WO2005032593A1 - 核移行能を有するポリアルギニン修飾リポソーム - Google Patents

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Definitions

  • the types of lipids constituting the lipid bilayer are not particularly limited. Specific examples thereof include phosphatidylcholines (eg, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine).
  • phosphatidylcholines eg, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine.
  • Hydrogenated products sphingomyelin, ganglioside, etc.
  • glycolipids Ru can be used one or two or more of these.
  • the phospholipid may be any of natural lipids derived from egg yolk, soybean and other animals and plants (eg, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc.), synthetic lipids and semi-synthetic lipids.
  • the lipid membrane is hydrated and stirred or subjected to ultrasonic treatment to produce a liposome having the peptide on the surface.
  • the organic solvent is evaporated off to obtain a lipid membrane.
  • the lipid membrane is hydrated, and ribosomes are produced by stirring or ultrasonication. I do.
  • the peptide can be introduced to the surface of the ribosome by adding the peptide modified with a hydrophobic group or a hydrophobic compound to the external solution of the ribosome.
  • the amount of the peptide present on the surface of the ribosome of the present invention is at least 2% (molar ratio), preferably at least 3% (molar ratio), more preferably at least 4%, based on the total lipids constituting the lipid bilayer. (Molar ratio) or more, the ribosome of the present invention can effectively exhibit intracellular translocation and nuclear translocation at a low temperature (usually 410 ° C, preferably 416 ° C). it can.
  • the upper limit of the amount of the peptide is usually 30% (molar ratio), preferably 25% (molar ratio), more preferably 20% (molar ratio) based on the total lipid constituting the lipid bilayer. .
  • the obtained lipid membrane (10 mol) was hydrated using 1 mL of phosphate buffered saline pre-warmed to 50 ° C. and stirred for 5 seconds.
  • the lipid dispersion was passed through a 400 nm, 200 nm or 100 nm polycarbonate membrane filter 11 times each. This resulted in the formation of ribosomes having octaarginine (5 mol% of total lipids) on the surface.
  • NIH3T3 cells coexist with metabolic inhibitors (0.1% sodium azide, 10mM sodium fluoride and 1gZmL antimycin A) or sucrose (0.4M), an endocytosis inhibitor After incubation at 37 ° C for 30 minutes at 37 ° C for 10 minutes, or at 37 ° C for 10 minutes in the presence of the macropinocytosis inhibitor Amiloride (5 mM), or at 4 ° C for 30 minutes in the absence of the inhibitor Then, ribosome (octaarginine content: 0.8 mol% or 5 mol% of the total lipid) in which octaarginine was introduced to the surface and the rhodamine dye was encapsulated in the inner aqueous phase was added, and the mixture was incubated for 1 hour.
  • metabolic inhibitors 0.1% sodium azide, 10mM sodium fluoride and 1gZmL antimycin A
  • sucrose 0.4M
  • an endocytosis inhibitor After incubation at 37 ° C for 30
  • FIG. 4 is a view showing the results of comparing the intracellular region areas where fluorescence is observed under various conditions.
  • FIG. 5 shows the results of measuring luciferase expression activity under various conditions.

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Abstract

　細胞内移行性及び核内移行性を有するリポソームを提供することを目的とし、この目的を達成するために、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを表面に有するリポソーム、具体的には、前記ペプチドが疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、前記疎水性基又は前記疎水性化合物が脂質二重層に挿入され、前記ペプチドが前記脂質二重層から露出しているリポソームを提供する。

Description

明 細 書
核移行能を有するポリアルギニン修飾リボソーム
技術分野
[0001] 本発明は、細胞内移行性及び核内移行性を有するリボソーム、並びに該リボソーム を利用した目的物質の細胞内及び核内送達用ベクターに関する。
背景技術
[0002] 近年、薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖等を標的部位に確実に送達するため のベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、遺伝子治療におい ては、 目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、ァ デノウィルス、アデノ関連ウィルス等のウィルスベクターが開発されている。しかしなが ら、ウィルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、こ のような問題点が少な 、リボソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めて 、る 。リボソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入 することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有し ている。
[0003] リボソームベクターとしては、例えば、ポリアルギニン等の凝集剤と核酸との複合体 がカプセルィ匕されたリボソームベクターが開発されている（特許文献 1参照)。また、 ペプチドキャリア一としては、膜透過性を有する HIV-1由来 Tatタンパク質、ポリアル ギニン、アルギニンリッチペプチド等のペプチドキャリアーが開発されている（特許文 献 2、 3参照)。
特許文献 1：特表 2002 - 520038号公報
特許文献 2 :特開平 10- 33186号公報
特許文献 3 :特開 2001— 199997号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、細胞内移行性及び核内移行性を有するリボソーム、並びに該リボソーム を利用した目的物質の細胞内及び核内送達用ベクターを提供することを目的とする 課題を解決するための手段
[0005] 上記課題を解決するために、本発明は、以下のリボソームを提供する。
(1)連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを表面に有するリボソーム。
(2)前記ペプチドが連続した 4一 20個のアルギニン残基を含む前記（1)記載のリポソ ーム。
(3)前記ペプチドがアルギニン残基のみ力 なる前記（1)又は（2)記載のリボソーム
(4)脂質二重層を構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合が 0— 40% (モル 比）である前記（1)一 (3)の 、ずれかに記載のリボソーム。
(5)前記ペプチドが疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、前記疎水性基 又は前記疎水性化合物が脂質二重層に挿入され、前記ペプチドが前記脂質二重層 力も露出して 、る前記（1)一（4)の 、ずれかに記載のリボソーム。
(6)前記疎水性基がステアリル基である前記（5)記載のリボソーム。
(7)細胞内又は核内へ送達しょうとする目的物質が封入されて!、る前記（1)一 (6)の いずれかに記載のリボソーム。
(8)前記目的物質が薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体であ る前記（7)記載のリボソーム。
(9)前記目的物質が核酸であって、前記核酸とポリカチオン性物質との複合体が内 部に封入されて 、る前記（8)記載のリボソーム。
(10)前記ポリカチオン性物質がステアリルィ匕ポリアルギニンである前記（9)記載のリ ポソーム。
( 11 )前記目的物質の細胞内送達用ベクターである前記（ 7)—（ 10)の 、ずれかに 記載のリボソーム。
(12)前記目的物質の核内送達用ベクターである前記（7)—（10)のいずれかに記 載のリボソーム。
発明の効果
[0006] 本発明のリボソームは、細胞内及び核内へ効率よく移行することができる。 また、本発明のリボソームは、 0— 40°Cという広範な温度域 (効果的な温度域は 4一 37°C)にお 、て細胞内移行性及び核内移行性を発揮することができる。
さらに、本発明のリボソームの細胞内移行経路は、エンドサイト一シスにのみ依存す るわけではないので、脂質二重層にカチオン性脂質が含まれている必要はなぐ力 チオン性脂質による細胞毒性を最小限に抑えることができる。
さらに、本発明のリボソームは、アデノウイルスベクターと同等の遺伝子発現活性を 、アデノウイルスベクターと異なり細胞毒性を示すことなく発揮することができる。 さらに、本発明のリボソームは、その表面のペプチド量を調節することにより、マクロ ピノサイト一シスを介して細胞内に移行することができる。マクロピノサイト一シスでは 、細胞外物質がマクロピノソームという画分として細胞内に取り込まれ、マクロピノソー ムはエンドノームと異なりリソノームと融合しないため、マクロピノソーム内封物はリソソ ームによる分解を回避することができる。したがって、本発明のリボソームがマクロピノ サイト一シスを介して細胞内に移行する場合、本発明のリボソームに封入された目的 物質を効率よく細胞内又は核内に送達することができる。
さらに、本発明のリボソームが表面に有するペプチド量をコントロールすることにより 、本発明のリボソームの細胞内移行経路をコントロールすることができる。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のリボソームは、脂質二重層膜構造を有する閉鎖小胞である限り、脂質二重 層の数は特に限定されるものではなぐ多重膜リボソーム (MLV)であってもよいし、 SUV (small unilamella vesicle;、 LUV (large unilamella vesicle;、 GUV (giant unilamella vesicle)等の一枚膜リボソームであってもよい。また、本発明のリボソームの サイズは特に限定されるものではないが、直径 50— 800nmであることが好ましぐ直 径 80— 150nmであることがさらに好ましい。
[0008] 本発明のリボソームにおいて、脂質二重層を構成する脂質の種類は特に限定され るものではなぐその具体例としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジォレオイルホ スファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコ リン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホ スファチジルグリセロール（例えば、ジォレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウ ロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパル ミトィルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール）、ホス ファチジルエタノールァミン（例えば、ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン、 ジラウロイルホスファチジルエタノールァミン、ジミリストイルホスファチジルエタノール ァミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールァミン、ジステアロイルホスファチジェ タノールァミン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン 酸、カルジォリピン等のリン脂質又はこれらの水素添加物；スフインゴミエリン、ガング リオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち 1種又は 2種以上を使用することができ る。リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質 (例えば、卵黄レシ チン、大豆レシチン等）、合成脂質又は半合成脂質のいずれであってもよい。
[0009] 脂質二重層には、脂質二重層を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を 調節したりするために、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロ 一ノレ、ジヒドロラノステロ一ノレ、デスモステロ一ノレ、ジヒドロコレステロ一ノレ等の動物由 来のステローノレ；スチグマステロ一ノレ、シトステロ一ノレ、カンペステローノレ、ブラシカス テロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロ一ノレ、エルゴステ ロール等の微生物由来のステロール；グリセロール、シュクロース等の糖類；トリオレイ ン、トリオクタノイン等のグリセリン脂肪酸エステルのうち、 1種又は 2種以上を含有さ せることができる。その含有量は特に限定されるものでないが、脂質二重層を構成す る総脂質に対して 5— 40% (モル比）であることが好ましぐ 10— 30% (モル比）であ ることがさらに好ましい。
[0010] 脂質二重層には、トコフエロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸ァスコルビル、 ブチルイ匕ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤;ステアリルァミン、ォレイルァミン等の正荷 電を付与する荷電物質；ジセチルホスフェート等の負電荷を付与する荷電物質；膜表 在性タンパク質、膜内在性タンパク質等の膜タンパク質を含有させることができ、その 含有量は適宜調節することができる。
[0011] 本発明のリボソームは、連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを表面に 有する。なお、一枚膜リボソームについては脂質二重層の外表面がリボソームの表面 であり、多重膜リボソームについては最外層の脂質二重層の外表面がリボソームの 表面である。また、本発明のリボソームは、表面以外の部分 (例えば、脂質二重層の 内表面）に上記ペプチドを有していてもよい。
[0012] 上記ペプチドにおける連続したアルギニン残基の個数は複数個である限り特に限 定されるものではないが、通常 4一 20個、好ましくは 6— 12個、さらに好ましくは 7— 1 0個である。上記ペプチド全体を構成するアミノ酸残基の個数は特に限定されるもの ではないが、通常 4一 35個、好ましくは 6— 30個、さらに好ましくは 8— 23個である。 上記ペプチドは、連続した複数個のアルギニン残基の C末端及び Z又は N末端に任 意のアミノ酸配列を含むことができる力 アルギニン残基のみ力もなることが好ましい
[0013] 連続した複数個のアルギニン残基の C末端又は N末端に付加されるアミノ酸配列 は、剛直性を有するアミノ酸配列（例えば、ポリプロリン)であることが好ましい。ポリプ 口リンは、柔ら力べて不規則な形をとつているポリエチレングリコール (PEG)と異なり、 直線的で、ある程度の堅さを保持している。また、当該アミノ酸配列に含まれるァミノ 酸残基は酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基であることが好まし、。負電荷を有する酸 性アミノ酸残基が、正電荷を有するアルギニン残基と静電的に相互作用し、アルギ- ン残基の効果を減弱させる可能性があるためである。
[0014] 本発明のリボソームの表面に存在する上記ペプチドの量は、脂質二重層を構成す る総脂質に対して通常 0. 1— 30% (モル比）、好ましくは 1一 25% (モル比）、さらに 好ましくは 2— 20% (モル比）である。本発明のリボソームの表面に存在する上記べ プチドの量が、脂質二重層を構成する総脂質に対して 2% (モル比)未満、好ましくは 1. 5% (モル比)未満、さらに好ましくは 1% (モル比)未満であると、本発明のリポソ一 ムは、主にエンドサイト一シスを介して細胞内又は核内へ移行することができる。この ときの上記ペプチドの量の下限値は、脂質二重層を構成する総脂質に対して通常 0 . 1% (モル比）、好ましくは 0. 5% (モル比）、さらに好ましくは 0. 7% (モル比）である 。本発明のリボソームの表面に存在する上記ペプチドの量力 脂質二重層を構成す る総脂質に対して 2% (モル比）以上、好ましくは 3% (モル比）以上、さらに好ましくは 4% (モル比）以上であると、本発明のリボソームは、主にマクロピノサイト一シスを介し て細胞内又は核内へ移行することができる。このときの上記ペプチド量の上限値は、 脂質二重層を構成する総脂質に対して通常 30% (モル比）、好ましくは 25% (モル 比）、さらに好ましくは 20% (モル比）である。マクロピノサイト一シスでは、細胞外物質 がマクロピノソームという画分として細胞内に取り込まれ、マクロピノソームはエンドソ ームと異なりリソノームと融合しないため、マクロピノソーム内封物はリソソームによる 分解を回避することができる。したがって、本発明のリボソームがマクロピノサイトーシ スを介して細胞内に移行する場合、本発明のリボソームに封入された目的物質を効 率よく細胞内又は核内に送達することができる。
[0015] 本発明のリボソームは、その表面の上記ペプチドを介して細胞内又は核内へ移行 することができる。リボソームの細胞内移行経路がエンドサイト一シスに依存する場合 、脂質二重層はその主要成分としてカチオン性脂質を含む必要があるが、本発明の リボソームの細胞内移行経路は、エンドサイト一シスにのみ依存するわけではないの で、脂質二重層にカチオン性脂質が含まれている必要はない。すなわち、本発明の リボソームの脂質二重層は、カチオン性脂質及び非力チオン性脂質のいずれか一方 で構成されていてもよいし、両方で構成されていてもよい。但し、カチオン性脂質は 細胞毒性を有するので、本発明のリボソームの細胞毒性を低減させる点からは、脂 質二重層に含まれるカチオン性脂質の量を出来る限り少なくすることが好ましぐ脂 質二重層を構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合は 0— 40% (モル比)で あることが好ましぐ 0— 20% (モル比）であることがさらに好ましい。
[0016] カチオン性脂質としては、例えば、 DODAC (dioctadecyldimethylammonium
chloride)、 DOTMA(N— (2,3— dioleyloxy)propy卜 Ν,Ν,Ν— trimethylammonium)、 DDA
B (didodecylammonium bromide)、 DOTAP (l,2- dioleoyloxy- 3- trimethylammonio propane)、 DC— Choi (3 β - N- (Ν',Ν',- dimethyト aminoethane)- carbamol cholesterol)
、 DMRIE ( 1 ,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium)、 DOSP
A (2,J-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]
—N,N— dimethyl— 1—propanaminum trifluoroacetate)等; 0举げられる。
[0017] 「非力チオン性脂質」とは、中性脂質又はァ-オン性脂質を意味し、中性脂質として は、例えば、ジァシルホスファチジルコリン、ジァシルホスファチジルエタノールァミン 、コレステロール、セラミド、スフインゴミエリン、セフアリン、セレブロシド等が挙げられ、 ァ-オン性脂質としては、例えば、カルジォリピン、ジァシルホスファチジルセリン、ジ ァシルホスファチジン酸、 N—スクシ-ルホスファチジルエタノールァミン（N—スクシ- ル PE)、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール 、ホスファチジルエチレングリコール、コレステロールコハク酸等が挙げられる。
[0018] 本発明のリボソームの好ましい態様として、上記ペプチドが疎水性基又は疎水性ィ匕 合物で修飾されており、疎水性基又は疎水性化合物が脂質二重層に挿入され、上 記ペプチドが脂質二重層から露出して 、るリボソームを例示することができる。なお、 本態様において、「ペプチドが脂質二重層力も露出している」には、ペプチドが脂質 二重層の外表面又は内表面の 、ずれか一方力 露出して 、る場合、両方から露出 している場合が含まれる。
[0019] 疎水性基又は疎水性ィ匕合物は、脂質二重層に挿入され得る限り特に限定されるも のでない。疎水性基としては、例えば、ステアリル基等の飽和又は不飽和の脂肪酸 基、コレステロール基又はその誘導体等が挙げられる力 これらのうち特に炭素数 10 一 20の脂肪酸基 (例えば、パルミトイル基、ォレイル基、ステアリル基、ァラキドイル基 等）が好ましい。また、疎水性ィ匕合物としては、例えば、上記に例示したリン脂質、糖 脂質又はステロール、長鎖脂肪族アルコール (例えば、フォスファチジルエタノール ァミン、コレステロール等）、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステル 等が挙げられる。
[0020] 本発明のリボソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エー テル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結'融解法等の公知の方法を用いて 作製することができる。
[0021] 水和法によるリボソームの製造例を以下に示す。
脂質二重層の構成成分である脂質と、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された 上記ペプチドとを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜 を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、へキサン、ヘプタン、シクロへ キサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロ口ホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベ ンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類;メタノール、エタノール等の低級アルコール 類;酢酸メチル、酢酸ェチル等のエステル類;アセトン等のケトン類等が挙げられ、こ れらを単独で又は 2種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を 水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、上記ペプチドを表面に有するリポソ ームを製造することができる。
[0022] また、水和法による別の製造例を以下に示す。
脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除 去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理すること によりリボソームを製造する。次いで、このリボソームの外液に、疎水性基又は疎水性 化合物で修飾された上記ペプチドを添加することにより、リボソームの表面に上記べ プチドを導人することができる。
[0023] リボソームを所定のポアサイズのフィルターで通過させることにより、一定の粒度分 布を持ったリボソームを得ることができる。また、公知の方法に従って、多重膜リポソ ーム力 一枚膜リボソームへの転換、一枚膜リボソーム力 多重膜リボソームへの転 換を行うことができる。
[0024] 本発明のリボソームの内部には、細胞内又は核内に送達しょうとする目的物質を封 人することができる。
目的物質の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、薬物、核酸、ペプチド、タ ンパク質、糖又はこれらの複合体等が挙げられ、診断、治療等の目的に応じて適宜 選択することができる。なお、「核酸」には、 DNA又は RNAにカ卩え、これらの類似体 又は誘導体 (例えば、ペプチド核酸 (PNA)、ホスホロチォエート DNA等）が含まれる 。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいず れであってもよい。
[0025] 目的物質が水溶性である場合には、リボソームの製造にあたり脂質膜を水和する際 に使用される水性溶媒に目的物質を添加することにより、リボソーム内部の水相に目 的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、リボソーム の製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質を添加することにより、リボソームの 脂質二重層に目的物質を封入することができる。
[0026] 目的物質が核酸である場合、封入すべき核酸を予めカチオン性物質と複合体化さ せておくことが好ましい。核酸とカチオン性物質との複合体の存在下、脂質膜を水和 し、次いで攪拌又は超音波処理することにより、核酸とカチオン性物質との複合体が 封入されたリボソームを簡便かつ効率よく製造することができる。
[0027] 「カチオン性物質」とは、その分子中にカチオン性基を有する物質を意味し、静電 的相互作用により核酸と複合体を形成することができる。カチオン性物質の種類は核 酸と複合体を形成し得る限り特に限定されるものではなぐ例えば、カチオン性脂質（ 例えば、 Lipofectamine (Invitrogen社製））；カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、 ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若 しくは共重合体又はこれらの誘導体 (例えばステアリルィヒ誘導体）；ポリエチレンィミン 等のポリカチオン性ポリマー；硫酸プロタミン等が挙げられる力 これらのうち特にステ ァリルイ匕ポリアルギニンが好まし ヽ。ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は 通常 4一 20個であり、好ましくは 6— 12個、さらに好ましくは 7— 10個である。カチォ ン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるものではな 、が、好ましくは 2 個以上である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなぐ例 えば、アミノ基;メチルァミノ基、ェチルァミノ基等のモノアルキルアミノ基;ジメチルアミ ノ基、ジェチルァミノ基等のジアルキルアミノ基;イミノ基；グァ-ジノ基等が挙げられ る。
[0028] 核酸とカチオン性物質との複合体は、その構成比率によって全体としてプラス電荷 又はマイナス電荷を帯びて 、るので、非力チオン性脂質又はカチオン性脂質との静 電的相互作用により、リボソーム内部に上記複合体を効率よく封入することができる。
[0029] 脂質二重層の構成成分である脂質と、疎水性基又は疎水性化合物で修飾された 上記ペプチドとを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより得られ る脂質膜は、カチオン性物質である上記ペプチドを含有しているので、その糸且成によ つては上記複合体と脂質膜との静電的相互作用が弱くなる場合がある。そのような場 合には、上記ペプチドを含有しない脂質膜を使用することが好ましい。上記ペプチド を含有しな ヽ脂質膜は、疎水性基又は疎水性ィ匕合物で修飾された上記ペプチドを 有機溶剤に溶解することなぐ脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解 した後、有機溶剤を蒸発除去することにより得られる。リボソーム表面への上記ぺプ チドの導入は、上記複合体が封入されたリボソームの形成の後に行われる。
[0030] 目的物質を封入したリボソームは、目的物質の細胞内送達用ベクター又は核内送 達用ベクターとして使用することができる。
目的物質を送達すべき細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなぐ動 物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましぐ哺乳動物 であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ゥシ、ヒッジ、ャ ギ、ゥマ、ブタ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、 目的物質を送達すべき細胞の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、体細胞 、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
[0031] 本発明のリボソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒と しては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クェン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液 を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分 子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、 pH調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加し て使用してもよい。
[0032] 本発明のリボソームは、分散液を乾燥 (例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等)させた状 態で使用することもできる。乾燥させたリボソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液，ク ェン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液をカ卩えて分散液とすることができる。
[0033] 本発明のリボソームは、 in vivo及び in vitroのいずれにおいても使用することもでき る。本発明のリボソームを in vivoにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば 、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、 リボソームに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調節することができる。 本発明のリボソームは、 0— 40°Cという広範な温度域 (効果的な温度域は 4一 37°C) において細胞内移行性及び核内移行性を発揮することができるので、目的に応じた 温度条件を設定することができる。低温 (通常 4一 10°C、好ましくは 4一 6°C)におい て細胞内移行性及び核内移行性を効果的に発揮するためには、本発明のリポソ一 ムがエンドサイト一シスを介さずに細胞内又は核内へ移行することが必要である。本 発明のリボソームの表面に存在する上記ペプチドの量が、脂質二重層を構成する総 脂質に対して 2% (モル比）以上、好ましくは 3% (モル比）以上、さらに好ましくは 4% (モル比）以上であると、本発明のリボソームは、低温 (通常 4一 10°C、好ましくは 4一 6°C)において細胞内移行性及び核内移行性を効果的に発揮することができる。この ときの上記ペプチド量の上限値は、脂質二重層を構成する総脂質に対して通常 30 % (モル比）、好ましくは 25% (モル比）、さらに好ましくは 20% (モル比）である。 実施例
[0034] 〔実施例 1〕細胞内移行能及び核内移行能を有するリボソームの作製
以下のように、ォクタアルギニンを表面に有するリボソームを水和法により調製した 。ステアリル化ォクタアルギニン 0. 75mgをエタノール 9. OmLに溶解させる一方、卵 黄ホスファチジルコリン 5. 02mg及びコレステロール 1. lmgをクロ口ホルム 21mLに 溶解させた。両溶解液を混合し、丸底フラスコに収容した (最終クロ口ホルム:エタノー ル比 = 7 : 3)。回転エバポレーターにより溶媒を除去した後、デシケーター内に 2時 間収納して乾燥させた。得られた脂質膜（10 モル)を、予め 50°Cまで温めておい た lmLリン酸緩衝ィ匕生理食塩水を用いて水和させ、 5秒間攪拌した。脂質分散液を 、 400nm、 200nm又は lOOnmのポリカーボネートメンブレンフィルターにそれぞれ 11回ずつ通過させた。これにより、ォクタアルギニン（総脂質の 5モル％)を表面に有 するリボソームが形成された。
[0035] リボソームの蛍光標識は、 1%ローダミン (Rho)又は 1%ローダミン標識フォスファチ ジルエタノールァミン (Rho— PE) (赤色）を取り込ませることにより行った。この際、水 相マーカーとしての Rhoは水和する溶媒中に溶かし，脂質マーカーとしての Rho— P Eはクロ口ホルム溶液に溶かした。
[0036] 共焦点レーザー顕微鏡による観察の下、 NIH3T3細胞（2. 5 X 105細胞 /60mm ディッシュ）を 10%FBS含有 DMEM中でー晚インキュベートした。次いで、 NIH3T 3細胞を、蛍光標識リボソーム (最終脂質濃度 0. 1 μ Μ)を含有する血清不含 DME Μ培養液中でインキュベートした。インキュベーションは、 37°C又は 4°Cで 1時間又は 3時間行った。 4°Cの場合、細胞を 4°Cで 30分間プレインキュペートし、観察するまで この温度に維持した。インキュベーション終了時に細胞を洗浄し、その後、固定する ことなく共焦点レーザー顕微鏡により観察した。細胞核は、蛍光色素 SYT024 (緑色 )を用いて染色した。 [0037] 共焦点レーザー顕微鏡による観察結果を図 1に示す。図 1中、左図は 37°Cの結果 を示し、右図は 4°Cの結果を示す。「R8— Lip」は、ォクタアルギニンを表面に有するリ ポソームの存在位置を表し (黒線で囲まれた小さな白色部分）、「Nucleus」は、核の 存在位置を表す (大きな白色部分)。
[0038] 図 1に示すように、両温度において、ほとんど全ての細胞の細胞質内及び核内でリ ポソームが観察された。なお、 LipofectAMINE試薬（Invitrogen社製）等の従来のトラ ンスフエクシヨン剤では、全細胞のうち 30— 50%程度がトランスフエクシヨンされるに すぎない。また、 4°Cでインキュベートした細胞の場合に検出された細胞内蛍光は、 3 7°Cでインキュベートした細胞の場合に検出された細胞内蛍光の約 70%であった。 これらの結果から、ォクタアルギニンを表面に有するリボソームが細胞内移行性及 び核内移行性を有し、 37°Cはもちろん、 4°Cという低温でも細胞内及び核内に移行 できることが判明した。
[0039] 〔実施例 2〕リボソームによる細胞内への遺伝子送達
ルシフェラーゼ遺伝子及びその上流に CMVプロモーターを有する全長 8454bpの プラスミド（CMVプロモーターを有する pQBIプラスミドにルシフェラーゼ遺伝子を組 み込んだもの） 8 μ g及びステアリル化アルギニン 16 μ gを 10mM HEPESバッファ 一中で攪拌して混合することにより、上記プラスミドとステアリルィ匕アルギニンとの複合 体を調製した。
ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン 0. 672mg及びコレステロールコハク 酸 0. 096mgをクロ口ホルム lmLに溶解させて得られた溶解液のうち 125 μ Lをガラ ス試験管に分取し、窒素ガスを吹き付けて蒸発乾固させ、脂質膜を形成させた。
[0040] 上記複合体含有液 250 μ Lを脂質膜に添加し、室温で 10分間放置することによつ て水和させた。水和後、超音波槽で超音波処理 (数秒間)することにより、上記複合 体が封入されたリボソームを調製した。リボソームの外液に lmg/mLステアリルィ匕 ォクタアルギニン溶液 12 Lを添カ卩し、室温で 30分間放置することにより、リボソーム の表面にォクタアルギニン (総脂質の 5モル0 /0)を導入した。
[0041] (i)上記プラスミドとステアリル化アルギニンの複合体 12. 5 μ L(DNA 0. 4 μ g相当） (ii)上記複合体が封入され、表面にォクタアルギニンが導入されたリボソーム 12. 5 μ L(DNA 0. 4 g相当)、又は
(iii)現在最も強力な遺伝子導入試薬として知られて ヽる LipofectAMINE PLUS試薬 ( Invitrogen社製）、 PLUS試薬 4 L、上記プラスミド（DNA 0. 4 g相当）及び
LipofectAMINE試薬 1 μ L
を、 ΝΙΗ3Τ3細胞 4 Χ 104個に添カ卩し、血清非存在下、 37°Cで 3時間培養した。さら に、血清存在下、 37°Cで 45時間培養した後、ルシフェラーゼ発現活性 (RLU/mgタ ンパク質)を比較した。ルシフェラーゼ発現活性は、細胞溶解液にルシフェラーゼ活 性測定試薬 (luciferase assay system, Promega社製)を加え、ルミノメーターにより化学 発光量を計測することにより測定した。
[0042] ルシフェラーゼ発現活性の測定結果を図 2に示す。図 2中、「DNA複合体」は上記
(i)、「R8リボソーム」は上記（ii)、「LipofectAMIN PLUS試薬」は上記（m)に該当する 図 2に示すように、上記プラスミドとステアリルィ匕アルギニンの複合体は、血清中の 分解酵素等の影響を受けたため、ルシフェラーゼ発現活性が最も低力つた。
LipofectAMINE PLUS試薬は、最も高いルシフェラーゼ発現活性を示した（約 1 X 1010 RLU/mgタンパク質)が、細胞毒性も認められた。上記複合体が封入され、表面にォ クタアルギニンが導入されたリボソームは、 LipofectAMINE PLUS試薬に近い活性（約 1 X 108 RLU/mgタンパク質)を示した力 細胞毒性は認められな力つた。なお、細胞 毒性につ!、ては実施例 3で詳細に検討した。
これらの結果から、ォクタアルギニンが表面に導入されたリボソームに遺伝子を封 入することにより、遺伝子を細胞内及び核内に効率よく送達できることが判明した。
[0043] 〔実施例 3〕リボソームの細胞毒性の評価
生細胞内ミトコンドリアによるホルマザン色素生成を利用した細胞生存率測定法 (M TTアツセィ）によって、実施例 2 (i)、 (ii)及び (iii)の細胞毒性を比較'検討した。 具体的には、実施例 2と同様の条件、すなわち DNA0. 4 8相当の試料を4 104 個の NIH3T3細胞に暴露し、 37°Cで 48時間恒温処理した後、 MTTアツセィにより 細胞生存率（％)を求めた。また、コントロールとして、上記プラスミドのみで処理した 場合の細胞生存率 (％)も同様に測定した。
[0044] 細胞生存率（％)の測定結果を図 3に示す。図 3に示すように、上記プラスミドとステ ァリル化アルギニンの複合体 (実施例 2 (i) ,図 3中「カチオン ZDNA複合体」）及び 上記複合体が封入され、表面にォクタアルギニンが導入されたリボソーム（実施例 2 ( ii) ,図 3中「R8修飾リボソーム封入カチオン ZDNA複合体」）で処理した細胞の生存 率は若干低下した力 有意では無かった。ところが、 LipofectAMINE PLUS試薬（実 施例 2 (iii) ,図 3中「リポフ クトァミン ZDNA」）で処理した細胞の細胞生存率は約 5 0%程度の有意な低下が観察された。
これらの結果から、表面にォクタアルギニンが導入されたリボソームは細胞毒性が 低いことが明らかになった。
[0045] 〔実施例 4〕リボソームの細胞内移行経路の検討
NIH3T3細胞を、表面にォクタアルギニンが導入されたリボソーム (ステアリル化ォ クタアルギニン含有量は総脂質の 5モル％)の存在下 (最終脂質濃度 0. ImM)、ィ ンキュペートした。インキュベートは、スクロース（0. 31M) (高張液）、エンドサイト一 シス阻害剤の混合物（1 μ g/mLアンチマイシン A、 10mM NaF及び 0. 1%アジ 化ナトリウム）又はニスタチン（25 gZmL)の存在下、 37°C又は 4°Cで 1時間実施し た。 NIH3T3細胞は、リボソームを添加する前に、エンドサイト一シス阻害剤の混合 物の存在下で 30分間プレインキュペートした。インキュベーション終了時に、溶媒を 除去し、 NIH3T3細胞を 3回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。 各場合において、蛍光が観察される細胞内領域面積を少なくとも 15細胞について 合計し、その平均値を求め、コントロール細胞の平均値に対する割合を算出した。そ の結果を図 4に示す。なお、図 4中、「低温」は 4°Cにおける結果、「高張液」、「エンド サイト一シス阻害剤」及び「ニスタチン」は 37°Cにおける結果である。
[0046] 図 4に示すように、蛍光が観察される細胞内領域面積にっ 、て、エンドサイト一シス 阻害剤で処理しても有意な低下は観察されな力つた。このことから、表面にォクタァ ルギニンが導入されたリボソームの細胞内移行経路は、エンドサイト一シスにのみ依 存するわけではな 、ことが判明した。
[0047] 〔実施例 5〕アデノウイルスベクターとの比較 実施例 2と同様にして、ルシフェラーゼ遺伝子及びその上流に CMVプロモーター を有するプラスミドとステアリルィ匕アルギニンとの複合体が封入され、表面にォクタァ ルギニンが導入されたリボソーム（図 5中「R8リボソーム」と表す。）を調製し、このリポ ソーム（DNA O. 4 g相当）を懸濁した 0. 25mLの血清不含 DMEM培地を、 24ゥ エルプレートで培養した HeLa細胞又は A549細胞（各 4 X 104細胞/ゥエル）に添加 し、 37°Cで 3時間インキュベートした。 3時間後、 10%ゥシ胎児血清を含む培地 lmL を添加し、さらに 45時間インキュベートした。その後、細胞を溶解し、細胞溶解液に ルシフェラーゼ活性測定試薬 (luciferase assay system, Pr omega社製)をカ卩え、ルシフ エラーゼ活性をルミノメーター（LuminescencerPSN、 ATTO)を用いて測定した。細胞 溶解液中のタンパク質量は BCAタンパク質定量キット（PIERCE、ロックフォード (IL)) を使用して測定した。対照として、リボソームに封入されていない上記プラスミドとステ ァリルイ匕アルギニンとの複合体 (DNA O. 相当）（図 5中「DN A複合体」と表す。 )を用いて、上記と同様にルシフェラーゼ活性及びタンパク質量を測定した。
[0048] 一方、ルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだアデノウイルス (E1—、 E3—及び複製能 力を欠損させ、 E1遺伝子の位置にサイトメガロウィルス 'プロモーター Zェンノヽンサ 一及びルシフェラーゼ遺伝子を含む 5型アデノウイルス)を作製した。アデノウイルス は、ヒト胚腎臓細胞 HEK293を用いて増幅し、塩ィ匕セシウム勾配遠心法によって精 製した。アデノウイルス懸濁液（5 X 103粒子 Z細胞又は 1 X 105粒子 Z細胞）を、 24 ゥエルプレートで培養した HeLa細胞又は A549細胞（各 4 X 104細胞 Zゥエル）に添 加し、血清を含まない培地 0. 25mL中、 37°Cで 3時間インキュベートした。その後、 1 0%ゥシ胎児血清培地 lmLを添加し、 45時間インキュベートした。インキュベート後、 上記と同様にルシフェラーゼ活性及びタンパク質量を測定した。
[0049] ルシフェラーゼ活性 (RLUZmgタンパク質）の測定結果を図 5に示す。図 5 (A)は 、 HeLa細胞を用いた場合の結果であり、図 5 (B)は、 A549細胞を用いた場合の結 果である。
[0050] 5 X 103粒子 Z細胞というアデノウイルス濃度は、通常の報告でよく用いられる濃度 であり、 1 X 105粒子 Z細胞というアデノウイルス濃度は、より高いルシフェラーゼ活性 を得るために、敢えて増量したものである。アデノウイルスは非常に強い細胞毒性を 示すため、アデノウイルス濃度を l X 105粒子 Z細胞以上に増加させることはできな かった。
[0051] 図 5に示すように、プラスミドとステアリルィ匕アルギニンとの複合体が封入され、表面 にォクタアルギニンが導入されたリボソームは、アデノウイルス濃度が 1 X 105粒子 Z 細胞である場合とほぼ同程度のルシフヱラーゼ活性を示した力 細胞毒性は認めら れな力つた。これらの結果から、ォクタアルギニンが表面に導入されたリボソームは、 アデノウイルスベクターと同等の遺伝子発現活性を、アデノウイルスベクターと異なり 細胞毒性を示すことなく発揮できることが判明した。
[0052] 〔実施例 6〕リボソームの細胞内移行経路の検討
NIH3T3細胞をエンドサイト一シス阻害剤であるショ糖 (0. 4M)又はマクロピノサイ トーシス阻害剤であるアミロリド (Amiloride) (2. 5mM)で 10分間前処理した後に、ル シフェラーゼ遺伝子及びその上流に CMVプロモーターを有するプラスミドとステアリ ル化アルギニンとの複合体が封入され、表面にォクタアルギニンが導入されたリポソ ーム（実施例 2参照） (DNA 0. 4 /z g相当）を添加して、 1時間インキュベートした。そ の後、培地を除去し、 20U/mLへパリン含有 PBSで 3回洗浄し、さらに PBSで 1回 洗浄した。洗浄後、血清不含培地で 70分間インキュベートした後、さらに 10%ゥシ胎 児血清を含む培地を lmL添カ卩して 12時間インキュベートした。 12時間インキュベー ト後、実施例 5と同様にルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールとして、エンドサ イト一シス阻害剤であるショ糖及びマクロピノサイト一シス阻害剤であるアミロリド（ Amiloride)で前処理して!/ヽな ヽ NIH3T3細胞を用いた。
[0053] 結果を図 6に示す。
図 6に示すように、エンドサイト一シス阻害剤であるショ糖で細胞を前処理した場合 、顕著な影響は観察されな力つたが、マクロピノサイト一シス阻害剤であるアミロリド（ Amiloride)で細胞を前処理した場合、ルシフェラーゼ活性の顕著な低下が観察され た。
[0054] マクロピノサイト一シスでは、細胞外物質がマクロピノソームという画分として細胞内 に取り込まれ、マクロピノソームはエンドノームと異なりリソノームと融合しないため、マ クロピノソーム内封物はリソソームによる分解を回避できると考えられる。このことから、 ォクタアルギニンが表面に導入されたリボソームの細胞内移行経路は、マクロピノサ イト一シスを介することが示唆された。
[0055] 〔実施例 7〕リボソームの細胞内移行経路の検討
NIH3T3細胞を、エネルギー代謝阻害剤（Metabolic inhibitors :アジ化ナトリウム 0 . 1%、フッ化ナトリウム 10mM及びアンチマイシン A 1 gZmLを含む）又はエンド サイト一シス阻害剤であるショ糖 (0. 4M)共存下 37°Cで 30分間、あるいはマクロピノ サイト一シス阻害剤であるアミロリド (Amiloride) (5mM)共存下 37°Cで 10分間、ある いは阻害剤非共存下 4°Cで 30分間インキュベートした後、ォクタアルギニンが表面に 導入され、ローダミン色素が内水相に封入されたリボソーム (ォクタアルギニン含有量 は総脂質の 0. 8モル％又は 5モル％)を添加し、 1時間インキュベートした。その後、 細胞を 20UZmLへパリンを含む PBSで洗浄し、さらにトリプシン処理後、遠心分離 し、再びへパリン含有 PBSで 2回洗浄した。洗浄済み細胞をナイロン 'メッシュによつ てろ過したものをフローサイトメーター（FACScan、ベタトン'ディキンソン）によって解 祈した。なお、コントロールとして、阻害剤非共存下 37°Cで 30分間インキュベーショ ンした細胞を用い、コントロールにおける細胞内取込量を 100%として、各場合にお ける細胞内取込量（％)を評価した。
[0056] 結果を図 7に示す。
図 7に示すように、ォクタアルギニン含有量が総脂質の 0. 8モル％である場合、ェ ネルギー代謝阻害剤共存下、エンドサイト一シス阻害剤であるショ糖共存下、及び低 温 (4°C)下で細胞内取込量が顕著に阻害された。一方、ォクタアルギニン含有量が 総脂質の 5モル％である場合、エネルギー代謝阻害剤共存下、及びマクロピノサイト 一シス阻害剤であるアミロリド共存下で細胞内取込量が顕著に阻害された。
[0057] これらの結果から、（1)ォクタアルギニンが表面に導入されたリボソームは、ォクタァ ルギニン含有量に関わらず、エネルギーを必要とする経路で細胞内に取り込まれる こと、（2)ォクタアルギニン含有量が総脂質の 0. 8モル0 /0である場合、ォクタアルギ- ンが表面に導入されたリボソームは、エンドサイト一シスを介して細胞内に取り込まれ ること、（3)ォクタアルギニン含有量が総脂質の 5モル％である場合、ォクタアルギ- ンが表面に導入されたリボソームは、マクロピノサイト一シスを介して細胞内に取り込 まれること、（4)低温 (4°C)における細胞内への取り込みは、ォクタアルギニン含有量 が少ないときには誘導されないこと、が示唆された。すなわち、ォクタアルギニン含有 量をコントロールすることにより、ォクタアルギニンが表面に導入されたリボソームの細 胞内移行経路をコントロールできることが判明した。
図面の簡単な説明
[図 1]蛍光標識リボソームとともにインキュベートとした細胞の共焦点レーザー顕微鏡 による観察結果を示す図である。
[図 2]各種条件おけるルシフ ラーゼ発現活性の測定結果を示す図である。
[図 3]各種条件における細胞生存率 (％)の測定結果を示す図である。
[図 4]各種条件において蛍光が観察される細胞内領域面積を比較した結果を示す図 である。
[図 5]各種条件おけるルシフ ラーゼ発現活性の測定結果を示す図である。
[図 6]各種条件おけるルシフ ラーゼ発現活性の測定結果を示す図である。
[図 7]各種条件におけるリボソーム細胞内取込量の測定結果を示す図である。

Claims

請求の範囲
[I] 連続した複数個のアルギニン残基を含むペプチドを表面に有するリボソーム。
[2] 前記ペプチドが連続した 4一 20個のアルギニン残基を含む請求項 1記載のリポソ ーム。
[3] 前記ペプチドがアルギニン残基のみ力 なる請求項 1又は 2記載のリボソーム。
[4] 脂質二重層を構成する総脂質に対するカチオン性脂質の割合が 0— 40% (モル比
)である請求項 1一 3のいずれかに記載のリボソーム。
[5] 前記ペプチドが疎水性基又は疎水性化合物で修飾されており、前記疎水性基又 は前記疎水性化合物が脂質二重層に挿入され、前記ペプチドが前記脂質二重層か ら露出している請求項 1一 4のいずれかに記載のリボソーム。
[6] 前記疎水性基がステアリル基である請求項 5記載のリボソーム。
[7] 細胞内又は核内へ送達しょうとする目的物質が封入されている請求項 1一 6のいず れかに記載のリボソーム。
[8] 前記目的物質が薬物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖又はこれらの複合体である 請求項 7記載のリボソーム。
[9] 前記目的物質が核酸であって、前記核酸とポリカチオン性物質との複合体が内部 に封入されて 、る請求項 8記載のリボソーム。
[10] 前記ポリカチオン性物質がステアリルィ匕ポリアルギニンである請求項 9記載のリポソ ーム。
[II] 前記目的物質の細胞内送達用ベクターである請求項 7— 10のいずれかに記載のリ ポソーム。
[12] 前記目的物質の核内送達用ベクターである請求項 7— 10のいずれかに記載のリポ ノーム。
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