WO2005035559A1 - Isoliertes photoprotein mtclytin, sowie dessen verwendung - Google Patents

Isoliertes photoprotein mtclytin, sowie dessen verwendung Download PDF

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WO2005035559A1
WO2005035559A1 PCT/EP2004/009843 EP2004009843W WO2005035559A1 WO 2005035559 A1 WO2005035559 A1 WO 2005035559A1 EP 2004009843 W EP2004009843 W EP 2004009843W WO 2005035559 A1 WO2005035559 A1 WO 2005035559A1
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WO
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nucleic acid
seq
photoprotein
sequence
acid molecules
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/009843
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English (en)
French (fr)
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Stefan Golz
Svetlana Markova
Ludmila Burakova
Ludmila Frank
Eugene Vysotski
Original Assignee
Bayer Healthcare Ag
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the invention relates to the photoprotein mtClytin, its nucleotide and amino acid sequence, and the activity and use of the photoprotein mtClytin.
  • Bioluminescence is the phenomenon of light generation by living things. It is the result of biochemical reactions in cells in which the chemical energy is released in the form of light quanta (so-called cold emission through chemiluminescence). Light generated in this way is monochromatic, because it is emitted with a discrete electron transition, but can be shifted into longer-wave spectral ranges by secondary fluorescent dyes (e.g. fluorescent proteins in the case of light jellyfish of the genus Aequora).
  • secondary fluorescent dyes e.g. fluorescent proteins in the case of light jellyfish of the genus Aequora
  • the biological function is diverse: around 90% of all living things shine in the sea depth between 200 and 1000 m (mesopelagial).
  • the light signals are used here for partner advertising, deception and as bait. Fireflies and fireflies also use the light signals to find partners.
  • a large number of coelenterates are bioluminescent (Morin et al., 1974). These organisms emit blue or green light.
  • the aequorin from Aequoria victoria identified as the first light producing protein in 1962 (Shimomura et al., 1969) emitted a blue light and not green light as phenotypically observed in Aequoria victoria as the isolated protein.
  • GFP green fluorescent protein
  • Table 2 Overview of some photoproteins. The organism from which the protein has been isolated, the name of the photoprotein and a selection are given. Patents or registrations.
  • Bioluminescence is widely used in technology today, e.g. in the form of bio-indicators for environmental pollution or in biochemistry angry sensitive detection of proteins, for the quantification of certain compounds or as a so-called "reporter” in the study of cellular gene regulation.
  • the photoproteins differ not only because of their nucleotide and amino acid sequence, but also because of their biochemical and physical properties. It could be shown that changing the amino acid sequence of photoproteins can change the physical and biochemical properties. Examples of mutagenized photoproteins are described in the literature (US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986).
  • Reporter or indicator genes are generally referred to as genes whose gene products can be easily detected using simple biochemical or histochemical methods. A distinction is made between at least 2 types of reporter genes.
  • Resistance genes are genes whose expression gives a cell resistance to antibiotics or other substances, the presence of which in the growth medium leads to cell death if the resistance gene is missing.
  • Reporter genes are used in genetic engineering as merged or unfused indicators. The most common reporter genes include beta-galactosidase (Alam et al., 1990), alkaline phospatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), luciferases and other photoproteins (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
  • Luminescence is the radiation of photons in the visible spectral range, this being done by excited emitter molecules. In contrast to fluorescence, the energy is not supplied from outside in the form of radiation of shorter wavelength.
  • Chemiluminescence is a chemical reaction that leads to an excited molecule that glows when the excited electrons return to the ground state. If this reaction is catalyzed by an enzyme, one speaks of bioluminescence.
  • the enzymes involved in the reaction are generally referred to as luciferases.
  • the species Clytia grenaria belongs to the Cnidaria, especially to the Medusas.
  • the bioluminescent or fiuorescent phenotype was already described in 1998 (Ward et al., 1998). Isolation of the cDNA
  • reaction products were incubated for 30 minutes at 37 ° C. with proteinase K and the cDNA was precipitated with ethanol.
  • the expression cDNA bank was carried out using the “SMART cDNA Library Construction Kit” from Clontech (USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the cloning was carried out into the expression vector pTriplEx2 (Clontech; USA).
  • the expression vectors were electroplated into bacteria of strain E. coli XLl-Blue transformed.
  • the bacteria were plated on LB culture media and incubated for 24 hours at 37 ° C. Replica plating was then carried out by transferring the bacteria to a further culture medium plate using a nitrocellulose filter. The replica plate was again incubated for 24 hours at 37 ° C. and the grown bacterial colonies were transferred to LB liquid medium. After the addition of IPTG (final concentration 0.1 mM), the bacteria were incubated for 4 hours at 37 ° C. on a shaker. The bacteria were harvested by centrifugation and the bacterial mass was resuspended in 0.5 ml digestion buffer (5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL pH 9.0) at 0 ° C. The bacteria were then broken down ⁇ by ultrasound.
  • IPTG final concentration 0.1 mM
  • the lysates. were incubated at 4 ° C for 3 hours after the addition of coelenterazines (final concentration 10E-07 M). The bioluminescence was then measured after the addition of calcium chloride (final concentration 20 mM) in the luminometer.
  • a photoprotein was identified.
  • the photoprotein was named mtClytin.
  • the mtClytin photoprotein is shown in detail below.
  • the photoprotein mtClytin shows the highest homology at the amino acid level to clytine from Clytia gregaria with an identity of 87% and to obelin from Obelia geniculata an identity of 77% (shown in Example 8; FIG. 8).
  • the homology of 87% - in relation to clytin - results at the C-terminal end of the protein, whereby multiple amino acid exchanges can be identified distributed over the entire protein.
  • the identity is below 30% (shown in Example 7; FIG. 7).
  • the BLAST method was used for sequence comparison (Altschul et al., 1997).
  • the photoprotein clytin-2 shows the highest homology at the amino acid level to clytin from Cyltia gregaria. However, the sequence has a number of deviations in the amino acid sequence, which are shown in Example 11 (FIG. 9). These deviations can lead to changed physicochemical, biochemical and bioluminescent properties.
  • the photoprotein clytin-2 has no signal peptide (as shown in Example 10).
  • the photoprotein mtClytin has a signal peptide that can lead to translocation of the photoprotein in mitochondria.
  • the signal peptide was identified by the computer program MITOPROT (Claros et al., 1996) (shown in Example 10).
  • the signal peptide determined by MITOPROT is given in SEQ _D NO: 3.
  • the mtClytin photoprotein is the first photoprotein to identify a natural signal peptide for translocation in mitochondria.
  • the invention also relates to functional equivalents of mtClytin.
  • Functional equivalents are those proteins which have comparable physicochemical properties and are at least 70% homologous to SEQ ID NO: 2. A homology of at least 80% or 90% is preferred. A homology of at least 95% is particularly preferred.
  • the invention also relates to the functional equivalents of the mtClytin signal peptide.
  • Functional equivalents are those proteins or peptides that have comparable physicochemical properties and are at least 70% homologous to SEQ ID NO: 3. A homology of at least 80% or 90% is preferred. A homology of at least 95% is particularly preferred.
  • the photoprotein mtClytin is suitable as a reporter gene for cellular systems especially for receptors, for ion channels, for transporters, for transcription factors or for inducible systems.
  • the signal peptide from mtClytin is also suitable as a fusion with reporter genes as a fused reporter gene for cellular systems, especially for repores, for ion channels, for transporters, for transcription factors or for inducible systems.
  • the photoprotein mtClytin is also suitable as a reporter gene through labeling, identification and characterization of cell organelles especially for mitochondria.
  • the signal peptide from mtClytin is also suitable for fusion with peptides or proteins for translocation in cell organelles, especially mitochondria.
  • MtClytin's photoprotein is also suitable as a reporter gene for determining parameters inside and outside cell organelles, especially mitochondria, especially calcium concentrations.
  • the signal peptide from mtClytin is also suitable as a fusion peptide as a reporter gene for determining • parameters inside and outside of cell organelles, especially mitochondria, especially calcium concentrations.
  • the photoprotein mtClytm is suitable as a reporter gene in bacterial and eukaryotic systems, especially in mammalian cells, in bacteria, in yeast, in Bakulo, in plants.
  • the photoprotein mtClytm is suitable as a reporter gene for cellular systems in combination with bioluminescent or chemiluminescent systems, especially systems with luciferases, with oxygenases, with phosphatases.
  • the signal peptide from mtClytin is also suitable as a fusion peptide as a reporter gene for cellular systems n ' combination with bioluminescent or chemiluminescent systems, especially systems with luciferases, with oxygenases, with phosphatases.
  • the photoprotein mtClytin is suitable as a fusion protein especially for receptors, for ion channels, for transporters, for transcription factors, for proteinases, for kinases, for phosphodiesterases, for hydrolases, for peptidases, for transferases, for membrane proteins and for glycoproteins.
  • the signal peptide from mtClytin is suitable as a fusion peptide as a fusion protein especially for receptors, for ion channels, for transporters, for transcription factors, for proteinases, for kinases, for phosphodiesterases, for hydrolases, for peptidases, for transferases, for membrane proteins and for glycoproteins.
  • the photoprotein mtClytin is particularly suitable for immobilization by antibodies, by biotin, by magnetic or magnetizable carriers.
  • the mtClytm photoprotein is suitable as a protein for energy transfer systems, especially FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) systems.
  • the photoprotein mtClytm is suitable as a label for substrates or ligands especially for proteases, for kinases, for transferases.
  • the photoprotein mtClytin is suitable for expression in bacterial systems especially for titer determination, as a substrate for biochemical systems especially for proteinases and kinases.
  • the photoprotein mtClytin is suitable as a marker specially linked to antibodies, linked to enzymes, linked to receptors, linked to ion channels and other proteins.
  • the signal peptide from mtClytm is also suitable as a fusion peptide as a marker specially linked to antibodies, linked to enzymes, linked to receptors, linked to ion channels and other proteins.
  • the photoprotein mtClytm is suitable as a reporter gene for pharmacological drug searches, especially in HTS (High Throughput Screening).
  • the signal peptide from mtClytin is also suitable as a reporter gene for pharmacological drug searches, especially in HTS (High Throughput Screening).
  • the mtClytm photoprotein is suitable as a component of detection systems especially for ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), for immunohistochemistry, for Western blot, for confocal microscopy.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the photo mtClytin is suitable as a marker for the analysis of interactions, especially for protein-protein interactions, for DNA-protein interactions, for DNA-RNA interactions, RNA-RNA Wech 'sel füren, for RNA-protein interactions ( DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid;).
  • the photoprotein mtClytin is suitable as a marker or fusion protein for expression in transgenic organisms, especially in mice, in rats, in hamsters and other mammals, in primates, in fish, in worms, in plants.
  • the signal peptide from mtClytm is also suitable as a fusion peptide as a marker or fusion protein • for expression in transgenic organisms, especially in mice, in rats, in hamsters and other mammals, in primates, in fish, in worms, in plants.
  • the photoprotein mtClytin is suitable as a marker or fusion protein for analyzing embryonic development.
  • the photoprotein mtClytin is suitable as a marker via a coupling agent, especially via biotin, via NHS (N-hydroxysulfosuccimide), via CN-Br.
  • the photoprotein mtClytin is suitable as a reporter coupled to nucleic acids, especially to DNA, to RNA.
  • the mtClytm photoprotein is suitable as a reporter coupled to proteins or peptides.
  • the mtClytin signal peptide is also suitable as a fusion peptide as a reporter coupled to proteins or peptides.
  • the photoprotein mtClytin is suitable as a reporter for measuring intra- or extracellular calcium concentrations.
  • the mtClytin photoprotein is suitable for characterizing signal cascades in cellular systems.
  • the mtClytm photoprotein coupled to nucleic acids or peptides is particularly suitable as a probe for Northern blots, for Southern blots, for Western blots, for ELISA, for nucleic acid sequencing, for protein analysis, chip analysis.
  • the photoprotein mtClytm is suitable for labeling pharmacological formulations, especially of infectious agents, of antibodies, of "small molecules".
  • the photoprotein mtClytin is suitable for geological investigations especially for ocean, groundwater and river currents.
  • the photoprotein mtClytm is suitable for expression in expression systems, especially in in vitro translation systems, in bacterial systems, in yeast systems, in Bakulo systems, in viral systems, in eukaryotic systems. •
  • the mtClytin signal peptide is also suitable as a fusion peptide for expression in expression systems, especially in in-vitro translation systems, in bacterial systems, in yeast systems, in Bakulo systems, in viral systems, in eukaryotic systems.
  • the photoprotein mtClytin is suitable for the visualization of tissues or cells during surgery, especially for invasive, non-invasive, and minimally invasive.
  • the photoprotein mtClytm is also suitable for marking tumor tissues and other phenotypically modified tissues, especially for histological examinations and surgical interventions.
  • the invention also relates to the purification of the photoprotein mtClytm, especially as a wild-type protein, as a fusion protein, as a mutagenized protein.
  • the invention also relates to the purification of the signal peptide from mtClytin, especially as a wild-type protein, as a fusion protein, as a mutagenized protein.
  • the invention also relates to the use of the photoprotein mtClytin in the field of cosmetics, especially bath additives, lotions, soaps, body colors, toothpaste, body powders.
  • the invention also relates to the use of the photoprotein mtClytin for coloring food, bath additives, ink, textiles and plastics.
  • the invention also relates to the use of the photoprotein mtClytin for coloring paper, especially greeting cards, paper products, wallpapers, handicrafts.
  • the invention also relates to the use of the photoprotein mtClytin for coloring liquids, especially for water pistols, for fountains, for drinks, for ice.
  • the invention also relates to the use of the photoprotein mtClytin for the production of toys, especially of finger paint, of make-up.
  • the invention relates to nucleic acid molecules that encode the polypeptide disclosed by SEQ ID NO: 2.
  • the invention relates to nucleic acid molecules that encode the polypeptide disclosed by SEQ ID NO: 3.
  • the invention relates to nucleic acid molecules which encode the polypeptide disclosed by SEQ ID NO: 6.
  • the invention relates to the polypeptide with the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 2.
  • the invention relates to the polypeptide with the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 3.
  • the invention relates to the polypeptide with the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 6.
  • the invention further relates to nucleic acid molecules selected from the group consisting of
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide which contains the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 2;
  • nucleic acid molecules whose complementary strand hybridizes with a nucleic acid molecule from a) or b) under stringent conditions and which encode a polypeptide which has the biological function of a photoprotein;
  • nucleic acid molecules which differ from those mentioned under c) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules which have a sequence homology of at least 95% to SEQ ID NO: 1 and whose protein product has the biological function of a • photoprotein;
  • nucleic acid molecules which have a sequence homology of at least 65% to SEQ ID NO: 1 and whose protein product has the biological function of a photoprotein.
  • the invention also relates to nucleic acid molecules which have a sequence homology of at least 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% or 60% to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 5 and for one Encode a polypeptide that has the properties of a photoprotein.
  • the invention also relates to nucleic acid molecules which have a sequence homology of at least 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65% or 60% to SEQ ID NO: 4 and code for a polypeptide which has the properties has a signal or leader peptide.
  • the invention relates to the above-mentioned nucleic acid molecules, in which the sequence contains a functional promoter 5 "to the sequence coding for the photoprotein or the sequence coding for the leader or signal sequence.
  • the invention also relates to nucleic acid molecules as described above, which are part of recombinant DNA or RNA vectors.
  • the invention relates to organisms which contain such a vector.
  • the invention relates to oligonucleotides with more than 10 consecutive nucleotides which are identical or complementary to the DNA or RNA sequence of the mtClytin molecules or the further molecules according to the invention.
  • the invention relates to photoproteins which are encoded by the nucleotide sequences described above.
  • the invention relates to methods for expressing the photoprotein polypeptides according to the invention in bacteria, eukaryotic cells or in in vitro expression systems.
  • the invention also relates to methods for purifying / isolating a photoprotein polypeptide according to the invention.
  • the invention relates to peptides with more than 5 consecutive amino acids which are recognized immunologically by antibodies against the photoproteins according to the invention.
  • the invention relates to the use of the invention, photoprotein-encoding nucleic acids as marker or reporter genes, in particular for the pharmacological active ingredient 'search and diagnostics.
  • the invention relates to the use of the photoproteins according to the invention or a nucleic acid according to the invention coding for a photoprotein as a marker or reporter or as a marker or reporter gene.
  • the invention relates to the use of the mtClytm photoprotein (SEQ ID NO: 2) and the use of a nucleic acid coding for the mtClytin photoprotein as a marker or reporter or as a marker or reporter gene, in particular for pharmacological active ingredient search and diagnosis.
  • the invention relates to the use of the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 1 as a marker or reporter gene, in particular for pharmacological search for active substances and diagnostics.
  • the invention relates to the use of the peptide shown in SEQ ID NO: 6 and the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 on which this is based as a marker or reporter gene, in particular for pharmacological active ingredient search and diagnostics.
  • the invention also relates to polyclonal or monocional antibodies which recognize a polypeptide according to the invention.
  • the invention also relates to monocional or polyclonal antibodies which recognize the photoprotein mtClytin (SEQ ID NO: 2) or the photoprotein Clytin-2 (SEQ ID NO: 6).
  • the invention also relates to monocional or polyclonal antibodies which recognize the signal peptide of the photoprotein mtClytm (SEQ ID NO: 3).
  • the invention further relates to a nucleic acid molecule selected from the group consisting of
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide which contains the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 3;
  • nucleic acid molecules which contain the sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • nucleic acid molecules whose complementary strand hybridizes with a nucleic acid molecule from a) or b) under stringent conditions and which encode a peptide which has the biological function of a signal or leader peptide;
  • nucleic acid molecules which differ from those mentioned under c) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules which show a sequence homology of at least 95% to SEQ ID NO: 4 and which encode a peptide which has the biological function of a signal or leader peptide;
  • Nucleic acid molecules which show a sequence homology of at least 65% to SEQ ID NO: 4 and which encode a peptide which has the biological function of a signal or leader peptide.
  • nucleic acid molecule selected from the group consisting of
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide which contains the amino acid sequence disclosed by SEQ ID NO: 6; b) nucleic acid molecules which contain the sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • Nuclear acid molecules the complementary strand of which hybridizes with a nucleic acid molecule from a) or b) under stringent conditions and which encode a polypeptide which has the biological function of a photoprotein;
  • nucleic acid molecules which differ from those mentioned under c) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules which show a sequence homology of at least 95% to SEQ ID NO: 5 and which encode a polypeptide which has the biological function of a photoprotein;
  • Nuclear acid molecules which show at least 80% sequence homology to SEQ ID NO: 5 and which encode a polypeptide which has the biological function of a photoprotein.
  • the invention also relates to a nucleic acid as described in the preceding paragraphs, which contains a functional promoter 5 'for the coding sequence.
  • the invention includes recombinant DNA or RNA vectors which contain the nucleic acids described above.
  • Organisms containing a vector as described above are also in accordance with the invention.
  • the invention also relates to oligonucleotides with more than 10 consecutive nucleotides which are identical or complementary to a partial sequence of a nucleic acid molecule as described above.
  • a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence as described above is also part of the invention.
  • According to the invention is also a method for the expression of the aforementioned polypeptides in bacteria, viral cells, yeast or eukaryotic cells or in in vitro expression systems.
  • a method for the purification / isolation of a polypeptide according to the invention is also part of the invention.
  • the invention are also peptides with more than 5 consecutive amino acids that are recognized immunologically by antibodies against the photoprotein mtClytin:
  • the invention also includes peptides with more than 5 consecutive amino acids which are recognized immunologically by antibodies against the photoprotein clytin-2.
  • Peptides with more than 5 consecutive are also part of the invention .
  • Amino acids immunologically by antibodies against the signal or SEQ DD NO: 3.
  • Leader peptide can be recognized.
  • peptides with more than 5 consecutive amino acids that are recognized immunologically by antibodies against the photoprotein by SEQ ID NO: 6 (clytin-2).
  • the invention relates to the use of a nucleic acid according to the invention as a marker or reporter gene.
  • the invention also relates to the use of a photoprotein according to the invention as a marker or reporter.
  • the invention relates to the use of a nucleic acid which has the sequence shown as SEQ ID NO: 4, or a sequence with 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% or 90%, preferably with 95% sequence identity to SEQ ID NO: 4, is included as a signal or leader sequence.
  • a peptide which is the sequence shown as SEQ ID NO: 3, or a sequence with 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% or 90% , preferably with 95% sequence identity to SEQ ID NO: 3, is part of the invention as a signal or leader peptide.
  • the cell organelles being mitochondria.
  • the cell organelles being the endoplasmic reticulum (ER).
  • the invention relates to the use of the nucleic acid sequence shown as SEQ ID NO: 4 as a signal or leader sequence.
  • SEQ ID NO: 3 which contains the sequence shown, as a signal or leader peptide is also part of the invention.
  • Also according to the invention is the use described in the two preceding paragraphs to transport a protein fused to the signal or leader peptide in cell organelles.
  • the cell organelles being mitochondria.
  • the cell organelles being the endoplasmic reticulum (ER).
  • polypeptides according to the invention as reporter proteins in the pharmacological search for active substances is also part of the invention.
  • the invention also relates to the use of the nucleic acids according to the invention as reporter genes in the pharmacological search for active substances.
  • Expression refers to the production of a molecule which, after the gene has been introduced into a suitable host cell, allows the transcription and translation of the foreign gene cloned into an expression vector.
  • Expression vectors contain the control signals required for the expression of genes in cells of prokaryotes or eukaryotes. ⁇
  • expression vectors can be constructed in two different ways.
  • transcription fusions the protein encoded by the cloned-in foreign gene is synthesized as an authentic, biologically active protein.
  • the expression vector carries all 5 ⁇ and 3 'control signals required for expression.
  • the protein encoded by the cloned-in foreign gene is expressed as a hybrid protein together with another protein that can be easily detected.
  • the 5 'and 3 ⁇ control signals required for expression including the start codon and possibly some of the sequences coding for the N-terminal regions of the hybrid protein to be formed, come from the vector.
  • the additional protein portion introduced not only stabilizes the protein encoded by the cloned foreign gene in many cases before it is broken down by cellular ones Proteases, but can also be used for the detection and isolation of the 'hybrid protein formed. Expression can be both transient and stable. Both bacteria, yeasts, viruses and eukaryotic systems are suitable as host organisms.
  • protein purification The isolation of proteins (even after overexpression) is often referred to as protein purification.
  • a variety of established methods and processes are available for protein purification.
  • Solid-liquid separation is a basic operation in protein isolation.
  • the process step is required both in the separation of the cells from the culture medium and in the clarification of the crude extract after cell disruption and removal of the cell debris, in the separation of precipitates after precipitation, etc. It is done by centrifugation and filtration.
  • the cell wall must be destroyed or made permeable by obtaining intracellular proteins.
  • high-pressure homogenizers or agitator ball or glass bead mills are used.
  • mechanical cell integrations and ultrasound treatment are used.
  • Extracellular proteins are obtained in relatively dilute solutions. Like extra-cellular proteins, they have to be concentrated before further use. In addition to the processes already mentioned, ultrafiltration has also proven itself - also on an industrial scale. Inorganic salts as accompanying substances in proteins are often undesirable for specific applications. They can be removed by gel filtration, dialysis and diafiltration, among others. ,
  • Numerous proteins are used as dry preparations. Vacuum, freeze and spray drying are important drying methods.
  • the mtClytm photoprotein is encoded by the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1):
  • the putative signal peptide of the photoprotein mtClytin has the following sequence (SEQ ID NO: 3):
  • the photoprotein clytin-2 is encoded by the following nucleotide sequence (SEQ ID NO: 5): 5 - -
  • Figure 1 shows the plasmid map of the vector pTriplEX2-mtClytin.
  • Figure 2 shows the plasmid map of the vector pcDNA3 -mtClytin.
  • Figure 3 shows the result of bacterial expression of mtClytin, and the bioluminescence activity of mtClytin after bacterial expression.
  • Y RLU: relative light units
  • X dilution
  • black bars mtClytin
  • gray bars control lysate
  • Figure 4 shows the result of the eukaryotic expression of mtClytin, and the bioluminescence activity of mtClytin after expression in CHO Cells.
  • Y RLU: relative light units
  • X ATP (logarithmic representation in mol / 1)).
  • Figure 7 shows the alignment of clytin and mtCyltin at the amino acid level.
  • Figure 8 shows the alignment of clytin and mtCyltin at the nucleic acid level.
  • Figure 9 shows the alignment of clytin, mtCyltin and Clytin-2 at the amino acid level.
  • the plasmid pTriplEx2 from Clontech was used as the vector for producing the construct shown below.
  • the derivative of the vector was named pTriplEx2-mtClytin.
  • the vector pTriplEx2-mtClytin was used for the expression of mtClytin in bacterial systems.
  • FIG. 1 shows the plasmid map of the vector pTriplEX2-mtClytin.
  • FIG. 2 shows the plasmid map of the vector pcDNA3 -mtClytm.
  • Bacterial expression was carried out in E. coli strain BL21 (DE3) by transforming the bacteria with the expression plasmids pTriplEX2-mtClytin and pTriplEX2.
  • the transformed bacteria were incubated in LB medium at 37 ° C. for 3 hours and expression was induced for 4 hours by adding IPTG to a final concentration of 1 mM.
  • the induced bacteria were harvested by centrifugation, resuspended in 50 mM Tris / HCl (pH 9.0) + 5 mM EDTA and disrupted by ultrasound. The lysate was then centrifuged for 15 minutes at 13000 revolutions per minute (16000 rcf) and the supernatant was removed.
  • the supernatant (dilutions 1: 5; 1:10; 1:20 and 1:50 with Tris / HCl pH 9.0)) was kept in the dark for 3 hours with coelenterazine (10E-07 M Coelenterazine in Tris / HCl pH 9 0) incubated. Immediately after the addition of 5 mM calcium chloride, the bioluminescence was measured in the luminometer. The integration time of the measurement was 40 seconds.
  • FIG. 3 shows the results of the bioluminescence measurement of mtClytin in bacteria.
  • the constitutive eukaryotic expression was carried out in CHO cells by transfection of the cells with the expression plasmids pcDNA3 -mtClytin and pcDNA3.1 (+) in transient experiments.
  • 10,000 cells per hole were plated in DMEM-F12 medium on 96-well microtiter plates and incubated at 37 ° C. overnight.
  • the transfection was carried out using the Fugene 6 kit (Röche) according to the manufacturer's instructions.
  • the transfected cells were incubated overnight at 37 ° C in DMEM-F12 medium.
  • the medium was then removed and replaced by 50 ⁇ l of coelenterazine (10E-07 M coelenterazine in PBS).
  • the cells were incubated for 3 hours at 37 ° C. and then ATP (adenosine triphosphate) was added to a final concentration of 1 ⁇ M.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the measurement was started immediately after the addition in the luminometer.
  • the integration time was 1 second with a total measurement time of 60 seconds.
  • FIG. 4 shows the results of the bioliiminescence measurement of mtClytm in CHO cells.
  • FIG. 7 shows the alignment of mtClytin with clytin (Clytia gregaria) at the nucleic acid level.
  • FIG. 8 shows the alignment of mtClytin with clytin (Clytia gregaria) at the amino acid level.
  • CHO cells were transiently transfected with pcDNA3-mtClytin or pcDNA-Obelin or pcDNA3 (without integrated cDNA). The transfection and measurement was carried out as described in Example 4. The measurement data were collected for a period of 60 seconds with an integration time of 1 second.
  • Figures 5 and 6 show the results of the kinetic analysis of mtClytin and Obelin.
  • the computer program MITOPROT was used to analyze the signal peptide of mtClytin (Claros et al., 1996). The following photoproteins were analyzed: Obelin (Q27709), Aequorin (P07164), Clytin (Q08121) and mtClytin (SEQ ID NO. 2).
  • Hmax_100 14,000 12,600 1,601 5,060
  • FIG. 9 shows the alignment of mtClytin, Clytin (Clytia gregaria) and Clytin-type2 at the amino acid level.
  • Green Fluorescent Protein Properties, Applications, and Protocols (Chalfie, M. and Kain, S., eds) pp. 45-70. Wiley-Liss, Inc. Yang Te-Tuan, Yale Parisa, Kitts Paul A. Kain Seven R., Quantification of gene expresssion with a secreted alkaline phosphatase reporter System. Biotechniques. 1997 23 (6) 11 lOff

Abstract

Die Erfindung betrifft das Photoprotein mtClytin, dessen Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung des Photoproteins mtClytin.

Description

Isoliertes Photoprotein mtClytin. sowie dessen Verwendung
Die Erfindung betrifft das Photoprotein mtClytin, dessen Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung des Photoproteins mtClytin.
Photoproteine
Als Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch Lebewesen. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). Derartig erzeugtes Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang abgestrahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z.B. fluoreszierende Proteine bei Leuchtquallen der Gattung Aequora) in längerwellige Spektralbereiche verschoben werden.
Die biologische Funktion ist vielfältig: In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagial) leuchten rund 90 % aller Lebewesen. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung, Täuschung und als Köder eingesetzt. Auch Glühwürmchen und Leuchtkäfer nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Die Bedeutung des Leuchtens von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar. Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen Einzel-Individuen einer großen Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt.
Eine Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent (Morin et al., 1974). Diese Organismen emittieren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria victoria (Shimomura et al., 1969) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht grünes Licht wie phänotypisch beobachtet bei Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen lässt (Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al., 1994). Als weitere Photoproteine konnten noch Clytih (Inouye et al, 1993), Mitrocomin (Fagan et al, 1993) und Obelin (Illarionov et al, 1995) identifiziert und beschrieben werden. Tabelle 1: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Name, der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc. No.) des Datenbankeintrages.
Figure imgf000003_0001
Tabelle 2: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl an. Patenten bzw. Anmeldungen.
Figure imgf000003_0002
Biolumineszenz wird heute in der Technik vielfältig genutzt, z.B. in Form von Bio-Indikatoren für Umweltverschmutzung oder in der Biochemie zürn empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation.
Die Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz von Photoproteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften verändert werden können. Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur beschrieben (US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986).
Die Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch die Oxidation von Coelenterazin (Haddock et al, 2001 ; Jones et al., 1999).
Reportersysteme
Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unter- scheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.
1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
2. Reportergene. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehören die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phbsphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.
Man unterscheidet Chemolumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion, die zu einem angeregten Molekül führt, das .selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion, beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.
Einordung der Spezies Clytia gregaria
Cnidaria→Leptomedusae→Campanulariidae→ Clytia gregaria
Die Spezies Clytia grenaria gehört zu den Cnidaria, speziell zu den Medusen. Der biolumineszente bzw. fiuoreszente Phänotyp wurde bereits 1998 beschrieben (Ward et al., 1998). Isolierung der cDNÄ
Zur Untersuchung der Biolumineszenz-Aktivität der Spezies Clytia gregaria wurden Exemplare im Weißen Meer (Biologische Station Kartesh, Russland) gefangen und in flüssigem Stickstoff gelagert. Zur Erstellung der cDNA-Bibliotheken von Clytia gregaria, wurde die poly(a)+ RNA mit Hilfe des „Straight A" Isolationsmethode von Novagen (USA) isoliert.
, Zur Herstellung der cDNA wurde eine RT-PCR durchgeführt. Hierzu wurden 1 μg RNA mit Reverser Transkriptase (Superscribt Gold U) nach folgendem Schema inkubiert:
PCR 1. 30 Sekunden 95°C 2. 6 Minuten 68°C 3. 10 Sekunden 95°C 4. 6 Minuten 68°C 17 Zyklen von Schritt 4 nach Schritt 3
Die Reaktionsprodukte wurden zur Inaktivierung der Polymerase für 30 Minuten bei 37°C mit Proteinase K inkubiert und die cDNA mit Ethanol präzipitiert. Die Expression-cDNA Bank wurde mit Hilfe des „SMART cDNA Library Construction Kits" der Firma Clontech (USA) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Klonierung erfolgte in den Expressionsvektor pTriplEx2 (Clontech; USA). Die Expressionsvektoren wurden durch Elektroporation in Bakterien des Stammes E. coli XLl-Blue transformiert.
Die Bakterien wurden auf LB-Nährböden plattiert und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde eine Replikaplattierung durchgeführt, indem die Bakterien mit Hilfe eines Nitrocellulosefϊlters auf eine weitere Nährbodenplatte übertragen wurden. Die Replikaplatte wurde wiederum für 24 Stunden bei 37°C inkubiert und die gewachsenen Bakterienkolonien in LB- Flüssigmedium übertragen. Nach der Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,1 mM) wurden die Bakterien für 4 Stunden bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet und die Bakterienmasse in 0,5 ml Aufschlusspuffer (5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL pH 9,0) bei 0°C resuspendiert. Anschließend erfolgte der Aufschluss der Bakterien ■ durch Ultraschall.
Die Lysate. wurden nach der Zugabe von Coelenterazine (Endkonzentration 10E-07 M) bei 4°C für 3 Stunden inkubiert. Anschließend erfolgte die Messung der Biolumineszenz nach der Zugabe von Calziumchlorid (Endkonzentration 20 mM) im Luminometer.
Es wurde ein Photoprotein identifiziert. Das Photoprotein wurde als mtClytin bezeichnet. Im Folgenden wird das Photoprotein mtClytin im einzelnen dargestellt. Das Photoprotein mtClytin zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene zu Clytin aus Clytia gregaria mit einer Identität von 87 % und zu Obelin aus Obelia geniculata eine Identität von 77 % (gezeigt in Beispiel 8; Figur 8). Die Homologie von 87 % - in Bezug auf Clytin - ergibt sich am C-terminalen Ende des Proteins, wobei verteilt über das gesamte Protein mehrfache Aminosäureaustausche zu identifizieren sind. Auf Nukleinsäureebene liegt die Identität unter 30 % (gezeigt in Beispiel 7; Figur 7). Zum Sequenzvergleich wurde das BLAST- Verfahren verwendet (Altschul et al., 1997).
Das Photoprotein Clytin-2 zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene zu Clytin aus Cyltia gregaria. Die Sequenz weist jedoch eine Reihe an Abweichungen in der Aminosäuresequenz auf, die im Beispiel 11 (Figur 9) dargestellt sind. Diese Abweichungen können zur veränderten physikochemischen, biochemischen und biolumineszenten Eigenschaften führen. Das Photoprotein Clytin-2 besitzt kein Signalpeptid (wie in Beispiel 10 gezeigt).
Das Photoprotein mtClytin besitzt ein Signalpeptid, das zur Translokation des Photoproteins in Mitochondrien führen kann. Die Identifizierung des Signalpeptides erfolgte durch das Computerprogramm MITOPROT (Claros et al., 1996) (gezeigt in Beispiel 10). Das durch MITOPROT ermittelte Signalpeptid ist in SEQ _D NO: 3 angegeben. Das Photoprotein mtClytin ist das erste Photoprotein, bei dem ein natürliches Signalpeptid zur Translokation in Mitochondrien identifiziert werden konnte.
Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente von mtClytin. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften haben und mindestens 70 % homolog sind zu SEQ ID NO: 2. Bevorzugt ist eine Homologie von mindestens 80 % oder 90 %. Besonders bevorzugt ist eine Homologie von mindestens 95 %.
Die Erfindung betrifft auch die funktionellen Äquivalente des Signalpeptides von mtClytin. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine oder Peptide, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften haben und mindestens 70 % homolog sind zu SEQ ID NO: 3. Bevorzugt ist eine Homologie von mindestens 80 % oder 90 %. Besonders bevorzugt ist eine Homologie von mindestens 95 %.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme. Das Signalpeptid von mtClytin eignet sich auch als Fusion mit Reportergenen als fusionierte Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeporen, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich auch als Reportergen durch Markierung, Identifizierung und Charakterisierung von Zellorganellen speziell für Mitochondrien.
Das Signalpeptid von mtClytin eignet sich auch zur Fusion mit Peptiden oder Proteinen zur Translokation in Zellorganellen speziell Mitochondrien.
Das Photoprotein von mtClytin eignet sich auch als Reportergen zur Bestimung von Parametern innerhalb und außerhalb von Zellorganellen, speziell von Mitochondrien, speziell von Kalzium- konzentrationen.
Das Signalpeptid von mtClytin eignet sich als Fusionspeptid auch als Reportergen zur Bestimmung • von Parametern innerhalb und außerhalb von Zellorganellen, speziell von Mitochondrien, speziell von Kalziumkonzentrationen.
Das Photoprotein mtClytm eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen.
Das Photoprotein mtClytm eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen, speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.
Das Signalpeptid von mtClytin eignet sich als Fusionspeptid auch als Reportergen für zelluläre Systeme n' Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen, speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Fusionsprotein speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine und für Glykoproteine.
Das Signalpeptid von mtClytin eignet sich als Fusionspeptid auch als Fusionsprotein speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine und für Glykoproteine.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger. Das Photoprotein mtClytm eignet sich als Protein für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen. Das Photoprotein mtClytm eignet sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrat für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.
Das Signalpeptid von mtClytm eignet sich als Fusionspeptid auch als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.
Das Photoprotein mtClytm eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).
Das Signalpeptid von mtClytin eignet auch als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoff suche speziell im HTS (High Throughput Screening).
Das Photoprotein mtClytm eignet sich als Komponente von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mikroskopie.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-RNA-Wech'selwirkungen, für RNA-Protein-Wechselwirkungen (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid; ). Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Marker oder Fusionsproteiii für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.
Das Signalpeptid von mtClytm eignet sich als Fusionspeptid auch als Marker oder Fusionsprotein • für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen. Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.
Das Photoprotein mtClytm eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.
Das Signalpeptid von mtClytin eignet sich als Fusionspeptid auch als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich als Reporter zur Messung von intra- oder extrazellulären Calziumkonzentrationen.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich zur Charakterisierung von Signalkaskaden in zellulären Systemen.
Das an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelte Photoprotein mtClytm eignet sich als Sonde speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nuklein- säuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.
Das Photoprotein mtClytm eignet sich zur Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".
Das Photoprotein mtClytin eignet sich für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.
Das Photoprotein mtClytm eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen - Systemen, in eukaryotischen Systemen. •
Das Signalpeptid von mtClytin eignet sich als Fusionspeptid auch zur Expression in Expressions- Systemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.
Das Photoprotein mtClytin eignet sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven. Das Photoprotein mtClytm eignet sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen Eingriffen.
Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Photoprotein mtClytm speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.
Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Signalpeptides von mtClytin speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein mtClytin auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein mtClytin zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein mtClytin zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein mtClytin zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein mtClytin zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke.
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 2 kodieren.
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 3 kodieren.
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 6 kodieren.
Die Erfindung betrifft das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 offenbart ist.
Die Erfindung betrifft das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 3 offenbart ist. Die Erfindung betrifft das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 6 offenbart ist.
Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 beinhaltet;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz enthalten;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist;
Eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen kann zum Beispiel in einer wässrigen Lösung, die 0,2 x SSC (lx Standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68°C durchgeführt werden (Sambrook et al., 1989).
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und deren Proteinprodukt die biologische Funktion eines • Photoproteins aufweist; und
f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 65 % zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und deren Proteinprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins - aufweist.
Die Erfindung betrifft auch NuHeinsäuremoleküle, die eine Sequenzhomologie von mindestens 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 % oder 60 % zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 5 aufweisen und für ein Polypeptid kodieren, welches die Eigenschaften eines Photoproteins besitzt.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle, die eine Sequenzhomologie von mindestens 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 % oder 60 % zu SEQ ID NO: 4 aufweisen und für ein Polypeptid kodieren, welches die Eigenschaften eines Signal- bzw. Leaderpeptides besitzt. Die Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen fui-ktionalen Promotor 5" zu der das Photoprotein kodierenden Sequenz bzw. der das Leader- oder Siganlsequenz kodierenden Sequenz enthält.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren sind.
Die Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten.
Die Erfindung bezieht sich auf Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zur DNA oder RNA Sequenz der mtClytin Moleküle oder der weiteren erfindungsgemäßen Molekülen sind.
Die Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotid- sequenzen kodiert sind.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptides.
Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Photoproteine erkannt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine kodierende Nukleinsäuren als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoff-' suche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine bzw. eine erfindungsgemäße, für ein Photoprotein kodierende Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung des Photoproteins mtClytm (SEQ ID NO: 2) bzw. die Verwendung einer für das Photoprotein mtClytin kodierenden Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker oder Reportergen insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik. Die Erfindung betrifft die Verwendung des in SEQ ID NO: 6 dargestellten Peptides und der hierzu zugrundeliegenden Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 5 als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale oder monokionale Antikörper, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid erkennen.
Die Erfindung betrifft auch monokionale oder polyklonale Antikörper, die das Photoprotein mtClytin (SEQ ID NO:2) bzw. das Photoprotein Clytin-2 (SEQ ID NO: 6) erkennen.
Die Erfindung betrifft auch monokionale oder polyklonale Antikörper, die das Signalpeptide des Photoprotein mtClytm (SEQ ID NO: 3) erkennen.
Des weiteren betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 3 beinhaltet;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Sequenz beinhaltet;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche ein Peptid kodieren, das die biologische Funktion eines Signal- oder Leaderpeptides aufweist;
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ ID NO: 4 zeigen, und welche ein Peptid kodieren, das die biologische Funktion eines Signaloder Leaderpeptides aufweist; und
f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 65 % zu SEQ ID NO: 4 zeigen, und welche ein Peptid kodieren, das die biologische Funktion eines Signal- oder Leaderpeptides aufweist.
Ebenfalls Bestandteil der Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 6 beinhaltet; b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Sequenz beinhaltet;
c) Nuklemsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist;
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ ID NO: 5 zeigen, und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist; und
f) . Nuklemsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 80 % zu SEQ ID NO: 5 zeigen, und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist..
Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure wie in den vorangehenden Absätzen beschrieben, welche einen funktionalen Promotor 5' zur kodierenden Sequenz enthält.
Die Erfindung beinhaltet rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren enthalten.
Organismen, die einen wie vorangehend beschriebenen Vektor enthalten, sind ebenfalls erfindungsgemäß.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zu einer Teilsequenz eines wie oben beschrieben Nukleinsäuremoleküls sind.
Ein Polypeptid, das durch eine wie oben beschriebene Nukleinsäuresequenz kodiert ist, ist ebenfalls Teil der Erfindung.
Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Expression der vorangehend genannten Polypeptide in Bakterien, viralen Zellen, Hefen oder eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides. Erfindungsgemäß sind ebenfalls Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen das Photoprotein mtClytin erkannt werden:
Bestandteil der Erfindung sind weiterhin Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen das Photoprotein Clytin-2 erkannt werden.
Ebenfalls Bestandteil der Erfindung sind Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden. Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen das durch SEQ DD NO: 3 offenbarte Signalbzw. Leaderpeptid erkannt werden.
Auch erfindungsgemäß sind Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen das Photoprotein offenbart durch SEQ ID NO:6 (Clytin-2) erkannt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Photoproteins als Marker oder Reporter.
Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, welche die als SEQ ID NO: 4 dargestellte Sequenz, bzw. eine Sequenz mit 60 %iger, 65 %iger, 70 %iger, 75 %iger, 80 %iger, 85 %iger oder 90 %iger, vorzugsweise mit 95 %iger Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4, beinhaltet, als Signal- bzw. Leadersequenz.
Auch ist die Verwendung eines Peptides, welches die als SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz, bzw. eine Sequenz mit 60 %iger, 65 %iger, 70 %iger, 75 %iger, 80 %iger, 85 %iger oder 90 %iger, vorzugsweise mit 95 %iger Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 3 beinhaltet, als Signal- bzw. Leaderpeptid Bestandteil der Erfindung.
Ebenfalls Erfindungsgemäß ist die in den zwei vorangehenden Absätzen beschriebene Verwendung, um an das Signal- bzw. Leaderpeptid fusionierte Proteine in Zellorganellen zu transportieren.
Bestandteil der Erfindung ist auch die im vorangehenden Absatz beschriebene Verwendung, wobei es sich bei den Zellorganellen um Mitochondrien handelt.
Bestandteil der Erfindung ist auch die im vorletzten Absatz beschriebene Verwendung, wobei es sich bei den Zellorganellen um das endoplasmatische Retikulum (ER) handelt. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der als SEQ ID NO: 4 dargestellten Nukleinsäuresequenz als Signal- bzw. Leadersequenz.
Auch ist die Verwendung des als SEQ ID NO: 3 dargestellten Peptides, welches die dargestellte Sequenz beinhaltet, als Signal- bzw. Leaderpeptid Bestandteil der Erfindung.
Ebenfalls Erfindungsgemäß ist die in den zwei vorangehenden Absätzen beschriebene Verwendung, um ein an das Signal- bzw. Leaderpeptid fusioniertes Protein in Zellorganellen zu transportieren.
Bestandteil der Erfindung ist auch die im vorangehenden Absatz beschriebene Verwendung, wobei es sich bei den Zellorganellen um Mitochondrien handelt.
Bestandteil der Erfindung ist auch die im vorletzten Absatz beschriebene Verwendung, wobei es sich bei den Zellorganellen um das endoplasmatische Retikulum (ER) handelt.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide als Reporterproteine in der pharmakologischen Wirkstoffsuche ist ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als Reportergene in der pharmakologischen Wirkstoffsuche.
Expression der erfindungsgemäßen Photoproteine
Als Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in einen Expressionsvektor Monierte Fremdgen erlaubt. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale. ■
Expressionsvektoren können prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei den sogenannten Transkriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression benötigten 5λ- und 3'- Kontrollsignale.
Bei den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. Die zur Expression benötigten 5'- und 3Λ- Kontrollsignale inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen vom Vektor. Der zusätzliche eingeführte Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen, sondern lässt sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des 'gebildeten Hybridproteins einsetzen. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen, Viren als auch eukaryotische Systeme.
Reinigung der erfindungsgemäßen Photoproteine
Die Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als Proteinreinigung bezeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung.
Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. Sowohl bei der Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei der Abtrennung von Niederschlägen nach Fällungen usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation und Filtration.
Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine muss die Zellwand zerstört bzw. durchlässig gemacht werden. Je nach Maßstab und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel- bzw. Glasperlenmühlen eingesetzt. Im Labormaßstab kommen u.a. mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung zum Einsatz.
Sowohl für extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln (Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung der löslichen Nukleinsäuren erstrebenswert (Fällung z.B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine werden häufig Träger (z.B. Stärke, Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.
Für die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur Verfügung (Absorptions- und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Elektrophoresen). Eine Säulenchromatographie wird auch im technischen Maßstab angewandt. Für den Labormaßstab ist vor allem die Affimtätschromatographie von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht.
Extrazelluläre Proteine fallen in relativ verdünnten Lösungen an. Sie müssen ebenso wie extra- zelluläre Proteine vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon erwähnten Verfahren hat sich - auch im industriellen Maßstab - die Ultrafiltration bewährt. Anorganische Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig unerwünscht. Sie können u.a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden. .
Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
Das Photoprotein mtClytm wird durch die folgende Nu leotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 1):
5 " - gacagataaaaaattcactccttagattatttagtgaataagagaaaaaaaggataagaaatcaag atgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatg cggctttacgtgcaagatcaagattgcaacgc acggcaaattttcacaccagcatactcttggctacagattcaaaatacgcggtcaaactcgatcct gattttgcaaatccaaaatggatcaacagacacaaatttatgttcaactttttggacataaacggt aaggggaaaatcacattagatgaaatcgtctccaaagcttcagacgacatttgtgctaaactggat gcaacaccagaacagaccaaacgtcaccaggatgctgttgaagcctttttcaagaaaatgggcatg gattatggtaaagaagttgcattcccagaatttattaagggatgggaagagttggccgaacacgac ttggaactctggtctcaaaacaaaagtacattgatccgtgaatggggagatgctgttttcgacatt ttcgacaaagacgcaagtggctcaatcagtttagacgaatggaaggcttacggacgaatctctgga atctgtccatcagacgaagacgctgagaagacgttcaaacattgtgatttggacaacagtggcaaa cttgatgttgatgagatgaccaggcaacatttaggcttctggtacacattggatccaacttctgat ggtctttatggcaattttgttccctaagaagcgttcagttaaaaacgctaaacattgttcagttgt aaaattatattcattttcatttcgtaaaattagtatttataaatttgtatcataaattgtatccat gttgtagactaaataagactcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa -3 " .
Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 2):
MQRFTNRLLSMSALRARSRLQRTANFHTS1LLATDSKYAVKLDPDFANPKW1NRHKFMFN FLDINGKGKITLDEIVSKASDDICAKLDATPEQTKRHQDAVEAFFKKMGMDYGKEVAFPE FIKGWEELAEHDLELWSQNKSTLIREWGDAVFDIFDKDASGSISLDEWKAYGRISGICPSDE DAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPTSDGLYGNFVP
Das putative Signalpeptide des Photoprotein mtClytin besitzt folgende Sequenz (SEQ ID NO: 3):
MQRFTNRLLSMSALRA
und weist folgende Nukleinsäuresequenz auf:
5'- atgcaaaggtttacaaatcgtcttctttccatgtcggctttacgtgca - 3' (SEQ ID NO 4)
Das Photoprotein Clytin-2 wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 5): 5 - -
GATCTCAGCTCAACTTGCAATAAGTATCAGATCAAATTTTGCAACTCAAAGCAAATCA TCAACTTCATCATAATGACTGACACTGCTTCAAAATACGCTGTCAAACTCAAGACCAA CTTTGAAGATCCAAAATGGGTCAACAGACACAAATTTATGTTCAACTTTTTGGACATT AACGGCAACGGAAAAATCACTTTGGATGAAATTGTCTCCAAAGCTTCGGATGACATTT GCGCCAAACTTGGAGCTACACCAGCTCAAACCCAACGTCATCAGGAAGCTGTTGAAGC TTTCTTCAAGAAGATTGGTTTGGATTATGGCAAAGAAGTCGAATTCCCAGCTTTCGTTA ACGGATGGAAAGAACTGGCCAAACATGACTTGAAACTTTGGTCCCAAAACAAGAAAT . CTTTGATCCGCAATTGGGGAGAAGCTGTATTCGACATTTTCGACAAGGACGGAAGTGG CTCAATCAGTTTGGACGAATGGAAAACATACGGAGGAATCTCTGGAATCTGTCCATCA GACGAAGACGCTGAAAAGACCTTCAAACATTGCGATTTGGACAACAGTGGCAAACTT GATGTTGACGAGATGACCAGACAACATTTGGGATTCTGGTACACCTTGGACCCTAACG CTGATGGTCTTTATGGCAACTTTGTCCCTTAAAAACTTTTTTTGCTGTAAATTCTTTACG GGTTATTTTTTCATAATTGTCATTTGATTTTAACTTTGTTTCGGAAAATGAAAAATATT CTTTATTCAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA -A
daraus ergibt sich eine Aminosauresequenz von (SEQ ID NO: 6):
MTDTASKYAVKXKTNFEDPKWVNRHKFMFNFLD1NGNGKITLDEIVSKASDDICAKLGAT PAQTQRHQEAVEAFFKKIGLDYGKEVEFPAFVNGWKELAKHDLKLWSQNKKSLIRNWGE AVFD1FDKDGSGSISLDEWKTYGGISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLG FWYTLDPNADGLYGNFVP
Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder.
Kurze Beschreibung der Figuren
•Figur 1 : Die Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTriplEX2-mtClytin.
Figur 2: Die Figur 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3 -mtClytin.
Figur 3: Die Figur 3 zeigt das Ergebnis der bakteriellen Expression von mtClytin, sowie die Biolumineszenzaktivität von mtClytin nach bakterieller Expression. (Y = RLU : relative light units; X = Verdünnung; schwarze Balken = mtClytin; graue Balken = Kontrolllysat).
Figur 4: Die Figur 4 zeigt das Ergebnis der eukaryotische Expression von mtClytin, sowie die Biolumineszenzaktivität von mtClytin nach Expression in CHO Zellen. (Y = RLU : relative light units; X = ATP (logarithmische Darstellung in mol/1)).
Figur 5: Die Fig. 5 zeigt die kinetische Analyse der Biolumineszenz von mtClytin. (Y = RLU : relative light units; X = Zeit [Sekunden]).
Figur 6: Die Fig. 6 zeigt die kinetische Analyse der Biolumineszenz von Obelin. (Y = RLU : relative light units; X = Zeit [Sekunden]).
Figur 7 : Die Figur 7 zeigt das Aligment von Clytin und mtCyltin auf Aminosäureebene.
Figur 8 : Die Figur 8 zeigt das Aligment von Clytin und mtCyltin auf Nuklein- säureebene.
Figur 9 : Die Figur 9 zeigt das Aligment von Clytin, mtCyltin und Clytin-2 auf ' Aminosäureebene.
Beispiele
Beispiel 1
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pTriplEx2 der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pTriplEx2-mtClytin bezeichnet. Der Vektor pTriplEx2-mtClytin wurde zur Expression von mtClytin in bakteriellen Systemen verwendet.
Die Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTriplEX2-mtClytin .
Beispiel 2
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes ' wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pcDNA3- mtClytin bezeichnet. Der Vektor pcDNA3 -mtClytin wurde zur Expression von mtClytin in eukaryotischen Systemen verwendet.
Die Figur 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3 -mtClytm .
Beispiel 3
Bakterielle Expression
Die bakterielle Expression erfolgte im E. coli Stamm BL21(DE3) durch Transformation der Bakterien mit den Expressionsplasmiden pTriplEX2-mtClytin und pTriplEX2. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die Expression für 4 Stunden durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris/HCl (pH 9,0) + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wurde anschließend für 15 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute (16000 rcf) zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Der Überstand (Verdünnungen 1:5; 1:10; 1:20 und 1:50 mit Tris/HCl pH 9,0)) wurde 3 Stunden mit Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in Tris/HCl pH 9 0) im dunkeln inkubiert. Direkt nach der- Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz im Luminometer gemessen. Die Integrationszeit der Messung betrug 40 Sekunden.
Die Figur 3 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung von mtClytin in Bakterien. Beispiel 4
Eukaryotische Expression
Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3 -mtClytin und pcDNA3.1(+) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiteφlatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Röche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM- F12 Medium inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt und durch 50 μl Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in PBS) ersetzt. Die Zellen wurden für 3 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend ATP (Adenosintriphosphat) bis zu einer Finalkonzentration von 1 μM zugegeben. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe im Luminometer gestartet. Die Integrationszeit betrug 1 Sekunde, bei einer Gesamtmessdauer von 60 Sekunden.
Die Figur 4 zeigt die Ergebnisse der Bioliimineszenzmessung von mtClytm in CHO Zellen.
Beispiel 5 BLAST
Ergebnis einer BLAST- Analyse von mtClytin auf der Aminosäureebene.
>emb | CAD87655.1 | unnamed protein product [Clytia gregaria], Length = 198, Score = 368 bits (945), Expect = e-101, Identities = 171/195 (87%)', Positives = 182/195 (92%) >sp|Q08121 | C YT_CLYGR Clytin precursor (Phialidin) , pir||S28860 clytin - hydromedusa (Clytia gregarium) , emb | CAA49754.1 | clytin [Clytia gregaria], gb|AAA28293.11 apoclytin, Length = 198, Score = 368 bits (945), Expect = e-101, Identities = 171/195 (87%), Positives = 182/195 (92%)
' >emb| CAD87658.1 | unnamed protein product [synthetic construct], Length = 198, Score = 367 bits (943), Expect = e-101, Identities = 170/195 (87%) , Positives = 182/195 (93%)
>sp|Q27709]θBL_OBELO Obelin precursor (OBL) , pdb|lEL4|A Chain A, Structure Of The Calcium-Regulated Photoprotein Obelin, Determined By Sulfur Sas, gb |AAA67708.11 unnamed protein product, Length = 195, Score = 327 bits (837)', Expect = le-88, Identities = 150/193 (77%) , Positives = 170/193 (87%)
>emb| CAD87674.1 | unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score .= 326 bits (835), Expect = 2e-88, Identities = 149/193 (77%), Positives = 170/193 (87%)
>emb| CAD87672.1 | unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score = 325 bits (834), Expect = 3e-88, Identities = 149/193 (77%), positives = 170/193 (87%)
>emb | CAD87673.11. unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score = 325 bits (833)., Expect = 4e-88, Identities = 149/193 (77%) , Positives = 170/193 (87%)
>pdb|lJFθ|A Chain A, The Crystal Structure Of Obelin From Obelia Geniculata At 1.82 A Resolution, gb|AAL86372.1 |AF394688_1 apoobelin [Obelia geniculata], Length = 195, Score = 325 bits (833), Expect = 4e-88, Identities = 149/193 (77%), Positives = 168/193 (86%)
Beispiel 6
BLAST
Ergebnis einer BLAST-Analyse von mtClytin aufNukleinsäureebene :
>emb|AX702125.l| Sequence 23 from Patent O03006497, Length = 597, Score = 669 bits (348), Expect = 0.0, Identities = 504/582 (86%)
>emb|AX702119.l| Sequence 17 from Patent WO03006497, Length = 597', Score = 669 bits (348), Expect = 0.0, Identities = 504/582 (86%)
>emb|X70221.l|CGCLYTIN C. gregaria mRNA for clytin, Length = 747, Score = 669 bits (348), Expect = 0.0, Identities = 504/582 (86%)
>gb |L13247.1 | CYIAPOCLYT Clytia gregarium apoclytin mRNA, complete cds, Length = 747, Score = 669 bits (348), Expect = 0.0, Identities = 504/582 (86%)
>emb|AX702187.l| Sequence 85 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86%) >emb|AX702185.l| Sequence 83 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits " (345) , Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86%)
>emb|AX702183. l| Sequence 81 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86%)
>emb|AX702181.l| Sequence 79 from Patent WO03006497', Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities =' 503/582 (86%)
>emb|AX702179.l| Sequence 77 from Patent WO03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86%)
>emb|AX702131.l| Sequence 29 from Patent O03006497, Length = 597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86%)
>emb|AX702129.l| Sequence 27 from Patent WO03006497, Length =.597, Score = 664 bits (345), Expect = 0.0, Identities = 503/582 (86%)
Beispiel 7
Die Figur 7 zeigt das Alignment von mtClytin mit Clytin (Clytia gregaria) auf Nukleinsäureebene.
Beispiel 8
Die Figur 8 zeigt das Alignment von mtClytin mit Clytin (Clytia gregaria) auf Aminosäureebene.
Beispiel 9
Kinetische Analyse von mtClytin
Zur kinetischen Analyse der Biolumineszenz von mtClytin, wurden CHO Zellen mit pcDNA3- mtClytin bzw. pcDNA-Obelin oder pcDNA3 (ohne integrierte cDNA) transient transfiziert. Die Transfektion und Messung erfolgte wie unter Beispiel 4 -beschrieben. Die Messdaten wurden für einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde erhoben.
Die Figuren 5 und 6 zeigen die Ergebnisse der kinetischen Analyse von mtClytin und Obelin. Beispiel 10
MITOPROT-Analyse
Zur Analyse des Signalpeptides von mtClytin wurde das Computerprogramm MITOPROT verwendet (Claros et al., 1996). Folgende Photoproteine wurden analysiert: Obelin (Q27709), Aequorin (P07164), Clytin (Q08121) und mtClytin (SEQ ID NO. 2).
Ergebnisse der Analysen:
Obelin:
Sequence name : OBELIN Input sequence length 195 aa
VALUES OF CO PUTED PARAMETERS Net Charge of query sequence : -11
Analysed region . : 11
Number of basic residues in targeting sequence . : 3 Number of acidic residues in targeting sequence : 0 Cleavagesite : not predictable Cleaved sequence :
HYDROPHOBIC SCALE USED GES KD GVH1 ECS
H17 -0.624 0.2-59 -0.308 0.295
MesoH -1.573 -0.241 -0.642 0.060
MuHd_075 . 14.019 3.641 4.408 1.523
MuHd_095 7.994 7.898 3.285 ' 1.838
MuHd_100 13.734 9.836 5.597 2.742
MuHd_105 21.195 11.755 7.339 4.117
Hmax_075 -9.450 -2.800 -4.008 ' 1.132
Hmax_095 -0.963 1.837 -1.971 1.103
Hmax_100 0.400 1.300 ,-1.942 2.240
Hmax_105 10.617 6.067 0.733 3.127
' PROBABILITY of export to mitochondria: 0.1479 Aequorin : Sequence name : AEQUORIN
Input sequence length : 196 aa
VALUES OF COMPUTED PARAMETERS Net Charge of query sequence Analysed region
Number of basic residues in targeting sequence Number of acidic residues in targeting sequence Cleavage site : not predictable Cleaved sequence
HYDROPHOBIC SCALE USED GES KD GVH1 ECS
H17 0.006 0.794 -0.263 0.368
MesoH -1.673 -0.382 - -0.703 0.048
MuHd_075 '24.326 4.153 5..947 2.450
MuHd_095 12.638 7.213 4.218 1.796
MuHd_100 13.748 8.827 4.477 2.427
MuHd_105 16.581 11.426 5.056 3.453
Hmax_075 0.438 0.233 -2.490 1.692
Hmax_095 0.525 -1.400 -2.394 0.674
Hmax_100 -0.100 -1.200 -2.292 1.550
Hmax_105 0.500 -0.000 -2.164 1.540
PROBABILITY of export to mitochondria: 0.0148 Clytin :
Sequence name : CLYTIN Input sequence length : 198 aa
VALUES OF COMPUTED PARAMETERS Net Charge of query sequence : -9
Analysed region : 32
Number of basic residues in targeting sequence : 6 Number of acidic residues in targeting sequence : 2 Cleavage site : not predictable Cleaved sequence : -
HYDROPHOBIC SCALE USED GES KD GVH1 ECS
H17 -0.429 0.341 -0.313 0.313
MesoH -1.778 -0.307 -0.718 0.053
MuHd_075 32.928 17.509 7.351 5.708
MuHd_095 30.874 20.344 9.074 5.834
MuHd_100 36.596 22.666 10.051 6.762
MuHd_105 '39.174 19.336 10.379 7.609
Hmax_075 4.900 7.087 -1.223 3.684
Hmax 095 13.600 10.100 1.251 4.390 -27-
Hmax_100 : 14.000 12.600 1.601 5.060
Hmax_105 : 6.650 13.067 -0.468 3.920
PROBABILITY of export to mitochondria: 0.2047 Clvtin-2 :
Sequence name: CLYTIN-2 Input sequence length : 198 aa
VALUES OF COMPUTED PARAMETERS Net Charge of query sequence ' : -7
Analysed region : ■ 16.
Number of basic residues in targeting sequence : 3 Number of acidic residues in targeting sequence : 1 Cleavage site : not predictable Cleaved sequence :
HYDROPHOBIC SCALE USED GES KD GVH1 ECS
H17 -0.288 0.341 -0.213 0.313
MesoH -1.519 -0.206 -0.681 0.081
MuHd_075 32.594 15.092 8.192 4.075
MuHd_095 ■ 36.090 19.707 8.836 6.716
MuHd_100 38.617 20.269 9.682 6.851
MuHd_105 30.267 16.082 8.229 5.470
Hmax_075 6.533 6.417 -0.793 2.508
Hmax_095 13.600 10.100 1.251 4.390
Hmax_100 13.600 10.100 1.251 4.390
Hmax_105 13.417 10.150- 1.612 3.862
PROBABILITY of export to mitochondria: 0.3974 mtClytin :
Sequence name: mtClytin Input sequence length : 228 aa
VALUES OF COMPUTED PARAMETERS Net Charge of query sequence : -8
Analysed region : 34 Number of basic residues in targeting sequence : 6 Number of acidic residues in targeting sequence : 0 Cleavage site : 17
Cleaved sequence : MQRFTNRLLSMSALRA
HYDROPHOBIC SCALE USED GES KD GVH1 ECS
H17 -0.135 0.453 -0.343 0.309
MesoH -1.623 -0.215 -0.701 0.073
MuHd_075 33.394 19.322 8.634 7.593
MuHd_095 34.726 19.634 8.110 .8.861
MuHd_100 32.825 16.596 7.376 7.520
MuHd_105 ' 28.005 19.893 ■ 7.410 • 7.865
Hmax_075 16.683 17.733 2.851 5.763
Hmax_095 13.125 13.388 2.299 4.314
Hmax_100 8.300 11.500 1.845 3.830
Hmax_105 1.700 9.500 -1.171 2.390
PROBABILITY of export to mitochondria: 0.9974
Die Wahrscheinlichkeit einer Translokation des analysierten Peptides in Mitochondrien steigt mit der Annäherung des berechneten Faktors an 1.
Die. Analyse der Proteinsequenzen von Obelin, Aequorin, Clytin, Clytin-2 und mtClytin hat ergeben, dass nur mtClytin die Merkmale eines Proteins aufweist, dass in Mitochondrien transportiert werden kann.
Beispiel 11
Die Figur 9 zeigt das Alignment von mtClytin, Clytin (Clytia gregaria) und Clytin-type2 auf Aminosäureebene.
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Claims

Patentansprflche
1. Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 beinhaltet; b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz beinhalten; c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist; d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden; e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist; und f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 65 % zu SEQ ID NO: 1 zeigen, und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische' Funktion eines Photoproteins aufweist.
2. Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die A inosäure- sequenz offenbart durch SEQ ID NO: 3 beinhaltet; b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Sequenz beinhalten; c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche ein Peptid kodieren, das die biologische Funktion eines Signal- oder Leaderpeptides aufweist; d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden; e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 90 % zu SEQ ID NO: 4 zeigen, und welche ein Peptid kodieren, das die biologische Funktion eines Signal- bzw. Leaderpeptides aufweist; und f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 60 % zu SEQ ID NO: 4 zeigen, und welche ein Peptid kodieren, das die biologische Funktion eines Signal- bzw. Leaderpeptides aufweist.
3. Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 6 beinhaltet; b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Sequenz beinhalten; c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist; d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden; e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ ID NO: 5 zeigen, und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist; und f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 80 % zu SEQ ID NO: 5 zeigen, und welche ein Polypeptid kodieren, das die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist.
4. Nukleinsäure nach Anspruch 1, 2 oder 3, welche einen funktionalen Promotor 5" zur kodierenden Sequenz enthält.
5. Rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche Nukleinsäuren nach Anspruch 4 enthalten.
6. Organismen, die einen Vektor gemäß Anspruch 5 enthalten.
7. Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die identisch oder komplementär zu einer Teilsequenz eines NuHeinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1, 2 oder 3 sind.
8. Polypeptid, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, 2 oder 3 kodiert ist.
9. Verfahren zur Expression der Polypeptide gemäß Anspruch 8 in Bakterien, viralen Systemen, Hefen oder eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
10. Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines Photoprotein Polypeptides gemäß Anspruch
11. Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen das Photoprotein mtClytin erkannt werden.
12. Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen das Photoprotein Clytin-2 erkannt werden.
13. Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen das durch SEQ ID NO: 3 offenbarte Signal- bzw. Leaderpeptid erkannt werden.
14. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 als Marker- oder Reportergen.
15. Verwendung eines Photoproteins gemäß Anspruch 8 als Marker oder Reporter.
16. Verwendung einer Nukleinsäure, welche die als SEQ ID NO: 4 dargestellte Sequenz beinhaltet, als Signal- bzw. Leadersequenz.
17. Verwendung eines Peptides, welches die als SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz beinhaltet, als Signal- bzw. Leaderpeptid.
18. Verwendung gemäß Anspruch 16 oder 17, um ein an das Signal- bzw. Leaderpeptid fusioniertes Protein in Zellorganellen zu transportieren.
19. Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei es sich bei den Zellorganellen um Mitochondrien oder das endoplasmatische Retikulum (ER) handelt.
20. Verwendung der Polypeptide gemäß Anspruch 8 als Reporterproteine in der pharmakologischen Wirkstoff suche.
1. Verwendung der Nukleinsäuren gemäß Ansprüchen 1-3 als Reportergene in der pharmakologischen Wirkstoffsuche.
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