WO2005037315A1 - 中皮腫治療剤 - Google Patents
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Abstract
インターロイキン-6（IL-6）アンタゴニスト、例えばIL-6受容体（IL-6R）に対する抗体を含んで成る中皮腫治療剤、及びIL-6アンタゴニスト、例えばIL-6Rに対する抗体を含んで成る中皮腫細胞増殖抑制剤。
Description
明 細 書 中皮腫治療剤 技術分野
本発明は、 新規な中皮腫治療剤及び中皮腫細胞抑制剤に関する。 背景技術
中皮腫は、 胸部の肺あるいは心臓などの臓器や胃腸 · 肝臓などの 腹部臓器をそれぞれ包む胸膜、 腹膜、 心膜の表面を覆う中皮に発生 する腫瘍である。 びまん性胸膜中皮腫では、 胸壁胸膜側では肋間神 経への浸潤によって胸痛をきたし、 臓側胸膜側では腫瘍増生と胸水 貯留により呼吸循環障害を生じることになる （高木， 医学の歩み （ 別冊 3月） 「呼吸器疾患」 pp. 469- 472， 1999) 。 やがて隣接する縦 隔臓器に波及し心臓に直接浸潤したり横隔膜を介して腹腔側へ進展 し、 またリ ンパ行性あるいは血行性転移が加わり胸腔外進展してい く （同上） 。
ァメ リ力では年間 3000人のびまん性胸膜中皮腫の発症が報告され 、 1980年代からの増加は著しく、 60歳代の男性に多く女性の約 5倍 の頻度とされている （高木， 医学の歩み （別冊 3月） 「呼吸器疾患 J pp . 469-472 , 1999) 。 近年の欧米諸国の報告では中皮腫発生頻 度は急速な増加傾向を示しており、 1995年の英国疫学統計では今後 25年間は中皮腫死亡が増え続けるこ とを予想し、 最悪の場合、 1940 年代生まれの男性の全死亡の 1 %が中皮腫によって占められる危険 性を指摘している （中野， 呼吸、 18卷， 9号， pp. 916-925， 1999) 中皮腫については多くの異なった臨床病期分類が用いられており
、 従来の中皮腫の治療報告は用いられる病期分類法が異なるため治 療成績を比鲛する際の—障害になっていた （中野，' 呼吸 I8卷 9号 pp .916-925, 1999) 。 そこで、 1995年になって International Mesoth elioma Interest Group (IMIG)によ り、 悪性胸膜中皮腫に対する国 際 TNM分類が提案されている （中野， 呼吸 18卷 9号 pp.916-925， 1 999)
また、 悪性中皮腫は石綿 （アスペス ト） 暴露と因果関係があり、 動物実験によ り証明もなされている （多田， 医学のあゆみ （別冊 3 月） 「呼吸器疾患」 PP.406-408， 1999) 。 気道に吸入されたァス べス トは胸膜直下に達し、 少なく とも約 20年の慢性刺激によって腫 瘍が発生し， これが胸膜全面に浅く広がっていく （高木， 医学の歩 み （別冊 3月） 「呼吸器疾患」 pp.469-472, 1999) 。 そのため、 悪 性中皮腫は石綿関連疾患に分類されるが、 すべての悪性中皮腫が石 綿によるものではなく、 約半数の患者で明らかな暴露が認められて いる （多田， 医学のあゆみ （別冊 3月） 「呼吸器疾患」 pp.406- 408 ， 1999) 。
悪性胸膜中皮腫は治療に抵抗し予後は極めて不良であり早急に対 策を講ずる必要がある （中野， 呼吸、 18卷， 9号， pp.916- 925， 199 9) 。 例えば、 中皮腫に対する化学療法では、 葉酸拮抗薬である met hotrexate (MTX) は leucovin併用超大量単独療法の奏効率が 37%と 良好であつたが、 大量の胸水貯留をきたす中皮腫への実施は技術的 に難しく、 普及しなかった （中野， 医学のあゆみ （別冊 3月） 「呼 吸器疾患」 pp.570- 573， 2003) 。 また、 びまん性胸膜中皮腫に対 しては胸膜肺摘除術や胸膜切除術が行われているが、 治療後再発を きたしやすく、 ことに述後の局所再発率は 35〜43%と高い （高木， 医学の歩み （別冊 3月） 「呼吸器疾患」 pp.469- 472， 1999) 。
多くのヒ ト中皮腫細胞株およびいくつかのマウス中皮腫細胞株が
in vitroで IL- 6を発現していることは知られており、 IL - 6を高発現 しているマ ス中皮虛細'胞株 AB22を移植したマウスでは、 癌細胞増 殖や臨床症状、 末梢血リ ンパ球組織の変化に先立って血清での IL-6 検出が見られることが報告されている （Bielefeldt - Ohmann, Cance r Immunol Immunother 40: 241 - 250， 1995) 。 また、 悪性胸膜中皮 腫患者の血清中の IL-6レベルは、 胸水流出 （pleural effusion) を 伴う肺腺癌患者に比べて高く、 悪性胸膜中皮腫の臨床症状の一つで ある血小板増加症に関して、 血清中 IL- 6レベルと血小板の数に顕著 な相関があることが知られている （Nakano, British Journal of C ancer 77(6): 907-912， 1998) 。 さ らに腹膜中皮腫患者の腫瘍細胞 は IL-6を高発現しており 、 死亡前には血清中の IL-6レベルが高くな るこ とが報告されている （Higashihara, Cancer October 15， 1992 , volume 70， No.8, pp.2105-2108) 。
Bielefeldt- Ohmannらは、 AB22を移植したマウスに週 2回の割合で ラッ ト抗マウス IL- 6抗体 （6B4) を投与したところ、 臨床症状の開 始および進行を顕著に弱める効果が認められたことを報告している
(Bielef eldt - 0hmann， Cancer Immunol Immunother 40： 241-250 , 1995) 。 しかしながら、 Bielefeldtの報告によれば、 抗 IL-6抗体は in vitroで AB22に対して直接の増殖抑制効果は有さず、 抗 IL- 6抗体 で治療したマウスと治療しないマウスの死後の外観に違いはなく、 治療したマウスにおいても相当に大きい腫瘍塊が認められた （Biel ef eldt-Ohmann, し ancer Immunol Immunother 40： 241-250 , 1995) 。 すなわち、 抗 IL-6抗体の中皮腫に対する増殖抑制は in vitroおよ び in vivoのいずれにおレヽても知られてレヽなかった。
高木， 医学の歩み （別冊 3月） 「呼吸器疾患」 pp.469- 472， 1999 中野， 呼吸、 18卷， 9号， pp.916- 925， 1999
多田， 医学のあゆみ （別冊 3月） 「呼吸器疾患」 pp.406-408， 19
99
中野， 医孥のあゆみ- (別冊 3月） 「呼吸器疾患」 pp.570- 573， 20
03
Bielef eldt-Onmann, Cancer Immunol Immunother 40： 241-250 , 1995
Higashihara , Cancer October 15， 1992 , volume 70， No.8， pp. 2105-2108 発明の開示
IL- 6アンタゴニス トが中皮腫そのものに作用して増殖抑制効果を 示すことは知られていなかった。 本発明は、 IL- 6アンタゴニス トを 有効成分として含有する新規な中皮腫治療剤 （中皮腫細胞の増殖抑 制剤） を提供することを目的とする。
本発明者は、 中皮腫細胞の増殖を抑制する新規な中皮腫治療剤を 開発すべく、 種々検討した結果、 IL- 6に関連するシグナル伝達を抑 制又は遮断することによ り、 中皮腫細胞の増殖を抑制することが出 来る という、 新規な知見を得、 本発明を完成させた。
従って、 本発明は、 ィンターロイキン- 6 (IL-6) アンタゴニス ト を有効成分として含んで成る中皮腫治療剤を提供する。
本発明はまた、 インターロイキン- 6 (IL-6) アンタゴニス トを有 効成分と して含んで成る中皮腫細胞に対する増殖抑制剤を提供する 前記中皮腫は例えば胸膜中皮腫であり、 よ り具体的には、 例えば 、 悪性胸膜中皮腫である。 悪性胸膜中皮腫にはびまん性胸膜中皮腫 が含まれる。
前記 IL-6アンタゴニス トは、 例えば IL- 6に対する抗体又は IL- 6受 容体に対する抗体でり、 好ましく は IL- 6受容体に対するモノクロー
ナル抗体である。 前記 IL- 6受容体に対する抗体は、 特に好ましくは 、 ヒ ト IL - 6受容体に対-するモノ ク ローナル抗体、 例えば PM - 1抗体で あり、 あるいはマウス IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体、 例 えば MR16- 1抗体である。 前記 IL- 6受容体に対する抗体は、 好ましく は組換え型抗体である。
前記 IL- 6受容体に対する抗体は、 キメラ抗体、 ヒ ト型化抗体また はヒ ト抗体であることが出来る。 本発明において特に好ましい抗体 は、 ヒ ト型化 PM- 1抗体である。
本発明はまた、 下記の形態をとることが出来る。
( 1) 中皮腫治療剤の製造のためのインターロイキン- 6 ( IL-6) アンタ ゴニス トの使用。
( 2) 前記中皮腫が胸膜中皮腫である、 前記 （1) に記載の使用。
( 3) 前記胸膜中皮腫が、 悪性胸膜中皮腫である、 前記 （2) に記 载の使用。
( 4) 前記 IL- 6ァンタ ゴニス トが IL- 6受容体に対する抗体である 、 前記 （1) 〜 （3) のいずれかに記載の使用。
( 5) 前記 IL- 6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体である、 前記 （4) に記載の使用。
( 6) 前記 IL-6受容体に対する抗体がヒ ト IL- 6受容体に対するモ ノク ローナル抗体である、 前記 （4) に記載の使用。
( 7) 前記 IL-6受容体に対する抗体がマウス IL-6受容体に対する モノ ク ローナル抗体である、 前記 （4) に記載の使用。
( 8) 前記 I L- 6受容体に対する抗体が組換え型抗体である、 前記 ( 4) 〜 （7) のいずれかに記載の使用。
( 9) 前記ヒ ト IL - 6受容体に対するモノクローナル抗体が PM-1抗 体である、 前記 （6) に記載の使用。
( 10) 前記マウス IL- 6受容体に対するモノクローナル抗体が MR1
6-1抗体である、 前記 （7) に記載の使用。 一
(11) 前 IBIL- 6受容—体—に対する抗体が IL- 6受容体に対するキメラ 抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 前記 （4) 〜 （10) の いずれかに記載の使用。
(12) 前記 IL - 6受容体に対するヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM-1抗体 である、 前記 （11) に記載の使用。
(13) 中皮腫細胞に対する増殖抑制剤の製増のためのィンタ一口 ィ キン- 6 (IL-6) アンタ ゴニス トの使用。
(14) 前記中皮腫が胸膜中皮腫である、 前記 （ 13) に記載の使 用。
(15) 前記胸膜中皮腫が、 悪性胸膜中皮腫である、 前記 （14) に 記載の使用。
(16) 前記 IL- 6ァンタ ゴニス トが IL-6受容体に対する抗体である 、 前記 （13) 〜 （15) のいずれかに記載の使用。
(17) 前記 IL - 6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体である、 前記 （16) に記載の使用。
(18) 前記 IL- 6受容体に対する抗体がヒ ト IL-6受容体に対するモ ノク ローナル抗体である、 前記 （16) に記載の使用。
(19) 前記 IL-6受容体に対する抗体がマウス IL- 6受容体に対する モノ ク ローナル抗体である、 前記 （16) に記載の使用。
(20) 前記 IL-6受容体に対する抗体が組換え型抗体である、 前記 (16) 〜 （19) のいずれかに記載の使用。
(21) 前記ヒ ト IL- 6受容体に対するモノクローナル抗体が PM - 1抗 体である、 前記 （18) に記載の使用。
(22) 前記マウス IL-6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が MR1 , 6-1抗体である、 前記 （19) に記載の使用。
(23) 前記 IL - 6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するキメ ラ
抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 前記 （16) 〜 （22) の いずれかに記載の使用—。 '
( 24) 前記 IL - 6受容体に対するヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM - 1抗体 である、 前記 （23) に記載の使用。
本発明はまた、 下記の形態を採ることが出来る。
( 1) 中皮腫の治療方法において、 当該治療を必要とする対象に インターロイキン- 6 ( IL-6) アンタゴニス トを投与することを含ん で成る方法。
( 2) 前記中皮腫が胸膜中皮腫である、 上記 （1·) に記載の方法。
( 3) 前記胸膜中皮腫が、 悪性胸膜中皮腫である、 上記 （2) に記 载の方法。
( 4) 前記 IL- 6アンタゴニス トが IL- 6受容体に対する抗体である 、 上記 （1) 〜 （3) のいずれかに記載の方法。
( 5) 前記 IL- 6受容体に対すさ抗体が IL- 6受容体に対するモノク ローナル抗体である、 上記 （4) に記載の方法。
( 6) 前記 IL- 6受容体に対する抗体がヒ ト IL-6受容体に対するモ ノク ローナル抗体である、 上記 （4) に記載の方法。
( 7) 前記 IL- 6受容体に対する抗体がマウス IL-6受容体に対する モノクローナル抗体である、 上記 （4) に記載の方法。
( 8) 前記 IL-6受容体に対する抗体が組換え型抗体である、 上記 ( 4) 〜 （7) のいずれかに記載の方法。
( 9) 前記ヒ ト IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が PM-1抗 体である、 上記 （6) に記載の方法。
( 10) 前記マウス IL- 6受容体に対するモノクローナル抗体が MR1 6-1抗体である、 上記 （7) に記載の方法。
( 11) 前記 IL-6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するキメラ 抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 上記 （4) 〜 （10) の
いずれかに記載の方法。
( 12) 前記 IL-6受容体に対するヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM- 1抗体 である、 上記 （11) に記載の方法。
( 13) 中皮腫細胞の増殖を抑制する方法において、 当該抑制を必 要とする対象にインターロイキン- 6 ( IL-6) アンタゴニス トを投与 することを含んで成る方法。
( 14) 前記中皮腫が胸膜中皮腫である、 上記 （13) に記載の方法
( 15) 前記胸膜中皮腫が、 悪性胸膜中皮腫である、 上記 （14) に 記載の方法。
( 16) 前記 I L-6アンタゴニス トが IL- 6受容体に対する抗体である 、 上記 （13) 〜 （15) のいずれかに記載の方法。
( 17) 前記 IL- 6受容体に対する抗体が IL - 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体である、 上記 （16) に記載の方法。
( 18) 前記 IL- 6受容体に対する抗体がヒ ト IL- 6受容体に対するモ ノク ローナル抗体である、 上記 （16) に記載の方法。
( 19) 前記 IL-6受容体に対する抗体がマウス IL-6受容体に対する モノ ク ローナル抗体である、 上記 （16) に記載の方法。
( 20) 前記 I L - 6受容体に対する抗体が耝換え型抗体である、 上記 ( 16) 〜 （19) のいずれかに記載の方法。
( 21) 前記ヒ ト IL - 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体が PM-1抗 体である、 上記 （18) に記載の方法。
( 22) 前記マウス IL-6受容体に対するモノク口一ナル抗体が MR1 6 - 1抗体である、 上記 （19) に記載の方法。
( 23) 前記 IL-6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するキメラ 抗体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 上記 （16) 〜 （22) の いずれかに記載の方法。
( 24) 前記 IL-6受容体に対するヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM- 1抗体 である、 上記 ( 23) に ¾の方法。 図面の簡単な説明
図 1 は、 実施例 1 の結果を示し、 種々の悪性中皮腫細胞株の IL- 6 の生産性を示すグラフである。
図 2は、 実施例 2の結果を示し、 種々の悪性中皮腫細胞株の IL- 6 受容体 （IL- 6R) の生産性 （生産しないこと） を示すグラフである 。 なお、 GAPDHは、 内在性コント ロールとして使用した GAPDH (グリ セルアルデヒ ド- 3-リ ン酸デヒ ドロゲナーゼ） の inRNA量を示す。
図 3は、. 実施例 3の結果を示し、 悪性中皮腫細胞株 H2052及び H24 52による血管形成誘導因子 （VEGF) の産生が、 IL-6と IL-6Rとによ り誘導されることを示すグラフである。
図 4は、 実施例 4の結果を示し、 悪性中皮腫細胞株 H28について 、 実施例 3 と同様な実験を行った結果であり、 この細胞株は IL-6/ IL - 6Rによる誘導を必要と しないで血管形成誘導因子 （VEGF) を生 産することを示すグラフである。
図 5は、 実施例 5の結果を示し、 IL- 6による VEGF産生誘導株であ る H2025細胞株においては、 Iい 6による刺激によって STAT3のリ ン酸 化が促進されるのに対し、 IL-6による VEGF産生非誘導株である H28 細胞株においては、 IL- 6による刺激によつて STAT3のリ ン酸化が促 進されないことを示すグラフである。
図 6は、 実施例 6の結果を示し、 I L- 6による VEGF産生誘導株であ る H2025細胞株では IL- 6と IL- 6Rとの刺激により S0CS3の発現が誘導 されるのに対し、 I L-6による VEGF産生非誘導株である H28細胞株で は、 非誘導的に S0CS3が発現されることを示すグラフである。
図 7は、 実施例 7で使用したプラスミ ド pGL3- VEGF及び pGL3-VEGF
mutのプロモーター及びその近傍の構造を示す図である。
図 8は、 実施例 7 結果を示し、 VEGFプロモーターをルシフェラ ーゼレポーター遺伝子に連結した系において、 VEGFプ口モーター中 の P- STAT3結合部位を変異した場合 IL- 6による VEGFプ口モーターの 活性化が生じないことを示すグラフである。
図 9は、 実施例 5〜 7の結果から推定される、 H2052細胞株にお ける、 Iい 6による刺激による VEGFプロモーターの誘導 （VEGFの産生 ) のメカニズムを示す模式図である。
図 10は、 実施例 8の結果を示し、 H2052細胞株の増殖が、 IL- 6Rの 存在下で、 IL- 6濃度依存的に増加することを示すグラフである。
図 11は、 実施例 9 の結果を示し、 IL-6及び IL- 6Rによる H2052細胞 株の増殖の促進が、 MRAにより抑制されることを示すグラフである 図 12は、 実施例 10の結果を示し、 H226細胞株の増殖が、 IL-6Rの 存在かで IL-6濃度依存的に増加すること、 及び MRAの抑制効果を示 すグラフである。
図 13は、 実施例 8の結果を示し、 H226細胞の増殖が、 IL-6Rの存 在下で、 IL-6濃度依存的に増加することを示すグラフである。
図 14は、 実施例 11の結果を示し、 IL- 6及び可溶性 IL-6受容体によ る悪性中皮腫細胞株 H2052細胞及び H226の増殖促進作用を、 ヒ ト型 化 PM- 1抗体が抑制することを示すダラフである。
図 15は、 実施例 12の結果を示し、 悪性中皮腫細胞株 MST0、 H226、 H2052及び H2452における Iい 6の刺激による VEGFの生産誘導が、 ヒ ト 型化 PM-1抗体によ り抑制されることを示すグラフである。
図 16は、 実施例 13の結果を示し、 H2052株及び H2452細胞株におい て、 I L- 6及び可溶性 IL- 6受容体の刺激によ り誘導される STAT3のリ ン酸化がヒ ト型化 PM-1抗体により抑制されることを示すグラフであ
る。
図 17は、 実施例 14の—結'果を示し、 IL- 6及び可溶性 Iい 6受容体の刺 激による H2052細胞株及び H226細胞株の増殖促進が、 抗 VEGF抗体に よ り抑制されないことを示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
IL - 6は B細胞刺激因子 2 (BSF2) あるいはイ ンターフェロ ン j82 とも呼称されたサイ ト力イ ンである。 IL- 6は、 B リ ンパ球系細胞の 活性化に関与する分化因子と して発見され （Hirano, T. et al. ,Na ture (1986) 324, 73-76 ) 、 その後、 種々の細胞の機能に影響を 及ぼす多機能サイ ト力イ ンであることが明らかになった （Akira, S . et al. , Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78) 。 Iい 6は、 T リ ンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている （Lotz, M. et al. , J. Exp. Med. (1988) 167, 1253 - 1258) 。
IL - 6は、 細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達 する。 一つは、 IL- 6が結合する分子量約 80kDのリ ガンド結合性蛋白 質の IL- 6受容体である （Taga， T. et al.， J. Exp. Med. (1987) 1 66, 967-981, Yamasaki, K. et al. , Science (1987) 241, 825-82
8)。 IL-6受容体は、 細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型 の他に、 主にその細胞外領域からなる可溶性 IL- 6受容体としても存 在する。
も う一つは、 非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kD の膜蛋白質 gpl30 である。 IL- 6と Iい 6受容体は IL- 6/1い 6受 容体複合体を形成し、 次いで gP130 と結合するこ とによ り、 IL - 6の 生物学的活性が細胞内に伝達される （Taga， T. et al. , Cell (198
9) 58, 573-581) 0
IL - 6アンタゴニス トは、 IL- 6の生物学的活性の伝達を阻害する物
質である。 これまでに、 IL-6に対する抗体 （抗 IL- 6抗体） 、 IL-6受 容体に対する抗体 （抗 1じ_6受容体抗体） 、 gpl30 に対する抗体 （抗 gpl30 抗体） 、 IL- 6改変体、 IL- 6又は IL-6受容体部分ペプチド等が 知られている。
抗 IL-6受容体抗体に関しては、 いくつかの報告がある （Novick, D. et al. , Hybridoma (1991) 10, 137 - 146 、 Huang, Y. W. et al .， Hybridoma (1993) 12， 621-630 、 国際特許出願公開番号 WO 95 - 09873 、 フランス特許出願公開番号 FR 2694767、 米国特許番号 US 5 21628 ) 。 その一つであるマウス抗体 PM- 1 (Hirata, Y. et al.， J . Immunol. (1989) 143, 2900-2906) の相捕性決定領域 (CDR; com plementar ity determining region ) をヒ ト饥体へ移植す ·οこ とに よ り得られたヒ ト型化 ΡΜ - 1抗体が知られている （国際特許出願公開 番号 W0 92-19759 ) 。
前記 IL- 6ァンタゴ二ス トは、 好ましくは IL- 6受容体に対する抗体 であり、 好ましくはヒ ト IL - 6受容体に対するモノクローナル抗体又 はマウス IL- 6受容体に対するモノ ク ローナル抗体である。 上記ヒ ト IL-6受容体に対するモノクローナル抗体としては PM- 1抗体が例示さ れ、 またマウス IL-6受容体に対するモノクローナル抗体としては Μ R16 - 1抗体が挙げられる。 前記の抗体は、 好ましく は、 キメラ抗体 、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体であり、 例えばヒ ト型化 PM-1抗体で める。
本発明で使用される IL-6アンタゴニス トは、 中皮腫細胞の増殖を 抑制し、 中皮腫治療剤の活性成分と して有用なものであれば、 その 由来、 種類および形状を問わない。
IL-6アンタゴニス トは、 IL-6によるシグナル伝達を遮断し、 IL- 6 の生物学的活性を阻害する物質である。 IL- 6アンタゴニス トは、 好 ましく は IL- 6、 IL-6受容体及び gpl30 のいずれかの結合に対する阻
害作用を有する物質である。 IL- 6ァンタゴ二ス ト と しては、 例えば 抗 IL-6抗体、''抗 IL-6受容体抗体、 抗 gpl30 抗体、 II- 6改変体、 可溶 性 IL-6受容体改変体あるいは IL- 6又は IL- 6受容体の部分べプチドぉ よび、 これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられる。
本発明で使用される抗 IL- 6抗体は、 公知の手段を用いてポリ クロ ーナル又はモノクローナル抗体と して得ることができる。 本発明で 使用される抗 IL-6抗体と して、 特に哺乳動物由来のモノ クローナル 抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノ クローナル抗体と しては、 ハ イブリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法によ り抗 体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産生されるもの がある。 この抗体は IL- 6と結合することによ り、 IL- 6の IL-6受容体 への結合を阻害して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断す る。
このような抗体と しては、 MH166 (Matsuda, T. et al. , Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) や SK2 抗体 (Sato, K. et al. , 第 21回 日本免疫学会総会、 学術記録（1991) 21， 166) 等が挙げら れる。
抗 IL- 6抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的には公知技術を使用し. 、 以下のよ うにして作製できる。 すなわち、 IL-6を感作抗原と して 使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免 疫細胞を通常の細胞融合法によつて公知の親細胞と融合させ、 通常 のスク リーニング法によ り、 モノ ク ローナルな抗体産生細胞をスク リーユングすることによって作製できる。
具体的には、 抗 IL- 6抗体を作製するには次のようにすればよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用されるヒ ト IL-6は、 Eur. J . Biochem (1987) 168， 543 - 550 、 J. Immunol. (1988) 140, 153 4-1541 、 ある ヽ【ま Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685— 2688 ίこ開
示された IL-6遺伝子/ァミ ノ酸配列を用いることによって得られる
IL- 6の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当な宿主 細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から目 的の IL- 6蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL- 6蛋白質を感作 抗原として用いればよい。 また、 IL - 6蛋白質と他の蛋白質との融合 蛋白質を感作抗原と して用いてもよい。
本発明で使用される抗 IL- 6受容体抗体は、 公知の手段を用いてポ リ ク口ーナル又はモノクローナル抗体と して得ることができる。 本 発明で使用される抗 IL- 6受容体抗体と して、 特に哺乳動物由来のモ ノクローナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノクローナル抗体 と しては、 ハイブリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的 手法により抗体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産 生されるものがある。 この抗体は IL- 6受容体と結合することによ り 、 IL-6の IL- 6受容体べの結合を阻害して IL-6の生物学的活性の細胞 内への伝達を遮断する。
このよ うな抗体と しては、 MR16 - 1抗体 ( Tamura , T. et al. Proc . Nat l. Acad. Sc i . USA ( 1993 ) 90 , 11924-11928)、 PM-l抗体 (Hi rata , Y. et al.， J. Immuno l . ( 1989 ) 143 , 2900-2906) 、 AUK12- 20抗体、 AUK64-7 抗体あるいは AUK146- 15 抗体 （国際特許出願公開 番号 W0 92- 19759 )などが挙げられる。 これらのうちで、 特に好まし い抗体として PM-1抗体が挙げられる。
なお、 PM-1抗体産生ハイプリ ドーマ細胞株は、 PM- 1として、 独立 行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （茨城県つくば 市東 1 丁目 1 番地 1 中央第 6 ) に、 平成元年 7 月 12日に、 FERM BP - 2998と してブダペス ト条約に基づき国際寄託されている。 また、 M R16-1 抗体産生ハイブリ 卜、一マ細胞株は、 Rat-mouse hybr idoma MR
16 - 1と して、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 （茨城県つくば市東— 1—卞目 1 番地 1 中央第 6 )■ に、 平成 9 年 3 月 13日に、 FERM BP-5875と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託され ている。
抗 IL-6受容体モノ ク ローナル抗体産生ハイプリ ドーマは、 基本的 には公知技術を使用し、 以下のよ うにして作製できる。 すなわち、 IL-6受容体を感作抗原と して使用して、 これを通常の免疫方法にし たがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公 知の親細胞と融合させ、 通常のスク リーニング法により、 モノ ク ロ 一ナルな抗体産生細胞をスク リーユングすることによって作製でき る。
具体的には、 抗 IL- 6受容体抗体を作製するには次のようにすれば よい。 例えば、 抗体取得の感作抗原と して使用されるヒ ト IL- 6受容 体は、 欧州特許出願公開番号 EP 325474 に、 マウス - 6受容体は日 本特許出願公開番号特開平 3- 155795に開示された IL-6受容体遺伝子 /ァミ ノ酸配列を用いることによって得られる。
IL - 6受容体蛋白質は、 細胞膜上に発現しているものと細胞膜より 離脱しているもの （可溶性 IL- 6受容体） （Yasukawa , K. et al . , J . Biochem. ( 1990 ) 108， 673-676) との二種類がある。 可溶性 IL- 6 受容体抗体は細胞膜に結合している IL- 6受容体の実質的に細胞外領 域から構成されており、 細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と 細胞内領域が欠損している点で膜結合型 IL-6受容体と異なっている 。 IL- 6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL-6受容体抗体の作 製の感作抗原として使用されうる限り、 いずれの IL-6受容体を使用- してもよい。
IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当 な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中
から目的の IL- 6受容体蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 IL - 6 受容体蛋白質を感作抗—原—と して用いればよい。 また、 IL-6受容体を 発現している細胞や IL- 6受容体蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質 を感作抗原と して用いてもよい。
ヒ ト IL- 6受容体をコ一ドする cDNAを含むプラスミ ド p IBIBSF2R を 含有する大腸菌 （E. co l i) は、 平成元年 （1989年） 1 月 9 日付で独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番地 1 中央第 6 ) に、 HB101-p IB IBSF2R として、 受 託番号 FERM BP-2232と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託されて レヽる。
本発明で使用される抗 gP130 抗体は、 公知の手段を用いてポリ ク 口ーナル又はモノク口ーナル抗体として得ることができる。 本発明 で使用される抗 gP130 抗体として、 特に哺乳動物由来のモノ ク ロ一 ナル抗体が好ましい。 哺乳動物由来のモノ ク ローナル抗体と しては 、 ハイブリ ドーマに産生されるもの、 および遺伝子工学的手法によ り抗体遺伝子を含む発現べクターで形質転換した宿主に産生される ものがある。 この抗体は gpl30 と結合することにより、 Iい 6/ IL - 6 受容体複合体の gpl30 への結合を阻害して IL- 6の生物学的活性の細 胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、 AM64抗体 （特開平 3-219894) 、 4B11抗 体および 2H4 抗体 （US 5571513) B-S12 抗体および B-P8抗体 （特開 平 8- 291199) などが挙げられる。
抗 gP130 モノ ク ローナル抗体産生ハイブリ ドーマは、 基本的には 公知技術を使用し、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 gpl3 0 を感作抗原と して使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって 免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細 胞と融合させ、 通常のスク リ ーニング法によ り、 モノ ク ローナル抗
体産生細胞をスク リーニングすることによって作製できる。
具体的にほ、 モノグロ'ーナル抗体を作製するには次のようにすれ ばよい。 例えば、 抗体取得の感作抗原として使用される gpl30 は、 欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された gpl30 遺伝子 Zアミ ノ酸配列を用いることによって得られる。
gP130 の遺伝子配列を公知の発現べクター系に挿入して適当な宿 主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中又は、 培養上清中から 目的の gpl30 蛋白質を公知の方法で精製し、 この精製 gP130 受容体 蛋白質を感作抗原と して用いればよい。 また、 gpl30 を発現してい る細胞や gpl30 蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原と し て用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるもので はないが、 細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択す るのが好ましく、 一般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラ ッ ト、 ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われ る。 例えば、 一般的方法と して、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は 、 皮下に注射することによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を PB S ( Pho sphat e-Buffer ed Sa l ine ) や生理食塩水等で適当量に希釈 、 懸濁したものを所望によ り通常のアジュパント、 例えば、 フロイ ント完全アジュパン トを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に 4- 21日毎 に数回投与するのが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体 を使用することができる。
このよ うに免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確 認した後に、 哺乳動物から免疫細胞が取り出され、 細胞融合に付さ れる。 細胞融合に付される好ましい免疫細胞と しては、 特に脾細胞 が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と しての哺乳動物のミェ ローマ細胞ほ、 すでに； 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3X63Ag8.6 53 (Kearney, J. F. et al. J. Immnol. (1979) 123， 1548-1550) 、 P3X63Ag8U.1 ( Current ropics in Microbiology and Immunolog y (1978) 81， 1-7) 、 NS- 1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J . Immunol. (1976) 6, 51ト 519 ) 、 MPC - 11 (Margulies. D. H. et al.， Cell (1976) 8, 405-415 ) 、 SP2/0 (Shulman, M. et al.， Nature (1978) 276, 269-270 ) 、 F0 (de St. Groth, S. F. et a 1. , J. Immunol. Methods (1980) 35， 1-21 ) 、 S194 (Trowbridge , I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313 - 323) 、 R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277, 131-133 ) 等が適宜使用される。 前記免疫細胞と ミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方 法、 たとえば、 ミルスティンらの方法 (Kohler. G. and Milstein,
C. 、 Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行う こと力 S できる。
よ り具体的には、 前記細胞融合は例えば、 細胞融合促進剤の存在 下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤と しては例えば 、 ポリ エチレングリ コール (PEG ) 、 センダイ ウィルス （HVJ ) 等 が使用され、 更に所望によ り融合効率を高めるためにジメチルスル ホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞と ミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ 細胞に対して免疫細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。 前記細胞融 合に用いる培養液と しては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の増殖 に好適な RPMI1640培養液、 MEM 培養液、 その他、 この種の細胞培養 に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さ らに、 牛胎児血清 (FCS ) 等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞と ミエローマ細胞との所定量を前記培
養液中でよく混合し、 予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、 例えば 、 平均分子量 1000〜6000 程度の PEG 溶液を通常'、 30〜60 % ( w/v ) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする融合細胞 （ハ イブリ ドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し 、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリ ドー マの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリ ドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、 アミノプテリ ンおよびチミジンを含む培養液） で培養することにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目 的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するめに 十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 ついで、 通常の限界希釈 法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リー ユングおよびクローニングが行われる。
また、 ヒ ト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得 る他に、 ヒ ト リ ンパ球を in vi t r oで所望の抗原蛋白質又は抗原発現 細胞で感作し、 感作 B リ ンパ球をヒ ト ミエローマ細胞、 例えば U266 と融合させ、 所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所 望のヒ ト抗体を得ることもできる （特公平卜 59878 参照） 。 さらに 、 ヒ ト抗体遺伝子のレパー ト リーを有する トランスジヱニック動物 に抗原又は抗原発現細胞を投与し、 前述の方法に従い所望のヒ ト抗 体を取得してもよい （国際特許出願公開番号 W0 93/12227 、 W0 92/ 03918 、 W0 94/02602 、 W0 94/25585 、 W0 96/34096 、 W0 96/3373 5 参照） 。
このよ う にして作製されるモノク 口ーナル抗体を産生するハイブ リ ドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 ま た、 液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイプリ ドーマからモノ ク ローナル抗体を取得するには、 当
該ハイプリ ドーマを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清と して得る方法、 あるいは—ハイプリ ドーマをこれと適合性がある哺乳 動物に投与して増殖させ、 その腹水と して得る方法などが採用され る。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適しており、 一方、 後 者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
例えば、 抗 IL- 6受容体抗体産生ハイプリ ドーマの作製は、 特開平 3-139293に開示された方法によ り行う ことができる。 独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター （茨城県つくば市東 1 丁 目 1 番地 1 中央第 6 ) に、 平成元年 7 月 12日に、 FERM BP- 2998とし てブタぺス ト条約に基づき国際寄託された PM-1抗体産生ハイプリ ド 一マを BALB/cマウスの腹腔内に注入して腹水を得、 この腹水から P M - 1抗体を精製する方法や、 本ハイプリ ドーマを適当な培地、 例え ば、 10%ゥシ胎児血清、 5 %BM-Condimed HI (Boehringer Mannhei m 製） 含有 RPMI1640培地、 ハイブリ ドーマ SFM 培地 （GIBCO- BRL 製 ) 、 PFHM-II 培地 （GIBC0-BRL 製） 等で培養し、 その培養上清から PM- 1抗体を精製する方法で行う ことができる。
本発明には、 モノクローナル抗体と して、 抗体遺伝子をハイプリ ドーマからク ローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを 宿主に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体 を用いることができる （例えば、 Borrebaeck A. K. and Larric k J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照） 。
具体的には、 目的とする抗体を産生する細胞、 例えばハイプリ ド 一マから、 抗体の可変 （V ) 領域をコ一ドする mRNAを単離する。 mR NAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 （Chirgwin ， J. M. et al.， Biochemistry (1979) 18, 5294-5299 ) 、 AGPC法 (Chomczynski, P. et al. , Anal. Biochem. (1987)162, 156 - 159)
等によ り全腿 を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製） 等を使用しで mRNAを調 する。 また、 QuickPrep' mRNA Purificati on Kit (Pharmacia 製） を用いることによ り mRNAを直接調製するこ とができる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V 領域の cDNAを合成す る。 cDNAの合成は、 AMY Reverse Transcriptase First-strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行う ことができる。 また、 cDNAの合成 および増幅を行うには 5，_Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） お よび PCR を用レヽた 5' - RACE 法 (Frohman, M. A. et al. , Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA (1988) 85， 8998 - 9002； Belyavsky, A. et al. ， Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 ) を使用することが できる。 得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、 ベタ ター DNA と連結する。 さ らに、 これより組換えベクターを作成し、 大腸菌等に導入してコ口ニーを選択して所望の組換えべクターを調 製する。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、 例えば、 デォキ シ法によ り確認する。
目的とする抗体の V 領域をコードする DNA が得られれば、 これを 所望の抗体定常領域 （C 領域） をコー ドする DNA と連結し、 これを 発現ベクターへ組み込む。 又は、 抗体の V 領域をコードする DNA を 、 抗体 C 領域の DNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、 後述のように抗体遺伝 子を発現制御領域、 例えば、 ェンハンサー、 プロモーターの制御の もとで発現するよ う発現ベクターに組み込む。 次に、 この発現べク ターによ り宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させることができる 本発明では、 ヒ 卜に対する異種抗原性を低下させること等を目的 と して人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメ ラ （Ch
imer i c) 抗体、 ヒ 卜型化 ( Humanized) 抗体、 ヒ 卜 ( human) 抗体を 使用できる。'これらの ¾変抗体は、 既知の方法を用いて製造するこ とができる。
キメ ラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V 領域をコードする DN A をヒ ト抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 これを発現べクタ 一に組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 125023 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキメラ抗体を得 るこ とができる。
例えば、 キメ ラ PM- 1抗体の L 鎖および H 鎖の V 領域をコー ドする DNA を含むプラスミ ドは、 各々 pPM-k3および pPM-hlと命名され、 こ のプラスミ ドを有する大腸菌は、 Nat ional Co l l ect ions of Indus t r ial and Mar ine Bacter ia Limi ted (グレー 卜ブリテン及び北部ァ ィルラン ド連合王国 スコ ッ トラン ド アバディーン AB2 1RY マックハー ドライブ通り 23) に、 1991年 2 月 12日に、 各々 NC IMB 40366 及び NC IMB40362と してブダぺス ト条約に基づき国際寄託され ている。
ヒ ト型化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒ ト抗体とも称され、 ヒ ト 以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR)をヒ ト 抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その一般的な遺伝子 組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023 、 国 際特許出願公開番号 W0. 92- 19759 参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDR と ヒ ト抗体のフレームワーク領域 ( FR ; framework region) を連結するように設計した DNA 配列を、 末端部にォーパーラップする部分を有するように作製した数個のォ リ ゴヌク レオチ ドから PCR 法により合成する。 得られた DNA をヒ ト 抗体 C 領域をコー ドする DNA と連結し、 次いで発現ベクターに組み
込んで、 これを宿主に導入し産生させることによ り得られる （欧州 特許出願公開番号 EP 239400 、 国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
CDR を介して連結される ヒ ト抗体の FRは、 相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成 ヒ ト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように 抗体の可変領域のフ レームワーク領域のアミ ノ酸を置換してもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53， 851-856) 。
キメ ラ抗体、 ヒ ト型化抗体には、 ヒ ト抗体 C 領域が使用される。 ヒ ト抗体 C 領域としては、 C が挙げられ、 例えば、 C Y 1 、 C y 2 、 C o/ 3 又は C y 4 を使用することができる。 また、 抗体又はそ の産生の安定性を改善するために、 ヒ ト抗体 C 領域を修飾してもよ い 0 "
キメラ抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒ ト抗体 由来の c領域からなり、 ヒ ト型化抗体はヒ ト以外の哺乳動物由来抗 体の相補性決定領域とヒ ト抗体由来のフレームワーク領域および C 領域からなり、 ヒ ト体内における抗原性が低下しているため、 本発 明に使用される抗体と して有用である。
本発明に使用される ヒ ト型化抗体の好ましい具体例としては、 ヒ ト型化 PM-1抗体が挙げられる （国際特許出願公開番号 W0 92-19759 参照） 。
また、 ヒ ト抗体の取得方法と しては先に述べた方法のほか、 ヒ ト 抗体ライブラリーを用いて、 パンニングにによ り ヒ ト抗体を取得す る技術も知られている。 例えば、 ヒ ト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv) と してファージディスプレイ法によ り ファージの表面に発 現させ、 抗原に結合するファージを選択することもできる。 選択さ れたファージの遺伝子を解析すれば、 抗原に結合する ヒ ト抗体の可
変領域をコー ドする DNA配列を決定することができる。 抗原に結合 する scFvの DNA配列が萌らかになれば、 当該配列'をを適当な発現べ クタ一を作製し、 ヒ ト抗体を取得することができる。 これらの方法 は既に衆知であり、 冊 92/01047, W0 92/20791, W0 93/06213, W0 93/11236, 0 93/19172, W0 95/01438, W0 95/15388を参考にする こ とができる。
前記のよ うに構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ 、 取得することができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプ 口モーター、 発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ A シグナ ルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベクターにより発 現させることができる。 例えばプロモーター/ェンハンサ一と して は、 ヒ トサイ トメガロ ウィルス前期プロモーターノエンハンサー （ human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer ノ 挙げることができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ ータ一 ェンノ、ンサ一と して、 レ ト ロ ウイルス、 ポリオ一マウイノレ ス、 アデノ ウィルス、 シミアンウィルス 40 (SV 40)等のウィルスプ 口モーター /ェンノヽンサーゃヒ トェロ ンゲーシヨ ンファクター 1 a (HEF1ひ） などの哺乳類細胞由来のプロモーター/ェンハンサーを 用いればよい。
例えば、 SV 40 プロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mu lliganらの方法 （Mulligan, R. C. et al. , Nature (1979) 277, 1 08-114) 、 また、 HEF1ひ 口モーター/ェンハンサーを使用する場合 、 Mizushima らの方法 (kizushima , S. and Nagata , S. Nucleic A cids Res. (1990) 18， 5322 ) に従えば容易に実施することができ る。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 抗体分泌のため
のシグナル配列、 発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現 させることができる。 '例 ばプロモーターと しては、 lacZプロモー ター、 araBプロモーターを挙げることができる。 lacZプロモーター を使用する場合、 Wardらの方法 （Ward， E. S. et al. , Nature (19 89) 341, 544-546； Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6， 242 2-2427 ) 、 araBプロモーターを使用する場合、 Betterらの方法 （B etter, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよ い。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のぺリ ブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 （Lei， S. P. et al J. Bact eriol. (1987) 169, 4379-4383) を使用すればよい。 ペリ プラズム に産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切にリ フォールド (refold) して使用する （例えば、 W096/30394を参照） 。
複製起源としては、 SV 40 、 ポリオ一マウィルス、 アデノウィル ス、 ゥシパピローマウィルス （BPV)等の由来のものを用いるこ とが でき、 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べク タ—は選択マーカーと して、 アミ ノグリ コシ ドホスホ トランスフエ ラーゼ （APH ) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キ サンチングァニンホスホリポシルトランスフェラーゼ （Ecogpt) 遺 伝子、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる 本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の産生系を使用す ることができる。 抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in V ivo の産生系がある。 in vitroの産生系としては、 真核細胞を使用 する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 動物細胞、 植物細胞、 又は真菌細胞を 用いる産生系がある。 動物細胞と しては、 （1) 哺乳類細胞、 例えば
、 CHO 、 COS 、 ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney) 、 HeLa、 Veroなど、 （2) 両生類—細'胞、 例えば、 アフリカッメガエル卵母細胞 、 あるいは（3) 昆虫細胞、 例えば、 sf9 、 sf21、 Tn5 などが知られ ている。 植物細胞と しては、 ニコチアナ ' タパクム （Nicotiana ta bacum)由来の細胞が知られており、 これをカルス培養すればよい。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロ ミセス （Saccharomyce s)属、 例えばサッカロ ミ セス · セレビシェ (Saccharomyces cerevi siae) 、 糸状菌、 例えばァスペルギルス属 （Aspergillus)属、 例え ばァスぺノレギルス . 二ガー （Aspergillus niger ) などが知られて いる。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌 細胞と しては、 大腸菌 （E. coli)、 枯草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し 、 形質転換された細胞を in vitroで培養することにより抗体が得ら れる。 培養は、 公知の方法に従い行う。 例えば、 培養液として、 DM EM、 MEM 、 RPMI1640, IMDMを使用することができ、 牛胎児血清 （FC S ) 等の血清補液を併用することもできる。 また、 抗体遺伝子を導 入した細胞を動物の腹腔等へ移すことによ り、 in vivo にて抗体を 産生してもよい。
一方、 in vivo の産生系と しては、 動物を使用する産生系や植物 を使用する産生系が挙げられる。 動物を使用する場合、 哺乳類動物 、 昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシなどを 用 ヽること力 Sできる (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology App lications, 1993)。 また、 昆虫としては、 カイコを用いることがで きる。 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、 動物又は植物の体
内で抗体を産生させ、 回収する。 例えば、 抗体遺伝子をャギ）3カゼ イ ンのよう ¾乳汁中に—固_有に産生される蛋白質をコ一ドする遺伝子 の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が揷入さ れた融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌の ャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれる トランスジェニッ クャギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 トラン スジエニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモンを トランスジエニックャギに使用しても よレヽ。 （Ebert, K.M. et al. , Bio/Technology (1994) 12， 699 - 70 2 ) 。
また、 カイコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を挿入したバキュ ロウィルスをカイコに感染させ、 このカイコの体液より所望の抗体 を得る （Maeda, S. et al. , Nature (1985) 315, 592-594) 。 さ ら に、 タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター 、 例えば ρΜΟΝ 530に挿入し、 このベクターを Agrobacterium tumefa ciens のようなパクテリ アに導入する。 このバクテリアをタバコ、 例えば Nicotiana tabacum に感染させ、 本タバコの葉よ り所望の抗 体を得る (Julian, K. - Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994) 2 4, 131-138) 。
上述のよ うに in vitro又は in vivo の産生系にて抗体を産生する 場合、 抗体重鎖 （H 鎖） 又は軽鎖 （L 鎖） をコー ドする DNA を別々 に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、 あるいは Η 鎖および L 鎖をコー ドする DNA を単一の発現ベクターに 組み込んで、 宿主を形質転換させてもよい （国際特許出願公開番号 W0 94-11523 参照） 。
本発明で使用される抗体は、 本発明に好適に使用され得るかぎり 、 抗体の断片やその修飾物であってよい。 例えば、 抗体の断片と し
ては、 Fab 、 F(ab')2 、 Fv又は H 鎖と L 鎖の Fvを適当なリ ンカーで 連結させたシングルチェイン Fv (scFv) が挙げ れる。
具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイ ン、 ペプシンで処理し 抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝 子を構築し、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で 発現させる （例えば、 Co, M.S. et al. , J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymolog y (1989) 178， 476-496 、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496 、 Lamoyi, E.， Methods in E nzymology (1989) 121 , 652-663 、 Rousseaux, J. et al. , Method s in Enzymology (1989) 121, 663-66, Bird, R. E. et al.， TIBT ECH (1991) 9， 132-137 参照） 。
scFvは、 抗体の H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域を連結することによ り得 られる。 この scFvにおいて、 H 鎖 V 領域と L 鎖 V 領域はリ ンカー、 好ましくは、 ペプチドリ ンカ一を介して連結される （Huston, J. S • et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879 - 5883 ) 。 scFvにおける H 鎖 V 領域および L 鎖 V 領域は、 上記抗体と して 記載されたもののいずれの由来であってもよい。 V 領域を連結する ペプチ ドリ ンカ一としては、 例えばァミノ酸 12-19 残基からなる任 意の一本鎖ぺプチドが用いられる。
scFvをコー ドする DNA は、 前記抗体の H 鎖又は、 H 鎖 V 領域をコ 一 ドする DNA 、 および L 鎖又は、 L 鎖 V 領域をコー ドする DNA を铸 型と し、 それらの配列のうちの所望のァミ ノ酸配列をコードする DN A 部分を、 その両端を規定するプライマー対を用いて PCR 法により 増幅し、 次いで、 さらにペプチドリ ンカ一部分をコードする DNA お よびその両端を各々 H 鎖、 L 鎖と連結されるように規定するプライ マー対を組み合せて増幅することによ り得られる。
また、 一旦 s cFvをコー ドする DNA が作製されれば、 それらを含有 する発現ベクター、 よび該発現べクターによ り形質転換された宿 主を常法に従って得ることができ、 また、 その宿主を用いて常法に 従って、 s cFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現 させ、 宿主によ り産生させることができる。 本発明でいう 「抗体」 にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物と して、 ポリエチレングリ コール （PEG )等の各種分 子と結合した抗体を使用することもできる。 本発明でいう 「抗体」 にはこれらの抗#：修飾物も包含される。 このような抗体修飾物を得 るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ること ができる。 これらの方法はこの分野においてすでに確立されている 前記のように産生、 発現された抗体は、 細胞内外、 宿主から分離 し均一にまで精製することができる。 本発明で使用される抗体の分 離、 精製はァフィ二ティークロマ トグラフィ一により行うことがで きる。 ァフィ二ティーク ロマ トグラフィ一に用いるカラムと しては 、 例えば、 プロティン A カラム、 プロテイン G カラムが挙げられる 。 プロテイン A カラムに用いる担体と して、 例えば、 Hyper D 、 P0 R0S 、 S ephar o s e F. F.等が挙げられる。 その他、 通常のタンパク質 で使用されている分離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定され るものではない。
例えば、 上記ァフィ二ティーク ロマトグラフィー以外のク ロマ ト グラフィー、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析等を適宜選択、 組 み合わせれば、 本発明で使用される抗体を分離、 精製することがで きる。 クロマ トグラフィーとしては、 例えば、 イオン交換クロマ ト グラフィ—、 疎水クロマ トグラフィー、 ゲルろ過等が挙げられる。
これらのク ロマ 卜グラフィーは HPLC (High performance liquid ch romatography) に； 用し得る。 3;た、 iネ目 HPLC (reverse phase HP LC) を用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA 等によ ' り行う ことができる。 すなわち、 吸光度の測定による場合には、 PB S (-)で適当に希釈した後、 280 nmの吸光度を測定し、 1 mg/ml を 1. 35 0D と して算出する。 また、 ELISA による場合は以下のように測 定することができる。 すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液 （pH9.6 ) で 1 μ g /mlに希釈したャギ抗ヒ ト IgG (TAG製） 100 1 を 96穴プレー ト （Nunc製） に加え、 4 °Cでー晚イ ンキュベーショ ンし、 抗体を固 相化する。 ブロ ッキングの後、 適宜希釈した本発明で使用される抗 体又は抗体を含むサンプル、 あるいは標品と してヒ ト IgG (CAPPEL 製） 100μ 1 を添加し、 室温にて 1時間ィンキュベーシヨ ンする。
洗浄後、 5000倍希釈したアル力リ フォスファターゼ標識抗ヒ ト Ig G (BIO SOURCE製） ΙΟΟμ Ι を加え、 室温にて 1時間イ ンキュベー トする。 洗浄後、 基質溶液を加えイ ンキュベーショ ンの後、 MICR0P LATE READER Model 3550 (Bio-Rad 製） を用いて 405nm での吸光度 を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。
本発明で使用される IL- 6改変体は、 IL- 6受容体との結合活性を有 し、 且つ IL- 6の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL-6 改変体は IL- 6受容体に対し IL-6と競合的に結合するが、 IL- 6の生物 学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナル伝達を遮断する。
IL-6改変体は、 IL - 6のァミ ノ酸配列のァミ ノ酸残基を置換するこ とによ り変異を導入して作製される。 IL- 6改変体のもと となる IL- 6 はその由来を問わないが、 抗原性等を考慮すれば、 好ましくはヒ ト IL-6である。
具体的には、 IL-6のァミ ノ酸配列を公知の分子モデリ ングプログ
ラム、 たとえば、 WHATIF (Vr iend et al . , J. Mo l . Graphi c s ( 199 0 ) 8， 52-56 ) を用"て-その二次構造を予測し、' さらに置換される ァミ ノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。 適切な置換ァミノ酸残基を決定した後、 ヒ ト IL- 6遺伝子をコ一ドず る塩基配列を含むベクターを鎳型として、 通常行われる PCR 法によ りアミ ノ酸が置換されるように変異を導入することによ り、 IL-6改 変体をコー ドする遺伝子が得られる。 これを必要に応じて適当な発 現ベクターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて IL - 6改変体を得ることができる。
IL- 6改変体の具体例と しては、 Brakenhoff et al . , J. Bi o l . Ch em. ( 1994) 269， 86-93 、 及び Savino et al .， EMBO J. (1994) 13 ， 1357-1367 、 WO 96-18648 、 W096— 17869 ίこ開示されてレ る。
本発明で使用される I L- 6部分ぺプチド又は IL- 6受容体部分べプチ ドは、 各々 IL-6受容体あるいは IL-6との結合活性を有し、 且つ IL-6 の生物学的活性を伝達しない物質である。 即ち、 IL- 6部分ペプチド 又は IL- 6受容体部分べプチドは IL-6受容体又は IL- 6に結合し、 これ らを捕捉することによ り Iい 6の IL- 6受容体への結合を特異的に阻害 する。 その結果、 IL- 6の生物学的活性を伝達しないため、 IL-6によ るシグナル伝達を遮断する。
IL-6部分べプチド又は IL- 6受容体部分べプチドは、 IL- 6又は IL- 6 受容体のアミ ノ酸配列において Iい 6と Iい 6受容体との結合に係わる 領域の一部又は全部のァミノ酸配列からなるぺプチドである。 この よ うなペプチドは、 通常 10〜80、 好ましく は 20〜50、 よ り好ましく は 20〜40個のァミ ノ酸残基からなる。
IL-6部分べプチ ド又は IL-6受容体部分べプチドは、 IL- 6又は IL- 6 受容体のアミ ノ酸配列において、 IL- 6と IL-6受容体との結合に係わ る領域を特定し、 その 部又は全部のァミ ノ酸配列を通常知られる
方法、 例えば遺伝子工学的手法又はべプチド合成法により作製する ことができ 。 — —
IL- 6部分べプチド又は IL- 6受容体部分べプチドを遺伝子工学的手 法によ り作製するには、 所望のぺプチドをコ一ドする DNA 配列を発 現ベクターに組み込み、 前記組換え型抗体の発現、 産生及び精製方 法に準じて得ることができる。
IL - 6部分べプチド又は IL- 6受容体部分べプチドをぺプチド合成法 によ り作製するには、 ペプチド合成において通常用いられている方 法、 例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
具体的には、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成 監修矢島治明 廣川書店 1991年に記載の方法に準じて行えばよい。 固相合成法とし ては、 例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しよう とするぺ プチ ドの C 末端に対応するアミノ酸を結合させ、 ひ - アミノ基及び 側鎖官能基を適切な保護基で保護したァミ ノ酸を C 末端から N 末端 方向の順番に 1 アミ ノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したァ ミノ酸又はべプチドのひ - アミ ノ基の該保護基を脱離させる反応を 交互に繰り返すことにより、 ペプチド鎖を伸長させる方法が用いら れる。 固相ペプチド合成法は、 用いられる保護基の種類によ り Boc 法と Fmo c法に大別される。
このようにして目的とするペプチドを合成した後、 脱保護反応及 びペプチド鎖の支持体からの切断反応をする。 ペプチド鎖との切断 反応には、 Bo c 法ではフッ化水素又はト リ フルォロメタンスルホン 酸を、 又 Fmoc法では TFA を通常用いることができる。 Boc 法では、 例えばフッ化水素中で上記保護べプチド樹脂をァ-ソール存在下で 処理する。 次いで、 保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチ ド を回収する。 これを凍結乾燥することによ り、 粗ペプチドが得られ る。 一方、 Fmoc法では、 例えば TFA 中で上記と同様の操作で脱保護
反応及びべプチ ド鎖の支持体からの切断反応を行う ことができる。 得られた ¾ぺプチ ド-は HPLCに適用することによ り分離、 精製す ることができる。 その溶出にあたり、 蛋白質の精製に通常用いられ る水- ァセ トニ ト リル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。 得られたクロマ トグラフィ一のプロフ ァイルのピークに該当する画 分を分取し、 これを凍結乾燥する。 このよ うにして精製したぺプチ ド画分について、 マススペク トル分析による分子量解析、 アミ ノ酸 組成分析、 又はアミ ノ酸配列解析等により同定する。
IL- 6部分べプチド及び IL- 6受容体部分べプチドの具体例は、 特開 平 2- 188600、 特開平 7- 324097、 特開平 8- 311098及び米国特許公報 US 5210075に開示されている。
本発明で使用される IL- 6アンタゴニス トの IL-6シグナル伝達阻害 活性は、 通常用いられる方法により評価することができる。 具体的 には、 IL- 6依存性ヒ ト骨髄腫株 （S6B45 , KPMM2) 、 ヒ ト レンネル ト Tリ ンパ腫細胞株 KT3 、 あるいは IL- 6依存性細胞 MH60. BSF2 を培養 し、 これに IL- 6を添加し、 同時に IL- 6アンタゴニス トを共存させる ことによ り IL 6依存性細胞の 3 H-チミジン取込みを測定すればよい また、 IL- 6受容体発現細胞である U266を培養し、 1 2 5 1 標識 IL- 6 を添加し、 同時に IL-6アンタゴニス トを加えることにより、 IL-6受 容体発現細胞に結合した 1 2 5 1 標識 IL-6を測定する。 上記アツセィ 系において、 IL-6Tンタ ゴニス トを存在させる群に加え Iい 6ァンタ ゴニス トを含まない陰性コント ロール群をおき、 両者で得られた結 果を比較すれば Iい 6アンタゴニス トの IL- 6阻害活性を評価すること ができる。
後述の実施例に示されるように、 抗 IL-6受容体.抗体により、 中皮 腫細胞の増殖抑制効果が認められたことから、 抗 IL- 6受容体抗体等
の IL-6アンタゴニス トは中皮腫の治療剤として有用であることが示 唆された。
本発明における治療対象は哺乳動物である。 治療対象の哺乳動物 は、 好ましく はヒ トである。
本発明の中皮腫治療剤又は中皮腫細胞増殖抑制剤は、 経口的にま たは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。 例え ば、 点滴などの静脈内注射、 筋肉内注射、 胸腔内注射、 腹腔内注射 、 皮下注射、 坐薬、 注腸、 経口性腸溶剤などを選択することができ 、 患者の年齢、 症状によ り適宜投与方法を選択することができる。 有効投与量は、 一回につき体重 1 kgあたり 0. 01 mg から 100 mgの範 囲で選ばれる。 あるいは、 患者あたり 1 〜： L000 mg 、 好ましく は 5 〜 50mg の投与量を選ぶことができる。
好ましい投与量、 投与方法は、 たとえば抗 I L-6レセプター抗体の 場合には、 血中にフリ一の抗体が存在する程度の量が有効投与量で あり、 具体的な例と しては、 体重 1 kgあたり 1 ヶ月 （ 4週間） に 0. 5 mgから 40mg、 好ましく は 1 mgから 20mgを 1回から数回に分けて、 例えば 2回 Z週、 1回/週、 1回 / 2週、 1回 Z 4週などの投与ス ケジュールで点滴などの静脈内注射、 皮下注射などの方法で、 投与 する方法などである。 投与スケジュールは、 病状の観察および血液 検査値の動向を観察しながら 2回/週あるいは 1回 Z週から 1回/ 2週、 1回 3週、 1回 / 4週のよ うに投与間隔を延ばしていくな ど調整することも可能である。
本発明の中皮腫治療剤又は中皮腫細胞増殖抑制剤は、 投与経路次 第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよ い。 このよ うな担体および添加物の例と して、 水、 医薬的に許容さ れる有機溶媒、 コラーゲン、 ポリ ビュルアルコール、 ポリ ビニルビ 口 リ ドン、 カノレポキシビニノレポリマー、 カノレポキシメ チノレセルロー
スナ ト リ ウム、 ポリ アク リル酸ナ ト リ ウム、 アルギン酸ナ ト リ ウム 、 水溶性デ ス トラン、 —カルボキシメチルスターチナ ト リ ウム、 ぺ クチン、 メチノレセノレロース、 ェチノレセノレロース、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイ ン、 ゼラチン、 寒天、 ジグリセリ ン、 プロ ピ レングリ コーノレ、 ポリエチレングリ コーノレ、 ワセリ ン、 パラフィ ン
、 ステアリノレアルコール、 ステアリ ン酸、 ヒ ト血清アルブミ ン （HS A ) 、 マンニ トール、 ソルビ トール、 ラク トース、 医薬添加物と し て許容される界面活性剤などが挙げられる。 使用される添加物は、 剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せで選択されるが、 こ れらに限定されるものではない。 実施例
以下、 実施例および参考例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 1 . 悪性中皮腫細胞株による IL-6の産生
培養液 （10% fetal calf serum(FCS ) 添加 RPMI ) 中、 24-ゥエル プレート中で、 細胞濃度 5 X 104 /ゥエルで、 悪性中皮腫細胞株、 MS T0、 Η2052, Η28、 Η226及ぴ Η2452の培養を開始し、 翌日細胞培養液 を交換し、 その後更に 3 日間培養し、 培養上清中の IL-6の濃度を、 全自動化学発光酵素免疫測定システム （富士レビォ、 ルミ パルス） によ り測定し、 細胞蛋白質の量で補正した。 結果を図 1 に示す。 実 験は 3連で行った。 Η28細胞系は IL- 6無産生株であつたが、 他の 4 株は IL- 6産生株であった。 特に Η2052細胞株及び Η226細胞株は IL-6 高産生株と考えられた。
実施例 2 . 悪性中皮腫細胞株における IL-6Rの発現
悪性中皮腫 5株の IL- 6受容体発現量を mRNA レベルで測定した。 陽性対照と して KT-3 細胞を用い、 陰性対照として潤膜細胞（Synovi
ocytes)を使用した。 これらの細胞を 10%FCS添加 RPMI中で 48時間培 養し、 細胞中の IL- 6¾容—体 （IL-6R) をコー ドする mRMAを、 検出手 段と して GeneAmp PCR System(Appl ied Biosystems社）を用いる reve rse- transcribed- PCR(RTPCR)法によ り測定した。 結果を図 2に示す 。 なお、 図 2 (下） は、 内在性コントロールとして使用した GAPDH( グリセルァノレデヒ ド -3-リ ン酸デヒ ドロゲナーゼ）の mRNA量を示す。
この結果よ り、 悪性中皮腫細胞は IL-6受容体を殆ど発現していな いと考えられる。 悪性胸膜中皮腫症例の胸水は血性胸水であるため 、 可溶性 IL-6受容体が多量に存在し、 これが IL- 6刺激伝達に関与し ていると推測される。
実施例 3. IL- 6刺激による VEGF産生誘導 （ 1 )
悪性中皮腫細胞株 H2052および H2452の腫瘍細胞を、 RPMI 1640培 地中で、 初期細胞濃度 5X104Zゥエルと して、 24—ゥエルプレート 上 3連で培養した。 翌日、 細胞培養液を交換し、 （1) 組換え IL- 6 (10 ng/ml) 、 (2) 組換え Iい 6 (10 ng/ml) +組換え可溶性 IL - 6R (100 ng/ml) による刺激、 及び （3) 抗 IL- 6受容体抗体であるヒ ト 型化 PM- 1抗体 （W0 92/19759参照） （25 μ g/ml) による阻害を開始 した （RPMIは培地対照） 。 更に 3 日間培養した後、 培養上清中の血 管形成誘導因子 （VEGF) の濃度を、 Quantikine Human VEGF Immuno assay Kit(R & D Systems社）によ り測定し、 細胞蛋白質量で補正し た。
結果を図 3に示す。 この図から明らかな通り、 H2052細胞株およ び H2452細胞株では IL- 6刺激によ り VEGF産生が誘導された。
実施例 4. IL - 6刺激による VEGF産生誘導 （2 )
悪性中皮腫細胞株 H28を用いて、 実施例 3の実験を反復した。 結 果を図 4に示す。 この結果から明らかな通り、 H28細胞株は VEGF高 産生株であるが、 IL-6刺激に対しては無反応であった。
実施例 5. I L- 6刺激による STAT3のリ ン酸化
IL- 6による VEGF産生—誘—導株である H2025細胞株および IL- 6による V EGF産生非誘導株である H28細胞株を、 組換え IL-6(10 ng/ml)及び可 溶性組換え IL- 6受容体（100ng/ml)の存在下で、 signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) と共にイ ンキュベー ト し、 イ ンキュベーショ ンの 0時間目、 0.5時間目及び 1時間目に 、 STAT3力、ら p-STAT3へのリ ン酸化についてウェスタンプロッ トによ り分析した。 結果を図 5に示す。
図 5から明らかな通り、 H2052細胞株では、 11^6刺激後 30分で STA T3の著明なリ ン酸化が認められた。 対照的に H28細胞株では IL-6刺 激に対しては僅かな STAT3のリ ン酸化しか認められなかった。 なお 、 図 5中、 P-STAT3はリ ン酸化 STAT3を示し、 STAT3はリ ン酸化と非 リ ン酸化 STAT3の総和を示す。
実施例 6. IL - 6刺激による S0CS3の誘導
IL - 6による VEGF産生誘導株である H2025細胞株および IL-6による V EGF産生非誘導株である H28細胞株を、 組換え IL- 6(10 ng/ml)及び可 溶性組換え IL-6受容体（100ng/ml)の存在下でィンキュベート して刺 激を行い、 インキュベーシ ョ ンの 0時間目、 2時間目及び 4時間目 こ、 誘導され 7こ suppressor of cytokine signaling 3 (SOし S3) 及 びダリセルアルデヒ ド- 3 -リ ン酸デヒ ドロゲナーゼ （GAPDH) の発現 量を、 それらをコー ドする mRNAの RT-PCRによる増幅後の測定によ り 、 測定した。 結果を、 図 6に示す。
図 6から明らかな通り、 H2052細胞株では、 IL- 6刺激後 2時間で S 0CS3 mRNAの誘導が認められた。 H28細胞株では恒常的な S0CS3の高 発現が観察された。
実施例 7. VEGFプ口モーターアツセィ
VEGFプロモーターによ りルシフェラーゼ遺伝子の発現をコント口
ールするプラスミ ド pGL3-VEGF、 及びリ ン酸化 STAT3結合部を崩した 変異型 VEGFプ口モーター こよ りルシフェラーゼ遺伝子の発現をコン トロールするプラスミ ド pGL3-VEGFmutを作成した （図 7 ) 。
H2052細胞 50，000当 り 1 μ gの pGL3— VEGFまたは pGL3_VEGFmutを 卜 ラ ンスフエタ ト し、 ト ラ ンスフエク トされた細胞を組換え IL-6 ( 10 ng/ml )および組換え可溶性 IL- 6受容体（100ng/ml )で刺激した。 2 日間刺激のあと、 VEGFプロモーターおよび変異型 VEGFプロモーター から誘導されたルシフ ラーゼ活性を検討した。 結果を図 8に示す 図 8から明らかな通り、 VEGFプ口モーターからリ ン酸化 STAT3結 合部を削除した場合、 IL-6刺激による VEGFプロモーターの活性化は 見られなくなった。 上記実施例 5、 6及び 7の結果から、 H2052細 胞株における Iい 6刺激による VEGF産生増強は、 JAK- STAT系を介して いるものと考えられた。 この予想される系を図 9に示す。
実施例 8 . IL-6及び可溶性 IL- 6受容体添加によるによる H2052、 H226の増殖促進
H2052糸田胞株を、 10%FCS添カロ RPMI培地中、 96 _ウエノレプレートに 5 00細胞 Zゥエルで細胞を播き、 耝換え可溶性 I L- 6受容体の lOOng/ml での存在下または非存在下で、 且つ種々の濃度 （ 0、 1 、 10又は 10 Ong/ml) の IL-6の存在下で、 5連で、 6〜 7 日間培養した。 結果を 図 10及び図 13に示す。 これらの図から明らかな通り、 H2052細胞株 及び H226細胞株は耝換え可溶性 IL-6受容体（lOOng/ml )存在下で、 I L-6濃度依存的に増殖する。
実施例 9 . IL- 6及び IL- 6Rの添加による H2052細胞の増殖促進の I L-6Rに対する抗体 （抗 IL-6R抗体） による抑制
IL-6及び IL- 6受容体による H2052細胞株の増殖促進が抗 IL- 6R抗体 により抑制されるか否かを見るため、 H2052細胞株を、 10%FCS添加 R
PMI培地中、 96—ゥエルプレー トに 500細胞/ゥエルで細胞を播き、 1 Ong/m 1の組換え可溶 ΙΪ- 6及び 100ng/mlの組換え可溶性 IL-6受容 体の存在下で、 且つ種々の濃度 （ 0、 1 /X g/ml又は 25 μ g/ml) のヒ ト型化 PM-1抗体の存在下で、 3連で、 7 日間培養した。 培養後、 MT Sアツセィによ り H2052細胞株の増殖量 （0D 450) を測定した。 結 果を図 11に示す。 その結果、 抗 IL- 6R抗体は濃度依存性に増殖を抑 制することがわかった。 一方、 対照として、 MRAの代わりに同じ濃 度のヒ ト I gGlを加えた場合、 抑制効果は見られなかった。
実施例 10. IL- 6及び可溶性 IL-6受容体添加によるによる H226の 增殖促進、 及び抗 IL-6R抗体による抑制
H226細胞株を、 10%FCS添加 RPMI培地中、 96—ゥエルプレートに、 500細胞 Zゥエルの濃度で細胞濃度で播き、 組換え可溶性 IL- 6受容 体の 100ng/mlでの存在下で、 且つ種々の濃度 （ 0、 1、 10又は 100η g/ml) の IL- 6の存在下で、 又は 25 μ g/mlの MRAの存在下で、 3連で 、 7 日間培養した。 結果を図 12に示す。 この図から明らかな通り、 IL- 6高生産性の H226細胞株は、 IL- 6高生産性の H2052細胞株と同様 、 組換え可溶性 IL-6受容体（lOOng/ml )存在下で、 IL-6濃度依存的に 増殖し、 その増殖は抗 IL-6R抗体により抑制された。
実施例 11. IL-6及び可溶性 IL- 6受容体添加による H2052細胞株、 H226細胞株の増殖促進の抗 IL- 6受容体抗体による抑制
H2052細胞株及び H226細胞株を、 10% FCS添加 RPMI培地中、 96-ゥ ヱルプレートに 200細胞/ゥヱルで細胞を播き、 IL- 6 ( 10ng/ml) 及 び可溶性 IL-6受容体 （100ng/ml ) の存在下で、 且つ種々の濃度 （ 0 、 1 μ g/ml , 5 / g/ml ) のヒ ト型化 PM - 1抗体の存在下で、 5連で、 6 日間培養した。 培養後、 MTSアツセィにより H2052細胞株及び H226 細胞株の細胞増殖率を測定した。 細胞増殖率は、 IL- 6/ s IL-6R無添 加に比べて何倍増殖したかによつて示す。 結果を図 14に示す。 その
結果、 抗 IL-6受容体抗体は、 H2052細胞株及び H226細胞株の IL- 6/s I い 6R添加による増殖促進ィ乍用を完全に抑制した。 '一方、 対照として 、 抗 I L- 6受容体抗体の代わりに同じ濃度のヒ ト IgGl ( S igma) を添 加した場合、 増殖抑制効果は認められなかった。
実施例 12. 抗 IL-6受容体抗体による、 IL-6刺激による VEGF産生 誘導の抑制
ヒ ト型化 PM- 1抗体の濃度 （0. 1 ii g/ml、 5 μ g/ml ) 以外は実施例 3 と同じ条件で、 抗 IL- 6受容体抗体による、 悪性中皮腫細胞株 MST0 、 H226、 H2052及び H2452における IL-6刺激による VEGF産生誘導の抑 制作用を検討した。 結果を図 15に示す。 その結果、 抗 IL- 6受容体抗 体は、 Iい 6/s Iい 6R刺激による VEGF産生誘導を完全に抑制した。 一 方、 対照と して、 抗 IL-6受容体抗体の代わりに同じ濃度のヒ ト I gGl
( Sigma) を添加した場合、 VEGF産生誘導の抑制作用は認められな かった。
実施例 13. 抗 IL-6受容体抗体による STAT3リ ン酸化の抑制
VEGF産生誘導株である H2052細胞株及び H2452細胞株で、 Iい 6 ( 10 ng/ml) 及び可溶性 IL- 6受容体 （lOOng/ml) 刺激によ り誘導される S TAT3リ ン酸化が、 5 μ g/mlの抗 IL- 6受容体抗体によ り抑制されるか を検討した。 結果を図 16に示す。 その結果、 抗 IL-6受容体抗体は、 悪性中皮腫細胞において IL- 6/s IL- 6R刺激により誘導されるリ ン酸 化 STAT3 (p-STAT3) を顕著に抑制した。 一方、 対照と して、 抗 IL-6 受容体抗体の代わりに同じ濃度のヒ ト I gGl ( Sigma) を添加した場 合、 STAT3のリ ン酸化の抑制はほとんど認められなかった。
実施例 14. 悪性中皮腫細胞の増殖に対する抗 VEGF抗体の効果
H2052細胞株及び H226細胞株を、 10% FCS添加 RPMI培地中、 96—ゥ エルプレー トに 500細胞/ゥエルで細胞を播き、 Iい 6 ( 10ng/ml) 及 び組換え可溶性 IL-6受容体 （lOOng/ml ) の存在下で、 且つ 1 μ §/ιη1
の抗 VEGF抗体の存在下で、 5連で、 6〜 7 日間培養した。 培養後、 MTSアツセィによ り増^ 4を検討した。 対照としては、 抗 VEGF抗体 の代わりに同じ濃度のヒ ト IgGl (Sigma) を用いた。 結果を図 17に 示す。 その結果、 抗 VEGF抗体は、 Iい 6/sIい 6R刺激による細胞増殖 を抑制しなかった。 このことから、 Iい 6/sIい 6R刺激による悪性中 皮腫細胞増殖作用は、 VEGFを介するものでないことが判明した。
参考例 1. ヒ ト可溶性 IL-6受容体の調製
Yamasakiらの方法 (Yamasaki, K. et al. , Science (1988) 241, 825-828) に従い得られた IL- 6受容体をコ一ドする cDNAを含むプラ スミ ド pBSF2R.236を用いて、 PCR 法により可溶性 Iい 6受容体を作成 した。 プラスミ ド pBSF2R.236を制限酵素 Sph I で消化して、 IL-6受 容体 cDNAを得、 これを mpl8 (Amersham製） に挿入した。 IL- 6受容体 cDNAにス トップコ ドンを導入するようにデザィンした合成ォリ ゴプ ライマーを用 ヽて、 イ ンビ ト ロ ミ ュータジエネシスシステム （Amer sham製） により、 PCR 法で IL-6受容体 cDNAに変異を導入した。 この 操作によりス ト ップコ ドンがアミ ノ酸 345 の位置に導入され、 可溶 性 IL- 6受容体をコー ドする cDNAが得られた。
可溶性 IL-6受容体 cDNAを CH0 細胞で発現するために、 プラスミ ド pSV (Pharmacia製） と連結させ、 プラスミ ド pSVL344 を得た。 dhfr の cDNAを含むプラスミ ド pECEdhfrに Hind Ill-Sal Iで切断した可溶 性 IL- 6受容体 cDNAを挿入し、 CH0 細胞発現プラスミ ド pECEdhfr 344 を得た。
10 μ gのプラスミ ド pECEdhfr344 を dhfr_CH0細胞株 DXB-ll (Urla ub， G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-42 20) へカルシウムフォスフェイ ト沈降法 (Chen, C. et al.， Mol. Cell. Biol. (1987) 7， 2745-2751 ) によ り、 ト ランスフエタ ト し た。 トランスフエタ トした CH0 細胞を ImM グルタミ ン、 10% 透析 FC
S 、 lOOU/ml のペニシリ ンおよび 100 μ g /ml のス ト レプ トマイ シ ンを含むヌク レオシド'不^ Γひ MEM 選択培養液で 3 週間培養した。 選択された CH0 細胞を限界希釈法でスク リ ーニングし、 単一の CH 0 細胞クローンを得た。 この CH0 細胞ク ローンを 20nM〜 200nM の濃 度のメ ト ト レキセートで増幅し、 ヒ ト可溶性 IL- 6受容体産生 CH0 細 胞株 5E27を得た。 CH0 細胞株 5E27を 5%FBS を含むイスコープ改変ダ ルべコ培養液 （IMDM、 Gibco 製） で培養した。 培養上清を回収し、 培養上清中の可溶性 IL-6受容体の濃度を ELISA にて測定した。 その 結果、 培養上清中には可溶性 IL - 6受容体が存在することが確認され た。
参考例 2. 抗ヒ ト IL - 6抗体の調製
10 μ g © Ii^ lL-6 (Hirano, T. et al. , Immunol. Lett. (198 8) 17, 41 ) をフロイント完全アジュパント と ともに BALB/cマウス を免疫し、 血清中に抗 IL- 6抗体が検出できるまで一週間毎にこれを 続けた。 局部のリ ンパ節から免疫細胞を摘出し、 ポリエチレンダリ コール 1500を用いてミエローマ細胞株 P3U1と融合させた。 ハイプリ ドーマを HAT 培養液を用いる Oiらの方法 （Selective Methods in C ellu丄 ar immunology, W. H. Freeman and Co. , San Francisco , 35丄 ，
1980 ) に従って選択し、 抗ヒ ト IL- 6抗体を産生するハイプリ ドー マを樹立した。
抗ヒ ト IL-6抗体を産生するハイプリ ドーマは下記のよ うにして I L-6結合アツセィをおこなった。 すなわち、 柔軟なポリ ビュル製の 9 6穴マイ ク ロ プレ一 卜 (Dynatech Laboratories， Inc. , Alexand r ia , VA) を 0.1Mの carbonate - hydrogen carbonate緩衝液 ( H 9.6 ) 中で 100 1 のャギ抗マウス (10 μ 1 /ml, Cooper Biomedical ， Inc製 Malvern, PA) によ り 4 °Cでー晚コート した。 次いで、 プ レー トを 100〃 1 の 1 %ゥシ血清アルブミ ン （BSA ) を含む PBS に
よ り室温で 2 時間処理した。
これを PBS''で洗浄し'た ¾、 100 1 のハイプリ ドーマ培養上清を 各穴へ加え、 4 °Cにてー晚インキュベートした。 プレートを洗净し て、 2000cpm/0.5ng/wellとなるように 1251 標識組換型 IL- 6を各穴 へ添加し、 洗浄した後各穴の放射活性をガンマカウンター （Beckma n Gamma 9000 , Beckman Instruments , Fullerton, し A) で fiU:^し 7こ 。 216 ハイプリ ドーマク ローンのうち 32のハイプリ ドーマク ローン が IL-6結合アツセィによ り陽性であった。 これらのクローンのなか で最終的に安定な MH166.BSF2が得られた。 該ハイプリ ドーマが産生 する抗 IL-6抗体 MH166 は IgGl κのサブタイプを有する。
ついで、 IL- 6依存性マウスハイプリ ドーマクローン ΜΗ60. BSF2 を 用いて MH166 抗体によるハイブリ ドーマの増殖に関する中和活性を 調べた。 MH60.BSF2 細胞を 1 X104 /200 1 /穴となるように分注 し、 これに MH166 抗体を含むサンプルを加え、 48時間培養し、 0.5 μ Ci/ 穴の 3 H チミジン (New England Nuclear , Boston, MA ) を 加えた後、 更に 6 時間培養を続けた。 細胞をグラスフィルターぺー zヽ0一上 ίこおき、 自動ノヽ一べスター (Labo Mash Science Co. , Tokyo , Japan ) で処理した。 コントロールと してゥサギ抗 IL- 6抗体を用 いた。
その結果、 MH166 抗体は IL- 6によ り誘導される MH60. BSF2 細胞の 3H チミジンの取込みを容量依存的に阻害した。 このことよ り、 MH 166 抗体は IL - 6の活性を中和することが明らかとなった。
参考例 3. 抗ヒ ト IL- 6受容体抗体の調製
Hirataらの方法 (Hirata, Y. et al. J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906 ) によ り作成した抗 IL- 6受容体抗体 MT18を CNBrによ り活 性化させたセファロース 4B (Pharmacia Fine Chemicals製， Piscat away, NJ) と添付の処方にしたがって結合させ、 IL-6受容体 （Yama
saki, K. et al. , Science (1988) 241, 825-828) を精製した。 ヒ ト ミエローマ細胞株 υ 60 Wジギトニン （Wako Chemicals製） ， 10 mMト リ エタ ノールァミ ン （ρΗ 7·8) および 0.15M NaClを含む ImM p- ノ ラア ミ ノ フエニノレメ タ ンスノレフォニノレフノレオラィ ドハイ ドロ ク ロ リ ド （Wako Chemicals製） （ジギトニン緩衝液） で可溶化し、 セフ ァロース 4Bビーズと結合させた MT18抗体と混合した。 その後、 ビー ズをジギトニン緩衝液で 6 回洗浄し、 免疫するための部分精製 IL - 6 受容体とした。
BALB/cマウスを 3 X109 個の U266細胞から得た上記部分精製 IL- 6 受容体で 10日おきに 4 回免疫し、 その後常法によ りハイプリ ドーマ を作成した。 成長陽性穴からのハイプリ ドーマ培養上清を下記の方 法にて IL-6受容体への結合活性を調べた。 5 ラ 107 個の U266細胞を 35 S —メチォニン （2.5mCi) で標識し、 上記ジギトニン緩衝液で可 溶化した。 可溶化した U266細胞を 0.04ml容量のセフ了口ース 4Bビー ズと結合させた MT18抗体と混合し、 その後、 ジギトニン緩衝液で 6 回洗浄し、 0.25mlのジギトニン緩衝液 （pH3.4 ) により 3 —メチ ォニン標識 IL- 6受容体を流出させ、 0.025ml の 1M Tris (pH 7.4) で中和した。
0.05mlのハイブリ ドーマ培養上清を 0.01mlの Protein G セフ ァ ロ ース （Phramacia 製） と混合した。 洗浄した後、 セファロースを上 記で調製した 0.005ml の35 S 標識 IL - 6受容体溶液と ともにィンキュ ペー トした。 免疫沈降物質を SDS- PAGEで分析し、 Iい 6受容体と反応 するハイプリ ドーマ培養上清を調べた。 その結果、 反応陽性ハイブ リ ドーマクローン PM—1 (FERM BP— 2998)を樹立した。 ハイブリ ドー マ PM - 1から産生される抗体は、 IgGl κのサブタイプを有する。
ハイプリ ドーマ PM-1が産生する抗体のヒ ト IL- 6受容体に対する I L- 6の結合阻害活性をヒ ト ミエローマ細胞株 U266を用いて調べた。
ヒ ト組換型 IL- 6を大腸菌よ り調製し （Hirano, T. et al. , Immunol . Lett. (1988) 17， 41-45) 、 ポルトン一ハンター試薬 （New Engl and Nuclear, Boston, MA ) によ り 125 I標識した （Taga, T. et al. , J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 ) 。
4 X105 個の U266細胞を 1 時間、 70% (v/v ) のハイブリ ドーマ PM-1の培養上清および 14000cpmの 125 I標識 IL-6とともに培養した 。 70 μ 1 のサンプルを 400 μ 1 のマイ ク ロフュージポリエチレンチ ユープに 300 μ 1 の FCS 上に重層し、 遠心の後、 細胞上の放射活性 を測定した。
その結果、 ハイブリ ドーマ ΡΜ- 1が産生する抗体は、 IL- 6の IL- 6受 容体に対する結合を阻害することが明らかとなつた。
参考例 4. 抗マウス IL- 6受容体抗体の調製
Saito, T. et al. , J. Immunol. (1991) 147， 168-173 に記載の 方法によ り、 マウス IL- 6受容体に対するモノクローナル抗体を調製 した。
マゥス可溶性 IL-6受容体を産生する CH0 細胞を 10%FCSを含む IMDM 培養液で培養し、 その培養上清から抗マウス IL- 6受容体抗体 RS12 ( 上記 Saito, T. et al 参照） を Affigel 10ゲル （Biorad製） に固定 したァフィユティーカラムを用いてマウス可溶性 IL- 6受容体を精製 した。
得られたマウス可溶性 IL- 6受容体 50μ gをフロイント完全アジュ バンドと混合し、 ウィスターラッ トの腹部に注射した。 2 週間後か らはフ口イント不完全アジュパンドで追加免疫した。 45日 目にラッ ト脾臓細胞を採取し、 2 X108 個を 1 X107 個のマウスミエローマ 糸田胞 P3U1と 50% の PEG1500 (Boehringer Mannheim 製） をもちいて 常法によ り細胞融合させた後、 HAT 培地にてハイプリ ドーマをスク リ一ユングした。
ゥサギ抗ラッ ト IgG 抗体 （Cappel製） をコートしたプレー トにハ ィプリ ドーマ培養上清— 加えた後、 マウス可溶性 IL- 6受容体を反応 させた。 次いで、 ゥサギ抗マウス IL- 6受容体抗体およびアルカ リ フ ォスファターゼ標識 tッジ抗ゥサギ IgG による ELISA 法によ りマウ ス可溶性 IL-6受容体に対する抗体を産生するハイブリ ドーマをスク リーニングした。 抗体の産生が確認されたハイプリ ドーマク ローン は 2 回のサブスク リーニングを行い、 単一のハイブリ ドーマク 口一 ンを得た。 このクローンを MR16-1と名付けた。
このハイプリ ドーマが産生する抗体のマウス IL-6の情報伝達にお ける中和活性を画 0. BSF2 細胞 (Matsuda, T. et al. , J. Immunol . (1988) 18， 951-956) を用いた 3H チミジンの取込みで調べた。 96ゥエルプレートに MH60. BSF2 細胞を 1 ラ 104 個/ 200 μ ΐ /ゥエル となるよ うに調製した。 このプレー トに 10pg/ml のマウス IL- 6と MR 16- 1抗体又は RS12抗体を 12.3〜1000ng/ml 加えて 37°C、 5%C02 で 44 時間培養した後、 lwCi/ ゥエルの 3H チミジンを加えた。 4 時間 後に 3H チミジンの取込みを測定した。 その結果 MR16- 1抗体は MH60 . BSF2 細胞の 3H チミジン取込みを抑制した。
したがって、 ノヽイブリ K一マ MR16—1 (FERM BP— 5875)カ 産生する 抗体は、 Iい 6の IL- 6受容体に対する結合を阻害することが明らかと なった。
Claims
1 . イ ンターロイキン- 6 ( I L-6) アンタゴニス トを有効成分と し て含んで成る中皮腫治療剤。
2 . 前記中皮腫が胸膜中皮腫である、 請求項 1に記載の中皮腫治 療剤。
3 . 前記胸膜中皮腫が悪性胸膜中皮腫である、 請求項 2に記載の 中皮腫治療剤。
4 . 前記 IL- 6アンタゴニス ト力 い 6受容体に対する抗体である、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の中皮腫治療剤。
5 . 前記 IL-6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するモノク口 ーナル抗体である、 請求項 4に記載の中皮腫治療剤。
6 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体がヒ ト IL-6受容体に対するモノ クローナル抗体である、 請求項 4に記載の中皮腫治療剤。
7 . 前記 IL- 6受容体に対する抗体がマウス IL- 6受容体に対するモ ノクローナル抗体である、 請求項 4に記載の中皮腫治療剤。
8 . 前記 IL-6受容体に対する抗体が組換え型抗体である、 請求項 4〜 7のいずれか 1項に記載の中皮腫治療剤。
9 . 前記ヒ ト Iい 6受容体に対するモノク ローナル抗体が PM - 1抗体 である、 請求項 6に記載の中皮腫療剤。
10. 前記マウス I L-6受容体に対するモノクローナル抗体が MR16 - 1 抗体である、 請求項 7に記載の中皮臛治療剤。
11. 前記 IL- 6受容体に対する抗体が IL-6受容体に対するキメラ抗 体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 請求項 4〜10のいずれか 1項に記載の中皮腫治療剤。
12. 前記 IL - 6受容体に対するヒ ト型化抗体がヒ ト型化 PM- 1抗体で ある、 請求項 11に記載の中皮腫治療剤。
13， インターロイキン -6 ( IL-6) アンタゴニス トを有効成分と し て含んで成 δ中皮腫細—胞—に対する増殖抑制剤。 '
14. 前記中皮腫が胸膜中皮腫である、 請求項 1 3に記載の増殖抑 制剤。
15. 前記胸膜中皮腫が悪性胸膜中皮腫である、 請求項 14に記載の 増殖抑制剤。
16. 前記 IL- 6アンタゴニス トが IL- 6受容体に対する抗体である、 請求項 13〜15のいずれか 1項に記載の増殖抑制剤。
17. 前記 IL- 6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するモノ ク口 ーナル抗体である、 請求項 16に記載の増殖抑制剤。
18. 前記 IL- 6受容体に対する抗体がヒ ト IL- 6受容体に対するモノ クローナル抗体である、 請求項 16に記載の増殖抑制剤。
19. 前記 IL- 6受容体に対する抗体がマウス IL-6受容体に対するモ ノクローナル抗体である、 請求項 16に記載の増殖抑制剤。
20. 前記 IL-6受容体に対する抗体が組換え型抗体である、 請求項 16〜19のいずれか 1項に記載の増殖抑制剤。
21. 前記ヒ ト IL- 6受容体に対するモノク ローナル抗体が PM-1抗体 である、 請求項 18に記載の増殖抑制剤。
22. 前記マウス IL-6受容体に対するモノクローナル抗体が MR16 - 1 抗体である、 請求項 19に記載の増殖抑制剤。
23. 前記 IL - 6受容体に対する抗体が IL- 6受容体に対するキメラ抗 体、 ヒ ト型化抗体またはヒ ト抗体である、 請求項 16〜22のいずれか 1項に記載の增殖抑制剤。
24. 前記 IL - 6受容体に対するヒ ト型化抗体がヒ ト型化 ΡΜ - 1抗体で ある、 請求項 23に記載の増殖抑制剤。
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