Isoliertes Photoprotein Berovin, sowie dessen Verwendung
Die Erfindung betrifft das Photoprotein Berovin, dessen Nukleotid- und Arninosäuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung des Photoproteins Berovin.
Photoproteine Als Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch Lebewesen. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). Derartig erzeugtes Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang abgestrahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z.B. fluoreszierende Proteine bei .Leuchtquallen der Gattung Aequora) in längerwellige Spektralbereiche verschoben werden.
Die biologische Funktion ist vielfältig: In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagial) leuchten rund 90 % aller Lebewesen. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung, Täuschung und als Köder eingesetzt. Auch Glühwürmchen und Leuchtkäfer nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Die Bedeutung des Leuchtens von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar. Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen , Einzel-Individuen einer großen Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt.
Eine Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent (Morin et al., 1974). Diese Organismen
* emittieren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria victoria (Shimomura et al., 1969) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht grünes Licht wie phänotypisch beobachtet bei Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen lässt (Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al., 1994). Als weitere Photoproteine konnten noch Clytin (Inouye et al., 1993), Mitrocomin (Fagan et al., 1993) und Obelin (Illarionov et al., 1995) identi- fiziert und beschrieben werden.
Tabelle 1: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Name, der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc. No.) des Datenbankeintrages.
Tabelle 2: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl an Patenten bzw. Anmeldungen.
Biolumineszenz wird heute in der Technik vielfältig genutzt, z.B. in Form von Bio-Indikatoren für Umweltverschmutzung oder in der Biochemie zum empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation.
Die Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Arninosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften.
Es konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz von Photoproteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften verändert werden können. Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur beschrieben (US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986).
Die Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch die Oxidation von Coelenterazin (Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999).
Reportersysteme
Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.
1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
2. Reportergene. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehört die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).
Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.
Man unterscheidet Chemolumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.
Einordung der Spezies Beroe abyssicola
Eumetazoa → Ctenophora → Cyclocoela → Beroida → Beroe abyssicola
Die Spezies Beroe abyssicola gehört zu den Cnidaria, speziell zu den Medusen.
Isolierung der cDNA
Zur Untersuchung der Biolumineszenz-Aktivität der Spezies Beroe abyssicola wurden Exemplare im Weißen Meer (Biologische Station Kartesh, Russland) gefangen und in flüssigem Stickstoff gelagert. Zur Erstellung der cDNA-Bibliotheken von Beroe abyssicola, wurde die poly(a)+ RNA mit Hilfe der „Straight A" Isolationsmethode von Novagen (USA) isoliert.
Zur Herstellung der cDNA wurde eine RT-PCR durchgeführt. Hierzu wurden 1 μg RNA mit Reverser Transkriptase (Superscribt Gold LT) nach folgendem Schema inkubiert:
PCR 1. 30 Sekunden 95°C 2. 6 Minuten 68°C 3. 10 Sekunden 95°C 4. 6 Minuten 68°C 17 Zyklen von Schritt 4 nach Schritt 3
Die Reaktionsprodukte wurden zur Inaktivierung der Polymerase für 30 Minuten bei 37°C mit Proteinase K inkubiert und die cDNA mit Ethanol präzipitiert. Die Expression-cDNA Bank wurde mit Hilfe des „SMART cDNA Library Construction Kits" der Firma Clontech (USA) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Klonierung erfolgte in den Expressionsvektor pTriplEx2 (Clontech; USA). Die Expressionsvektoren wurden durch Elektroporation in Bakterien des Stammes E. coli XLl-Blue transformiert.
Die Bakterien wurden auf LB-Nährböden plattiert und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde eine Replikaplattierung durchgeführt, indem die Bakterien mit Hilfe eines Nitrocellulosefilters auf eine weitere Nährbodenplatte übertragen wurde. Die Replikaplatte wurde wiederum für 24 Stunden bei 37°C inkubiert und die gewachsenen Bakterienkolonien in LB- Flüssigmedium übertragen. Nach der Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,1 mM) wurden die Bakterien für 4 Stunden bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet und die Bakterienmasse in 0,5 ml Aufschlusspuffer (5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCL pH 9,0) bei 0°C resuspendiert. Anschließend erfolgte der Aufschluss der Bakterien durch Ultraschall.
Die Lysate wurden nach der Zugabe von Coelenterazine (Endkonzentration 10E-07 M) bei 4°C für 3 Stunden inkubiert. Anschließend erfolgte die Messung der Biolumineszenz nach der Zugabe von Calziurnchlorid (Endkonzentration 20 mM) im Luminometer.
Es wurde ein Photoprotein identifiziert. Das Photoprotein wurde als Berovin bezeichnet, hn Folgenden wird das Photoprotein Berovin im einzelnen dargestellt.
Berovin
Das Photoprotein Berovin zeigt die höchste Homologie auf A inosäureebene zu Obelin aus Obelia longissima mit einer Identität von 29 % (gezeigt in Beispiel 5). Auf Nukleinsäureebene liegt die Identität unter 30 % (gezeigt in Beispiel 6). Zum Sequenzvergleich wurde das BLAST- Verfahren verwendet (Altschul et al., 1997).
Die biolumineszenten Eigenschaften von Beroe species wurden schon zuvor phänomenologisch beschrieben (Ward et al., 1974; Ward et al. 1975).
Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente von Berovin. Funktionelle Äquivalente sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften haben und mindestens 70 % homolog sind zu SEQ LO NO: 2. Bevorzugt ist eine Homologie von mindestens 80 % oder 90 %. Besonders bevorzugt ist eine Homologie von mindestens 95 %.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Fusionsprotein speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, fürKinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine, für Glykoproteine.
Das Photoprotein Berovin eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Protein für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich zur Expression in bakteriellen Systemen speziell zur Titerbestirnmung, als Substrat für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Komponente von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Irnmunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mikroskopie.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Marker für die .Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechselwirkungen (DNA: desoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid; ).
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Marker oder Fusionsprotein für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.
Das Photoprotein Berovin eignet sich als Reporter zur Messung von intra- oder extrazellulären Calziumkonzentrationen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich zur Charakterisierung von Signalkaskaden in zellulären Systemen.
Das an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelte Photoprotein Berovin eignet sich als Sonde speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nuklein- säuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".
Das Photoprotein Berovin eignet sich für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.
Das Photoprotein Berovin eignet sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven.
Das Photoprotein Berovin eignet sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen Eingriffen.
Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Photoprotein Berovin speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Berovin auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahn- creme, von Körperpudern.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Berovin zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Berovin zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Berovin zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Berovin zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke.
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ JJD NO: 2 kodieren.
Die Erfindung betrifft das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ LD NO: 2 offenbart ist.
Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ LD NO: 2 umfasst;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die durch SEQ JJD NO: 1 dargestellte Sequenz enthalten;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen;
Eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen kann zum Beispiel in einer wässrigen Lösung, die 0,2 x SSC (lx Standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68°C durchgeführt werden (Sambrook et al., 1989).
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden;
e) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 95 % zu SEQ LD NO: 1 zeigen, und deren Proteinprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist; und
f) Nukleinsäuremolekülen, welche eine Sequenzhomologie von mindestens 65 % zu SEQ LD NO: 1 zeigen, und deren Proteinprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweist.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle, die eine Sequenzhomologie von mindestens 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 % oder 60 % zu SEQ JJD NO:l aufweisen und für ein Polypeptid kodieren, welches die Eigenschaften eines Photoproteins besitzt.
Die Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen funktionalen Promotor 5' zu der das Photoprotein kodierenden Sequenz enthält.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren sind.
Die Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten.
Die Erfindung bezieht sich auf Oligonukleotide mit mehr als 10 aufeinanderfolgenden Nukleo- tiden, die identisch oder komplementär zur DNA oder RNA Sequenz der Berovin Moleküle oder der weiteren erfindungsgemäßen Molekülen sind.
Die Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotid- sequenzen kodiert sind.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptides.
Die Erfindung bezieht sich auf Peptide mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die immunologisch durch Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Photoproteine erkannt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine kodierende Nukleinsäuren als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine bzw. eine erfindungsgemäße, für ein Photoprotein kodierende Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung des Photoproteins Berovin (SEQ ID NO: 2) bzw. die Verwendung einer für das Photoprotein Berovin kodierenden Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker oder Reportergen insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die Verwendung das in SEQ ID NO: 3 dargestellte Peptid und die hierzu zugrundeliegende Nukleinsäuresequenz SEQ JD NO: 1 als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid erkennen.
Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die das Photoprotein Berovin (SEQ JJD NO: 2) erkennen.
Expression der erfindungsgemäßen Photoproteine
Als Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transkription und Translation des in einen Expressionsvektor klonierte Fremdgen erlaubt. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.
Expressionsvektoren können prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei den sogenannten Transkriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression benötigten 5'- und 3"- Kontrollsignale.
Bei den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. Die zur Expression benötigten 5λ- und 3"- Kontrollsignale inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen vom Vektor. Der zusätzlich eingeführte Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen, sondern lässt sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des gebildeten Hybridproteins einsetzen. Die Expression kann sowohl transient als auch stabil erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen, Viren als auch eukaryotische Systeme.
Reinigung der erfindungsgemäßen Photoproteine
Die Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als Proteinreinigung bezeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung.
Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. .Sowohl bei der Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei der Abtrennung von Niederschlägen nach Fällungen usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation und Filtration.
Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine muss die Zellwand zerstört bzw. durchlässig gemacht werden. Je nach Maßstab und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel- bzw. Glasperlenmühlen eingesetzt. Im Labormaßstab kommen u.a. mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung zum Einsatz.
Sowohl für extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln (Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung der löslichen Nukleinsäuren erstrebenswert (Fällung z.B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). Bei der Gewinnung' extrazellulärer Proteine werden häufig Träger (z.B. Stärke, Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.
Für die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur Verfügung (Absorptions- und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Elektrophoresen). Eine Säulenchromatographie wird auch im technischen Maßstab angewandt. Für den Labormaßstab ist vor allem die Affinitätschromatographie von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht.
Extrazelluläre Proteine fallen in relativ verdünnten Lösungen an. Sie müssen ebenso wie extrazelluläre Proteine vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon erwähnten Verfahren hat sich - auch im industriellen Maßstab - die Ultrafiltration bewährt.
Anorganische Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig unerwünscht. Sie können u.a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden.
Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
Das Photoprotein Berovin wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ LD NO: 1):
GAGTTTTAAACTTTATACAACACTACTTTATAAAATCTAATTTGAGCCAATCAAAATG ACTGAACGTCTGAACGAGCAGAACAACGAGAGTTACCGCTACCTGAGAAGCGTGGGA AACCAGTGGCAGTTCAACGTAGAGGACCTCCACCCCAAGATGTTGTCCCGTCTCTACA AGAGATTCGATACTTTCGATCTAGACAGTGACGGTAAGATGGAGATGGACGAGGTCTT GTACTGGCCCGACAGGATGAGGCAGCTGGTAAACGCTACTGATGAGCAGGTTGAGAA GATGCGGGATGCTGTGAGAGTTTTCTTTTTGCACAAGGGAGTGGAGCCAGTAAACGGT CTCCTCAGAGAGGACTGGGTGGAAGCTAACAGAGTCTTCGCTGAGGCTGAGAGAGAA AGAGAGCGACGAGGAGAACCTTCTCTTATCGCACTTCTCTCCAACTCTTACTACGATG TACTGGATGATGACGGTGATGGTACTGTTGACGTCGATGAATTAAAGACCATGATGAA AGCATTTGATGTGCCCCAGGAAGCTGCCTACACCTTCTTCGAGAAGGCAGACACTGAC AAGAGTGGAAAGTTGGAGAGAACAGAACTAGTTCATCTCTTTAGAAAGTTTTGGATGG AGCCTTACGATCCACAGTGGGACGGAGTCTACGCTTATAAGTACTAATAAATTATCGG ATCCAGAACAAACGGCAAGAACTATTTTACACTCCACTTCAATTATAAACGATGATTT CATCGTTTCATGAAAACAAATTTTAGCATAAAACAATAAACATTTTCGACTACTAAAA TTACAGTCAACATAAAAATTTTAAAGTGTGTGATAAATTTTTCTGAATGTCTCCTAACT TCGATAATAATCTTCAAACTTTTAGTCAATATATGGAAATAAAAATATTTTGGTTTGAT GAGATGATAAAACTTTTGTTTTAAATTTTAGTTGGAGTAATTCATTGAATATGAAATG GACTTCGGACAATTACCCTGGCCTTCTGTATATTTAAAGCATGCTTTCCGTCAATAATT TGTTGTATCTATGTATTTATTTGTACATTAATTTAACCATATAGAATTATCTGTATAAT CCCTGTTATATTTATACACTGCATTACAAAA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 2):
MTERLNEQNNESYRYLRSVGNQWQFNVEDLHPKMLSRLYKRFDTFDLDSDGKMEMDEV LYWPDP RQLVNATDEQVEK VLRDAVRVFFLHKGVEPVNGLLREDWVEANRVFAEAER
ERERRGEPSLIALLSNSYYDVLDDDGDGTVDVDELKTMMKAFDVPQEAAYTFFEKADTD KSGKLERTELVΉLFRKFWMEPYDPQWDGVYAYKY
Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder.
Kurze Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Die Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTriplEX2-Berövin.
Figur 2: Die Figur 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3 -Berovin
Figur 3: Die Fig. 3 zeigt die Biolumineszenzaktivität von Berovin nach bakterieller Expression. (Y = RLU : relative light units; X = Verdünnung; schwarze Balken = Berovin; graue Balken = Kontrolllysat)
Figur 4: Die Fig. 4 zeigt die Biolumineszenzaktivität von Berovin nach Expression in CHO Zellen. (Y = RLU : relative light units; X = ATP (logarithmische Darstellung in mol/1))
Figur 5: Die Fig. 5 zeigt die kinetische Analyse der Biolumineszenz von Berovin. (Y = RLU : relative light units; X = Zeit [Sekunden]).
Figur 6: Die Fig. 6 zeigt die kinetische Analyse der Biolumineszenz von Obelin. (Y = RLU : relative light units; X = Zeit [Sekunden])
Figur 7 : Die Figur 7 zeigt das Alignment von Berovin und Obelin (Obelia longissima) auf Aminosäureebene
Beispiele
Beispiel 1
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pTriplEx2 der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pTriplEx2 -Berovin bezeichnet. Der Vektor pTriplEx2-Berovin wurde zur Expression von Berovin in bakteriellen Systemen verwendet.
Die Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTriplEX2-Berovin .
Beispiel 2
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pcDNA3- Berovin bezeichnet. Der Vektor pcDNA3 -Berovin wurde zur Expression von Berovin in eukaryotischen Systemen verwendet.
Die Figur 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-Berovin .
Beispiel 3
Bakterielle Expression
Die bakterielle Expression erfolgte im E. coli Stamm BL21(DE3) durch Transformation der Bakterien mit den Expressionsplasmiden pTriplEX2 -Berovin und pTriplEX2. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die Expression für 4 Stunden durch Zugabe von EPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris HCl (pH 9,0) + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wurde anschliessend für 15 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute (16000 rcf) zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Der Überstand (Verdünnungen 1:5; 1:10; 1:20 und 1:50 mit Tris/HCl pH 9,0)) wurde 3 Stunden mit Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazin in Tris/HCl pH 9,0) im dunkeln inkubiert. Direkt nach der Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz im Luminometer gemessen. Die Integrationszeit der Messung betrug 40 Sekunden.
Die Figur 3 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung von Berovin in Bakterien.
Beispiel 4
Eukaryotische Expression
Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-Berovin und pcDNA3.1(+) in transienten Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Röche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM- F12 Medium inkubiert. Anschhessend wurde das Medium entfernt und durch 50 μl Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazin in PBS) ersetzt. Die Zellen wurden für 3 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschhessend ATP (Adenosintriphosphat) bis zu einer Finalkonzentration von 1 μM zugegeben. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe im Luminometer gestartet. Die Integrationszeit betrug 1 Sekunde, bei einer Gesamtmessdauer von 60 Sekunden.
Die Figur 4 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung von Berovin in CHO Zellen.
Beispiel 5
Ergebnis einer BLAST- Analyse von Berovin auf der Aminosäureebene:
>pdb|UF2|A Chain A, Crystal Structure Of W92f Obelin Mutant FromObelia Longissima At 1.72 Angstrom Resolution, Length = 195, Score = 82.4 bits (202), Expect = 4e-15, Identities = 52/177 (29%), Positives = 88/177 (49%) , Gaps = 4/177 (2%)
>emb| CAD87675.1 | unnamed protein product [synthetic construct] , Length = 195, Score = 82.0 bits (201), Expect = 6e-15, Identities = 52/177 (29%) , Positives = 88/177 (49%) , Gaps = 4/177 (2%)
>emb| CAD87673.1 | unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score = 82.0 bits (201), Expect = 6e-15, Identities = 52/177 (29%) , Positives = 88/177 (49%) , Gaps = 4/177 (2%)
>emb| CAD87672.1 | unnamed protein product [synthetic construct], Length = 195, Score = 82.0 bits (201), Expect = 6e-15, Identities = 52/177 (29%) , Positives = 88/177 (49%) , Gaps = 4/177 (2%)
>emb | CAD87671.11 unnamed protein product [Obelia longissima], Length = 195, Score = 82.0 bits (201), Expect = 6e-15, Identities = 52/177 (29%) , Positives = 88/177 (49%) , Gaps = 4/177 (2%)
Beispiel 6
Ergebnis einer BLAST-Analyse von Berovin auf Nukleinsäureebene :
>emb|AL162584.9| Human DNA sequence from clone RP11-12A16 on chromosome 9, complete sequence, Length = 160178, Score = 50.7 bits (26), Expect = 7e-04, Identities = 28/29 (96%)
>gb|BC044324.l| Xenopus laevis, clone MGC: 52816 IMAGE : 724996, mRNA, complete cds , Length = 2718, Score = 44.9 bits (23), Expect = 0.040, Identities = 25/26 (96%)
>emb|AJ298151.1 |XLA298151 Xenopus laevis mRNA for beta-a yloid precursor protein B (app gene) , Length = 2740, Score = 44.9 bits (23) , Expect = 0.040
Identities = 25/26 (96%)
>emb|AL139825.14 | Human DNA sequence from clone RP11-467D7 on chromosome 20. Contains a novel gene, ESTs, STSs and GSSs, complete sequence, Length = 37526, Score = 44.9 bits (23), Expect = 0.040, Identities = 27/29 (93%)
>gb|U50135.l| Caenorhabditis elegans cosmid C52E12, complete sequence, Length = 40420, Score = 44.9 bits (23), Expect = 0.040, Identities = 25/26 (96%)
>gb|AC126802.4 | Mus musculus chromosome 5 clone RP24-543J12, complete sequence, Length = 321487615, Score = 43.0 bits (22), Expect = 0.15, Identities = 30/34 (88%)
Beispiel 7
Die Figur 7 zeigt das Alignment von Berovin mit Obelin (Obelia longissima) auf Aminosäureebene.
Beispiel 8
Kinetische Analyse von Berovin
Zur kinetischen Analyse der Biolumineszenz von Berovin, wurden CHO Zellen mit pcDNA3- Berovin bzw. pcDNA-Obelin oder pcDNA3 (ohne integrierte cDNA) transient transifiziert. Die Transfektion und Messung erfolgte wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Messdaten wurden für einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde erhoben.
Die Figuren 5 und 6 zeigen die Ergebnisse der kinetischen Analyse von Berovin und Obelin.
Literatur / Patente
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