WO2005033094A2 - Verfahren zur herstellung von 3-methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 3-methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol Download PDF

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WO2005033094A2
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thien
propan
reduction
nucleic acid
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Maria Kesseler
Bernhard Hauer
Thomas Friedrich
Michael Breuer
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/14—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen
    • C07D333/16—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen by oxygen atoms

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of 3-methylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol of the formula I.
  • B stands for an n-fold negatively charged inorganic or organic acid residue and H n B for a pharmaceutically acceptable acid.
  • EP-B-0273658 describes a process for the preparation of the corresponding base of duloxetine by reacting 2-acetylthiophene in a Mannich reaction with formaldehyde and dimethylamine, reducing the keto group of the Mannich base thus obtained to racemic (S) -3- N, N-dimethylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol, etherification of the alcohol function with naphthyl fluoride and finally Conversion of the dimethylamino group into a methylamino function.
  • the desired enantiomer of the naphthyl ether is obtained by using chiral starting materials or by racemate separation at the end product stage, for example via the salts with optically active acids or chromatography on a chiral stationary phase.
  • EP-A-0457559 also describes a method analogous to EP-B-0273658.
  • the keto group of the Mannich base with the asymmetric reduction system LAH-Icb lithium aluminum hydride - [(2R, 2S) - (-) - 4-dimethylamino-1, 2-diphenyl-3-methyl-2-butanol]
  • LAH-Icb lithium aluminum hydride - [(2R, 2S) - (-) - 4-dimethylamino-1, 2-diphenyl-3-methyl-2-butanol]
  • the disadvantage of this is the sensitivity of the LAH-Icb reduction system, which is only stable for a few minutes.
  • the object of the present invention was therefore to provide a process for the preparation of 3-methylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol I which overcomes the disadvantages of the prior art described here.
  • the object was achieved by first reacting thiophene in a Friedel-Crafts reaction with a .beta.-halogenopropionic acid halide or an acrylic acid halide in the presence of a Lewis acid, a hydrogen halide being introduced before the reaction product was isolated.
  • the keto group of the 3-halo-1- (thien-2-yl) propan-1-one of the formula III obtained is then reduced
  • Hai halogen and sets the reduced product of formula IV
  • the present invention therefore relates to a process for the preparation of 3-methylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol of the formula I.
  • step b) the propanone obtained in step a) is reduced and then, preferably without isolation of the reaction product, reacted with methylamine.
  • the process according to the invention gives the target compound I in good overall yields.
  • the production of the intermediate halogen propanone IM is not linked to the use of expensive organotin reagents.
  • the difficult to handle halogen propanol IV does not need to be isolated.
  • the process allows an enantioselective preparation of the S enantiomer IS by simple means carry out the reduction of the halopropenone intermediate III in the presence of a chiral catalyst or a chiral reducing agent which have a selectivity with regard to the formation of (S) -3-halo-1- (thien-2-yl) propan-1-ol IS ,
  • Enantioselectivity in the context of the present invention means that the enantiomeric excess ee (in%) of the S-enantiomer, which is calculated in a known manner according to:
  • At least 50% is at least 50%, preferably at least 80%, in particular at least 90% and especially at least 95%.
  • the end product of step a) is essentially no 1-thien-2-yl-propenone II, which is used in the processes of the prior art Technology always occurs as a by-product and reduces the yield of the desired acylation product III.
  • Suitable Lewis acids are covalent metal halides and semimetal halides which have an electron pair gap. As a rule, they are selected from halogen compounds of titanium, tin, aluminum, vanadium, iron or boron.
  • the chlorides are preferred; in the case of aluminum, however, the monoalkyl aluminum dichlorides and the dialkyl aluminum chlorides are also suitable. In the case of boron, the fluoride is also suitable.
  • suitable Lewis acids are titanium tetrachloride, boron trichloride, boron trifluoride, tin tetrachloride, vanadium pentachloride, iron trichloride, aluminum trichloride, alkyl aluminum dichlorides and dialkyl aluminum chlorides. Aluminum trichloride is particularly preferably used.
  • Suitable ß-halogenopropionic acid halides are 3-chloropropionic acid chloride and 3-bromopropionic acid bromide or chloride. 3-Chloropropionic acid chloride is preferably used.
  • Acrylic acid chloride is preferably used as the acrylic acid halide.
  • a ⁇ -halopropionic acid halide is preferably used as the acylating agent in step a).
  • Suitable hydrogen halides are hydrogen chloride and hydrogen bromide.
  • a hydrogen halide is preferably used in which the halogen atom corresponds to the ⁇ -halogen radical in the ⁇ -halogenopropionic acid halide used. Accordingly, when using 3-chloropropionic acid chloride, hydrogen chloride is preferably used.
  • Suitable solvents for the reaction in step a) are all solvents which are usually used in Friedel-Crafts acylation reactions. overall In principle, aprotic solvents are suitable which do not reduce the reactivity of the reagents used, in particular the Lewis acid, or which do not enter into competitive reactions with the Lewis acid under the given reaction conditions.
  • aromatic hydrocarbons which are significantly more difficult to acylate than thiophene, such as benzene, nitrobenzene and halogenated aromatic hydrocarbons, for example chlorobenzene and dichlorobenzene, and furthermore halogenated aliphatic hydrocarbons, in particular haloalkanes such as chloromethane, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, chloroethane, di- and trichloroethane. Mixtures of the abovementioned solvents are also suitable.
  • Solvents in which the Friedel-Crafts acylation can proceed essentially homogeneously such as nitrobenzene or halogenated hydrocarbons, are preferably used.
  • Halogenated aromatic or aliphatic hydrocarbons are particularly preferred, with haloalkanes being particularly preferred.
  • dichloroethane or chlorobenzene is used.
  • the Lewis acid must be used in at least equimolar amounts, based on the amount of acylated thiophene that can be theoretically achieved, since it forms a complex with the ketone formed during the acylation, which is stable under the usual reaction conditions of the Friedel-Crafts reaction , It is preferably in a molar ratio of 1: 1 to 1: 2, particularly preferably from 1: 1 to 1: 1, 5 and in particular from 1: 1, 1 to 1: 1, 5, based on 1 mol of the minor proportion used acylation component (thiophene or ß-halopropionic acid halide).
  • Thiophene and the ß-halopropionic acid halide are used in a molar ratio of preferably 1: 0.5 to 1: 2, particularly preferably 1: 0.7 to 1: 1, 5 and in particular 1: 0.8 to 1: 1, 2 used.
  • the order in which the reagents are combined in Friedel-Crafts acylation is of minor importance. For example, you can add the Lewis acid in the solvent and first add the ß-halopropionic acid halide and then the thiophene. Alternatively, one can submit thiophene and Lewis acid and add the ß-halopropionic acid halide.
  • the reaction temperature is i.a. selected depending on the solvent. It is usually in the range from 10 ° C to 40 ° C.
  • the reaction temperature is suitably at most 50 ° C., since otherwise the solvent itself will react.
  • the reaction temperature is preferably from -20 ° C. to 40 ° C., particularly preferably from 0 to 30 ° C.
  • reaction pressure is not critical. In general, the reaction is carried out at normal pressure; however, it can also be done with overpressure or underpressure.
  • overpressure is used when the solvent is volatile or is not liquid under normal conditions, as is the case with chloromethane, for example.
  • the hydrogen halide is preferably introduced after the acylation has taken place.
  • the termination of the acylation reaction can be determined by conventional methods in the art, e.g. by gas chromatography, thin layer chromatography or NMR spectroscopy.
  • the duration of the introduction depends, among other things, on the batch size and can be determined by the person skilled in the art in individual cases. As a rule, it is carried out at least until no more 1-thien-2-yl-propenone can be detected.
  • the reaction mixture is generally first worked up hydrolytically in order to cleave the ketone-Lewis acid complex formed.
  • Water or dilute aqueous mineral acids e.g. dilute hydrochloric acid. Further cleaning and isolation is carried out according to known methods, as described, for example, in Organikum, VEB Deutscher Verlag dermaschineen, 17th edition, 1988, p. 323 ff.
  • step a) leads in step a) to a 3-halogeno- (thien-2-yl) -1-propanone III in high yields.
  • Any 1-thien-2-yl-propenone II that may be formed in the course of the acylation reaction is essentially completely converted into the 3-halo- (thien-2-yl) -1-propanone III, so that the reaction mixture does not exceed 1 mole / o. particularly preferably at most 0.5 mol% propenone II, based on the yield of 3-halogeno- (thien-2-yl) -1-propanone III.
  • step b) The reduction of propanone III in step b) is possible, for example, using a metal or semimetal hydride or using hydrogen in the presence of a suitable transition metal catalyst.
  • Suitable metal or semimetal hydrides are both the neutral and the complex hydrides of metals or semimetals.
  • Metal or semimetal hydrides which have proven themselves in the reduction of ketones to alcohols are advantageously used. They are preferably the hydrides of boron or aluminum.
  • Suitable neutral hydrides are, for example, borane (BH 3 ; B 2 H 6 ), alan (AlH 3 ), silane (SiH 4 ), mono- and dialkylboranes, such as bis (3-methylbut-2-yl) borane (disiamylborane) or 9 -Borabicyclo [3.3.1] nonane (9-BBN), mono- and dialkylaluminium compounds such as diisobutylaluminium hydride (DIBAL-H), and trialkylsilanes such as trimethylsilane or triethylsilane.
  • borane BH 3 ; B 2 H 6
  • AlH 3 alan
  • silane SiH 4
  • mono- and dialkylboranes such as bis (3-methylbut-2-yl) borane (disiamylborane) or 9 -Borabicyclo [3.3.1] nonane (9-BBN)
  • Suitable complex hydrides are, for example, complex borohydrides such as sodium borohydride (NaBH 4 ), lithium borohydride (LiBH 4 ) or calcium borohydride Ca [BH 4 ] 2 , complex aluminum hydrides such as ethyl aluminum hydride (LiAIH 4 ), complex alkyl or alkoxy borohydrides such as lithium triethyl borohydride or Kaliumtri ⁇ sopropoxyborhydrid
  • Solvents suitable for reduction with metal or semimetal hydrides depend in particular on the reducing agent used and should of course not contain any groups which are also reduced under the reaction conditions.
  • the reduction with the above-mentioned hydrides is preferably carried out in aprotic solvents without functional groups which can be reduced under the given reaction conditions.
  • aromatic and aliphatic hydrocarbons for example C 5 -C 8 alkanes and C 5 -C 8 cycloalkanes, such as pentane, hexane, heptane, cyclopentane, cyclohexane and cyclooctane, aromatics, such as benzene, toluene, nitrobenzene, chloro- and Dichlorobenzene, furthermore open-chain and cyclic ethers with 4 to 8 carbon atoms, such as diethyl ether, methyl tert-butyl ether, tetrahydrofuran or dioxane, furthermore chlorinated hydrocarbons, in particular haloalkanes, such as chloromethane, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, di- or trichloroethane. Mixtures of the abovementioned solvents are also suitable.
  • the reduction with some of the above-mentioned complex hydrides, in particular with less reactive hydrides, such as sodium borohydride, is also possible in the presence of protic solvents, for example CrC 3 alcohols, such as methanol, ethanol, propanol or isopropanol, or even in aqueous solution.
  • protic solvents for example CrC 3 alcohols, such as methanol, ethanol, propanol or isopropanol, or even in aqueous solution.
  • a mixture of at least one of the abovementioned aprotic solvents and at least one alcohol is preferably used.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a suitable base when using protic solvents.
  • Suitable bases are, for example, alkali metal hydroxides, such as sodium or potassium hydroxide, or alkylimetal carbonates, such as sodium or potassium carbonate.
  • Sodium hydroxide is preferably used.
  • the reduction with many of the metal or semimetal hydrides mentioned above is often exothermic, so that the reaction is suitably carried out with removal of the heat of reaction, i.e. is carried out with cooling.
  • the reaction temperature is preferably -50 to 40 ° C, particularly preferably -30 to 30 ° C and in particular - 20 to 20 ° C.
  • the reduction can be carried out by customary methods of the prior art, as described, for example, in Organikum, VEB Deutscher Verlag dermaschineen, 17th edition, 1988, p. 492 ff.
  • the propanone III is initially introduced and the reducing agent is added in portions.
  • Propanone III can also be reduced, for example, with an aluminum alcoholate.
  • the reduction of ketones with an aluminum alcoholate is usually referred to as Meerwein-Ponndorf-Verley reduction.
  • a ketone is in the corresponding alcohol is transferred and the alcoholate is simultaneously oxidized to the corresponding aldehyde (in the case of alcoholates of primary alcohols) or ketone (in the case of alcoholates of secondary alcohols).
  • the reaction can be carried out by known methods, as described, for example, in Organikum, VEB Deutscher Verlag dermaschineen, 17th edition, 1988, pp. 486 ff.
  • the reduction of propanone III is also achieved by catalytic hydrogenation, i.e. by reacting propanone III with hydrogen in the presence of suitable transition metal catalysts.
  • suitable transition metals include the metals of subgroups VIII, VI and I, in particular platinum, ruthenium, copper, chromium and nickel.
  • the catalysts must of course be chosen so that they do not catalyze / hydrogenate the thiophene group.
  • the catalysts can be used both as heterogeneous and as homogeneous catalysts. Suitable processes are known in principle and, for example, in transition metals in organic synthesis. M. Beller, C. Bolm, Wiley-VCH, Weinheim, 1998, Volume 2, page 1 ff. (Homogeneous catalysts) and page 81 ff. (Heterogeneous catalysts).
  • step b) is preferably carried out with a metal or semimetal hydride and particularly preferably with one of the complex metal or semimetal hydrides mentioned above.
  • Sodium borohydride is especially used.
  • the process according to the invention is used to prepare (S) -3-methylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol of the formula I-S
  • step b) being carried out in the presence of a chiral reducing agent or a chiral catalyst which has a selectivity with regard to the formation of (S) -3 -Methylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol IS.
  • step b) uses, for example, an asymmetric metal or semimetal hydride as the reducing agent or the reduction is carried out in the presence of an asymmetric induction-imparting compound.
  • the asymmetrical metal or semimetal hydrides are preferably asymmetrical aluminum, boron or silicon hydrides.
  • Suitable asymmetric borohydrides are described, for example, in E. J. Corey, C. J. Helal, Angew. Chem. 1998, 110, 2092-2118 or in MM Midland, LA Morell, Methods Org. Chem., Houben-Weyl, 4th edition, Volume E 21d, pp. 4082-4098, 1995, whereupon in full Reference is made.
  • Suitable asymmetric silicon hydrides are described, inter alia, in H. Brunner, Methods Org. Chem., Houben-Weyl, 4th Edition, Volume E21d, pp. 4074-4081, 1995, to which reference is also made in full.
  • asymmetrical induction-imparting compounds are understood to be those which are influenced by influencing the actual reducing agent, e.g. design the reduction of the propanone IM enantioselectively by forming bonds or complexing with the reducing agent or by taking up a hydrogen atom or another reductive component from the reducing agent.
  • the compounds imparting asymmetrical induction themselves are not reducing.
  • this includes asymmetric hydrogenation catalysts.
  • hydrogen serves as the actual reducing agent, while the asymmetric catalyst favors the enantioselective formation of one of the possible enantiomers.
  • the hydrogenation can take place both in a heterogeneous and in a homogeneous phase.
  • Suitable catalysts for asymmetric hydrogenation in the heterogeneous phase are described, for example, in A. Baiker, HU Blaser in the Handbook of Heterogeneous Catalysis, Volume 5 (edited by G. Ertl, H. Knörzinger, J.Weitkamp), Wiley-VCH, Weinheim, 1997 , 2422-2436, which is hereby incorporated by reference in its entirety.
  • Catalysts which contain a metal from subgroup VIII, for example platinum or ruthenium, in particular ruthenium, and at least one phosphorus-containing ligand are particularly suitable. Suitable catalysts are described, for example, in R. Noyori, T. Ohkuma, Angew. Chem. 2001, 113, 40-75, to which reference is hereby made in full. Ruthenium (II) diamine complexes are particularly suitable, in which the ruthenium is also bound to a bidentate chiral diphosphine ligand.
  • a metal from subgroup VIII for example platinum or ruthenium, in particular ruthenium, and at least one phosphorus-containing ligand.
  • Suitable catalysts are described, for example, in R. Noyori, T. Ohkuma, Angew. Chem. 2001, 113, 40-75, to which reference is hereby made in full.
  • Ruthenium (II) diamine complexes are particularly suitable, in which the rut
  • diphosphine ligands which are suitable for the reduction of the halogen propanone III to the S-halogen propanol IV-S are (R) -BINAP of the formula A, (R, R) -DIOP of the formula B and (R, R) -CHIRAPHOS the Formula C.
  • Ph phenyl 4-methylphenyl (TolBINAP) 3,5-dimethylphenyl (XylBINAP)
  • particularly preferred catalysts contain a diamine ligand.
  • suitable diamine ligands are 1,2-ethylenediamine, 1,2-diphenyl-1,2-ethylenediamine and 1,2-cyclohexanediamine in their enantiomeric forms.
  • the hydrogenation is usually carried out under the previously described conditions.
  • a particularly preferred asymmetric induction-imparting compound is the oxazaborylidine of the formula D.
  • R is C-
  • the oxazaborylidine is generally used in catalytic amounts for the reduction.
  • the borane is used in at least equimolar amounts, based on the halopropane III, but preferably in excess.
  • the reaction usually takes place in suitable solvents. Suitable solvents are aprotic solvents. solvents that have no reducible groups under the given reaction conditions. These include in particular the aforementioned haloalkanes, aromatics and cyclic or acyclic ethers. Ether is preferably used, with tetrahydrofuran being particularly preferred.
  • the reaction temperature is preferably -80 to 20 ° C, particularly preferably -30 to 10 ° C.
  • the procedure is usually such that the oxazaborylidine is initially introduced in the solvent and either the borane and then the halopropane III or, conversely, first the halopropane III and then the borane are added at the desired reaction temperature, the first addition mode being preferred.
  • the reaction time depends, among other things, on the batch size and can be determined in a particular case by a person skilled in the art.
  • the catalyst or excess reducing agent used is deactivated or removed in the process according to the invention, depending on the reduction process used.
  • this is usually done by hydrolysis, for example with an aqueous or alcoholic solution.
  • the use of homogeneous hydrogenation catalysts or the reduction with aluminum alcoholates is also often carried out hydrolytically. If the reduction takes place in the form of a catalytic hydrogenation in a heterogeneous phase or with an enzyme as the reducing agent, the catalyst or the enzyme can be separated by physical separation, e.g. can be removed by decanting or filtration.
  • homogeneous reduction systems in particular when reducing with metal or semimetal hydrides, however, it is preferably initially not deactivated.
  • methylamine is added to the reaction mixture, which may be deactivated or separated from heterogeneous reduction systems, and is preferably reacted at elevated temperature, for example at 30 to 80 ° C., in particular at 50 to 70 ° C.
  • the methylamine can be used either in gaseous form or as an aqueous solution, the use as an aqueous solution being preferred.
  • reaction is preferably carried out at a pressure of 1 to 250 bar and in particular under the autogenous pressure which the system generates itself.
  • reaction mixture After reaction with methylamine, the reaction mixture is worked up in the usual way. If this is not done before adding methylamine, te, the catalyst or the reducing agent is deactivated and separated as already described, the solvent is removed and clean methylaminopropanol I is isolated from the residue, for example by crystallization, digesting, extraction or chromatography.
  • step a) of the process no expensive or time-consuming reagents or solvents are required and the halopropane III is produced in very high yields.
  • step b) the isolation of the sensitive halogen propanol IV and a loss of yield associated therewith or the difficult handling of the halogen propanol IV are avoided.
  • the S-enantiomer of methylaminopropanol I-S which is essential for the further conversion to duloxetine, can be obtained selectively with the process according to the invention if the reduction takes place in step b) with a chiral reducing agent.
  • the present invention further relates to a process for the preparation of (S) -3-methylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol of the formula IS, in which a 3-halo-1- (Thien-2-yl) propan-1-one III is reduced enantioselectively, characterized in that the reduction takes place in the presence of a dehydrogenase.
  • the (S) -3-halo-1- (thien-2-yl) propan-1-ol IV-S obtained is reacted with methylamine without isolation.
  • Suitable dehydrogenases are above all dehydrogenases (EG 1.1.1.x), in particular alcohol dehydrogenases (EC1.1 .1.1 or EG1.1.1.2), which bring about the selective reduction of halogen propanone III to S-halogen propanol IV-S .
  • the dehydrogenase is preferably obtained from a microorganism, particularly preferably from a bacterium, a fungus, in particular a yeast, deposited in stock collections or obtainable from isolates from a natural source, such as soil samples, biomass samples and the like.
  • the dehydrogenase comes from a yeast or a lactic acid bacterium.
  • the dehydrogenase can be used in purified or partially purified form or in the form of the microorganism itself.
  • Methods for obtaining and purifying dehydrogenases from microorganisms are well known to the person skilled in the art, for example from K. Nakamura & T. Matsuda, "Reduction of Ketones" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2O02, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim, recombinant processes for the production of dehydrogenases are also known, for example from W. Hummel, K. Abokitse, K. Drauz, C. Rollmann and H. Gröger, Adv. Synth. Catal.
  • Suitable bacteria are, for example, those of the genus Pseudomonas, Burkholderia, Agrobacterium, Rhodococcus, Lactobacillus or Lactococcus.
  • Suitable yeasts are, for example, those of the genus Geotrichum, Pichia, Candida, Hansenula or Saccharomyces.
  • Dehydrogenases from yeast and lactic acid bacteria are particularly preferably used. Preferred among these are dehydrogenases which are obtained from yeasts of the genus Geotrichum or Candida or which are obtained from lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus or Lactococcus.
  • Lactobacillus species are L. brevis, L. kefir, L. plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. delbrueckii and L. sanfrancisco.
  • Candida species are C. magnoliae, C. rugosa, C. utilis, C. boidinii, C. parapsilosis and C. antarctica.
  • Geotrichum species are G. candidum, G. clavatum and G. fermentans.
  • Dehydrogenases from Candida magnoliae, Geotrichum candidum or Lactobacillus brevis are particularly preferably used.
  • the reduction with the dehydrogenase usually takes place in the presence of a suitable coenzyme (also referred to as a cofactor).
  • a suitable coenzyme also referred to as a cofactor
  • NADH and / or NADPH is usually used as the coenzyme for the reduction of the ketone.
  • dehydrogenases can be used as cellular systems which inherently contain cofactor, or alternative redox mediators can be added (A. Schmidt, F. Hollmann and B. Bühler "Oxidation of Alcohols" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.lll, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim).
  • the reduction with the dehydrogenase usually also takes place in the presence of a suitable cosubstrate, which generally acts as a reducing agent for the coenzyme oxidized in the course of the reduction and thus regenerates it.
  • suitable cosubstrates are sugar, in particular hexoses, such as glucose, mannose, fructose, and / or oxidizable alcohols, in particular ethanol, propanol or isopropanol, and formate.
  • a second dehydrogenase e.g. Glucose dehydrogenase can be added when using glucose as cosubstrate. This can be used as a free or immobilized enzyme or in the form of free or immobilized cells. They can be produced either separately or by coexpression in a (recombinant) dehydrogenase strain.
  • the dehydrogenases used according to the invention can be used freely or immobilized.
  • An immobilized enzyme is an enzyme that is fixed to an inert carrier. Suitable carrier materials and the enzymes immobilized thereon are known from EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 and DE-OS 100193773 and from the references cited therein. Revelation this publication is referred to in its entirety in this regard.
  • Suitable carrier materials include, for example, clays, clay minerals, such as kaolinite, diatomaceous earth, perlite, silicon dioxide, aluminum oxide, sodium carbonate, calcium carbonate, cellulose powder, anion exchange materials, synthetic polymers, such as polystyrene, acrylic resins, phenol formaldehyde resins, polyurethanes and polyolefins, such as polyolefins ethylene and polypropylene.
  • the carrier materials are usually used in a finely divided, particulate form for the production of the supported enzymes, with porous forms being preferred.
  • the particle size of the carrier material is usually not more than 5 mm, in particular not more than 2 mm (sieve line).
  • Carrier materials are, for example, Ca alginate and Carrageenan.
  • Enzymes as well as cells can also be cross-linked directly with glutaraldehyde (cross-linking to CLEAs). Corresponding and further immobilization methods are described, for example, in J. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim.
  • the reduction reaction can take place in aqueous or non-aqueous reaction media or in 2-phase systems or (micro) emulsions.
  • the aqueous reaction media are preferably buffered solutions which generally have a pH of 5 to 8, preferably 6 to 8.
  • the aqueous solvent can also contain at least one alcohol, e.g. Contain ethanol or isopropanol.
  • Non-aqueous reaction media are to be understood as meaning reaction media which contain less than 1% by weight, preferably less than 0.5% by weight, of water, based on the total weight of the reaction medium.
  • the reaction is preferably carried out in an organic solvent.
  • Suitable solvents are, for example, aliphatic hydrocarbons, preferably having 5 to 8 carbon atoms, such as pentane, cyclopentane, hexane, cyclohexane, heptane, octane or cyclooctane, halogenated aliphatic hydrocarbons, preferably having one or two carbon atoms, such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane or tetrachloroethane, aromatic hydrocarbons, such as benzene, toluene, the xylenes, chlorobenzene or dichlorobenzene, aliphatic acyclic and cyclic
  • the reduction with the dehydrogenase is carried out in an aqueous-organic, in particular aqueous, reaction medium.
  • the halogen propanone III is preferably used in the concentration of 0.1 g / l to 500 g / l, particularly preferably from 1 g / l to 50 g / l, and can be added continuously or discontinuously.
  • the enzymatic reduction is generally carried out at a reaction temperature below the deactivation temperature of the dehydrogenase used and preferably at at least -10 ° C. It is particularly preferably in the range from 0 to 100 ° C., in particular from 15 to 60 ° C. and especially from 20 to 40 ° C., for example around 30 ° C.
  • the halogen propanone III with the dehydrogenase, the solvent and, if appropriate, the coenzymes, optionally an auxiliary dehydrogenase for regeneration of the coenzyme and / or further co-substrates, and the mixture, for. B. by stirring or shaking.
  • the keto group of the halopropane III is reduced to an OH group, the S-enantiomer of the halopropanol IV-S being formed essentially selectively.
  • the reduction will lead to a conversion of at least 70%, particularly preferably of at least 85% and in particular of at least 95%, based on the halogenated propanone III contained in the mixture.
  • the progress of the reaction, i. H. the sequential reduction of the ketone can be followed by conventional methods such as gas chromatography.
  • Alcohol dehydrogenases with at least one of the following properties are particularly preferably used as dehydrogenases in the process according to the invention:
  • Alcohol dehydrogenases with an amino acid sequence that has a partial amino acid sequence of at least 5, 6, 7 or 8, preferably at least 10, e.g. 10, 11, 12, 13, 14, or 15, consecutive amino acid residues according to SEQ ID NO: 1, wherein preferably the position corresponding to amino acid position 12 according to SEQ ID NO: 1 stands for valine; or b) a partial amino acid sequence of at least 5, 6, 7 or 8, preferably at least 10, e.g. 10, 11, 12, 13, 14, or 15, consecutive amino acid residues according to SEQ ID NO: 2; and functional equivalents thereof.
  • Alcohol dehydrogenases which catalyzes the reduction in an enantiomeric purity of at least 85% ee (in the presence of NADH and / or NADPH; at 30 ° C. and pH 6.0).
  • Alcohol dehydrogenases which are encoded by a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 3, or which comprise an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 4 or at least a partial sequence according to FIG. 3, and preferably from Lactobacillus brevis are available; as well as the functionally equivalent alcohol dehydrogenases derived therefrom.
  • Alcohol dehydrogenases which are encoded by a nucleic acid sequence comprising SEQ ID NO: 5 or which have an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 6 and which are preferably obtainable from Candida magnoliae (ATCC 1 2573); as well as the functionally equivalent alcohol dehydrogenases derived therefrom.
  • Another object of the present invention is also a (S) -3-chloro-1- (thien-2-yl) propan-1-ol dehydrogenase with at least one of the properties listed above.
  • the temperature stability range of the dehydrogenase is preferably from 10 to 80 ° C.
  • the temperature optimum of their activity is preferably in the range from 20 to 60 ° C., particularly preferably from 25 to 40 ° C.
  • the pH stability range is preferably pH 4 to 10.
  • the optimal pH for dehydrogenation is preferably in the range of pH 5 to 8.
  • the dehydrogenase according to the invention is preferably for the dehydrogenation of (S) -3-chloro-1- (thien-2-yl) -propan-1-ol to 3-chloro-1- (thien-2-yl) - propan-1- one in the presence of NAD + or NADP + . It preferably has a molecular weight in the range of 30 ⁇ 2 kDaltons.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence, comprising the coding sequence for the dehydrogenase according to the invention or a coding partial sequence.
  • a nucleic acid sequence comprising the coding sequence for the dehydrogenase according to the invention or a coding partial sequence.
  • a non-limiting example of this is the sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 6.
  • the present invention furthermore relates to an expression cassette comprising the nucleic acid sequence according to the invention in operative linkage with at least one regulatory nucleic acid sequence.
  • the present invention furthermore relates to a recombinant vector comprising at least one expression cassette according to the invention.
  • the present invention also relates to a prokaryotic or eukaryotic host, transformed with at least one vector according to the invention.
  • the present invention relates to the use of the dehydrogenase according to the invention or a microorganism producing this dehydrogenase for the production of (S) -3-halo-1- (thien-2-yl) propan-1-ol and in particular for the production of Duloxetine.
  • dehydrogenases also included according to the invention are “functional equivalents” of the specifically disclosed enzymes with (S) -3-chloro-1- (thien-2-yl) propan-1-ol dehydrogenase activity and the use thereof in the method according to the invention.
  • “Functional equivalents” or analogs of the specifically disclosed enzymes are, within the scope of the present invention, different polypeptides thereof which also have the desired biological activity, such as substrate specificity.
  • “functional equivalents” are understood to mean enzymes which are derived from 3-chloro Reduce 1- (thien-2-yl) -propan-1-one to the corresponding S-alcohol and the at least 20%, preferably 50%, particularly preferably 75%, very particularly preferably 90% of the activity of an enzyme, comprising one of the below SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 6 amino acid sequences listed or shown in FIG. 3.
  • Functional equivalents are also preferably stable between pH 4 to 10 and advantageously have a pH optimum between pH 5 and 8 and a temperature optimum in the range from 20 ° C. to 80 ° C.
  • “functional equivalents” are also understood to mean, in particular, mutants which, in at least one sequence position of the above-mentioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned, but nevertheless have one of the above-mentioned biological activities. “Functional equivalents” thus include those by a or several amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions available mutants, the changes mentioned being able to occur in any sequence position as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention. Functional equivalence is particularly given when the reactivity patterns between mutant and unchanged polypeptide match qualitatively, i.e. For example, the same substrates can be implemented at different speeds.
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity.
  • salts means both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules according to the invention.
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts, such as sodium, calcium, ammonium , Iron and zinc salts, and salts with organic bases, such as, for example, amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like, acid addition salts, such as, for example, salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and Oxalic acid are also the subject of the invention.
  • inorganic salts such as sodium, calcium, ammonium , Iron and zinc salts
  • organic bases such as, for example, amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine and the like
  • acid addition salts such as, for example, salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric
  • “Functional derivatives” of polypeptides according to the invention can also be prepared on functional amino acid side groups or on their N- or C-terminal end using known techniques. Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups, obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups, produced by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxyl groups, produced by reaction with acyl groups.
  • “functional equivalents” according to the invention include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form and also modified forms obtainable by changing the glycosylation pattern.
  • “Functional equivalents” naturally also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, regions of homologous sequence regions can be determined by sequence comparison and, based on the specific requirements of the invention, equivalent enzymes can be determined.
  • “Functional equivalents” also include fragments, preferably individual domains or sequence motifs, of the polypeptides according to the invention which, for example, have the desired biological function.
  • “Functional equivalents” are also fusion proteins which contain one of the polypeptide sequences mentioned above or functional equivalents derived therefrom and at least one further, functionally different, heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without mutual substantial functional impairment of the fusion protein parts)
  • Non-limiting examples of such heterologous sequences are, for example, signal peptides or enzymes.
  • “Functional equivalents” included according to the invention are homologs to the specifically disclosed proteins. These have at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90%, 95%, 97% or 99%, homology to one of the specific ones Disclosed amino acid sequences, calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448.
  • a percentage homology of a homologous polypeptide according to the invention means in particular percentage identity of the amino acid residues based on the Total length of one of the amino acid sequences specifically described herein.
  • Homologs of the proteins or polypeptides according to the invention can be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation or shortening of the protein.
  • Homologs of the protein according to the invention can be identified by screening combinatorial banks of mutants, such as, for example, shortening mutants.
  • a varied bank of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as, for example, by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • methods that can be used to generate banks of potential homologues from a degenerate oligonucleotide sequence. The chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be carried out in an automatic DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into a suitable expression vector.
  • degenerate gene set makes it possible to provide all sequences in a mixture that contain the desired set encode potential protein sequences.
  • Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are known to the person skilled in the art (for example Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • the invention relates in particular to nucleic acid sequences (single and double-stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) which code for an enzyme with dehydrogenase activity according to the invention.
  • nucleic acid sequences which e.g. code for amino acid sequences according to SEQ ID MO: 1, 2, 4, 6 or FIG. 3 or characteristic partial sequences thereof, or include nucleic acid sequences according to SEQ ID NO: 3 or 5 or characteristic partial sequences thereof.
  • nucleic acid sequences mentioned herein can be produced in a manner known per se by chemical synthesis from the nucleotide building blocks, such as, for example, by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleic acid building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • the addition of synthetic oligonucleotides and the filling of gaps with the aid of the Klenow fragment of DNA polymerase and ligation reactions as well as general cloning methods are described in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences (single and double-stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) coding for one of the above polypeptides and their functional equivalents, which are accessible, for example, using artificial nucleotide analogs.
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides or proteins or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which e.g. can be used as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention.
  • nucleic acid molecules according to the invention can also contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a section thereof.
  • nucleotide sequences according to the invention enable the generation of probes and primers which can be used for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which, under "stringent” conditions (see below), comprises at least about 12, preferably at least about 25, for example about 40, 50 or 75 successive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence according to the invention or of a corresponding antisense strand hybridizes.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, can be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals be when it's chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences or a section thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a section thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers which have been created on the basis of this sequence.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides according to the invention can also be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be identified and isolated from all organisms.
  • the nucleic acid sequences according to the invention or the homologues thereof can advantageously be isolated from fungi, yeasts or bacteria. Gram-negative and gram-positive bacteria are mentioned as bacteria.
  • the nucleic acids according to the invention are preferably obtained from gram-negative bacteria, advantageously from alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria or gamma-proteobacteria, particularly preferably from bacteria of the Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae or Rhizobiaceae families, very particularly preferably from bacteria of the genus Agrobacterium, Pseudomonas or Burkholderia above the Methods known to those skilled in the art are isolated.
  • Nucleic acid sequences according to the invention can be obtained, for example, using conventional hybridization methods or the PCR technique from other fungi or bacteria, e.g. isolate via genomic or cDNA libraries. These DNA sequences hybridize under standard conditions with the sequences according to the invention. Short oligonucleotides of the conserved regions, for example from the active center, which can be determined in a manner known to the person skilled in the art by comparison with a dehydrogenase according to the invention, are advantageously used for the hybridization. However, longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences can also be used for the hybridization.
  • DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of DNA: RNA hybrids of the same length.
  • DNA hybrids are advantageously 0.1 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 45 ° C., preferably between approximately 30 ° C. to 45 ° C.
  • DNA: RNA hybrids the hybridization conditions are advantageously 0.1 x SSC and temperatures between about
  • These specified temperatures for the hybridization are, for example, calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of approximately 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are described in relevant textbooks on genetics, such as, for example, Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, and can be made according to formulas known to the person skilled in the art, for example depending on the length of the nucleic acids , the type of hybrid or the G + C content. The person skilled in the art can obtain further information on hybridization from the following textbooks: Ausubel et al.
  • the invention also relates to derivatives of the specifically disclosed or derivable nucleic acid sequences.
  • nucleic acid sequences according to the invention e.g. derived from SEQ ID NO: 3 or 5 and differ from them by addition, substitution, insertion or deletion of one or more nucleotides, but continue to code for polypeptides with the desired property profile.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or which have been changed in accordance with the codon usage of a specific source or host organism, in comparison to a specifically named sequence, as well as naturally occurring variants, such as e.g. Splice variants or allele variants, thereof.
  • the invention also relates to the molecules derived from the specifically disclosed nucleic acids by sequence polymorphisms. These genetic polymorphisms can exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variations usually cause a 1 to 5% variance in the nucleotide sequence of a gene.
  • nucleic acid sequence is understood to mean, for example, allelic variants which have at least 40% homology at the derived amino acid level, preferably at least 60% homology, very particularly preferably at least 80, 85, 90, 93, 95 or 98% homology over the entire sequence range (for homology at the amino acid level, reference is made to the above statements on the polypeptides).
  • allelic variants which have at least 40% homology at the derived amino acid level, preferably at least 60% homology, very particularly preferably at least 80, 85, 90, 93, 95 or 98% homology over the entire sequence range (for homology at the amino acid level, reference is made to the above statements on the polypeptides).
  • the homologies can advantageously be higher over partial regions of the sequences.
  • Derivatives are also to be understood to mean homologs of the nucleic acid sequences according to the invention, for example fungal or bacterial homologs, shortened sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence. At the DNA level, for example, they have a homology of at least 40%, preferably of at least 60%, particularly preferably of at least 70%, very particularly preferably of at least 80% over the entire specified DNA range. Derivatives are also to be understood, for example, as fusions with promoters.
  • the promoters that precede the specified nucleotide sequences can be changed by one or more nucleotide exchanges, insertions, inversions and / or deletions, but without the functionality or effectiveness of the promoters being impaired. Furthermore, the effectiveness of the promoters can be increased by changing their sequence, or completely replaced by more effective promoters, including organisms of other species.
  • Derivatives are also to be understood as variants whose nucleotide sequence in the range from -1 to -1000 bases upstream before the start codon or 0 to 100O bases downstream after the stop codon have been changed such that the gene expression and / or the protein expression is changed, preferably increased.
  • the invention also encompasses nucleic acid sequences which hybridize with the coding sequences mentioned above under “stringent conditions”.
  • This property means the ability of a poly- or oligonucleotide to bind to an almost complementary sequence under stringent conditions, while under these conditions non-specific bindings between non-complementary partners are avoided.
  • the sequences should be 70-100%, preferably 90-100%, complementary.
  • complementary sequences of being able to specifically bind to one another is used, for example, in the Northern or Southern blot technique or in the primer binding in PCR or RT-PCR. Usually oligonucleotides with a length of 30 base pairs or more are used for this.
  • Stringent conditions mean, for example in Northern blot technology, the use of a washing solution which is 50-70 ° C., preferably 60-65 ° C., for example 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (20x SSC: 3M NaCl , 0.3M Na citrate, pH 7.0) for the elution of non-specifically hybridized cDNA probes or oligonucleotides.
  • a washing solution which is 50-70 ° C., preferably 60-65 ° C., for example 0.1x SSC buffer with 0.1% SDS (20x SSC: 3M NaCl , 0.3M Na citrate, pH 7.0) for the elution of non-specifically hybridized cDNA probes or oligonucleotides.
  • SDS 3M NaCl , 0.3M Na citrate, pH 7.0
  • polynucleotides can be found in the screening of genomic or cDNA libraries and, if appropriate, can be multiplied therefrom by means of suitable primers by means of PCR and then isolated, for example, using suitable probes.
  • polynucleotides according to the invention can also be synthesized chemically.
  • the invention also relates to expression constructs containing, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide according to the invention; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3'-downstream and, if appropriate, further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • operative linkage is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can perform its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • sequences which can be linked operatively are Targeting sequences as well as enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Further regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication and the like. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. (1990).
  • a nucleic acid construct according to the invention is to be understood in particular to be those in which the gene for a dehydrogenase according to the invention has one or more regulation signals for control, e.g. Increase that gene expression has been operatively or functionally linked.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the nucleic acid construct can also have a simpler structure, ie no additional regulation signals have been inserted in front of the coding sequence and the natural promoter with its regulation has not been removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation no longer takes place and gene expression is increased.
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more of the "enhancer" sequences already mentioned, functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • the nucleic acids according to the invention can be contained in the construct in one or more copies. Further markers, such as antibiotic resistance or genes complementing auxotrophies, may also be contained in the construct, optionally for selection on the construct.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, lacl q " T7-, T5-, T3- , gal, trc, ara, rhaP (rhaP BAD ) SP6, lambda-P R - or in the lambda-P L - promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria grarn-positive promoters amy and SPO2, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH included.
  • promoters of pyruvate decarboxylase and methanol oxide for example from Hansenula, are also advantageous. Artificial promoters can also be used for regulation.
  • the nucleic acid construct is advantageously inserted into a vector, such as, for example, a plasmid or a phage, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as, for example, a plasmid or a phage
  • vectors are also to be understood as meaning all other vectors known to the person skilled in the art, for example viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or replicated chromosomally. These vectors represent a further embodiment of the invention. Suitable plasmids are, for example, in E.
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0) 444 904018).
  • the nucleic acid construct for the expression of the other genes contained additionally contains 3'- and / or 5'-terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected depending on the selected host organism and gene or genes for optimal expression.
  • regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and introduced into the genome of the host via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or the nucleic acid according to the invention.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusing a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • Common recombination and cloning techniques such as those described in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, from "Cloning Vectors" (Powels P.H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • recombinant microorganisms can be produced which, for example, have been transformed with at least one vector according to the invention and can be used to produce the polypeptides according to the invention.
  • the recombinant constructs according to the invention described above are advantageously introduced and expressed in a suitable host system.
  • Common cloning and transfection methods known to the person skilled in the art such as, for example, co-precipitation, protoplast fusion, electroporation, retroviral transfection and the like, are preferably used to bring the nucleic acids mentioned into expression in the respective expression system. Suitable systems are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, F.
  • homologously recombined microorganisms can also be produced.
  • a vector is produced which contains at least a section of a gene or a coding sequence according to the invention, in which optionally at least an amino acid deletion, addition or substitution has been introduced in order to change the sequence according to the invention, for example to disrupt functionally ("knock-out" vector).
  • the introduced sequence can, for example, also be a homologue from a related microorganism or can be derived from a mammalian, yeast or insect source.
  • the vector used for homologous recombination can alternatively be designed in such a way that the endogenous gene is mutated or otherwise altered in the case of homologous recombination, but still encodes the functional protein (for example the upstream regulatory region can be altered in such a way that the expression of the endogenous protein thereby is changed).
  • the modified section of the gene according to the invention is in the homologous recombination vector.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid according to the invention or the nucleic acid construct.
  • Microorganisms such as bacteria, fungi or yeasts are advantageously used as host organisms.
  • Gram-positive or gram-negative bacteria are preferred, preferably bacteria from the Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae families, particularly preferably bacteria from the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderocacteria, Saliumella, Salmonella.
  • the genus and species Escherichia coli is very particularly preferred.
  • Further advantageous bacteria can also be found in the group of alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria or gamma-proteobacteria.
  • the host organism or the host organisms according to the invention preferably contain at least one of the nucleic acid sequences, nucleic acid constructs or vectors described in this invention, which code for an enzyme with dehydrogenase activity according to the invention.
  • Microorganisms are usually in a liquid medium that contains a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source mostly in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and possibly vitamins, at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C to 60 ° C attracted with oxygen.
  • the pH of the nutrient liquid can be kept at a fixed value, that is to say it can be regulated during cultivation or not.
  • the cultivation can take place “batch”, “semi batch” or continuously.
  • Nutrients can be introduced at the beginning of the fermentation or fed semi-continuously or continuously.
  • the ketone can be added directly to the cultivation or advantageously after cultivation.
  • the enzymes can be isolated from the organisms by the method described in the examples or used as a crude extract for the reaction. Recombinant production of the polypeptides according to the invention
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of polypeptides according to the invention or functional, biologically active fragments thereof, wherein a polypeptide-producing microorganism is cultivated, where appropriate the expression of the polypeptides is induced and these are isolated from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if this is desired.
  • the recombinant microorganism can be cultivated and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH of 6 to 9. Suitable cultivation conditions are described in detail, for example, in T. Manitatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted and the product is obtained from the lysate by known protein isolation methods.
  • the cells can optionally be operated by high-frequency ultrasound, by high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by a combination of several of the processes listed.
  • Purification of the polypeptides can be achieved with known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and with other customary methods such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemical Working Methods, Walter de Gruyter Verlag, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • vector systems or oligonucleotides which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus code for modified polypeptides or fusion proteins which serve, for example, for easier purification.
  • suitable modifications are, for example, so-called “tags” which act as anchors, such as, for example, the modification known as hexa-histidine anchors or epitopes which can be recognized as antigens of antibodies (described, for example, in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (NY) Press).
  • anchors can be used to attach the proteins to a solid support, such as, for example, a polymer matrix, which can be filled, for example, in a chromatography column, or to a microtiter plate or to another support.
  • a solid support such as, for example, a polymer matrix, which can be filled, for example, in a chromatography column, or to a microtiter plate or to another support.
  • these anchors can also be used to recognize the proteins.
  • customary markers such as fluorescent dyes, enzyme markers which form a detectable reaction product after reaction with a substrate, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to derivatize the proteins.
  • the dehydrogenases can be used in the process according to the invention as free or immobilized enzyme.
  • the process according to the invention is advantageously carried out at a temperature between 0 ° C. to 95 ° C., preferably between 10 ° C. to 85 ° C., particularly preferably between 15 ° C. to 75 ° C.
  • the pH in the process according to the invention is advantageously kept between pH 4 and 12, preferably between pH 4.5 and 9, particularly preferably between pH 5 and 8.
  • enantiomerically pure or chiral products such as 3-chloro-1- (thien-2-yl) - (S) - propan-1-ol, are to be understood as enantiomers which show an enantiomeric enrichment.
  • Growing cells containing the nucleic acids, nucleic acid constructs or vectors according to the invention can be used for the method according to the invention.
  • Dormant or disrupted cells can also be used.
  • Disrupted cells are understood to mean, for example, cells which have been made permeable by treatment with, for example, solvents, or cells which have been broken up by means of enzyme treatment, by mechanical treatment (for example French press or ultrasound) or by some other method.
  • the crude extracts thus obtained are advantageously suitable for the process according to the invention.
  • Purified or purified enzymes can also be used for the process. Immobilized microorganisms or enzymes, which can advantageously be used in the reaction, are also suitable.
  • the process according to the invention can be operated batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • the activity-colored gel of a dehydrogenase from Lu10288 isolated according to the invention Lane 1: Molecular weight standards from below: 47 kDa, 74 kDa, 121 kDa, 205 kDa; Lane 2: empty; Lane 3: homogenate supernatant; Lane 4: Value fraction Q-Sepharose; Lane 5: Value fraction Q-Sepharose (triple amount); Lane 6: Superdex value fraction; Lane 7: Mono-Q value fraction; Lane 8: Mono-P fraction;
  • FIGS. 2A and 2B show a typical course of the reaction of various batches for the preparation of (S) -3-methylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol I-S by reduction with a dehydrogenase from Lactobacillus brevis.
  • FIG. 3A shows the result of the N-terminal sequencing of a blot band of dehydrogenase from Lu10288 isolated according to the invention
  • FIG. 3B the sequencing data of various proteolytic fragments of a dehydrogenase from Lu10288 purified according to the invention; if a main sequence could be determined for several signals per sequencing step, this is shown underlined twice. Illegible positions are marked with "/"; for positions whose determination is subject to a certain degree of uncertainty, the amino acid residue is given in brackets. Two amino acids are indicated in one position if no clear preference can be given. "?" means an unknown or undetermined amino acid.
  • the propanone from Example 1 was placed in a mixture of 400 ml of toluene and 200 g of methanol at 0 ° C. After the addition of 2 g of 30% aqueous sodium hydroxide solution, 21.4 g of sodium borohydride were added in portions over the course of 2.5 h. After stirring for 40 minutes at 0 ° C., the reaction mixture was mixed with 12.1 g of 40% aqueous methylamine solution. The mixture was stirred at 60 ° C. under autogenous pressure for 6 h. After cooling to room temperature, the solvent was removed, the residue was digested with toluene and filtered off. The filtrate was dried to give 175.8 g of the title compound as a light yellow solid.
  • glucose dehydrogenase from commercial sources (eg Jülich Fine Chemicals Order No. 22.10 or 19.10) or from our own sources could be used, the latter being an E.coli XL10 Gold pUC19 clone which was the glucose dehydrogenase Gene from Bacillus subtilis (Genbank-Acc.No.M12276) contained (Lu11293).
  • Each 150 ml medium was sterilized in two 1 liter Erlenmeyer flasks and completed with 5 ml sterile saline. After inoculation of an LB ampicillin agar plate, the precultures were incubated for 12 hours at 37 ° C. and 200 rpm and added to the fermentation medium. The fermentation was started at 37 ° C, 0.1 bar internal pressure, pH 7.0 (control with 20% phosphoric acid and 25% NaOH) with a gassing rate of 7.5 L / min and 300 rpm (control pO 2 between 20 and 50% with 10-20 L / min supply air and 500-1500 rpm).
  • Example 4 Screening for dehydrogenases to reduce 3-chloro-1- (thien-2-yl) propan-1-one
  • GC Hydrodex- ⁇ -6-TBDM, 25 m, 90 ° C 10min 5 ° C / min 180 ° C 10min, running time: 38 min, inlets: heater: 200 ° C, press: 106.8 kPa, total flow: 102 ml / min, split ratio: 125: 1, split flow: 99.8 ml / min, detector: 200 ° C or HPLC: Chiracel OD-H, 250 * 4.6mm (Daicel), 40 ° C, flow 1.0 ml / min, 0.0-1.0 min: 97.5% n-hexane + 2.5% isopropanol; Detection at 230 nm (alcohol) and 260 nm (ketone) at Rt 9.50 (3-chloro-1- (thien-2-yl) propan-1-one), Rt 16.60 min (R-3- Chloro-1- (thien-2-yl) propan-1-ol)
  • Lactobacillus brevis strains Lu10288, 10290 and 10291 were isolated as follows.
  • the pH of the solution was adjusted to 5.4.
  • the solution was autoclaved 15 'at 121 ° C.
  • KMB medium 50 ml of sterile glucose solution (5 g ad 50 ml H 2 0) and 40 ml ethanol were added with stirring and agar plates were poured.
  • KMB medium 50 ml of sterile glucose solution (5 g ad 50 ml H 2 0) and 40 ml ethanol were added with stirring and agar plates were poured.
  • the solution was autoclaved 15 'at 121 ° C.
  • the glucose and the CaCO 3 (Riedel de Haen) were dissolved separately and autoclaved and mixed with the agar before pouring the plates.
  • liquid KMB medium with 20 g / l fructose 24 h 37 ° C, 50 rpm
  • the strains were characterized by determining the acid fermentation pattern (pH measurement and concentration determination of glucose, fructose, lactate, acetate, E- thanol by HPLC analysis of the culture supernatants).
  • Heterofermentative strains with acetate and lactate formation were isolated and systematically characterized by analysis of the 16sRNA.
  • Tables 1, 2 and 3 show exemplary strains or the sales and ee values.
  • Example 5 Purification of the dehydrogenase from Lactobacillus brevis
  • a Superdex 200 molecular sieve column (Pharmacia) with a diameter of 2.6 cm and a volume of 240 ml was equilibrated in 20 mM MES, 1 mM MgCl 2 , 1 tablet Complete per liter buffer (EDTA free), pH 7.1.
  • the value fractions of the Q-Sepharose were combined (240 ml) and adjusted to 80% saturation by slowly adding 124 g of ammonium sulfate. The pH was kept at 7.1. The solution was stirred at 4 ° C. for 10 minutes and then centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes.
  • the pellet obtained was resuspended in 5 ml of equilibration buffer and dialyzed for 1 hour at 4 degrees Celsius (10 kDa exclusion volume).
  • the dialyzed solution was divided into two 9 ml portions and applied to the molecular sieve column at a flow of 4 ml per minute. 4 ml fractions were collected and tested. Fractions 48 to 56 were again active for both substrates.
  • a preparative Mono-Q HR column (Pharmacia) with a volume of 20 ml was equilibrated in 20 mM MES, 1mM MgCl 2 , pH 7.1. 70 ml of the pooled superdex fractions were applied at a flow rate of 4 ml per minute. After washing the column, the column was developed with a linear gradient in 100 minutes after 100% 20 mM MES, 1 mM MgCl 2 , 0.5 M NaCl, pH 7.1. 4 ml fractions were collected. Active fractions (fractions 36 to 41) were pooled.
  • the sample was diluted with the same volume of Novex "Native Tris-Glycine” sample buffer (Novex).
  • the Tris-Glycine gels from Anamed (without SDS, 1 mm thick, 10 sample pockets) were installed in the running chamber.
  • Invitrogen Tris-Glycine Native "running buffer (Invitrogen) (10x) used after dilution.
  • the sample pockets were loaded and the gel started at 200 V and approx. 50 mA.
  • the duration of the electrophoresis was approximately 1.5 hours.
  • the running chamber was in ice water. After the gel was removed, it came into a glass dish and was washed in 50 mM MES, 8 mM MgCl 2 , pH 6.2 and incubated.
  • the N-terminus of the dehydrogenase purified in this way was determined after SDS-PAGE and gel blotting by means of Edman sequencing (SEQ ID NO: 1).
  • the fermentation was started at 28 ° C., 0.1 bar internal pressure, pH 6.0 with a gassing rate of 5 l / min and 500 rpm (regulation pO 2 > 20%) and ended after 26 h at an OD600 of 15.1 , homogenization:
  • the harvested cells (378 g of bio-moist mass) were suspended in 1 l of 50 mM MES +1 mM MgCl 2 , pH 6.5 with 10 tablets Protease-Inhibitor Complete (without EDTA), from Röche (approx. 9 x conc.) And Opened twice with 1000 bar in a Microfluidizer Z04. After centrifugation (20 min / 10000 g) half of the clear supernatant (1.3 I homogenate) was purified as described below.
  • fraction samples were diluted appropriately in 50 mM MES pH 6.0, 0.2 mM NaDH / NaDPH, 100 mM glucose, 50 ⁇ l / ml GDH and 10 mM 3-chloro-1- (thien-2-yl ) - Propan-1 -one tested for activity at 30 ° C.
  • volume of 400 ml was equilibrated in 20 mM MES buffer, 1 mM MgCl 2 , pH 6.8. 650 ml of homogenate were mixed with 11 tablets Complete (protease inhibitor mixture) and applied to the Q-Sepharose column at an application rate of 7.5 ml / min. The detection was carried out at 280 nm. The mixture was then washed with 700 ml of the same buffer.
  • Ammonium sulfate precipitation 41 ml of Q-Sepharose peak value fractions were ad 90% saturated with (NH 4 ) 2 SO 4 (pH 6.2), stirred for 30 min at 4 ° C. and then centrifuged for 10 min at 10,000 g. The pellet obtained was suspended in 10 ml of 20 mM MES, 1 mM MgCl 2 , 1 tablet / I Complete (without EDTA), from Röche, pH 6.2 and for 30 min against 20 mM MES, 1 mM MgCl 2 , 1 tablet / I Complete (without EDTA), Röche, pH 6.2, in a Slide-A-Lyzer, Pierce (10 kDa exclusion volume), dialyzed.
  • a Superdex 200 molecular sieve column (Pharmacia) with a diameter of 2.6 cm and a volume of 240 ml was equilibrated in 20 mM MES, 1 mM MgCl 2 , 1 tablet Complete per liter buffer (EDTA free), pH 6.2.
  • a Mono-Q HR5 / 5 column (from Pharmacia) with a volume of 1 ml was equilibrated in 20 mM MES, 1 mM MgCl 2 , pH 6.8. 10 ml of the combined value fractions of the Superdex column were applied at a flow rate of 1 ml per minute. After washing the column, the column was developed with a linear gradient in 100 minutes after 100% 20 mM MES, 1 mM MgCl 2 , 0.75 M NaCl, pH 6.8 and 10 minutes with 20 mM MES, 1 mM MgCl 2 , pH 6.8 rinsed. 1 ml of fractal ons collected (detection 226 nm). Active fractions (fractions 24 to 27) were pooled.
  • Example 7 Preparation of (S) -3-methylamino-1- (thien-2-yl) propan-1-ol 1-S by reduction with a dehydrogenase from Lactobacillus brevis
  • Lactobacillus brevis Lu10288 was grown and harvested as in Example 4.
  • the resting cells (10-100 g / L biomass) were treated with 0.2-2 mM NAD (P) + , 1 to 100 g / L of the propanone from Example 1 (batch or fed-batch) and 18 g / L glucose added and incubated at 30 ° C for 2-8 h.
  • the reaction was kept at pH 6.0-7.0 by titration with 0.5 M NaOH and followed by HPLC analysis.
  • Figures 2A and B show typical courses according to approaches 1 and 2 respectively.
  • the biomass was then removed by centrifugation and / or filtration.
  • the NMR analysis of the MTBE extracts showed a 3-chloro-1- (thien-2-yl) propan-1-ol content of 60-70%.
  • the contents of unreacted 3-chloro-1- (thien-2-yl) propan-1-one and of the by-product 1-thien-2-yl-propen-1-one were each below 10%.
  • 1-Thien-2-yl-propen-1-ol could only be detected in traces.
  • Example 8 Cloning of the dehydrogenase from Lactobacillus brevis Lu 10288 a) Chromosomal DNA preparation from LU10288 after previous protoplasting:
  • Solutionl 0.41 M sucrose 0.01M MgSO 4 * 7H 2 O 5ml / l M12 medium 1: 2 10ml / M0% KH 2 PO 4 pH 6.7 2.5 mg / ml lysozyme (add shortly before use) Prepare solution 1 as follows:
  • Proteinase Qiagen, 20mg / ml stock solution
  • TE buffer 10mM Tris * CI pH8, 1mM EDTA pH 8
  • Proteinase K (Qiagen Proteinase: 20 mg / ml, ie 50 ⁇ l) and incubate at 37 ° C overnight in the incubator.
  • the mixture is filled into a dialysis tube. It is dialysed 3 times in each case for 1 hour at 4.degree. C. in 1.51 TE buffer. The last dialysis step is also possible overnight.
  • the DNA was incubated for 1-2 hours in an Eppendorf shaker at 55-60 ° C at a gentle shaking frequency (400 rpm).
  • sequence FWDGGYTAQ (cf. V8-RP Fr.7) presumably represents the C-terminus due to the termination. From this and from the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO. 1) nucleic acid sequences were taken into account, taking into account the codon usage of Lactobacillus brevis derived (primers Mke338 and 339), which served as follows for cloning the dehydrogenase gene by PCR amplification on chromosomal DNA from Lu10288 (protocol see above).
  • the PCR was carried out according to the Stratagene standard procedure with Pfu polymerase (Stratagene) and the following temperature program: 95 ° C. for 5 minutes; 30 cycles at 95 ° C for 45 sec, 52 ° C for 45 sec, and 72 ° C for 1 min 20 sec; 72 ° C for 10 min .; 10 ° C until use.
  • the PCR product (0.8 kB) was isolated by agarose gel electrophoresis (1.2% E-gel, Invitrogen) and column chromatography (Mini-Elute, Qiagen) and then digested with Ndel / Hindlll and in appropriately digested pDHE19 .2 vector (a pJOE derivative, DE19848129) cloned.
  • the ligation batches were transformed into E.coli XL1 Blue (Stratagene).
  • the sequencing of corresponding clones resulted in the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, which corresponds to the amino acid sequence SEQ ID NO: 4, as an insert in the plasmid pDHE10288adh1 thus obtained. It contains all the peptides identified in Examples 5 and 8.
  • SEQ ID NO: 3 nucleic acid sequence of the dehydrogenase of Lu10288 (as well as opposite strand) 1 ATGTCTAACC GTTTGGATGG AAAAGTAGCA ATCGTTACAG GTGGTACGTT TACAGATTGG CAAACCTACC TTTTCATCGT TAGCAATGTC CACCATGCAA 51 GGGTATCGGT TTAGCTATCG CCACGAAGTT CGTTGAAGAA GGGGCTAAGG CCCATAGCCA AATCGATAGC GGTGCTTCAA GCAACTTCTT CCCCGATTCC 101 TCATGATTAC CGGCCGGCAC AGCGATGTTG GTGAAAAAGC AGCTAAGAGT AGTACTAATG GCCGGCCGTG TCGCTACAAC CACTTTTTCG TCGATTCTCA 151 GTCGGCACTC CTGATCAGAT TCAATTTTTC CAACATGATT CTTCCGATGA CAGCCGTGAG GACTAGTCTA AGTTAAAAAGGCTACT 201 AGACGGCTGG ACG
  • Example 9 Activity determination of the recombinant dehydrogenase from Lactobacillus brevis Lu 10288
  • the plasmid pDHE10288adh1 was retransformed in E.coli TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: a RhaA ' derivative of E.coli TG 1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto- Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40 (2), 397-413).
  • 100 ul cell suspension were 20 min in 900 ul 50mM MES pH6 with 50 ul / ml glucose-DH (example), 100mM glucose, 100mM NaCl, 1mM NADH, 1mM NADPH and with 10 mM 3-chloro-1- (thien-2-yl ) -propan-1-one incubated shaking.
  • the batches were analyzed analogously to Example 4. On average 0.13 mM 3-chloro-1- (thien-2-yl) -propan-1-ol was formed, which corresponds to an activity of 6.6 U / L culture suspension.
  • nucleic acid sequences (primers Mke366, 367 and 374) were derived from the peptides, which as follows are the cloning of the dehydrogenase gene by PCR amplification on chromosomal DNA from Lu8472 (genomic DNA kit with triple concentrated lyticase Solution, Qiagen, Hilden) served.
  • the primers MKe366 and MKe367 were mixed 1: 1.
  • the PCR was carried out according to the Strateumble standard specification with PfuTurbo polymerase (Stratagene) and the following temperature gradient program: 95 ° C. for 1 minute; 30 cycles at 95 ° C for 1 min., X ° C 1 for 45 sec, and 72 ° C for 2 min; 72 ° C for 10 min .; 10 ° C until use.
  • the PCR product (-0.5 kB) was isolated by agarose gel electrophoresis (1.2% e-gel, Invitrogen) and column chromatography (GFX kit, Amersham Pharmacia) and then sequenced (sequencing primers: Mke 366 and Mke374 ).
  • SEQ ID NO: 5 The amino acid sequence derived therefrom (SEQ ID NO: 6) shows an identity of 53% to the carbonyl reductase from Candida magnoliae (WO200140450). The peptide sequences determined after protein purification are included with minor deviations. Differences could

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft enzymatische und nicht-enzymatische Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol; sowie Enzyme zur Durchführung dieser Verfahren; für diese Enzyme kodierende Nukleinsäuresequenzen, diese enthaltende Expressionskassetten, Vektoren und rekombinante Wirte.

Description

Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1- (thien-2-yl)-propan-1-ol der Formel I
Figure imgf000002_0001
und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung des S-Enantiomers l-S.
Das S-Enantiomer des Aminopropanols I der Formel l-S
Figure imgf000002_0002
OH
ist eine wichtige Vorstufe für die Synthese des Antidepressivums Duloxetine der Formel II
Figure imgf000002_0003
worin B für einen n-fach negativ geladenen anorganischen oder organischen Säurerest steht und HnB für eine pharmazeutisch verträgliche Säure.
Verfahren des Standes der Technik zur Herstellung von Duloxetine bzw. ihrer korrespondierenden Base sind aufwendig und erfordern den Einsatz chiraler Reagenzien oder chiraler Edukte.
So beschreibt die EP-B-0273658 ein Verfahren zur Herstellung der korrespondierenden Base von Duloxetine durch Umsetzung von 2-Acetylthiophen in einer Mannich- Reaktion mit Formaldehyd und Dimethylamin, Reduktion der Ketogruppe der dabei erhaltenen Mannich-Base zum racemischen (S)-3-N,N-Dimethylamino-1-(thien-2- yl)propan-1-ol, Veretherung der Alkoholfunktion mit Naphthylfluorid und schließlich Umwandlung der Dimethylamino-Gruppe in eine Methylamino-Funktion. Das gewünschte Enantiomer des Naphtylethers erhält man durch Einsatz chiraler Ausgangsmaterialien oder durch Racemattrennung auf der Stufe des Endprodukts, beispielsweise über die Salze mit optisch aktiven Säuren oder Chromatographie an einer chiralen stationären Phase.
Die US-5,362,886 beschreibt ein analoges Verfahren, bei dem das nach Reduktion der Ketogruppe erhaltene racemische Propanol mit S-Mandelsäure versetzt wird. Das hierbei erhaltene S-Enantiomer des Alkohols wird in die nachfolgenden Reaktionsstu- fen eingesetzt.
Die EP-A-0457559 beschreibt ebenfalls ein der EP-B-0273658 analoges Verfahren. Hierbei wird die Ketogruppe der Mannich-Base mit dem asymmetrischen Reduktionssystem LAH-Icb (Lithiumaluminiumhydrid-[(2R,2S)-(-)-4-Dimethylamino-1 ,2-diphenyl-3- methyl-2-butanol]) zum Alkohol in Form des S-Enantiomers reduziert. Nachteilig hierbei ist neben den Kosten die Empfindlichkeit des Reduktionssystems LAH-Icb, das nur wenige Minuten stabil ist.
Auch W. J. Wheeler und F. Kuo beschreiben in Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, Band XXXVI, Nr. 3, Seite 213 bis 223 ein Verfahren zur Herstellung von Duloxetine. Hierzu wird Thiophen-2-carbonsäurechlorid in einer Stille- Kopplung mit Vinyl-tri-n-butylstannan in Gegenwart katalytischer Mengen Benzylchlor- bis(triphenylphosphin)palladium(ll) in DMPU (Dimethylpropylenharnstoff) zu 1-(Thien- 2-yl)-propenon der Formel II
Figure imgf000003_0001
umgesetzt, welches anschließend durch Behandlung mit Chlorwasserstoff in 3-Chlor- 1-(thien-2-yl)-propan-1-on der Formel II 1.1
Figure imgf000003_0002
überführt wird. Das so erhaltene Chlorpropanon III.1 wird anschließend unter Verwendung eines chiralen Oxazaborolidins und BH3 zu (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)- propan-1-ol der Formel IV.1-S
Figure imgf000003_0003
OH reduziert. Der so erhaltene Alkohol IV.1-S wird durch sukzessive Umsetzung mit Natri- umiodid und anschließend mit Methylamin in (S)-3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan- 1-ol l-S überführt. Durch nachfolgende sukzessive Umsetzung mit Natriumhydrid, 1- Fluornaphtalin und Chlorwasserstoff erhält man Duloxetine in Form des Hydrochlorids. Von Nachteil ist hierbei zum einen, dass zur Herstellung des Chlorpropanon- Zwischenprodukts III.1 zahlreiche Schritte und teure Reagenzien erforderlich sind. Zum anderen wird bei der Überführung des Chlorpropanons II 1.1 in den A inoalkohol das Chlorpropanol IV.1-S isoliert. Untersuchungen der Anmelderin haben jedoch gezeigt, dass dieses Chlorpropanol empfindlich ist und sich in einer stark exothermen Reaktion leicht zersetzt, was nicht nur zu Ausbeuteverlusten bezüglich des Aminoal- kohols führt, sondern auch die Handhabung der Reaktion in technischem Maßstab erschwert.
Verfahren zur Herstellung des von W. J. Wheeler et al. beschriebenen, bei der Syn- these von Duloxetine als Zwischenprodukt auftretenden 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan- 1-ons sind literaturbekannt. Nachteilig bei den bekannten Verfahren des Standes der Technik ist jedoch, dass entweder das Chlorpropanon III.1 in schlechter Ausbeute anfällt oder mit schwierig handzuhabenden Reagenzien gearbeitet werden muss. So beschreiben A. Etienne et al. in CR Acad. Sei., Ser. C, 1979, 288 (1), 49-52, die Herstel- lung des Chlorpropanons III.1 durch Friedel-Crafts-Reaktion von Thiophen mit 3-
Chlorpropionylchlorid in Gegenwart von Aluminiumtrichlorid als Lewissäure-Katalysator und in Nitromethan als Lösungsmittel. Das Chlorpropanon III.1 wird in einer Ausbeute von nur 7% erhalten. Auch die entsprechende, von Liu et al. in Chirality, 12, 26-29 (2000), beschriebene Umsetzung in Gegenwart von Zinntetrachlorid als Lewissäure- Katalysator und Benzol als Lösungsmittel führt zu unbefriedigenden Ausbeute. Meth- Cohn et al. beschreiben in Acta Chem. Scand. B 20 (6), 1577-1587 (1966) die entsprechende Friedel-Crafts-Acylierung an Thiophen in Gegenwart von Eisentrichlorid bzw. Aluminiumtrichlorid, wobei das Chlorpropanon II 1.1 in mäßigen bis guten Ausbeuten entsteht. Nachteilig ist hierbei, dass als Lösungsmittel Schwefelkohlenstoff ver- wendet werden muss.
Kamal, G. B. R. Khanna, R. Ramu und T. Krishnaji beschreiben in Tetrahedron Lett. 44, 2003, 4783-4787 die Herstellung der Duloxetine-Vorstufe (S)-3-Hydroxy-3-(thien-2- yl)-propannitril durch Acetylierung von Thiophen mit Chloracetylchlorid, Reduktion des Ketons mit Natriumborhydrid zum racemischen Alkohol, Substitution des Chlorrestes durch Cyanid und Umsetzung des racemischen Nitrilalkohols mit Vinylacetat in Gegenwart einer Lipase aus Pseudomonas cepacia (immobilisiert auf Diatomit), wobei die Lipase selektiv die Veresterung des R-Enantiomers katalysiert, so dass das gewünschte S-Enantiomer, welches unverestert bleibt, in reiner Form isoliert werden kann. Von Nachteil ist hierbei zum einen die große Anzahl an erforderlichen Reaktionsschritten und zum anderen der Verlust der Hälfte des Nitrilalkohols, da der ve- resterte R-Anteil nicht weiter zu Duloxetine umgesetzt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol I bereitzustellen, welches die hier geschilderten Nachteile des Standes der Technik überwindet. Zudem sollte es die Verbindung I in guter Gesamtausbeute liefern und insbesondere auch die enantioselektive Herstellung des S-Enantiomer l-S erlauben.
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass man zunächst Thiophen in einer Friedel- Crafts-Reaktion mit einem ß-Halogenpropionsäurehalogenid oder einem Acrylsäureha- logenid in Gegenwart einer Lewissäure umsetzt, wobei man vor der Isolierung des Reaktionsprodukts einen Halogenwasserstoff einleitet. Anschließend reduziert man die Ketogruppe des dabei erhaltenen 3-Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-ons der Formel III
Hai = Halogen und setzt das reduzierte Produkt der Formel IV
Figure imgf000005_0002
mit Methylamin um.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von 3- Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol der Formel I
Figure imgf000005_0003
bei dem man
a) Thiophen mit einem ß-Halogenpropionsäurehalogenid oder einem Acrylsäureha- logenid in Gegenwart einer Lewis-Säure zu einem 3-Halogen-1-(thien-2-yl)- propan-1-on umsetzt, wobei man gleichzeitig oder nach erfolgter Umsetzung, je- doch vor der Isolierung des Reaktionsprodukts, einen Halogenwasserstoff einleitet und
b) das in Schritt a) erhaltene Propanon reduziert und anschließend, vorzugsweise ohne Isolierung des Reaktionsprodukts, mit Methylamin umsetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert die Zielverbindung I in guten Gesamtausbeuten. Die Herstellung der Halogenpropanon-Zwischenstufe IM ist zudem nicht an den Einsatz teurer zinnorganischer Reagenzien gekoppelt. Das schwierig handzuhabende Halogenpropanol IV braucht nicht isoliert zu werden. Zudem erlaubt das Verfahren in einfacher Weise eine enantioselektive Herstellung des S-Enantiomers l-S, indem man die Reduktion der Halogenpropenon-Zwischenstufe III in Gegenwart eines chiralen Katalysators oder eines chiralen Reduktionsmittels durchführt, welche eine Selektivität bezüglich der Bildung von (S)-3-Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol l-S aufweisen.
„Enantioselektivität" im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass der Enan- tiomerenüberschuss ee (in %) des S-Enantiomers, der sich in bekannter Weise berechnet nach:
ee (%) = [S-Enantiomer - R-Enantiomer / (S-Enantiomer - R-Enantiomer)] x 100
wenigstens 50 %, vorzugsweise wenigstens 80 %, insbesondere wenigstens 90 % und speziell wenigstens 95 % beträgt.
Durch das Einleiten eines Halogenwasserstoffs während oder vorzugsweise nach er- folgter Acylierung, jedoch vor der Isolierung des Reaktionsprodukts, erhält man als Endprodukt des Schrittes a) im Wesentlichen kein 1 -Thien-2-yl-propenon II, welches bei den Verfahren des Standes der Technik stets als Nebenprodukt auftritt und die Ausbeute an gewünschtem Acylierungsprodukt III schmälert.
Als Lewis-Säure kommen kovalente Metallhalogenide und Halbmetallhalogenide, die eine Elektronenpaarlücke aufweisen, in Betracht. In der Regel sind sie ausgewählt unter Halogenverbindungen des Titans, Zinns, Aluminiums, Vanadiums, Eisens oder Bors. Bevorzugt sind die Chloride; im Falle des Aluminiums sind jedoch auch die Mo- noalkylaluminiumdichloride und die Dialkylaluminiumchloride geeignet. Im Falle des Bors ist auch das Fluorid geeignet. Beispiele für geeignete Lewis-Säuren sind Titantetrachlorid, Bortrichlorid, Bortrifluorid, Zinntetrachlorid, Vanadiumpentachlorid, Ei- sentrichlorid, Aluminiumtrichlorid, Alkylaluminiumdichloride und Dialkylaluminiumchloride. Besonders bevorzugt verwendet man Aluminiumtrichlorid.
Geeignete ß-Halogenpropionsäurehalogenide sind 3-Chlorpropionsäurechlorid und 3- Brompropionsäurebromid oder -Chlorid. Vorzugsweise verwendet man 3-Chlorpropion- säurechlorid.
Als Acrylsäurehalogenid wird vorzugsweise Acrylsäurechlorid verwendet.
Vorzugsweise setzt man in Schritt a) als Acylierungsmittel ein ß-Halogenpropionsäurehalogenid ein.
Geeignete Halogenwasserstoffe sind Chlorwasserstoff und Bromwasserstoff. Vor- zugsweise setzt man einen Halogenwasserstoff ein, in welchem das Halogenatom dem ß-Halogenrest im eingesetzten ß-Halogenpropionsäurehalogenid entspricht. Dementsprechend verwendet man bei Einsatz von 3-Chlorpropionsäurechlorid vorzugsweise Chlorwasserstoff.
Als Lösungsmittel für die Umsetzung in Schritt a) sind sämtliche Lösungsmittel geeignet, die üblicherweise in Friedel-Crafts-Acylierungsreaktionen eingesetzt werden. Ge- eignet sind grundsätzlich aprotische Lösungsmittel, welche die Reaktivität der eingesetzten Reagenzien, insbesondere der Lewis-Säure, nicht herabsetzen bzw. mit der Lewis-Säure unter den gegebenen Reaktionsbedingungen keine Konkurrenzreaktionen eingehen. Beispiele hierfür sind der zu acylierende Aromat selbst (d.h. Thiophen), aromatische Kohlenwasserstoffe, die im Vergleich zu Thiophen deutlich schwerer acy- liert werden, wie Benzol, Nitrobenzol und halogenierte aromatische Kohlenwasserstoffe, z.B. Chlorbenzol und Dichlorbenzol, des weiteren halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, insbesondere Halogenalkane, wie Chlormethan, Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Chlorethan, Di- und Trichlorethan. Geeignet sind auch Gemische der vorstehend genannten Lösungsmittel. Vorzugsweise verwendet man Lösungsmittel, in denen die Friedel-Crafts-Acylierung im Wesentlichen homogen ablaufen kann, wie Nitrobenzol oder halogenierte Kohlenwasserstoffe. Bevorzugt sind insbesondere halogenierte aromatische oder aliphatische Kohlenwasserstoffe, wobei Halogenalkane besonders bevorzugt sind. Speziell verwendet man Dichlorethan oder Chlorbenzol.
Die Lewis-Säure muss in wenigstens äquimolaren Mengen, bezogen auf die theoretisch zu erreichende Menge an acyliertem Thiophen, eingesetzt werden, da sie mit dem bei der Acylierung gebildeten Keton einen Komplex bildet, der unter den üblichen Reaktionsbedingungen der Friedel-Crafts-Reaktion stabil ist. Vorzugsweise wird sie in einem Molverhältnis von 1 :1 bis 1 :2, besonders bevorzugt von 1 :1 bis 1 :1 ,5 und insbesondere von 1 :1 ,1 bis 1 :1 ,5, bezogen auf 1 Mol der in geringerem Anteil eingesetzten Acylierungskomponente (Thiophen oder ß-Halogenpropionsäurehalogenid) eingesetzt.
Thiophen und das ß-Halogenpropionsäurehalogenid werden in einem Molverhältnis von vorzugsweise 1 :0,5 bis 1 :2, besonders bevorzugt von 1 :0,7 bis 1 :1 ,5 und insbesondere von 1 :0,8 bis 1 :1 ,2 eingesetzt.
Die Reihenfolge, in welcher bei der Friedel-Crafts-Acylierung die Reagenzien zusam- mengegeben werden, ist von untergeordneter Bedeutung. So kann man beispielsweise die Lewis-Säure im Lösungsmittel vorlegen und zuerst das ß-Halogenpropionsäurehalogenid und anschießend das Thiophen zugeben. Alternativ kann man Thiophen und Lewis-Säure vorlegen und mit dem ß-Halogenpropionsäurehalogenid versetzen.
In der Regel ist es günstig, bei der Zugabe des ß-Halogenpropionsäurehalogenids zu kühlen, da die Reaktion der Lewis-Säure mit dem Säurehalogenid in der Regel stark exotherm verläuft. Die Reaktionstemperatur wird u.a. in Abhängigkeit vom Lösungsmittel gewählt. Üblicherweise liegt sie im Bereich von 10 °C bis 40 °C. Bei Verwendung von Halogenkohlenwasserstoffen, insbesondere von Halogenalkanen beträgt die Re- aktionstemperatur geeigneterweise höchstens 50 °C, da ansonsten das Lösungsmittel selbst in Reaktion tritt. Vorzugsweise beträgt die Reaktionstemperatur -20 °C bis 40 °C, besonders bevorzugt 0 bis 30 °C.
Der Reaktionsdruck ist prinzipiell nicht kritisch. Im Allgemeinen wird die Reaktion bei Normaldruck durchgeführt; sie kann jedoch auch bei Über- oder Unterdruck erfolgen.
Überdruck wird beispielsweise angewendet, wenn das Lösungsmittel leichtflüchtig ist oder unter Normalbedingungen nicht flüssig ist, wie dies beispielsweise bei Chlormethan der Fall ist.
Die Einleitung des Halogenwasserstoffs erfolgt vorzugsweise nach erfolgter Acylie- rung. Die Beendigung der Acylierungsreaktion kann nach üblichen Verfahren des Standes der Technik festgestellt werden, z.B. durch Gaschromatographie, Dünnschichtchromatographie oder NMR-Spektroskopie. Die Dauer der Einleitung hängt unter anderem von der Ansatzgröße ab und kann vom Fachmann im Einzelfall bestimmt werden. In der Regel erfolgt sie mindestens so lange, bis kein 1-Thien-2-yl- propenon mehr nachgewiesen werden kann.
Zur Aufarbeitung des Acylierungsprodukts wird das Reaktionsgemisch in der Regel zunächst hydrolytisch aufgearbeitet, um den gebildeten Keton-Lewis-Säure-Komplex zu spalten. Zur Hydrolyse verwendet man üblicherweise Wasser oder auch verdünnte wässrige Mineralsäuren, z.B. verdünnte Salzsäure. Die weitere Reinigung und Isolierung erfolgt nach bekannten Verfahren, wie sie beispielsweise in Organikum, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, 17. Auflage, 1988, S. 323 ff. beschrieben sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt in Schritt a) zu einem 3-Halogen-(thien-2-yl)-1- propanon III in hohen Ausbeuten. Im Verlauf der Acylierungsreaktion gegebenenfalls gebildetes 1-Thien-2-yl-propenon II wird im wesentlichen vollständig in das 3-Halogen- (thien-2-yl)-1 -propanon III überführt, so dass das Reaktionsgemisch höchstens 1 Molo/o, besonders bevorzugt höchstens 0,5 Mol-% Propenon II, bezogen auf die Ausbeute an 3-Halogen-(thien-2-yl)-1 -propanon III, enthält.
Die Reduktion des Propanons III in Schritt b) gelingt beispielsweise mit einem Metalloder Halbmetallhydrid oder mit Wasserstoff in Gegenwart eines geeigneten Übergangsmetallkatalysators.
Geeignete Metall- oder Halbmetallhydride sind sowohl die neutralen als auch die komplexen Hydride von Metallen bzw. Halbmetallen. Günstigerweise verwendet man Metall- oder Halbmetallhydride, die sich bei der Reduktion von Ketonen zu Alkoholen bewährt haben. Vorzugsweise handelt es sich um die Hydride des Bors oder des Aluminiums.
Geeignete neutrale Hydride sind beispielsweise Boran (BH3; B2H6), Alan (AIH3), Silan (SiH4), Mono- und Dialkylborane, wie Bis(3-methylbut-2-yl)boran (Disiamylboran) oder 9-Borabicyclo[3.3.1]nonan (9-BBN), Mono- und Dialkylaluminiumverbindungen, wie Diisobutylaluminiumhydrid (DIBAL-H), und Trialkylsilane, wie Trimethylsilan oder Triethylsilan.
Geeignete komplexe Hydride sind beispielsweise komplexe Borhydride, wie Natriumborhydrid (NaBH4), Lithiumborhydrid (LiBH4) oder Calciumborhydrid Ca[BH4]2, komplexe Aluminiumhydride, wie üthiumaluminiumhydrid(LiAIH4), komplexe Alkyl- oder Alko- xyborhydride, wie Lithiumtriethylborhydrid oder Kaliumtriϊsopropoxyborhydrid
(KB[OCH(CH3)2]3H), oder komplexe Alkyl- oder Alkoxyaluminiumhydride, wie Natrium- diethylaluminiumhydrid, Lithiumbis(2-methoxyethoxy)aluminiumhydrid (Li- AI[OC2H4OCH3]2H2), Natriumbis(2-methoxyethoxy)aluminiumhydrid (NaAI[OC2H4OCH3]2H2; "RedAI") oder Lithiumaluminiumtris(tert-butoxy)hydrid (Li- AI[OC(CH3)3]3H) und dergleichen.
Für die Reduktion mit Metall- oder Halbmetallhydriden geeignete Lösungsmittel hängen insbesondere vom verwendeten Reduktionsmittel ab und sollten selbstverständlich keine Gruppen enthalten, die unter den Reaktionsbedingungen ebenfalls reduziert werden. So führt man die Reduktion mit den vorstehend genannten Hydriden vorzugs- weise in aprotischen Lösungsmitteln ohne funktionelle Gruppen, die unter den gegebenen Reaktionsbedingungen reduzierbar sind, durch. Beispiele hierfür sind aromatische und aliphatische Kohlenwasserstoffe, beispielsweise C5-C8-Alkane und C5-C8- Cycloalkane, wie Pentan, Hexan, Heptan, Cyclopentan, Cyclohexan und Cyclooctan, Aromaten, wie Benzol, Toluol, Nitrobenzol, Chlor- und Dichlorbenzol, weiterhin offen- kettige und cyclische Ether mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Diethylether, Methyl- tert-butylether, Tetrahydrofuran oder Dioxan, ferner chlorierte Kohlenwasserstoffe, insbesondere Halogenalkane, wie Chlormethan, Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Di- oder Trichlorethan. Geeignet sind auch Gemische der vorstehend genannten Lösungsmittel. Vorzugsweise verwendet man die vorstehend genannten aromatischen Kohlenwasserstoffe, Ether oder Halogenkohlenwasserstoffe.
Die Reduktion mit einigen der oben genannten komplexen Hydride, insbesondere mit weniger reaktiven Hydriden, wie Natriumborhydrid, gelingt auch in Gegenwart proti- scher Lösungsmittel, z.B. von CrC3-Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol oder Isopropanol, oder sogar in wässriger Lösung. In diesem Fall verwendet man vorzugsweise ein Gemisch aus wenigstens einem der zuvor genannten aprotischen Lösungsmittel und wenigstens einem Alkohol. Da die Hydride in basischen protischen Lösungen stabiler sind, erfolgt die Umsetzung bei Verwendung protischer Lösungsmittel vorzugsweise in Gegenwart einer geeigneten Base. Geeignete Basen sind beispielsweise Alkalimetallhydroxide, wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkylimetallcarbonate, wie Natrium- oder Kaliumcarbonat. Vorzugsweise verwendet man Natriumhydroxid.
Die Reduktion mit vielen der zuvor genannten Metall- oder Halbmetallhydride verläuft häufig exotherm, so dass die Umsetzung geeigneterweise unter Abführung der Reak- tionswärme, d.h. unter Kühlung durchgeführt wird. Die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise -50 bis 40 °C, besonders bevorzugt -30 bis 30 °C und insbesondere - 20 bis 20 °C. Die Reduktion kann nach üblichen Verfahren des Standes der Technik durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Organikum, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, 17. Auflage, 1988, S. 492 ff. beschrieben sind. Dabei legt man in der Regel das Propanon III vor und gibt das Reduktionsmittel portionsweise zu. Es ist jedoch auch möglich, Propanon III und Reduktionsmittel gleichzeitig portionsweise zuzugeben.
Die Reduktion des Propanons III gelingt beispielsweise auch mit einem Aluminiumal- koholat. Die Reduktion von Ketonen mit einem Aluminiumalkoholat bezeichnet man üblicherweise auch als Meerwein-Ponndorf-Verley-Reduktion. Dabei wird ein Keton in den entsprechenden Alkohol überführt und das Alkoholat wird gleichzeitig zum entsprechenden Aldehyd (bei Alkoholaten primärer Alkohole) bzw. Keton (bei Alkoholaten sekundärer Alkohole) oxidiert. Die Durchführung der Reaktion kann nach bekannten Verfahren erfolgen, wie sie beispielsweise in Organikum , VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, 17. Auflage, 1988, S. 486 ff. beschrieben sind.
Die Reduktion des Propanons III gelingt außerdem auch durch katalytische Hydrierung, d.h. durch Umsetzung des Propanons III mit Wasserstoff in Gegenwart geeigneter Übergangsmetallkatalysatoren. Zu den geeigneten Ü ergangsmetallen zählen die Metalle der Nebengruppen VIII, VI und I, insbesondere Platin, Ruthenium, Kupfer, Chrom und Nickel. Die Katalysatoren müssen selbstverständlich so gewählt werden, dass sie die Hydrierung der Thiophengruppe nicht katal/sieren. Die Katalysatoren können sowohl als Heterogen- als auch als Homogenkatalysatoren eingesetzt werden. Geeignete Verfahren sind prinzipiell bekannt und beispielsweise in Transition Metals in Organic Synthesis. M. Beller, C. Bolm, Wiley-VCH, Weinheim, 1998, Band 2, Seite 1 ff. (Homogenkatalysatoren) bzw. Seite 81 ff. (Heterogen katalysatoren) beschrieben.
Die Reduktion in Schritt b) erfolgt vorzugsweise mit einem Metall- oder Halbmetallhydrid und besonders bevorzugt mit einem der vorstehen genannten komplexen Metall- oder Halbmetallhydride. Speziell setzt man Natriumborhydrid ein.
Mit den vorstehend beschriebenen nicht asymmetrischen Reduktionsmitteln wird das prochirale 3-Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-on IM vornehmlich zu dem racemischen Alkohol IV reduziert. Die nachfolgende Umsetzung mit Methylamin führt entsprechend zum racemischen 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1 -ol I.
In einer bevorzugten Ausführungsform dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von (S)-3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol der Formel l-S
Figure imgf000010_0001
OH
bzw. des Gemischs mit seinem R-Enantiomer l-R, wobei das Enantiomer l-S im Gemisch überwiegt, wobei man die Reduktion in Schritt b) in Gegenwart eines chiralen Reduktionsmittels oder eines chiralen Katalysators durchführt, welche eine Selektivität bezüglich der Bildung von (S)-3-Methylamino-1-(thien-2-yl)propan-1-ol l-S aufweisen.
Hierbei wird das prochirale Halogenpropanon III in Schritt b) enantioselektiv zum S- Halogenpropanol der Formel IV-S
Figure imgf000010_0002
OH bzw. zu einem Gemisch aus S- und R-Enantiomer, in welchem das S-Enantiomer ü- berwiegt, reduziert. Zu diesem Zweck setzt man in Schritt b) als Reduktionsmittel beispielsweise ein asymmetrisches Metall- oder Halbmetallhydrid oder führt die Reduktion in Gegenwart einer asymmetrische Induktion vermittelnden Verbindung durch.
Bei den asymmetrischen Metall- oder Halbmetallhydriden handelt es sich vorzugsweise um asymmetrische Aluminium-, Bor- oder Siliciumhydride. Geeignete asymmetrische Borhydride sind beispielsweise in E. J. Corey, C. J. Helal, Angew. Chem. 1998, 110, 2092-2118 oder in M. M. Midland, L. A. Morell, Methoden Org. Chem., Houben- Weyl, 4. Aufl., Band E 21d, S. 4082-4098, 1995 beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. Geeignete asymmetrische Siliciumhydride sind unter anderem in H. Brunner, Methoden Org. Chem., Houben-Weyl, 4. Aufl., Band E21d, S. 4074-4081 , 1995 beschrieben, worauf ebenfalls in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Unter asymmetrische Induktion vermittelnde Verbindungen versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche, die durch Beeinflussung des eigentlichen Reduktionsmittels, z.B. durch Bindungsbildung oder Komplexbildung mit dem Reduktionsmittel oder durch Aufnahme eines Wasserstoffatoms oder eines anderen reduktiven Be- Standteils aus dem Reduktionsmittel, die Reduktion des Propanons IM enantioselektiv gestalten. Die asymmetrische Induktion vermittelnden Verbindungen selbst sind in der Regel nicht reduzierend.
Hierzu gehören zum einen asymmetrische Hydrierkatalysatoren. Bei der asymmetri- sehen Hydrierung dient Wasserstoff als eigentliches Reduktionsmittel, während der asymmetrische Katalysator die enantioselektive Bildung eines der möglichen Enantio- ere begünstigt. Die Hydrierung kann sowohl in heterogener als auch in homogener Phase erfolgen. Geeignete Katalysatoren für die asymmetrische Hydrierung in heterogener Phase sind beispielsweise in A. Baiker, H. U. Blaser in Handbook of Heteroge- neous Catalysis, Band 5 (Herausgeber G. Ertl, H. Knörzinger, J.Weitkamp), Wiley- VCH, Weinheim, 1997, 2422-2436, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird, beschrieben.
Von größerer Bedeutung sind jedoch Katalysatoren für die Hydrierung in homogener Phase. Besonders geeignet sind Katalysatoren, die ein Metall der Nebengruppe VIII, z.B. Platin oder Ruthenium, insbesondere Ruthenium, und wenigstens einen phos- phorhaltigen Liganden enthalten. Geeignete Katalysatoren sind beispielsweise in R. Noyori, T. Ohkuma, Angew. Chem. 2001 , 113, 40-75 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. Insbesondere sind Ruthenium(ll)- Diaminkomplexe geeignet, in denen das Ruthenium außerdem an einen zweizähnigen chiralen Diphosphanliganden gebunden ist. Beispiele für Diphosphanliganden, die für die Reduktion des Halogenpropanons III zum S-Halσgenpropanol IV-S geeignet sind, sind (R)-BINAP der Formel A, (R,R)-DIOP der Formel B und (R,R)-CHIRAPHOS der Formel C
Figure imgf000012_0001
A B
Ar = Phenyl (BINAP) Ph = Phenyl 4-Methylphenyl (TolBINAP) 3,5-Dimethylphenyl (XylBINAP)
Außerdem enthalten besonders bevorzugte Katalysatoren einen Diaminliganden. Beispiele für geeignete Diaminliganden sind 1 ,2-Ethylendiamin, 1 ,2-Diphenyl-1 ,2- Ethylendiamin und 1 ,2-Cyclohexandiamin in ihren enantiomeren Formen.
Die Hydrierung erfolgt in der Regel unter den zuvor besc riebenen Bedingungen.
Eine besonders bevorzugte asymmetrische Induktion vermittelnde Verbindung ist das Oxazaborylidin der Formel D
Figure imgf000012_0002
worin R für C-|-C4-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, Isobutyl oder tert-Butyl und insbesondere für Methyl steht.
Mit diesem Reagenz sind prochirale Ketone mit hoher Enantioselektivität in sekundäre Alkohole überführbar (E. J. Corey, Pure Appl. Chem. 62, 1209, 1990; E. J. Corey, J. O. Link, J. Am. Chem. Soc. 114, 1906, 1992). Als eigentliches Reduktionsmittel dienen Borane, z.B. BH3, Dialkylborane, Dialkoxyborane oder Diaryloxyborane. Die Umsetzung des Chlorpropanons III.1 mit dem Oxazaborylidin D (R = Methyl) und BH3zum S- Chlorpropanol IV.1-S wurde bereits von W. J. Wheeler und F. Kuo in Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, Band XXXVI, Nr. 3, S. 213-223 beschrieben.
Bei der Reduktion wird das Oxazaborylidin in der Regel in katalytischen Mengen eingesetzt. Das Boran wird in wenigstens äquimolaren Mengen, bezogen auf das Halo- genpropanon III, vorzugsweise jedoch im Überschuss verwendet. Die Reaktion erfolgt meist in geeigneten Lösungsmitteln. Geeignete Lösungsmittel sind aprotische Lö- sungsmittel, die keine unter den gegebenen Reaktionsbedingungen reduzierbare Gruppen besitzen. Hierzu zählen insbesondere die zuvor genannten Halogenalkane, Aromaten und cyclischen oder acyclischen Ether. Bevorzugt verwendet man Ether, wobei Tetrahydrofuran besonders bevorzugt ist. Die Reaktionstemperatur beträgt vor- zugsweise -80 bis 20 °C, besonders bevorzugt -30 bis 10 °C. Die Durchführung erfolgt in der Regel so, dass man das Oxazaborylidin im Lösungsmittel vorlegt und bei der gewünschten Reaktionstemperatur entweder zuerst das Boran und anschließend das Halogenpropanon III oder umgekehrt zuerst das Halogenpropanon III und anschließend das Boran zufügt, wobei der erste Zugabemodus bevorzugt ist. Die Reakti- onsdauer ist unter anderem von der Ansatzgröße abhängig und kann im Einzelfall vom Fachmann bestimmt werden.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die enantioselektive Reduktion des Propanons III zum S-Halogenpropanol IV-S auf enzymkatalysierem Weg , insbesonde- re in Gegenwart einer Dehydrogenase, gut gelingt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher eine Dehydrogenase als Reduktionsmittel eingesetzt.
Nach beendeter Reduktion wird im erfindungsgemäßen Verfahren je nach verwende- tem Reduktionsverfahren der eingesetzte Katalysator bzw. überschüssiges Reduktionsmittel gegebenenfalls desaktiviert bzw. entfernt. Bei der Verwendung von Metalloder Halbmetallhydriden erfolgt dies in der Regel durch Hydrolyse, beispielsweise mit einer wässrigen oder alkoholischen Lösung. Auch bei der Verwendung homogener Hydrierungskatalysatoren oder bei der Reduktion mit Aluminiumalkoholaten wird häufig hydrolytisch aufgearbeitet. Erfolgt die Reduktion in Form einer katalytischen Hydrierung in heterogener Phase oder mit einem Enzym als Reduktionsmittel, so kann der Katalysator bzw. das Enzym durch physikalische Trennung, z.B. durch Abdekantieren oder Filtration entfernt werden. Bei der Verwendung homogener Reduktionssysteme, insbesondere bei der Reduktion mit Metall- oder Halbmetallhydriden, wird vorzugswei- se jedoch zunächst nicht desaktiviert.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn man nach der Reduktion das erhaltene Halogenpropanol IV nicht isoliert, sondern direkt mit Methylamin zum 3-Methylamino-1- (thien-2-yl)-propan-1-ol I umgesetzt. Hierzu wird das gegebenenfalls desaktivierte bzw. von heterogenen Reduktionssystemen abgetrennte Reaktionsgemisch mit Methylamin versetzt und vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, beispielsweise bei 30 bis 80 °C, insbesondere bei 50 bis 70 °C, umgesetzt. Das Methylamin kann entweder gasförmig oder als wässrige Lösung eingesetzt werden, wobei die Verwendung als wässrige Lösung bevorzugt ist. Vorzugsweise wird es in einer Menge von 1 bis 100 Moläquivalen- ten, besonders bevorzugt von 5 bis 10 Moläquivalenten, bezogen auf die Menge des eingesetzten Halogenpropanon IM, eingesetzt. Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise bei einem Druck von 1 bis 250 bar und insbesondere unter dem Eigendruck, den das System selbst erzeugt.
Nach erfolgter Umsetzung mit Methylamin wird das Reaktionsgemisch in üblicher Weise aufgearbeitet. Hierzu wird, falls das nicht schon vor der Methylamin-Zugabe erfolg- te, der Katalysator bzw. das Reduktionsmittel wie bereits beschrieben desaktiviert und abgetrennt, das Lösungsmittel wird entfernt und aus dem Rückstand wird sauberes Methylaminopropanol I beispielsweise durch Kristallisation, Digerieren, Extraktion oder Chromatographie isoliert.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol I in guten Ausbeuten erhältlich. Insbesondere sind in Schritt a) des Verfahrens keine teuren oder aufwändig handzuhabenden Reagenzien oder Lösungsmittel erforderlich und das Halogenpropanon III entsteht in sehr hohen Ausbeuten. In Schritt b) wird die Isolierung des empfindlichen Halogenpropanols IV und ein damit verbundener Ausbeuteverlust bzw. die schwierige Handhabung des Halogenpropanols IV vermieden. Außerdem ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren das S-Enantiomer des Methylami- nopropanols l-S, welches für die weitere Umsetzung zu Duloxetine wesentlich ist, selektiv erhältlich, wenn in Schritt b) die Reduktion mit einem chiralen Reduktionsmittel erfolgt.
Ein weitere Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von (S)-3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol der Formel l-S, bei dem man ein 3-Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-on III enantioselektiv reduziert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Reduktion in Gegenwart einer Dehydrogenase erfolgt. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das dabei erhaltene (S)-3-Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol IV-S ohne Isolierung mit Methylamin umgesetzt. Bezüglich geeigneter und bevorzugter Dehydrogenasen und der Durchführung des Verfahrens wird auf die folgenden Ausführungen ausdrücklich verwiesen.
Biochemische Ausführungsformen:
Geeignete Dehydrogenasen (EC 1.1. X.X) sind vor allem Dehydrogenasen (E.G. 1.1.1.x) insbesondere Alkohol Dehydrogenasen (E.C.1.1 .1.1 oder E.G.1.1.1.2), welche die selektive Reduktion des Halogenpropanons III zum S-Halogenpropanol IV-S bewirken. Die Dehydrogenase wird bevorzugt aus einem Mikroorganismus, besonders bevorzugt aus einem Bakterium, einem Pilz, insbesondere einer Hefe, jeweils hinterlegt in Stammsammlungen oder erhältlich aus Isolaten natürlicher Quelle, wie Bodenproben, Biomasseproben und dergleichen gewonnen. Insbesondere stammt die Dehydro- genäse aus einer Hefe oder einem Milchsäurebakterium.
Die Dehydrogenase kann in gereinigter oder teilweise gereinigter Form oder in Form des Mikroorganismus selbst verwendet werden. Verfahren zur Gewinnung und Aufreinigung von Dehydrogenasen aus Mikroorganismen sind dem Fachmann hinreichend bekannt, z.B. aus K. Nakamura & T. Matsuda, „Reduction of Ketones" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2O02, Vol. III, 991-1032, Wiley- VCH, Weinheim. Rekombinante Verfahren zur Erzeugung von Dehydrogenasen sind ebenfalls bekannt, beispielsweise aus W. Hummel, K. Abokitse, K. Drauz, C. Rollmann und H. Gröger, Adv. Synth. Catal. 2003, 345, Nr. 1 + 2, S. 153-159. Geeignete Bakterien sind beispielsweise solche der Gattung Pseudomonas, Burkhol- deria, Agrobacterium, Rhodococcus, Lactobacillus oder Lactococcus. Geeignete Hefen sind beispielsweise solche der Gattung Geotrichum, Pichia, Candida, Hansenula oder Saccharomyces.
Besonders bevorzugt werden Dehydrogenasen aus Hefen und Milchsäurebakterien eingesetzt. Hierunter bevorzugt sind Dehydrogenasen, die aus Hefen der Gattung Geotrichum oder Candida oder die aus Milchsäurebakterien der Gattung Lactobacillus oder Lactococcus gewonnen werden.
Beispiele für Lactobacillus-Arten sind L. brevis, L. kefir, L. plantarum, L. casei, L. aci- dophilus, L. delbrueckii und L. sanfrancisco.
Beispiele für Candida-Arten sind C. magnoliae, C. rugosa, C. utilis, C. boidinii, C. pa- rapsilosis und C. antarctica.
Beispiele für Geotrichum-Arten sind G. candidum, G. clavatum und G. fermentans.
Besonders bevorzugt verwendet man Dehydrogenasen aus Candida magnoliae, Ge- otrichum candidum oder Lactobacillus brevis.
Üblicherweise erfolgt die Reduktion mit der Dehydrogenase in Gegenwart eines geeigneten Coenzyms (auch als Cofaktor bezeichnet). Als Coenzym für die Reduktion des Ketons dient üblicherweise NADH und/oder NADPH. Daneben können Dehydro- genasen als zelluläre Systeme eingesetzt werden, die inherent Cofaktor enthalten, oder alternative Redoxmediatoren zugesetzt werden (A. Schmidt, F. Hollmann und B. Bühler „Oxidation of Alcohols" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.lll, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim).
Üblicherweise erfolgt die Reduktion mit der Dehydrogenase außerdem in Gegenwart eines geeigneten Cosubstrats, welches in der Regel als Reduktionsmittel für das im Verlauf der Reduktion oxidierte Coenzym fungiert und diese somit regeneriert. Beispiele für geeignete Cosubstrate sind Zucker, insbesondere die Hexosen, wie Glucose, Mannose, Fructose, und/oder oxidierbare Alkohole, insbesondere Ethanol, Propanol oder Isopropanol, sowie Formiat. Zur Oxidation des Cosubstrates und damit verbunden zur Regeneration des Coenzyms kann eine zweite Dehydrogenase, wie z.B. Glucose Dehydrogenase bei Verwendung von Glucose als Cosubstrat, zugesetzt werden. Diese kann als freies oder immobilisiertes Enzym oder in Form von freien oder immobilisierten Zellen eingesetzt werden. Ihre Herstellung kann sowohl separat als auch durch Coexpression in einem (rekombinanten) Dehydrogenase-Stamm erfolgen.
Die erfindungsgemäß verwendeten Dehydrogenasen können frei oder immobilisiert eingesetzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf im- mobilisierten Enzyme sind aus der EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbo- nat, Cellulosepulver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Po- lystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Poly- ethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträger- ten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Sieblinie). Analog kann bei Einsatz der Dehydrogenase als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobi- liserte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Carragee- nan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross-Iinking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfahren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin „Immobilization of Enzymes" in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim beschrieben.
Die Reduktionsreaktion kann in wässrigen oder nichtwässrigen Reaktionsmedien oder in 2-Phasensystemen oder (Mikro-)Emulsionen erfolgen. Bei den wässrigen Reakti- onsmedien handelt es sich vorzugsweise um gepufferte Lösungen, die in der Regel einen pH-Wert von 5 bis 8, vorzugsweise von 6 bis 8, aufweisen. Das wässrige Lösungsmittel kann neben Wasser außerdem wenigstens einen Alkohol, z.B. Ethanol oder Isopropanol enthalten.
Unter nicht-wässrigen Reaktionsmedien sollen Reaktionsmedien verstanden werden, die weniger als 1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 0,5 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Gesamtgewicht des Reaktionsmediums, enthalten. Vorzugsweise wird die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit 5 bis 8 Koh- lenstoffatomen, wie Pentan, Cyclopentan, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Octan oder Cyclooctan, halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit einem oder zwei Kohlenstoffatomen, wie Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan oder Tetrachlorethan, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, To- luol, die Xylole, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol, aliphatische acyclische und cyclische Ether, vorzugsweise mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Diethylether, Methyl-tert- butylether, Ethyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tetra- hydrofuran oder Ester wie Ethylacetat oder n-Butylacetat oder Ketone wie Methylisobu- tylketon oder Dioxan oder Gemische davon. Besonders bevorzugt werden die vorgenannten Ether, insbesondere Tetrahydrofuran, verwendet.
Beispielsweise wird die Reduktion mit der Dehydrogenase in einem wässrig- organischen, insbesondere wässrigen Reaktionsmedium durchgeführt.
Das Halogenpropanon III wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 500 g/l, besonders bevorzugt von 1 g/l bis 50 g/I in die enzymatische Reduktion eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden. Die enzymatische Reduktion erfolgt in der Regel bei einer Reaktionstemperatur unterhalb der Desaktivierungstemperatur der eingesetzten Dehydrogenase und vorzugsweise bei wenigstens -10 °C. Besonders bevorzugt liegt sie im Bereich von 0 bis 100 °C, insbesondere von 15 bis 60 °C und speziell von 20 bis 40 °C, z.B. bei etwa 30 °C.
Zur Durchführung kann man beispielsweise das Halogenpropanon III mit der Dehydrogenase, dem Lösungsmittel und gegebenenfalls den Coenzym en, gegebenenfalls einer Hilfs-Dehydrogenase zur Regenerierung des Coenzyms und/oder weiteren Co- Substraten vorlegen und das Gemisch durchmischen, z. B. durch Rühren oder Schütteln. Es ist aber auch möglich, die Dehydrogenase(n) in einem Reaktor, beispielsweise in einer Säule, zu immobilisieren, und durch den Reaktor eine das Halogenpropanon III und gegebenenfalls Coenzyme und/oder Cosubstrate enthaltende Mischung zu leiten. Hierzu kann man die Mischung im Kreislauf durch den Reaktor leiten bis der ge- wünschte Umsatz erreicht ist. Dabei wird die Ketogruppe des Halogenpropanons III zu einer OH-Gruppe reduziert, wobei im Wesentlichen selektiv das S-Enantiomer des Halogenpropanols IV-S entsteht. In der Regel wird man die Reduktion bis zu einem Umsatz von wenigstens 70 %, besonders bevorzugt von wenigstens 85 % und insbesondere von wenigstens 95%, bezogen auf das in der Mischung enthaltene Halo- genpropanon III führen. Das Fortschreiten der Reaktion, d. h. die sequentielle Reduktion des Ketons, kann dabei durch übliche Methoden wie Gaschromatographie verfolgt werden.
Besonders bevorzugt werden als Dehydrogenasen im erfindungsgemäßen Verfahren Alkohol-Dehydrogenasen mit wenigstens einer der folgenden Eigenschaften eingesetzt:
Alkohol Dehydrogenasen, mit einer Aminosäuresequenz, die im Bereich des N- Terminus a) eine Aminosäureteilsequenz von wenigstens 5, 6, 7 oder 8, vorzugsweise wenigstens 10, wie z.B. 10, 11 , 12, 13, 14, oder 15, aufeinanderfolgenden Aminosäureresten gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst, wobei vorzugsweise zusätzlich die der Aminosäureposition 12 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechende Position für Valin steht; oder b) eine Aminosäureteilsequenz von wenigstens 5, 6, 7 oder 8, vorzugsweise wenigstens 10, wie z.B. 10, 11 , 12, 13, 14, oder 15, aufeinanderfolgenden Aminosäureresten ge- maß SEQ ID NO: 2 umfasst; und funktionale Äquivalente davon.
Alkohol Dehydrogenasen welche zur Reduktion von 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on zu (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol befähigt ist.
Alkohol Dehydrogenasen, welche die Reduktion in einer Enantiomerenreinheit von wenigstens wenigstens 85 % ee (in Gegenwart von NADH und/oder NADPH; bei 30°C und pH 6.0) katalysiert.
Alkohol Dehydrogenasen, welche von einer Nukleinsäuresequenz, umfassend SEQ ID NO:3, kodiert werden, oder welche eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder wenigstens eine Teilsequenz gemäß Figur 3 umfassen, und vorzugsweise aus Lactobacillus brevis erhältlich sind; sowie die davon abgeleiteten funktional äquivalenten Alkohol Dehydrogenasen.
Alkohol Dehydrogenasen, welche von einer Nukleinsäuresequenz, umfassend SEQ ID NO:5, kodiert werden, oder welche eine Aminosäuresequenz, umfassend SEQ ID NO: 6, aufweisen, und vorzugsweise aus Candida magnoliae (ATCC 1 2573) erhältlich sind; sowie die davon abgeleiteten funktional äquivalenten Alkohol Dehydrogenasen.
Ein weitere Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine (S)-3-Chlor-1-(thien- 2-yl)-propan-1-ol-Dehydrogenase mit wenigstens einer der vorstehend aufgeführten Eigenschaften.
Vorzugsweise liegt der Temperatur-Stabilitätsbereich der Dehydrogenase bei 10 bis 80 °C. Das Temperatur-Optimum ihrer Aktivität liegt vorzugsweise im Bereich von 20 bis 60 °C, besonders bevorzugt von 25 bis 40 °C. Der Stabilitätsbereich für den pH liegt vorzugsweise bei pH 4 bis 10 . Der optimale pH für die Dehydrogenierung liegt vorzugsweise im Bereich von pH 5 bis 8 .
Des weiteren ist die erfindungsgemäße Dehydrogenase vorzugsweise zur Dehydroge- nierung von (S)-3-ChIor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol zu 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1- on in Gegenwart von NAD+ oder NADP+ befähigt. Bevorzugt weist sie ein Molekulargewicht im Bereich von 30 ± 2 kDalton auf.
Außerdem ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, um- fassend die kodierende Sequenz für die erfindungsgemäße Dehydrogenase oder eine kodierende Teilsequenz. Ein nichtlimitierendes Beispiel dafür ist die in SEQ ID NO: 3 oder 6 dargestellte Seqeuenz.
Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Expressionskassette, umfas- send in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz.
Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein rekombinanter Vektor, umfassend wenigstens eine erfindungsgemäße Expressionskassette.
Außerdem ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein prokaryontischer oder euka- ryontischer Wirt, transformiert mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor.
Schließlich ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der erfin- dungsgemäßen Dehydrogenase oder eines diese Dehydrogenase produzierenden Mikroorganismus zur Herstellung von (S)-3-Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol und insbesondere zur Herstellung von Duloxetine.
Weitere Abwandlungen erfindungsgemäßer Dehydrogenasen: Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret offenbarten Enzyme mit (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol-Dehydrogenase - Aktivität und die Verwendung dieser in den erfindungsgemäßen Verfahren.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie z.B. Substratspezifität, besitzen. So versteht man beispielsweise unter „funktionalen Äquivalenten" Enzyme, die von 3-Chlor-1-(thien-2- yl)-propan-1-on zum entsprechenden S-Alkohol reduzieren und die mindestens 20 %, bevorzugt 50 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % der Aktivität eines Enzyms, umfassend eine der unter SEQ ID NO:1 , 2, 4 oder 6 aufgeführten oder in Figur 3 dargestellten Aminosäuresequenzen, aufweist. Funktionale Äquivalente sind außerdem vorzugsweise zwischen pH 4 bis 10 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum zwischen pH 5 und 8 sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 20°C bis 80°C.
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotz- dem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. „Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.
Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entneh- men:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution Ala Ser Arg Lys Asn Gin; His Asp Glu Cys Ser Gin Asn Glu Asp Gly Pro His Asn ; Gin lle Leu; Val Leu lle; Val Lys Arg ; Gin ; Glu Met Leu ; lle Phe Met ; Leu ; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp ; Phe Val lle; Leu
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktiviät.
Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Sal- ze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktioneilen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit A- cylgruppen. Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße „funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glyko- sylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermit- teln.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktioneil verschiedene, heterologe Sequenz in funk- tioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funk- tionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide oder Enzyme.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95%, 97% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444- 2448. Eine prozentuale Homologie eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutage- nese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins.
Homologe des erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Ver- fahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor li- giert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereit- Stellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oli- gonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 :477).
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Scree- ning der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Expri- mieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
Weitere Ausgestaltung erfindungsgemäßer kodierender Nukleinsäuresequenzen
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), die für ein Enzym mit erfindungsgemäßer Dehydrogenase-Aktivität kodieren. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, welche z.B. für Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID MO: 1 , 2, 4, 6 oder Figur 3 oder charakteristische Teilsequenzen davon kodieren, oder Nuklein- Säuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 3 oder 5 oder charakteristische Teilseq uenzen davon umfassen.
Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Frag- mentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA- Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und dop- pelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsge- mäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukleinsäurefragmente, die z.B. als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter „stringenten" Bedingun- gen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense- Stranges hybridisiert.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Ab- schnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleo- tidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleoti- de können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich prinzipiell aus allen Organismen identifizieren und isolieren. Vorteilhaft lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder die Homologen davon, aus Pilzen, Hefen oder Bakterien isolieren. Als Bakterien seien gram-negative und gram-positive Bakterien genannt. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren aus gram-negativen Bakterien vorteilhaft aus alpha-Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma- Proteobacterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae oder Rhizobiaceae, ganz besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Agrobacterium, Pseudomonas oder Burkholderia über dem Fachmann bekannte Methoden isoliert.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Pilzen oder Bakterien, z.B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispielsweise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit einer erfindungsgemäßen Dehydrogenase in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen bei- spielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca 10 °C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwi- sehen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridi- sierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa
30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C- Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann fol- genden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.
So können weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen z.B. von SEQ ID NO:3 oder 5 abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Dele- tion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon.
Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den kon- kret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Poly- morphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz eines Gens.
Unter Derivaten einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 40 % Homologie auf der abgeleiteten A- minosäureebene, bevorzugt mindestens 60 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 80, 85, 90, 93, 95 oder 98 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführun- gen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen kön nen die Homologien vorteilhaft höher liegen.
Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen. Sie besitzten z.B. auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 40 %, bevorzugt von mindestens 60 %, besonders bevorzugt von mindestens 70 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80 % über den gesamten angegebenen DNA- Bereich. Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, Insertionen, Inversionen und/oder Deletionen verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich von -1 bis -1000 Basen stromaufwärts vor dem Startkodon oder 0 bis 100O Basen stromabwärts nach dem Stopkodon so verändert wurden, dass die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben ge- nannten kodierenden Sequenzen unter „stringenten Bedingungen" hybridisieren.
Unter dieser Eigenschaft versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nichtkomplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vor- zugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50 - 70 °C, vorzugsweise 60 - 65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCI, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingun- gen ist dem Fachmann bekannt und ist z:B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Diese Polynukleotide lassen sich bei der Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.
Ausgestaltungen erfindungsgemäßer Konstrukte
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für opera- tiv verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylie- rungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Unter einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind insbesondere solche zu verstehen, bei weichen das Gen für eine erfindungsgemäße Dehydrogenase mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktioneil verknüpft wurden.
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehrere der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktioneil verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein . Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq" T7- , T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAD)SP6-, lambda-PR- oder im lambda-PL- Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den grarn- positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxi- dase, beispielsweiseaus Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-IM113-B1 , Igt11 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101, plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Ams- terdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'- und/oder 5'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirts- Organismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pou- wels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen wer- den.
Erfindungsgemäß brauchbare Wirtsorganismen
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren oder Konstrukte sind rekombinante Mikro- Organismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klo- nierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Pro- toplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemä- ßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Sequenz zu verändern, z.B. funktionell zu disrumpieren ("Knock- out"-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z.B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquel- le abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktioneile Protein kodiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäßen Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z.B. beschrieben in Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51 :503.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, beson- ders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha-Proteobacterien, beta- Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden.
Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit erfindungsgemäßer Dehydrogenaseaktivität kodieren.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen.
Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Das Keton kann direkt zur Anzucht gegeben werden oder vorteilhaft nach Anzucht. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden. Rekombinante Herstellung der erfindungsgemäßer Polypeptide
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäße Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Mania- tis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezemiert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q- Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisa- tion, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin- Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibo- dies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikroti- terplatte oder an einem sonstigen Träger dienen. Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
Weitere Ausgestaltungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen enzymatischen Reduktionsverfahrens
Die Dehydrogenasen können im erfindungsgemäßen Verfahren als freies oder immobilisiertes Enzym verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0 °C bis 95 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 85 °C, besonders bevorzugt zwischen 15 °C bis 75 °C durchgeführt.
Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 4,5 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 5 und 8 gehal- ten.
Unter enantiomerenreinen bzw. chiralen Produkten, wie 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-(S)- propan-1-ol, sind im erfindungsgemäßen Verfahren Enantiomere zu verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantiome- renreinheiten von mindestens 70 %ee, bevorzugt von min. 80 %ee, besonders bevorzugt von min. 90 %ee, ganz besonders bevorzugt min. 98 %ee erreicht.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufgeschlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z.B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wur- den. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reaktion Anwendung finden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.
Die Durchführung des Verfahrens kann vorteilhafterweise in Bioreaktoren erfolgen, wie z.B. beschrieben in Biotechnology, Band 3, 2. Auflage, Rehm et al Hrsg., (1993) ins- besondere Kapitel II. Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, ohne sie jedoch einzuschränken. Hierbei wird auf beiliegende Figuren Bezug genommen, dabei zeigt:
Figuri das aktivitätsgefärbte Gel einer erfindungsgemäß isolierten Dehydrogenase aus Lu10288; Spur 1 : Molekulargewichtsstandards von unten: 47 kDa, 74 kDa, 121 kDa, 205 kDa; Spur 2: leer; Spur 3: Homogenat Überstand; Spur 4: Wertfraktion Q- Sepharose; Spur 5: Wertfraktion Q-Sepharose (dreifache Menge); Spur 6: Wertfraktion Superdex; Spur 7: Wertfraktion Mono-Q; Spur 8: Wertfraktion Mono-P;
Figur 2A und 2B einen typische Reaktionsverlauf verschiedener Ansätze zur Herstellung von (S)-3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol l-S durch Reduktion mit einer Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis.
Figur 3A das Ergebnis der N-terminalen Sequenzierung einer Blotbande von erfindungsgemäß isolierter Dehydrogenase aus Lu10288; und Figur 3B die Sequenzierdaten verschiedener proteolytischer Fragmente einer erfindungsgemäß gereinigten Dehydrogenase aus Lu10288; sofern bei mehreren Signalen pro Sequenzierschritt eine Hauptsequenz feststellbar war, ist diese doppelt unterstrichen dargestellt. Nicht lesba- re Positionen sind mit „/" gekennzeichnet; für Positionen deren Bestimmung mit einer gewissen Unsicherheit behaftet ist, wird der Aminosäurerest in Klammern angegeben. Zwei Aminosäuren sind in einer Position angegeben, wenn keine eindeutige Präferenz angegeben weden kann. „?" bedeutet eine unbekannte, bzw. nicht bestimmbare Aminosäure.
Beispiele
A. Chemische Beispiele
Beispiel 1 : Herstellung von 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on III.1
33 kg Thiophen wurden in 150 kg Dichloethan vorgelegt und anschließend mit 62,7 kg Aluminiumtrichlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 10 °C gekühlt und mit 55 kg 3-Chlorpropionsäurechlorid versetzt. Das Gemisch wurde anschließend 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Die GC- und NMR-Kontrolle zeigten, dass das Reaktionsgemisch noch etwa 3-4 Mol-% 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propenon, bezogen auf die Summe aus gebildetem 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on und 3-Chlor-1-(thien-2-yl)- propenon, enthielt. Daraufhin leitet man bei Raumtemperatur so lange (ca. 30 Minuten) Chlorwasserstoff ein, bis kein Propenon mehr nachweisbar war. Anschließend hydro- lysierte man das Reaktionsgemisch durch Zugabe von 100 kg entionisiertem Wasser. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit 100 kg entionisiertem Wasser gewaschen. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man 65,7 kg (96 % der Theorie) der Titelverbindung als Öl. Beispiel 2: Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol I durch Reduktion mit Natriumborhydrid
Das Propanon aus Beispiel 1 wurde in einem Gemisch aus 400 ml Toluol und 200 g Methanol bei 0 °C vorgelegt. Nach Zugabe von 2 g 30%iger wässriger Natriumhydroxidlösung wurden innerhalb von 2,5 h 21 ,4 g Natriumborhydrid portionsweise zugegeben. Nach 40 min Rühren bei 0 °C wurde das Reaktionsgemisch mit 12,1 g 40%ige wässrige Metylaminlösung versetzt. Das Gemisch wurde 6 h bei 60 °C unter Eigendruck gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur entfernte man das Lösungsmittel, digerierte den Rückstand mit Toluol und filtrierte davon ab. Das Filtrat wurde getrocknet und man erhielt 175,8 g der Titelverbindung in Form eines hellgelben Feststoffs.
B. Biochemische Beispiele:
Beispiel 3: Bereitstellung von Glucose-Dehydrogenase zur Cofaktor-Regenerierung
Zur Cofaktor-Regenerierung konnte Glucose-Dehydrogenase aus kommerziellen Quellen (z.B. Jülich Fine Chemicals Order-No. 22.10 oder 19.10) oder eigenen Quellen verwendet werden, wobei letztere ein E.coli XL10 Gold pUC19-Klon war, der das Glu- cose-Dehydrogenase-Gen aus Bacillus subtilis (Genbank-Acc.No. M12276) enthielt (Lu11293).
Zur Fermentation von E. coli Lu11293 wurde folgendes Medium angesetzt:
Figure imgf000034_0001
*Salzlösung: 2,1 g CaCI2 * 2 H2O 3,5 g MgSO4 * 7 H2O 14 g NH4CI + 14 mL Ampicillin-Lösung (100 mg/mL) in 500 mL Wasser lösen und sterilfiltrieren
Jeweils 150 ml Medium wurden in zwei 1 I Erlenmeyerkolben sterilisiert und mit 5 ml steriler Salzlösung komplettiert. Nach Beimpfen von einer LB-Ampicillin-Agarplatte wurden die Vorkulturen 12 Stunden bei 37 °C und 200 UPM inkubiert und zum Fermentationsmedium gegeben. Die Fermentation wurde bei 37°C, 0,1 bar Innendruck, pH 7,0 (Regelung mit 20% Phosphorsäure und 25% NaOH) mit einer Begasungsrate von 7,5 L/min und 300 upm gestartet (Regelung pO2 zwischen 20 und 50% mit 10-20 L/min Zuluft und 500-1500 Upm). Nach 2 h wurden zur Induktion 0,1 mM IPTG zugegeben und nach insgesamt 13 h die Fermentation beendet. Nach Ernte und Waschen der Zellen (1 ,3 kg) wurden diese bis zur Verwendung (2-20 g/L im Ansatz) bei — 20°C gelagert.
Beispiel 4: Screening nach Dehydrogenasen zur Reduktion von 3-Chlor-1-(thien-2-yl)- propan-1-on
a) Verschiedene Bakterien- und Pilzstämme (überwiegend aus verschiedenen Stammsammlungen) wurden 24 bis 48 h in 20 ml LB-Medium, MRS-Medium (Fa.Difco) oder GYP-Medium (verwendet für Hefen) (1% w/v D-Glucose, je 0.5 % w/v Hefeextrakt und Polypepton, pH 6.0) bei 30 oder 37°C angezogen, in 3mM Tris-HCI pH7.5 gewaschen und in 2 ml Puffer resuspendiert. Ein Aliquot wurde mit 1 Vol. Glaskugeln (0,3-0, 5mm Durchmesser) in der Schwingmühle aufgeschlossen (3x5 min mit Zwischenkühlung a 10 min auf Eis). Nach Abtrennung der Trübung durch Zentrifugation (5 min 140O0 U/min 4°C) wurde ein klarer Rohextrakt erhalten. Die Zellsuspensionen und Rohextrakte wurden anschließend getestet auf reduktive Aktivität für 3-Chlor-1-(thien-2-yl)- propan-1-on aus Beispiel 3).
Verwendeter Assay:
150 μl Zellen/Rohextrakt
50 μl 1 M Glukoselösung 50 μl Glukose-Dehydrogenase (12-15 U/μl; 20-200 mg BFM/ml) aus Beispiel 3
50 μl 2 mM NADH
50 μl 2 mM NADPH
10 μl 0,5 M 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on in Methanol
190 μl 50 mM MES pH 6,0 oder Tris-HCI pH 7,5
Die Inkubation erfolgte bei 30 °C. Die Proben (200 μl) wurden mit 3 μl konz HCI nach
1 , 2 oder 24 h abgestoppt. Nach Zentrifugation wurden die Überstände per HPLC auf
3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on und 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol untersucht
(Chromolith Speed ROD, RP-18e 50 - 4,6mm, Fluß 1 ,5 ml/min, 0,0 - 1 ,0 min: 35% A- cetonitril+ 65% 10mM KH2PO4 Puffer pH 2,5; 1 , 1 - 1 ,3 min: 80% Acetonitril+ 20%
10mM KH2PO4 Puffer pH 2,5; 1 ,3 - 2,0 min: 35% Acetonitril+ 65% 10mM KH2P04 Puf- fer pH 2,5; Detektion bei 230 nm (Alkohol) und 260 nm (Keton) bei einer Retentionszeit Rt = 1 ,250 min (3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol) und Rt = 1 ,500 min (3-Chlor-1- (thien-2-yl)-propan-1-on); eventuelle Nebenprodukte aus HCI-Eliminierung (1 -Thien-2- yI-propen-1-on und 1-Thien-2-yl-propen-1-ol) bei Rt = 0,971 min und Rt = 1 ,1 65 min).
Ausgewählte Stämme wurden wiederholt getestet, wobei zur Bestimmung des Enanti- omerenüberschusses (ee) die Proben mit Methyl-tert.-butylether (MTBE) oder Methyli- sobutylketon (MIBK) extrahiert und per chiraler GC- oder HPLC-Analytik charakterisiert wurden. Folgende Methoden wurden hierzu verwendet: GC: Hydrodex-ß-6-TBDM, 25 m, 90°C 10min 5°C/min 180°C 10min, Laufzeit: 38 min, Inlets: Heater: 200°C, Pres- sure: 106.8 kPa, Total Flow: 102 ml/min, Split Ratio: 125:1 , Split Flow: 99.8 ml/min, Detector: 200°C bzw. HPLC: Chiracel OD-H, 250*4,6mm (Daicel), 40°C, Fluß 1 ,0 ml/min, 0,0 - 1 ,0 min: 97,5% n-Hexan+2,5% Isopropanol; Detektion bei 230 nm (Alkohol) und 260 nm (Keton) bei Rt 9,50 (3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on), Rt 16,60 min (R-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol) und Rt 18,30 min (S-3-Chlor-1-(thien-2-yl)- propan-1-ol).
b) Verschiedene Lactobacillus-Stämme wurden neu isoliert
Die Lactobacillus brevis-Stämme Lu10288, 10290 und 10291 wurden wie folgt isoliert.
b1) Verwendete Medien
Kleymanns-Medium:
In 915ml werden folgende Substanzen gelöst
10g/l Trypton (Difco-Becton Dicinson)
7g/l Hefe Extrakt (Difco-Becton Dicinson)
2g/l Beef Extrakt (Difco-Becton Dicinson) 5 g/l Fructose
2 g/l Maltose
3,6 g/l Gluconsäure 50%
1 ,9 g/l Citronensäure*H2O
5 g/l Acetat 1 g/l Tween 80
0,2 g/l MgSO4*7H2O
0,05 g/l MnSO4
0,01 g/l FeSO4
0,4 g/l L-Cystein 1 ,25 ml NH4OH 25% für Agarplatten: Zusatz von 2% Bacto Agar (Difco-Becton Dicinson)
Der pH der Lösung wurde auf 5,4 eingestellt.
Die Lösung wurde 15' bei 121 °C autoklaviert.
Nach dem Autoklavieren wurden 50 ml sterile Glucoselösung (5g ad 50 ml H20) und 40ml Ethanol unter Rühren zugesetzt und Agar-Platten gegossen. KMB-Medium:
10g/l Trypton (Difco-Becton Dicinson)
7g/l Hefe Extrakt (Difco-Becton Dicinson) 2 g/l KH2PO4
1 g/l Tween 80
0,5 g/l MgSO4*7H2O
1 g/l MnSO4
20g/l CaCO3 10g/l Glucose
1 ,5% Agar für die Herstellung von Agarplatten
Die Lösung wurde 15' bei 121 °C autoklaviert.
Die Glucose und das CaCO3 (Riedel de Haen) wurden separatat gelöst und autoklaviert und vor dem Plattengießen mit dem Agar vermischt.
b2) Isolierung der Mikroorganismen:
5-10 g Mais-Silage aus dem Norddeutschen Raum (LUFA-Oldenburg) wurde in einem
50 ml Erienmeyerkolben anaerob bei 37 °C über Nacht mit 20 ml Saline inkubiert. Der erhaltenen flüssige Anteil wurde 1 :100 in 50 ml Kleymanns Medium überimpft und an- aerob 24h bei RT und leichtem Rühren inkubiert. Danach wurde die Zellsuspension auf die beschriebenen Kleymanns-Selektionsagarplatten ausplattiert. Die Platten wurden anaerob für 48-72h bei 37°C inkubiert und die erhaltenen Kolonien durch wiederholtes
Ausstreichen auf KMB-Medium isoliert.
In flüssigem KMB-Medium mit 20 g/l Fructose (24 h 37°C, 50 Upm) fand die Charakterisierung der Stämme durch Bestimmung des Säure-Fermentationsmusters statt (pH- Messung und Konzentrationsbestimmung von Glucose, Fructose, Lactat, Acetat, E- thanol per HPLC-Analyse der Kulturüberstände). Heterofermentative Stämme mit Acetat- und Lactatbildung wurden isoliert und per Analyse der 16sRNA systematisch cha- rakterisiert.
c) Screening-Ergebnisse
Die Tabellen 1 ,2 und 3 zeigen beispielhafte Stämme bzw. die Umsätze und ee-Werte.
Tabelle 1
Figure imgf000037_0001
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Tabelle 2 Umsätze:
Figure imgf000038_0002
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n.b.; nicht bestimmt
Umsätze bezogen auf gebildeten 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol in mM
Tabelle 3 Testwiederholung mit ee-Wertbestimmung
Figure imgf000039_0002
Beispiel 5: Reinigung der Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis
Zur Fermentation von Lactobacillus brevis Lu10288 wurde folgendes Medium angesetzt:
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2 Vorkulturen wurden von MRS-Agarplatte beimpft, 17 h bei 37°C, 200 Upm inkubiert und zum Fermentationsmedium gegeben. Die Fermentation wurde bei 37°C, 0,1 bar Innendruck, pH 5,8 mit einer Begasungsrate von 1 l/min und 100 Upm gestartet (keine p O2- Regelung) und nach 23 h bei einer OD600 von 14,8 beendet. Die Aktivität der gewaschenen Zellproben wurde analog zu Beispiel 4a) mit ruhenden Zellen in MES, pH6.0 bestimmt.
Die Reinigung der Dehydrogenase aus Lu10288 wurde wie folgt durchgeführt:
Homogenisation: 100g Biofeuchtmasse von Lu 10288 (Lactobacillus brevis) wurden in 5 x 20g Portionen mit 100ml MES-Puffer, 1mM MgCI2, pH 7,1 resuspendiert und in einer Kugelmühle mit Glasperlen (0,1mm-0,2mm Durchmesser, 50ml resuspendierte Zellen zu 50ml Glasperlen) in 10 Portionen für 20 Minuten unter Eiskühlung bei 4000rpm homogenisiert. Die Glaskugeln wurden über eine G2 Glasnutsche abgetrennt und mit 20ml Puffer gewaschen. Das gesammelte Homogenat wurde dann in einem GSA Rotor bei 12000rpm für 20 Minuten geklärt (610ml).
a) Q-Sepharose lonenaustausch-Chromatographie: Eine Q-Sepharose fast flow (Pharmacia) mit einem Durchmesser von 5cm und einem Volumen von 400 ml wurde in 20 mM MES-Puffer, 1 mM MgCI2, pH 6,8 äquilibriert. 610 ml Homogenat wurden mit 11 Tabletten Complete (Proteaseinhibitor-Mischung , Röche, Complete, EDTA-free; Cat. No.: 1873580) versetzt und auf die Q-Sepharose- Säule bei einer Auftragsgeschwindigkeit von 10ml/min aufgetragen. Die Detektion bei 280 nm. Dann wurde im gleichen Puffer mit drei Säulenvolumina gewaschen. Zur Elu- tion wurde ein linearer Gradient von 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 1 M NaCI, pH 6,8 angelegt (in 100 Minuten von 0% NaCI nach 100% NaCI). Es wurden 10 ml Fraktionen gesammelt und getestet. Fraktion 42 bis 62 war im HPLC-Test mit 3-Chlor-1-(thien-2- yl)-propan-1-on aktiv.
b) Superdex Molekularsieb-Chromatographie:
Eine Superdex 200 Molekularsiebsäule (Pharmacia) mit einem Durchmesser von 2,6 cm und einem Volumen von 240 ml wurde in 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 1 Tablette Complete pro Liter Puffer (EDTA frei), pH 7,1 äquilibriert. Die Wertfraktionen der Q- Sepharose wurden vereinigt (240ml) und durch langsame Zugabe von 124 g Ammoniumsulfat auf 80 %ige Sättigung eingestellt. Der pH wurde auf 7,1 gehalten. Die Lösung wurde 10 Minuten bei 4°C gerührt und dann 20 Minuten bei 12000 U/min abzentrifu- giert. Das erhaltene Pellet wurde in 5 ml Äquilibrierungspuffer resuspendiert und für 1 Stunde bei 4 Grad Celsius dialysiert (10 kDa Ausschlußvolumen). Die dialysierte Lösung wurde in zwei Teile a 9 ml aufgeteilt und auf die Molekularsiebsäule bei einem Fluß von 4ml pro Minute aufgetragen. 4 ml Fraktionen wurden gesammelt und getestet. Fraktionen 48 bis 56 waren wieder für beide Substrate aktiv.
c) Mono-Q lonenaustausch-Chromatographie:
Eine präparative Mono-Q HR Säule (Pharmacia) mit einem Volumen von 20 ml wurde in 20 mM MES, 1mM MgCI2, pH 7,1 äquilibriert. 70 ml der vereinigten Wertfraktionen der Superdex wurden mit einer Flussgeschwindigkeit von 4 ml pro Minute aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule wurde die Säule mit einem linearen Gradienten in 10O Minuten nach 100% 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 0,5 M NaCI , pH 7,1 entwickelt. Es wurden 4 ml Fraktionen gesammelt. Aktive Fraktionen (Fraktion 36 bis 41) wurden vereinigt.
d) Mono-P lonenaustausch-Chromatographie: Eine Mono-P Säule (Pharmacia, 4 ml) wurde in 20 mM MOPS, 1 mM MgCI2, pH 7,1 äquilibriert. 21 ml der Mono-Q Wertfraktion wurde bei einem Fluß von 0,75 ml/min aufgetragen. Nach dem Waschen bis zur Basislinie wurde ein linerarer Gradient in 10O Minuten nach 100% 20 mM MOPS, 1 mM MgCI2, 0,5 M NaCI, pH 7,1 angelegt. Fraktionen (0,75ml) wurden gesammelt. Aktive Fraktionen (34-39) wurden vereinigt.
Aktivitätsfärbung in Gelen:
Die Probe wurde mit dem gleichen Volumen Novex „Native Tris-Glycin" Probenpuffer (Novex) verdünnt. Die Tris-Glycin-Gele von Anamed (ohne SDS, 1 mm dick, 10 Probentaschen) wurden in die Laufkammer eingebaut. Als Laufpuffer wurde Invitrogen „Tris-Glycin Native" Laufpuffer (Invitrogen) (10x) nach Verdünnung eingesetzt. Die Probentaschen wurden beladen und das Gel bei 200 V und ca 50 mA gestartet. Die Dauer der Elektrophorese betrug etwa 1 ,5 Stunden. Die Laufkammer stand in Eiswasser. Nachdem das Gel ausgebaut wurde kam es in eine Glasschale und wurde in 50mM MES, 8mM MgCI2, pH 6,2 gewaschen und inkubiert.
Dann wurde zu diesem Gel in dieser Lösung 0,35mM NADP und 0,35mM NAD, 19,6mg NB-Tetrazolium und 2,1 mg Phenazin Ethosulfat (PES) gegeben. Dann erfolgte die Zugabe des Substrates (3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol) ad 1mM Endkonzentration. Die Gele standen bis zur Färbung in Dunkelheit. Ein typisches Gel ist in Figur 1 gezeigt.
Bilanz der Isolierung von LU 10288 Dehydrogenase
Figure imgf000042_0001
Wp: Wertpeak-Fraktionen
* Aktivitätbestimmung der frischen Probe
** Aktivitätbestimmung nach Lagerzeit
Der N-Terminus der so gereinigten Dehydrogenase wurde nach SDS-PAGE und Gelblotting mittels Edman-Sequenzierung bestimmt (SEQ ID NO: 1).
Beispiel 6: Reinigung der Dehydrogenase aus Candida magnoliae
Zur Fermentation von Candida magnoliae Lu8742 wurde 2 Vorkulturen in 150 ml Medium mit 8 g/l Hefeextrakt (65%), 5 g/l Pepton, 3,5 g/l Glucose, 5 g/l KH2PO4 , 2 g/l MgSO4 * 7H2O, pH6,0 15 Stunden bei 28 °C und 200 Upm angezogen und in 13,2 I analoges Medium mit 10,7 g/l Glucose und 4 ml Tegosipon überimpft. Die Fermentation wurde bei 28°C, 0,1 bar Innendruck, pH 6,0 mit einer Begasungsrate von 5 l/min und 500 Upm gestartet (Regelung pO2 > 20%) und nach 26 h bei einer OD600 von 15,1 beendet. Homogenisation:
Die geernteten Zellen (378 g Biofeuchtmasse) wurden in 1 I 50 mM MES +1 mM MgCI2, pH 6,5 mit 10Tabletten Protease-Inhibitor Complete(ohne EDTA), Fa. Röche, suspendiert (ca. 9 x Konz.) und 2 x mit 1000 bar in einem Microfluidizer Z04 aufgeschlossen. Nach Zentrifugation (20 min/10000 g) wurde die Hälfte des klaren Überstandes (1 ,3 I Homogenat) wie nachfolgend beschrieben gereinigt. Dabei wurden die Fraktions-Proben in geeigneter Verdünnung in 50 mM MES pH 6,0, 0,2 mM NaDH/NaDPH, 100 mM Glucose, 50 μl/ml GDH und 10 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)- propan-1 -on bei 30°C auf Aktivität getestet.
Q-Sepharose lonenaustausch-Chromatographie:
Eine Q-Sepharose fast flow (Pharmacia) mit einem Durchmesser von 5 cm und einem
Volumen von 400 ml wurde in 20 mM MES-Puffer, 1 mM MgCI2, pH 6,8 äquilibriert. 650 ml Homogenat wurden mit 11 Tabletten Complete (Proteaseinhibitor Mischung) versetzt und auf die Q-Sepharose-Säule bei einer Auftragsgeschwindigkeit von 7,5 ml/min aufgetragen. Die Detektion erfolgte bei 280 nm. Dann wurde mit 700 ml gleichem Puffer gewaschen. Zur Elution wurde ein linearer Gradient von 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 0,75 M NaCI, pH 6,8 angelegt (in 100 Minuten von 0% NaCI nach 100% NaCI) und mit 200 ml 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 0.75M NaCI, pH 6,8 nachgewaschen. Es wurden 10 ml Fraktionen gesammelt und getestet. Fraktion 56 bis 96 war im HPLC- Test mit 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-on aktiv.
Ammoniumsulfat-Fällung: 41 ml Q-Sepharose-Wertpeak-Fraktionen wurden ad 90 % mit (NH4)2SO4 gesättigt (pH 6,2), 30 min bei 4°C gerührt und anschließend 10 min bei 10000 g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 10 ml 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 1 Tablette/I Complete(ohne EDTA), Fa. Röche, pH 6,2 suspendiert und 30 min gegen 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 1 Tablette/I Complete(ohne EDTA), Fa. Röche, pH 6,2, in einem Slide-A-Lyzer, Fa. Pierce (10 kDa Ausschlussvolumen), dialysiert.
Superdex Molekularsieb-Chromatographie:
Eine Superdex 200 Molekularsiebsäule (Pharmacia) mit einem Durchmesser von 2,6 cm und einem Volumen von 240 ml wurde in 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 1 Tablette Complete pro Liter Puffer (EDTA frei), pH 6,2 äquilibriert. Das Dialysat aus der Ammoniumsulfatfällung (2 x 7ml) wurde auf die Molekularsiebsäule bei einem Fluß von 4 ml pro Minute aufgetragen. 4 ml Fraktionen wurden gesammelt und getestet. Fraktionen 21 bis 24 waren wieder für beide Substrate aktiv.
Mono-Q lonenaustausch-Chromatographie:
Eine Mono-Q HR5/5 Säule (Fa. Pharmacia) mit einem Volumen von 1 ml wurde in 20 mM MES, 1 mM MgCI2, pH 6,8 äquilibriert. 10ml der vereinigten Wertfraktionen der Superdex-Säule wurden mit einer Flussgeschwindigkeit von 1ml pro Minute aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule wurde die Säule mit einem linearen Gradienten in 100 Minuten nach 100% 20 mM MES, 1 mM MgCI2, 0,75 M NaCI, pH 6,8 entwickelt und 10 min mit 20 mM MES, 1 mM MgCI2, pH 6,8 nachgespült. Es wurden 1 ml Frakti- onen gesammelt (Detektion 226 nm). Aktive Fraktionen (Fraktion 24 bis 27) wurden vereinigt.
Das Ergebnis der Isolierung ist in folgender Tabelle zusammengefasst
Figure imgf000044_0001
* (S)-3-Chlor-1 -(thien-2-yl)-propan-1 -ol AS-Fäll.: Ammoniumsulfat-Fällung Wp: Wertpeak-Fraktionen Der N-Terminus der so gereinigten Dehydrogenase wurde nach SDS-PAGE und Gelblotting mittels Edman-Sequenzierung bestimmt (SEQ ID NO: 2).
Beispiel 7: Herstellung von (S)-3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol l-S durch Reduktion mit einer Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis
Lactobacillus brevis Lu10288 wurde wie in Beispiel 4 angezogen und geerntet. Die ruhenden Zellen (10-100 g/L Biomasse) wurden mit 0,2 - 2 mM NAD(P)+, 1 bis 100 g/L des Propanons aus Beispiel 1 (batch oder fed-batch) und 18 g/L Glucose versetzt und 2-8 h bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Titration mit 0,5 M NaOH bei pH 6,0-7,0 gehalten und durch HPLC-Analytik verfolgt. Figuren 2A und B zeigen typische Verläufe gemäß den Ansätzen 1 bzw.2. Ansatz 1 9 ml Zellsuspension Lu10288 (mit 200g BFM / 1) 3 ml 1 M Glukose Lösung 3 ml 20 mM NADP Lösung 0,9 ml GDH Lösung (12-15 U/μl) 3 ml 1 M NaCI Lösung 11 ,1 ml Wasser + 10 mM Keton (aus Beispiel 1) Nach 1 h wurden erneut 10 mM Keton zugegeben. satz 2: 9 ml Zellsuspension Lu10288 (200g BFM / 1) 3 ml 1 M Glukose-Lösung 3 ml 2 mM NADP-Lösung 3 ml 2 mM NAD-Lösung 0,9 ml GDH Lösung (12-15 U/μl) 3 ml 1 M NaCI Lösung 11 ,1 ml Wasser + 10 mM Keton (0,6 ml 0,5 M Keton aus Beispiel 1 in Methanol) Nach 45, 110, 180 und 300 min wurden erneut je 10 mM Keton zugegeben.
Im Anschluß wurde die Biomasse durch Zentrifugation und/oder Filtration entfernt. Die NMR-Analyse der MTBE-Extrakte ergab einen 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol- Gehalt von 60-70%. Die Gehalte an nicht umgesetztem 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan- 1-on sowie an dem Nebenprodukt 1-Thien-2-yl-propen-1-on lagen je unter 10%. 1- Thien-2-yl-propen-1-ol konnte nur in Spuren detektiert werden.
Zu dem zellfreien wässrigen Ansatz gab man anschließend 1 ,1 g 40%ige wässrige Methylaminlösung zu. Das Gemisch wurde 6 h bei 60 °C unter Eigendruck gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur entfernte man das Lösungsmittel, digerierte den Rückstand mit Toluol und filtrierte davon ab. Alternativ konnte die Zellabtrennung nach der Aminierungsreaktion durchgeführt werden. Nach dem Trocknen des Filtrats erhielt man 202 mg der Titelverbindung in Form eines hellgelben Feststoffs. Man erhielt das S-Enantiomer in einem Enantiomerenüberschuss von 95 % ee. Die Bestimmung des ee-Wertes erfolgte durch Bestimmung des Drehwertes (c = 1 , Lösungsmittel: Methanol) und mittels Shift-NMR (Shift-Reagenz: 2,2,2-Trifluor-1-(9-anthryl)ethanol (+) (TFAE) ; Lösungsmittel: CDCI3; 500 MHz)
Beispiel 8: Klonierung der Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis Lu 10288 a) Chromosomale DNA-Präparation aus LU10288 nach vorheriger Protoplastierung:
(1) Benötigte Lösungen
Lösungl: 0,41 M Saccharose 0,01M MgSO4*7H2O 5ml/l M12-Medium 1 :2 10ml/M0% KH2PO4 pH 6,7 2,5 mg/ml Lysozym (kurz vor Gebrauch zugeben) Ansetzen der Lösung 1 wie folgt:
14,03 g Saccharos, 0,25 g MgSO4*7H2O, 5ml M12 (10x conc) und 1 ml 10% KH2PO4 pH 6,7 auf 100 ml auffüllen und sterilfiltrieren.
Proteinase: Fa. Qiagen, 20mg/ml stock solution
RNase: Fa. Qiagen, 100mg/ml stock solution
TE-Puffer: 10mM Tris*CI pH8, 1 mM EDTA pH 8
(2) Anzucht und Aufschluß:
- Anzucht über Nacht in 100ml MRS- Medium (Fa. Difco) in 250ml Erienmeyerkolben mit Schikanen bei 37°C und 200 rpm.
- Zellen zentrifugieren: 4000 rpm, 10 min, 4°C - Überstand verwerfen und das Pellet in 5ml Lösung1 (+ Lysozym) aufnehmen und gut resuspendieren. Im Brutschrank (37°C) 1 - 4h inkubieren.
- Protoplasten vorsichtig zentrifugieren: 3000 rpm, 10 min.
- Überstand verwerfen, Pellet mit 10 ml Lösung 1 (ohne Lysozym) waschen: 3000 rpm, 4°C, 8 min. - Überstand verwerfen, Pellet mit 10 ml 0,01 M Tris-HCI pH 8,0 waschen: 3000rpm, 4°C, 8 min.
- Überstand verwerfen, Pellet in 4 ml TE - Puffer resuspendieren.
- Zugabe von 0,5 ml 10% SDS und 0,5 ml 5M NaCI, vorsichtig mischen.
- Zugabe von 1 mg Proteinase K (Qiagen Proteinase: 20 mg/ml, also 50 μl) und In- kubation bei 37°C, über Nacht im Brutschrank.
- Diesen Ansatz mit TE - Puffer auf 20 ml auffüllen.
(3) Extraktion: - Zugabe von Phenol 1 :1 , d.h. 20ml Phenol + 20 ml Ansatz. Vorsichtig mischen und bei 4°C, 4000 rpm, 5min zentrifugieren.
- Obere Phase abheben und in neues Falcon (20ml) überführen.
- Zugabe von 20ml Phenol:Chloroform:lsoamylalkohol (25:24:1). Vorsichtig mischen und bei 4°C, 4000rpm, 5min zentrifugieren. - Obere Phase abheben und in neues Falcon (ca. 18ml) überführen.
- Zugabe von 18 ml Chloroform: Isoamylalkohol (24:1 , also 18ml Chloroform+333μl Isoamylalkohol). Vorsichtig mischen und bei 4°C, 4000 rpm, 5min zentrifugieren. Diesen Schritt so lang wiederholen, bis obere Phase klar ist.
- Obere Phase (18ml) mit 2 Volumen Ethanol (36ml) fällen. Zugabe von 1/50 3M Natriumacetat (ca. 360μl). Mindestens 30min bei -20°C fällen lassen. Danach bei 4°C, 12000 rpm, 30min zentrifugieren.
- Überstand verwerfen, Pellet in 1-2ml TE-Puffer aufnehmen. Zugabe von 20μg RNase pro ml TE-Puffer. Inkubation: 1 h, 37°C im H2O-Bad. (4) Dialyse:
Nach RNase-Behandlung füllt man den Ansatz in einen Dialyseschlauch. Es wird 3mal jeweils für 1 Stunde bei 4°C in 1 ,51 TE-Puffer dialysiert. Der letzte Dialyseschritt ist auch über Nacht möglich.
- Dialysierte DNA in Falcon füllen und auf mehrere Eppendorff-Gefäße verteilen (500μl).
- Zugabe von 2 Volumen Ethanol (1000μl) und 1/3 Volumen 2M LiCI (166μl).
- Fällung bei -20°C, mindestens 30min. Danach bei 4°C, 12000 rpm, 30min zentri- fugieren.
- Überstand vorsichtig abschütten.
- Waschen des Pellets mit 20ml 70% Ethanol und bei 12000 rpm, 4°C, 15min zentrifugieren.
- Überstand vorsichtig abschütten, das Pellet an der Luft trocknen lassen und die DNA in entsprechendem Volumen 10mM TrisΗCI pH 8,0 aufnehmen e nach Pelletgröße ab 100 μl).
Zur Verbesserung des Rücklösens wurde die DNA 1-2 Stunden im Eppendorfschüttler bei 55-60°C bei leichter Schüttelfrequenz (400 rpm) inkubiert.
b) Aus der Proteinreinigung des Beispiels 5 wurden nach tryptischem Verdau und Edmannsequenzierung der Peptide weitere Aminosäuresequenzen erhalten. Ergebnisse der Sequenzanalyse sind in Fig. 3B zusammengestellt.
Die Sequenz FWDGGYTAQ (vgl. V8-RP Fr.7) stellt aufgrund des Abbruchs vermutlich den C-Terminus dar. Von dieser und von der N-terminalen Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 1 ) wurden unter Berücksichtigung der Codon Usage von Lactobacillus brevis Nukleinsäuresequenzen abgeleitet (Primer Mke338 und 339), die wie folgt der Klonierung des Dehydrogenase-Gens durch PCR-Amplifikation an chromosomaler DNA aus Lu10288 (Protokoll siehe oben) dienten.
PCR:
Figure imgf000047_0001
hergestellt gemäß Beispiel 8a)
Primer:
Figure imgf000047_0002
Die PCR wurde nach Stratagene-Standardvorschrift mit Pfu-Polymerase (Stratagene) und dem folgenden Temperatur-Programm durchgeführt: 95°C für 5 Minuten; 30 Zyklen mit 95°C für 45 sec, 52°C für 45 sec, und 72°C für 1 min 20 sec; 72°C für 10 min.; 10°C bis zur Verwendung. Das PCR-Produkt (0,8 kB) wurde durch Agarosegel- Electrophorese (1 ,2%E-Gel, Invitrogen) und Säulen-Chromatographie (Mini-Elute, Qiagen) isoliert und anschließend mit Ndel/Hindlll verdaut und in entsprechend verdauten pDHE19.2-Vektor (ein pJOE-Derivat, DE19848129) kloniert. Die Ligationsan- sätze wurden in E.coli XL1 Blue (Stratagene) transformiert. Die Sequenzierung ent- sprechender Klone ergab als Insert im so erhaltenen Plasmid pDHE10288adh1 die in SEQ ID NO:3 dargestellte Nukleinsäuresequenz, die der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:4 entspricht. In ihr finden sich alle in Beispiel 5 und 8 identifizierten Peptide wieder.
SEQ ID NO: 4 Aminosäuresequenz der Dehydrogenase aus Lu10288 1 MSNRLDGKVA IVTGGTLGIG LAIATKFVEΞ GAKV ITGRH SDVGEKAAKS 51 VGTPDQIQFF QHDSSDEDG TKLFDATEKA FGPVSTLVNN AGIAV KSVE 101 ETTTAE RKL LAV LDGVFF GTRLGIQRMK NKGLGASIIN SSIEGFVGD 151 PSLGAYNASK GAVRIMSKSA ALDCALKDYD VRVNTVHPGY IKTPLVDDLP 201 GAEEAMSQRT KTPMGHIGEP NDIAYICVYL ASNESKFATG SEFWDGGYT 251 AQ*
SEQ ID NO: 3 Nukleinsäuresequenz der Dehydrogenase aus Lu10288 (sowie Gegenstrang) 1 ATGTCTAACC GTTTGGATGG AAAAGTAGCA ATCGTTACAG GTGGTACGTT TACAGATTGG CAAACCTACC TTTTCATCGT TAGCAATGTC CACCATGCAA 51 GGGTATCGGT TTAGCTATCG CCACGAAGTT CGTTGAAGAA GGGGCTAAGG CCCATAGCCA AATCGATAGC GGTGCTTCAA GCAACTTCTT CCCCGATTCC 101 TCATGATTAC CGGCCGGCAC AGCGATGTTG GTGAAAAAGC AGCTAAGAGT AGTACTAATG GCCGGCCGTG TCGCTACAAC CACTTTTTCG TCGATTCTCA 151 GTCGGCACTC CTGATCAGAT TCAATTTTTC CAACATGATT CTTCCGATGA CAGCCGTGAG GACTAGTCTA AGTTAAAAAG GTTGTACTAA GAAGGCTACT 201 AGACGGCTGG ACGAAATTAT TCGATGCAAC GGAAAAAGCC TTTGGCCCAG TCTGCCGACC TGCTTTAATA AGCTACGTTG CCTTTTTCGG AAACCGGGTC 251 TTTCTACATT AGTTAATAAC GCTGGGATCG CGGTTAACAA GAGTGTCGAA AAAGATGTAA TCAATTATTG CGACCCTAGC GCCAATTGTT CTCACAGCTT 301 GAAACCACGA CTGCTGAATG GCGTAAACTA TTAGCCGTCA ACCTTGATGG CTTTGGTGCT GACGACTTAC CGCATTTGAT AATCGGCAGT TGGAACTACC 351 TGTCTTCTTC GGTACCCGAT TAGGGATTCA ACGGATGAAG AACAAAGGCT ACAGAAGAAG CCATGGGCTA ATCCCTAAGT TGCCTACTTC TTGTTTCCGA 401 TAGGGGCTTC CATCATCAAC ATGTCTTCGA TCGAAGGCTT TGTGGGTGAT ATCCCCGAAG GTAGTAGTTG TACAGAAGCT AGCTTCCGAA ACACCCACTA 451 CCTAGCTTAG GGGCTTACAA CGCATCTAAA GGGGCCGTAC GGATTATGTC GGATCGAATC CCCGAATGTT GCGTAGATTT CCCCGGCATG CCTAATACAG 501 CAAGTCAGCT GCCTTAGATT GTGCCCTAAA GGACTACGAT GTTCGGGTAA GTTCAGTCGA CGGAATCTAA CACGGGATTT CCTGATGCTA CAAGCCCATT 551 ACACTGTTCA CCCTGGCTAC ATCAAGACAC CATTGGTTGA TGACCTACCA TGTGACAAGT GGGACCGATG TAGTTCTGTG GTAACCAACT ACTGGATGGT 601 GGGGCCGAAG AAGCGATGTC ACAACGGACC AAGACGCCAA TGGGCCATAT CCCCGGCTTC TTCGCTACAG TGTTGCCTGG TTCTGCGGTT ACCCGGTATA 651 CGGTGAACCT AACGATATTG CCTACATCTG TGTTTACTTG GCTTCTAACG GCCACTTGGA TTGCTATAAC GGATGTAGAC ACAAATGAAC CGAAGATTGC 701 AATCTAAATT TGCAACGGGT TCTGAATTTG TAGTTGACGG TGGCTACACT TTAGATTTAA ACGTTGCCCA AGACTTAAAC ATCAACTGCC ACCGATGTGA 751 GCTCAA CGAGTT
Beispiel 9: Aktivitätsbestimmung der rekombinanten Dehydrogenase aus Lactobacillus brevis Lu 10288
Das Plasmid pDHE10288adh1 wurde in E.coli TG10 pAgro4 pHSG575 retransformiert (TG10: ein RhaA'-Derivat von E.coli TG 1 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001 ), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413).
Je 6 Transformanten wurden in 20mL LBAmp/Spec/Cm (100μg/l Amp; 50mg/ISpec; 10μg/ICm) 0,1mM IPTG 0,5g/L Rhamnose in 100mL Erienmeyerkolben (Schikanen) 18 h bei 37°C angezogen, bei 5000g/10min zentrifugiert , einmal mit 10mM Tris/HCI pH7,0 gewaschen und in 2 ml des gleichen Puffers resuspendiert. 100 μl Zellsuspension wurden 20 min in 900 μl 50mM MES pH6 mit 50μl/ml Glucose-DH (Beispiell) , 100mM Glucose, 100mM NaCI, 1mM NADH, 1mM NADPH und mit 10 mM 3-Chlor-1- (thien-2-yl)-propan-1-on schüttelnd inkubiert. Die Ansätze wurden analog zu Beispiel 4 analysiert. Im Durchschnitt wurden 0,13 mM 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol gebil- det, was einer Aktivität von 6,6 U/L Kultursuspension entspricht. In analogen Ansätzen mit Rohextrakt, der durch Zellaufschluß mit 0,7ml Glaskugeln (d=0,5mm) in einer Schwingmühle (3x 5min mit Zwischenkühlung auf Eis) gewonnen wurde, wurden 0,21 M 3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol, entsprechend einer Aktivität von 10,7 U/L, gemessen. In Kontrollversuchen ohne Zusatz von Rhamnose bei der Anzucht war kein 3- Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-oI detektierbar.
Beispiel 10: Klonierung der Dehydrogenase aus Candida magnoliae Lu8472
Aus der Proteinreinigung des Beispiels 6 wurden nach nochmaliger Bestimmung der N-terminalen Sequenz durch Edmannsequenzierung folgende Aminosäuresequenz erhalten:
(S,G oder T)(T oder P)TSNALVTGGSRGIGAA Nach tryptischem Verdau und Edmannsequenzierung der Peptide wurde folgende weitere Aminosäuresequenz erhalten:
IGVNSINPG
Von den Peptiden wurden unter Berücksichtigung der Codon Usage von Candida magnoliae Nukleinsäuresequenzen abgeleitet (Primer Mke366, 367 und 374), die wie folgt der Klonierung des Dehydrogenase-Gens durch PCR-Amplifikation an chromosomaler DNA aus Lu8472 (Genomic DNA Kit mit dreifach konzentrierter Lyticase- Lösung, Qiagen, Hilden) dienten.
PCR:
Figure imgf000050_0001
Primer:
Figure imgf000050_0002
Die Primer MKe366 und MKe367 wurden 1:1 gemischt. Die PCR wurde nach Strata- gene-Standardvorschrift mit PfuTurbo-Polymerase (Stratagene) und dem folgenden Temperatur-Gradienten-Programm durchgeführt: 95°C für 1 Minuten; 30 Zyklen mit 95°C für 1 min., X°C1 für 45 sec, und 72°C für 2 min; 72°C für 10 min.; 10°C bis zur Verwendung. Das PCR-Produkt (-0,5 kB) wurde durch Agarosegel-Electrophorese (1 ,2%E-Gel, Invitrogen) und Säulen-Chromatographie (GFX-Kit, Amersham Pharmacia) isoliert und anschließend sequenziert (Sequenzierprimer: Mke 366 und Mke374). Die erhaltene Sequenz ist in SEQ ID NO:5 dargestellt. Die daraus abgeleitete Amio- säuresequenz (SEQ ID NO:6) zeigt eine Identität von 53% zur Carbonyl-Reduktase aus Candida magnoliae (WO200140450). Die nach Proteinreinigung ermittelten Pep- tidsequenzen sind mit geringfügigen Abweichungen enthalten. Unterschiede könnten
1 Es wurden 12 Ansätze mit unterschiedlichen Annealingtemperaturen gefahren, von 25°C bis 45°C (Delta je ca. 2 °C). In allen Ansätzen entstand als Hauptprodukt in ähnlicher Konzentration eine 0,5 kB-Bande. einerseits auf Sequenzierfehlern beruhen oder durch die Existenz mehrerer Isoenzyme in Candida magnoliae Lu8742 bedingt sein.
SEQ ID NO:6 Partielle Aminosäuresequenz der Dehydrogenase aus Lu8472 1 NALVTGGSRG IGEATAIKLA EEGYSVTIAS RGLKQLΞAVK AK PIVKQGQ 51 VHHV QLDLS DVDAAAAFKG SPLPASRYDV LVSNAGVAQF SPFIEHAKQD 101 WSQMLAINLA APIALAQTFA KAIGDKPRNT PAHIVFVSSN VSLRGFPNIG 151 VNSITPG
SEQ ID NO:5 Partielle Nukleinsäuresequenz der Dehydrogenase aus Lu8472 (sowie Gegenstrang) 1 AACGCGCTGG TGACGGGCGG CAGCCGCGGC ATTGGCGAAG CCACTGCCAT TTGCGCGACC ACTGCCCGCC GTCGGCGCCG TAACCGCTTC GGTGACGGTA 51 TAAGCTCGCC GAGGAGGGCT ACAGCGTCAC GATTGCGTCT CGCGGCCTTA ATTCGAGCGG CTCCTCCCGA TGTCGCAGTG CTAACGCAGA GCGCCGGAAT 101 AGCAGCTCGA GGCTGTGAAG GCCAAACTAC CCATTGTGAA GCAGGGACAG TCGTCGAGCT CCGACACTTC CGGTTTGATG GGTAACACTT CGTCCCTGTC 151 GTTCACCACG TGTGGCAGCT TGATCTCAGT GATGTCGACG CTGCGGCCGC CAAGTGGTGC ACACCGTCGA ACTAGAGTCA CTACAGCTGC GACGCCGGCG 201 CTTCAAAGGG TCGCCGCTAC CTGCCAGCCG CTACGACGTG CTCGTCAGCA GAAGTTTCCC AGCGGCGATG GACGGTCGGC GATGCTGCAC GAGCAGTCGT 251 ATGCTGGCGT GGCCCAGTTT AGCCCGTTCA TCGAGCATGC GAAGCAGGAC TACGACCGCA CCGGGTCAAA TCGGGCAAGT AGCTCGTACG CTTCGTCCTG 301 TGGTCGCAGA TGCTTGCCAT CAATCTGGCG GCACCCATTG CGCTGGCCCA ACCAGCGTCT ACGAACGGTA GTTAGACCGC CGTGGGTAAC GCGACCGGGT 351 GACATTTGCT AAGGCCATTG GCGACAAGCC GCGCAACACA CCGGCCCACA CTGTAAACGA TTCCGGTAAC CGCTGTTCGG CGCGTTGTGT GGCCGGGTGT 401 TTGTGTTTGT CTCGTCGAAC GTCTCGTTGC GAGGCTTCCC GAACATCGGC AACACAAACA GAGCAGCTTG CAGAGCAACG CTCCGAAGGG CTTGTAGCCG 451 GTCAACTCCA TCACCCCCGG CA CAGTTGAGGT AGTGGGGGCC GT

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1 -(thien-2-yl)-propan-1 -ol der Formel I
Figure imgf000052_0001
a) Thiophen mit einem ß-Halogenpropionsäurehalogenid oder einem Acrylsäu- rehalogenid in Gegenwart einer Lewis-Säure zu einem 3-Halogen-1-(thien-2- yl)-propan-1-on umsetzt, wobei man gleichzeitig oder nach erfolgter Umsetzung, jedoch vor der Isolierung des Reaktionsprodukts, einen Halogenwasserstoff einleitet und b) das in Schritt a) erhaltene Propanon reduziert und anschließend, gegebenen- falls ohne Isolierung des Reaktionsprodukts mit Methylamin umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei man in Schritt a) als Lewis-Säure Aluminiumtrichlorid verwendet.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, wobei man die Umsetzung in Schritt a) in einem halogenierten Kohlenwasserstoff als Lösungsmittel durchführt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man in Schritt b) die Reduktion mit einem Metall- oder Halbmetallhydrid oder mit Wasserstoff in Gegenwart eines Übergangsmetallkatalysators als Reduktionsmittel durchführt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zur Herstellung von (S)- 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol der Formel l-S
Figure imgf000052_0002
gegebenenfalls im Gemisch mit seinem R-Enantiomer l-R, wobei das Propanol der Formel l-S im Gemisch überwiegt, wobei man die Reduktion in Schritt b) in Gegenwart eines chiralen Reduktionsmittels oder eines chiralen Katalysators durchführt, welche eine Selektivität bezüglich der Bildung von (S)-3-Methylamino- 1 -(thien-2-yl)propan-1 -ol aufweisen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei man in Schritt b) als Reduktionsmittel ein a- symmetrisches Metall- oder Halbmetallhydrid oder Wasserstoff in Gegenwart eines asymmetrischen Übergangsmetallkatalysators als Reduktionsmittel verwendet oder wobei man die Reduktion in Gegenwart einer asymmetrische Induktion vermittelnden Verbindung durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei man in Schritt b) die Reduktion in Gegenwart einer Dehydrogenase (E.C. 1.1. x.x.) durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Reduktion in Gegenwart einer Dehydrogenase (E.C. 1.1.1.x) insbesondere in Gegenwart einer Alkohol Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1 oder E.C.1.1.1.2) durchgeführt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Dehydrogenase ausgewählt ist unter Dehydrogenasen aus Hefen der Gattung Geotrichum, Pichia, Candida, Hansenula oder Saccharomyces und aus Bakterien der Gattung Pseudomonas, Burkholderia, Agrobacterium, Rhodococcus oder Lactobacillus.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Dehydrogenase ausgewählt ist unter Dehydrogenasen aus Geotrichum candidum, Candida magnoliae und Lactobacillus brevis.
11. Alkohol Dehydrogenase, mit einer Aminosäuresequenz, die im Bereich des N- Terminus a) eine Aminosäureteilsequenz von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten gemäß SEQ ID NO: 1 umfasst, wobei vorzugsweise zusätzlich die der Aminosäureposition 12 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechende Position für Valin steht; oder eine b) Aminosäureteilsequenz von wenigstens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst; sowie die davon abgeleiteten funktional äquivalenten Alkohol Dehydrogenasen.
12. Alkohol Dehydrogenase nach Anspruch 11, welche zur Reduktion von 3-Chlor-1- (thien-2-yl)-propan-1-on zu (S)-3-Chlor-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol befähigt ist.
13. Alkohol Dehydrogenase nach Anspruch 12, welche die Reduktion in einer Enan- tiomerenreinheit von wenigstens 85 % ee (in Gegenwart von NADH und/oder NADPH; bei 30°C und pH 6.0) katalysiert.
14. Alkohol Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 11 bis 13, welche von einer Nukleinsäuresequenz, umfassend SEQ ID NO:3, kodiert wird, oder welche eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder wenigstens eine Teilsequenz gemäß Figur 3 umfasst, und vorzugsweise aus Lactobacillus brevis erhältlich ist; sowie die davon abgeleiteten funktional äquivalenten Alkohol Dehydrogenasen.
15. Alkohol Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 11 bis 13, welche von einer Nukleinsäuresequenz, umfassend SEQ ID NO:5, kodiert wird, oder welche eine Aminosäuresequenz, umfassend SEQ ID NO: 6, aufweist, und vorzugsweise aus Candida magnoliae (ATCC 12573) erhältlich ist; sowie die davon abgeleiteten funktional äquivalenten Alkohol Dehydrogenasen.
16. Nukleinsäuresequenz, umfassend die kodierende Sequenz für die Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 11 bis 15, insbesondere gemäß SEQ ID NO: 3 und 5; sowie die davon abgeleiteten Derivate.
17. Expressionskassette, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 15.
18. Rekombinanter Vektor, umfassend wenigstens eine Expressionskassette nach Anspruch 16.
19. Prokaryontischer oder eukaryontischer Wirt, transformiert mit wenigstens einem Vektor nach Anspruch 17.
20. Verwendung der Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder eines diese Dehydrogenase produzierenden natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismus zur Herstellung von (S)-3-Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei man als Dehydrogenase die Alkohol Dehydrogenase nach einem der Ansprüche 11 bis 14 oder einen diese Dehydrogenase produzierenden natürlichen oder rekombinanten Mikroorganismus einsetzt.
22. Verfahren zur Herstellung von (S)-3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol der Formel l-S, bei dem man ein 3-Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-on enantioselektiv reduziert, dadurch gekennzeichnet, dass die Reduktion in Gegenwart einer Dehydrogenase erfolgt.
23. Verfahren nach Anspruch 21 , wobei man das bei der Reduktion erhaltene (S)-3- Halogen-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol ohne Isolierung mit Methylamin umsetzt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 oder 22, wobei die Dehydrogenase ausgewählt ist unter Dehydrogenasen aus Hefen der Gattung Geotrichum, Pi- chia, Candida, Hansenula oder Saccharomyces und aus Bakterien der Gattung Pseudomonas, Burkholderia, Agrobacterium, Rhodococcus oder Lactobacillus.
25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Dehydrogenase ausgewählt ist unter Dehydrogenasen aus Geotrichum candidum, Candida magnoliae oder Lactobacillus brevis. cillus brevis.
26. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Dehydrogenase ausgewählt ist unter Alkohol-Dehydrogenasen nach einem der Ansprüche 11 bis 15.
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