JPS6322194A - 自動化核酸抽出方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

又所Ω責景 本発明は核酸の細胞からの単離及び精製に関し、特にそ
の様な単離を自動的に達成する装置に関する。 １ｎｖｉｔｒｏでの核酸の操作における第一の工程の一
つはそれらの単離を含むものであり、例えば遺伝病の試
験を行うために比較的純粋なゲノムＤＮＡの試料が必要
とされ、又、組換え技術はベクターＤＮＡ及びクローン
化されるＤＮＡの両者の単離を必要とする。 一般的にＤＮＡは細胞内に遊離分子としては存在せずＤ
ＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白質の複雑な会合物として存在する
。これはＤＮＡの細胞の遺伝的青写真の担体としての役
割の結果である。遺伝情報を発現するためにＤＮＡはメ
ツセンジャーＲＮＡの産生のための鋳型として用いられ
このメツセンジャーＲＮＡはリボゾームにより蛋白質に
翻訳される。遺伝子発現のプロセスに直接関連する蛋白
質例えばＲＮＡポリメラーゼ及び正常蛋白質はＤＮＡと
ｉｎ　ｖｉｖｏで相互作用して核−蛋白質複合体を形成
する。ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、各種巻戻
し及びスーパーコイル化酸素、組換え及び修復酵素及び
ＤＮＡ複製の開始或いは維持に関連する蛋白質も又ｉｎ
　ｖｉｖｏでＤＮＡと会合し、それにより純粋ＤＮＡの
単離を複雑化している。 このＤＮＡのこれらのその他の蛋白質及び核酸との複雑
な会合のためにＤＮＡを得るための精製（単ｍ）手法は
一般的に次の三段階のプロセスに考えることができる：
（１）細胞壁の崩壊及び膜からの可溶性高分子量ＤＮＡ
の放出、（２）蛋白質変成或いは蛋白質分解によるＤＮ
Ａ−蛋白質複合体の分解、及び（３）その他の高分子か
らのＤＮＡの単離。 このプロセス内に於て、細菌起源のＤＮＡ（原核生物Ｄ
ＮＡ）はＤＮＡが染色体であるか或いはプラスミド或い
はバクテリオファージなどの染色体外のものであるかに
応じて異った方法により典型的に精製される。染色体Ｄ
ＮＡの精製においては細菌細胞壁は一般的に凍結−融解
により或いは酵素リゾチーム及びキレート化剤エチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）による処理により一般的に
弱められる。細胞溶解は緩衝化された塩溶液中における
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗剤の添加に
より達成される。溶解に続き、この溶液を膵臓リボヌク
レアーゼで処理してＲＮＡとプロテアーゼを加水分解し
て蛋白質を劣化させる。 残存蛋白質及びオリゴペプチドをフェノール或いはフェ
ノールとクロロホルムの等量混合物の有機溶媒で抽出す
る。蛋白質の殆んどは変成し、有機相に入り、有機相と
水相の界面に沈澱し、この相分離は遠心分離により達成
される。その後、ＤＮＡを含む透明な粘稠水性相を取出
す。アルコールを添加するとＤＮＡが水性相から白色繊
維状物質として沈澱し、ガラス棒に巻付けることができ
る。 アルコールからの沈澱はＤＮＡ及びＲＮＡの小さいオリ
ゴヌクレオチド類及び蛋白質の除去に用いた有機溶媒を
除去しながら高分子１ｉＤＮＡを濃縮する役割を果たす
。残存洗剤及び塩類は、再懸濁ＤＮＡ溶液を適切な緩衝
液に対して透析することにより除去することができる。 場合によっては、ＤＮＡを平衡密度セシウムクロライド
勾配上の遠心分離或いはヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーにより更に精製するのが好ましい場合があ
る。上記染色体ＤＮＡに対するプロセスにおいて典型的
な実験処方はしばしばＤＮＡ抽出及び精製のプロセスに
対して少なくとも２日間要求する（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　　Ｒａｙｍｏｎｄ　
　Ｌ、　　Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ及びＲｏｂｅｒｔ　Ｃ，
Ｔａｃｔ著、１９８３年１６２頁参照）。 プラスミド及びバクテリオファージを含む原核生物ＤＮ
Ａの染色体外要素の精製に際しては標本を汚染する染色
体ＤＮＡの量を最少にするのが望ましい。バクテリオフ
ァージについてはこれはしばしば先ず感染細菌からのフ
ァージ粒子を精製し、次いで精製ファージ粒子をプロテ
アーゼ及び／又はフェノールを用いて処理してバクテリ
オファージＤＮＡを放出させることにより達成されてい
る。 更にＤＮＡの精製は染色体ＤＮＡについて説明したのと
同様な手段により達成される。しかしながら、その大き
さのために沈澱バクテリオファージ及びプラスミドＤＮ
Ａはガラス棒上には巻付けることができず従って、一般
的に遠心分離により回収されている。ここでも又全体の
単離及び精製プロセスのためには３日間が普通必要であ
る。 真核生物細胞については全細胞ＤＮＡの単離及び精製は
上記バクテリアについて説明した洗剤溶解方法の修正に
よりしばしば達成されている。主たる相異は典型的に細
胞溶解及び細胞蛋白質の消化が洗剤の存在下においてプ
ロティナーゼＫを用いて達成されていることである。（
Ｍ、　ＧｒｏｓｓＢｅｌｌａｒｄ、　Ｐ　、　０ｕｄｅ
ｔ及びＰ、　Ｃｈａｍｂｏｎ、　Ｅｕｒ、　　Ｊ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　３６（１９７３）　３２−３８　
；　Ｎ、　Ｂ１１ｎ、及びり。 Ｗ、　５ｔａｆｆｏｒｄ、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒ
ｅｓ、、　３　（１９７６）　２３０３−２３０８　；
及びり、　Ｊ、　Ｌａｗ、Ｐ、　Ｍ、　Ｆｒｏｓｓａｒ
ｄ　　及びり、　Ｌ、　Ｒｕｃｋｎａｇｅｌ、　Ｇｅｎ
ｅ、　２８（１９８４）　１５３−１５８参照〕。プロ
ティナーゼには次いで溶解物のフェノール或いはフェノ
ール／クロロホルム混合物による抽出により除去される
。典型的には細菌ＤＮＡの抽出に対するような混合操作
においては溶解物／フェノール或いは溶解物／フェノー
ル−クロロホルムはエマルジョンを形成し、その水相及
び有機相は遠心分離により分離される。ＤＮＡを含む上
部の即ち水性の相を次いで注ぎ出すか或いはピペットを
用いて取出し、この実質的に蛋白質のない溶解物を透析
して小分子量の細胞汚染物質及び残存フェノールを除去
する。 上記手法において、プロセスを自動化する能力を重大に
制限する抽出における主たる制限はフェノール抽出の際
に水性及び有機相を分離するための遠心分離の必要性で
ある。しばしば所望の純度を達成するために幾つかの抽
出が必要とされ、その各々は遠心分離を必要とする。こ
れらの各種遠心分離のために作業は手動で行われており
、従って高価である。又、これらの構成は抽出操作の自
動化を困難且つ高価にする。 一日の 本発明の好ましい実施態様に従えば、遠心分離を用いる
ことなく細胞からの核酸の抽出及び精製の新しい方法を
実施する自動化装置が提供される。 この方法において、溶解物は高濃度の塩を有する溶解緩
衝液の存在下においてプロティナーゼにで細胞を処理す
ることにより形成される。この溶解物をフェノールベー
ス溶媒系と混合してエマルジョンを形成する。このエマ
ルジョンを少なりトモ３５°Ｃの温度、より好ましくは
４５°Ｃより大きい温度に加熱して相分離を促進する。 最適の結果のためには約５５°Ｃの温度が好ましい。相
分離の速度は又エマルジョンの表面積を増大することに
より高められる。−皮相分離が完了すると、下部の有機
相を除去し、上部の水相を繰返し所定の回数フェノール
ベース溶媒で溶出し、最終的にクロロホルムを用いて抽
出する。この残存水相を次いで透析して更に核酸溶液を
精製′ｅＡ′４ｒｆｉする。 この方法を実施するための装置は試料細胞を保持するた
めの少なくとも一つの抽出溶液及び試薬を抽出溶液に移
送し流体を抽出容器から除去するための移送系を含む。 この相分離操作及び消化に際して抽出容器の所望温度を
維持するための加熱系がもうけられその含有される流体
の混合を得るために抽出容器を穏やかに振動するための
モータが使用される。このモータは又抽出容器を水平軸
の周りに回転させ、溶解物のフェノールベース溶媒系に
よる処理により得られるエマルジョンの表面積を増大さ
せる。高塩濃度と加熱及びエマルジョンの表面積の増大
の組合せの結果、相分離が２〜８分内に完了し、遠心分
離の必要性を全く除去する。 加熱系、モータ、及び移送系をコントロールするため、
容積をコントロールするため試薬の反応容器中への流れ
の時間設定のために、反応容器内の温度を追跡するため
に、及び抽出容器からの有、機相の流れを追跡するため
に、コンピュータ系が用いられる。このコンピュータは
又相分離中にモータによる混合時間及び待時間を設定す
るマスタータイマーとしても機能し、上記方法に基づい
て設定された所定の指示に従って操作する。加圧透析系
も又装置内に含まれ、移送系により抽出容器に連結され
る。この透析系は透析物をし再使用し、過度の補給を避
けるために分光光度計を介して浴容器から透析物を再循
環するためのポンプ及び浴容器に戻すための濾過系を含
む。 この発明の第２の実施例においては、抽出容器及び透析
装置は夫々独立して操作されるが、透析系は１つのもの
から別のものへと材料を簡単に移すことができるように
抽出容器と合うような形態をしている。この第２の好ま
しい実施例の装置はまた、抽出容器の中の核酸の標準エ
タノール沈澱用に特に用いられるものである。 本発明の説明の目的のために次の定義が適用される。 「エマルジョン」とは一方が他の中に懸濁して保たれる
二つの非混和性の混合物である。細胞からの核酸の抽出
において、細胞溶解及び溶解物とフェノールベース溶媒
系との混合後にエマルジョンが形成され、その構成流体
は核酸を含有する水相及びフェノール、変成蛋白質、脂
質類およに帆の細胞成分を含有する有機相である。核酸
に加えて水相も又典型的に不純物を含有し、それらは多
くの状況において更にｉｎ　ｖｉｔｒｏの操作が行われ
る前に除去されなければならない。これらの不純物とし
ては多くの炭水化物、アミノ酸などの小分子量細胞構成
物質及びヌクレオシド及びヌクレオチド等のより小さな
核酸（通常細胞液と称される）が含まれる。 「透析」とは駆動力が濃度勾配のみである場合における
二つの液体を分離する多孔質の隔壁を通しての異った大
きさの溶質の輸率差に依存する分離方法である。核酸の
抽出において透析はエマルジョンの水相における不純物
を除去するためにしばしば使用される。 「制限」とは独特の塩基配列部位におけるＤＮＡの選択
的なエンドヌクレアーゼによる切断である。一般的に、
制限性はＤＮＡ純度に対する厳格な試験と考えられる。 本発明の手法は核酸抽出に際して遠心分離を用いること
なく有機（フェノール）及び水性（ＤＮＡ及び／又はＲ
ＮＡ）相の分離を達成する新規方法の自動化に依存する
ものである。この使用される実験方法は哺乳動物細胞特
に末梢血管リンパ球、肝臓及び羊膜細胞などの組織から
の高分子量ＤＮＡ（約１０８ダルトン）までの核酸の抽
出に適したものであるが、しかし、それは又抽出が行わ
れる前に組織が適当に調製されるならばその他の真核生
物細胞に対しても用いることができる。この方法は下記
の通りである： 工程１．核酸が抽出されるべきｍ織が高濃度の塩を有す
る溶解緩衝液の存在下において酵素プロティナーゼにで
消化され、この塩はイオン強度を増大する。好ましい溶
解緩衝液は８Ｍ尿素、ＩＭＮａ　Ｃ１，１％Ｓ　Ｄ　Ｓ
、　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡＳｐＨ８，０である。消化は消化されるべき細胞
の性質に応じて典型的に約５５°Ｃにおいて３〜６時間
行われる。８Ｍ尿素の濃度はほぼ飽和に対応するもので
あり、従って上限を表わす。これより幾分低い濃度も使
用することができるが、最良の効率のためには８Ｍが好
ましいい。下限は約４Ｍ尿素のように思われる。又、そ
の他のカオトロピック剤例えばグアナジン塩酸塩も尿素
の代りに用いることができる。洗剤ＳＤＳの濃度も又典
型的に０．５％程度から２％まで変えることができるが
、しかし、約１％が殆んどのタイプの哺乳動物の細胞に
対してより適切であるように思われる。その他の洗剤例
えばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（商標）　、Ｎｏｎｅｄ
ｉｔ　　（商標）及びラウロイオルサルコシンなども又
使用される。同様に、高塩濃度も下記の工程３における
相分離を相当に遅らせる０、５Ｍから好ましいＬＭ　　
ＮａＣｆｆ１溶液を用いた場合に得られる速度よりも相
分離の速度を余り増大させるようには思われない２Ｍま
で変化させることができる。その他の塩、例えばＫＣＩ
も又使用することが出来、その好ましい濃度は用いられ
る塩のイオン強度に応じて異なる。又、ＥＤＴＡ以外の
キレート化剤例えば８−ヒドロキシキノリンを用いても
よく、又場合によってはキレート化剤は省略してもよい
。Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ２は緩衝液として機能する。 工程２．工程１から得られた溶解物を室温において約２
０分間等容積のフェノールベース溶媒系、好ましくは約
５０：４８：２の比率のフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコールと穏やかに混合されるが、フェノー
ルは蛋白質を変成及び抽出し、クロロホルムは疏水性を
増大し及びＤＮＡが水相に残るのを確実にしく工程３参
照）、及　。 びイソアミルアルコールは主として抗界面活性剤（消泡
剤）として機能する。次いで混合の結果としてエマルジ
ョンが形成される。この有機溶媒系について例えばフェ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコール系をＴｒ
ｉｓ−ＨＣｆ緩衝液、ｐＨ８，０で飽和したフェノール
で置換するなどの変更を用いてもよいが、しかし、工程
３における所望の相分離を行う際の効率のため、又緩衝
液で飽和したフェノールを用いた系の際に起こり得るよ
うなりＮＡが有機相と水相の間の界面において損失しな
いのでフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル系が好ましい。同様に、この好ましいフェノールベー
ス溶媒系の正確な容量比（即ち５０：４８：２）を変え
ることが可能であるが、クロロホルムの濃度が余りに低
いとしばしばＤＮＡが水相に溜まるよりも有機相に入る
ことになる。−ａ的に約１：１のフェノール対クロロホ
ルムの比が最適の性能を与えるように思われる。同様に
、抗界面活性剤の濃度が余りに低いと泡立ちが生じチュ
ーブを目詰りさせる可能性がある。 工程３．　工程２から得られたエマルジョンの相分離は
次いで好ましくは３５°Ｃ〜５５°Ｃの温度より好まし
くは４５°Ｃ〜５５°Ｃの温度、最も好ましくは約５５
°Ｃに加熱しなからエマルジョンの表面積を増大するこ
とにより達成されるが後者の温度はクロロホルムの沸点
に近いものである。表面積の増大はエマルジョンを含有
する反応容器を溶解物と有機相の間の界面の断面積を増
大し、これらの二相の深さを減少させる側にエマルジョ
ンを位置することにより典型的に行われる。この工程に
おける高濃度の塩、大きい界面面積及び高温の組合せは
エマルジョンを二相系に２〜８分以内に分離させ、よっ
て遠心分離の必要性を全く除去する。 工程４０反応容器をゆっくり正常の真直ぐの位置に戻し
、相分離を維持する。 工程５．　下部のフェノール相を抜出し、廃液に排出す
る。 工程６．上記工程２〜５の抽出操作を核酸を含有する上
部相が透明になるまで繰返す。典型的にはリンパ球から
の核酸の単離には１回のみの追加の抽出が必要とされる
のに対し、その他の細胞タイプ例えば肝臓に対しては３
回もの追加の抽出が必要とされる場合がある。典型的に
は最終抽出はフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール混合物を用いるよりも残存フェノールの殆んど
を除去するクロロホルムのみを用いて行われる。 工程７．工程６の後に残存する水相は、透析が最終のＤ
ＮＡ洗浄の好ましい方法である場合、透析装置へ取り出
される。又、別の方法としては、透析が標本を濃縮する
ために用いられるのではない場合、ＤＮＡやＲＮＡは標
準エタノール沈澱を用いて取り出される。 工程８．　工程７において取出され１こ溶液を典型的に
は加圧下に透析し、核酸を濃縮し、残存有機分子を除去
する。 工程９．　任意工程として工程８の後に水相をＲＮ　ａ
ｓｅ或いはＤＮａｓｅのいづれかで処理し、抽出工程２
〜８を繰返して水相にそれぞれＤＮＡ或いはＲＮＡのみ
を残すことができる。 工程１０．精製試料を集める。 装−１ 本発明の好ましい実施態様に従えば細胞から核酸を単離
精製するための装置が第１図、第２Ａ及び２Ｂ図、第３
図及び第４図に図示されており、それらは各々系を通し
て各種試薬及びガスを一定経路に従って運ぶための流体
移送系１００、抽出操作の際に環境及び抽出容器の物理
的傾きをコントロールするための室／検子系２００、透
析系３００及び自動コントロールを行うためのコンピュ
ータ系４００を示している。 第１図に示される流体移送系１００は一連の試薬容器１
〜９、各試薬容器に対して一対のバルブを配置した一連
の電気的に操作されるガスパルプ２１〜３８を含む。一
連のガスバルブ２１〜３８の各々は試薬容器内の圧力を
コントロールするために圧力マニホルド４０或いはベン
トマニホルド４１のいづれか、及び１〜９の特別の試薬
容器に接続されている。その様な試薬容器はその中に含
まれる試薬に応じて典型的にはガラス或いはポリエチレ
ンで構成されている。上記の抽出操作に用いられる特別
の方法に対しては試薬としては酵素、プロティナーゼＫ
、８Ｍ尿素、ＬＭ　　ＮａＣｆ、１％　ＳＤＳ、５０　
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、及び１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ
、ｐＨ８，０で構成される溶解緩衝液、フェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール（５０：４８：２）
の混合液、クロロホルム、及びＲＮａｓｅ及び／又はＤ
Ｎａｓｅなどが挙げられる。その他の方法、例えば細菌
及び酵母からの抽出のために使用することのできるその
他の試薬としては例えばりゾチーム、ＳＤＳ、エタノー
ル、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！、、ＥＤＴＡ、各種塩溶液、そ
の他の緩衝液が挙げられる。 試薬容器の各々は電気的に操作されているバルブプロッ
タ５０に連結されており、このバルブブロックは米国特
許４，００８．７３６号明細書（１９７７年２月２２日
発行、発明の名称：　ＶＡＬＶＥ　ＡＲＲＡＮＧＥＭ−
ＥＮＴ　ＦＯＲＤＩＳＴＲＩＢＵＴＩＮＧ　ＦＬＵＩＤ
Ｓ、ウィットマンーリーボルド等（Ｗｉｔｅｍａｎ−Ｌ
ｉｅｂｏｌｄ、　ｅｔ　ａｌ）　］に記載されているも
のと同様なゼロデッド（ｚｅｒｏ　ｄｅａｄ）容積バル
ブの組立て物であり系内の全てのその他のバルブブロッ
クも同様である。その様な電気的に操作されるバルブブ
ロックの一例はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
、　Ｉｎｃ、部品番号６００６５６により製造されてい
る。もう一つの例は同時係属中の出願”Ｉｍｐｒｏｖｅ
ｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ
ｒ　ｔｈｅ　Ｓ’ｅｑｕ−ｅｎｔｉａｌ　Ｐｅｒｆｏｒ
ｍａｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓ
ｅｓ”（Ｌ、Ｅ、Ｈｏｏｄ等により５ｅｒｉａｌ　　Ｎ
ｉｌ　４４０．５７１゜ｋで１９８２年１１月１０日に
出願され同−被譲渡人に譲渡されたもの）に記載されて
いる。各種試薬容器からの流体流れは適当なガスパルプ
を開け、適当な排気バルブを閉じて所望の試薬容器内の
圧力を増大させ、及びバルブブロック５０内の適当なバ
ルブを開けることによりコントロールされる。バルブブ
ロック５０に連結されているバルブブロック５１は次い
で容器１１〜１５の一つである特別の抽出容器に流れを
導く。これらの抽出容器内への流れはその各々がガスマ
ニホルド７２或いはベントマニホルド７４のいずれかに
連結されている一連の電気的操作されるガスバルブの対
６１〜７０を介してコントロールされる。−度抽出容器
内の抽出が完了し、有機及び水相が分離されると、有機
相（抽出容器の底部にある）を所望の抽出容器内の圧力
を増大させ、バルブブロック５１内の対応するバルブを
開けて抽出容器１１上のチューブ１７のような排出チュ
ーブを通して流体を容器の外に押出す。バルブブロック
５１は流れを電気伝導度検出器５５を通してもう一つの
バルブブロック５２及び廃液に導く。水相はその高い塩
含量のために高い電気伝導度を有するので、有機相が抜
出されると大きな電気伝導度増大が見られる。これが相
界面が検出されたことを示し、それ以上の如何なる流体
の抽出容器からの除去を停止するのに必要な信号をコン
ピュータ系に与える。その信号が一度受取られるとバル
ブブロック５２中の廃液バルブが閉じられ、バルブブロ
ック５１のいづれかの適当な出入口即ち１以上の出入口
８０〜８６が開かれ、水相を透析３００に排出するか或
いは透析出入口が閉められ流体移送ライン中に残存する
水相を押出してもう一つのフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール抽出の準備中の適当な反応容器に
戻す。ガスバルブ３９を使用してＴｒｉｓ−ＨＣｌのよ
うな緩衝液を抽出容器１０からブロックバルブ５２中に
バックフラッシングのために押出す。 各種容器及びバルブを接続するための上記装置における
チューブ１６のようなチューブは典型的にＴｅｆ　ｔｏ
ｎ　（商標）で構成されている。系内における液体を移
動するための各チューブは大まかに測定された流れ抵抗
を有し、圧力マニホルドによる移動中に固定された知ら
れた圧力で操作される。よって、移動に必要とされる時
間の長さは移動物質の容積に直接に対応し、コンピュー
タ系によりコントロールされる。系内のガス流も又コン
ピュータ系によりコントロールされ、ガスバルブ２１〜
３９及び６１〜７０は、典型的にソレノイド操作されて
いる。その様なバルブの一例は、Ａｎｇｅｒ　Ｉｎｃ、
製のフルオロカーボンバルブが挙げられる。適当な電気
伝導度検出メータ５５の一例はＭｏｄｅｌ　　２１２−
１００電気伝導度メータに連結された、Ｗｅｓｃｏｎ　
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　　Ｍ　ｏ　ｄ　ｅ　１２１９
−２００電気伝導度フローセルである。 第２Ａ図及び第２Ｂ図にはモータ２０１、検子アーム２
３０、及びバンドヒータ２２１〜２２５（各抽出容器に
対して１個づつ）及び対応するサーミスタ２３１〜２３
５並びに抽出容器１１〜１５を含む断熱室２０５を含む
部屋／揺り子糸が示されている。典型的な実施態様にお
いて、室２０５は通常構成の容易性及びその透明性のた
めにプレクシガラスで構成されている長方形の平行六面
体であり、この平行六面体は約２Ｑインチ（約５０．８
ｃｍ）の長さＬｌ、約１４インチ（約３５．６ｃｍ）の
高さＨｌ、及び約１２インチ（約３０．５ｃｍ）の幅Ｗ
１を有し、又平行六面体の頂部に温度コントロールを助
けるための絶１ｔｌ！１２１１を有する。又、１以上の
ファン（図示せず）を通常使用して抽出容器を冷却する
ために室２０５を通しての排気を維持する。層２１１の
ための典型的な材料は約１７２インチ（約１．３ｃｍ）
厚のスタイロフォームである。 室２０５の上記寸法は抽出容器の所望の数及び大きさ、
及び室内に望まれる空間の量に応じて相当に変化させる
ことができ、抽出容器の操作を容易にすることができる
。揺り子アーム２０３は典型的には約１７４〜１７２イ
ンチ（約０．１〜１．３ｃｍ）厚、及び約１６インチ（
約４０．６ｃｍ）長、及び約４インチ（約１０．１ｃｍ
）幅のプレクシガラスなどの絶縁材料の平坦なシートで
ある。この揺り子アーム２０３には通常揺り子アームの
長さに沿って典型的には金属性であり、本質的にモータ
２０１のための延長された駆動軸である揺り子アーム軸
２１３が堅く付着されている。揺り子アーム２０３は典
型的には抽出容器の各々を保持するためのねじ切された
１１χめ合〜Ｕを堅く所定位置に貫通された穴を有し、
抽出容器は典型的にはねじ切りされた頂部を有し、その
嵌込みは容器内にガス及び液体を流入するためのテフロ
ンラインに対応した三つの貫通孔を有する。好ましい状
態において、モータ２０１はＤＮＡの剪断を避けるため
に混合操作中に毎秒はぼ１回の抽出容器のゆっくりした
振動を与えるように連動されているステッパモータであ
り、その振動は典型的には５０°〜６０°の角度を介す
るものである。相分離に際し、モータ２０１を抽出容器
に　。 対して完全な水平に対応する位置まで押進め、数分間保
持し、次いで通常相分離が維持されることを確実にする
ために約１０秒間に亘って正常な位置（即ち、抽出容器
に対して真直ぐな容器）に戻される。その様なモータ２
０１の一例はピッチ直径がＯ’、６〜３．６に定速ギヤ
にされたＡＩＰＲＡＸ　ＭｏｄｅｌＫ８２Ｂ２１−Ｐ２
である。 第５図は抽出容器１１〜１５のための好ましい設計を図
示するものである。各容器はガラスで構成され、約１５
０柵の全長Ｌ　２、約２８ｍｍの最大外側断面直径ＤＩ
を有し、流体の除去を容易にするために点Ｐまでテーパ
している。好ましい態様においては、容器は目盛りが付
されておりねじ頂部２１２の下に約４０ｍ１の容積を有
する。その様な容積の一例はＣｏｒｎ　ｉｎｇストック
番号８０８２として市販されているパイレックス円錐ね
しキャップ遠心目盛付チューブである。これらの容器を
揺り子アーム２０３の所定位置に保持するために使用さ
れる嵌込みは典型的に三つの部品即ち、ねじ山を切られ
たキャップ２１７．ねじ頂部２１２を受けるための内部
のねじ山を切られた開口部及びキャップ２１７を受ける
外部のねし山を切られた領域を有するフランジ付カップ
リング２１５、及びフランジ付カップリング２１５に加
圧嵌込まれて抽出容器の不活性な栓としての役割を果た
すテフロンインサート２１９により典型的に構成されて
いる。インサート２１９は通常必要とされる液体及びガ
スを受入れるための三つの貫通孔を有する。例えば抽出
容器１１に対しては排出チューブ１７、ガスマニホルド
７２に連結している加圧チューブ１８及びベントマニホ
ルド７４に連結しているベントチューブ１９がある。こ
のチューブの主たる特徴はチューブが垂直な位置から水
平な位置に再配置される際に生ずるそれが含む液体の表
面積の大きな変化であり、この表面積の変化がエマルジ
ョンの相分離速度を高める。この表面積の変化を達成す
ることのできるその他のチューブ形状も又使用すること
ができ、一般的な場合においてその中に含まれる液体の
表面積を増大するために必要とされる回転角度は９０°
でなくてもよい。 第３図には抽出容器１１〜１５から取出された核酸を更
に精製及び濃縮するために使用される加圧透析系３００
の概略が示されている。系３００はマニホルド収納部３
５１及び温容器３５０を含み、これらの両者は典型的に
直方体断面であり、温容器は通常的８２の溶解物３７０
を含有する。 温容器３５０及びマニホルド収容部３５１は共に透析物
から異物を排除するために使用されるカバー３５２に対
向し、容器３５０がそれにシール３５３を介して密封さ
れており、マニホルド収納部３５１はその一方の側に蝶
番３５４により、他方の側において締め金３５５により
接続されている。温容器３５０は通常周囲雰囲気に排気
されている。好ましい態様において、温容器、マニホル
ド収納部、及びカバーはプレキシガラスで構成されてい
る。 カバーに付着されその中の孔を通して透析物中に懸架さ
れて複数の透析バッグ３１１〜３１５があり、それらは
典型的には抽出容器１１〜１５とそれらにパルプブロッ
ク５１を介して対応関係にある。マニホルド収納部３５
１は収納部３５１が透析バッグを受入れる底部部品３５
６を貫通する孔を除いては閉じられた容器であるように
底部部品３５６を含み、ガスチューブ３２３及び３２４
、及び流体ライン１０１〜１０５のための孔はフィード
スルーにより密封されている。第６図は圧力が透析時に
マニホルド収納部３５１において維持することができる
ような透析バッグと密封系の詳細を図示するものである
。一般的に、これらの透析バッグは透析装置とは独立に
ガラス嵌込み部に付着される。例えば、透析バッグ３１
１は一端においてテーバに磨かれているガラスチューブ
３７１の小片の一部にかぶせて置かれている。次いでこ
のチューブ３７１と透析バッグ３１１を対応する磨かれ
たガラスチューブ片３７２中に堅く押込まれ、回転が与
えられて三片のチューブ間に密封が行われることにより
この透析バッグを堅く両者の間に保持する。 カバー３５２はこのより大きなチューブ３７２及び透析
バッグ３１１に適合するようにドリル加工されており、
Ｏ−リングシール３７４に適合するようにさら孔が開け
られている。この透析バッグ及びチューブ３７１及び３
７２で作られているガラス嵌込部を次いで孔を通して置
く。底部片３５６はマニホルド収納部が蝶番３５４の周
りに閉じられた位置に回転される際にこのガラス嵌込み
部と並べられる孔３７５を有する。グロメットシール３
７６が孔３７５内に配置され、ガラス嵌込部とマニホル
ド間の密封を行うために用いられる。 この透析系３００は又透析物３７０を浴容器から抜出す
ための再循環チューブ３３６．透析物を再循環系を通し
てポンプ送りするための螺動ポンプ３７７、透析物の吸
光度を追跡するための分光光度計３３５及びフェノール
及びその他の有機物質を滲出するための二重のライン内
フィルター３３３を有する再循環系３３０をも含むもの
である。典型的な実施において、フィルター３３３は有
機物質を除去するための炭素室フィルター３３２及び無
機物質を除去するための温床イ、オン交換樹脂フィルタ
ー３３１を含む。又、分光光度計３３５は透析物中に残
存するフェノールの目安を与える際に典型的に２７０ｒ
＋ｍにおける吸光度を測定する。 この系は吸光度（Ａ２７０）が０．０１以下に低下する
際にフラッグを通常設定し、コンピュータ系に透析機能
が完全であることを示す。透析操作の際にマニホルド収
納部３５１内の圧力は窒素などの不活性ガスを用いて維
持され、通常５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕｅ
ｌｌから販売されている２　〜８　ｍｌの容積を有する
コロジオンバッグなどの透析バッグを有する際には約１
２００ａｎＨｇ　（ゲージ）に維持される。ポンプ３３
７は典型的には１５ｐｓｉ（約１．１ｋｇ／Ω２）のベ
ッド及び約１１／分の流速を与える。二重蒸留水が典型
的に透析物３７０として使用される。この再循環系の目
的あ規則的間隔で補給される代わりに透析物を再使用し
て更に自動的操作を容易にすることである。 第４図は自動的コントロールのために用いられるコンピ
ュータ系４００の概略図を示す。この系はＨｅｗｌｅｔ
ｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　８５などのマイクロプロセッサベ
ースのコンピュータ４０１により構成されており、それ
は抽出時に抽出容器の加熱コントロールするための加熱
コントローラ４０９を駆動し、及びそれぞれバルブブロ
ック、ガスバルブ及び螺動ポンプ４３６のソレノイドを
コントロールするための駆動材４１０．４１１及び４１
２に信号を入力するためにコンピュータ４０１からのデ
ジタル信号をアナログ信号に変換するだめの変換系４０
３に連結されている。変換器４０３も又分光光度計３３
５及び電気伝導度メータ５５及びサーミスター２３１〜
２３５からの信号をコンピュータ４０１に与えるアナロ
グからデジタルへの変換器として作用する。その様な変
換器４０３の一例はＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ３
４９　フィンターフエースである。このコンピュータは
又混合操作の際に抽出容器を振動させ、又相分離のため
に抽出容器を水平に位置させるために使用されるステッ
パーモータをコントロールするためのモーターコントロ
ーラ４０５に信号を与える。その様なコントローラ４０
５（７）典型例は５ｕｐｅｒｉｏｒ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ
からのＭｏｄｕｌｙｎｘ　（商標）Ｍｏｔｉｏｎ　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｃａｒｄ　、タイプ
ｌ０Ｄ００５Ａである。 ５皿 第７図を見れば、７はこの発明の第２の好ましい実施例
であり、これには核酸自動抽出が備わってはいるが、自
動透析を組み入れてはいない。むしろ、この第２実施例
の装置は透析カセットと合う様に設計されているので以
後透析カートリッジと呼ぶこととして、抽出後は、もし
希望なら、もっと低い温度で透析は単独で行うことがで
きる。 この装置はまた、核酸の標準エタノール沈殿方法と共に
使用され得る。 第２実施例は典型的には１０ｐｓ　ｉの高圧源７０１、
典型的には１．５ｐｓｉの低圧源７０３、水成試薬用の
ガス・マニホルド７０４、及び有機試薬用のガス・マニ
ホルド７０５を含んでいる。水成試薬の典型的な選択は
次に述べる通りである： 容器Ｒ１はプロティナーゼＫを含む；容器Ｒ２はリゾチ
ームを含む；容器Ｒ３は、例えば、４Ｍ尿素、　０．２
ＮａＣｌ　、　１００ｍＭ　ＴｒｉＳ−■Ｃ１ｐ　Ｈ８
，０，０，５％のラウリル酸サルコシン１０ｍＭＣＤ　
Ｔ　、Ａのような溶解緩衝液を含む；容器Ｒ４は３Ｍ酢
酸ナトリウムｐＨ５，５を含む；容器Ｒ６は７０％のエ
タノールを含む；そして容器Ｒ７は水を含んでいる。有
機試薬は次に述べる通りである： 容器Ｒ８はエタノールを含む；容器Ｒ９は５０対５０の
フェノール／クロロホルムを含む；そして容器ＲＩＯは
クロロホルムを含む。電気的に作動されるバルブ・ブロ
ック７２３は、息前のように時間と圧力を基に測定しな
がら、試薬の種々な容器Ｒ１〜ＲＩＯからの流れを制御
する。 バルブ・ブロック７２３のボート７１０は８個の反応容
９７４１〜７４８への種々な試薬の流れを方向づけるバ
ルブ・ブロック７２５に接続される。ストリップ・ヒー
タ７４９が各々の容器に付いており、抽出中の望ましい
温度制御をもたらす。バルブ・ブロック７２５及び反応
容器７４１〜７４８は又廃気マニホルド７２６に連結さ
れている。この第２実施例では、反応容器７４１〜７４
８、廃気マニホルド７２６、ストリップ・ヒータ７４９
、及びバルブ・ブロック７２５は全て振子装置上に設置
されており、モーフ（図示せず）によって軸７２７の周
りで同時に揺すられる。第１実施例では抽出工程の間の
軸７２７の周りでの振動はきわめてゆっくりであり、お
およそ１秒Ｋ、回、典型的には５００乃至６０’の角度
である。又、装置は揺れるので、反応容器は位相分離の
間完全な水平位置にある。 この第２実施例では、ガス分配が簡略化されたばかりで
なく、反応容器系も簡略化された。各々の反応容器の上
部の外で転送流体に圧力をかけねばならない代りに、容
器が流出型のものであったり、もし望むなら底部外に圧
力をかけられるので、反応容器内の材料は重力流によっ
て取り出され得る。又、反応容器７４１〜７４８の底部
には、各々の容器に対して１個づつ、有機相が取り出さ
れる時に監視するために電池７５１〜７５８がある。反
応容器からの流れはアンガー・バルブ７６１〜７６８に
よって制御される。 第８図は振子装置上で反応容器を保持するために装置の
１部を破断して示している。キャップ８０１は反応容器
７４８の上部に対ｊ７てきつくバネ負荷封じ８０５を保
持している。底部には、典型的にはポリエチレンの旋回
接続子８０７が雄ルナー型取付具８０８と共に反応容器
を密封するようにする。旋回接続子は反応容器の洗浄を
楽にするために取り外し自在である。この実施例におい
ては、Ｏリング８０９に対して反応容器７４８のリップ
７４９が載っているので、反応内容器の内側全体が洗浄
されるものであり、汚れを取り除くための空間を全く必
要としない。 ハウジング８２３の内部で移動する胴体８１１は適所に
旋回接続子８０７を保持する。電池７５８は例えば腐食
抗力をもたらすために、典型的には金で塗装される。 電池の２つの電極はテフロン分離帯８１５によって分離
されている。別のテフロン分離帯８１７が、バネ８２１
によって負荷がかけられている保持リング８１９に対し
て電池を適所に保持するので、反応容器７４８に対して
集成体全体に負荷をかけることとなる。又、ハウジング
８２３はピン８２４を介して設置部材８２５へ摺動自在
に付着されていて、前記ピン８２４は設置部材８２５の
中で上下に滑る様になっていて、旋回接続子のかたい封
印を反応容器へ及ぼす様にさせるのである。 第９図には、この第２実施例で使用する様に設計された
反応容器の３つの例が示されている。容器９０１は１４
ｍＪ容器で、これは長さ約６インチ、約０．６インチの
最大内のり直径Ｄ９０１の、縦横１０；１の比率を有す
るガラスで構成される。容器９０１の上部９０５は四角
に切断されており、残りのＤＮＡを収集するためにデッ
ド・スペースをもうけなくても、バネ負荷封じ８０５に
対してしっかりと封印される。 消化されることになっている材料が上部９０５から導入
されるので、該上部の内のり直径Ｄ９０５は比較的太き
（、約０．２５インチである。容器９０１の底部では、
容器約０．１５６インチの内のり直径Ｄ９０７へと首状
にサイズが狭まっており、内側へ１．７°角度をつけて
削られていて、雌ルアー型取付具９０７をもならす様に
する。容器の底部にはリップ９０９がもたらされていて
、洗浄中に０リング８０９と共に封印する効果をもたら
す。反応容器９０２は、全体要約４．５インチ、最大内
のり直径０，４５インチの、縦横比率が１０＝１になる
、７ｒｒＬｌ容晋である。容器９０２に′は、容器９０
１と同じように、底部に、雌ルアー型取付共及びリップ
がもたらされている。同様に、上部は四角に切断され、
封じ８０５に対して載るために、容器９０１のサイズと
同じサイズになっている。反応容器９０３は約３．６イ
ンチの長さで、最大内のり直径約０．３６インチの、縦
横比率１０＋１になる、３．５−容器である。この容器
の上部及び底部は容Ｎ９０１及び９０２の上部並びに底
部にぴったりと合うようになっている。これら夫々の容
器における１０：１の縦横比率は、垂直位置にある時の
容器内の流体の断面域に対して容器が水平位置にある時
に該容器内にある流体の領域への実用的な比率をもたら
すものであり、それ故に、相努離の工程を楽にするので
ある。もっと大きい縦横比率でさえも相分離には望まし
いのであるが、１５：１よりも大きな縦横比率は別の工
程に対して実用的でなく、例えば、容器の中で試薬を混
合する時などはそうである。又、１０：１よりも低い縦
横比率も用い得るが、６．５＝１以下であれば、相分離
は著しく低下する。 第１０図は通常の垂直位置にある指子装置１００１の側
面図である。指子装置は揺台１００２を担持しており、
この揺台１００２には反応容器が典型的には熱エポキシ
によって取付られている。揺台は又容器と接触してスト
リップ・ヒータ７４９を保持するようになる。台８２５
は指子装置１００１に摺動自在に取付られており、ピン
８２４（図示せず）及びハウジング８２３を保持し、長
さのそれぞれ異なる反応容器が適所に保持されるのを可
能にする。キャップ８０１は指子装置１００１へ取付け
られたラッチ１００５によって適所に保持されており、
前記ラッチは前記キャップ上で下へ挾み付けて、適所へ
と鎖錠し、バネ負荷封じ８０５（図示せず）及び反応容
器７４８間に固い封印を与える。旋回接続子８０７はレ
バー・アクチユエータ１００７によって反応容器に対し
て適所にしっかりと保持されており、該レバー・アクチ
ュエータはハウジング８２３を前に説明したように、台
８２５の一側で上下に動かす。 抽出を行うためのこの第２の実施例を使う場合、本願発
明の方法は若干変更さねばならない。第１に、容器から
容器への横断消化を避ける場合、あるいは後で説明する
浄化サイクルの場合を除いた他の全ての操作の時に、指
子装置１００１は反応容器７４１〜７４８の順序を逆に
して逆転させられ、容器はマニホルド７２６へ排気する
。溶解緩衝液及びプロティナーゼＫが、バルブ・ブロッ
ク７２３及び７２５を介して所望の番号の反応容器へ添
加される。 次に、容器は約６０℃に予め温められ、容器をしずかに
揺すっている間、５乃至１０秒間にプロティナーゼＫに
存在し得るがもじれないあらゆる残余の核酸分解作用を
取り除（。（残りの説明を簡単にするために、工程は１
つの反応容器、容器７４８に関してのみ記載することと
する。） 指子装置は次にその通常垂直位置に揺れ戻り、キャップ
８０１はラッチ１００５を上昇させてはずされる。そし
て、上部から核酸試料が加えられ、ラッチ１００５が容
器へしっかりとキャップ８０１を押し付けて閉められる
。それから指子装置はその通常の垂直位置に関して公称
９０’位置へと移動し、反応容器は試料を消化するため
に公称６０℃まで温めている間水平位置の周りで前後に
揺動される。消化が完了した後、揺子装置は上下逆転し
て、反応容器は廃気マニホルドへ排気する。フェノール
／クロロホルム溶媒が次に酸塩バルブ・ブロック７２３
及び７２５を介して溶解酸塩と一緒に反応容器へ配られ
、溶解酸塩と溶媒は、第１実施例において説明したよう
に、核酸から汚染蛋白質を抽出するために約１５分間水
平位置周囲で前後に揺らすことによってしずかに混合さ
れる。−旦抽出が完了したならば、揺子装置は停止し、
反応容器は相分離を成し遂げるために加熱されている間
約５分間、水平位置に保持されている。相分離が発生し
たならば、揺子装置　１００１は、反応容器の底部が水
平線上で約１０度になるような位置へと揺すられて、ア
ンガー・バルブ７６８は廃気マニホルド７２６へ排気し
、加熱によって生じた圧力を解除する。それからアンガ
ー・バルブ７６８は閉じ、容器が垂直位置へ動かされ、
下方のフェノール相が廃気マニホルド７２６へ抽出され
る。電池７５８は反応容器から材料を取り出すのを停止
するために、相の変化を検出するために用いられる。上
述した抽出工程は上方相が蛋白質から解除された状態に
なるまで、前のように繰り返される。これらの連続する
抽出工程の時間は典型的には１０乃至１５分である。し
かしながら、連続相分離はもっと短時間、約２乃至３分
で発生する。 上述の抽出工程が完了したならば、核酸を濃縮する２つ
の方法、透析あるいはエタノール沈殿の内いづれか一方
を用いることができる。 第１１Ａ図には、反応容器の底部で雌ルアー型取付具上
に合うように設計された透析カートリッジ１１００の構
造が示されている。このカートリッジは、２つの透析部
材１１１７及び１１１９と一連のガスケット１１２１．
１１２２．１１２３及び１１２４でサンドイッチ状に挾
み付けられた２等分された枠部材１１１３及び１１１５
で作られていて、前記ガスケットは透析部材の間でサン
ドイッチ状に挟まれている。各々の枠半分は一連の突出
した窓を有しており、枠半分づつが一緒に組付けられた
時、ガスケット１１２１〜１１２４によってもたらされ
た部材間の空間により限定された４つの槽を提供しなが
ら、透析部材とガスケットを適所にしっかりと挾み付け
る。 第１１１３図は４つの槽１１４１〜１１４４が有る完全
な構造を示している、この槽を一杯にするために、ガス
ケットには、上部に雄ルアー型取付具１１５１〜１１５
４を有する注入管がもたらされている。又、各々の注入
管は反応容器が中にぴったりと収まるように間隔をあけ
であるのと正確に同じ距離分離隔している。 第１２Ａ図乃至第１２Ｂ図は透析カートリッジを取付け
、満たんにするのに用いられる方法を示している。第１
に、透析カートリッジは第１２Ａ図に示されているよう
に、半分垂直位置へと揺り動かされる。次に、反応容器
が第１２Ｂ図に示されているように開けられ、容器は、
カートリッジを取付けるために、第１２Ｃ図に示された
ように、幾分揺子装置１００１から離して振られる。分
析カートリッジ１１１３はそれから第１２Ｄ図にあるよ
うに取付けられ、第１２Ｅ図にあるように、レバー・ア
クチュエーター１００７並びに他の反応容器に用いられ
るアクチュエーターに対応するレバー・アクチュエータ
ーによって適所に締め付けられる。揺子装置は次に第１
２Ｆ図に示された位置へ揺り戻され、これで透析カート
リッジにおける槽への注入を行う。 第１３図は反応容器７４１〜７４８へ取付けられた透析
カートリッジ１１００及び１１０１を有する揺子装置の
正面図である。透析カートリッジが満なんになると、カ
ートリッジは取り外され、標準の透析工程が抽出された
核酸を濃縮して洗浄するために用いられる。透析カート
リッジの更に詳しい説明については１９８６年４月１０
日の、Ｇ、Ｒｉｅｈａｒｄ　Ｃａｔｈｅａｒｔ。 他による係属中の出願、ｒＤｉａｌｙｓｅｔｔｅ　（商
標）透析カートリッジ」を参照いたｔ！きたい。 核酸、例えばエタノール沈殿を濃縮するための別の手が
かりは装置の構造によっても高められるものである。標
準のエタノール沈殿により、ある量の酢酸ナトリウムが
試薬容器Ｒ４から反応容器へ加えられるが、この量は残
余溶解酸塩の量の０１に等しいものである。そして、試
薬容器Ｒ８からのエタノールのこの２つの量が加えられ
、容器は核酸を沈殿するのにしずかに揺らされる。２つ
の量のエタノールは溶解酸塩及び酢酸すトリウムを一緒
にした量の２倍に相応する。 沈殿した核酸を収集するには今後Ｐｒｅｃｉｐｉｔｅｔ
ｔｅ（商標）収集ユニット１４４という名で呼ばれる特
別の収集装置が用いられる。第１４図はこの収集ユニッ
ト１４００の断面を示している。該ユニットは円形上部
１４０１から構成されており、該円形上部は上方に伸び
出ている要素があり、その最上部では反応容器の底部に
ぴったりとはまるように雌ルアー型取付共の形態を取る
。環状管１４０３が上部１４０１を通過しており、ユニ
ットの表面に核酸が収積しないようにするために面取し
た滑らかな表面を有する。上部１４０１にはスナップ・
リング１４０９があり、該スナップ・リングは、上部１
４０１及び底部１４１５を一緒に保持するために底部１
４１５の中に設置した円形の戻り止めに嵌まる。フィル
タ１４０２をそこに保持するために支持網１４１７が上
部及び底部間に挟まれている。円形突起１４１８は前記
網１４１７に対してフィルタ１４０２を押圧し、ユニッ
ト内の適所にフィルタと網を共に保持する。底部１４１
９がもたらされており、該底部は、旋回接続子１４１９
が通常取付られている所の胴体８１１へ直接はまるよう
になる。更に、底部１４１９には、排気用にユニットを
接続するために管１４２０がもたらされている。上部１
４０１の底部及び網の間の容積は沈殿した核酸を収集す
るためにもたらされている。 ｐｒｅｅｉｐｉｔｅｔｔｅ（商標）収集ユニット１４０
０を使用するには、まず−旦エタノール沈殿を行ってか
ら、揺子装置がその逆転位置へ揺すられる。旋回接続子
が取り外され、Ｐｒｅｃｉｐｉｔｅｔｔｅ収集ユニット
が設置場所に据付けられる。揺子装置は次にその通常の
垂直位置へ激しく揺すられ、と同時に、この下方向動作
が空気及びエタノール中で脈動している間に、反応容器
の側部から、Ｐｒｅｃｉｐｉｔｅｔｔｅ収集ユニットへ
と、沈殿物を流出させるようにする。この空気とエタノ
ールの脈動は交互のサイクルで行われるもので、典型的
には、空気の場合、時間にして約６００７脂Ｓｅｅ、エ
タノールの場合、時間にして約３００７　ｍ５ｅｃであ
るが、こめ時間は洗浄されている反応容器のサイズ次第
で変化し得る。沈殿物が反応容器から流出さるに従って
、沈殿物は収集ユニットのフィルタ１４０２に収集され
る。もし希望するならば、反応容器をエタノールで満た
し、ユニットを通して廃気物を出すようにして該容器を
排水することにより、沈殿物は更に洗浄され得る。 そして、沈殿物は、フィルタを収集ユニットから取９外
すことで収集され得る。 透析あるいは沈殿方法のいづれの場合でも、ＤＮＡ上に
残っている微片が次に行う抽出工程を汚染し得るし、又
、将来にわたる実験で次々と反復され得るので、反応容
器を再度使用する前には含入りに洗浄しなければいけな
い。この洗浄を達成するには洗浄サイクルが始められる
が、この洗浄サイクルにおいては、各々の容器は相互汚
染を防止するなめに、別個に洗浄される。この順序を次
に述べろ。 第１に、各々の容器は約６０℃に容器内で加熱された水
を加えてリンスする。各々の容器は激しく揺すられ、湯
を一度に排出する。次に６標準硝酸を各々の容器に加え
、激しく揺すっている間に約６０℃に加熱する。次に、
硝酸を一度に排出する。 各々の容器は次に水でリンスされ、６０℃に加熱され、
激しく揺られ、そして、−度に水に排出する。 ５０対５０の溶解緩衝液と水の混合物が各々の容器に加
えられ、硝酸を中和し、６０℃に加熱し、前のように容
器は揺すられ、排水される。そして、各々の容器は第１
回目の水でのリンスと同じように第２回目のリンスをさ
れる。上述の個々のサイクルは約３分必要である。この
洗浄操作の結果、反応容器は再使用の準備が整ったこと
となる。 この第２実施例のコンピュータ制御は操作すべき幾つか
のバルブがあること、透析ポ、ンピング系がないこと、
監視すべき分光光度計がないことを除けば第１実施例の
ものと実質的に同じである。 コンピュータソフトウエアニ 最も基本的レベルにおいて、抽出装置のソフトウェアコ
ントロールは各種物質の一つの容器からもう一つの容器
への所望の流れを達成し、必要な操作を行うために適当
な時点において、バルブを開閉し、スイッチを入れたり
切ったりする事柄である。本発明の方向が一連の工程で
あるという事実はソフトウェアコントロールには便利な
ものである。以下に、使用することが望ましい如何なる
プログラム言語にも容易に翻訳することのできる抽出方
法の各工程に示される特別の指示事項の一例を示す。そ
れは試薬容器ｌが溶解緩衝液を含有し、試薬容器２がプ
ロティナーゼＫを含有し、試薬容器３がフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコールを含有し、試薬容器
４がクロロホルムを含有し、及び試薬容器５がＲＮａｓ
ｅを含有するとの想定に基づくものである。 工程１：組織消化 ユニ２１１号　コマンド １０　バルブ２２：５０（出入口９１）；５１　（出入
口８０．８１）；６１ を開ける。 コマンドｌＯＯ後４分後に全ての バルブを閉める。 コメント：溶解緩衝液の容器１への移送が今や完了した
。 ３０　バルブ２４ｉ５０（出入口９２）；５１　（出入
口８０．８１）；６１ を開ける。 ４０　コマンド３０後０．５分後に全てのバルブを閉め
る。 コメント：ブロティナーゼにの移送が今や完了した。 ５０　容器１のヒータ２２１のスイッチを入れ、温度を
５５°Ｃに昇げて維 持する。 ６０　モータ２０１のスイッチを入れ、回転角を一秒の
周期で±６０”　に 設定する。 ７０　コマンド６０後３時間後にモータ２０１及びヒー
タ２２１のスイン チを切る。 ８０　消化混合物の冷却を待つ。 工程２：抽出 ９０　バルブ２６；５０（出入口９３）；５１（出入口
８０．８１）；６１ を開ける。 ｌＯＯコマンド９０後５分後にパルプ６１以外の全ての
バルブを閉じる。 コメント：抽出混合物（フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール） の移送が今や完了した。 １１０　モータ２０１のスイッチを入れ、回転角を±６
０°に設定する；周 期１秒。 １２０　コマンド１１０後２０分後にモータ２０１のス
イッチを切る。 工程３：相分離 １４０　モータ２０１のスイッチを入れ、回転角を９０
°に設定する。 １５０　回転角が９０°に達するとモータ２０１のスイ
ッチを切る。 コメント：抽出容器は今や水平位置に保持されている。 １６０　ヒータ２３１のスイッチを入れ、温度５５°Ｃ
に上昇させて維持する。 １７０　温度がコマンド１５０の下に５５°Ｃに達した
後１２分後にヒータ２３１ のスイッチを切る。 工程４；抽出容器の真直ぐな位置への変換１８０　温度
が５５°Ｃに到達後１２分後にモータ２０１のスイッチ
を入れる。 回転角を０°に設定。降下速度は ９°／秒に設定。 工程５：フェノール相の抜出し １９０　バルブ６１を閉める。 ２００　バルブ６２；５１（出入口８１）；５２（出入
ロア１．７２）を開け る。 ２１０　電気伝導度を電気伝導度メーター５５で追跡す
る。 ２２０　電気伝導度が１０　’　Ｍｈｏｓに到達後１秒
後に全てのバルブを閉じる。 コメント：電気伝導度が高くなった後にコマンド２２０
における１秒間の遅れ はバルブブロック５２への移送ラ イン中に残された残存フェノール が除去されたことを確実にするた めである。 ２３０　バルブ５２（出入ロア４）；６１を開ける。 ２４０　コマンド２３０掻３０秒後に全てのバルブを閉
じる。 ２５０　バルブ５２（出入ロア１．７３）；３９；５２
（出入口８１）；６１ 開ける。 コメント：コマンド２５０はバルブブロック５２を逆流
させ、移送ライン中に 残された水溶液を更に抽出或いは 精製のために抽出容器１１に押戻 す。 ２６０　全でのバルブを閉じる。 工程６：抽出操作の繰返し ２７０　　コマンド９０〜２５０をＮ回行う。 コメント：抽出が行われる数であるＮは経験及び試料組
織のタイプに応じてプ ログラマ−により選択される。 ２８０　バルブ２８；５０（出入口９４）；５１（出入
口８０．８１）ｉ６１ を開ける。 コメント：コマンド２８０は最終抽出のための抽出容器
１１に添加する。 ２９０　バルブ６１以外の全てのバルブを閉じる。 ３００　工程１１０〜２６を１回繰返す。 工程７：水溶液の取出しく透析へ） ３１０　バルブ５１（出入口８０．８１）ｉ６２．３２
１を開ける。 ３２０　コマンド３１０後５分後に全てのバルブを閉じ
る。 コメント：抽出容器１１内の水溶液は今や透析バッグ４
１１内に入る。 工程８：水溶液の透析 ３３０　ポンプ３３７のスイッチを入れる。 ３４０　バルブ３２４を開ける。 ３５０　　Ａ２７０を分光光度計３３５で追跡する。 ３６０　　Ａ２７０が０．０１に等しいか或いは未満に
なった際に全てのバルブを 閉じ、ポンプ３３７のスイッチを 切る。 工程９：水溶液からのＲＮＡの取出しく任意） ３７０　バルブ３２４を開ける；バルブ５１（出入口８
１．８２）；６１を開 ける。 ３８０　コマンド３６０後５分後に全てのバルブを閉じ
る。 コメント：透析バッグ３１１中の透析された水溶液は抽
出容器１１内にある。 ３９０　バルブ３０；５０（出入口９５）；５１（出入
口８０．８１）；６１ を開ける。 ４００　工程９０〜３６０を繰返す。 工程１０：試料の採集 ４１０　バルブ３２４：５１　（出入口８２）；５２（
出入ロア１．７５）を開け る。 ４２０　コマンド４１０の後５分後に全てのバルブを閉
じる。 凡匪■宜反性

【実施例】　ヒトリンパ球からのＤＩ’ＮＡの調整リン
パ球は先ず１単位の全血から洗浄し、４ｄの平衡化塩溶
液中に再懸濁した。（平衡化塩溶液は１容の溶液Ａ及び
９容の溶液Ｂによりなり、溶液Ａは０．１％グルコース
、５　Ｘｌ０−１０Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　ｚ、９．８Ｘ　１
０−’Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．５．４Ｘ１０−’Ｍ　
Ｋ　Ｃ！！、、０．１４５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１，、
ｐＨ７，６であり、溶液Ｂは０．１４Ｍ　　ＮａＣ１で
ある。）次いで、０．３５ｄの上記リンパ球懸濁液を、
４戚の溶解緩衝液（ＩＭＮａ　Ｃ１，１％ＳＤＳ、８Ｍ
尿素、１０ｍＭＥＤＴＡ、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８，０）及び０．６５ｍ１の溶解緩衝液中の１
■のプロティナーゼにと混合し、５成の全容量を得た。 消化は、前記円錐チューブ（抽出容器１１）中で５５°
Ｃにおいて３時間行った。約５蔵のフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール５Ｑ：４８：２をチュー
ブに添加し、２相を実験処法に従って２０分間混合した
。抽出容器を次いで水平位置に５５°Ｃにおいて１０分
間回転させ、相を分離させた。この抽出容器を次いでゆ
っ（り約１０秒間に亘って垂直位置に回転して戻し、下
方の有機層を廃液に除去した。２回目の抽出をフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール混合物を用い
て行い、第３回目の抽出を５ｒｄのクロロホルムを用い
て行った。クロロホルムを廃液に除去し、水性ＤＮＡ含
有層を透析バッグ３１１のような透析バッグに圧送した
。この水溶液を次いでＡ２７０が０．０１未満になるま
で実験処法に従って加圧透析した。最終ＤＮＡ溶液を次
いでバッグから抜出し採集した。 この方法に従って約２５０ｕｇのＤＮＡを含有する約１
ｄのＤＮＡ溶液が得られた。得られた溶液は０．５２の
吸光度比Ａ２３０：Ａ２６０及び１．９０の吸光度比Ａ
２６０：Ａ２８０を有し、極めた高い純度を示している
。（完全に純粋なりＮＡについては吸光度比Ａ２３０：
Ａ２６０は０．５±０．０５であり、Ａ２６０：Ａ２８
０は１．９±０．１である。）この試料の０．８％アガ
ロースゲル及び標準エチジウムブロマイド染色技術を用
いた分析は５０キロベース対より大きな（即ち３．５　
Ｘ　１０’ダルトンより大）大きさの単一バンドを示す
。又、最も重要なことに酵素ＥｃｏＲ１を用いた消化は
陽性でありＤＮＡが純粋であり従って制限可能であるこ
とを示しており、ＤＮＡ純度に対して極めて厳格な試験
に合格している。 上記具体例についての変化は相分離工程を行うために加
熱及び表面積の増大の重要性を示している。例えばヒト
リンパ球について抽出容器が加熱されず室温に維持され
且つ抽出容器が水平位置に回転されないならば相分離は
典型的に６０分を越える時間を必要とする。又、抽出容
器が５５°Ｃに加熱されるが、水平位置に回転されない
場合には相分離は４分間を越える時間を必要とする。５
５°Ｃに加熱して抽出容器を水平位置に回転すると相分
離は典型的には５分間を必要とするのみである。 しかしながら、これらの変更の各々において高塩濃度が
相分離速度をほぼ２倍の因子で高めている。 以上本発明の装置及び方法の好ましい態様を説明したが
、本発明のその広い面から離れることなく多くの変更及
び修正がなされることは当業者に明らかであろう。例え
ば、抽出容器は大きな影響を有するにも拘らず必ずしも
相分離を高速化するために水平位置に回転する必要はな
い。同様に、４５°Ｃ〜５５°Ｃの好ましい範囲未満の
温度において相分離を行うことができるが、その場合に
はより低速で進行し、又それよりも更に低ければ速度は
尚−層遅くなる。装置に関して、本発明による自動化装
置はより多くの或いはより少ない抽出容器、試薬容器及
び透析バッグを用いて調整することができる。又、幾つ
かのバルブは装置の異った場所に送るのが便利な場合が
あり、例えばバルブブロック５２を電気伝導度メーター
５５の前方に置いてもよい。しかしながら、これは流れ
が停止された場合に水相の幾らかの損失を生ずるであろ
う。加えて、自動化抽出系に含まれる各゛種装置の部品
に選ばれる特別のモデル数は使用され得る特別のモデル
に関して限定的なものでなく、単に例示として提供され
ているに過ぎない。又、装置は液体移送系１００及び透
析系３００に独立した室／検子系を提供することにより
部分的にのみ自動化されてもよいことが明らかであろう
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による流体移送系の概略図を示す。 第２＾図及び第２８）図は本発明による室／検子系の二
つの図面を示す。 第３図は本発明による加圧透析系を示す。 第４図は本発明によるコンピュータ系の概略図を示す。 第５図は抽出容器に対する好ましい設計及びその装置内
における取付けを示す。 第６図は透析系における透析バッグの懸架系の詳細を示
す。 第７図は本願発明の第２の実施例の概略図を示す。 第８図は本願発明の第２の実施例に従って、これがどの
ように封印されるのかを示す反応容器の断面図を示す。 第９図は本願発明の第２の実施例に従った反応容器の３
つの異なる形を示している。 第１０図は本願発明の第２の実施例に従った振子装置の
側面図を示す。 第１１Ａ図は第２実施例と共に使用される透析カートリ
ッジの拡大図を示す。 第１１Ｂ図は第１１Ａ図の完全な形のカートリッジを示
す。 第１２Ａ図乃至第１２Ｆ図は第１ＩＢ図の透析カートリ
ッジを満たんにするために用いられる方法を示す説明図
。 第１３図は第２実施例の振子装置に取付けられた透析カ
ートリッジの正面図を示す。 第１４図は第２実施例と共に用いられる沈澱収集ユニッ
トを示す。 ＦＩＧ、　　２ｂ、 ＦＩＧ、　　４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被抽出試料を保持するための一方の末端に該試料を
   負荷するための開口部（以下、頂部末端という）、及び
   他方の末端に開口部（以下、底部末端という）を有する
   チューブよりなる貫流タイプの反応容器手段、 該反応容器手段を保持するための、及び該反応容器手段
   を水平軸の周りに前後に揺するための、及び該反応容器
   手段を該水平軸の周りに回転させるための揺子手段、 プロティナーゼＫ、リーシス緩衝液、フェノールベース
   溶媒及びクロロホルムの該反応容器手段への制御された
   移送のための流体移動手段、 該反応容器手段から該他方の末端を介して流体を抜出す
   ための廃液マニホルド手段 を含んでなり、及び 該反応容器手段、該流体移送手段及び該廃液マニホルト
   手段が全て一緒に回転及び揺すられるように該揺子手段
   に取付けられていることを特徴とする核酸抽出装置。 ２、該反応容器の該他方の末端がルアー（Ｌｕｅｒ）タ
   イプの取付器具よりなる特許請求の範囲第１項記載の装
   置。 ３、更に透析カートリッジ手段を含んでなり、その透析
   カートリッジ手段が該反応容器上の該ルアータイプ取付
   器具に接続し、及び噛合わせるための及び該反応容器手
   段から抽出核酸を該透析カートリッジ内で透析するため
   に受取るためのルアータイプ取付器具を有する特許請求
   の範囲第２項記載の装置。 ４、更に該反応容器手段内に析出した核酸を集めるため
   の析出物最終手段を含んでなり、該析出物最終手段が該
   反応容器手段上の該ルアータイプ取付器具と噛合うため
   のルアータイプ取付器具を有する特許請求の範囲第２項
   記載の装置。 ５、揺子装置上に取付けられた反応容器内に含有される
   試料から核酸を抽出する方法において、該反応容器は該
   試料を受取るための一方の末端に開口部及び他方の末端
   に該反応装置から流体の排出をコントロールするための
   バルブに連結された開口部を有する貫流タイプであり、
   該揺子手段は試料が受取られ及び試薬を貫流シールを通
   して該反応容器に移送するために流体移送系に連結され
   ている反応容器の末端をシールするための貫流シールを
   有し、 該揺子装置を試料を受取るための該反応容器の該末端が
   該他方の末端よりも低くなるような位置に揺する工程、 該他方の末端を該廃液マニホルドに排出する工程、 リーシス緩衝液及びプロティナーゼＫを添加する工程、 該バルブを閉じる工程、 該揺子装置を試料を受取るための該末端が該他方の末端
   より高くなるように揺する工程、 試料を反応容器に添加する工程、 反応容器をその中の試料及びリーシス緩衝液及びプロテ
   ィナーゼＫと共に前後に揺って試料を消化して溶解物を
   生成する工程、 試料の消化後、該他方の末端が試料導入末端より高くな
   る位置に反応容器を揺する工程、 該バルブを開けて他方の末端を廃液マニホルドに排出す
   る工程、 フェノール／クロロホルムベース溶媒を該反応容器に添
   加する工程、 該バルブを閉じる工程、 該容器内で該溶解物及び該溶媒を混合するために該反応
   容器を前後に揺すり抽出されたアミノ酸及び蛋白質のエ
   マルジョンを生成する工程、 該反応容器を水平位置に揺すって該エマルジョンの表面
   積を増大させ、及び該エマルジョンの核酸部分及び有機
   部分に相分離を起こす工程、 該有機部分を該バルブを通して排出する工程、 該核酸部分を濃縮する工程、及び 該濃縮された核酸部分を採集する工程、 を含んでなることを特徴とする方法：