WO2005063782A1

WO2005063782A1 - アスパラギン結合型糖タンパク質コア糖鎖構造の合成

Info

Publication number: WO2005063782A1
Application number: PCT/JP2004/019384
Authority: WO
Inventors: Shinichiro Nishimura; Yasuhiro Takegawa
Original assignee: Shionogi & Co., Ltd.
Priority date: 2003-12-26
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2005-07-14
Also published as: EP1698634A4; EP1698634A1; JP4778315B2; US7598372B2; US20070166783A1; JPWO2005063782A1; CN1918174A; CN1918174B

Abstract

　アスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の３糖部分を化学的に合成する。　非常に安価なマンノースβ−１，４−結合を有する天然多糖を出発原料として利用し、マンノースのβ1→４グリコシド結合を形成させる。

Description

明細書

ァスパラギン結合型糖タンパク質コア糖鎖構造の合成

技術分野

[0001] 本発明は糖鎖化学合成の分野に属し、詳細には糖タンパク質糖鎖を簡便に化学合成するための方法およびそのための中間体に関する。

背景技術

[0002] 糖タンパク質は、糖鎖と呼ばれるオリゴ糖部分を有するタンパク質である。

近年、糖タンパク質が生体内で細胞接着や情報伝達などの生命現象に深く関わつていることが明らかにされつつあり、様々な生命現象を引き起こす糖鎖の構造が徐々にわ力つてきている。しかし、生体内で糖鎖が機能する上で発現する量は微量であり、糖鎖の化学的、物理的性質を解明するほどの量を純粋に得ることは非常に難しい糖タンパク質のひとつであるァスパラギン結合型糖タンパク質は人の血清中や卵白アルブミンなどに幅広く存在する。このァスパラギン結合型糖鎖は、糖鎖構造の分岐および構成糖の特徴から高マンノース型、複合型および混合型に分類される。これらの型はすべて、マンノース 3分子、 N—ァセチルダルコサミン 2分子からなる共通する 5 糖のコア糖鎖構造を糖鎖の還元末端側にもって、る：

[化 1]

ンパク質

ァスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコァ糖鎖構造

そのため、上記式で示されるコア糖鎖構造をィ匕学的に合成することがァスパラギン結合型糖鎖の機能を調べる上で研究の基礎となる。

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0003] しかし、このァスパラギン結合型糖鎖のコア糖鎖構造をィ匕学的に合成するための効率的な手法は未だ存在していない。その理由としては、コア糖鎖構造には化学的に合成する上で非常に困難な部分を含んでいることが挙げられる。

コア糖鎖構造の化学的合成において、マンノース βグリコシド結合構造、すなわち β -マンノグリコシド結合 (Man β l→4GlcNAc)をィ匕学的に形成させることは非常に困難である。マンノースの 2位の水酸基がアキシアル型に結合しているため、隣接基効果を利用できないこと、また j8 -マンノグリコシド結合は、糖特有のァノマー効果に対して電気的に不安定な構造をとることなどが、その理由である。非特許文献 1には )8 - マンノグリコシド結合構造の化学的合成法が記載されているが、それは非常に複雑な工程を含み、時間およびコストを必要とする。

さらに、 j8 -マンノグリコシド結合 (Man jS l→4GlcNAc)の形成が困難である理由としては、グリコシルイ匕反応時にァクセプターとなる N-ァセチルダルコサミンの反応溶媒への溶解性が低、こと、また 4位の水酸基の反応性が他の水酸基に比べて低、ことが挙げられる (水酸基の反応性： 1位》 6位 > 2位 > 3位 > 4位)。

また、ァスパラギン結合型糖鎖のコア糖鎖構造をィ匕学的に合成する際には、

GlcNAc β l→4GlcNAc構造の合成についても問題がある。

このようにァスパラギン結合型糖鎖のコア糖鎖構造をィ匕学的に合成するには、特に還元末端の 3糖 (Man j8 l→4GlcNAc j8 l→4GlcNAc)の合成力、大きな問題として残つている。より効率的に、このコア糖鎖構造を合成するためには、特に j8 -マンノグリコシド結合を効率的に合成するという問題を解決しなければならない。

[0004] 非特許文献 1 : Kunz, H. and Gunther, W. (1988) Angrew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1086-1087

課題を解決するための手段

[0005] そこで、本発明者らはマンノース残基が β 1→4結合で連なった構造を有する天然多糖、特にマンノース j8— 1, 4—結合を有するガラタトマンナン、グァガムおよびマンナンに着目した。すなわち、本発明ではコア糖鎖構造の合成において最大の難関となる 13 -マンノグリコシド結合の形成を、天然多糖の構造中に含まれる Man β 1→ 4Manの 2糖を利用して行うという新合成手法を用いることにより克服し、コア糖鎖構造の効率的合成法を確立することを目的とする。

すなわち、本発明は、ァスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の 3糖 (Man jS 1→4G1CN J8 l→4GlcN)を製造する方法において、 (1)マンノース ι8—1, 4 結合を有する多糖類、好ましくはマンノース |8—1, 4 結合を有するガラタトマンナン、グァガムおよびマンナン、さらに好ましくは、式 (V) :

[化 2]

(式中、 nは 50以上の整数）

で示されるガラタトマンナン誘導体、または、式 (VI)：

[化 3]

(式中、 nは 50以上の整数）

で示されるマンナン誘導体、を加水分解し、次いで得られた化合物の水酸基を保護することにより、式 (I) :

[化 4]

(式中、 P¹は水酸基の保護基であり、波線は OP¹基がアキシアル配置もしくはェカトリアル配置、または両配置が混在して、ることを示す）

で示されるマンノース 2糖 (ManP¹ β l—AManP¹型)ィ匕合物を製造する工程；

(2)得られたマンノース 2糖 (Manpi jS l—AManP¹型）化合物をノヽロゲン化し、次いで還元することにより、マンノース 2糖ィ匕合物における還元末端側のマンノースがグリカールに変換したグリカールイ匕合物とし、次に、

(3)得られたグリカールイ匕合物をアジドナイトレーシヨン反応に付し、還元末端側のマンノースの 2位にアジド基がェカトリアルに位置する式 (Π)：

[化 5]

(式中、 P¹は前記と同意義であり、波線は-トロ基がアキシアル配置もしくはェカトリァル配置、または両配置が混在していることを示す）

で示されるアジ化 2糖 (ManP¹ β l—AManP¹型)ィ匕合物を製造する各工程；

(4)得られたアジ化 2糖 (ManP¹ β l—AManP¹型)化合物の-トロ基を脱離基に置換し、好ましくは

(4 1)得られたアジ化 2糖 (ManP¹ β l—AManP¹型)ィ匕合物の-トロ基を OP^1G基 (式中、 P^1Gは水酸基の保護基）に置換し、 P^1Gを脱保護した後、トリハロアセトニトリルを反応させ、トリノ、ロアセトイミデート体とする力、または (4 2)得られたアジ化 2糖 (ManP¹ β l—AManP¹型)化合物の-トロ基を脱離基で置換し、次いで

(5)得られた脱離基導入体に式：

[化 6]

(式中、 P²は水酸基の保護基、 P³はァミノ保護基、 P¹¹は水酸基の保護基である) で示されるァミノ保護ダルコビラノシドを反応させ、式 (ΠΙ)：

[化 7]

(式中、 P\ P²、 P³および p¹¹は前記と同意義）

で示される 3糖 (Man iS 1—4G1CNP¹ β l→4GlcNP²型)化合物を製造する各工程: (6)得られた 3糖ィ匕合物の還元末端に保護ァスパラギンを結合させ、式 (IV)： [化 8]

(式中、 P¹および ΡΊま前記と同意義、 P⁴および P⁶は各々独立してァミノ保護基、 P⁵はカルボキシ保護基である）

で示されるァスパラギン結合型 3糖 (Man β l→4GlcNP¹ β l→4GlcNP²)化合物を製造する工程：

を含む方法、およびそれぞれの工程に力かる方法、ならびに：

本発明の方法に有用な合成中間体である式 (Π)：

[化 9]

(式中、 P¹は水酸基の保護基であり、波線は-トロ基がアキシアル配置もしくはェカトリアル配置、または両配置が混在して、ることを示す）

で示されるアジ化 2糖 (ManP^ l—AManP¹型）ィ匕合物、および

式 (III)：

[化 10]

(式中、

P²および P¹¹は水酸基の保護基、 P³はァミノ保護基である) で示される 3糖 (Man β l→4GlcNP¹ β l→4GlcNP²型)ィ匕合物：に関する。

発明の効果

[0012] 本発明は、ァスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の 3糖 (Man iS l→4GlcN |8 l→4GlcN)部分を簡便に合成できるので、様々な生命現象を引き起こすァスパラギン結合型糖タンパク質の機能および構造特性を解明するのに有用である。

発明を実施するための最良の形態

[0013] 本発明のコア糖鎖構造の新合成手法の概略を示すと次のとおりになる：

[化 11]

f¾ ぐ ¾^PP' ₍ マンノース — 1， 4

一結合を有する多糖類

(")

(Hi)

(式中、波線は OP¹基または-トロ基が独立してアキシアル配置もしくはェカトリアル配置、または両配置が混在していることを示す）

[0014] まず、マンノース /3—1， 4 結合を有する多糖類を酸加水分解後、ァセチル化を行い 2糖である化合物 (I)Man |8 l→4Manを得る。次に、これを化学的手法により還元末端側のマンノースをグリカールへ変換し、アジドナイトレーシヨン反応を行い、化合物（ II)に変換する。この還元末端側の 2位にアジド基がェカトリアルに位置する化合物 (II) は、コア糖鎖構造の Man iS l→4GlcNAc部分へと変換できる有用な鍵中間体である。このように、ガラタトマンナン、グァガムおよびマンナン誘導体力も得られる化合物 (I) から、コア糖鎖構造の中でも最も合成困難である Man iS l→4GlcNAc構造へ変換可能である中間体 (Π)が安価かつ大量かつ簡単に合成できる。さらに、この中間体 (Π)をグリコシルドナーとして利用することにより、コア糖鎖構造の還元末端の 3糖 (Man |8 1 →4GlcNAc β l→4GlcNAc)に容易に変換できる 3糖構造の化合物 (ΙΠ)を合成する事ができる。このようにして、非常に安価な天然多糖を利用することにより、コア構造の還元末端の 3糖の合成を簡略ィ匕することに成功した。

[0015] 次に本発明方法の各工程について詳細に説明する。

工程 (1) :

工程 1はマンノース j8— 1, 4 結合を有する多糖類力もマンノース 2糖 (ManP^ 1→ AManP¹型)化合物 (I)を製造する。まず、マンノース β 1, 4 結合を有する多糖類を加水分解し、次いで水酸基を保護し、そして目的の 2糖を分離する。

出発原料であるマンノース j8—l, 4—結合を有する多糖類としては、好ましくはマンノース β—1, 4-結合を有するガラタトマンナン、グァガムおよびマンナンを使用し、さらに好ましくはさらに好ましくは、式 (V) :

[化 12]

(式中、 ηは 50以上の整数）

で示されるガラタトマンナン誘導体、または、式 (VI)：

[化 13]

(式中、 ηは 50以上の整数）

で示されるマンナン誘導体を使用する。

[0016] ガラタトマンナン（galactomannnan)誘導体（ガラタトマンノグリカン（

galactomannoglycan)とも呼ばれる）は、マメ科植物の種子をはじめとし、アルファルファゃクローノ一の実などに広く存在する。グァーノレ guar, Cyamopsis tetragonolobus )やイナゴマメ（carobまたは locust bean, Ceratonia siliqua)の実のガラタトマンナンは植物ガム製品として市販されて、る。グァ一種子から取れる「グァガム」は、マンノースが 13 1→4結合で連なった直鎖状の糖鎖にマンノース 1残基毎にガラクトースが a 1→6結合で分岐している天然多糖である。この物質の用途はほとんどが食品添加物であり、様々な缶詰製品の増粘剤として、食品の品質保持 (型崩れ防止)や味の緩和剤として用いられており、簡単に入手可能かつ非常に安価である。

マンナン (mannan)誘導体は、 D マンノース力構成される多糖の総称である。ゾゥゲヤシの種子胚乳、ラン科植物の球根などに含まれる植物マンナンは D マンノース残基が β 1→4結合で連なった直鎖構造を有し、水に難溶である。

これらは詳細には、「地域生物資源活用大辞典」藤卷宏編（1998)農山漁村文化協会、 Y. C. Lee, et al. (1977) Analytical Biochem., 79, 329-337および Shiryo Yaga, et al. (1995) Mokuzai Gakkaishi, vol41, No 4, 440- 443に記載されている。

マンノース j8— 1, 4 結合を有する多糖類の加水分解は通常、酸加水分解を行う。それには、通常、硫酸、好ましくは 10— 20%硫酸、トリフルォロ酢酸、硫酸酢酸溶液を用い、反応温度は 50— 70°Cが好ましい。

加水分解物中、 70%エタノール可溶ガラタトマンナンを分離することにより、重合度「9」以上のものを除く。一般に、重合度が高くなれば、不溶画分に残る。

[0017] 水酸基の保護には通常、糖質化学の分野で利用されるァセチル基、ベンジル基、 4ーメトキシベンジル基、ベンゾィル基、メトキシメチル基、テトラヒドロビラニル基、トリメチルシリル基、トリェチルシリル基などである。

[0018] 2糖の分離は通常、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、および Zまたは高速液体ク口マトグラフィ一により行う。

[0019] 工程 2 :

工程 2はマンノース 2糖 (ManP¹ β l—AManP¹型）化合物（I)からグリカール化合物を製造する。まず、 2糖化合物の還元末端側マンノースの 1位をハロゲン化し、還元することによりグリカールイ匕合物を製造する。

ハロゲン化は通常、ハロゲン化水素、酸ハロゲン化物等を用い、室温程度にて行う。還元は亜鉛等の金属を用いて行うが、高温は避ける。

[0020] 工程 3 : 工程 3はグリカールイ匕合物をアジドナイトレーシヨン反応に付し、還元末端側のマンノースの 2位にアジド基がェカトリアルに位置するアジ化 2糖ィ匕合物 (Π)を製造する。アジドナイトレーシヨン反応は、アジド化と-トロ化とを同時に反応させて行う。この反応により、ェカトリアルとアキシアルの混合物が生成されるので、それを分離精製することにより、還元末端側のマンノースの 2位にアジド基がェカトリアルに配置されたィ匕合物を得る。

[0021] 工程 4 :

工程 4はアジ化 2糖ィ匕合物の-トロ基を脱離基に置換する工程である。ここで使用する脱離基は、フッ素、臭素、塩素、トリクロロアセトイミデート、 4-ペンテニル、アルキルチオ (硫黄）、ァリールチオなどが一般的である。

好ましくは、アジ化 2糖ィ匕合物の-トロ基を- OP 基 (P は水酸基の保護基）に置換し、 P¹⁰を脱保護した後、トリハロアセトニトリルを反応させ、トリハロアセトイミデート体とする。またはロゲン化水素を反応させてハロゲン体を得る。あるいは、 OP 体または P^1G脱保護体は、ペンテ-ル体、ァセチルチオ体、ァリールチオ体などの脱離基導入体へと常法により変換してもよい。

[0022] 工程 5 :

工程 5は得られた脱離基導入体にアミノ保護ダルコビラノシドを反応させ、 3糖 (Man β l→4GlcNP¹ β l→4GlcNP²型)化合物を製造する。

ァミノ保護ダルコビラノシドは次のスキームに従って製造できる。

[化 14]

[0023] ァミノ保護基： P³としては通常、フタルイミド基、 tert—ブチルォキシカルボ-ル基、ベンジルォキシカルボ-ル基、ァセチル基、ベンゾィル基、ベンジル基などを利用する次いで、これを得られた脱離基導入体と酸性 (ルイス酸性)条件下、反応させる。

[0024] 工程 6 :

工程 6は、得られた 3糖ィ匕合物にァスパラギンを結合させる。ァスパラギンの結合は例えば、以下に示すスキームに従って行うことができる。

[化 15]

上記のようにして合成した 3糖を、目的タンパク質のァスパラギン残基に導入し、さらに新たな糖を付カ卩させてその糖鎖を伸長させることができる。さらにあらカ^め 3糖に対して糖鎖を伸長させた後にタンパク質に導入することもできる。

あるいは、得られたァスパラギン結合型 3糖のァスパラギンに、通常のペプチド合成化学を応用すれば、タンパク質を伸張させることができる。また、非還元末端のマンノースに通常の糖質化学を応用すれば、糖鎖を伸張させることができる。

実施例

[0026] 以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する力本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

実施例にて使用している試薬の入手先は次のとおりである。

•三晶株式会社 (食品資材部）

グァガム (Guargum)MEYPROGAT 120S

•関東ィ匕学株式会社

亜鉛粉末 (Zinc Powder)

硫酸銅 5水和物 (Co_PPer(II)Sulfate Pentahydrate (結晶粉末）

セリウム (IV)ジアンモニゥム二トレー KDiammonium Cerium(IV) Nitrate)

[0027] ·和光純薬工業株式会社

齚酸ナトリウム (Sodium Acetate)

無水酢酸 (Acetic Anhydride)

トリフノレオ口酢酸 (Trifluoroacetic Acid)

アジ化ナトリウム (Sodium Azide)

1,8-ジァザビシクロ [5， 4, 0]ゥンデ力- 7-ェン (DBU、 1，8- Diazabicyclo[5, 4， 0] undec— ene

トリクロロアセトニトリル (CC1 CN、 Trichloroacetonitrile)

3

ホウ素トリフルオリドジェチルエーテノレコンプレックス (BF OEt 、 Boron Trifluoride

3 2

Diethyl Ether Complex)

酢酸 (Acetic Acid,有機合成用）

ピリジン (Pyridine,有機合成用）

テトラヒドロフラン (THF、 Tetrahydroluran,有機合成用）

ジクロロメタン (CH CI 、 Dichloromethane,有機合成用）

2 2

ァセトニトリル (Acetonitrile、有機合成用）

酢酸ェチル

クロ口ホルムトルエン

無水 MgSO

4

トリェチルァミン

[0028] •東京化成株式会社 (食品資材部）

臭化水素（30% HBr-AcOH, 30% Hydrogen Bromide in Acetic Acid)

[0029] •ナカライテスタ株式会社

ペンジノレアミン (Benzylamine)

[0030] •日本アルコール販売株式会社

99%エタノール

[0031] 実施例 1

1.グァガムの加水分解および Man jS l→4Manの単離

合成スキーム（1)

[化 17]

Guargum (1 ) 200g(large scale)

2.0q(small scale)

e)

Insolble Galactomannan

in 70%EtOH(3)

[0032] 1. 1.グァガムの加水分解 (少量スケール）

(A) グァガムをトリフルォロ酢酸 (TFA)で酸加水分解し、 70%エタノール可溶ガラクトマンナン ( aiact omannan)をネ守る。

グァガム (l)2.0gを IN TFA 16.6mlに溶解させ、オイルバス中で 110°Cに加熱しながら、 90分間スターラーを用いて撹拌した。反応溶液を、 40mLの 99%エタノールに加え、室温で静置すると、白い粉末が沈殿してくるのでブフナー漏斗を用いてろ過を行い、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をトルエンで数回共沸させ、 70%エタノール可溶のガラタトマンナン (2) 2.26gと、 70%エタノール不溶物のガラタトマンナン (3) 73mg を得た。

この 70%エタノール可溶のガラタトマンナン (2)を MALDI-TOFMSにより測定したところ重合度 1から 8まで分解されて、ることを確認した。

[0033] (B) 70%エタノール可溶のガラタトマンナンをァセチル化し、 0-(2,3,4,6-テトラ- 0-ァセチル- β - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 1 ,2,3,6-テトラ- 0-ァセチル- at -and β - D- マンノピラノシド (4)を得る。

得られた 70%エタノール可溶のガラタトマンナン（2)2.26gをピリジン 23mlに溶解させ、氷冷中で無水酢酸 23mlを加え、 10°Cで 22時間撹拌させた。反応溶液に氷水をカロえ、クロ口ホルムを用いて抽出し、水、 NaHCO水溶液、 NaCl水溶液の順で洗浄をし

3

た後、無水 MgSOを用いて乾燥させた。セライト濾過を用いて MgSOを取り除き、濾

4 4

液を減圧下で濃縮した。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶出液；トルエン/酢酸ェチル = 2: 1)を用いて分離精製し、目的物 (4)を 450mg得た。

試料 α : β = 2: 1混合物； [ a lD-0.5 (c 0.012,クロ口ホルム)； ' NMR δ (CDC1 )

3

1.99一 2.19 (all s, 24H, 8COCH ), 3.64 (m, 1H, H- 5'), 3.77 (m, 1/3H, H- 5 j8 ),3.95

3

—4.13 (m, 2 + 2/3H, H- 5 a , H~4 β , H~4 a and H- 6'b), 4.23—4.37 (m, 3H, H-6b β , H-6a a , H— 6b a , H— 6a' and H— 6a β ) , 4.72 (d, 1/3H, ] ^β = 1.1Hz, H- 1 l'，2'

β '), 4.75 (d, 2/3H, J " =1.1 Hz, H- 1 a '), 5.04 (m, 1H, H- 3'), 5.17— 5.25 (m,

1', 2'

2H, H-4', H-2 a and H-3 β ), 5.39— 5.45 (m, 2H, H— 2', H— 2 β and H— 3 a ), 5.81 (d, 1/3H, =1.1 Hz, H- 1 j8 ), 6.03 (d, 2/3H, J^a =2.0 Hz, H— 1 a ).

1, 2 1, 2

理論値 (C H O として): C, 49.56; H, 5.64;実測値: C, 49.34; H, 5.67

28 38 19

HR-FAB MS[M+Na]+計算値 (C H O Naとして) 701.191 ,実測値 709.190

28 38 19

U.c； Rf = 0.30 (トルエン/酢酸ェチル = 1 : 1)

[0034] 1. 2.グァガムの加水分解 (大量スケール）

(A)' グァガムを TFAで酸加水分解し、 70%エタノール可溶のガラタトマンナンを得るグァガム (1) 200gを INトリフルォロ酢酸 (TFA) 1660mlに溶解させ、オイルバス中で 110°Cに加熱しながら、 35分間メカ-カルスターラーを用いて撹拌した。グァガムが懸濁したところで、 15分間超音波破砕を行い、 110°C下で、メカ-カルスターラーを用いて 80分間撹拌した。反応溶液を、氷水で冷却した後、 4Lの 99%エタノールにカ卩えた。室温で静置すると、白い粉末が沈殿してくるのでブフナー漏斗を用いてろ過を行い、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をトルエンで数回共沸させ、 70%エタノール可溶のガラタトマンナン (2) 200.3gと、 70%エタノール不溶物のガラタトマンナン (3) 9.9g を得た。

この 70%エタノール可溶物のガラタトマンナン (2)を MALDI-TOFMSにより測定したところ重合度 1から 8まで分解されて、ることを確認した。

[0035] (B)' 70%エタノール可溶のガラタトマンナンをァセチル化し、 0-(2,3,4,6,-テトラ- 0- ァセチル- β - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 1 ,2,3,6,-テトラ- 0-ァセチル- at -and β -D-マンノピラノシド (4)を得る。

得られた 70%エタノール可溶のガラタトマンナン（2)200.3gをピリジン 2100mLに溶解させ、氷冷中で無水酢酸 2100mlをカ卩え、 10°Cで 22時間撹拌させた。反応溶液に氷水を加え、クロ口ホルムを用いて抽出し、水、 NaHCO水溶液、 NaCl水溶液の順で洗

3

浄をした後、無水 MgSOを用いて乾燥させた。セライト濾過を用いて MgSOを取り除き

4 4

、濾液を減圧下で濃縮した。この残渣をシリカゲルクロマトグラフィー (溶出液；トルェン /酢酸ェチル = 1 :2)を用いて部分精製し、さらに中圧クロマトグラフィー (溶出液；トルェン /酢酸ェチル = 2: 1)を用いて分離精製し、目的物 (4)25.2gを得た。

[0036] 2. 0- (2,3,4,6-テトラ- 0-ァセチル- 13 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 1 ,3,6-トリ- 0- ァセチル- 2-アジド- 2-デォキシ- at -D -ダルコビラノシド (8)の合成

合成スキーム（2)

[化 18] yield 36% from (4)

yield 33% from (6)

[0037] (C) O— (2,3,4,6—テトラ— O—ァセチル— β— D—マンノピラノシル )— (1→4)— 2,3,6—トリ— Ο— ァセチル- α -D-マンノピラノシルブロミド（5)の合成

化合物 (4)2.20gを酢酸 19mlに溶解させ、氷冷中で 30% HBr-AcOHを 4.6ml加え遮光しながら室温で 150分間撹拌した。反応終結を TLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロ口ホルムを用いて抽出し、水、 NaHCO水溶液、 NaCl水溶液の順で洗

3

浄した後に、無水 MgSOで乾燥させた。セライトろ過を用いて MgSOを取り除き、ろ液

4 4

を減圧下で濃縮し、目的物 (5)を含む反応混合物を 2.21g得た。

U.c.; Rf = 0.35 (トルエン/酢酸ェチル = 1：1)

[0038] (D)O- (2,3,4,6-テトラ- 0-ァセチル- 13 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- ,3,6-ジ- 0-ァセチル- D-グリコール (6)の合成

氷冷中で、酢酸 3.8ml、水 7.6ml、酢酸ナトリウム 2.06g、硫酸銅 5水和物 0.20g、亜鉛 1.65gの順番で 3つ口フラスコに、メカ-カルスターラーを用いて撹拌しながらカロえた。次に、化合物 (5)を含む反応混合物を酢酸 7.6mlに溶かし、氷冷中で反応溶液に加え、室温で遮光しながら 4時間撹拌させた。反応終結を TLCで確認した後、反応溶液をセライトろ過を用いて亜鉛を取り除き、ろ液に氷水をカ卩え、クロ口ホルムを用いて抽出し、水、 NaHCO水溶液、 NaCl水溶液の順で洗浄した後に無水 MgSOで乾燥し

3 4 た。セライトろ過を用いて MgSOを取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフ

4

ラッシュシリカゲルクロマトグラフィー (溶出液；トルエン/酢酸ェチル = 2:1)を用いて分離精製し、目的物 (6)を 0.64g得た。

化合物 (4)からの収率： 36%·

[0039] ^JH NMR δ (CDC1 ) .200, 2.05, 2.08, 2.10, 2.12 and 2.17(all s, 18H, 6COCH ),

3 3

3.66(ddd, 1H, J =9.8Hz, J = 5.8Hz, J =12.2Hz, H— 5'), 4.05(dd, 1H, J

4', 5' 5',6a' 5',6 b' 3， 4

=6.0Hz, J =8.1Hz, H-4), 4.12(dd, 1H, J =2.6Hz, J =12.2Hz, H— 6b，)，

4, 5 5',6b' 6a'， 6b'

4.13-4.17(m, 1H, H— 5), 4.23(dd, 1H, J =5.3Hz, J =12.2Hz, H- 6b), 4.30(dd,

5,6b 6a, 6b

1H, J =5.8Hz, J =12.2Hz, H— 6a，)， 4.42(dd, 1H, J =2.9Hz, J =12.2Hz,

5，，6a， 6a，，6b， 5,6a 6a, 6b

H-6a), 4.79(dd,lH,J =6.1Hz, J =3.1Hz, H— 2), 4.86 (d, 1H, J =1.1Ηζ, H— 1'),

1， 2 2,3 ，2'

5.05 (dd'lH, J =3.4Hz, J =10.1Hz, H- 3'), 5.22 (t, 1H, J =9.8Hz,H— 4'), 5.45

2', 3' 3',4' 4',5'

(dd, 1H, J =l.lHz J = 3.4Hz, H— 2'), 5.51 (m, 1H, H— 3), 6.40 (dd, 1H, J

，2' 2'，3' 1,2

=6.1 Hz, J = 1.2Hz,H-l)

duble bond cis

¹³C NMR δ (CDC1 ) 20.5-21.0(m, 6COCH ), 61.8(C— 6), 62.5(C- 6'), 65.9(C— 4'),

3 3

68.5(C- 3 and C- 2'), 70.8(C- 3'), 72.6(C- 5'), 74.0(C-4), 74.4(C-5), 97.9(C- 1'), 99.0(C-2), 145.6(C-1), 169.5- 170.6(m, 6COCH )

3

U.c.; Rf = 0.40 (トルエン/酢酸ェチル = 1：1)

[0040] (E)O- (2,3,4,6-テトラ- 0-ァセチル- j8 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 3,6- di- 0-ァセチル- 2-アジド- 2-デォキシ a - and jS - D -ダルコビラノシル二トレート（7)の合成

化合物 (6) 510mgを脱水ァセトニトリル 5.4mlに溶かし、 20°Cに冷やし、スターラーで撹拌した。この溶液に、アジィ匕ナトリウム (NaN )89mgを加え、さらに、セリウム (IV)ジ

3

アンモ-ゥム二トレート 1.50gを 15分毎に 4回に分けてカ卩えた。反応溶液をへリウム雰囲気下、 - 20°Cで 18時間撹拌した。反応終結を TLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロ口ホルムを用いて抽出し、水、 NaHCO水溶液、 NaCl水溶液の順で洗浄

3

し、無水 MgSOで乾燥させた。セライトろ過を用いて MgSOを取り除き、ろ液を減圧下で濃縮し,目的物 (7)を含む残渣 460mgを得た。

U.c.; Rf = 0.5 0 (トルエン/酢酸ェチル = 1：1)

[0041] (F)O- (2,3,4,6-テトラ- 0-ァセチル- 13 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 1 ,3,6-トリ- 0-ァセチル -2-アジド- 2-デォキシ- at -D -ダルコビラノシド (8)の合成

化合物 (7)を含む反応混合物の残渣 460mgを酢酸 2.0mlに溶かし、酢酸ナトリウム 170mgをカ卩え、 80°Cのオイルバス中で 75分間撹拌した。反応終結を TLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロ口ホルムを用いて抽出し、水、 NaHCO水溶液、

3

NaCl水溶液の順で洗浄し、無水 MgSOで乾燥させた。セライトろ過を用いて MgSOを

4 4 取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ一 (溶出液;トルエン/酢酸ェチル = 3 : 2)を用いて分離精製し、目的物 (8)と

0- (2,3,4,6-テトラ- 0-ァセチル- 13 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 1 , 3,6-トリ- 0-ァセチル -2-アジド- 2-デォキシ- ex - D-マンノピラノシド (9)を含む残渣 360mg得た。この混合物を少量のエタノールに熱しながら溶かし、氷水で冷やしながら結晶化させた。これにより、目的物 (8)を 201mmg得た。

U.c.; Rf = 0.39 (トルエン/酢酸ェチル = 1：1)

化合物 (6)からの収率： 33%。

[0042] ^JH NMR δ (CDC1 ) 1.99, 2.05, 2.10, 2.12, 2.17 and 2.20 (all s, 21H, 7COCH ),

3 3

3.51 (dd, 1H, J =3.8Hz J = 10.5Hz, H— 2), 3.61 (ddd, 1H, J =9.9Hz, J

1, 2 2,3 4',5' 5',6a'

=5.0Hz, J = 2.8Hz, H- 5'), 3.83 (t, 1H, J =10.2Hz, H— 4), 3.99 (m, 1H, H— 5),

5', 6b' 4,5

4.12 (dd, 1H, J = 2.8Hz J = 12.3Hz, H-6b'), 4.24 (dd, 1H, J = 3.7Hz J =

5，，6b， 6a，，6b， 5,6b 6a, 6b

12.5Hz, H-6b), 4.30(dd, 1H, J =2.8Hz, J =12.5Hz, H- 6a) 4.38(dd, 1H, J

5， 6a 6a, ob 5， 6a

=2.8Hz, J = 12.5Hz, H— 6a), 4.66 (d, 1H, J = 0.6Hz, H- 1 '), 5.03 (dd, 1H, J

6a, 6b l',2 ' 2'， 3'

=3.2Hz, J = 9.9Hz, H- 3'), 5.23 (t, 1H, J = 9.9Hz, H- 4'), 5.42 (dd, 1H, J

3',4' 4',5' 1'2'

=0.6Hz, J = 3.2Hz, H-2'), 5.43 (dd, 1H, J =10.5Hz, J = 9.3Hz, H— 3), 6.24 (d,

2',3' 2, 3 3,4

1H, J = 3.8Hz, H-l)

1,2

¹³C NMR δ (CDC1 ) 20.5-20.9(m, 6COCH ), 60.3(C- 2), 61.9(C- 6), 62.2(C- 6'),

3 3

65.8(C— 4'), 68.KC-2'), 69.7(C- 3), 70.4(C- 5), 70.7(C- 3'), 72.5(C- 5'), 74.0(C-4), 89.9(C- 1), 97.5(C-1 '), 168.6- 170.4(m, 6COCH ) 理論値 (C H O として)： C, 47.20; H, 5.33; N, 6.35 ;実測値: C, 46.90; H, 5.32; N

26 35 17

6.39.

HR-FAB MS[M+H]+計算値 (C H N O として) 662.205,実測値 662.202

26 36 3 17

mp+183.5-184.0°C (エタノールから)，

U.c.; Rf = 0.39 (トルエン/酢酸ェチル = 1：1)

[0043] 3. ァリル 0- (2, 3, 4, 6-テトラ- 0-ァセチル- 13 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 0- (3:

6-ジ- 0-ァセチル- 2-アジド- 2-デォキシ- 13 - D -ダルコビラノシル )- (1→4)- 3, 6-ジ -0-ベンジル 2-デォキシ- 2-フタルイミド- 13 -D -ダルコビラノシド (13)の合成合成スキーム（3)

[化 19]

[0044] (G) O- (2,3,4,6-テトラ- O-ァセチル- β - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 3,6-ジ- Ο-ァセチル- 2-アジド- 2-デォキシ- D -ダルコビラノース（10)の合成

化合物 (8)300mgを THF 3.0mlに溶解させ、氷冷中でベンジルァミン 89 μ 1を加え、室温で 48時間撹拌した。反応終結を TLCで確認した後、反応溶液に氷水を加え、クロロホルムを用いて抽出し、水、 1N.HC1水溶液、 NaCl水溶液の順で洗浄し、無水 MgSOで乾燥させた。セライトろ過を用いて MgSOを取り除き、ろ液を減圧下で濃縮し

4 4

た。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー (溶出液；トルエン/酢酸ェチル = 3:2)を用いて分離精製し、目的物 (10)を 257mg得た。

化合物 (8)からの収率： 92%。

HR- FAB MS[M+H]+計算値 (C H N O として) 620.194 ;実測値 620.192。

24 34 3 16

U.c； Rf = 0.26 (トルエン/酢酸ェチル = 1:1)

[0045] (H) 0- (2,3,4,6-テトラ- 0-ァセチル- 13 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 3,6-ジ- 0-ァセチル- 2-アジド- 2-デォキシ- at -D -ダルコビラノシルトリクロロアセトイミデート (11)の合成

化合物 (10)85mgを CH C1 550 μ 1と CCl CN 275 μ 1に溶解させ、氷冷中で DBU 10.2

2 2 3

1を加え、室温で 2時間撹拌した。反応終結を TLCで確認した後、反応溶液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー (溶出液；トルエン/ 酢酸ェチル =2:1)を用いて分離精製し、目的物 (11)を 80mg得た。

化合物 (10)からの収率： 76%。

[0046] ^JH NMR δ (CDC1 ) 1.97, 2.02, 2.07, 2.08, 2.16 and 2.17(all s, 18H, 6COCH ),

3 3

3.56— 3.60(m, IH, H- 5'), 3.60(dd, IH, J =3.4Hz, J =10.5Hz, H— 2), 3.88(t, IH, J

1, 2 2, 3

=9.8Hz, H-4), 4.09(dd, IH, J =2.7Hz, J =12.5Hz, H— 6b，)， 4.09-4.14(m,

4, 5 5', 6b' 6a', 6b'

IH, H-5), 4.21(dd, IH, J =3.9Hz, J =12.5Hz, H- 6b), 4.33(dd, IH, J

5， 6b 6a, 6b 5， 6a

=2.2Hz, J =12.5Hz, H— 6a), 4.33(dd, IH, J , =4.9Hz, J =12.5Hz, H— 6a，)，

6a, ob 5，， 6a， 6a，， 6b，

4.69(s, IH, H- 1'), 5.01(dd, IH, J =3.4Hz, J =10.0Hz, H- 3'), 5.20(t, IH, J

2', 3' 3', 4' 4', 5'

=9.8Hz, H-4'), 5.38(d, IH, J =3.4Hz, H— 2'), 5.51(dd, IH, J =10.5Hz, J

2'， 3' 2， 3 3, 4

=9.5Hz, H-3), 6.41(d, IH, J =3.4Hz, H— 1), 8.79(s, IH, NH)

1, 2

¹³C NMR δ (CDC1 ) 20.5-20.7(m, 6COCH ), 60.8(C- 2), 61.9(C- 6), 62.3(C- 6'),

3 3

65.8(C— 4'), 68.2(C-2'), 69.3(C- 3), 70.7(C- 5 and C- 3'), 72.6(C- 5'), 74.1(C-4), 90.5(C(NH)CC1 ), 94.KC-1), 97.3(C- 1'), 160.6(C(NH)CC1 ), 169.5- 170.4(m,

3 3

6COCH )

3

U.c； Rf = 0.37 (トルエン/酢酸ェチル = 1:1)

[0047] (I)ァリル O- (2, 3, 4, 6-テトラ- O-ァセチル- j8 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- O- (3, 6-ジ- 0-ァセチル- 2-アジド- 2-デォキシ- 13 - D -ダルコビラノシル )- (1→4)- 3, 6-ジ -0-ベンジル 2-デォキシ- 2-フタルイミド- β -D -ダルコビラノシド (13)の合成化合物 (l l)47mgとァリル- O- 3, 6-0-ジ-ベンジル- 2-デォキシ- 2-フタルイミド- β - D -ダルコビラノシド (12)45mgを CH C1 700 μ 1に溶解させ、 MS4A (モレキュラーシー

2 2

ブス）を 70mg加え、窒素雰囲気下、 -20°Cで 30分撹拌した。

次に、 BF OEtを 2.3 1加え、窒素雰囲気下、 - 20°Cで 24時間撹拌した。反応終結

3 2

を TLCで確認した後、トリェチルァミン (TEA)をカ卩ぇ中和した後、セライトろ過を用いて MS4Aを取り除き、ろ液を減圧下で濃縮した。この残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー (溶出液；トルエン/酢酸ェチル = 5:2)を用いて部分精製し、目的物 (13)とァリル 0- (2, 3, 4, 6-テトラ- 0-ァセチル- j8 - D-マンノピラノシル )- (1→4)- 0- (3, 6-ジ -0-ァセチル- 2-アジド- 2-デォキシ- a - D -ダルコビラノシル )- (1→4)- 3, 6-ジ- 0-ベンジル 2-デォキシ- 2-フタルイミド- β - D -ダルコビラノシドを含む残渣 32mgを得た（ α； j8 =l :2)。さらに HPLC (溶出液;へキサン/エタノール = 12: 1)を用いて分離精製し、目的物 (13)を 21mg得た。

化合物 (11)からの収率： 31%。

JH NMR δ (CDC1 ) 1.90, 1.92, 1.96, 2.00, 2.07, 2.15(all s, 18H, 6COCH ), 3.08(m,

3 3

1H, H- 5'), 3.27(dd, 1H, J =8.1Hz, J =10.2Hz, H- 2'), 3.46(ddd, 1H, J

1', 2' 2', 3' 4", 5"

=9.9Hz, J =4.8Hz, J =2.6Hz, H— 5つ， 3.51— 3.56(m, 1H, H— 5), 3.56(t, 1H, J

5", 6a" 5", 6b" 4',

=9.8Hz, H-4'), 3.76(dd, 1H, J =1.4Hz, J =10.9Hz, H— 6b), 3.87(dd, 1H, J

5' 5， ob 6a, ob 5， 6a

=2.9Hz, J =10.9Hz, H— 6a), 3.91(dd, 1H, J=6.3Hz, J=13.0Hz, CHH'CH=CH2),

6a, ob

3.98-4.20(m, 7H, H- 6b", H- 6b'， H-4, H- 2, H- 6a'， H- 3, CHH'CH=CH2), 4.27(dd, 1H, J ' =4.8Hz, J ' =12.3Hz, H- 6aつ, 4.27 and 4.66(ABq, 2H, J=12.5Hz,

5", oa 6a", 6b

PhCH ), 4.30(d, 1H, J =8.1Hz, H- 1 '), 4.42 and 4.73(ABq, 2H, J=12.0Hz, PhCH

2 1', 2' 2

), 4.45(s, 1H, H— Γ), 4.76(dd, 1H, J =3.4Hz, J =9.9Hz, H- 3'), 4.92(dd, 1H, J

2', 3' 3', 4' 2",

=3.4Hz, J =9.9Hz, H— 3つ， 4.93(dd, 1H, J=1.5Hz, J =10.4Hz, CH=CH H),

3" 3", 4" trans trans

4.93(dd, 1H, J=1.5Hz, J =17.2Hz, CH=CHHcis), 5.06(d, 1H, J =8.4Hz, H— 1), cis 1,2

5.14(t, 1H, J =9.9Hz, H-4"), 5.30(d, 1H, J =3.4Hz, H— 2つ， 5.60(m, 1H,

i", 5" 2", 3"

CH=CH2), 6.70-7.58(m, 14H, Ar- H)

¹³C NMR δ (CDC1 ) 20.5-20.6(m, 6COCH3), 55.5(C- 2), 62.2(C- 6' and C- 6"),

3

64.5(C-2'), 65.9(C-4"), 67.8(C- 6), 68.1(C- 2"), 69.7(CH CH=CH ), 70.7(C-3"), 71.9(C-3'), 72.0(C-5'), 72.5(C-5"), 73.5 and 74.3(2PhCH2), 74.6(C'-4 and C- 5), 78.2(C-4), 97.3(C-1 and C- Γ), 100.8(C- 1'), 117.3(CH CH=CH ), 127.0-133.7(m,

2 2

18Ar-C), 137.9(CH CH=CH ), 169.6— 170.4(m, 8C=0)

2 2

HR- FAB MS[M+Na]+計算値 (C H N O Naとして).1153.375,実測値 1153.374

55 62 4 22

U.c； Rf = 0.53 (トルエン/酢酸ェチル = 1:1)

(J) (グリコシルァクセプターデータ）ァリル- 0-3, 6-ジ- 0-ベンジル- 2-デォキシ- 2- フタルイミド— j8—D—ダルコビラノシド (12)

ァミノ保護ダルコビラノシド (12)を、次の合成スキームに従って製造した。

[化 20]

yield 65%

λ NMR δ (CDCl ) 3.63(m, 1H， H- 5)， 3.76- 3.85(m， 3H， H- 4， H- 6a and H- 6b)，

3

3.97(dd, 1H， J=13.1Hz， J=6.1Hz， CHH，CH=CH )， 4.15— 4.26(m， 3H， H— 2， H— 3 and

2

CHH，CH=CH )， 4.52 and 4.73(ABq, 2H, J=12.2Hz， PhCH2), 4.58 and 4.64(ABq,

2

2H, J=11.9Hz， PhCH2), 4.99(dd, 1H， J=1.3Hz， J =10·3Ηζ， CH=CHcisH ), trans trans

5.07(dd, IH, J=1.3Hz, J =17.2Hz, CH=CH Htrans), 5.17(d, IH, J =8.1Hz, H— 1) cis cis 1, 2

5.61-5.70(m, IH, CH=CH ), 6.93— 7.67(m, 14H, Ar— H)

2

¹³C NMR δ (CDCl ) 55.3(C-2), 69.7(C- C=C), 70.7(C - 6), 73.5(C- 5), 73.8 and 74.3(Ph-C), 74.5(C-4), 78.7(C-3), 97.4(C- 1), 117.3(C- C=C), 127.4- 128.5(m, Ar-C), 133.6(C-C=C), 137.6 and 138.2(C=0)

HR-FAB MS[M+H]+計算値 (C H NOとして) 530.218,実測値 530.215

31 32 7

U.c； Rf = 0.72 (トルエン/酢酸ェチル = 1:1)

産業上の利用可能性

糖鎖において糖を新たに付加して伸張させる場合、糖転移酵素を利用すれば簡便であるため、糖鎖の自動合成は通常、付加する糖とその糖を付加するための糖転移酵素が使用される。しかし、ァスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖のコア糖鎖構造における還元末端の 3糖 (Man iS l→4GlcN |8 l→4GlcN)部分を作るための糖転移酵素は存在してヽな、。従ってその合成は化学合成法に頼らざるを得な、。

本発明は、非常に安価な天然多糖であるマンノース |8— 1, 4 結合を有するガラクトマンナン、グァガムおよび Zまたはマンナン誘導体を利用することによる、コア構造の還元末端 3糖の簡便な合成方法である。