 C2547/G多态与血压值间的相关性
Figure imgf000015_0001
数值为均值土标准差。 BMI, 体重指数。 为了避免其他危险因素的干扰， 使用协方差分析 ( SAS软件包， ANC0VA分析）对 BMI、 甘油三酯、 血肌酐、 血 糖值进行了调整。
结论: 如表 10所示， C2547/G多态 G等位基因携带者的收缩压和舒张压 水平均显著高于 C/C基因型携带者。 2. 男性中 C2547/G多态与血压值间的相关性
采用常规方法， 检测 525名男性中的 C2547/G多态与血压值， 并进- 行统计分析， 结果如表 11所示。
表 11 在 525名男性中 C2547/G多态与血压值间的相关性
C2547/G
C/C Ρ
n 16 + 509
收缩压， mm Hg 164. 13 ± 27. 81 143. 71 ± 32. 57 0. 007
舒^ J£, 腿 Hg 100. 00 ± 13. 13 91. 00 士 17. 35 0. 02
BMI, kg/m2 24. 53 ± 4. 06 25. 05 ± 3. 70 < 0. 001 甘油三酯， mmol /L 1. 71 ± 1. 00 1. 51 士 0· 97 0. 57
jfcf唐, mmol/L 5. 69 ± 0. 57 5. 66 士 1· 49 0. 009 数值为均值士标准差。 ΒΜΙ , 体重指数。 使用协方差分析 ( ANC0VA )对 ΒΜΙ、 甘油三酯、 血肌酐、 血糖值进行了调整。
结论： C2547/G多态 G等位基因男性携带者的收缩压和舒张压水平高于 C/C 基因型男性携带者尤其显著。 实施例 6 体外检测 α -1A肾上腺素受体基因的试剂盒
体外检测 α -1 Α肾上腺素受体基因的试剂盒， 该试剂盒包含：
1. 扩增 C2547/G位点的引物：
5， TGCTGACAGGACACATATCGG 3， ( SEQ ID NO 2 ) (正向）和
5' TTCAGTGCCCTTTGCTAAT 3' ( SEQ ID NO 3 ) (反向 （同时是测序引物） )；
2. PCR扩增酶及相应緩冲液： Tag DNA聚合酶， 10X緩冲液， dNTP;
3. 检测 C2547/G位点多态性的试剂： 标记有四种荧光染料的 ddNTP, 测 序酶， 。 应理解， 在阅读了本发明的上述描述内容之后， 本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改， 但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书 所限定的范围内。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种突变的 α -1Α 肾上腺素受体基因， 该基因的核苷酸序列与在 Genbank 中登记的 α - 1A 肾上腺素受体 UniGene: HS 520951 , db-xref = "Locus ID: 148 " ; db_xref= "MIM: 104221 "相比， 不同之处在于 C2547/G多态性 位点的等位基因为 G, 所述 C2547/G位点在 SEQ ID NO 1所示序列的第 266位 为。。
2、 如权利要求 1 所述的突变的 α -1Α 腎上腺素受体基因， 该基因为原 发性高血压病相关基因。
3、 一种检测如权利要求 1所述的突变 α -1Α肾上腺素受体基因的方法， 该方法为聚合酶链式反应与直接测序法相结合。
4、 一种体外检测原发性高血压相关基因的方法， 该方法包括检测 α -1Α 肾上腺素受体基因 C2547/G位点多态性。
5、 如权利要求 4 所述的体外检测原发性高血压相关基因的方法， 所述 检测 α -1Α腎上腺素受体基因 C2547/G位点多态性的方法为聚合 式反应与 直接测序法相结合。
6、 一种体外检测待测样品中是否存在原发性高血压相关基因的方法， 该方法包括：
1 )提取待测样品的 DNA, 针对 α -1Α肾上腺素受体基因 C2547/G位点设计 引物进行 PCR扩增；
2 )对所述的 PCR产物进行分析；
3 )鉴定 α - 1A肾上腺素受体 C2547/G位点是否为 G。
7、 如权利要求 6 所述的体外检测待测样品中是否存在原发性高血压相 关基因的方法， 其中对所述的 PCR产物进行分析的方法为聚合酶链式反应与直 接测序法相结合。
8、 一种体外预测待测个体原发性高血压危险性的方法， 该方法包括体 夕卜检测来自待测个体的样品中 α -1 A肾上腺素受体 C2547/G位点的多态性， 其 中携带 G等位基因个体患原发性高血压的危险性比携带 C等位基因的个体患原 发性高血压的危险性显著升高。
9、 如权利要求 8 所述的体外预测待测个体原发性高血压危险性的方 法， 其中检测来自待测个体的样品中 C2547/G位点的多态性的方法为聚合 式反应与直接测序法相结合。
10、 一种体外检测 C -1A 上腺素受体基因的试剂盒， 该试剂盒包含： 1 )扩增 C2547/G位点的引物；
2 ) PCR扩增酶及相应緩冲液；
3 )检测 C2547/G位点多态性的试剂。
11、 如权利要求 1或 2所述的突变的 α -1Α肾上腺素受体基因在原发性 高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
12、 如权利要求 3 所述的检测突变 (X -1A 肾上腺素受体基因的方法在原 发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
13、 如权利要求 4或 5所述检测原发性高血压相关基因的方法在原发性 高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
14、 如权利要求 6或 7所述的体外检测待测样品中是否存在原发性高血 压相关基因的方法在原发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
15、 如权利要求 8或 9所述的体外预测待测个体原发性高血压危险性的 方法在原发性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
16、 如权利要求 10所述的检测 α - 1 Α腎上腺素受体基因的试剂盒在原发 性高血压的预防、 诊断或治疗中的应用。
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