WO2005045023A1 - 核酸の濃縮精製方法および装置 - Google Patents

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WO2005045023A1
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nucleic acids
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Satoshi Hashiguchi
Ken Inose
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Arkray Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a device that performs pre-processing of a specimen. More specifically, the present invention relates to a pretreatment device for extracting a nucleic acid to be inspected from a cell or the like in a nucleic acid test.
  • Genetic tests include identification tests for pathogenic microorganisms that are difficult to culture, detection of pathogenic microorganisms during antibiotic treatment or at the beginning of infection, detection of antigens when migration antibodies are suspected, control of the source of pathogenic microorganisms, paternity testing, etc. It is possible to perform tests that were difficult with conventional clinical tests, such as discrimination, and further, diagnosis of leukemia's solid tumor at the gene level and definitive diagnosis of genetic diseases. This method is more effective in detecting bacteria that require a longer time to culture, compared to techniques that use bacterial culture until the results are obtained. Furthermore, since DNA is stable depending on the storage conditions, it is possible to perform tests on past samples such as frozen biopsy materials and bones. In addition, genetic testing has been attracting attention in order to expand testing opportunities in tests for sexually transmitted diseases, which have been increasing in recent years.
  • Conventional methods for purifying and concentrating nucleic acids include a purification method using phenol Z, a form Z ethanol, a purification method using a column Z filter for adsorbing nucleic acids, and a purification method using magnetic silica beads. Being done.
  • nucleic acid is electrophoresed in a prepared gel, and the recovery device is moved to a position of a target nucleic acid in the gel.
  • a method for recovering a target nucleic acid by electrophoresis is known (for example, see Patent Document 1).
  • the target nucleic acid is electrophoresed on a plate-like electrophoresis gel.
  • a method is known in which the nucleic acid is recovered by inserting a recovery chip near the target nucleic acid band (see, for example, Patent Document 2).
  • the purification method using phenol Z Cloguchi form Z ethanol requires powerful chemicals because it uses powerful drugs, and the environment in which it can be used is limited. .
  • the operation is laborious and requires high-speed centrifugation, which makes automation difficult.
  • it is difficult to obtain high purification accuracy.
  • the purification method using a column Z filter that adsorbs nucleic acids is performed while the solution is flowing.Therefore, for samples with a large amount of contaminants such as debris, the column / filter may be clogged and the purification efficiency may decrease immediately. is there. Then, it is necessary to perform centrifugation or suction operation, which makes automation difficult.
  • silica may be mixed into the sample. And it is difficult to obtain a high recovery rate.
  • the conventional technique for recovering nucleic acid requires a flat plate electrophoresis gel, and the flat plate electrophoresis gel is subjected to one end of electrophoresis to obtain a target nucleic acid. It is necessary to process the gel at the corresponding position.
  • Gels used for electrophoresis may have significantly different properties depending on the process of formation that is vulnerable to impact. Therefore, generally, after performing electrophoresis, the position of the target nucleic acid in the electrophoresis gel is recognized by ultraviolet rays, and then the portion containing a large amount of the target nucleic acid is treated.
  • Patent Document 1 Japanese Utility Model Application No. 5-88296
  • Patent Document 2 JP-A-8-327595
  • nucleic acids are charged with a cationic surfactant and a nonionic surfactant, and placed in an electric field to separate and purify nucleic acids from a sample containing the contaminants, and to concentrate or concentrate the nucleic acids. Almost, it is a state.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration for nucleic acid concentration by electrophoresis in the presence of a surfactant.
  • the sample contains impurity 2 together with nucleic acid 1.
  • a surfactant is mixed into this sample.
  • As the surfactant a nonionic surfactant 3 and a cationic surfactant 4 are used.
  • the surfactant mixed in the sample adsorbs to the contaminant 2.
  • Nucleic acids and cationic surfactants can also be adjusted by adjusting the amount of home appliances with a nonionic surfactant, or by adding salts such as sodium salt and poly-ionic substances (henoline, dextran sulfate, DNA). It is possible to adjust the adsorption.
  • the contaminant 2 to which the cationic surfactant 4 has been adsorbed is charged to a positive charge. Then, the contaminant 2 to which the surfactant has been adsorbed and the nucleic acid 1 to which no surfactant has been adsorbed or which has a small amount of adsorption can be separated by electrophoresis. This makes it possible to easily remove the contaminant 2 and to concentrate the nucleic acid 1 on the specimen.
  • the electrophoresis is performed twice, so that the nucleic acid is reliably enriched.
  • excess ions in the sample are removed, and in the second electrophoresis, the nucleic acid in the sample is concentrated.
  • nonionic surfactant to be added to a specimen containing nucleic acid examples include polyoxyethylene p-t one-year-old butyl ether (Triton-based surfactant and the like), polyoxyethylene Non-ionic surfactants such as len sorbitan alkyl ester (Tween-based surfactant, etc.) and polyoxyethylene alkyl ether (Brij-based surfactant, etc.) can be used. Specifically, for example, Triton X-100, Tween- 20, Brij 35 and the like. Preferably, 1% TritonX-100 is desirable. If the cell membrane and nuclear membrane are not dissolved by the addition of the surfactant, heat treatment is performed at 96 ° C for 10 minutes after adding a nonionic surfactant.
  • cationic surfactants include zefylamine, cetyltrimethylammonium-dumchloride, cetylpyri-dimethylmethylammonium-dumchloride, and decylpyridin-dimethylchloride (DPC).
  • DPC decylpyridin-dimethylchloride
  • Pretreatment of the sample is performed in this way, a DC voltage of 100 V is applied, and electrophoresis is performed for 10 minutes to remove excess ions in the sample.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a migration tank for the first electrophoresis.
  • the electrophoresis tank 5 is provided with a sample tank 6 and a partition 9 for separating the positive electrode side and the negative electrode side.
  • the sample tank 6 penetrates the partition wall 9, and has one end protruding to the positive electrode side and the other end protruding to the negative electrode side. Both ends of the sample tank 6 are open, and the openings at both ends are closed by gels 8. Thus, a potential difference is generated in the sample tank 6 to perform electrophoresis of the contaminants to which the nucleic acid and the surfactant are adsorbed.
  • the nucleic acid After removing excess ions contained in the sample, the nucleic acid is concentrated by the second electrophoresis.
  • electrophoresis is performed by placing a sample tank into which a sample has been injected in the first electrophoresis and a recovery tank for nucleic acid connected thereto in the electrophoresis tank. .
  • FIG. 3 is a diagram showing the configuration of the electrophoresis tank for the second electrophoresis.
  • a sample tank 6, a collection tank 7, and a partition 9 for separating the positive electrode side and the negative electrode side are provided.
  • the sample tank 6 is inserted into the partition wall 9 and protrudes toward the negative electrode.
  • the recovery tank 7 is inserted into the partition wall 9 and has a configuration protruding toward the positive electrode.
  • the sample tank 6 and the collection tank 7 are connected at the portion where the partition 9 is provided, and are connected via the gel 8.
  • Both ends of the sample tank 6 are open, and the openings at both ends are closed by gels 8. Then, both ends of the recovery tank 7 are open, the negative electrode side is closed by the gel 8, and the positive electrode side is closed by the ultrafiltration membrane 11.
  • a voltage of 120 V is applied between the electrodes to perform electrophoresis for 120 minutes.
  • the nucleic acid recovery efficiency can be improved.
  • the second electrophoresis without performing the first electrophoresis.
  • the nucleic acid can be easily concentrated. Inspection Excess ions present in the body can permeate the ultrafiltration membrane and do not affect nucleic acid recovery.
  • the present invention firstly relates to a method for concentrating and purifying nucleic acids using electrophoresis, in which a charge amount is adjusted for contaminants in a sample containing nucleic acid, and then the sample is purified. Place in an electric field to concentrate and purify nucleic acids.
  • a method for concentrating and purifying nucleic acids by electrophoresis wherein a cationic surfactant and a nonionic surfactant are added to a sample containing nucleic acids to reduce the amount of charge to contaminants in the sample. Then, the sample is placed in an electric field and subjected to electrophoresis to concentrate and purify the nucleic acid.
  • the amount of charge other than nucleic acids is adjusted by the adsorption of a cationic surfactant, and the amount of the cationic surfactant adsorbed is adjusted by the amount of a nonionic surfactant added.
  • a nonionic surfactant and a cationic surfactant are added to a sample, the sample is electrophoresed, and a device for concentrating and purifying nucleic acid on the anode side is configured.
  • a nucleic acid concentration / purification apparatus for performing electrophoresis in which a container whose side surface is made of an insulator is partitioned by a conductive separator that suppresses diffusion, and a sample is put into the container A chamber and a nucleic acid recovery chamber are configured, and an end of the container is connected to an electrode via a buffer tank to form a device.
  • the present invention firstly relates to a method for concentrating and purifying nucleic acids using electrophoresis, in which a charge in a sample containing nucleic acids is adjusted, and then the sample is placed in an electric field.
  • the method of concentrating and purifying the nucleic acid is adopted, so that the behavior of the nucleic acid and the contaminant in electrophoresis is different, and the nucleic acid can be efficiently separated.
  • the difference in behavior between the contaminant and the nucleic acid can be adjusted by charging, and the behavior can be easily controlled.
  • a mechanism for performing nucleic acid concentration without using a centrifugal separator or the like can be provided outside the compartment.
  • the second is a method for concentrating and purifying nucleic acids by electrophoresis.
  • concentration of contaminants in the sample is adjusted by adding a surfactant, and the sample is subjected to electrophoresis in an electric field to concentrate and purify nucleic acids.
  • the operation is easy, and the safety of the work can be easily secured.
  • nucleic acid By increasing the amount of adsorption to the contaminant, the difference in behavior between the nucleic acid and the contaminant in electrophoresis can be increased, and the nucleic acid can be separated efficiently. Furthermore, since impurities are migrated in the opposite direction to the nucleic acid, inhibition of purification by the impurities can be prevented, and nucleic acid can be easily purified.
  • a method for concentrating and purifying nucleic acids by electrophoresis in which a cationic surfactant and a nonionic surfactant are added to a sample containing nucleic acids to reduce the amount of charge to contaminants in the sample.
  • the concentration of nucleic acid is adjusted and purified by placing the sample in an electric field and performing electrophoresis, so that the amount of cationic surfactant adsorbed is determined by the ratio of cationic surfactant to nonionic surfactant. It is adjustable and can easily adjust the behavior of contaminants in electrophoresis.
  • adsorbing a nonionic surfactant to the nucleic acid it is possible to inhibit the adsorption of the cationic surfactant to the nucleic acid.
  • the control of the amount of charge other than nucleic acid is performed by the adsorption of a cationic surfactant, and the amount of the cationic surfactant adsorbed is adjusted by the amount of a nonionic surfactant added.
  • the ratio of adsorption of the cationic surfactant and the nonionic surfactant to the contaminants can be controlled by an easy operation.
  • the charge amount of the contaminants can be adjusted by an easy operation.
  • adsorbing a nonionic surfactant to a nucleic acid it is possible to inhibit the adsorption of a cationic surfactant to the nucleic acid.
  • a non-ionic surfactant and a cationic surfactant are added to the sample, the sample is electrophoresed, and a device for concentrating and purifying nucleic acid on the anode side is configured. Since the nucleic acid in the sample can be purified and the behavior of the nucleic acid can be controlled, the concentration and purification device can be made compact while maintaining safety.
  • a nucleic acid concentration and purification apparatus for performing electrophoresis the inside of a container having a side surface made of an insulator is partitioned by a conductive separator for suppressing diffusion, and a sample is put into the container. Chamber and a nucleic acid recovery chamber, and the ends of the container are connected to the electrodes via buffer tanks, respectively. Since the connected devices are configured, it is possible to configure a concentration and purification device with a simple configuration, reduce the cost for manufacturing, and configure a device that is easy to control and highly secure. is there.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of nucleic acid concentration by electrophoresis in the presence of a surfactant.
  • FIG. 2 is a diagram showing a configuration of a migration tank for first electrophoresis.
  • FIG. 3 is a diagram showing a configuration of a migration tank for the second electrophoresis.
  • FIG. 4 is a diagram showing a configuration of a first electrophoresis tank.
  • FIG. 5 is a diagram showing a configuration of a second electrophoresis tank.
  • [6] A perspective view showing a configuration of a sampling unit.
  • FIG. 7 is a plan view of a sampling unit.
  • FIG. 8 is a side view of a sampling unit.
  • FIG. 9 is a side sectional view of a sampling unit.
  • FIG. 10 is a perspective view of a connection portion.
  • FIG. 13 is a view showing an assembling configuration of a separation unit.
  • FIG. 15 is a diagram showing an overall configuration of an electrophoresis apparatus.
  • FIG. 16 is a perspective view of an electrophoresis unit.
  • FIG. 17 is a side sectional view of the electrophoresis unit.
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing the first half of the purification process using an electrophoresis unit.
  • FIG. 20 is a side sectional view showing an assembling configuration of the electrophoresis unit.
  • FIG. 21 is a perspective view of the same.
  • FIG. 22 is a diagram showing a configuration of a first block.
  • FIG. 23 is a diagram showing a configuration of a second block.
  • FIG. 24 is a front view of a packing.
  • FIG. 25 is a view showing a comparison result in purification of a gonococcal genome.
  • FIG. 26 is a view showing a gel obtained by electrophoresis of a sample showing the results of DNA concentration.
  • FIG. 4 is a diagram showing a configuration of the first electrophoresis tank.
  • the electrophoresis tank 21 is divided into a negative electrode side tank 22 and a positive electrode side tank 23 by partition walls 24 and 25.
  • the partition walls 24 and 25 are provided at the center of the electrophoresis tank 21, and the sample units 26 are mounted on the partition walls 24 and 25.
  • the sample unit 26 has a configuration in which one end protrudes to the negative electrode side tank 22 and the other end protrudes to the positive electrode side tank 23.
  • the negative electrode side of the sample unit 26 is filled with gel, and an injection hole for sample injection is formed on the side surface. The injection hole is closed by a stopper during electrophoresis.
  • the negative electrode is inserted into the negative electrode side tank 22
  • the positive electrode is inserted into the positive electrode side tank 23
  • a voltage is applied to the electric swimming tank 21.
  • FIG. 5 is a diagram showing a configuration of the second electrophoresis tank.
  • the electrophoresis tank 21 is separated from the negative electrode side tank 22 and the positive electrode by the partition walls 24 and 25. It is divided into side tub 23.
  • the partitions 24 and 25 are disposed in the center of the electrophoresis tank 21, and the separation units 32 are mounted on the partitions 24 and 25.
  • the separation unit 32 has one end protruding into the negative electrode side tank 22 and the other end protruding into the positive electrode side tank 23. Then, a negative electrode is inserted into the negative electrode side tank 22, a positive electrode is inserted into the positive electrode side tank 23, and a voltage is applied to the electrophoresis tank 21.
  • the separation unit 32 is configured by connecting three members, and includes a sampling unit 26, a connection unit 33, and a filtration unit 34.
  • a ring is attached between the sampling unit 26 and the connection part 33 and between the connection part 33 and the filtration part 34 to secure the connection and to prevent the buffer solution from flowing out.
  • the negative electrode side of the sampling unit 26 is filled with gel, and the positive electrode side of the connection part 33 is also filled with gel.
  • An ultrafiltration membrane is mounted on the filtration unit 34.
  • the nucleic acid is concentrated using such an electrophoresis tank.
  • a pretreated sample is plugged through an injection hole.
  • the sample unit 26 is set in the electrophoresis tank 21 so that the upper surface slightly comes out of the liquid.
  • a DC voltage of 100 V is applied and electrophoresis is performed for 20 minutes. This removes the extra ions in the sample.
  • the buffer was adjusted to pH 8.0 using an aqueous solution, 40 mM Tris, 40 mM glacial acetic acid, and ImM EDTA.
  • connection unit 33 and the filtration unit 34 are connected to the sample unit 26.
  • O-rings are installed at each connection point to prevent liquid leakage.
  • connection section 33 put a mixture of 100% ethanol and ⁇ at a ratio of 6: 4, and in the sampling unit 26, put TE-l (10mM Tris-HC1, 0. ImM EDTA, pH 8.0). It is something to keep.
  • the filter section 34 contains TE-1.
  • FIG. 6 is a perspective view showing the configuration of the sampling unit
  • FIG. 7 is a plan view of the sampling unit
  • FIG. 8 is a side view of the sampling unit
  • FIG. 9 is a sampling unit. It is a side sectional view of a kit.
  • the sampling unit 26 is configured by holding a gel in a container.
  • the sampling unit 26 uses a microcon (registered trademark) YM-3 microcon centrifugal filter unit manufactured by Millipore Co., Ltd. by using a centrifugal filter unit.
  • the ultrafiltration membrane was removed and a hole with a diameter of 5 mm was drilled inside.
  • the present invention is not limited to this and can be used.
  • the sampling unit 26 includes a cylinder 41 and a pedestal 43.
  • the cylinder 41 is connected to a pedestal 43, and has an injection hole 42 for injecting a sample.
  • the pedestal 43 is formed in a stepped columnar shape, and the pedestal 43 is formed with a hole 44 communicating with the upper and lower surfaces.
  • a gel 48 is provided in the cylinder 41.
  • the thickness of gel 48 is about several mm,
  • connection unit 33 The configuration of the connection unit 33 will be described.
  • FIG. 10 is a perspective view of the connecting portion
  • FIG. 11 is a side sectional view of the connecting portion.
  • connection part 33 also uses a centrifugal filter unit manufactured by Millipore as a calorie, similar to the sampling unit 26.
  • the ultrafiltration membrane inside is removed and a hole with a diameter of 5 mm is opened inside. .
  • the connection part 33 is composed of a cylindrical body 41 and a pedestal 43.
  • the cylinder 41 is connected to the base 43.
  • the pedestal 43 is formed in a stepped cylindrical shape, and the pedestal 43 is formed with a hole 44 communicating with the upper and lower surfaces.
  • a gel 48 having a thickness of about several mm is provided in the cylinder 41.
  • the gel 48 is located on the upper surface of the pedestal 43 in the cylindrical body 41 and prevents the liquid from flowing between the gel and the sampling unit 26.
  • FIG. 12 is a side sectional view of the filtration unit.
  • the filtering unit 35 also uses a centrifugal filter unit manufactured by Millipore Corporation.
  • the filtration unit 35 is composed of a cylinder 41 and a pedestal 43.
  • the cylinder 41 is connected to the base 43
  • the length of the cylindrical body 41 is shorter than the sampling unit 26 and the connecting portion 33, and is about 5 mm shorter.
  • the pedestal 43 is formed in the shape of a stepped column, and the pedestal 43 has a hole 44 communicating with the upper and lower surfaces.
  • an ultrafiltration membrane 49 is provided on the upper surface of the pedestal 43. As a result, the outflow of the nucleic acid can be prevented, and the nucleic acid can be concentrated.
  • the nucleic acid was concentrated by the above-described first electrophoresis and second electrophoresis, and the concentration of the recovered nucleic acid was examined by absorbance measurement.
  • the sample was treated with 100% / zL of 1% Triton (registered trademark) X-100 solution and heat-treated at 96 ° C for 10 minutes.
  • 0.5xTAE was used as a buffer for electrophoresis.
  • LxTAE was used for dissolution of agarose.
  • the solution was prepared with 40 mM Tris, 40 mM glacial acetic acid, and ImM EDTA, and was adjusted to pH 8.0.
  • connection part 33 is left standing with the opening side of the cylinder 41 facing upward, and the thickness of the 1% agarose gel (SeaKem Gold agarose: TaKaRa) is reduced to about 7 mm from the opening side of the cylinder 41. Pour and harden the genole.
  • 1% agarose gel SeaKem Gold agarose: TaKaRa
  • the sampling unit 26 is allowed to stand still with the opening side of the cylinder 41 facing upward, and the 1% agarose gel (SeaKem Gold agarose: TaKa
  • the sampling unit 26 was turned over, and the solidified gel was poured into the opening side of the cylinder 41.
  • the electrophoresis tank used was HU-6 (manufactured by Air Brown), and the power supply was MPSU-200 (manufactured by Air Brown).
  • the electrophoresis tank was separated by a putty into a positive electrode side and a negative electrode side, and 0.5xTAE was put on the positive electrode side and the negative electrode side.
  • the sampling unit 26 was placed on the putty so that the upper surface of the sampling unit 26 slightly came out of the buffer solution.
  • connection unit 33 and the filtration unit 34 are connected to the sampling unit 26 after performing the first electrophoresis to form a separation unit and perform the second electrophoresis. .
  • a solution obtained by mixing 100% ethanol and ⁇ in a ratio of 6 to 4 was put into the connection part 33.
  • the TE-l (10 mM Tris-HC1, 0. ImM EDTA, pH 8.0) solution was put into the filtration unit 34.
  • connection unit 33 and the filtration unit 34 were connected to the sampling unit 26, and the separation unit was set up.
  • FIG. 13 is a diagram showing an assembly configuration of the separation unit.
  • the separation unit is constructed by assembling the sampling unit 26, the connection unit 33, and the filtration unit 34 in the same direction, and between the connection unit 33 and the filtration unit 34 and between the connection unit 33 and the filtration unit 34.
  • a ring 51 is attached to each to prevent liquid leakage from the separation unit.
  • the electrophoresis tank was separated into a positive electrode side and a negative electrode side with a putty, and 0.5xTAE was put on the positive electrode side and the negative electrode side.
  • the assembled separation unit was placed on the putty with the sampling unit 26 end on the negative electrode side and the filtration unit 34 on the positive electrode side.
  • the nucleic acid solution was collected in the filtration unit 34, the absorbance was measured, and the concentration of the nucleic acid collected from the UV starch was calculated.
  • FIG. 14 is the UV spectrum of the recovered liquid.
  • the calculated nucleic acid concentration was 32.3 ng (6.7 x 106 copies Z.)
  • the nucleic acid concentration was calculated by calculating the absorbance at 260 nm (A260), Is multiplied by the optical path length of the cell (mm) and divided by 10.
  • the calculated purity of the nucleic acid was 1.91.
  • the purity is calculated by dividing the absorbance at 260 nm (A260) by the absorbance at 280 nm (A280). If the sample is 100% pure DNA, this value is about 1.8. In the case of RNA with 100% purity, the value is 2.0.
  • the A280 value reflects the amount of protein and phenol that are mixed in the analyte.If the absorbance ratio is much lower than 1.5, it is possible that low-molecular substances such as protein are mixed. is there.
  • FIG. 15 is a diagram showing the overall configuration of the electrophoresis apparatus.
  • the electrophoresis apparatus 50 performs concentration of nucleic acids contained in a sample by an electrophoresis unit 51 disposed in an electrophoresis tank 50b.
  • the electrophoresis tank 50b has a buffer tank 55, 58 and a cooling water tank 57.
  • the buffer tanks 55, 56 are filled with a buffer solution for electrophoresis
  • the cooling water tank 57 has an electrophoresis unit 51. Cooling water such as ice water is filled for cooling.
  • the positive electrode 53 is disposed in the buffer 55, and the negative electrode 54 is disposed in the buffer 56.
  • the ends of the electrophoresis unit 51 are exposed in the buffer tanks 55 and 56, respectively.
  • the buffer tanks 55 and 56 and the cooling water tank 57 are separated by a partition wall 52, and the partition wall 52 and the electrophoresis tank 50b are made of insulating material. Putty can be used.
  • the side of the electrophoresis unit 51 is contacted with the cooling water by the partition wall 52 to be cooled. Thus, heat generation during electrophoresis can be eliminated, and the sample can be purified in a stable temperature environment.
  • FIG. 16 is a perspective view of the electrophoresis unit
  • FIG. 17 is a side sectional view of the electrophoresis unit
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing the first half of the purification process by the electrophoresis unit
  • FIG. It is a schematic diagram which shows a latter period.
  • the electrophoresis unit 51 is mainly composed of an insulating material such as acrylic resin, and is configured as one electrophoresis unit 51 by fixing a plurality of members with bolts or the like.
  • the electrophoresis unit 51 has a columnar space 51b extending in the direction in which the space extends, and two holes are provided so as to be orthogonal to the direction in which the space 51b extends.
  • One is an introduction hole 67 for introducing a sample into the space 51b, and the other is a collection hole 66 for collecting a sample concentrated from the space 51b.
  • the introduction hole 67 and the sampling hole 66 communicate with the space 51b.
  • a collection tank 71 and a sample tank 72 are provided inside the electrophoresis unit 51, and the introduction hole 67 is connected to the sample tank 72 and the collection hole 66 is connected to the collection tank 71.
  • a gel wall 64 is provided between the sample tank 72 and the collection tank 71, and a gel wall 64 is also provided on the negative electrode side of the sample tank 72.
  • An ultrafiltration membrane 65 is provided on the positive electrode side of the recovery tank 71. That is, the sample tank 72 is configured between the two gel walls 64, and the recovery tank 71 is configured between the gel wall 64 and the ultrafiltration membrane 65.
  • the space 51b in the electrophoresis unit 51 is filled with the buffer for electrophoresis, and the sample tank 72 and the collection tank 71 are also filled with the buffer.
  • a voltage is applied to both ends of the electrophoresis unit 51.
  • the sample includes a nucleic acid to be purified and contaminants, and a nucleic acid smaller than the target nucleic acid.
  • the nucleic acid 1 and the extra electrolyte 2b move to the positive electrode side, and the contaminant 2 moves to the negative electrode side. Then, by applying a voltage for a certain time, the nucleic acid 1 and the extra electrolyte 2b reach the collection tank 71 through the gel wall 64 as shown in FIG. 19 (c). Further, when the voltage is continuously applied, the extra electrolyte 2b having a small molecular weight as shown in FIG. 19 (d) passes through the ultrafiltration membrane 65 and is discharged from the recovery tank 71. Then, the target nucleic acid 1 stays in the recovery tank 71.
  • the target nucleic acid 1 can be easily separated from the sample.
  • FIG. 20 is a side sectional view showing an assembling structure of the electrophoresis unit
  • FIG. 21 is a perspective view of the same.
  • FIG. 22 is a diagram showing the configuration of the first block
  • FIG. 23 is a diagram showing the configuration of the second block
  • FIG. 24 is a front view of the packing.
  • the electrophoresis unit 51 is configured by combining a first block 61, a second block 62, a third block 63, a packing 73, and an ultrafiltration membrane 65.
  • a first block 61, a second block 62, and the third block 63 holes communicating with the front and rear surfaces for forming the space 51b of the electrophoresis unit 51 are provided in the center, and bolts are used for each block. Holes communicating with the front and rear surfaces are provided at the four corners.
  • the first block 61 constitutes the end of the electrophoresis unit 51
  • the second block 62 constitutes the sample tank 72 and the collection tank 71
  • the third block 63 holds the gel wall 64. It is.
  • a packing 73 is provided between the blocks to prevent the cooling water from flowing into the electrophoresis unit 51 between the blocks.
  • the ultrafiltration membrane 65 is sandwiched between the knocking 73 and 73.
  • a hole 61b is provided, which constitutes a part of the space 51b of the electrophoresis unit 51. Holes 61c for inserting bolts are provided at four corners of the first block 61.
  • a hole 62b is provided, which forms a part of the space 51b of the electrophoresis unit 51. Holes 62c for inserting bolts are also provided at the four corners of the second block 62.
  • the second block 62 is provided with a vertically provided hole 62d communicating with the hole 62b. The holes 62d serve as the introduction hole 67 and the collection hole 66 of the electrophoresis unit 51.
  • the shape of the third block 63 is such that the thickness of the first block 61 in the front-rear direction is reduced, and the gel wall 64 is held in a hole provided in the center.
  • the nose / kin 73 is formed of a sheet having a cross shape in a front view.
  • a hole 73b is provided at the center, and in the present embodiment, it is made of a 0.5 mm thick silicone sheet.
  • the nose / kin 73 has a configuration in which four corners are cut out, and has a shape that does not come into contact with a bolt for fastening a block.
  • the diameter of the hole 73b matches the diameter of the hole 61b of the first block 61 and the diameter of the hole 62b of the second block 62.
  • the ultrafiltration membrane 65 one having a size larger than the hole 73b is used and can be sandwiched by the knocking 73.
  • Comparative Test 1 compares the use of the electrophoresis apparatus in this example with the use of the magnetic silica bead method in the purification of the gonococcal genome from cultured gonococcal added urine.
  • Neisseria gonorrhoeae was cultured at 37 ° C. for 2 days in Chocolate Medium EX (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • a cell dilution solution 1. was added to 60 L of mixed urine of healthy subjects. To this, 60 ⁇ L of lysis buffer A having the composition shown in Table 1 was added and mixed.
  • the mixture was heated at 96 ° C for 10 minutes.
  • a 100 L sample was taken from the mixture, introduced as a sample into the electrophoresis apparatus of this example, and subjected to electrophoresis at a voltage of 150 V for 60 minutes.
  • PCR treatment was performed on 5 ⁇ L of the collected sample (100 ⁇ L), and the fluorescence intensity was measured.
  • the prescription for the PCR treatment was as shown in Table 2.
  • the size of the first block 61 was 20 mm in width, 20 mm in height, 5 mm in thickness, and the diameter of the hole 61b was 5 mm. The same was true for the second block 62, and the diameter of the hole 62d was 2 mm.
  • the size, width and height of the third block 63 are the same as those of the first block 61, and the thickness is 2.5 mm.
  • the solution used was lOmM Tris-HCl (pH 8.0).
  • YM-100 (Millipore) was used as the ultrafiltration membrane.
  • the thickness of the packing 73 was 0.5 mm.
  • MagExtractor (Toyobo Co., Ltd.) was used as the magnetic silica beads. Up to 10 minutes of heating the mixed solution at 96 ° C, the same operation as the above-described operation using the electrophoresis apparatus was performed. A 100 L sample was taken from the mixture and processed as per the MagExtractor protocol. PCR treatment was performed on 5 ⁇ L of the 100 ⁇ L of the obtained recovered sample, and the fluorescence intensity was measured.
  • the thermal cycle of the PCR treatment was as follows: after holding at 50 ° C for 2 minutes, holding at 95 ° C for 2 minutes, holding at 95 ° C for 10 seconds, and holding at 56 ° C. Hold for 60 seconds was performed up to 50 cycles.
  • FIG. 25 is a view showing a comparison result in purification of a gonococcal genome.
  • the thick line is the one using this example, and the thin line is the one using the magnetic silica bead method.
  • the dotted line is standard.
  • a sample tank having a volume of 200 L and a collection tank having a volume of 50 L was used.
  • the sample was prepared by mixing 100 ⁇ L of 7 ng / L / Hindlll DNA and mixing with 100 ⁇ L of lysis buffer ⁇ .
  • the sample was introduced into the sample tank of the electrophoresis apparatus, electrophoresed at a voltage of 100 V for 30 minutes, and concentrated.
  • FIG. 26 is a diagram showing a gel obtained by electrophoresis of a sample showing the results of DNA concentration.
  • ⁇ is a sample before concentration
  • B is a sample collected after concentration. As shown in FIG. 26, for each sample amount, a clearer band was obtained in the sample collected after concentration than in the sample before concentration.
  • the state of the band of 2 ⁇ L of the collected sample is considered to correspond to the state of the band of 6 ⁇ L before concentration.
  • the DNA could be concentrated using the electrophoresis apparatus according to the present example.
  • the present invention is simple to operate and has a simple device configuration, and thus can be applied to uses such as a test device for automatically concentrating and testing nucleic acids.

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Abstract

　従来核酸の精製濃縮方法は、劇薬を使用するため、高度の化学設備を必要とし、 利用する環境が限定される。そして、操作に手間がかかり高速遠心等が必要で自動化が困 難であり、高い精製精度を得ることも困難である。さらに、カラム／フィルターを用いた 精製方法は、ごみの混入が多いサンプルでは目詰まりを起こし精製効率が低くなる可能性 があり、遠心もしくは吸引操作を行う必要があり自動化が困難である。 　そこで、試料中に存在する夾雑物２に界面活性剤３・４を吸着させ、核酸１と異な る挙動を示させることにより、夾雑物２と核酸１とを分離させるものであり、陽イオン界 面界面活性剤４と非イオン界面活性剤３で核酸１以外の夾雑物２を帯電させ、電界中にお くことで、夾雑物２を含む検体より核酸１を分離精製し、核酸１の濃縮もしくは濃縮し易い状態とする。

Description

明 細 書
核酸の濃縮精製方法および装置
技術分野
[0001] 本発明は、検体の前処理を行うデバイスに関するものである。より詳しくは、核酸検 查において、菌体などより検査対象となる核酸を取出すための前処理デバイスに関 するものである。
背景技術
[0002] 近年、ヒトゲノムの解読が進み、さまざまな生命現象と遺伝子の関連が解明されてき ている。そして、この成果により、医学'医療は病態から病因へ、治療から予防へと視 野を広げている。ここにおいて、遺伝子検査技術は重要な基盤となっている。
遺伝子検査は、培養困難な病原微生物の同定検査、抗生物質加療中や感染初期 の病原微生物の検出、移行抗体が疑われた際の抗原検出、病原微生物の感染源調 查、親子鑑定などの個人識別、さらに白血病'固形腫瘍の遺伝子レベルの病型診断 や遺伝病の確定診断など従来の臨床検査では困難であった検査を行うことができる 。そして、結果を得るまでの時間力 菌の培養を用いる手法に比べて短ぐ培養に時 間の力かる細菌の検出には威力を発揮する。さらに DNAは保存条件によっては安 定しているため、凍結生検材料、骨など過去の検体からも検査を行うことができる。 また、近年増加傾向にある性感染症の検査において、検査機会の拡大を図るべく 、遺伝子検査が注目されて 、る。
[0003] 従来核酸の精製濃縮方法としては、フ ノール Zクロ口ホルム Zエタノールを用い た精製方法、核酸を吸着するカラム Zフィルターを用いた精製方法、磁性シリカビー ズを用いた精製方法等が知られて 、る。
[0004] さら〖こ、平板状の電気泳動ゲルカゝら核酸を回収する方法として、作成したゲルにお いて核酸を電気泳動し、ゲルにおいて目的とする核酸の位置に回収装置を移動し、 更なる電気泳動により目的とする核酸を回収する方法が知られている（例えば、特許 文献 1参照)。
この他に、平板状の電気泳動ゲルにおいて、核酸を電気泳動して目的とする核酸 を分離し、目的とする核酸のバンド近傍に回収チップを挿入して核酸を回収する方 法が知られている（例えば、特許文献 2参照)。
しかし、従来核酸の精製濃縮方法において、フエノール Zクロ口ホルム Zエタノー ルを用いた精製方法は、劇薬を使用するため、高度の化学設備を必要とするもので あり、利用する環境が限定される。そして、操作に手間が力かるとともに、高速遠心が 必要となり、自動化が困難である。また、高い精製精度を得ることが困難である。 核酸を吸着するカラム Zフィルターを用いた精製方法は、溶液を流しながら行うた め、ごみ等の混入量の多いサンプルでは、カラム/フィルターが目詰まりを起こしや すぐ精製効率が低くなる可能性がある。そして、遠心もしくは吸引操作を行う必要が あるので、自動化が困難である。
さらに、磁性シリカビーズを用いた精製方法は、磁石によるビーズの回収を失敗し た場合や、シリカビーズが磁性体より剥落した場合には、サンプルにシリカが混入す る可能性がある。そして、高い回収率を得ることが困難である。
[0005] さらに、平板状の電気泳動ゲル力 核酸を回収する従来の技術においては、平板 状の電気泳動ゲルを必要とするとともに、この平板状の電気泳動ゲルにおいて一端 電気泳動を行い、目的核酸の該当位置のゲルを処理する必要がある。
電気泳動に用いられるゲルは、衝撃に弱ぐ生成過程により、特性が大きく異なる 場合がある。このため、一般に電気泳動を行った後に、紫外線により電気泳動ゲルに おける目的核酸の位置を認識した後に、目的核酸の含有量の多い部分を処理する ものである。
[0006] このため、遺伝子検査等にこの手法を利用する場合には、一回の検査にかかる時 間が長くなる。また、電気泳動に用いるゲルが大きくゲルのムラによる核酸のバンドに にじみにより核酸の回収率が低下する可能性がある。さらに、ゲルが大きい場合には 、電気泳動に必要となる電力が大きくなる。
特許文献 1：実開平 5— 88296号公報
特許文献 2：特開平 8- 327595号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0007] 解決しょうとする問題点は、核酸の精製濃縮方法において、複雑かつ高度な化学 設備を必要とすることである。
課題を解決するための手段
[0008] 上記の課題を解決すベぐ様々の試験が行われ、検体中に存在する夾雑物に界 面活性剤を吸着させ、核酸と異なる挙動を示させることにより、夾雑物と核酸とを分離 させることが見出されたちのである。
そして、陽イオン界面界面活性剤と非イオン界面活性剤で核酸以外の夾雑物を帯 電させ、電界中におくことで、夾雑物を含む検体より核酸を分離精製し、核酸の濃縮 もしくは濃縮しやす 、状態とするものである。
[0009] 図 1は界面活性剤存在下における電気泳動による核酸濃縮構成を示す模式図で ある。
検体中には、核酸 1とともに夾雑物 2が含まれるものである。この検体中に、界面活 性剤を混合する。界面活性剤としては非イオン界面活性剤 3と陽イオン界面活性剤 4 とを用いるものである。
検体中に混合された界面活性剤は夾雑物 2に吸着する。非イオン性界面活性剤に よる家電量の調整や、塩ィ匕ナトリウムなどの塩類やポリア-オン性物質 (へノリン、デ キストラン硫酸、 DNA)の添カ卩によっても核酸と陽イオン界面活性剤の吸着を調整す ることがでさる。
陽イオン界面活性剤 4が吸着した夾雑物 2は、正電荷に帯電することとなる。そして 、界面活性剤の吸着した夾雑物 2と、界面活性剤の吸着していない、もしくは吸着量 の少ない核酸 1とを電気泳動により分離することができるものである。これにより、検体 力も夾雑物 2を容易に取り除くことができ、核酸 1を濃縮できるものである。
[0010] 次に、核酸濃縮の手法について説明する。
この核酸濃縮の手法において、電気泳動を 2回行うことにより、核酸の濃縮を確実 に行うものである。第一の電気泳動においては検体中の余分なイオンを除き、第二 の電気泳動においては検体中の核酸の濃縮を行うものである。
[0011] 核酸を含む検体に添加する非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシェチ レン p— t一才クチルフエ-ル エーテル (Triton系界面活性剤等）、ポリオキシェチ レン ソルビタン アルキル エステル (Tween系界面活性剤等）、ポリオキシェチレ ンアルキル エーテル (Brij系界面活性剤等)等の非イオン性界面活性剤が使用で き、具体的には、例えば、 TritonX— 100、 Tween— 20、 Brij 35等があげられる。好 ましくは 1%の TritonX-100が望ましい。当該界面活性剤の添カ卩により細胞膜、核 膜が溶解されない場合には、非イオン界面活性剤を加えた後、 96°Cで 10分間加熱 処理を行う。
検体に陽イオン界面活性剤として、ゼフイラミン、セチルトリメチルアンモ -ゥムクロラ イド、セチルピリ-ジゥムメチルアンモ -ゥムクロライド、デシルピリジ -ゥムクロライド（ DPC)があげられる。好ましくは 0. 2%DPCを 100 Lカロえる。
なお、検体には、非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を同時に加えた後に、 加熱処理を行うことも可能である。
検体に界面活性剤を加えて前処理を行うため、核酸が大腸菌などの原核細胞内に 存在する場合においても、細胞壁が界面活性剤により破壊されることから、大腸菌の 培養液などを検体として用いることができ、検体前処理の操作を容易に行うことがで きるものである。
このように検体の前処理を行 、、 100Vの直流電圧を加え 10分間電気泳動を行!、 、検体中の余分なイオンを除去する。
この後に、 125— 150Vの直流電圧を加え、 120分間電気泳動を行い、正極側に ぉ 、て核酸を採取するものである。
[0012] 検体の電気泳動を行う電気泳動槽の構成につ!、て説明する。
まず、第一の電気泳動について説明する。
図 2は第一電気泳動の泳動槽構成を示す図である。
電気泳動槽 5内にはサンプル槽 6、正極側と負極側とを分ける隔壁 9が設けられて いる。サンプル槽 6は隔壁 9に貫通しており、一端が正極側に、他端が負極側に突出 した構成となっている。サンプル槽 6の両端は開口しており、両端の開口部はそれぞ れゲル 8 · 8により閉じられている。これにより、サンプル槽 6内に電位差を発生させて 核酸および界面活性剤が吸着した夾雑物の電気泳動を行うものである。
[0013] 検体に非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を加え、加熱処理を行った後に 、検体をサンプル槽 6に注入する。
そして、電極間に 100Vの電圧をカ卩えて、 10分間の電気泳動を行うものである。 これにより、検体中に含まれる余分なイオンを除くものである。
検体中に含まれる余分なイオンを除いた後に、第二の電気泳動により核酸の濃縮 を行うものである。
[0014] 第二電気泳動について説明する。
第二の電気泳動においては、第一の電気泳動で検体を注入したサンプル槽に、核 酸の回収槽を接続していたものを電気泳動槽内に配置して電気泳動を行うものであ る。
図 3は第二電気泳動の泳動槽構成を示す図である。
電気泳動槽 5内にはサンプル槽 6、回収槽 7、正極側と負極側とを分ける隔壁 9が 設けられている。サンプル槽 6は隔壁 9に挿入され、負極側に突出した構成となって いる。回収槽 7は隔壁 9に挿入され、正極側に突出した構成となっている。サンプル 槽 6と回収槽 7とは隔壁 9配設部において接続されており、ゲル 8を介して接続されて いる。
サンプル槽 6の両端は開口しており、両端の開口部はそれぞれゲル 8 · 8により閉ざ されている。そして、回収槽 7の両端は開口しており、負極側はゲル 8により閉じられ ており、正極側は限外ろ過膜 11により閉じられて 、る。
このように構成された電気泳動槽において、電極間に 120Vの電圧を加え、 120分 間の電気泳動を行うものである。
[0015] このように、電気泳動槽において第二の電気泳動を行うことにより、余分なイオンを 除いた検体を電気泳動することができ、回収槽 7において核酸を効率的に回収でき るものである。また、回収槽 7の正極側には限外ろ過膜 11を設けており、核酸は回収 槽 7より排出されることなぐ回収槽 7内にとどまる。このため、核酸の回収効率を向上 することができるものである。
なお、検体の状態によっては、第一の電気泳動を行うことなぐ第二の電気泳動を 行うことも可能である。回収槽 7に接続したサンプル槽 6に前処理を行った検体を注 入して電気泳動することにより、容易に核酸の濃縮を行うことができるものである。検 体中に存在する余分なイオンは限外ろ過膜を透過できるので、核酸の回収に影響を あたえない。
[0016] すなわち、本発明は第 1に、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核 酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に、試料を電界中に おき、核酸の濃縮精製を行う。
[0017] 第 2に、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽ィォ ン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中にお き、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行う。
[0018] 第 3に、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中に陽ィ オン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を 調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行う。
[0019] 第 4に、核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うととも に、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節する。
[0020] 第 5に、試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、該試料を 電気泳動し、陽極側において核酸の濃縮精製を行う装置を構成する。
[0021] 第 6に、電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、側面を絶縁体により構成し た容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室 および核酸回収室を構成し、該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、電極に 接続して!/ヽる装置を構成する。
発明の効果
[0022] 本発明は、第 1に、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む 試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、核酸 の濃縮精製を行う方法をとるので、電気泳動における核酸と夾雑物の挙動に相違を あたえ、核酸を効率的に分離できる。夾雑物と核酸との挙動における差異を荷電によ り調節可能であり、挙動の制御を容易に行える。
遠心分離装置などを利用する必要がなぐ核酸濃縮を行う機構をコンパ外に構成 することができる。
[0023] 第 2に、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽ィォ ン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中にお き、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うことができ、陽イオン界面活性剤 を用いるので、操作容易であり、作業の安全を容易に確保できる。
そして、夾雑物への吸着量を増大させることにより、電気泳動における核酸と夾雑物 との挙動差を大きくすることができ、核酸を効率的に分離できる。さらに、夾雑物が核 酸とは反対方向に泳動されるので、夾雑物による精製の阻害を防止でき、核酸の精 製を容易に行うことができる。
[0024] 第 3に、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中に陽ィ オン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を 調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うの で、陽イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤との割合により陽イオン界面活性剤 の吸着量を調節可能であり、電気泳動における夾雑物の挙動を容易に調節できるも のである。
また、核酸に非イオン界面活性剤を吸着させることにより、核酸への陽イオン界面 活性剤の吸着を阻害することも可能である。
[0025] 第 4に、核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うととも に、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節するの で、容易な操作により、夾雑物への陽イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤の吸 着割合を操作することができる。さらに、夾雑物帯電量の調節を容易な操作により行 うことができる。また、核酸に非イオン界面活性剤を吸着させることにより、核酸への 陽イオン界面活性剤の吸着を阻害することも可能である。
[0026] 第 5に、試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、該試料を 電気泳動し、陽極側において核酸の濃縮精製を行う装置を構成するので、 簡便な 構成により、試料中の核酸を精製することができるとともに、核酸の挙動を制御可能 であるため、安全性を維持しながら、濃縮精製装置をコンパクトに構成できる。
[0027] 第 6に、電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、側面を絶縁体により構成し た容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室 および核酸回収室を構成し、該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、電極に 接続している装置を構成するので、 簡便な構成により、濃縮精製装置を構成可能 であり、製作に力かるコストを低減するとともに、制御が容易かつ安全性の高い装置 を構成することが可能である。
図面の簡単な説明
[図 1]界面活性剤存在下における電気泳動による核酸濃縮構成を示す模式図。
[図 2]第一電気泳動の泳動槽構成を示す図。
[図 3]第二電気泳動の泳動槽構成を示す図。
[図 4]第一電気泳動槽の構成を示す図。
[図 5]第二電気泳動槽の構成を示す図。
圆 6]サンプリングユニットの構成を示す斜視図。
[図 7]サンプリングユニットの平面図。
[図 8]サンプリングユニットの側面図。
[図 9]サンプリングユニットの側面断面図。
[図 10]接続部の斜視図。
圆 11]接続部の側面断面図。
圆 12]ろ過部の側面断面図。
圆 13]分離ユニットの組立て構成を示す図。
[図 14]回収された液の UVスペクトル。
[図 15]電気泳動装置の全体構成を示す図。
[図 16]電気泳動ユニットの斜視図。
[図 17]電気泳動ユニットの側面断面図。
[図 18]電気泳動ユニットによる精製過程の前期を示す模式図。
圆 19]同じく精製過程の後期を示す模式図。
圆 20]電気泳動ユニットの組み付け構成を示す側面断面図。
[図 21]同じく斜視図。
[図 22]第 1ブロックの構成を示す図。
[図 23]第 2ブロックの構成を示す図。
[図 24]パッキンの正面図。 [図 25]淋菌ゲノムの精製における比較結果を示す図。
[図 26]DNAの濃縮結果を示すサンプルを電気泳動したゲルを示す図。
符号の説明
[0029] 1 核酸
2 夾雑物
3 非イオン界面活性剤
4 陽イオン界面活性剤
5 電気泳動槽
6 サンプル槽
9 隔壁
発明を実施するための最良の形態
[0030] 危険な薬品を使うことなぐ精製率の高い核酸濃縮装置を構成するという目的を、 界面活性剤と電気泳動を用いた手法により実現した。
実施例 1
[0031] 次に、本発明の実施例について説明する。
まず、電気泳動に用いる電気泳動槽の構成にっ ヽて説明する。
図 4は第一電気泳動槽の構成を示す図である。
電気泳動槽 21は隔壁 24· 25により、負極側槽 22と正極側槽 23とに分けられてい る。隔壁 24· 25は電気泳動槽 21の中央部に配設されており、隔壁 24· 25にサンプ ルユニット 26が装着されている。サンプルユニット 26は一端を負極側槽 22に、他端 を正極側槽 23に突出した構成となって 、る。サンプルユニット 26の負極側にはゲル が詰められており、側面にサンプル注入用の注入孔が開けられている。注入孔は電 気泳動時には栓により閉じられるものである。
そして、負極側槽 22に負極が挿入され、正極側槽 23に正極が挿入され、電気泳 動槽 21に電圧がかけられるものである。
[0032] 次に、電気泳動槽の他の構成例について説明する。
図 5は第二電気泳動槽の構成を示す図である。
第二電気泳動において、電気泳動槽 21は隔壁 24· 25により、負極側槽 22と正極 側槽 23とに分けられて 、る。隔壁 24 · 25は電気泳動槽 21の中央部に配設されてお り、隔壁 24· 25に分離ユニット 32が装着されている。分離ユニット 32は一端を負極側 槽 22に、他端を正極側槽 23に突出した構成となっている。そして、負極側槽 22に負 極が挿入され、正極側槽 23に正極が挿入され、電気泳動槽 21に電圧がかけられる ものである。
分離ユニット 32は、 3つの部材を接続して構成するものであり、サンプリングユニット 26、接続部 33、ろ過部 34とにより構成される。サンプリングユニット 26と接続部 33と の間、および接続部 33とろ過部 34との間には Οリングが装着され接続を確保するとと もに、緩衝液の流出を防止しているものである。
なお、サンプリングユニット 26の負極側にはゲルが詰められており、接続部 33の正 極側にもゲルが詰められている。そして、ろ過部 34には限外ろ過膜が装着されてい る。
[0033] このような電気泳動槽を用いて、核酸の濃縮を行うものである。
まず、第一電気泳動において、前処理したサンプルを注入孔より入れ栓をする。そ して、電気泳動槽 21にサンプルユニット 26を上面が少し液から出るように設置する。 この後、 100Vの直流電圧をかけ、 20分間電気泳動を行うものである。これによりサン プル中の余分なイオンを取り除くものである。なお、緩衝液は ΙχΤΑΕ溶液、 40mM Tris、 40mM 氷酢酸、 ImM EDTAにより調製し、 pH8. 0とした。
[0034] そして、第一電気泳動槽 21において余分なイオンを取り除いた後に、サンプルュ ニット 26に接続部 33およびろ過部 34を接続するものである。各接続個所には Oリン グを装着し、液漏れを防ぐものである。
接続部 33内には、 100%エタノールと ΙχΤΑΕを 6 :4で混合した液を入れ、サンプ リングユニット 26内には TE— l (10mM Tris— HC1、 0. ImM EDTA、 pH8. 0)を 入れておくものである。ろ過部 34には TE-1を入れておく。
[0035] 次に、サンプリングユニット 26、接続部 33、ろ過部 34の構成について説明する。
まず、サンプリングユニット 26の構成について説明する。
図 6はサンプリングユニットの構成を示す斜視図であり、図 7はサンプリングユニット の平面図であり、図 8はサンプリングユニットの側面図であり、図 9はサンプリングュニ ットの側面断面図である。
サンプリングユニット 26は、容器にゲルを保持させて構成するものであり、ミリポア社 製のマイクロコン（登録商標） YM— 3 マイクロコン 遠心式フィルタユニットを力卩ェし て利用するものであり、内部の限外ろ過膜をはずし、内部に直径 5mmの孔を開けた ものである。なお、同様の効果を得られるものであれば、これに限らず用いることが出 来るものである。
サンプリングユニット 26は筒体 41と台座 43とにより構成されている。筒体 41は台座 43に接続しており、サンプルを注入するための注入孔 42が設けられている。台座 43 は段付き円柱状に構成されており、台座 43には上下面に連通する孔 44が構成され ている。
筒体 41内にはゲル 48が配設されている。ゲル 48の厚みは数 mm程度であり、筒体
41の開口部をふさぐ構成となっている。これにより、注入孔 42より供給された検体が ゲル 48の内側に供給されるものである。
[0036] 接続部 33の構成について説明する。
図 10は接続部の斜視図であり、図 11は接続部の側面断面図である。
接続部 33もサンプリングユニット 26と同様に、ミリポア社製の遠心式フィルタユニット をカロェして利用するものであり、内部の限外ろ過膜をはずし、内部に直径 5mmの孔 を開けたものである。
接続部 33は筒体 41と台座 43とにより構成されている。筒体 41は台座 43に接続し ている。台座 43は段付き円柱状に構成されており、台座 43には上下面に連通する 孔 44が構成されている。
筒体 41内には、厚み数 mm程度ゲル 48を配設している。ゲル 48は、筒体 41内に おいて、台座 43の上面に位置しており、サンプリングユニット 26との間の液体の流動 を防止するものである。
[0037] ろ過部 34について説明する。
図 12はろ過部の側面断面図である。
ろ過部 35もミリポア社製の遠心式フィルタユニットをカ卩ェして利用するものである。 ろ過部 35は筒体 41と台座 43とにより構成されている。筒体 41は台座 43に接続し ており、筒体 41の長さはサンプリングユニット 26や接続部 33よりも短く構成されてお り、約 5mm短く構成されているものである。台座 43は段付き円柱状に構成されており 、台座 43には上下面に連通する孔 44が構成されている。
そして、筒体 41内において、台座 43の上面に限外ろ過膜 49が配設されている。こ れにより核酸の流出を防ぎ、核酸の濃縮を行うことが可能となる。
[0038] 次に、核酸の濃縮操作例について説明する。
検体として、大腸菌培養液を用いて、上記の第一電気泳動および第二電気泳動に より核酸の濃縮を行い、回収された核酸濃度を吸光度測定により調べた。
検体は、大腸菌（Escherichia coli DH5 a )培養液 100 μ Lをを用いた。
検体に、 l %Triton (登録商標） X-100溶液 100 /z Lをカ卩え、 96°Cで 10分間加熱 処理した。
この後に 0. 2%DPCを 100 /z Lカロえ、電気泳動用の試料を調製した。
[0039] 電気泳動用のバッファとしては 0. 5xTAEを使用した。
ァガロースの溶解には lxTAEを使用した。
なお、 ΙχΤΑΕ溶液は、 40mM Tris、 40mM 氷酢酸、 ImM EDTAにより調製 し、 pH8. 0とした。
接続部 33を筒体 41の開口側を上方にして静置し、筒体 41の開口側より、 1 %ァガ ロースゲル（SeaKem Gold agarose : TaKaRa)をゲルの厚さ力 ¾一 7mm程度に なるように流し込み、ゲノレを固めた。
サンプリングユニット 26も接続部 33と同様に、筒体 41の開口側を上方にしてに静 置し、筒体 41の開口側より、 1 %ァガロースゲル（SeaKem Gold agarose : TaKa
Raから購入)をゲルの厚さが数 mm程度になるようした。そして、ゲルが固まった後に
、サンプリングユニット 26をひっくり返し、筒体 41の開口側に固まったゲルを流し込ん に。
[0040] 電気泳動槽は HU— 6 (エアブラウン社製）を用い、電源は MPSU—200 (エアブラウ ン社製)を用いた。
サンプリングユニット 26の注入孔 42より、調製した電気泳動用試料を入れて栓をし 電気泳動槽をパテにより正極側と負極側とに分離し正極側と負極側に 0. 5xTAE を入れた。
そして、パテにサンプリングユニット 26の上面が少しバッファ液から出るように設置し た。
この後に、直流電圧 100Vをかけ、 20分間第一の電気泳動を行った。
[0041] 次に、第一の電気泳動を行った後のサンプリングユニット 26に接続部 33と、ろ過部 34とを接続して、分離ユニットを構成し、第二の電気泳動を行うものである。
第二電気泳動の操作例を説明する。
100%エタノールと ΙχΤΑΕとを 6対 4で混合した溶液を接続部 33内に入れた。 TE-l (10mM Tris— HC1、0. ImM EDTA、 pH8. 0)溶液をろ過部 34内に入 れた。
次に、サンプリングユニット 26に接続部 33と、ろ過部 34とを接続して、分離ユニット を糸且み立てた。
[0042] 図 13は分離ユニットの組立て構成を示す図である。
分離ユニットは、サンプリングユニット 26、接続部 33、ろ過部 34を同一方向に向け て組み立てるものであり、接続部 33とろ過部 34との間、および接続部 33とろ過部 34 との間に Oリング 51をそれぞれ装着して、分離ユニットよりの液漏れを防ぐものである
[0043] 電気泳動槽をパテにより正極側と負極側とに分離し正極側と負極側に 0. 5xTAE を入れた。
組み立てた分離ユニットのサンプリングユニット 26側端を負極側に、ろ過部 34を正 極側にしてパテに配置した。
この後に、直流電圧 200Vをかけ、 240分間、第二の電気泳動を行った。
[0044] 次に、ろ過部 34において核酸溶液を回収して、吸光度の測定を行い、 UVスぺタト ルより回収された核酸濃度を算出した。
図 14は回収された液の UVスペクトルである。
算出された核酸濃度は、 32. 3ng (6. 7 X 106コピー Z であった。 核酸濃度の算出は、 260nmにおける吸光度 (A260)に、核酸の性状固有の係数 をかけ、さらに、セルの光路長（mm)をかけて、 10で割ったものである。
[0045] また、回収された核酸の純度を、 UVスペクトルより算出した。
算出された核酸の純度は、 1. 91であった。
純度の算出は、 260nmにおける吸光度 (A260)を、 280nmにおける吸光度 (A2 80)で割ることにより、行うものである。サンプルが純度 100%の DNAの場合、この値 は約 1. 8となる。また、純度 100%の RNAの場合には 2. 0となる。 A280の値は、被 測定物に混入しているタンパク質やフエノールの量を反映し、吸光度比が 1. 5を大き く下回るような場合は、タンパク質などの低分子物質の混入が考えられるものである。 実施例 2
[0046] 次に、第 2の実施例における電気泳動装置について説明する。
図 15は電気泳動装置の全体構成を示す図である。
電気泳動装置 50は、電気泳動槽 50b内に配置する電気泳動ユニット 51により検体 中に含まれる核酸の濃縮を行うものである。電気泳動槽 50bは、ノ ッファ槽 55 · 58お よび冷却水槽 57を有し、バッファ槽 55 · 56には電気泳動のためのバッファ溶液が満 たされ、冷却水槽 57には電気泳動ユニット 51を冷却するために、氷水などの冷却水 が満たされる。ノ ッファ槽 55には正極 53が配設されており、ノ ッファ槽 56には負極 5 4が配設されている。電気泳動ユニット 51の端部は、それぞれバッファ槽 55 · 56内に 露出しており、この電気泳動ユニット 51内に検体を導入して、正極 53と負極 54との 間に電圧をかけることにより、検体中の核酸の濃縮を行う。
ノ ッファ槽 55 · 56と冷却水槽 57とは隔壁 52により区切られており、隔壁 52および 電気泳動槽 50bは絶縁性のあるものを用い、隔壁 52としてはシリコーン系充填材ゃ エポキシ榭脂系のパテを用いることができる。隔壁 52により電気泳動ユニット 51の側 部は冷却水に接して、冷却されることとなる。これにより、電気泳動時の発熱を解消し て、安定した温度環境で検体の精製を行うことができる。
[0047] 次に、電気泳動ユニット 51について説明する。
図 16は電気泳動ユニットの斜視図であり、図 17は電気泳動ユニットの側面断面図 であり、図 18は電気泳動ユニットによる精製過程の前期を示す模式図であり、図 19 は同じく精製過程の後期を示す模式図である。 電気泳動ユニット 51は主にアクリル榭脂などの絶縁素材により構成されるものであ り、複数の部材をボルトなどにより固定して、 1つの電気泳動ユニット 51として構成さ れる。電気泳動ユニット 51は、内部に延出方向に沿った円柱上の空間 51bが設けら れており、この空間 51bの延出方向と直交するように孔が 2つ設けられている。 1つは 空間 51b内に検体を導入するための導入孔 67であり、もう 1つは空間 51bより濃縮し た検体を採取するための採取孔 66である。導入孔 67および採取孔 66はそれぞれ 空間 51bに連通している。
電気泳動ユニット 51の内部には、回収槽 71およびサンプル槽 72が設けられており 、導入孔 67がサンプル槽 72に採取孔 66が回収槽 71にそれぞれ接続している。サン プル槽 72と回収槽 71との間には、ゲル壁 64が設けられており、サンプル槽 72の負 極側にもゲル壁 64が設けられている。そして、回収槽 71の正極側には限外ろ過膜 6 5が配設されている。すなわち、サンプル槽 72は 2つのゲル壁 64 · 64間に構成され ており、回収槽 71はゲル壁 64と限外ろ過膜 65との間に構成されている。
[0048] 次に、電気泳動ユニット 51による精製過程について説明する。
検体の精製を行う場合には、電気泳動ユニット 51内の空間 51bは電気泳動用のバ ッファで満たされるものであり、サンプル槽 72およびと回収槽 71もバッファで満たされ る。図 18 (a)に示すごとぐサンプル槽 72に検体を導入した後に電気泳動ユニット 51 の両端に電圧を加える。なお、検体には精製を目的とする核酸と夾雑物、目的とする 核酸よりも小さな核酸が含まれる。
電気泳動ユニット 51に電圧をかけると、図 18 (b)に示すごとぐ核酸 1および余分な 電解物 2bが正極側に移動し、夾雑物 2が負極側に移動する。そして、一定時間電圧 をかけることにより、図 19 (c)に示すごとぐ核酸 1および余分な電解物 2bがゲル壁 6 4を通り回収槽 71に到達する。さらに、継続して電圧をかけると、図 19 (d)に示すごと ぐ分子量の小さい余分な電解物 2bは限外ろ過膜 65を通り、回収槽 71より排出され る。そして、目的物である核酸 1が回収槽 71内にとどまることとなる。
このように、電気泳動ユニット 51において、電気泳動および限外ろ過膜を用いるこ とにより、検体中より目的の核酸 1の分離を容易に行うことができる。
[0049] 次に、電気泳動ユニット 51の各部の構成について説明する。 図 20は電気泳動ユニットの組み付け構成を示す側面断面図であり、図 21は同じく 斜視図である。図 22は第 1ブロックの構成を示す図であり、図 23は第 2ブロックの構 成を示す図であり、図 24はパッキンの正面図である。
電気泳動ユニット 51は、第 1ブロック 61、第 2ブロック 62、第 3ブロック 63とパッキン 73および限外ろ過膜 65とを組み合わせることにより構成される。第 1ブロック 61、第 2 ブロック 62、第 3ブロック 63には、電気泳動ユニット 51の空間 51bを構成するための 前後面に連通する孔が中央に設けられており、各ブロックをボルト止めするための前 後面に連通する孔が四隅に設けられている。
第 1ブロック 61は電気泳動ユニット 51の端部を構成するものであり、第 2ブロック 62 はサンプル槽 72および回収槽 71を構成するものであり、第 3ブロック 63はゲル壁 64 を保持するものである。各ブロック間にはパッキン 73が配設されてブロック間のにお ける冷却水の電気泳動ユニット 51内への流入を防止する。電気泳動ユニット 51の一 端側に置いては、ノ ッキン 73 · 73により限外ろ過膜 65が挟持される。
第 1ブロック 61の中央部には、図 22に示すごとく、孔 61bが設けられており、これが 電気泳動ユニット 51の空間 51bの一部を構成する。そして、第 1ブロック 61の四隅に はボルトを挿入するための孔 61cが設けられている。
第 2ブロック 62の中央部には、図 23に示すごとく、孔 62bが設けられており、これが 電気泳動ユニット 51の空間 51bの一部を構成する。第 2ブロック 62の四隅にもボルト を挿入するための孔 62cが設けられている。そして、第 2ブロック 62には孔 62bに連 通する上下方向に設けた孔 62dが設けられて 、る。この孔 62dが電気泳動ユニット 5 1の導入孔 67および採取孔 66となる。
なお、第 3ブロック 63の形状は、第 1ブロック 61の前後方向の厚みを小さくしたもの であり、中央に設けた孔にゲル壁 64を保持するものである。
ノ¾ /キン 73は、正面視十字形のシートにより構成されている。中央部には孔 73bが 設けられており、本実施例においては厚さ 0. 5mmのシリコーンシートにより構成され るものである。ノ¾ /キン 73は図 24に示すごとぐ四隅を切り欠いた構成となっており、 ブロックを締結するためのボルトと接触しない形状となっている。なお、孔 73bの径は 第 1ブロック 61の孔 61bや、第 2ブロック 62の孔 62bの径と一致するものである。 限外ろ過膜 65としては、孔 73bより大きいものを用い、ノ ッキン 73 · 73により挟持可 能とする構成となっている。
[0051] 次に、本実施例における電気泳動装置を用いた核酸の濃縮精製分離の試験につ いて説明する。
[比較試験 1]
比較試験 1は、培養淋菌添加尿からの淋菌ゲノムの精製において、本実施例にお ける電気泳動装置を用いたものと、磁性シリカビーズ法を用いたものとを比較したも のである。
まず、本実施例における電気泳動装置を用いた操作について説明する。 チョコレート培地 EX (日水製薬株式会社）で淋菌（Nesseria gonorrhoeae)を 37 °Cで 2日間培養した。
得られたコロニーを生理食塩水に懸濁し、吸光度が OD530 = 0. 18となるように調 整した後に、生理食塩水で 100倍に希釈し、菌体希釈液を得た。
そして、健常人混合尿 60 Lに菌体希釈液 1. を添加した。これに、表 1に示 す組成の溶解バッファ Aを 60 μ L加えて混合した。
混合液を 96°Cで 10分間加熱した。混合液より 100 Lを採りサンプルとして、本実 施例の電気泳動装置に導入し、電圧 150Vで 60分間の電気泳動を行った。
回収サンプル 100 μ Lのうち 5 μ Lについてポリメラーゼ連鎖反応（PCR)処理を行 い、蛍光強度を測定した。
PCR処理の処方は表 2に示すものであった。
なお、第 1ブロック 61のサイズは幅 20mm、高さ 20mm、厚み 5mm、孔 61bの直径 は 5mmであり、第 2ブロック 62も同様であり孔 62dの直径は 2mmであった。第 3ブロ ック 63のサイズ、幅と高さにおいて第 1ブロック 61と同様であり厚みは 2. 5mmであり 、ゲル壁はァガロースゲルを用い、ァガロースは SeaKem Gold agarose (TaKaR a)を用い、溶解液は lOmM Tris— HCl (pH8. 0)を用いた。限外ろ過膜としては、 YM— 100 (ミリポア）を用いた。また、パッキン 73の厚みは 0. 5mmであった。
[0052] 次に、磁性シリカビーズ法を用いた操作にっ 、て説明する。
磁性シリカビーズとしては MagExtractor (東洋紡績株式会社)を用いた。 混合液の 96°Cで 10分間加熱までは、前記の電気泳動装置を用いた操作と同様に 行った。混合液より 100 Lを採りサンプルとして、 MagExtractorのプロトコール通 りに処理した。得られた回収サンプル 100 μ Lのうち 5 μ Lについて PCR処理を行い 、蛍光強度を測定した。
なお、 PCR処理の熱サイクルとしては、表 3に示すごとぐ 50°Cで 2分間保持したの ちに、 95°Cで 2分間保持した後に、 95°Cで 10秒間保持と 56°Cで 60秒間保持とを 5 0サイクルまで行った。
[0053] [表 1] 溶解バッファ A 組成
2% (重量） T r i t o n X— 1 00
セチルトリメチルアンモニゥム
0. 1 %
クロライド （CT AC)
1 OmM T r i s-HC I (p H8. 0)
1 OmM EDTA (p H 8. 0)
300 mM N a C I
1 6. 6コピ一 /〃 L ヒトゲノム
[0054] [表 2]
P CR処方
1反応あたりの処方
Η2θ 15. 15 JUL
10Χ Gene Taq Buffer 2. 5
10mM AUGC 0. 5 し
100mM MgCI2 0. 375
5μΜ F-D-NG-R1-32 1
WO fA NG-F3405-20 0. 125
100 M NG 3526-20R 0. 125 し
UNG 0. 1 し
5ϋ/μί Gene Taq NT 0. 125
20 j uL + 回収サンプル 5 L
[0055] [表 3] 熱サイクル
50°C 2min
95°C 2min
95°C 1 OSec 50
56°C 6 OSec Jサイクル
[0056] 図 25は淋菌ゲノムの精製における比較結果を示す図である。図 25において太線 は本実施例を用いたものであり、細線は磁性シリカビーズ法を用いたものである。な お、点線は標準である。
結果、本実施例を用いたものにおいて、磁性シリカビーズを用いたものより早く検出 することができた。これは磁性シリカビーズ法よりも本発明の方が核酸の精製、分離 の効率が高 、ことを示すものである。 [0057] [濃縮試験]
次に、本実施例における電気泳動装置を用いた DNAの濃縮操作について説明す る。
本実施例における電気泳動装置において、サンプル槽の容積を 200 Lとし、回 収槽の容積を 50 Lとしたものを用いた。
2. 7ng/ Lのえ /Hindlll DNAを 100 μ Lとし、 100 μ Lの溶解液バッファ Αと 混合して、サンプルを調整した。サンプルを電気泳動装置のサンプル槽に導入し、 電圧 100Vで 30分間にわたり電気泳動を行い、濃縮した。
この後、濃縮前のサンプルおよび濃縮後の回収サンプルについてそれぞれ、 2 L 、 4 L、 6 L、 8 Lを採り、ゲル電気泳動を行った。また、濃縮後の回収サンプル につ ヽてはサンプル量を 10 μ Lとした電気泳動も行った。
図 26は DNAの濃縮結果を示すサンプルを電気泳動したゲルを示す図である。 図 26において、 Αは濃縮前のサンプルであり、 Bは濃縮後に回収されたサンプルで ある。図 26に示すごとぐ各サンプル量に対して、濃縮前のサンプルよりも濃縮後に 回収されたサンプルにお 、て、よりはっきりとしたバンドを得た。
図 26において、回収サンプル 2 μ Lのバンドの状態は、濃縮前の 6 μ Lのバンド状 態に相当するとおもわれる。
このことより、本実施例による電気泳動装置を用いて DNAの濃縮を行うことができ た。
産業上の利用可能性
[0058] 本発明は、操作が簡便であるとともに、装置構成が簡易であるので、 自動で核酸の 濃縮および検査を行う検査装置などの用途にも適用できる。

Claims

請求の範囲
[1] 電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、
核酸を含む試料中の夾雑物に対して、
荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、
核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
[2] 電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、
核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤加えて、
試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、
電気泳動することにより、
核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
[3] 電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、
核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、 試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、
電気泳動することにより、
核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
[4] 核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽ィ オン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節することを特徴 とする請求項 3に記載の核酸の濃縮精製方法。
[5] 試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、
該試料を電気泳動し、
陽極側において核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製装置。
[6] 電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、
側面を絶縁体により構成した容器内を、
拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、
該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成し、
該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、
電極に接続して!/ヽることを特徴とする核酸の濃縮精製装置。
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