WO2005034974A1

WO2005034974A1 - 血栓症の予防または改善のための健康食品及び血栓症の予防または治療用医薬組成物

Info

Publication number: WO2005034974A1
Application number: PCT/JP2004/014872
Authority: WO
Inventors: Hitomi Kumagai
Original assignee: Nihon University
Priority date: 2003-10-09
Filing date: 2004-10-07
Publication date: 2005-04-21
Also published as: JPWO2005034974A1; JP4877664B2

Abstract

　血栓症の予防または改善に有効な健康食品および血栓症の予防または治療用医薬組成物を提供する。シイタケの有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物、またはレンチオニン等のシイタケの活性成分を有効成分として含有する血栓症の予防または改善のための健康食品及びシイタケの有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物、またはレンチオニン等のシイタケの活性成分を有効成分として含有する血栓症の予防または治療用医薬品組成物。

Description

明細書

血栓症の予防または改善のための健康食品及び血栓症の予防または治療用医薬組成物

技術分野

[0001] 本発明は、血栓症の予防または改善のための健康食品及び血栓症の予防または治療用医薬組成物に関する。

背景技術

[0002] 近年、シィタケ（Lentinus edodes)の薬理作用が注目されており、例えば、特開 200 0-159683号には、シィタケの肝機能障害治療作用が開示されており、また特開 20 03— 155249号には、シィタケの IgA産生促進作用が開示されている。

特許文献 1：特開 2000-159683号

特許文献 2 :特開 2003— 155249号

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] し力しながら、これまでシィタケの薬理活性成分として注目されて、たのは、主に多糖類等の水溶性成分であり、シィタケの多糖類以外の薬理活性成分、例えば有機溶媒抽出成分または有機溶媒と水との混合物による抽出成分、特に精油成分の薬理作用については報告されていない。また、シィタケの成分の血小板凝集抑制作用にっ、ても報告されてヽな、。

本発明者らは、シィタケの成分のうち、有機溶媒抽出成分または有機溶媒と水との混合物による抽出成分、特に一定時間酵素反応を進行させた後に有機溶媒に抽出される成分が血小板凝集抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させた。該成分には、次式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VI： [0004] [化 3]

[0005] で表される化合物等が含まれる。本発明の発明者らは、これらの化合物のうち、特に上記式 Iで表される 1, 2, 3, 5, 6—ペンタチェパン（以下、レンチォニンと記す）が高い血小板凝集抑制作用を有することを見出した。

レンチォニンは、シィタケの香気成分として知られており、前駆物質であるレンチ- ン酸の γ—ダルタミル基が γ—ダルタミルトランスフェラーゼの作用により脱離してデスダルタミルレンチニン酸が生じ、これに C—Sリアーゼが作用することによりスルフェン酸またはチォスルフィネートが生じ、さらにチォスルフィネートの非酵素的開裂により生成する含ィォゥフラグメントが縮重合を繰り返すことにより生成する。なお、この時、レンチォニン以外に、上記式 II一 VIで表される含ィォゥ化合物も生成される。

従って、本発明はシィタケの有機溶媒抽出成分もしくは有機溶媒と水との混合物による抽出成分 (以下、場合により「本発明のシィタケの抽出物」または単に「シィタケの抽出物」と記す）、シィタケの有機溶媒可溶成分である上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び Ζまたは VIの化合物またはその誘導体 (以下、場合により「本発明のシィタケの活性成分」または単に「シィタケの活性成分」と記す)を含有する血栓症の予防または改善のための健康食品または血栓症の予防または治療用医薬組成物に関する。

課題を解決するための手段

[0006] 第 1に、本発明は、下記の健康食品に関する。

(1)シィタケの有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する血栓症の予防または改善のための健康食品。 (2)前記抽出物がシィタケの子実体の有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物である（1)記載の健康食品。

(3)前記抽出物がシィタケの子実体の有機溶媒による抽出物である（1)記載の健康

^ P

(4)前記抽出物が、シィタケ、好ましくはシィタケの子実体を破砕した後、 3— 70°Cの温度で 1分間以上放置した後に、抽出されたものである（1)一 (3)の、ずれかに記載の健康食品。

(5)次式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIで表される化合物またはその誘導体を有効成分として含有する血栓症の予防または改善のための健康食品。

[0007] [化 4]

[0008] (6)前記誘導体が、次式 VII、 VIII、 IX、 X、 XI及び Zまたは XIIで表される化合物である（5)記載の健康食品。

[0009] [化 5]

[0010] (式中、 R¹— R¹³は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、未置換または置換された炭素原子数 1一 20のアルキル基、未置換または置換された炭素原子数 1一 20のァルケ -ル基、未置換または置換された 1一 20のアルコキシ基、未置換または置換された炭素原子数 6から 20のァリール基、未置換または置換された炭素原子数 7から 20のアルキルァリール基を表す）

(7)前記誘導体が、上記式 VIIで表される化合物である（6)記載の健康食品。

(8)上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIで表される化合物を有効成分として含有する（5)記載の健康食品。

(9)上記式 Iで表される化合物を有効成分として含有する（5)記載の健康食品。

[0011] また、本発明は、下記の医薬組成物に関する。

(10)シィタケの有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する血栓症の予防または治療用医薬組成物。

(11)前記抽出物がシィタケの子実体の有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物である（ 10)記載の医薬組成物。

(12)前記抽出物がシィタケの子実体の有機溶媒による抽出物である（10)記載の医薬組成物。

(13)前記抽出物が、シィタケ、好ましくはシィタケの子実体を破砕した後、 3— 70°C の温度で 1分間以上放置した後に、抽出されたものである（10)—（12)のいずれかに記載の医薬組成物。

[0012] (14)上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIで表される化合物またはその誘導体を有効成分として含有する血栓症の予防または治療用医薬糸且成物。

(15)前記誘導体が、上記式 VII、 VIII、 IX、 X、 XI及び Zまたは ΧΠで表される化合物である（14)記載の医薬組成物。

(式中、 R¹— R¹³は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、未置換または置換された炭素原子数 1一 20のアルキル基、未置換または置換された炭素原子数 1一 20のァルケ -ル基、未置換または置換された 1一 20のアルコキシ基、未置換または置換された炭素原子数 6から 20のァリール基、未置換または置換された炭素原子数 7から 20のアルキルァリール基を表す）

(16)前記誘導体が、上記式 VIIで表される化合物である（15)記載の医薬組成物。

(17)上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIで表される化合物を有効成分として含有する（14)記載の医薬組成物。

(18)上記式 Iで表される化合物を有効成分として含有する（14)記載の医薬組成物。本発明は、また、下記に示す血栓症の予防または治療方法にも関する。

(19)シィタケの有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物を投与することを含む血栓症の予防または治療方法。

(20)上記式 Iで表される化合物を投与することを含む血栓症の予防または治療方法

(21)上記式 Iで表される化合物を他の抗血小板薬と共に投与することを含む血栓症の予防または治療方法。発明の効果

[0013]

本発明により、血栓症の予防または改善に有効な健康食品および血栓症の予防または治療用医薬組成物が提供される。本発明の健康食品及び医薬品組成物は、シクロォキシゲナーゼ阻害とは異なる作用機序で血小板凝集抑制効果を奏するものと考えられる。本発明のシィタケの活性成分、特にレンチォニンは、血小板内の情報伝達物質による血小板凝集カスケードには関与せず、血小板の接着や放出反応などの形態変化、もしくはそれに伴うタンパク質のリン酸ィ匕を抑制することにより血小板凝集を抑制すると考えられる。従って、他の抗血栓症剤と共に用いた場合に、異なる作用機序の効果により血栓症をより有効に予防または治療することができる。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]本発明のシィタケ抽出物の GC-MS分析の結果を示す図である。

[図 2]レンチォニンの血小板凝集抑制作用を示すグラフである。

[図 3]レンチォニンの血小板凝集抑制作用を示すグラフである。

[図 4]本発明のシィタケ抽出物の血小板凝集抑制作用を示すグラフである。

[図 5]本発明のシィタケ抽出物の血小板凝集抑制作用を示すグラフである。

[図 6]レンチォニンの血小板凝集抑制作用を示すグラフである。

[図 7]血小板凝集の作用機序を示す図である。

[図 8]レンチォニン、 1, 2—ジチェパン、 1, 2—ジチアンの血小板凝集抑制作用を示すグラフである。

[図 9]レンチォニン、 1, 2—ジチェパン、 1, 2—ジチアンの血小板凝集抑制作用を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0015] 本発明の健康食品または医薬品組成物において、原料となるシィタケは生のシイタケでも乾燥したシィタケでも良い。乾燥シィタケは、例えば天日乾燥または乾燥炉等による機械乾燥により製造されたものである。またシィタケは子実体及び菌糸体のいずれを用いてもよいが、好ましくは子実体を用いる。

抽出溶媒は、有機溶媒または有機溶媒と水との混合物、好ましくは有機溶媒である。有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、 n—もしくはイソプロパノール、 n—、イソ、第二もしくは第三ブタノール、 n—、イソ、第二もしくは第三ペンタノール、 n—、ィソ、第二もしくは第三へキサノール等のアルコール類、アセトン、メチルェチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸ェチル、酢酸プロピル等のエステル類、クロ口ホルム、塩化メチレン等のハロゲンィ匕炭化水素、ジェチルエーテル等のエーテル類、へキサン、ペンタン等の脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素またはこれらの混合物が挙げられ、好ましくはジェチルエーテルである力これらに限定されない。

抽出温度は、好ましくは 70°C以下、より好ましくは 40°C以下、例えば 5— 30°Cである。（70°Cより高い温度で長時間加熱すると、抽出すべき成分が分解する場合があるからである。）

抽出方法は、有機溶媒または水と有機溶媒との混合物中での冷浸、温浸、還流冷却下での加熱等であり得る。抽出は、連続式で行ってもバッチ式で行ってもよぐ例えば常温から溶媒の沸点の範囲の温度で、加圧、常圧または減圧下で行う。抽出時間は、抽出方法、抽出溶媒等に応じて、適宜決定し得る。例えば、 5— 30°Cでの抽出の場合、 1分間一 24時間、好ましくは 15分間一 30分間である。

抽出に先立って、シィタケの破砕、恒温処理等の前処理を行うのが好ましい。これは、シィタケに含まれるレンチニン酸から出発してレンチォニン等の含ィォゥ化合物を生成する酵素反応を効率良く進行させるためである。

破砕は、例えば pH3— 12の緩衝液中、ホモジネーター等の機器を用いて破砕すること〖こより行われる。

恒温処理は、例えば約 3— 70°C、好ましくは 15— 50°C、より好ましくは 25— 40°C の温度に、 1分間一 24時間、好ましくは 10分間一 12時間、より好ましくは 30分間一 3時間維持することにより行われる。

本発明の健康食品または医薬組成物に使用される抽出物は、有機溶媒による抽出操作後、濾過、乾燥、分画などの処理を行うことによりさらに精製されたものであってもよい。濾過、乾燥、分画は当業者に周知の常法により行うことができる。

また、本発明の健康食品または医薬品組成物に使用される抽出物は、抽出、所望により精製した後、濃縮または乾固、または凍結乾燥し、所望によりさらに滅菌操作を行ったものであってもよい。濃縮または乾固は、常圧または減圧下、好ましくは 150 °C以下、より好ましくは 30°C以下の温度で行う。 150°Cを超えると抽出すべき成分が分解する場合があるからである。

ただし、本発明の健康食品及び医薬品組成物は、上記の抽出'精製方法により得られた抽出物を含有するものに限定されず、レンチォニンを初めとするシィタケの精油成分を含むものであればょ、。

[0017] 本発明の健康食品または医薬品組成物は、上記式 I一 VIで表される化合物を有効成分として含有するものであってもよい。これらの化合物は、抽出物中の成分として含有されて、てもよく、また合成により得られたィ匕合物であってもよ、。

上記式 Iで表される化合物（レンチォニン）は、例えば Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1: Organic and Bio- Organic Cemistry (1972-1999), (3), 509-514; 1990に記載の方法により合成することができる。

該方法は、ジョードメタンと二硫ィ匕ニナトリウム Na Sを水：ジクロロメタンの二層混

2 2

合物中、室温で反応させることからなる。

具体的には、下記の方法により合成される。水（100cm³)中の二硫化ニナトリウム（ 2. 8g、 25. 5mmol)の溶液を、メチレンクロライド（100cm³)中のジョードメタン（6. 81g, 25. 5mmol)の溶液に添加する。二層混合物を室温で 5日間激しく撹拌する。淡黄色の水層が無色になる。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥する。クロマトグラフィにかけると、まず二ヨウ化メタンが溶出され、次に、 1,2,3,5,6-ペンタチェパン（融点 61°C)が約 18%の収率で得られる。

[0018] また、レンチォ-ンは、例えば Tetrahedron Vol.41, No.22, pp.5145 - 5158に記載の方法により製造することができる。

該方法は、金属ハロゲンィ匕物と金属テトラチォペルカーボネートを反応させることからなる。

具体的には、下記の方法により合成される。

エタノール 40ml中のナトリウムテトラチォペルカーボネート（0. lOmol)をエーテルで処理して結晶形の塩を沈殿させた。エタノール 100ml中のヨウ化メチレンを 27. 3g (0. lOmol)を攪拌しながら添加し、全ての沈殿が溶解したら、水 750mlを添加する。エーテル層を分離し、水で 3回洗浄し、塩ィ匕カルシウムで乾燥し、溶媒を留去すると、黄色油状物質 13. 7gが得られる。シリカゲルのカラムクロマトグラフィーで精製し、さらに得られた粗生成物をアセトンに溶解し、—25°Cで沈殿させることにより、レンチォニン (融点 58— 61°C)が 25%の収率で得られる。 [0019] 上記式 IIで表される化合物は、例えば Phosphorus and Sulfor and the Related Elements, 15(1), 27-32; 1983, Phosphorus and Sulfur and the Related Elements, 8(2), 157-9; 1980等に記載の方法により合成することができる。

また、本発明の健康食品または医薬品組成物は、上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び/または VIで表される化合物の誘導体を有効成分として含有するものであってもよ、。そのような誘導体は、例えば上記式 VII、 VIII、 IX、 X、 XI及び Zまたは ΧΠで表される化合物である。

これは上記で単離精製された、または上記で合成された上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIの化合物に、常法により置換基を導入することにより、製造しうる。本発明のシィタケの抽出物またはシィタケの活性成分は、高活性及び低毒性なので医療に安全に用いることができる。

[0020] (健康食品）

本発明の「健康食品」は、上記本発明のシィタケの抽出物またはシィタケの活性成分を有効成分とするエキス剤 (軟エキス剤、乾燥エキス剤)、カプセル剤、顆粒剤、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤等の形態であってもよい。これらは当該分野で知られている方法により製剤化することができる。これらの製剤の形態の健康食品は、下記で医薬組成物について列挙した補助剤を含有することができる。本発明のシィタケの抽出物またはシィタケの活性成分の配合量は、剤形により異なる。また、一日あたりの有効成分服用量は、有機溶媒抽出成分の凍結乾燥重量として、例えば 1一 15g、好ましくは 2— 5g、化合物もしくはその誘導体の場合、例えば 0. 1- 1. 5g、好ましくは 0. 2-0. 5gとなる量である。

[0021] また、本発明の健康食品は、一般加工食品等の食品に、本発明のシィタケの活性成分を添加した食品、いわゆる機能性食品であってもよい。そのような食品としては、例えば、上記本発明の活性成分を添加した飴、ガム、ゼリー、ビスケット、クッキー、煎餅、パン、麵、魚肉，畜肉練製品、茶、清涼飲料、コーヒー飲料、乳飲料、乳清飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン等が挙げられる。さらに、本発明の健康食品は、前記シィタケ及び所望によりその他の材料を飲用アルコールに漬けた健康酒をも含む。そのような機能性食品である場合は、各々の食品原料に上記本発明のシィタケの抽出物またはシィタケの活性成分の所要量を添加すること以外は、その加工食品の通常の製造方法により製造することができる。この場合、本発明のシィタケの抽出物またはシィタケの活性成分の配合量は、添加する食品により異なるが、例えばシイタケの有機溶媒抽出成分の凍結乾燥重量として、例えば 0. 001— 10重量％、好ましくは 0. 1— 1重量％である。また、化合物もしくはその誘導体として配合する場合は、例えば 0. 0001— 10重量％、好ましくは 0. 01-0. 1重量％である。

[0022] (医薬組成物）

本発明の「医薬組成物」は、有効成分として、上記本発明のシィタケの活性成分を含む。剤形は特に限定されないが、例えばエキス剤（軟エキス剤、乾燥エキス剤）、力プセル剤、顆粒剤、溶液、乳濁液、懸濁液、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤、点眼剤、点鼻液、軟膏、クリーム、ローション剤、注射剤、座薬等であり得る。本発明の医薬組成物へのシィタケの抽出物またはその活性成分の配合量は剤形により異なる。また、一日あたりの有効成分投与量は、有機溶媒抽出成分の凍結乾燥重量として、例えば 1一 15g、好ましくは 2— 5gである。また、化合物もしくはその誘導体として配合する場合は、例えば 0. 1-1. 5g、好ましくは 0. 2— 0. 5gである。

[0023] これらの製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、希釈剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化される。

本発明のシィタケの活性成分を含有する医薬用組成物は、通常、常法に従って調製され、目的に適する形態で製剤化される。医薬品組成物は、本発明のシィタケの活性成分と、医薬の製剤技術分野で使用し得るとして知られている補助剤を含有し得る。

[0024] 固形の製剤は、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、糖衣錠等であり、有効成分としての本発明の化合物と、希釈剤（例えば乳糖、デキストロース、ショ糖、セルロース、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉等）、滑沢剤（例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール等）、結合剤（例えば澱粉類、アラビアゴム、ゼラチン、メチノレセノレロース、カノレボキシメチルセルロース、ポリビュルピロリドン等）、離散剤（例えば澱粉、アルギン酸、アルギン酸塩等）、飽和剤、着色料、甘味料、湿潤剤（例えばレシチン、ポリソルベート、硫酸ラウリル塩等)等を含有することができる。これらは、既知の方法例えば混合、粒状ィ匕、錠剤化、糖衣ィ匕等の方法により製剤化することができる。

[0025] 液状の製剤は、例えばシロップ、溶液、乳濁液及び懸濁液の形態とすることができる。

懸濁液及び乳濁液は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ぺクチン、メチノレセノレロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール等を含有することができる。

筋肉内注射用懸濁液又は溶液は、薬理学的に許容され得る担体として、例えば滅菌水、ォリーブ油、ォレイン酸ェチル、グリコール類、例えばプロピレングリコール、及び必要に応じて適量のリドカイン塩酸塩を含有することができる。静脈注射もしくは注入用溶液は、担体として例えば滅菌水を含有することができる力好ましくは滅菌等張食塩水溶液の形である。

本発明の健康食品及び医薬組成物は、血小板凝集に起因する疾病、例えば脳梗塞'心筋梗塞の予防、改善または治療に使用されるものである。

なお、本発明は、上記で説明した本発明のシィタケの抽出成分またはシィタケの活性成分を、所望により他の抗血小板薬と共に投与することを含む血栓症の予防または治療方法にも関する。

他の抗血小板薬の例としては、塩酸チクロビジン、シロスタゾール、ィコサペント酸ェチル、ベラプロストナトリウム、塩酸サルポダレラート、アスピリン 'ダイアルミネート配合剤、アスピリン等が挙げられ、上記本発明の医薬組成物をこれらの抗血小板薬の一種類または二種類以上と組み合わせて投与することができる。

実施例

[0026] 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。し力しながら、これらは本発明を限定するものではない。

実施例 1：シィタケ抽出液の調製生シィタケの子実体 300gに 500mlの 0. 2MTris— HC1緩衝液（pH3. 0、 5. 0、 7 . 0または 9. 0)を添加し、ホモジナイザー（マツバラ製)で 3分間ホモジナイズした。その後、 37°Cで 30分間インキュベートした。

これに、セライト 50gを添カ卩し、濾過した。濾液と残渣を各 150mlのメチレンクロライドで 5回抽出し、合わせた抽出液を硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーを通すことにより脂質を除去した。

得られた油状物質を GC- MSで分析した。 pH3. 0、 5. 0、 7. 0及び 9. 0でインキュペートした場合に得られる成分を各々下記の表 1に示す。

[0027] [表 1]

ND:検出されなかった

[0028] 実施例 2 :シィタケ抽出液の調製

生シィタケの子実体 300gに 500mlの 0. 2MTris— HC1緩衝液（pH7. 0)を添カロし、ホモジナイザー（マツバラ製)で 3分間ホモジナイズした。その後、 37°Cで 30分間ィンキュペートした。

これに、セライト 50gを添加し、濾過した。濾液を L N蒸留装置（田中理化硝子製作所製)を用い、常圧下、 100°Cで蒸留した。得られた留分に、メチレンクロライド 80 mlを添加した。有機相を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過し、濾液を濃縮した。 [0029] 実施例 3 :シィタケ抽出液の調製

37°Cで 30分間のインキュベートを行わないこと以外は、実施例 2と同様の方法によりシィタケ抽出液を調製した。

[0030] [表 2]

ND :検出されなかった

[0031] 実施例 4：シイタケ抽出液の調製

乾燥シィタケの子実体 50gを、 900mlの 0. 2MTris— HC1緩衝液（pH9. 0)中に、 4°Cで 30分間浸漬した後、ホモジナイザー（マツバラ製)で 3分間ホモジナイズし、その後、 37°Cで 3時間インキュベートした。

得られた油状物質を GC-MSで分析した。チャートを図 1に示す。得られた成分を上記の表 1に示す。

[0032] 試験例

以下の試験例にお!、て下記の試薬及び器具を用いた。

Dulbecco' sPBS (-)溶液：日水製薬株式会社製の Dulbecco' sPBS (― ) 9. 6gを蒸留水に溶解して全量を 1000mlとなるように溶解したものを使用した。器具：測定に用いたガラス製品 (キュベット等)及び金属製器具 (ステアリングロッド等）は、血小板異物接触刺激によって起こる吸着、凝固を防止するために、全てシリコン（SIGMACOTE、シグマアルドリッチジャパン製）によりシリコンコーティング処理を施したものを使用した。

[0033] 試験例 1：レンチォニンのァラキドン酸による血小板凝集に対する抑制作用

レンチォニン (小川香料株式会社製)を、酸ィ匕防止剤として Lーァスコルビン酸パルミテートを 50ppm含むエタノーノレに溶解し、終濃度力 S各々 3. 16 X 10—⁴、 1. 0 X 10— 3. 16 X 10—⁵、 1. 0 X 10—⁵、 3. 16 X 10— ⁶、 1. 0 X 10— ⁶、 3. 16 X 10— ⁷、 1. 0 X 10 一⁷となるように希釈することにより、レンチォニン希釈液を調製した。

ァラキドン酸（シグマアルドリッチジャパン製） lOOmgを 2. 76mlの 0. 5Nの NaOH に溶解し、エツペンドルフチューブに 50 μ 1ずつ分注し、窒素ガスを添加後、—80°C で冷凍保存し、使用時に PBS緩衝液中で PRP中の濃度が 1. 5mMとなるように希釈したものを、凝集惹起物質溶液として使用した。

[0034] 2週間以上服薬していない健康な成人（21— 23才)より、真空採血管を用いて血液 9容量部に対し、 3. 8%クェン酸ナトリウム 1容量部となるように採血した。

得られたタエン酸ィ匕血液を 1500rpmで 10分間遠心分離を行、、上層を多血小板血漿（platelet rich plasma,以下、 PRPと記す）として用いた。下層をさらに 3000rpm で 15分間遠心分離し、その上層を乏血小板血漿 (platelet poor plasma,以下 PPPと記す）として用いた。

キュベットに上記で調製した PPPを 300 1、他のキュベットに上記で調製した PRP 300 1を分注した。これを aggregometer (NKK HEMA TRACER 1 MODE L PAT-4A, SSR ENGINEERING社）にセットし、 lOOOrpmでスターラーを回転させて 37°Cでインキュベートした。

[0035] 透過度は、記録計 (CHROMATOPAC C— R4A、島津製作所製）により記録した。まず、 PPPを入れたキュベットをセットして記録計の透過度を 40000に合わせ、次に PRPを入れたキュベットをセットして記録計の透過度を 0に合わせることにより、 S PAN調整を行つた。この SPAN調整は測定のたびに行つた。

次に、上記の PRPを入れたキュベットをセットし、記録計を始動させた後、上記で調製した各濃度のレンチォニン希釈液 2 1を添加し、 3分後に上記で調製した凝集惹起物質溶液を 18 μ 1添加して凝集曲線の変化を 10分間記録した。

対照として、レンチォニン希釈液の代わりに希釈溶媒のみを添加して、上記と同様の方法により PRPの透過度を測定した。

[0036] 血小板凝集抑制率は、下記のように求めた。

血小板凝集に伴う PRPの透過率 (Τ%)の変化を血小板の凝集率 (Agg%)の変化とみなし、その最大値を最大凝集率 (Agg. max%)とした。試料を添加しない PRPおよび試料を添加した PRPにつ、て求めた最大凝集率 (それぞれ T、 T'とする）を求め

、この値力下記式により抑制率を計算した。

[0037] 抑制率（％) = (l-T' /T) X 100

[0038] 結果を図 2のグラフに示す。グラフ中、試料の濃度は横軸に、該濃度における抑制率は縦軸に示されている。このグラフから、凝集を 50%阻害する濃度 (M)、即ち IC

50 値を求めたところ、 1. 62 X 10— ⁴Mであった。

[0039] 試験例 2 :レンチォニンの U— 46619による血小板凝集に対する抑制作用

凝集惹起物質溶液として、上記ァラキドン酸溶液の代わりに、 lmgの U-46619 ( U— 46619 lmgZ酢酸メチル 100 1,フナコシ株式会社製））をエタノール 185 1 で希釈することにより 10mMの U-46619溶液として- 20°Cで冷凍保存したものを、使用時に PBS緩衝液で PRP中の終濃度が 1 μ Μとなるように希釈した溶液を用いること以外は、上記試験例 1と同じ方法により、レンチォニンの血小板凝集に対する抑制作用を調べた。

結果を図 3のグラフに示す。グラフ中、試料の濃度は横軸に、該濃度における抑制率は縦軸に示されている。このグラフから、 IC 値を求めたところ、 1. 97 Χ 10— ⁴Μで

50

あった。

[0040] 血小板凝集抑制作用を有する化合物として、アスピリンが知られているが、ァスピリンの血小板凝集抑制作用は、シクロォキシゲナーゼ阻害によるものであり、これにより強力な血小板凝集作用を有するトロンボキサン Α2の産生を阻止する一方、同様の機序で産生される血小板凝集抑制作用を有するプロスタサイクリンの産生をも阻止してしまう。しかしながら、本試験例により、トロンボキサン A2の類縁ィ匕合物である U— 4 6619を惹起物質として使用したところ（トロンボキサン A2は不安定な化合物であるため）、この場合も血小板凝集抑制作用を示した。これにより、レンチォニンの血小板凝集抑制作用は、シクロォキシゲナーゼ阻害とは異なる作用機序によるものと考えられる。従って、本発明により、上記アスピリンを血小板凝集抑制剤として使用する場合の問題点を解決することが可能であると考えられる。

[0041] 試験例 3 :シィタケ有機溶媒抽出物のァラキドン酸による血小板凝集に対する抑制作用

試料として、上記レンチォニン溶液の代わりに、実施例 4で調製したシィタケの有機溶媒抽出物を使用したこと以外は、上記試験例 1と同じ方法により、ァラキドン酸による血小板凝集に対する抑制作用を調べた。

結果を図 4のグラフに示す。グラフ中、試料の濃度は横軸に、該濃度における抑制率は縦軸に示されている。このグラフから、凝集を 50%阻害する濃度 (M)、即ち IC

50 値を求めたところ、 201. 3 /z gZmlであった。

これにより、シィタケの有機溶媒抽出物が高い血小板凝集抑制作用を有することが明らかである。

試験例 4：シィタケ有機溶媒抽出物の U— 46619による血小板凝集に対する抑制作用

試料として、上記レンチォニン溶液の代わりに、実施例 4で調製したシィタケの有機溶媒抽出物を使用したこと以外は、上記試験例 2と同じ方法により、 U— 46619による血小板凝集に対する抑制作用を調べた。

結果を図 5のグラフに示す。グラフ中、試料の濃度は横軸に、該濃度における抑制率は縦軸に示されている。このグラフから、凝集を 50%阻害する濃度 (M)、即ち IC

50 値を求めたところ、 549. 4 /z gZmlであった。

[0042] 試験例 5 : A23187、ホルボール 12—ミリステート 13—アセテート（以下、 PMAと記す）、血小板活性化因子 (以下 PAFと記す)、 ADPを各々惹起物質として用いた場合のレンチォニンによる血小板凝集抑制作用を調べた。

レンチォニンの希釈液としては、試験例 1で調製したレンチォニン希釈液を用いた各惹起物質の溶液は、下記のように調製した。

A23187 :和光純薬工業株式会社製の A23187を DMSOに溶解し、終濃度 12. 5mMの A23187溶液として冷蔵保存した。使用時には PBS緩衝液で PRP中の終濃度が 50 Mとなるように希釈した。

PMA:フナコシ株式会社製の PMAをエタノールで溶解し、終濃度 90 μ Μの PMA 溶液として冷蔵保存した。使用時には 4%エタノール含有 PBS緩衝液で PRP中の終濃度が 5 Mとなるように希釈した。

PAF:フナコシ株式会社製の PAFlOmgをクロ口ホルムに溶解し、 ImMの PAF溶液として— 20°Cで冷凍保存した。使用時には使用量をエツペンドルフチューブに分注し、クロ口ホルムを窒素ガスで除去した後、 0. 25%BSAを含有する PBS緩衝液を添加し、超音波処理を行い、 PRP中の終濃度が 1 μ Μとなるように希釈した。

ADP：和光純薬工業株式会社製の ADPを、 PBS緩衝液で PRP中の終濃度が 10 μ Μとなるように希釈した。

2週間以上服薬していない健康な成人（21— 25才)より、真空採血管を用いて血液 9容量部に対し、 3. 8%クェン酸ナトリウム 1容量部となるように採血した。

血液は冷却により自然凝集が起こりやすいため、以下の操作は室温下で行った。採血で得られたタエン酸ィ匕血液を 1500rpmで 10分間遠心分離を行、、上層を多血小板血漿（platelet rich plasma,以下、 PRPと記す）として用いた。下層をさらに 3000 rpmで 15分間遠心分離し、その上層を乏血小板血漿 (platelet poor plasma,以下 P PPと記す)として用いた。血小板は採血後 3時間程で血小板機能の低下が見られるため、採血後 3時間以内に使用した。

血小板凝集能測定

PRPに血小板凝集惹起物質を加えて撹拌すると、血小板は急速に凝集塊を作り、血小板凝集塊が生じるに従って PRPの透過度は高くなる。血小板凝集能の測定は、この現象を利用して行った。

血小板凝集能は、 aggregometer (NKK HEMA TRACER 1 MODEL P AT-4A, SSR ENGINEERING社）を用いて測定した。キュベットは 37°Cでインキュペートし、スターラーの回転速度は、 lOOOrpmになるようにセットした。

透過度は、記録計 (CHROMATOPAC C— R4A、島津製作所製）により記録した。まず、キュベットにステアリングロッドを入れたものを用意し、一方のキュベットには PPPを 300 μ 1入れ、他方のキュベットには PRPを 300 μ 1分注した。次に、 ΡΡΡを入れたキュベットをセットして記録計の透過度を 40000に合わせ、次に PRPを入れたキュベットをセットして記録計の透過度を 0に合わせることにより、 SPAN調整を行った。この SPAN調整は測定のたびに行った。

対照として、レンチォニン希釈液の代わりに希釈溶媒のみを添加したものを用いた血小板凝集抑制率は、試験例 1と同じ方法により求めた。

結果を図 6のグラフに示す。

図 6より明らかなように、細胞内の Caイオン濃度を上昇させることで血小板凝集を引き起こす A23187、プロテインキナーゼ Cを活性ィ匕させることで血小板凝集を弓 Iき起こす PMA、血小板活性ィヒ物質である PAF,血小板凝集に伴い血小板中の濃染顆粒より放出され、他の血小板に作用を及ぼす ADPのいずれの惹起物質によって引き起こされる血小板凝集に対しても、レンチォニンは抑制効果を示した。各惹起物質の作用機序を図 7にまとめる。これにより明らかなように、レンチォニンは、血小板内の情報伝達物質による血小板凝集カスケードには関与せず、血小板の接着や放出反応などの形態変化、もしくはそれに伴うタンパク質のリン酸ィ匕を抑制していると考えられる。

試験例 6 : レンチォニンの血小板凝集抑制作用力構造のどの部分に起因しているのかを検討するため、レンチォニンと構造の類似した環状ィォゥ化合物を合成し、それぞれの血小板凝集抑制作用を測定することで、構造活性相関を調べた。

まず、レンチォニンのジスルフイド構造と環状構造に着目し、ジスルフイド構造を有する環状硫黄化合物である 1, 2-ジチェパン、 1, 2-ジチアンを合成し、レンチォ- ンの作用と比較した。

1, 2—ジチェパンの合成

4. 02mol (547. 84g)の 1, 5—ペンタンジチオールを 5mlのジクロロメタンに溶解し、 2. 5mlの純水で水和したシリカゲル 5gをカ卩えたジクロロメタン 25mlの中に加え、撹拌しながら 3. 5mlのジクロロメタンに溶解した臭素 4. 06mmol(208. 97mg)を滴下した。滴下終了後、 10分間撹拌し、濾紙で濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮して、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (移動相：ジクロロメタン:へキサン = 1： 2 )を行い、 1, 2—ジチェパンを得た。

1, 2—ジチアンの合成

4. 02mol (491. 45mg)の 1, 4 ブタンジチオールを 5mlのジクロロメタンに溶解し、 2. 5mlの純水で水和したシリカゲル 5gをカ卩えたジクロロメタン 25mlの中に加え、撹拌しながら 3. 5mlのジクロロメタンに溶解した臭素 4. 06mmol(208. 97mg)を滴下した。滴下終了後、 10分間撹拌し、濾紙で濾過した後、ロータリーエバポレーターで濃縮して、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (移動相：ジクロロメタン:へキサン = 1： 2 )を行い、 1, 2—ジチアンを得た。

上記で合成した 1, 2—ジチェパン、 1, 2—ジチアンをレンチォニンの希釈液と同じ希釈率で希釈し、試験例 1と同様の方法でァラキドン酸による血小板凝集の抑制作用を調べ、試験例 1と同様の方法により IC 値を求めた。結果を図 8に示す。図より明

50

らかなように、レンチォニンの IC は、 1， 2—ジチェパン、 1， 2—ジチアンの IC より低

50 50 ぐレンチォニンの血小板凝集抑制作用力 1, 2—ジチェパン、 1, 2—ジチアンの凝集抑制作用より高いことがわかる。

試験例 7 :

ァラキドン酸凝集を 100%抑制する濃度におけるレンチォニン、 1, 2- 1, 2—ジチアンの種々の惹起物質に対する血小板凝集抑制作用を、試験例 5と同様の方法により調べた。結果を図 9のグラフに示す。グラフより明らかなように、レンチォニンはいずれの惹起物質による血小板凝集も抑制する力 1, 2—ジチェパン、 1, 2- ジチアンは、ァラキドン酸以外の惹起物質による血小板凝集の抑制作用が低ぐ特に A23817や PMAに対する抑制作用はほとんどなかった。このことからレンチォ- ンの血小板凝集抑制は、ジスルフイド構造のみにあるのではな!/、ことがわかった。産業上の利用可能性

本発明により、血栓症の予防または改善に有効な健康食品および血栓症の予防または治療用医薬組成物が提供される。

Claims

請求の範囲

[1] シィタケの有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する血栓症の予防または改善のための健康食品。

[2] 前記抽出物がシィタケの子実体の有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物である請求の範囲第 1項記載の健康食品。

[3] 前記抽出物がシィタケの子実体の有機溶媒による抽出物である請求の範囲第 1項記載の健康食品。

[4] 前記抽出物が、シィタケを破砕した後、 3— 70°Cの温度で 1分間以上放置した後に、抽出されたものである請求の範囲第 1一 3項のいずれか 1項に記載の健康食品。

[5] 次式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIで表される化合物またはその誘導体を有効成分として含有する血栓症の予防または改善のための健康食品。

[化 1]

[6] 前記誘導体が、次式 VII、 VIII、 IX、 X、 XI及び Zまたは ΧΠで表される化合物である請求の範囲第 5項記載の健康食品。

[化 2]

(式中、 R¹— R¹³は各々独立に水素原子、水酸基、ハロゲン原子、未置換または置換された炭素原子数 1一 20のアルキル基、未置換または置換された炭素原子数 1一 2 0のァルケ-ル基、未置換または置換された 1一 20のアルコキシ基、未置換または置換された炭素原子数 6から 20のァリール基、未置換または置換された炭素原子数 7 力 20のアルキルァリール基を表す）

[7] 前記誘導体力 S、上記式 VIIで表される化合物である請求の範囲第 6項記載の健康食

[8] 上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIで表される化合物を有効成分として含有する請求の範囲第 5項記載の健康食品。

[9] 上記式 Iで表される化合物を有効成分として含有する請求の範囲第 5項記載の健康

^ P

[10] シィタケの有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物を有効成分として含有する血栓症の予防または治療用医薬組成物。

[11] 前記抽出物がシィタケの子実体の有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物である請求の範囲第 10項記載の医薬組成物。

[12] 前記抽出物がシィタケの子実体の有機溶媒による抽出物である請求の範囲第 10項記載の医薬組成物。

[13] 前記抽出物が、シィタケを破砕した後、 3— 70°Cの温度で 1分間以上放置した後に、抽出されたものである請求の範囲第 10— 12項のいずれか 1項に記載の医薬組成物

[14] 上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIで表される化合物またはその誘導体を有効成分として含有する血栓症の予防または治療用医薬糸且成物。

[15] 前記誘導体が、上記式 VII、 VIII、 IX、 X、 XI及び Zまたは ΧΠで表される化合物である請求の範囲第 14項記載の医薬組成物。

[16] 前記誘導体が、上記式 VIIで表される化合物である請求の範囲第 15項記載の医薬組成物。

[17] 上記式 I、 II、 III、 IV、 V及び Zまたは VIで表される化合物を有効成分として含有する請求の範囲第 14項記載の医薬組成物。

[18] 上記式 Iで表される化合物を有効成分として含有する請求の範囲第 14項記載の医薬組成物。

[19] シィタケの有機溶媒または有機溶媒と水との混合物による抽出物を投与することを含む血栓症の予防または治療方法。

[20] 上記式 Iで表される化合物を投与することを含む血栓症の予防または治療方法。

[21] 上記式 Iで表される化合物を他の抗血小板薬と共に投与することを含む血栓症の予防または治療方法。