WO2005026348A1 - スクリーニング方法 - Google Patents

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WO2005026348A1
WO2005026348A1 PCT/JP2004/013396 JP2004013396W WO2005026348A1 WO 2005026348 A1 WO2005026348 A1 WO 2005026348A1 JP 2004013396 W JP2004013396 W JP 2004013396W WO 2005026348 A1 WO2005026348 A1 WO 2005026348A1
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cell
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PCT/JP2004/013396
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Inventor
Ryogo Hayashi
Yuji Iizawa
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
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    • G01N33/56927—Chlamydia
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis

Definitions

  • the present invention relates to a remedy for arteriosclerosis and a method and kit for screening for a preventive and remedy for its complications. More specifically, the present invention relates to a 60 kDa heat shock protein (hereinafter, referred to as “HSP60”) derived from Chlamydia pneumoniae (hereinafter sometimes abbreviated as “Cp”). And a screening method for a therapeutic drug for arteriosclerosis and a prophylactic / therapeutic drug for its complications using a mammalian monocyte cell line, and a kit therefor.
  • HSP60 60 kDa heat shock protein derived from Chlamydia pneumoniae
  • Chlamydia pneumoniae an obligate intracellular parasitic gram-negative bacterium, is one of the major causative agents of central pneumonia, as well as arteriosclerosis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease, Alzheimer's disease, A link to chronic disease has been suggested.
  • Arteriosclerosis (especially atherosclerosis) is the leading cause of death in Japan, the United States and Europe in acute coronary syndrome (ACS; including acute myocardial infarction and unstable angina) and cerebrovascular disease (especially ischemic cerebrovascular disease). Cerebral infarction, cerebral embolism, cerebral thrombosis, etc.).
  • ACS acute coronary syndrome
  • cerebrovascular disease especially ischemic cerebrovascular disease. Cerebral infarction, cerebral embolism, cerebral thrombosis, etc.).
  • the association of Cp with arteriosclerosis has begun to be noticed since a study of road fatalities reported that atherosclerotic lesions correlated with the prevalence of serum anti-Cp antibodies (Saikku, P Et al., Lancet (UK), 1988, Volume 2, pp. 983-9886).
  • C p derived HSP 6 0 (hereinafter, "sometimes referred to as the chs P 60 j) Gahi detected from the capital of atherosclerotic lesions (Kol, A. et al., Circulation (USA), 1 9 9 8 year, 9 8 Certificates, pp.
  • Ma tri Kkusumeta primary macro port phage differentiated from human monocytes is one of collagenolytic enzymes when stimulated with chs P 60 It has been reported that the production of oral proteinase-9 (hereinafter sometimes abbreviated as “Maraudal P-9”) is increased (Vehmaan-Kreula, P. et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. (USA), 2001, Vol. 21, pp. El — e 8).
  • MMP-9 is overproduced in advanced human atherosclerotic lesions, and is strongly expressed and activated especially in ruptured lesions (Loftus, ⁇ ⁇ et al., Stroke (USA), 2000, No. 3). 1 roll, pp. 40-47).
  • high levels of MMP-9 in plasma may be a risk factor for death from cardiovascular disease, and polymorphisms in the MMP-9 gene are stable.
  • Significantly correlated with future incidence of cardiovascular events in angina patients. (Blankenberg, S. et al., Circulation (USA), 2003, Volume 107, Volume 157. 9-15885)
  • MMP-9 knockout mice the progression of lesions in atherosclerosis is suppressed, etc. (Luttun, A. et al., Circulation ( United States), 2004, Vol. 109, pp. 148-141).
  • Atherosclerosis refers to a condition in which the vascular lumen is narrowed by plaques covered with collagen fibers, but clinical findings suggest that ACS such as myocardial infarction and angina pectoris may occur. It is considered that plaque characteristics rather than stenosis are more important in the event of coronary artery with thrombus formation leading to stenosis. In other words, the hypothesis that lesions with a large lipid core and a thin fibrous cap covering them are susceptible to breakage and have a high risk of developing complications is supported (Libby, P., Circulation ( (United States), 1995, Vol. 91, pp. 284-4—2805).
  • Collagen is the main component of the fibrous cap covering the plaque surface, and matrix meta-oral proteases (MMPs), which are collagenases, can directly weaken the cap (Young, JL et al., Thrombosis and Haemostasis (Germany), 2008, Vol. 88, pp. 554-567, Jones, CB) et al., Cardiovascular Research (Netherlands), 2003, Vol. 59, pp. 8 1 2 — 8 2 3). Plaque rupture is caused by the fact that Mac phage ⁇ vascular smooth muscle cells activated by T cells take up oxidized LDL 'and foam, and the fibrous cap is weakened by MMPs secreted from the resulting foam cells. And it is thought to happen. Among them, MMP-9 is considered to play a major role in plaque destabilization, since significant production enhancement was observed in broken plaque.
  • MMPs matrix meta-oral proteases
  • lasidipine a hypertension treatment, suppressed ⁇ -9 secretory production in mouse macrophages stimulated by phorbol ester and tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), but (Be ⁇ losta, S. et al. The Journal of Pharmacology and Experiments ⁇ Therapeutics (USA), 2001, Vol. 296, No. 3, pp. 7 36— '7 4 3), Results of clinical trials show that lasidipine inhibits the progression of arteriosclerosis The power to be effective has been demonstrated (Zanchetti, A. et al., Circulation (USA), 2010, Vol.
  • substances that can suppress the overproduction of ⁇ P-9 from macula phage or the like due to CP infection or chsp60 stimulation can be used for treatment of arteriosclerosis, suppression of progression (especially ACS, ischemic cerebrovascular It is expected as a new drug that is effective for the prevention of serious complications such as disorders) or the treatment of those complications.
  • a compound screening system having sufficient sensitivity to be used as an evaluation system for such a drug and having excellent reproducibility has not been known so far. It is possible to induce high levels of ⁇ -9 production by stimulating with cholesterol esters or TNF- ⁇ , as in the efficacy evaluation system for statins and lacidipine described above.
  • an object of the present invention is to provide a screening method capable of selecting a substance capable of suppressing the overproduction of MMP-9 from Mac phage or the like caused by C ⁇ infection or chsp60 stimulation with high sensitivity, reproducibility and efficiency.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, using a monocyte cell line (eg, THP-1 cell line) as an MMP-9-producing cell, infected it with CP.
  • a monocyte cell line eg, THP-1 cell line
  • MMP-9 expression was significantly higher than monocytes isolated from blood or primary macula phages that differentiated them.
  • the present inventors have further studied based on these findings, and have completed the present invention.
  • a monocyte cell line and a 60 kDa heat shock protein derived from Chlamydia 'pneumoniae or a partial peptide thereof or a salt thereof or a cell capable of producing the same (the cell is a monocyte cell line)
  • a method for treating atherosclerosis and preventing or preventing Z or its complications, screening for therapeutic substances
  • a monocyte cell line is selected from the group consisting of THP_1, U-937, P31 / FUJ, RAW 267.4 and J774A.
  • the monocyte cell line is a THP-1 cell line.
  • a monocytic cell line and a cell capable of producing a 60 kDa heat shock protein derived from 'Chlamydia' pneumoniae or its partial peptide or a salt thereof, or a cell capable of producing it which may be the same as or different from keratinocytes), for treating arteriosclerosis and / or for preventing its complications.
  • Chlamydia pneumoniae-derived 6 O kDa heat shock protein or a cell capable of producing a partial peptide or a salt thereof is a Chlamydia pneumoniae.
  • a monocyte cell line is selected from the group consisting of THP-1, U-937, P31FUJ, RAW264.7 and J774A.1.
  • Atherosclerosis comprising a substance capable of inhibiting the induction of Matrix meta-oral proteinase 9 gene expression in mammalian cells by a 60 kDa heat shock protein derived from Chlamydia pneumoniae Treatment and / or prevention of its complications
  • FIG. 1 shows the changes in the induction of TNFa (FIG. 1A) and MMP-9 (FIG. 1B) production in monocyte cell lines induced by chsp60 stimulation.
  • FIG. 2 shows the dependence of the induction of MMP-9 production in a monocyte cell line on the concentration of chsp60. Detailed description of the invention
  • the method for treating arteriosclerosis and the prevention of Z or its complications of the present invention is as follows: a monocyte cell line and a 60 kDa heat shock protein derived from Chlamydia pneumoniae. Alternatively, a partial peptide thereof, a salt thereof, or a cell capable of producing the same is used.
  • treatment of arteriosclerosis means, for example, suppression of progression of atherosclerotic lesions ⁇ stabilization of plaque
  • “complications of arteriosclerosis” include, for example, acute myocardial infarction, Cardiovascular and cerebral vascular events such as acute coronary syndrome (ACS) such as unstable angina, cerebral infarction, cerebral thrombosis, and cerebral embolism.
  • ACS acute coronary syndrome
  • the chsp60 used in the present invention is not particularly limited in its origin as long as it is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, for example, naturally It can be isolated from various isolates of Chlamydia pneumoniae (eg, clinical isolates from pneumonia patients). Further, it may be chemically synthesized based on the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and may be obtained from a transformant into which a nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence has been introduced. It may be a produced recombinant protein. Alternatively, the nucleic acid is It may be a protein synthesized biochemically using a cell-free (transcription) translation system.
  • the amino acid sequence J substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is at least about 60%, preferably at least about 70%, more than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence has about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably 95% or more of homology.
  • homology refers to an optimal alignment (preferably, the algorithm is optimized for optimal alignment) when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art.
  • the ratio of the same amino acid and similar amino acid residues to all overlapping amino acid residues (° / 0 ) can be taken into account.
  • Similar amino acids means amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), and polar amino acids (Gln, Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), small side chain amino acids (Gly, Ala, Ser, Thr, Met), etc. Amino acids classified into the same group as above. It is expected that such substitution with a similar amino acid will not change the phenotype of the protein (ie, a conservative amino acid substitution). Examples of conservative amino acid substitutions are well known in the art and are described in various documents (see, for example, Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990)).
  • Algorithms for determining the homology of amino acid sequences include, for example, the algorithm described in Karlin et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) [The algorithm is NBLAST and XBLAST program (version 2.0) This thread is inserted (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25 .: 3389-3402 (1997))], Needle sleep et al., J. Mol. Biol.
  • the amino acid sequence that is substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is at least about 60%, preferably about 60%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the “protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” includes the aforementioned “amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2”. And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • “activity” refers to mammals (eg, humans, monkeys, lions, pomas, pigs, higgs, goats, dogs, cats, puppies, nomsters, monoremots, mice, rats, etc.).
  • MMP-9 expression enhancing activity in cells eg, leukocyte cells including monocyte cells such as monocytes and macrophages, and cells existing in blood or vascular wall such as vascular smooth muscle cells
  • plaque destabilization fibrosis "Substantially homogeneous” means that their activities are qualitatively equivalent (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, It is preferable that the expression of MMP-9 is as high as the strong activity (eg, 0.5 to 2 times). The quantitative factors such as the force S, the degree of these activities, and the molecular weight of the protein may be different.
  • MMP-9 expression-enhancing activity can be measured, for example, by the method described in Non-Patent Document 5 or the like (ELISA using anti-banded P-9 antibody, gelatin zymography, quantitative RT-PCR) or a method similar thereto. Can be performed according to
  • ch S p60 for use in the present invention, for example, 1) one or two or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (e.g. 1 to 5 0 or so, 3 0 preferably 1 to Amino acid sequence in which about 1 to 10 amino acids have been deleted, and more preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably 1 to 5 amino acids.
  • SEQ ID NO: 2 e.g. 1 to 5 0 or so, 3 0 preferably 1 to Amino acid sequence in which about 1 to 10 amino acids have been deleted, and more preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably 1 to 5 amino acids.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the chsp60 in the present invention preferably has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and has a chlamydia 'pneumoniae KKpn- ;! strain [Ki shimoto T. and Soejima R., Intern. Med., 32: 934- 937 (1993)] [the KKpn-1 Chs P 60 recombinant E.
  • proteins and peptides are described according to the convention of peptide labeling, with the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end. Containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n - propyl, isopropyl
  • alkyl groups such as n- butyl; for example, C 3 _ 8 Shikuroarukinore groups such as cyclohexyl consequent opening pentyl, consequent opening; e.g. , phenyl, alpha - 12 Ariru group - C 6, such as naphthyl; - 14 Ararukiru group C 7 such as ⁇ - naphthylmethyl etc.
  • a- Nafuchiru CM alkyl group for example, benzyl, phenylene Lou alkyl group, such as full Enechiru
  • a piperyloxymethyl group is used.
  • chsp60 has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus
  • those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in chsp60.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • chsp60 has an amino group at the N-terminal amino acid residue (eg, a methionine residue) protected with a protecting group (eg, an acyl group such as an alkanol such as a formyl group or an acetyl group), Cut in vivo N-terminal daltamine residue generated by cleavage is pyroglutamine-oxidized.
  • a protecting group eg, an acyl group such as an alkanol such as a formyl group or an acetyl group
  • Cut in vivo N-terminal daltamine residue generated by cleavage is pyroglutamine-oxidized.
  • Substituents on the side chains of amino acids in the molecule for example, --OH, --SH, amino group, imidazole group, indole group Or a guadino group
  • an appropriate protecting group for example, an acyl group such as an alkanol group such as a formyl group or an
  • chs P 60 partial peptide (hereinafter, sometimes simply referred to as "partial peptide of the present invention") is a pair flops tide having a partial amino acid sequence of chsp60 described above, and chsp60 substantially the same activity Any one may be used as long as it has.
  • “substantially the same activity” is as defined above.
  • the measurement of "substantially equivalent activity” can be Nau row as in the case of chs P 60.
  • the partial peptide of the present invention includes, for example, those having a partial amino acid sequence including a region involved in enhancing MMP-9 expression in mammalian cells, among the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the like. Used.
  • a peptide having at least 50 or more, preferably 100 or more, more preferably 200 or more amino acids is preferable.
  • the partial peptide of the present invention may have a carboxyl group (one COOH), a carboxylate (—COO—), an amide (one C ⁇ NH 2 ) or an ester (one COOR) at the C-terminus.
  • R in the ester those similar to those described above for chspSO can be mentioned.
  • the partial peptide of the present invention has a carboxyl group (or a carboxylate) other than the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, those similar to the C-terminal ester and the like are used.
  • the partial peptide of the present invention includes a peptide in which the amino group of the N-terminal amino acid residue is protected with a protecting group, and a peptide in which the N-terminal daltamine residue is oxidized with glutamine.
  • examples include those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, and those in which sugar chains are bonded, such as so-called glycopeptides.
  • the chs P 60 or a salt thereof partially peptidyl 'de physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) or bases (eg, alkali metal salts) and salts with such used, preparative Ri
  • physiologically acceptable acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • chs P 60 or a salt thereof can be prepared as described above, the protein separation and purification techniques per se publicly known from cells of the various C p strains.
  • a culture medium suitable for chlamydia growth by infecting Cp with suitable host cells such as human lung-derived cultured cells (eg, HL cells) (eg, Eagle medium supplemented with cycloheximide) After culturing for an appropriate period of time, disrupt cells by sonication or the like, and purify large quantities of Cp cells by density gradient centrifugation.
  • the soluble fraction is separated by reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like, thereby obtaining chsp60 or a salt thereof. Can be purified.
  • chsp60 or a partial peptide thereof or a salt thereof can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting chsp60s with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • condensation and the elimination of the protecting group are performed according to a method known per se, for example, the methods described in the following 1) to 5).
  • the protein (peptide) thus obtained can be purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, the protein (peptide) '
  • the salt can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • ch the synthesis of SP 60 include, typically, may be a commercially available resin for protein synthesis.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, Benzoxybenzyl alcohol resin, 4-methylinobenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,, 4, Examples thereof include 1-dimethyoxyphenyl-2-hydroxymethyl) phenoxy resin, and 41- (2,4, -dimethoxy-Fmocaminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to the sequence of the target protein (peptide) according to various known condensation methods.
  • proteins and other substances are cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • a disulfide bond formation reaction in a molecule is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein (peptide) or its amide Get the body.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • the carbodiimides DCC, ⁇ , N'-diisopropyl rubodiimid, ⁇ -ethyl- ⁇ , 1- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and the like are used.
  • Condensation of the protected amino acid can be performed, for example, by directly adding the protected amino acid to the resin together with an activating reagent and a racemization inhibitor (e.g., HOBt, HOOBt), or by adding the protected amino acid in advance to a symmetric anhydride or HOB ester or Activated as HOOB t-ester and then added to the resin.
  • an activating reagent e.g., HOBt, HOOBt
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin is appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone; methylene chloride; Halogenated hydrocarbons such as trifluoroethanol; sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; amines such as pyridine; ethers such as dioxane and tetrahydrofuran; and ethers such as acetonitrinole and propionitrile. Tolyls; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or appropriate mixtures thereof.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be used for the protein condensation reaction, and is usually selected from the range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. If condensation is insufficient as a result of the test using the dihydrin reaction, sufficient condensation can be achieved by repeating the condensation reaction without removing the protecting group.
  • condensation is not sufficient even after repeating the condensation reaction, sufficient condensation can be carried out by acetylating the unreacted amino acid with acetic anhydride or acetylimidazole.
  • the method for protecting the functional groups that should not be involved in the reaction of the raw materials, the method for elimination of the protective groups and the protective groups, and the method for activating the functional groups involved in the reaction are appropriately selected from known groups or known means Can.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, Boc, t-Pentinoleoxycanoleponinole, isobonoleninoleoxy power / reponinole, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, and C-methoxybenzyloxycarbonyl.
  • 1 Z, Br — Z, adamantyl oxycanoleboninole, tri-funoleoloacetinole, phta leonore, honoleminole, 2 —Nitropheninolenes renoenore, dihue-norephosfuinothioinole, F m 0 c and the like.
  • the carboxyl group of the starting amino acid is, for example, alkyl esterified (for example, straight chain such as methinole, ethinole, propinole, petitinole, t-butylinole, cyclopentinole, cyclohexinole, cycloheptyl, cyclooctinole, 2-rydamantyl, etc.) , Branched or cyclic alkyl esterification), aral Kill esterification (eg, Nginoleestenole, 412 Trobenginoleestenole, 4-Methoxypentinoleestenole, 4-chlorobenzineoleestenole, Benzhydryl esterification), phenacyl esterification, penzinoleoxy It can be protected by carboxylhydrazide, t-butoxycarbhydrazide, tritylhydrazide and the like.
  • alkyl esterified for example, straight chain such
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for esterification include, for example, those derived from carbonic acids such as lower (C ⁇ ) alkanol groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups. Groups and the like.
  • Examples of the group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydroviranyl group, and a t-butyl group.
  • protecting groups for histidine imidazonoles include Tos, 4-methoxy-1,2,3,6-trimethinolebenzenesnolehoninole, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, and Trt. , Fmoc and the like are used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon; anhydrous hydrogen fluoride, methanesnolefonic acid, and triflic acid.
  • Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid, or a mixture thereof; base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc .; reduction with sodium in liquid ammonia. .
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C to 40 ° C.
  • cation scavengers such as' anisole, phenol, thioaesole, methacresolone, noracrezo monoleme, dimethinoresnoleide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • the addition is effective.
  • the 2,4-di-trophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is removed by thiophenol treatment.
  • the forminole group used as an indole protecting group for tributofan includes deprotection by acid treatment in the presence of 1,2-ethanedithionole, 1,4-butanedithionole, etc., as well as dilute sodium hydroxide solution, It is also removed by alkaline treatment with dilute ammonia.
  • Activated carboxyl groups of the starting amino acids include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2, 4, 5 Phenols, 2,4-dinitrophenol, cyanomethanol alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimid, and esters with HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2, 4, 5 Phenols, 2,4-dinitrophenol, cyanomethanol alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimid,
  • an amide form of a protein for example, after amidating and protecting a monocarboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide chain is added to the amino group side to a desired chain length. After the elongation, a protein (peptide) in which only the N-terminal ⁇ -amino group protecting group of the peptide chain has been removed and a protein (peptide) in which only the C-terminal carboxyl group protecting group has been removed are produced, The two proteins (peptides) are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the ester form of the protein (peptide) can be obtained, for example, by condensing the carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then treating the ester form of the protein (peptide) as described above. Can be obtained.
  • the partial peptide or a salt thereof of the present invention can also be produced by cleaving chsp60 or a salt thereof with an appropriate peptidase.
  • Chsp60 such is prepared by culturing the Chsp60 or transformant transformed with a expression vector containing a nuclear 'acid encoding a partial peptide thereof, separating and purifying ch S p60 acids from the resulting culture Yobutsu You can also.
  • the nucleic acid encoding chsp60 or a partial peptide thereof may be DNA or RNA, or may be a DNAZRNA chimera.
  • DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded DNA, double-stranded DNA or double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid can be used. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • the DNA encoding chsp60 or its partial peptide was prepared by reverse transcription from genomic DNA extracted from Cp cells by conventional methods, or RNA extracted from Cp cells by conventional methods (or by RT-PCR). Amplified DNA) and chemically synthesized DNA.
  • DNA encoding chsp60 or a partial peptide thereof specifically, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions Hybridi A protein (eg, an MMP-9 expression-enhancing activity) having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 ), And the like.
  • Examples of a DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under high stringent conditions include, for example, about 60% in a region overlapping with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • DNA having a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization is carried out by a method known per se or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning, 2nd edition, U. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. ) [This can be done according to the method described on my own. When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can be performed, preferably according to high stringency conditions.
  • stringent conditions refers to about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% in a region overlapping with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more under conditions capable of hybridizing with a DNA having a nucleotide sequence having a homology of about 95% or more.
  • a sodium concentration of about 19 to 40 m M, preferably about 19 to 20 mM at a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C, particularly preferably at a sodium concentration of about 19 mM. Is about 65 ° C.
  • the salt concentration of the hybridization solution the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, and the hybridization.
  • the desired stringency can be easily adjusted by appropriately changing the reaction time, salt concentration of the washing solution, washing temperature and the like.
  • the DNA encoding chsp60 or its partial peptide is preferably a DNA containing a part of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a part of the nucleotide sequence in which the reading frame of the codon matches (that is, in-frame). And so on.
  • chs P 60 or a DNA co one de that part peptide is or The protein using synthetic DNA primers one having a portion of the base sequence that co one de the peptide, cells producing chs P 60 (e.g. Ability to amplify by PCR using genomic DNA or cDNA derived from Cp cells) as a mold, or an appropriate cloning vector for the genomic DNA fragment or cDNA (eg, Batateriophage, Plasmid, Cosmid) Phagemid), and screened by coloie or plaque hybridization using a probe labeled with a DNA fragment coding for a part or all of chsp60 or synthetic DNA as a probe.
  • synthetic DNA primers one having a portion of the base sequence that co one de the peptide
  • cells producing chs P 60 e.g. Ability to amplify by PCR using genomic DNA or cDNA derived from Cp cells
  • an appropriate cloning vector for the genomic DNA fragment or cDNA eg, Batateriophag
  • hybridization can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition (described above). When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual attached to the library.
  • a DNA encoding chsp60 or a partial peptide thereof can also be cloned by an antibody screening method using an anti-chsp60 antibody.
  • the RACE method can be used as a method for quickly and easily obtaining a full-length cDNA clone.
  • oligonucleotides homologous to the partial base sequences of the sense strand and antisense strand of double-stranded DNA corresponding to a part of the cDNA of chsp60 are synthesized, and appropriate oligonucleotides are used.
  • a DNA encoding chsp60 or a partial peptide thereof can be chemically synthesized based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 using a commercially available automatic DNA / RNA synthesizer. It is also possible to synthesize a full-length DNA by synthesizing fragments of the sense strand and the antisense chain so as to overlap each other, hybridizing these fragments, and combining the PCR method and the like.
  • the DNA base sequence can be determined using known kits such as Mutan " 1 -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), 0M-LA PCR, and Gapped duplex.
  • the conversion can be carried out according to a method known per se such as the Kunkel method or a method similar thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is, after digestion with a restriction enzyme, or after addition of a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation start codon and translation stop codon can be added using a suitable synthetic DNA adapter. '
  • chs P 60 or expression downy click terpolymer containing a nucleic acid co one de that part peptide may, for example, excising the desired DNA fragment from the DNA encoding Chsp60, the DN A fragment suitable expression vector in It can be produced by connecting to the downstream of the promoter.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUCl2pUCl3; a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194); a plasmid derived from yeast (eg, p SH19, pSH15); pacteriophages such as ⁇ phage; animal viruses such as retroinoles, vacsuawinores, and noculoinoles; pA1-11, pXT1, Rc / CMV; pRc / RSV, pcDNAI / Neo, etc. are used.
  • Any promoter can be used as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • T 7 promoter When the host is a Eshieri HERE spp, t rp promoter, lac flop port motor, rec A promoter, LP L promoter, lpp promoter one coater, Le Shi like are preferred T 7 promoter.
  • a PH05 promoter When the host is yeast, a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter and the like are preferred.
  • a polyhedrin promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • SRo when the host is an animal cell, SRo; promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, HSV-TK promoter and the like are used. Among them, preferred are CMV promoter, SRa promoter and the like.
  • Examples of the expression vector include, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired. What they contain can be used.
  • a selection marker for example, Ann Pishiri down resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Am p r), Neomai Shin-resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as o r, G 4 1 8 resistance), Te Torasaitarin resistance gene, hygromycin resistance gene, dihydric de port reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [Meso-trexate (MTX) resistance].
  • Am p r Ann Pishiri down resistance gene
  • Neomai Shin-resistant gene hereinafter sometimes abbreviated as o r, G 4 1 8 resistance
  • Te Torasaitarin resistance gene hereinafter sometimes abbreviated as hygromycin
  • a signal sequence suitable for the host may be added to the N-terminal side of chsp60. If the host is Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc .; if the host is Bacillus ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. If the host is yeast, When the host is an animal cell, an insulin signal sequence, an ⁇ -interferon signal sequence, an antibody molecule signal sequence, etc. are used. '
  • a transformant containing DNA encoding chsp60 or a partial peptide thereof can be produced by transforming a host with an expression vector containing the DNA according to a known method.
  • the expression vector includes those described above.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K12, DH1 [Procedures, Op., The National, Op. USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 16 (1968)], JM 103 (Nucleic Acids Research, 9, 30) 9 (1 981)], JA 221 [Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 5 17 (1 9 7 8)], HB 10 1 [Journal 'ob''molecular' bio For example, 41 volumes, 495 (1969), C600 [Genetics, 39 volumes, 440 (1954)] and the like are used.
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207—21 'Journal of Biochemistry, 95, Vol. 87 (1989)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R ", NA87-111A, DKD-5D, 2OB-12, Schizosaccharomyces bomb (Schizosaccharomyces bomb). 'pombe) NCYC 1913, N CYC 230 36, Pichia pastoris KM71 and the like are used.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night-moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell),
  • MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, High Five TM cells derived from eggs of Trichoplusia ni, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like are used.
  • viruses When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N cell; BmN cell) or the like is used as the insect cell.
  • Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711) and Sf21 cell (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977) ) Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 3115, 592 (19985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7, V ero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr ⁇ ) cell). ), Mouse L cell, mouse AtT—20, mouse myelo Mammal cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
  • Escherichia bacterium is described, for example, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2 Transformation can be performed according to the method described in 110 (1972), Gene, Vol. 17, 107 (1982) and the like.
  • Bacillus spp. Can be transformed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Volume 168, 11 (1979), etc. .
  • Yeasts are described, for example, in Methods in Enzymology, Vol. 194, Vol. 182 — 187 (1991), Proceedings of the National Academy Op. Transformation can be performed according to the method described in Sciences of the USA, USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 1929 (19778). Insect cells and insects are, for example, bio Z technology (
  • the transformant can be cultured according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferable as the medium used for the culture.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like necessary for growing the transformant.
  • a carbon source for example, dalcose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • a nitrogen source for example, ammonium salts, nitrates, corn-like liquor, peptone, Inorganic or organic substances such as casein, meat extract, soybean meal, and potato extract
  • examples of the inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the medium may be supplemented with yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like. ⁇ of the medium is preferably about 5 to about 8.
  • a medium for culturing a transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia for example, a medium containing glucose and casamino acid can be used (for example, Miller, Miller, Gianna Leob 'Experiment'in'Molecular) 'Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-43, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • an agent such as 3j3-indolylacrylic acid may be added to the medium to make the promoter work efficiently.
  • Culture of the transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia is usually performed at about 15 to about 43 ° C. for about 3 to about 24 hours. Ventilation and agitation may be performed if necessary. Culture of the transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Bacillus is usually performed at about 30 to about 40 ° C for about 6 to about 24 hours. If necessary, ventilation or stirring may be performed.
  • a culture medium for culturing a transformant in which the host is yeast for example, a minimal medium (Burkholder) [Bostian, KL et al., Proc. Onethings Op The Nashinanore Academy Academy Of Sciences' Ob The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77, 4500 (1980) ] Or an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Processing of the National Academy of Sciences Opus USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81 volumes, 5330 (1994)].
  • the pH of the medium is preferably from about 5 to about 8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 ° C. to about 35 ° C.
  • a medium for culturing a transformant in which the host is an animal cell for example, a MEM medium containing about 5 to about 20% fetal bovine serum [Science, Volume 122, Volume 501] (1952)], DMEM medium [Virology, 8 vol., 39 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the medium] '' Medical Association (The Journal of the American Medical Association No. 9: ,, 5 19 (1 9 6 7)), 19 9 Medium [Proceding of the Society for the No. Physiological Medicine (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), Volume 73, 1 (1950)], etc.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to about 8. It is usually carried out at about 30 ° C. to about 40 ° C. for about 15 to about 60 hours. Or stirring may be performed. '
  • chspSO or a partial peptide thereof or a salt thereof can be produced in the cell, in the cell membrane, or outside the cell of the transformant.
  • Chsp60s can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • the culture, the bacteria or cells are collected by known methods from suspended in a suitable buffer, ultrasound, lysozyme and / or freeze-thaw, etc. After the cells or cells are destroyed by the method described above, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • proteins (peptides) are secreted into the culture solution, a method of collecting the culture supernatant from the culture by a known method is used.
  • the protein (peptide) contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by a method known per se.
  • Such methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation; mainly using differences in molecular weights such as dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyatarylamide gel electrophoresis.
  • a method utilizing a difference in charge such as ion exchange chromatography; a method utilizing a specific affinity such as affinity chromatography; a method utilizing a difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography.
  • a method utilizing a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing electrophoresis; and the like. These methods can be appropriately combined.
  • affinity chromatography In order to purify the recombinant chsp60s more quickly and easily, it is preferable to use affinity chromatography.
  • an anti-chsp60 antibody column As the affinity column, an anti-chsp60 antibody column can be used. If a suitable tag sequence (eg, His tag, GST tag, MBP tag, etc.) is added to the DNA encoding the partial peptide, a metal ion chelate, glutathione, maltose immobilized column Etc. can be used as appropriate.
  • a metal ion chelate, glutathione, maltose immobilized column Etc. can be used as appropriate.
  • Both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies against chsp60 are commercially available (eg, manufactured by Amersham) or a method for producing an antibody or antiserum known per se using chsp60s as an antigen (for example,- : See below).
  • the free form can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and the protein (peptide) is converted into a salt.
  • the salt can be converted to a free form or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the protein (peptide) produced by the transformant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus obtained chsp60s can be confirmed by soil blotting using specific antibodies.
  • Chsp60 such is the RNA corresponding to the DNA encoding the above chs P 60 or a partial peptide thereof as an ⁇ , that Do the like Usagi reticular erythrocyte lysate, wheat germ lysate, Escherichia coli lysate
  • In vitro synthesis can be performed using a cell-free protein translation system.
  • a cell-free transcription / translation system containing RNA polymerase the DNA encoding chsp60 or a partial peptide Can also be synthesized.
  • the cell-free protein (transcription) translation system a commercially available one can be used, or a method known per se, specifically, E.
  • coli extract can be obtained from Pratt JM et al., Transcription and Tranlation, 179-209, Hames BD & Higgins SJ eds., IRL Press, Oxford (1984). It is a commercially available cell lysate, derived from E. coli or E. coli S30 extract system (Promega Corp.) - RTS 500 Rapid Tranlation System ( Roche Co.) Hitoshiryoku S include, 1 from Usagi reticulocytes Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega) and the like, and those derived from wheat germ include PR0TEIOS TM (TOYOBO). Among them, those using a wheat germ lysate are preferred.
  • Methods for preparing wheat germ lysates include, for example, Johnston FB et al., Nature, 179, 160-161 (1957), and Erickson AH et al., Meth. Enzymol., 96, 38-50 (1996). ) Etc. can be used.
  • Examples of the system or apparatus for protein synthesis include a batch method (Pratt, JM et al. (1984), supra) and a continuous cell-free system that continuously supplies amino acids, energy sources, etc. to the reaction system.
  • Protein synthesis system (Spirin AS et al., Science, 242, 1162-1164 (1988)), dialysis method (Kikawa et al., 21st Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, WID6), or multi-layer method (PR0TEI0S TM Wheat germ cell-free) manual for protein synthesis core kit) (manufactured by TOYOBO).
  • a method of supplying a type II RNA, an amino acid, an energy source, and the like to the synthesis reaction system as needed, and discharging a synthesized product and a decomposed product as needed JP-A-2000-333673 can be used.
  • chsp60s can be provided not only as an isolated protein (peptide) but also in the form of a cell capable of producing it.
  • the cells capable of producing chs P 60 include, in addition to various strains belonging to Kuramijia pneumoniae that produce chsp60 naturally, artificially chs P 60 such the have been engineered to produce cells, for example, and the chsp60 Or a transformant containing DNA encoding the partial peptide.
  • the transformant is capable of producing chsp60 in an amount sufficient to enhance MMP-9 expression in the cell line under conditions suitable for culturing a monocyte cell line.
  • the cells capable of producing chsp60s include various strains belonging to Chlamydia pneumoe, particularly preferably the above-mentioned KKpn-1 strain.
  • the monocyte cell line used in the present invention is not particularly limited as long as it is a cell line established from monocytes or macrophages derived from mammals, and known monocyte cell lines (for example, ⁇ _ 1, U-93, ⁇ 31 / FUJ, mouse monocyte-derived R AW 264.7, J774A.1, etc.), as well as mammals Cells of cell lines newly established by establishing monocytes or macrophages isolated from E. coli using known culture techniques are also included.
  • Monocyte-based cell lines include monocytes and macrophages isolated from mammals such as humans, and monocyte-based cells such as primary macula phages differentiated from monocytes using differentiation-inducing factors such as GM-CSF. as compared to the primary cell, the degree of ⁇ P- 9 enhanced expression by chs P 60 stimulation significantly higher. Therefore, there is an advantage that a more sensitive screen-jung system can be provided. Desirably, the expression of the MMP-9 gene when stimulated with ⁇ ⁇ ⁇ ch chsp60s for 48 hours is 5 times or more, preferably 10 times or more, more than that of the case where no stimulation is performed with chsp60s A 20-fold or more monocyte cell line is used.
  • the monocyte cell line is a cell of a cell line such as THP-1, U-937, P31 / FUJ derived from human monocyte, and particularly preferably, a THP-1 cell line. Cells.
  • Monocyte cell lines are prepared using a culture medium suitable for each cell [for example, minimal essential medium (MEM) supplemented with fetal calf serum or antibiotics (penicillin, streptomycin, etc.), Dulbecco's modified, if desired. Eagle's medium (DMEM), RPMI 164 medium, 199 medium, F12 medium, etc.].
  • MEM minimal essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified, if desired.
  • RPMI 164 medium 199 medium, F12 medium, etc.
  • the screening method of the present invention measures and compares the expression of MMP-9 gene under both conditions when a monocyte cell line is stimulated with chsp60s in the presence and absence of a test compound. It is characterized by the following.
  • the stimulation by chsp60s can be appropriately selected according to the form of the provided chsp60s. That is, when chs P 60 such that an isolated protein (peptide), monocytic was dissolved in the chs P 60 such a predetermined concentration KabukaHoso ⁇ culture (e.g., see above)
  • the incubation can be carried out by incubating the monocytic cell line with E. coli.
  • the concentration of chsp60s is about 100 to about 100 nM (about 5 to about 80 / zg / ml when using chsp60), preferably about 200 to about 400 nM.
  • No. Incubation can be carried out using a culture vessel used for culturing animal cells.
  • a 96-well plate is preferably used.
  • the cell density is, for example, about 5 ⁇ 10 5 to about 1 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • Fin incubation for example, C_ ⁇ 2 Lee incubator: during (eg 5% C_ ⁇ 2, 95% air), from about 4 0 to about 7 2 hours at about 3 0 to about 4 0 ° C, preferably About 44 to about 50 hours can be performed.
  • the chsp60 compound is provided in the form of cells capable of producing it, by fin incubation the monocytic cell line under coexistence of the cell, stimulating the cell line in chs P 60 such can do.
  • the added amount of cells capable of producing chsp60s may be any amount that can provide the same stimulation as that stimulated by the above concentration of chsp60s.
  • the added amount of cells capable of producing chsp60s may be any amount that can provide the same stimulation as that stimulated by the above concentration of chsp60s.
  • Chsp60 such producing cells may be a monocytic KabukaHoso 1 ⁇ body.
  • a transformant obtained by transforming a monocyte cell line as a host cell with an expression vector containing DNA encoding chsp60 or a partial peptide thereof according to the method described above can be performed by incubation under the same conditions as described above.
  • the transformant is more preferred to be manipulated so that resulting produced only under predetermined conditions the chs P 60 such.
  • a method for preparing such a transformant include, for example, expression in which DNA encoding chsp60 or a partial peptide thereof is placed under the control of an inducible native promoter (eg, a metallotionin promoter, a heat shock promoter, etc.). Examples include a method using a vector and a method using a CRE-loxP system.
  • stimulation with chsp60s refers to the time when an inducer (or induction stress) is applied
  • non-stimulation refers to the time when chsp60s expression is not induced.
  • test compound used for screening of the compound for example, a compound library prepared using combinatorial chemistry technology, a run prepared by solid phase synthesis or phage display method. Dam peptide library, or natural components derived from microorganisms, animals, plants, marine organisms and the like.
  • the method for measuring the expression of the marauding P-9 gene in a monocyte cell line is not particularly limited. For example, using a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding MMP-9 or a part thereof as a probe, and performing RNA hybridization extracted from the cell line as type ⁇ , or performing P-9 coding
  • a synthetic oligo-DNA containing a part of the salt-base sequence as a primer and performing quantitative RT-PCR using RNA extracted from the cell line as a type II, gene expression at the RNA level can be achieved. The amount can be measured.
  • the nucleic acid containing the base sequence encoding MMP-9 or a part thereof includes, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or a base sequence that can hybridize with the base sequence under conditions of high stringency. Nucleic acids are listed.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or a DNA / RNA chimera.
  • the nucleic acid may be single-stranded or double-stranded, and if single-stranded, may be a sense strand or an antisense strand. In the case of a double-stranded DNA, it may be a DNA: RNA hybrid.
  • expression of the MMP-9 gene can be performed at the protein level using a conventional Imno-Assy system using an anti-MMP-9 antibody.
  • the anti-MMP-9 antibody used here may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • F (ab,) 2 , Fab ', Fab fraction, etc. Can also be used.
  • P-9 MMP-9 or its partial peptide or salt thereof (sometimes referred to as J) can be used as an antigen in accordance with a known method for producing an antibody or antiserum.
  • the protein is preferably, but not limited to, a protein of the same origin as the monocyte cell line used for screening.
  • MMP-9s are purified from MMP-9-producing cells (eg, monocytes derived from mammals, macrophages, etc.) using a known protein separation technique, or represented by SEQ ID NO: 4.
  • Monoclonal and polyclonal antibodies to MMP-9 can be prepared, for example, as follows.
  • MMP-9s are administered to a warm-blooded animal to a site where the antibody can be produced upon administration, by itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production during administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal used include mammals such as monkeys, rabbits, rabbits, dogs, monoremots, mice, rats, sheep, goats, and the like (and birds other than mammals). , Mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen such as a mouse
  • an antigen such as a mouse
  • the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by collecting the cells and fusing the anti-producing cells contained therein with myeloma cells of the same or different species.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Minorestein (Nature, 256, 495 (1975)).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used. .
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells to be used is about 1: 1 to 20: 1, and the PEG (preferably PEG100 to PEG600) power 1 It is added at a concentration of about 0-80% and at 20-40 ° C, preferably at 30-37 ° C :! By incubating for ⁇ ⁇ 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas are obtained, for example, by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then labeling with a radioactive substance or an enzyme.
  • a solid phase eg, a microplate
  • Anti-globulin antibody (if mouse cells are used for cell fusion, anti-mouse immunoglobulin purine antibody is used) or protein A, and monoclonal antibody bound to solid phase is detected; anti-immunoglobulin antibody A method in which the hybridoma culture supernatant is added to the solid phase to which the antibody or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and the monoclonal antibody bound to the solid phase is detected. You can sing. Selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • Monoclonal antibodies can usually be selected in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as hybridomas can grow.
  • Such a medium is, for example, 1 to 20%, preferably 10 to 20%.
  • RPMI 1640 medium containing fetal calf serum 1 to: GIT medium containing 10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or a hybrid serum-free medium (SFM-1) 01, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 0.37 ° C.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the monoclonal antibody thus obtained can be obtained by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger, (E.g., DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or only antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to release the antibody.
  • an immunoglobulin separation and purification method eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger, (E.g., DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or only antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to release the
  • a polyclonal antibody against MMP-9 can be produced according to a method known per se.
  • an immune antigen protein antigen itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described monoclonal antibody production method. It can be manufactured by collecting antibody-containing substances and separating and purifying the antibodies. it can.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are determined by the efficiency of the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier. If possible, any kind may be cross-linked at any ratio.For example, ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ cysteine oral globulin, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of 0.1 to 20 with respect to 1 hapten. Preferably, a method of coupling at a ratio of 1 to 5 is used.
  • an active ester reagent containing an active ester, maleimide active ester, thiol, or dithioviridyl group are used for the hapten and carrier force ring.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier and a diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of monoclonal antibody.
  • the method for quantifying MMP-9 or a salt thereof using an anti-MMP-9 antibody is not particularly limited, and the amount of the antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in the test solution is measured.
  • Any measurement method may be used as long as it is a measurement method calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • the anti-p-9 antibody is allowed to react competitively with the test solution (culture supernatant after incubation) and the labeled banded P-9s, and the labeled antibody bound to the antibody is reacted. Quantification of MMP-9 or its salt in the test solution by measuring the proportion of the MMP-9 class (competition method), and
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of MMP-9
  • the other antibody recognizes the other part of P-9, such as the C-terminal Desirably, it is an antibody.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • the binding of antibody or antigen to the labeling agent is
  • Avidin systems can also be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized anti-P- 9 antibody (primary reaction), and then reacted with another labeled anti-MMP-9 antibody (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the labeling agent on the carrier, the amount of MMP-9 or a salt thereof in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the immobilized antibody and the labeled antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • an anti-P-9 antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to MMP-9.
  • the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of band P-9
  • the antibody used in the primary reaction is preferably used. Is an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal.
  • the anti-P_9 antibody can also be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephelometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are used for the antibody.
  • the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated (BZF separation), the amount of either B or F label is measured, and the amount of Quantify the amount of antigen.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a solid phase antibody is used as the primary antibody.
  • a solid-phase method using a soluble primary antibody and a solid-phased antibody as a secondary antibody is used.
  • the liquid phase method it is possible to use homogeneous immonoassays such as surface plasmon resonance, fluorescence polarization imnoassay, fluorescence quenching imnoassay, and fluorescence energy transition imnoassay.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then a solid phase and a liquid phase are separated.
  • the antigen in the solution is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, and then a solid-phased antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase. Then, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • nephelometry the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephelometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • An MMP-9 measurement system may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, written documents, and the like.
  • the expression of the MMP-9 gene can be measured using the enzyme activity of the produced MMP-9 or a salt thereof as an index.
  • the method for measuring the enzyme activity is not particularly limited.
  • a test solution (culture supernatant after incubation is completed) may be gel-containing an MMP- 9 substrate (eg, gelatin, type IV collagen, etc.). , SDS—polyacrylamide gel, etc.), remove the SDS, refold MMP-9, incubate the gel in an appropriate buffer—and adjust the concentration of the dissolving band. Quantification by image analysis.
  • the method for measuring the expression of the P-9 gene is to competitively react the test solution and the enzyme-labeled thigh P-9s with an anti-Mandarial P-9 antibody. This is a competitive ELISA method.
  • results of the above measurement of MMP- 9 gene expression for example, chs P 60 stimulation during MMP- 9 expression level of a gene about 2 0% or more, preferably 3 0% or more, more preferably Can be selected as compounds that inhibit the induction of MMP-9 expression by chsp60.
  • the compound that inhibits the induction of expression of the fraction P-9 selected as described above is a plaque that inhibits the increase in secretion of MMP-9 from foam cells derived from Mac mouth phage vascular smooth muscle cells due to Cp infection. It is effective for the treatment of arteriosclerosis and / or the prevention and treatment of its complications, because it can prevent the fibrous cap from weakening and prevent the plaque from destabilizing and breaking down.
  • the present invention also provides a kit suitable for performing the above-described screening method.
  • the screening kit of the present invention is characterized by comprising a monocyte lineage cell line and a chsp60 or a cell capable of producing the same, or an expression vector containing a DNA encoding the same.
  • the monocyte cell line and the chsp60s or cells capable of producing the same or the expression vector containing the DNA encoding the same are as described above in the description of the screening method of the present invention. Can be used.
  • the screening kit of the present invention comprises a monocyte cell line engineered to produce chsp60s.
  • a monocyte cell line those described above in the description of the screening method of the present invention can be used.
  • the screening kit of the present invention may further contain reagents for measuring the expression of the MMP-9 gene.
  • the kit can further include, for example, sense and antisense primers capable of amplifying a fragment of MMP-9 RNA.
  • the base sequence of the primer pair include the above-mentioned Vehmaan-Kreula, P. et al., Arterioscler. Throrab. Vase. Biol. (USA), 2001, Vol. 21, pp. E1—e Examples include, but are not limited to, the primers described in No.
  • nucleotide sequence of a nucleic acid encoding MMP-9 (eg, For example, based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 3), another suitable primer can be easily constructed using known primer design support software as necessary.
  • the kit further contains an anti-MMP-9 antibody and an enzyme-labeled MMP-9 or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • an anti-MMP-9 antibody and the enzyme-labeled MMP-9 those described above in the description of the screening method of the present invention can be used.
  • the kit further comprises a secondary antibody capable of specifically recognizing the anti-P-9 antibody (primary antibody) (for example, when the primary antibody is a rabbit-derived anti-femoral P-9 IgG antibody, a goat-derived anti-Peagle IgG).
  • the present invention also provides an agent for treating arteriosclerosis and preventing or treating Z or its complications, comprising a substance capable of suppressing the induction of MMP-9 gene expression in mammalian cells by chsp60.
  • the prophylactic or therapeutic agent can contain a pharmacologically acceptable carrier as needed.
  • the “pharmacologically acceptable carrier” various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid preparations; Formulated as a solvent, solubilizer, suspending agent, tonicity agent, buffer, soothing agent, etc. in liquid preparations. If necessary, pharmaceutical additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners can also be used.
  • excipients include lactose, sucrose, D-mantol, D-sorbitol, starch, ⁇ ; modified starch, dextrin, crystalline cellulose, low-substituted hydroxypropynolecellulose, and carboxymethyl.
  • Senorelose sodium, arabia gum, dextrin, pullulan, light caffeic anhydride examples include synthetic aluminum silicate and magnesium metasilicate.
  • lubricant examples include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloid silica and the like.
  • Preferred examples of the binder include pregelatinized starch, sucrose, gelatin, arabia gum, methinoresenorelose, carboxymethylsenorelose, sodium carboxymethinoresenorelose sodium, crystalline senorelose, and sucrose. , D-mannonitrile, trenoperose, dextrin, punorelane, hydroxypropinolesenololose, hydroxypropinolemethinoresenorelose, polyvinylinolepyrrolidone and the like.
  • disintegrants include lactose, sucrose, starch, carboxymethinoresenorelose, force / repoxymethinoresenolaceroscanolecum, closcanoremerose sodium, carboxymethyl starch sodium, light anhydrous kerosene. Acid, low-substituted hydroxypropylcellulose and the like.
  • Preferred examples of the solvent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, phenolic cornole, propylene glycol cornole, polyethylene glycol cornole, sesame oil, corn oil, olive oil, cottonseed oil and the like.
  • solubilizing agent examples include polyethylene dalicol, propylene glycol cornole, D-mannitonole, tre /, loin, benzinole benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, and sodium carbonate. Lithium, sodium citrate, sodium salicylate, sodium acetate and the like.
  • the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium radium sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium radium sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate.
  • polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidide Hydrophilic polymers such as sodium, canolepoxymethinoresenorelose, sodium methinoresenorelose, hydroxoximethinoresenorelose, hydroxyxetinoresenorelose, and hydroxypropyl pill cellulose; polysorbate And polyoxyethylene hardened castor oil.
  • the tonicity agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, glucose and the like.
  • buffers such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • Preferred examples of the soothing agent include benzyl alcohol and the like.
  • Preferable examples of the preservative include paraoxybenzoic acid esters, black alcohol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, and sorbic acid.
  • Suitable examples of the antioxidant include sulfite and ascorbate.
  • Suitable examples of the coloring agent include water-soluble edible tar dyes (eg, edible dyes such as edible red Nos. 2 and 3, edible yellows 4 and 5, edible blue Nos. 1 and 2), water-insoluble lake dyes (Eg, the aluminum salt of the water-soluble edible tar dye, etc.), and natural pigments (eg, j3-carotene, chlorophyll, bengalara, etc.).
  • water-soluble edible tar dyes eg, edible dyes such as edible red Nos. 2 and 3, edible yellows 4 and 5, edible blue Nos. 1 and 2
  • water-insoluble lake dyes Eg, the aluminum salt of the water-soluble edible tar dye, etc.
  • natural pigments eg, j3-carotene, chlorophyll, bengalara, etc.
  • sweetener examples include sodium saccharin, sodium potassium glycyrrhizinate, aspartame, stevia and the like.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include oral preparations such as tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, and suspensions; , Subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.), external preparations (eg, intranasal preparations, transdermal preparations, ointments, etc.), suppositories (eg, rectal suppositories, Vaginal suppositories), pellets, Parenteral preparations such as drops and sustained-release preparations (eg, microrelease capsules) can be safely orally or parenterally administered, respectively.
  • oral preparations such as tablets, capsules (including soft capsules and microcapsules), granules, powders, syrups, emulsions, and suspensions
  • Subcutaneous injections eg, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections, etc.
  • the pharmaceutical composition can be produced by a method commonly used in the technical field of formulation, for example, a method described in Japanese Pharmacopoeia. Hereinafter, the specific production method of the drug product will be described in detail.
  • the content of the compound obtained by the screening method of the present invention in the pharmaceutical composition varies depending on the dosage form, the dose of the compound and the like, and is, for example, about 0.1 to 100% by weight.
  • oral preparation the active ingredient, an excipient (e.g., lactose, sucrose, starch, D- mannitol), disintegrating ⁇ (e.g., such as carboxymethylcellulose force Rushiumu), binders (e.g., alpha starch, Gum arabic, carboxy simethinoresenololose, hydroxypropinoresenololose, polyvinylinolepyrrolidone, etc.) or lubricants (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene dalicol 600, etc.) It is produced by compression molding and then, if necessary, coating with a coating base in a manner known per se for the purpose of taste masking, enteric coating or persistence. ,
  • excipient e.g., lactose, sucrose, starch, D- mannitol
  • disintegrating ⁇ e.g., such as carboxymethylcellulose force Rushiumu
  • binders e.g., alpha starch, Gum arab
  • the coating base examples include a sugar coating base, a water-soluble film coating base, an enteric film coating base, and a sustained release film coating base. .
  • sucrose is used, and one or more kinds selected from talc, precipitated calcium carbonate, gelatin, gum arabic, pullulan, carnauba wax and the like may be used in combination.
  • Water-soluble film-coating bases include, for example, cenorelose such as hydroxypropinoresenorelose, hydroxypropinolesmethinoresenorelose, hydroxysechinoresenorelose, and methinoleshydroxechinoresenorelose.
  • cenorelose such as hydroxypropinoresenorelose, hydroxypropinolesmethinoresenorelose, hydroxysechinoresenorelose, and methinoleshydroxechinoresenorelose.
  • Polymers synthetic polymers such as polybutylacetal getylaminoacetate, aminoalkyl methacrylate copolymer E (Eudragit E (trade name), Koutum Pharma Co., Ltd.), polyvinylpyrrolidone, etc .; Sugars and the like.
  • Enteric film coating bases include, for example, hydroxypine pinolemethinoresenolerose phthalate, hydroxypropinolemethinoresolenole-s-acetate succinate, canoleboximetinoletinol cellulose, and acetic acid.
  • Senololose-based polymers such as cellulose phthalenolate; Copolymer meta-atalinoleate L (Eudragit L (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.); methacrylic acid copolymer LD [Eudragit L_30D55 (trade name) , Rohm Pharma Co., Ltd.), methacrylic acid copolymers
  • sustained-release film coating base examples include cellulosic polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl methacrylate copolymer—RS (Eudragit RS (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.); Acrylic acid-based polymers such as ethyl acid / methyl methacrylate copolymer suspension [Eudragit NE (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.] and the like.
  • cellulosic polymers such as ethyl cellulose; aminoalkyl methacrylate copolymer—RS (Eudragit RS (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.); Acrylic acid-based polymers such as ethyl acid / methyl methacrylate copolymer suspension [Eudragit NE (trade name), Rohm Pharma Co., Ltd.] and the like.
  • the above-mentioned coating bases may be used by mixing two or more kinds thereof at an appropriate ratio.
  • a light-shielding agent such as titanium oxide or iron trioxide may be used.
  • Injectables contain active ingredients as dispersants (eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, etc., polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, sodium alginate, etc.), and preservatives (eg, methyl paraben, propinorenol).
  • dispersants eg, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, etc., polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, sodium alginate, etc.
  • preservatives eg, methyl paraben, propinorenol
  • isotonic eg, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, pudose, etc.
  • aqueous solvents e.g, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, D-sorbitol, pudose, etc.
  • oily solvents e.g., vegetable oils such as olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, propylene glycol, etc.
  • additives such as a solubilizing agent (eg, sodium salicylate, sodium acetate, etc.), a stabilizer (eg, human serum albumin, etc.), a soothing agent (eg, benzyl alcohol, etc.) are added. May be used.
  • the injection solution is usually filled in a suitable ampoule. ''
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in mammals (e.g., humans, mice, It can be administered orally or parenterally to monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dosage of the prophylactic / therapeutic agent varies depending on the target disease, the severity, the administration target, the administration route, and the like. For example, in an adult patient (at a weight of 6 O kg) suffering from atherosclerosis, Is about 0.1 to about 100 mg per day, preferably about 1.0 to about 50 mg, and more preferably about 1.0 to about 100 mg per day as an active ingredient. 0 to about 20 mg, and this amount can be administered once or in several divided doses.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on each of the items B by IUPAC-IUB.Communication on Biochemical Nomenclature or abbreviations commonly used in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylily; ⁇ Nucleic acid
  • R N A Ribonucleic acid
  • RNA Messenger ribonucleic acid
  • dATP Deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP Deoxythymidine triphosphate
  • dGTP Deoxyguanosine triphosphate
  • dCTP Deoxycytidine triphosphate
  • a 1 a Aranine
  • a rg: Arginine H is: histidine
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification show the following sequences.
  • the base sequence of the DNA encoding chsp60 derived from Chlamydia pneumoniae KKpn-l strain is shown.
  • nucleotide sequence of an oligonucleotide designed to function as a primer for amplifying DNA encoding chsp60 derived from Chlamydia pneumoniae KKpn-l strain is shown.
  • Chlamydia pneumoniae KKpn-1 strain-derived DNA encoding chsp60 Shows the nucleotide sequence of an oligonucleotide designed to function as a primer for amplification.
  • the genetic manipulation method described below is in accordance with the method described in a compendium (Maniatis et al., Molecular Closure, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) or the method described in the protocol attached to the reagent. 'I got it.'
  • Cloning of chs P 60 gene was performed by PCR to ⁇ the DNA extracted from Cp-infected cells.
  • HEp- 2 cells (approximately 2.5X 10 5 Ce lls / ml; Obtaining Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) to inoculation plates (25cm 2 flask) 37 ° C at a carbon dioxide gas incubator, - after ⁇ culture, mono Discard the supernatant of the layer and transfer to Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) medium (10% FBS, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 50 ⁇ g / mL gentamicin, 0.5 g / mL cycloheximide).
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • Cp Chlamydia * -Hum-moe (C p) KKpn-1 strain [Kishimoto T. and Soejima R., Intern. Med., 32: 934-937 (1993)] Cp was cultured by infecting -2. After culturing for 72 hours, the infected cells are collected with a cell scraper, washed twice with PBS, resuspended in 4 ml of TE buffer, and lysed by freeze-thawing three times at -80 ° C. The nucleic acid fraction obtained by phenol treatment and ethanol precipitation was used as type I for PCR.
  • the ⁇ A fragment amplified above was digested with a restriction enzyme Ndel (Takara Shuzo), and the fragment was recovered by agarose gel electrophoresis. Its cut E. coli expression advance Ndel and DNA fragment plasmid pET21a (Obtaining:. N0VAGEN) were mixed, the DNA Ligation Kit Ver.2 (Takara Shuzo) was ligated in chs P 60 expression flop Rasumi de pHSP21_l Obtained. Escherichia coli BL21 (DE 3 ) is transformed with Escherichia coli using this plasmid.
  • BL21 (DE3) / pHSP21-1 strain was obtained.
  • This Escherichia coli strain was given the accession number of FERM BP-8430, and the Patented Organism Depositary (T305-A) was incorporated by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on July 16, 2003. 856'6 Tsukuba, Ibaraki Pref.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) / pHSP21-1 strain 1 white ear obtained in Reference Example 1 was inoculated into 1 L of seed culture medium (1% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 0.5% NaCl and 50 mg / L ampicillin). Then, seed culture was performed by culturing at 30 ° C.
  • main culture medium (1.2% Tryptone, 2.4% Yeast Extract, 0, 2% Bactopeptone, 0.05% NaCl, 1.5% Glucose, 50 mg / L ampicillin and 50 mg / L Vitamin-Bl), and elapse 37 ° C, stirring 150rpm, air flow rate 20NL / tnin, dissolved oxygen concentration
  • Main culture was started under the conditions of 2.0 ppm and pH control of 6.8.
  • Cretu Titnit value X) 80 H reached Niommera ⁇ ; add Isopropyl ⁇ -D (-) -Thi oga lactopyranoside (IPTG) to a final concentration of ImM, and further 4 hours Expression of chsp60 was induced by culturing, and the expressed cells were recovered by centrifugation at 6000 rpm for 20 min.5 mM ethylenediaminetetraacetate sodium and ImM (p-amidinophenyl) methanesulfonyl fluoride were added to 350 g of the obtained cells.
  • the eluate was replaced with 50 mM Tris / HC1 (pH 8.0) containing 2 M urea using ultrafiltration (PSU, 10k, Sartrius) and concentrated to obtain 2 L of concentrated solution.
  • the eluate was passed through a Sephadex G-25 column (5 cm 'x 50 cm, Amersham Biosciences) equilibrated with Dulbecco's phosphate buffered saline solution, and 650 mL of the obtained ch.sp60 fraction was further added to the column.
  • An Acticlean wheat iodine column (5 cm ⁇ 20 cm, Sterogene) equilibrated with Becko's phosphate buffered saline solution was used to remove endotoxin.
  • the N-terminal amino acid sequence of purified chsp60 obtained in Reference Example 2 was The sequence was determined using a sequencer (Applied Biosystems, Model 492). As a result, except for the lack of the N-terminal amino acid Met of the obtained chsp60, the HSP60 derived from the Chlamydia pneumoe KKpn-1 strain deduced from the cDNA base sequence (SEQ ID NO: 1) was deleted. It was consistent with the N-terminal amino acid sequence.
  • THP-1 cells a monocyte cell line, were purchased from American Type Culture Collection '(ATCC). IX 10 6 cells / mL THP_1 cell suspension prepared in RPMI 1640 medium (containing 100 / ig / mL streptomycin ⁇ 100umts / mL penicillin and 50g / mL gentamicin) supplemented with 1% fetal serum The prepared chsp60 was added at 20 ⁇ g / mL, and cultured under an environment of 5% CO 2 and 37 ° C. After 1, 2, and 3 days of culture, the culture supernatant is aspirated, and the amount of MMP-9 in the supernatant is measured.
  • Example 2 monocyte system cell line IX 10 of 6 cells / mL THP- 1 cell suspension prepared in Reference Example 2 Chsp60 was added at 5, 10 or 20 ⁇ g / mL, and the cells were cultured in an environment of 5% CO 2 and 37 ° C. Two days after the culture, the culture supernatant was aspirated, and the amount of secreted P-9 in the supernatant was measured with an ELISA kit manufactured by Amersham. Culture in the same manner without adding chsp60 The culture supernatant of the obtained THP-1 cells was used as a control. The result is shown in figure 2. Induction of MMP-9 production increased in a concentration-dependent manner with chsp60.
  • the screening method of the present invention uses a monocyte cell line to achieve higher MMP-9 expression compared to monocytes isolated from blood or primary macula phage.
  • the screening method of the present invention uses a monocyte cell line to induce higher MMP-9 expression than monocytes isolated from blood or primary macula phage. It is effective as a highly sensitive screening system for a novel therapeutic agent for arteriosclerosis that can suppress the progression of arteriosclerosis due to Chlamydia 'pneumoniae infection.

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Abstract

本発明は、クラミジア・ニューモニエ感染による動脈硬化症の進展を抑制し得る新規動脈硬化症治療薬のスクリーニング手段を提供する。具体的には、単球系株化細胞と、クラミジア・ニューモニエ由来６０ｋＤａ熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産生し得る細胞（該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なってもよい）とを用いることを特徴とする、動脈硬化症の治療および／またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング方法が提供される。

Description

明細書
スク リ一二ング方法
技術分野
本発明は、 動脈硬化症の治療薬およびその合併症の予防，治療薬をス クリーニングするための方法お'よびキッ トに関する。 より詳細には、 本 発明は、 クラミジァ ' ェユーモニエ （Chlamydi a pneumon i ae； 以下、 「 C p」 と略記する場合がある） 由来の 6 0 k D a熱ショ ック蛋白質 （以 下、 「HSP60」 と略記する場合がある） および哺乳動物の単球系株化細胞 を用いた、 動脈硬化症の治療薬およびその合併症の予防 ·治療薬のスク リーニング法およびそのためのキッ トに関する。
背景技術
偏性細胞内寄生性グラム陰性菌であるクラミジァ · ニューモニエは巿 中肺炎の主要な原因菌の一種であるとともに、 動脈硬化症、 喘息、 慢性 閉塞性肺疾患、 アルツハイマー病、 多発性硬化症などの慢性疾患との関 連性が示唆されている。
動脈硬化症 （特に粥状硬化症） は、 日米欧で死因の上位を占める急性 冠症候群 （A C S ；急性心筋梗塞、 不安定狭心症を含む) や脳血管疾患 (特に虚血性脳血管障害 ；脳梗塞、 脳塞栓、 脳血栓などを含む） 等の合 併症を発症させる。 C pの動脈硬化症との関連性は、 交通事故死者での 調査により動脈硬化病変と血清中抗 C p抗体の保有率とが相関するとの 報告がなされて以来注目され始めた （Saikku, P.ら、 Lancet (英国） 、 1 9 8 8年、 第 2卷、 p p . 9 8 3 - 9 8 6 ) 。 その後、 血清疫学的知 見に基づいた動脈硬化症における C pの原因微生物としての証拠が数多 く報告されている （例えば、 Thomas, M.ら、 Ci rcul at ion (米国） 、 1 9 9 9年、 第 9 9卷、 p p . 2 7 3 3 - 2 7 3 6を参照） 。 さらに、 実験 動物モデルにおいて、 C p感染は動脈硬化病変の形成を促進することが 報告され、 抗菌薬の投与によりその病変形成が抑制されることも示され てレヽる （例えば、 Muhlestein, J. B.ら、 Circulation (米国） 、 1 9 9 8 年、 第 9 7巻、 p p . 6 3 3— 6 3 6を参照） 。
これらの知見に基づいて、 心筋梗塞患者約 2 0 0人を対象にしてマク 口ライ ド系抗菌薬を用いた臨床試験が実施され、 発作の再発率が 3分の 1以下に減少したと報告された。 しかしながら、 この成果を受けて米国 で約 7 0 0 0人を対象にして実施された同薬剤での大規模長期試験では 無効との判定が示されており、 抗菌薬の有効性についての議論は末だ決
'着していない。 さらに、 抗菌薬の乱用による耐性菌の出現といった問題 点も指摘されており、 仮に有効性が確認されたとしても、 抗菌薬は動脈 硬化症治療の主流とはならないと予測される。
C p感染による動脈硬化病変の形成 ·進展の分子機構についてはこれ までよく理解されていなかった。最近、 C p由来の HSP60 (以下、 「chsP60 j と略記する場合がある） がヒ トの動脈硬化病変から検出され （Kol, A. ら、 Circulation (米国） 、 1 9 9 8年、 第 9 8卷、 p p . 3 0 0— 3 0 7 ) 、 さらに、 ヒ ト単球から分化させた初代マク口ファージを chsP60で 刺激するとコラーゲン分解酵素の 1つであるマ トリ ックスメタ口プロテ イナーゼ— 9 (以下、 . 「匪 P- 9」 と略記する場合がある） の産生量が増加 すること力 幸 告された (Vehmaan-Kreula, P.ら、 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. (米国） 、 2 0 0 1年、 第 2 1卷、 p p . e l — e 8) 。 MMP- 9は進展したヒ ト動脈硬化病変で過剰産生され、特に破綻した病変で 強発現し、 活性化されている （Loftus, Α·ら、 Stroke (米国） 、 2 0 0 0年、 第 3 1卷、 p p . 4 0 - 4 7 ) 。 また、 血漿中の MMP- 9濃度の高さ が心血管疾患死の危険因子であり得ることや、 MMP- 9遺伝子の多型が安定 狭心症患者における将来の心血管ィベントの発症率と有意に相関するこ と. （Blankenberg, S.ら、 Circulation (米国） 、 2 0 0 3年、 第 1 0 7 卷、 p p . 1 5 7 9 - 1 5 8 5 ) 、 さらに、 MMP— 9ノックァゥトマウスで は、 粥状動脈硬化症における病変の進展が抑制されること等も示されて レ、る （Luttun, A.ら、 Circulation (米国） 、 2 0 0 4年、 第 1 0 9卷、 p p . 1 4 0 8 — 1 4 1 4 ) 。
粥状動脈硬化症は、 コラーゲン線維に覆われた粥腫 （プラーク） によ つて血管内腔が狭窄される病態を指すが、 臨床上の知見から、 心筋梗塞 や狭心症などの A C Sの発症に至る血栓形成を伴った冠動脈のィベント' には、狭窄度よりむしろプラークの性状が重要であると考えられている。 即ち、 脂質コアが大きくそれを被覆する線維性被膜の薄い病変はブラー ク破綻を来しやすく、 合併症を発症するリスクが高いとの仮説が支持さ れている （Libby, P.、 Circulation (米国） 、 1 9 9 5年、 第 9 1卷、 p p . 2 8 4 4— 2 8 5 0) 。
プラーク表面を覆う線維性被膜の主成分はコラーゲンであり、 コラー ゲン分解酵素であるマ ト リ ックスメタ口プロテアーゼ群 （MMPs) は被膜 を直接的に脆弱ィ匕させ得る (Young, J. L. ら、 Thrombosis and Haemostasis (独国） 、 2 0 0 2年、 第 8 8卷、 p p . 5 5 4— 5 6 7、 Jones, C. B. ) ら、 Cardiovascular Research (オランダ） 、 2 0 0 3年、 第 5 9卷、 p p . 8 1 2 — 8 2 3) 。 プラーク破綻は、 T細胞により活性化された マク口ファージゃ血管平滑筋細胞が酸化 L D L'を取り込んで泡沫化し、 生じた泡沫細胞から分泌される MMP sにより線維性被膜が脆弱化されるこ とにより起こると考えられている。 中でも、 MMP - 9は破綻プラークにおい て有意な産生増強が確認されていることから、 プラークの不安定化に主 要な役割を果たしていると考えられる。
以上のことから、 C p感染による動脈硬化症進展のメカニズムと して、 chsp60刺激によってマク口クァージ等からの MMP - 9分泌が促進され、 その MMP - 9が線維性被膜を脆弱化させ、 プラーク破綻を引き起こすことが強く 示唆される。
実際に、 MMP- 9分泌産生抑制作用を示す薬物が動脈硬化症の進展抑制効 果を有するとの報告が多くなされている。 例えば、 高血圧症治療薬であ るラシジピンは、 ホルボールエステルや腫瘍壌死因子 （TNF- α) により 刺激されたマウスマクロファージにおける ΜΜΡ - 9分泌産生を抑制したが (Be丄 losta, S. り、 The Journal of Pharmacology and Experiments丄 Therapeutics (米国） 、 2 0 0 1年、 第 2 9 6卷 3号、 p p . 7 3 6— ' 7 4 3 ) 、 臨床試験の結果、 ラシジピンは動脈硬化の進展抑制効果があ ること力 S実証された (Zanchetti, A.ら、 Circulation (米国） 、 2 0 0 2年、 第 1 0 6卷、 p p . 2 4 2 2 - 2 4 2 7) 。 また、 コレステロ一 ル低下薬として知られるフルパスタチンとシンパスタチンは、 ホルボー ルエステル（TPA)により刺激されたマウス及ぴヒ トマクロファージにお ける MMP- 9分泌産生を阻害したが （Bellosta, S.ら、 Asteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology (米国） 、 1 9 9 8年、 第 1 8卷、 p p . 1 6 7 1 - 1 6 7 8 ) 、 これらを含む多くのスタチン系薬物が複 数の臨床試験において動脈硬化の進展抑制効果を有することが示された (Grobbee, D. E.ら、 Drugs (ニュージーランド国） 、 2 0 0 3年、 第 6 3卷、 p p . 8 9 3— 9 1 1 ) 。 発明の開示
上記の知見から、 C p感染または chsp60刺激によるマク口ファージ等 からの丽 P- 9の過剰産生を抑制し得る物質は、 動脈硬化症の治療、 進展抑 制 （特に AC S、 虚血性脳血管障害等の重篤な合併症の予防） またはそ れら合併症の治療に有効な新規薬剤として期待される。 しかしながら、 そのような薬物の探索おょぴ評価系として使用し得るのに十分な感度を 有.し、 且つ再現性に優れた化合物スクリ一エング系はこれまでに知られ ていない。 上記スタチン系薬物やラシジピンの薬効評価系のように、 ホ ルボールエステルや TNF- αで刺激することにより高レベルの ΜΜΡ - 9産生 を誘導することは可能であるが、 これら薬剤もしくはサイ ト力インによ る ΜΜΡ- 9産生誘導は実際の C Ρ ίί染ィベントを反映しておらず、 また、 従 来使用されている単球ゃマク口ファージでは構成的な ΜΜΡ - 9発現のため に非刺激時のバックダラゥンドが高いなどといった問題点があった。
したがって、 本発明の目的は、 C ρ感染または chsp60刺激によるマク' 口ファージ等からの MMP- 9の過剰産生を抑制し得る物質を、 高感度で且つ 再現性および効率よく選抜し得るスクリ一ユング系を提供し、 以つて、 新規な動脈硬化症治療薬およびその合併症の予防 ·治療薬を提供するこ とである。
本発明者らは、 上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 MMP- 9 産生細胞として単球系の株化細胞 （例： THP-1細胞株） を用いてこれを C Pに感染もしくは chsp60で刺激すると、 意外にも、 血液から単離した単 球やそれを分化させた初代マク口ファージに比べて著しく高い MMP - 9発 現が誘導されることを初めて見出した。 本発明者らは、 これらの知見に 基づいてさらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
[ 1 ] 単球系株化細胞と、 クラミジァ ' ニューモニエ由来 6 0 k D a 熱ショ ック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれ を産生し得る細胞 （該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なつ てもよい） とを用いることを特徴とする、 動脈硬化症の治療および Zま たはその合併症の予防 ·治療物質のスクリ一二ング方法、
[ 2 ] 試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をクラミ ジァ · ニュー'モニエ由来 6 Ό k D a熱ショ ック蛋白質もしくはその部分 ぺ.プチドまたはその塩で刺激し、 両条件下におけるマトリ ックスメタ口 プロティナーゼー 9遺伝子の発現を比較することを特徴とする、 上記 [ 1 ] 記載のスク リ一ユング方法、
[ 3 ] 試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をクラミ ジァ · ニューモニエに感染させ'、 両条件下におけるマトリ ックスメ タ口 プロティナーゼー 9遺伝子の発現を比較することを特徴とする、 上記 [ 1 ] 記載のスクリーユング方法、
[4] クラミジァ · ニューモニエ由来 6 O k D a熱ショ ック蛋白質も' しくはその部分ぺプチドまたはその塩を産生し得る単球系株化細.胞にお けるマトリ ックスメタロプロティナーゼー 9遺伝子の発現を、 試験化合 物の存在下および非存在下で比較することを特徴とする、 上記 [ 1 ] 記 載のスクリ一二ング方法、
[ 5 ] 1 0 0 nMのクラミジァ · ニューモニエ由来 6 0 k D a熱ショ ック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩で 4 8時間刺激した ときのマトリ ックスメタロプロティナーゼ一 9遺伝子の発現が、 非刺激 時の 5倍以上である単球系株化細胞を用いることを特徴とする、 上記 [ 1 ] 記載のスク リーニング方法、
[ 6 ] 単球系株化細胞が、 非刺激時にマ ト リ ックスメタ口プロティナ ーゼー 9遺伝子を実質的に発現しないことを特徴とする、 上記 [ 1 ] 記 載のスクリ一二ング方法、 '
[ 7 ] 単球系株化細胞が、 TH P _ 1、 U— 9 3 7、 P 3 1 / F U J、 RAW 2 6 4. 7および J 7 7 4 A. 1からなる群より選択される株化 細胞である、 上記 [ 1 ] 記載のスクリーユング方法、
[ 8 ] 単球系株化細胞が T H P— 1株化細胞である、 上記 [ 1 ] 記载 のスクリ一二ング方法、 [9] 単球系株化細胞と、' クラミジァ ' ニューモニエ由来 6 0 k D a 熱ショ ック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれ を産生し得る細胞 （該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なつ てもよい） とを含んでなる、 動脈硬化症の治療および/またはその合併 症の予防 · 治療物質のスクリーユング用キッ ト、
[ 1 0] クラミジァ · ニューモニエ由来 6 O k D a熱ショック蛋白質 もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を産生し得る細胞がクラミジァ
• ニューモニエまたは単球系株化細胞である、 上記 [ 9] 記載のスク リ 一二ング用キッ ト、
[ 1 1 ] 単球系株化細胞が、 THP— 1、 U— 9 3 7、 P 3 1 F U J、 R AW 2 6 4. 7および J 7 74 A. 1からなる群より選択される 株化細胞である、 上記 [ 9] 記載のスク リーニング用キッ ト、
[ 1 2] 単球系株化細胞が THP— 1株化細胞である、 上記 [9] 記 載のスクリ一ユング用キッ ト、
[ 1 3] クラミジァ ' ニューモニエ由来 6 0 k D a熱ショ ック蛋白質 による哺乳動物細胞におけるマトリ ックスメタ口プロティナーゼー 9遺 伝子の発現誘導を抑制し得る物質を含有してなる、 動脈硬化症の治療お よび/またはその合併症の予防 ·治療剤、
[ 1 4] クラミジァ · ニューモニエ由来 6 O k D a熱ショック蛋白質 による哺乳動物細胞におけるマトリ ックスメタ口プロティナーゼ一 9遺 伝子の発現誘導を抑制し得る物質の有効量を (#乳動物に投与することを 含む、 該哺乳動物における動脈硬化症の治療および/またはその合併症 の予防または治療方法、 及び
[ 1 5] 動脈硬化症の治療および/またはその合併症の予防または治 療剤の製造のための、 クラミジァ ' ニューモニエ由来 6 O k D a熱ショ ック蛋白質による哺乳動物細胞におけるマトリ ックスメタ口プロティナ ーゼー 9遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質の使用などに関する 図面の簡単な説明'
図 1は、 chsp60刺激による単球系株化細胞における TNF a (図 1 A ) お よび MMP- 9 (図 1 B ) 産生誘導の経 変化を示す。
図 2は、 単球系株化細胞における MMP- 9産生誘導の chsp60濃度依存性を 示す。 発明の詳細な説明
本発明の動脈硬化症の治療および Zまたはその合併症の予防 · .治療物 質のスク リーニング方法は、 単球系株化細胞と、 クラミジァ ' ニューモ ニェ由来 6 0 k D a熱ショ ック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたは その塩あるいはそれを産生し得る細胞とを用いることを特徴とする。 こ こで 「動脈硬化症の治療」 とは、 例えば、 動脈硬化病変の進展抑制ゃプ ラークの安定化などを意味し、 また 「動脈硬化症の合併症」 としては、 例えば、 急性心筋梗塞、 不安定狭心症等の急性冠症候群 （A C S ) 、 脳 梗塞、 脳血栓症、 脳塞栓症等の虚血性脳血管障害などの心血管および脳 血管ィベントが挙げられる。
本発明において使用される chsp60は、 配列番号 2で表されるァミノ酸 配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質であ れば、 その由来に特に制限はなく、 例えば、 关然より分離されたクラミ ジァ · ニューモニエに属する各種菌株 （例えば、 肺炎患者からの臨床分 離株など） から単離することができる。 また、 配列番号 2で表されるァ ミノ酸配列に基づいて化学的に合成されたものであってもよく、 上記ァ ミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体 から産生された組換え蛋白質であってもよい。 あるいは、 該核酸を铸型 として無細胞 （転写） 翻訳系を用いて生化学的に合成された蛋白質であ つてもよレヽ。
「配列番号 2で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列 J としては、 配列番号 2で表わされるアミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好 ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは 約 9 0 %以上、 最も好ましくは条勺 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。
ここで 「相同性」 とは、 当該技術分野において公知の数学的アルゴリ ズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、 最適なァラ インメント （好ましくは、 該アルゴリズムは最適なアラインメントのた めに配列の一方もしくは両方へのギヤップの導入を考慮し得るものであ る） における、 オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ 酸および類似アミノ酸残基の割合 （°/0 ) を意味する。 「類似アミノ酸」 とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、 例えば、 芳香 族アミノ酸 （Phe、 Trp、 Tyr) 、 脂肪族アミノ酸 （Ala、 Leu、 I l e、 Val ) 、 極性アミノ酸 （Gln、 Asn) 、 塩基性アミノ酸 （Lys、 Arg、 Hi s) 、 酸性 アミノ酸 （Glu、 Asp) 、 水酸基を有するアミノ酸 （Ser、 Thr) 、 側鎖の 小さいアミノ酸 （Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met) などの同じグループに分類 されるアミノ酸が挙げられる。 このような類似ァミノ酸による置換は蛋 白質の表現型に変化をもたらさない （即ち、 保存的アミノ酸置換である ) ことが予測される。 保存的アミノ酸置換の具'体例は当該技術分野で周 知であり、種々の文献に記載されている （例えば、 Bowi eら， Sc i ence, 247 ： 1306 - 1310 (1990)を参照) 。
ァミノ酸配列の相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、 例え ば、 Karl inら， Pro Nat l. Acad. Sci . USA, 90 : 5873 - 5877 (1993)に 記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは NBLASTおよび XBLASTプログラム (vers ion 2. 0) こ糸且み込まれてレヽる （Altschulら， Nucl ei c Aci ds Res. ， 25.： 3389-3402 ( 1997) ) ] 、 Needle睡ら， J. Mo l . Biol.， 8： 444-453 (1970)に記載のアルゴリ ズム [該アルゴリ ズムは GCGソフ ト ウエアパッケ ージ中の GAPプログラムに組み込まれている] 、 Myersおよび Mi l ler, CABI0S, 4： 11-17 (1988)に記載のアルゴリ ズム [該アルゴリズムは CGC 配列アラインメントソフ トウエアパッケージの一部である ALIGNプ口グ ラム ( version 2. 0) 【こ糸且み込まれて ヽる]、 Pearsonら， Proc. Nat l. Acad. Sc i . USA, 85： 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム [該ァルゴリ ズ ムは GCGソフ トウェアパッケージ中の FASTAプログラムに組み込まれてい る] 等が挙げられるが、 それらに限定されない。
より好ましくは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一 のァミ ノ酸配列とは、 配列番号 2で表されるァミ ノ酸配列と約 6 0 %以 上、 好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ま しくは約 9 0 %以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
「配列番号 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質」 とは、 前記の 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列 と実質的に同一のアミノ酸配列」 を含有し、 且つ配列番号 2で表される ァミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質を いう。
ここで 「活性」 とは、 哺乳動物 （例： ヒ ト、 サル、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 ノヽムスター、 モノレモッ ト、 マウス、 ラッ ト等） 細胞 （例えば、 単球 · マクロファージなどの単球系細胞を含 む白血球細胞や血管平滑筋細胞等の血液もしくは血管壁に存在する細胞 など） における MMP-9発現増強活性、 プラーク不安定化 （線維性被膜脆弱 化） 活性をいい、 「実質的に同質」 とは、 それらの活性が性質的に （例 ：生理学的に、 または薬理学的に） 同質であることをいう。 したがって、 MMP- 9発現增強活性等が同等' （例： 0 . 5〜 2倍） であることが好ましい 力 S、 これらの活性の程度、 蛋白質の分子量などの量的要素は異なってい てもよい。
MMP- 9発現増強活性の測定は、 例えば、 上記非特許文献 5等に記載され る方法 （抗匪 P- 9抗体を用いた ELISA、 ゼラチン 'ザィモグラフィー、 定 量的 RT-PCR) またはそれに準じる方法に従って行うことができる。
また、 本発明で使用される chSp60としては、 例えば、 1)配列番号 2で 表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 特に好ま ' しくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 2)配列番 号 2で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0個程 度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 特に 好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 3)配 列番号 2で表されるァミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜 5 0 個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 特に好ましくは数（ 1〜 5 ) 個） のァミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 4)配列番号 2で表されるァミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1 〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個 程度、 特に好ましくは数 （ 1〜 5 ) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置 換されたアミノ酸配列、 または 5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を 含有する蛋白質などのいわゆるムテインも含ま'れる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 その挿入、 欠失または置換の位置は特に限定されない。
本発明における chsp60は、 好ましくは、 配列番号 2で表されるァミノ 酸配列を有する、 クラミジァ 'ニューモニエ KKpn-；!株 [Ki shimoto T. and Soej ima R. , Intern. Med. , 32 : 934 - 937 (1993) ]由来の蛋白質 [該 KKpn - 1 株由来の chsP60遺伝子を導入された組換え大腸菌 Escherichia coli BL21(DE3)/pHSP21- 1株は、 FERM BP-8430の受託番号を付され、 平成 1 5 ( 2 0 0 3 ) 年 7月 1 6 日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特 許生物寄託センター （〒305- 8566 茨城県つくば巿東 1 一 1 一 1 中央 第 6 ) に寄託されている] 、 あるいは他の C p菌株由来のそのバリアン トである。
本明細書において、 蛋白質およびペプチドは、 ペプチド標記の慣例に 従って左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端 ) で記載されている。 配列番号 2で表わされるアミノ酸配列を含有する. 蛋白質をはじめとする chsP60は、 C末端がカルボキシル基 （一 C O O H ) 、 力ノレボキシレート（一 C O O—) 、 アミ ド （一 C O N H2) またはエス テル （一 C O O R ) の何れであってもよレヽ。
ここでエステルにおける Rと しては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n — プロピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの アルキル基 ； 例えば、 シク口ペンチル、シク口へキシルなどの C 3_8シクロアルキノレ基；例えば、 フエニル、 α —ナフチルなどの C 6— 12ァリール基 ； 例えば、 ベンジル、 フ エネチルなどのフエ二ルー アルキル基 ； α—ナフチルメチルなどの a—ナフチルー C Mアルキル基などの C 7— 14ァラルキル基 ； ピパロィルォ キシメチル基などが用いられる。
chsp60が C末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレー ト） を 有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化 たはエステル化されてい るものも chsp60に含まれる。 この場合のエステルと しては、 例えば上記 した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 chsp60には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アル カノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切 断されて生成する N末端の 'ダルタミン残基がピログルタミン酸化したも の.、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば— O H、 一 S H、 アミ ノ基、 イ ミダゾール基、 インドール基、 グァ ^ジノ基など） が適当な保 護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アルカノィル基など の ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合した いわゆる糖蛋白質などの複合蛋'白質なども含まれる。
chsP60の部分ペプチド （以下、 単に 「本発明の部分ペプチド」 と略称 する場合もある） は、 上記した chsp60の部分アミノ酸配列を有するぺプ チドであり、 且つ chsp60と実質的に同質の活性を有する限り、 何れのも. のであってもよい。 ここで 「実質的に同質の活性」 とは上記と同意義を 示す。 また、 「実質的に同質の活性」 の測定は chsP60の場合と同様に行 なうことができる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドとして、 例えば、 配列番号 2で表 されるアミノ酸配列のうち、 哺乳動物細胞における MMP- 9発現増強作用に 関わる領域を含む部分ァミノ酸配列を有するものなどが用いられる。 本発明の部分ペプチドとしては、 少なく とも 5 0個以上、 好ましくは 1 0 0個以上、 より好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸を有するぺプチ ドなどが好ましい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端がカルボキシル基 （一 C O O H ) 、 カルボキシレ一ト (― C O O— ) 、 アミ ド （一 C〇N H 2) またはエス テル （一 C O O R ) の何れであってもよい。 こでエステルにおける R としては、 chspSOについて前記したと同様のものが挙げられる。 本発明 の部分ペプチドが C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレー ト） を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステル化さ れているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば、 C末端のエステルと同様のものなどが用いられる。 さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した chsp60と同様に、 N末 端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、 N末端の ダルタミン残基がピ口グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側 鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結 合したいわゆる糖ぺプチドなどの複合ぺプチドなども含まれる。
chsP60またはその部分ぺプチ'ドの塩としては、 生理学的に許容される 酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が 用いられ、 と りわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このよ うな塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、. 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用い られる。
chsP60またはその塩は、 前述の通り、 各種 C p菌株の菌体から自体公 知の蛋白質分離 ·精製技術によって調製することができる。具体的には、 例えば、 ヒ ト肺由来培養細胞 （例 ： HL細胞等） などの.適当な宿主細胞を C pに感染させ、 クラミジァ増殖に適した培地 （例 ： シクロへキシミ ド 添加イーグル培地等） 中で適当な期間培養した後、 超音波処理等によつ て細胞を破砕し、 密度勾配遠心法等を用いて C p菌体を大量精製する。 得られた C p菌体を溶解して可溶性画分を抽出した後、 該可溶性画分を 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマ グラフィー、 ァフィニテ ィークロマトグラフィーなどで分離することによって、 chsp60またはそ の塩を精製することができる。
chsp60もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 「chsp60類 （ chsp60s) 」 と総称する場合がある） は、 公知のペプチド合成法にしたが つて製造することもできる。 ペプチド合成法は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれであつ て.もよい。 chsp60類を構成し得る部分ぺプチドもしくはアミノ酸と残余 部分とを縮合し、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離すること により 目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、 縮合や保護基の脱離は、 自体公知の方法、 例えば、 以下の 1) 〜5)に記載された方法にしたがって行われる。
1) M. Bodanszky および M. A. Ondett i , ペプチド、 シンセシス (Pept i de Synthes i s) , Intersc i ence Publ i shers, New York (1966年)
2) Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド（The Pept i de)， Academi c Press,' New York (1965年）
3)泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （1975年）
4)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205 、 （1977年）
5)矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ペプチド合成、 広川書店 このよ うにして得られた蛋白質 （ペプチド） は、 公知の精製法により 精製単離することができる。 ここで、 精製法としては、 例えば、 溶媒抽 出、 蒸留、 カラムクロマトグラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結 晶、 これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質 （ペプチド） が遊離体である場合には、 該 遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によつて適当な塩に変換 することができるし、 逆に蛋白質 （ペプチド）'が塩と して得られた場合 には、 該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体また は他の塩に変換することができる。
chS P60類の合成には、 通常、 市販の蛋白質合成用樹脂を用いることが できる。 このような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒ ドロ キシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一 ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4ーメチノレベンズヒ ドリルァ ミ ン樹脂、 P A M樹脂、 4ーヒ ドロキシメチルメチルフエニルァセ トァ ミ ドメチル樹脂、 ポリアク リルァミ ド樹脂、 4一 （ 2， ， 4， 一ジメ ト キシフエ二ルーヒ ドロキシメチル) フエノキシ樹脂、 4 一 ( 2， ， 4， —ジメ トキシフエ-ルー F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂などが 挙げられる。
このような樹脂を用い、 α —アミノ基と側鎖官能基を適当に保護した アミノ酸を、 目的とする蛋白質 （ペプチド） の配列通りに、 自体公知の 各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白 質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分 子内ジスルフイ ド結合形成反応を実施し、 目的の蛋白質 （ペプチド） ま たはそのアミ ド体を取得する。
上記した保護ァミノ酸の縮合においては、 蛋白質合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類が好ま しい。 カルボジイ ミ ド類と しては、 D C C、 Ν , N ' —ジイソプロピル力 ルボジイ ミ ド、 Ν—ェチルー Ν，一 ( 3—ジメチルァミノプロ リル) カル ポジイミ ドなどが用いられる。
保護アミノ酸の縮合は、 例えば活性化試薬およびラセミ化抑制添加剤 (例えば、 H O B t、 H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に 添加するか、 あらかじめ保護アミノ酸を対称酸無水物または H O B tェ ステルあるいは H O O B tエステルとして活性'化した後に樹脂に添加す ることによつて行われる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、 蛋白質縮 合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択される。 例え ば、 N , N—ジメチルホルムアミ ド、 N , N—ジメチルァセ トアミ ド、 N—メチルピロ リ ドンなどの酸アミ ド類 ；塩化メチレン、 クロ口ホルム などのハロゲン化炭化水素類 ； トリフルォロエタノールなどのアルコー ル類； ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類； ピリジンなどのァ ミン類； ジォキサン、 テトラヒ ドロフランなどのエーテル類； ァセトニ トリノレ、 プロピオ二トリルなどの二トリル類 ；酢酸メチル、 酢酸ェチル などのエステル類； あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は、 蛋白質縮合反応に使用されることが知られている範囲か ら適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は、 通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 二 ンヒ ドリン反応を用いたテス トの結果、 縮合が不十分な場合には、 保護' 基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を
'行なうことができる。縮合反応を繰り返しても縮合が不十分な場合には、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセチ ル化することによって、 十分な縮合を行なうことができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護方法ならびに保護基、 お よびその保護基の脱離方法、反応に関与する官能基の活性化方法などは、 公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t 一ペンチノレォキシカノレポ二ノレ、 イソボノレニノレオキシ力/レポ二ノレ、 4—メ トキシベンジルォキシカルボニル、 C 1 一 Z、 B r — Z、 ァダマンチル ォキシカノレボニノレ、 ト リ フノレオロアセチノレ、 フタ ロイノレ、 ホノレミノレ、 2 —ニトロフエニノレスノレフエ二ノレ、 ジフエ -ノレホスフイノチオイノレ、 F m 0 cなどが挙げられる。
原料アミノ酸のカルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例 えば、 メチノレ、 ェチノレ、 プロピノレ、 プチノレ、 t—プチノレ、 シクロペンチ ノレ、 シクロへキシノレ、 シクロへプチル、 シクロォクチノレ、 2—了ダマン チルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル化） 、 ァラル キルエステル化 (例えば、 ンジノレエステノレ、 4一二 トロべンジノレエス テノレ、 4ーメ トキシペンジノレエステノレ、 4一クロ口べンジノレエステノレ、 ベンズヒ ドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ペンジノレオキシ カルボ-ルヒ ドラジド化、 t—ブトキシカルボ-ルヒ ドラジド化、 トリ チルヒ ドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保 護することができる。 エステル化に適する基と しては、 例えば、 ァセチ ル基などの低級 （C^) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル 基、 ベンジルォキシカルボニル基、 エ トキシカルボニル基などの炭酸か' ら誘導される基などが挙げられる。 また、 エーテル化に適する基.と して は、 例えば、 ベンジル基、 テ トラヒ ドロビラニル基、 t一プチル基など が挙げられる。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基と しては、 例えば、 B z 1、 C 12- B z 1、 2—ニ ト口ベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用い られる。
ヒスチジンのイ ミダゾーノレの保護基と しては、 例えば、 T o s、 4 - メ トキシ一 2, 3 , 6— トリメチノレベンゼンスノレホニノレ、 DN P、 ベン ジルォキシメチル、 B um, B o c、 T r t、 Fm o cなどが用いられ る。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d 一炭素などの触媒の存在下での水素気流中で 接触還元 ； 無水フッ化水 素、 メタンスノレホン酸、 トリ フル才ロメタンスノレホン酸、 トリフルォロ 酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理 ； ジイソプロピルェチル ァミン、 ト リェチルァミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処 理 ； 液体アンモユア中ナトリ ウムによる還元などが挙げられる。 上記酸 処理による脱離反応は、 一般に約一 20 °C〜 40 °Cの温度で行なわれる。 酸処理においては、 例えば、'ァニソール、 フエノール、 チオアエソール、 メ.タクレゾーノレ、 ノ ラクレゾ一ノレ、 ジメチノレスノレフィ ド、 1 , 4ーブタ ンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤 の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用 いられる 2， 4—ジ-トロフエニル基は、 チォフエノール処理により除 去される。 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミ ノレ基は、 1， 2—エタンジチォーノレ、 1 , 4—ブタンジチォ一ノレなどの 存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリ ウム溶液、 希アン モニァなどによるアルカリ処理によっても除去される。 ' 原料ァミノ酸のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、 対応する酸無水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン タクロ ロフエノ一ノレ、 2 , 4 , 5—ト リ ク ロ口フエノーノレ、 2 , 4—ジ 二 トロフエノール、 シァノメチノレアルコール、 パラ二 トロフエノ一ノレ、 H O N B、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N—ヒ ドロキシフタルイ ミ ド、 H O B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料アミ ノ酸のアミノ基 の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用いら れる。 +
蛋白質 （ペプチド） のアミ ド体を得る別の方法としては、 例えば、 ま ず、 カルボキシ末端アミノ酸のひ一カルボキシル基をアミ ド化して保護 した後、 アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプ チド鎖の N末端の α—アミノ基の保護基のみ 除いた蛋白質 （ぺプチド ) と C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質 （ペプチド ) とを製造し、 この両蛋白質 （ペプチド） を上記したような混合溶媒中 で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合によ り得られた保護蛋白質 （保護ペプチド） を精製した後、 上記方法により すべての保護基を除去し、 所望の粗蛋白質 （粗ペプチド） を得ることが できる。 この粗蛋白質 （粗 プチド） は既知の各種精製手段を駆使して 精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質 （ペプチド） のァ ミ ド体を得ることができる。
蛋白質 （ペプチド） のエステル体は、 例えば、 カルボキシ末端アミノ 酸の 0；—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しァミノ酸エステ ルとした後、 上記蛋白質 （ペプチド） のアミ ド体の場合と同様にして得 ることができる。
本発明の部分べプチドまたはその塩は、 chsp60またはその塩を適当な ぺプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
さらに、 chsp60類は、 chsp60またはその部分ペプチドをコードする核 '酸を含有する発現べクターを導入した形質転換体を培養し、 得られる培 養物から chSp60類を分離精製することによって製造することもできる。 chsp60またはその部分ぺプチドをコ一ドする核酸は DN Aであっても RNAであってもよく、 あるいは DNAZRNAキメラであってもよい。 好ましくは D N Aが挙げられる。 また、 該核酸は二本鎖であっても、 一 本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA 二本鎖 RNAま たは DNA ： RNAのハイブリ ッ ドでもよレ、。 一本鎖の場合は、 センス 鎖 （即ち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （即ち、 非コード鎖 ) であってもよい。
chsp60またはその部分ペプチドをコードする DNAとしては、 C p菌 体から常法により抽出したゲノム DNA、 C p菌体から常法により抽出 した RN Aから逆転写反応により調製した （あるいは RT-PCRにより増幅 した） c DNA、 化学合成した DNAなどが挙げられる。
chsp60またはその部分ぺプチドをコードする DNAとして、 具体的に は、 配列番号 1で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号 1で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイ ズする塩基配列を含有し、 俞記した配列番号 2で表されるァミ ノ酸配列 を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （例 ： MMP- 9発現増強活性など） を有する蛋白質 （ペプチド） をコードする D N Aなどが挙げられる。 配列番号 1 で表される塩基配列とハイス ト リ ンジェン トな条件下でハ イブリダィズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号 1で表される塩 基配列と、 オーバーラップする領域において、 約 6 0 %以上、 好ましく は約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有 する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨ ンは、 自体公知の方法あるいはそれに準.じる方 法、 例えば、 モレキュラー ' クローユング （Mol ecular Cloning) 第 2版 U · Sambrook et al. , Col d Spring Harbor Lab. Press, 1989) 【こ 己載 の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを 使用する場合、 ハイブリダィゼーシヨ ンは、 添付の使用説明書に記載の 方法に従って行なうことができる。 ハイプリダイゼーションは、 好まし くは、 ハイス トリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ここで 「ス トリンジェントな条件」 とは、 配列番号 1で表される塩基 配列と、 オーバーラップする領域において、 約 6 0 %以上、 好ましくは 約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 % 以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を有する D N Aとがハイブリダズし得る条件をいい、 例えば、 ナトリウム濃度が 約 1 9〜 4 0 m M、 好ましくは約 1 9〜 2 0 m Mで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5 °C、 特に好ましくは、 ナトリゥム濃度が 約 1 9 m Mで温度が約 6 5 °Cの場合が挙げられる。 当業者は、 ハイプリ ダイゼーシヨ ン溶液の塩濃度、 ハイブリダゼーシヨ ン反応の温度、 プロ ーブ濃度、 プローブの長さ、 ミスマッチの数、 ハイブリダィゼーシヨン 反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、 所望のス トリンジエンシーに容易に調節することができる。
chsp60またはその部分ぺプチドをコードする D N Aは、 好ましくは配 列番号 1 で表される塩基配列またはコ ドンの読み枠の一致した （即ち、 インフレームの） 該塩基配列の一部を含有する D N Aなどである。
chsP60またはその部分ぺプチドをコ一ドする D N Aは、 該蛋白質また はぺプチドをコ一ドする塩基配列の一部分を有する合成 D N Aプライマ 一を用い、 chsP60を産生する細胞 （例 ： C p菌体） 由来のゲノム D N A または c D N Aを鑄型として P C R法によって増幅する力 、 または該ゲ ノム D N A断片もしくは c D N Aを適当なクローニングべクター （例 ： バタテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミ ド、 ファージミ ドなど） に組 み込んで作製したライプラリーを、 chsp60の一部あるいは全領域をコー ドする D N A断片もしくは合成 D N Aを標識したものをプローブとした コロエーもしくはプラークハイブリダィゼーシヨンによりスクリーニン グすることによってクローユングすることができる。 ハイプリダイゼー シヨ ンは、 例えば、 モレキュラー ' ク ローニング (Mol ecular Cloning) 第 2版 （前述） に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライプラリーを使用する場合、 ハイブリダィゼーシヨ ンは、 該ラ ィブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことが できる。 ライプラリー用のベクターとして発現ベクターを使用した場合、 抗 chsp60抗体を用いた抗体スクリ一二ング法によつても chsp60またはそ の部分ぺプチドをコードする D N Aをクローニングすることができる。 また、 迅速かつ簡便に完全長 c D N Aクローンを得る方法として、 R A C E法を用いることができる。 即ち、 chsp60の c D N Aの一部に相当す る二本鎖 D N Aのセンス鎖及びァンチセンス鎖の部分塩基配列に相同な オリ ゴヌクレオチドをそれぞれ合成して、 各オリゴヌクレオチドと適当 なアダプタープライマーとを一対の P C Rプライマーとして 5 ' 及び 3 ' .RAC E反応を行い、 各増幅断片を制限酵素とリガーゼを用いる等の 方法で連結することにより、 完全長の c DNAクローンを得ることがで さる。
あるいは、 chsp60またはその部分ペプチドをコードする DNAは、 配 列番号 1で表される塩基配列に ¾づいて、 市販の DN A/RNA自動合 成機を用いて化学的に合成することができる。 センス鎖及びアンチセン ス鎖のフラグメントを互いにオーバーラップするような長さで合成し、 これらのフラグメントをハイプリダイズさせ、 P C R法等を組み合わせ' て完全長の DNAを作製することもできる。
D N Aの塩基配列は、公知のキッ 卜、例えば、 Mutan"1- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0M- LA PCR 法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準 じる方法に従って変換することができる。
クローン化された蛋白質をコードする DN Aは、 目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化するか、 リンカ一を付加した後に、 使 用することができる。 該 DNAはその 5 ' 末端側に翻訳開始コ ドンとし ての AT Gを有し、また 3 '末端側には翻訳終止コ ドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コ ドンや翻 訳終止コ ドンは、 適当な合成 DN Aアダプターを用いて付加することが できる。 '
chsP60またはその部分ぺプチドをコ一ドする核酸を含有する発現べク ターは、 例えば、 chsp60をコードする D N Aから目的とする D N A断片 を切り出し、 該 DN A断片を適当な発現べクター中のプロモーターの下 流に連結することにより製造することができる。
発現べクターとしては、大腸菌由来のプラスミ ド（例、 ； p B R 3 2 2、 p B R 3 2 5、 p U C l 2 p U C l 3 ) ； 枯草菌由来のプラスミ ド （ 例、 p U B 1 1 0、 p T P 5、 p C 1 9 4 ) ；酵母由来プラスミ ド （例、 p S H 1 9、 p S H 1 5 ) ; λファージなどのパクテリオファージ ； レ トロゥイノレス、 ワクシュアウイノレス、 ノ キュロウイノレスなどの動物ウイ ルス ； p A 1 — 1 1、 p XT l、 R c /CMV、 p R c /R S V、 p c D N A I /N e oなどが用いられる。
プロモーターと しては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な プロモーターであればいかなるものでもよレヽ。
宿主がェシエリ ヒア属菌である場合、 t r pプロモーター、 l a cプ 口モーター、 r e c Aプロモーター、 L P Lプロモーター、 l p pプロモ 一ター、 T 7プロモーターなどが好ましレ、。
宿主がバチルス属菌である場合、 S P O lプロモーター、 S P 0 2プ 口モーター、 p e n Pプロモーターなどが好ましレヽ。
宿主が酵母である場合、 P H0 5プロモーター、 P GKプロモーター、 GA Pプロモーター、 A DHプロモーターなどが好ましレヽ。
宿主が昆虫細胞である場合、 ポリヘドリ ンプロモーター、 P 1 0プロ モーターなどが好ましい。
例えば、 宿主が動物細胞である場合、 S R o;プロモーター、 S V 4 0 プロモーター、 L T Rプロモーター、 CMV (サイ トメガロウィルス） プロモーター、 H S V-T Kプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 CMVプロモーター、 S R aプロモーターなど'が好ましい。
発現ベクターと しては、 上記の他に、 所望によりェンハンサー、 スプ ライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 S V 4 0複 製起点 （以下、 S V 4 0 o r i と略称する場合がある） などを含有して いるものを用いることができる。 選択マーカーと しては、 例えば、 アン ピシリ ン耐性遺伝子 （以下、 Am p rと略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 orと略称する場合がある、 G 4 1 8耐性） 、 テ トラサイタリン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子、 ジヒ ド 口葉酸還元酵素 （以下、 d h f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソ トレキセート （MTX) 耐性〕 等が挙げられる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 chsp60の N端末 側に付加してもよい。 宿主がェシヱリヒァ属菌である場合、 PhoA · シグ ナル配列、 OmpA · シグナル配列などが ；宿主がバチルス属菌である場合 α—アミラーゼ · シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列などが 宿主が酵母である場合、 MFひ ' シグナル配列、 S UC 2 · シグナル' 配列などが；宿主が動物細胞である場合、ィンシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン · シグナル配列、 抗体分子 · シグナル配列などが それぞれ用いられる。 '
chsp60またはその部分ぺプチドをコ一ドする D N Aを含有する形質転 換体は、 公知の方法にしたがい、 該 DN Aを含有する発現べクターで、 宿主を形質転換することによって製造することができる。
ここで、 発現ベク ターとしては、 前記したものが挙げられる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリ ヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆 虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリ ヒァ属菌としては、例えば、ェシェリ ヒア .コリ （Escherichia coli) K 1 2 · D H 1 〔プロシージングズ · ォプ · ザ · ナショナル · ァ 力デミ一 ·ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ 'ザ 'ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 6 0卷， 1 6 0 (1 9 6 8)〕 ， J M 1 0 3 〔ヌクイ レック · ァシッズ · リサーチ (Nucleic Acids Research) , 9卷， 3 0 9 (1 9 8 1 )〕 ， J A 2 2 1 〔ジャーナル ' ォプ 'モレキュラー 'パイ ォロジ一 (Journal of Molecular Biology) , 1 2 0卷， 5 1 7 (1 9 7 8)] , HB 1 0 1 〔ジャーナル ' ォブ 'モレキュラー ' バイオ口ジ一， 4 1卷， 4 5 9 (1 9 6 9 )〕 ， C 6 0 0 〔ジェネティ ックス （Genetics ) ， 3 9卷， 4 4 0 (1 9 5 4)〕 などが用いられる。
バチルス属菌と しては、 例えば、 バチルス · サプチルス (Bacillus subtilis) M I 1 1 4 〔ジーン， 2 4卷， 2 5 5 (1 9 8 3 )〕 ， 2 0 7 ― 2 1 〔ジャーナノレ 'ォブ 'バイオケミ ス ト ジ一 (Journal of Biochemistry ) ， 9 5卷， 8 7 (1 9 8 4)〕 などが用いられる。
酵母と しては、例えば、サッカロマイセス セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2 , AH 2 2 R", NA 8 7— 1 1 A, DKD— 5 D ， 2 O B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ (Schizosaccharomyces' pombe) NCYC 1 9 1 3 , N CYC 2 0 3 6 , ピキア パス ト リ.ス （ Pichia pastoris) KM 7 1 などが用いられる。
昆虫細胞と しては、 例えば、 ウィルスが A c N P Vの場合、 夜盗蛾の 幼虫由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f 細胞) 、
Trichoplusia niの中腸由来の M G 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞、 Estigmena acrea由来 の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmN P Vの場合、 昆虫細胞とし ては、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N 細胞 ； BmN細胞） などが用い られる。 該 S f 細胞と しては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J. L. ら、 イン ' ヴィボ （In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫と しては.、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネ イチヤー （Nature) , 3 1 5卷， 5 9 2 ( 1 9 8 5)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 C O S— 7， V e r o , チヤィ ニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， d h f r遺 伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO ( d h f r■ ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 2 0， マウスミエロー マ細胞， ラッ ト G H 3 , ヒ 'ト F L細胞などが用いられる。
形質転換は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法にしたがって実施するこ とができる。
ェシエリ ヒア属菌は、 例えば、 プロシージングズ · ォブ .ザ · ナショ ナル ' アカデミー 'ォブ 'サイェンジィズ 'ォプ 'ザ 'ユーエスエー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 6 9巻， 2 1 1 0 ( 1 9 7 2 )やジーン (Gene) , 1 7卷， 1 0 7 ( 1 9 8 2 )などに記載の方法に従って形質転 換することができる。
バチルス属菌は、 例えば、 モレキュラー ' アン ド ' ジェネラル ' ジェ' ネティックス (Molecular & General Genetics) , 1 6 8巻， 1 1 1 ( 1 9 7 9 )などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、 例えば、 メソッズ ·イン 'ェンザィモロジ一 （Methods in Enzymology) , 1 9 4卷， 1 8 2 — 1 8 7 ( 1 9 9 1 ) 、 プロシージン グズ · ォプ · ザ ·ナショナル · アカデミー · ォプ ·サイェンシィズ · ォ ブ ·ザ，ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 7 5卷， 1 9 2 9 ( 1 9 7 8 )などに記載の方法に従って形質転換することができる。 昆虫細胞および昆虫は、 例えば、 バイオ Zテクノロジー （
Bio/Technology) ，6, 47- 55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換す ることができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコール. 2 6 3 - 2 6 7. ( 1 9 9 5 ) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジー （Virology ) , 5 2巻， 4 5 6 ( 1 9 7 3 )に記載の方法に従って形質転換すること ができる。
形質転換体の培養は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法にしたがって実 施することができる。
例えば、 宿主がェシェリ ヒァ属菌またはバチルス属菌である形質転換 体を培養する場合、培養に 用される培地としては液体培地が好ましレ、。 また、 培地は、 形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物など を含有することが好ましい。 ここで、 炭素源としては、 例えば、 ダルコ ース、 デキス ト リ ン、 可溶性澱粉、 ショ糖などが ； 窒素源としては、 例 えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ぺプト ン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質が ； 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸ニ水素 ナトリウム、 塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。 また、 培地 には、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 ' 培地の ρ Ηは、 好ましくは約 5〜約 8である。
宿主がェシェリ ヒァ属菌である形質転換体を培養する場合の培地とし ては、 例えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む Μ 9培地 〔ミラー （Mi l l er ) , ジヤーナノレ · ォブ ' ェクスペリメンッ ' イン ' モレキュラー ' ジェ 不アイ ックス (Journal of Experiment s in Molecular Genetics) , 4 3 1 — 4 3 3 , Co l d Spring Harbor Laboratory, New York 1 9 7 2〕 が好ましい。 必要により、 プロモーターを効率よく働かせるために、 例 えば、 3 j3—インドリルァク リル酸のような薬剤を培地に添加してもよ レ、。
宿主がェシェリ ヒァ属菌である形質転換体の培養は、 通常約 1 5〜約 4 3 °Cで、 約 3〜約 2 4時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行 つてもよレヽ。 . 宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、 通常約 3 0〜約 4 0 °Cで、 約 6〜約 2 4時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行って もよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、 ノ ークホールダー (Burkholder) 最小培地 [Bost i an, K. L. ら、 プロシ 一ジングズ · ォプ ·ザ · ナショナノレ · アカデミー · ォブ · サイェンシィ ズ ' ォブ ·ザ ·ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 7 7卷， 4 5 0 5 (1 9 8 0)〕や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 [Bitter, G. A. ら、 プロシージングズ ' ォブ ·ザ · ナショナル · アカデミー · ォ プ■サイェンシィズ · ォプ■ ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. U S A) , 8 1卷， 5 3 3 0 ( 1 9 8 4) 〕 などが挙げられる。 培地の p Hは、 好ましくは約 5〜約 8である。 培養は、 通常約 2 0 °C〜約 3 5 °Cで、 約 2 4〜約 7 2時間行なわれる。 必要に応じて、 通気や撹拌を行 つてもよい。 ' 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地と しては、 例えば、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C. ，ネイチヤー ( Nature) , 195, 788 (1962)) に非働化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を 適宜加えたものなどが用いられる。 培地の： Hは、 好ましくは約 6. 2 〜約 6. 4である。 培養は、 通常約 2 7°Cで、 約 3〜約 5 日間行なわれ る。 必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例 えば、 約 5〜約 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （ Science) , 1 2 2卷， 5 0 1 (1 9 5 2)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジ 一 (Virology) ， 8卷， 3 9 6 (1 9 5 9)〕 ， R PM I 1 6 4 0培地 〔 ジャーナル · ォブ■ザ■ ァメ リカン ' メディカル · アソシエーション ( The Journal of the American Medical Associationノ 丄 9 9 ¾：, 5 1 9 ( 1 9 6 7 )] , 1 9 9培地 〔プロシージング · ォブ · ザ · ソサイエティ • フォー ·ザ ·ノ ィォロジカル · メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 7 3卷， 1 ( 1 9 5 0 )〕 などが用いら れる。 培地の p Hは、 好ましくは約 6〜約 8である。 培養は、 通常約 3 0°C〜約 4 0°Cで、 約 1 5〜約 6 0時間行なわれる。 必要に応じて通気 や撹拌を行ってもよい。 '
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に chspSO もしくはその部分べプチドまたはその塩を製造することができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から chsp60類を自体公知の 方法にしたがって分離精製することができる。
例えば、 chSp60類を培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、 培養物 , から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、 超 音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細 胞を破壊した後、 遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る方法な' どが適宜用いられる。 該緩衝液は、 尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質 変性剤や'、 トリ トン X— 1 0 0™などの界面活性剤を含んでいてもよレ、。 培養液中に蛋白質 （ペプチド） が分泌される場合には、 培養物から、 公 知の方法で培養上清を集める方法が用いられる。
このよ うにして得られた培養上清あるいは抽出液中に含まれる蛋白質 (ペプチド） の精製は、 自体公知の方法にしたがって分離精製すること ができる。 このような方法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を 利用する方法；透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリ アタリルァミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方 法； イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法； ァ フイエティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法； 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法 ；等 電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法； などが用いられる。 これらの方法は適宜組み合わせることもできる。
より迅速かつ簡便に組換え chsp60類を精製するには、 ァフィ二ティー クロマトグラフィーを利用することが好ましい。 ァフィ二ティーカラム としては、 抗 chsp60抗体カラムを用いることができ、 また、 chsp60また はその部分ぺプチドをコ一'ドする D N Aに適当なタグ配列 (例： Hi sタグ 、 GSTタグ、 MBPタグなど） を付加し-た場合は、 金属イオンキレート、 グ ルタチオン、 マルトース固定化カラムなどを適宜用いることができる。 chsp60に対するモノク口一ナル抗体またはポリクローナル抗体はいずれ も市販されており （例： A m e r s h a m社製など） 、 あるいは、 chsp60 類を抗原として用いて自体公知の抗体または抗血清の製造法 （例えば、 -： 後記参照） に従って製造することができる。
かく して得られる蛋白質 （ペプチド） が遊離体として得られた場合に は、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって、 該遊離体を塩' に変換することができ、 蛋白質 （ペプチド） が塩として得られた場合に は、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 該塩を遊離体ま たは他の塩に変換することができる。
なお、 形質転換体が産生する蛋白質 （ペプチド） を、 精製前または精 製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加え たり、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 該蛋白修飾酵素 と しては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドぺ プチダーゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。 かく して得られる chsp60類の存在は、 特異抗体を用いた土ンザィムィ ムノアツセィゃウェスタンブロッテイングなどにより確認することがで きる。
あるいはまた、 chsp60類は、 上記の chsP60またはその部分ペプチド をコードする D N Aに対応する R N Aを錶型と して、 ゥサギ網状赤血 球ライセー ト、 コムギ胚芽ライセート、 大腸菌ライセー トなどからな る無細胞蛋白質翻訳系を用いてィンビト口合成することができる。 あ るいは、 さ らに R N Aポリメラーゼを含む無細胞転写/翻訳系を用い て、 chsp60またはその部分ぺプチドをコ一ドする D N Aを铸型と して も合成することができる。 無細胞蛋白質 （転写） 翻訳系は市販のもの を用いることもできるし、 それ自体既知の方法、 具体的には大腸菌抽 出液は Pratt J. M. et al. , Transcription and Tranlation, 179 - 209， Hames B. D. &Higgins S. J. eds. , IRL Press, Oxford (1984)に記載の 方法等に準じて調製することもできる。 市販の細胞ライセー トと して は、 大腸菌由来のものは E. coli S30 extract system (Promega社製）や - RTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製）等力 S挙げられ、 ゥサギ 網状赤血球由来の 1 のは Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega 社製）等、 さらにコムギ胚芽由来のものは PR0TEI0STM (TOYOBO社製）等' が挙げられる。 このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適で ある。 コムギ胚芽ライセー トの作製法と しては、 例えば Johnston F.B. et al. , Nature, 179, 160 - 161 (1957)あるレヽは Erickson A. H. et al. , Meth. Enzymol. , 96, 38-50 (1996)等に記載の方法を用いること ができる。
蛋白質合成のためのシス テ ムまたは装置と しては、 バッチ法 (Pratt, J. M. et al. (1984) 前述）や、 アミノ酸、 エネルギー源等を連 続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム （Spirin A. S. et al. , Science, 242， 1162-1164 (1988) ) 、 透析法 （木川等、 第 21回日本分子生物学会、 WID6) 、 あるいは重層法 （PR0TEI0S™ Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説 書 ： TOYOBO社製) 等が挙げられる。 さらには、 合成反応系に、 铸型の R NA、 アミノ酸、 エネルギー源等を必要時に供給し、 合成物や分解物を必要時に排出す る方法 （特開 2000-333673) 等を用いることができる。
かく して得られる蛋白質 （ペプチド） の塩 （遊離体） への変換、 精製 前後の修飾および存在の確認 （検出） は、 上記と同様にして行うことが できる。 本発明のスクリーユング において、 chsp60類は、 単離された蛋白質 (ペプチド） としてだけではなく、 それを産生し得る細胞の形態で提供 することもできる。 chsP60類を産生し得る細胞としては、 天然に chsp60 を産生するクラミジァ · ニューモニエに属する各種菌株の他、 人為的に chsP60類を産生するように操作された細胞、 例えば、 前記した chsp60ま たはその部分べプチドをコ一ドする D N Aを含有する形質転換体が挙げ られる。 後者の場合、 該形質転換体は、 単球系株化細胞の培養に適した 条件下で該株化細胞における MMP- 9発現を増強するのに十分な量の chsp60を産生し得るものである。 ' 好ましくは、 chsp60類を産生し得る細胞は、 クラミジァ 'ニューモ- ェに属ずる各種菌株、 特に好ましくは前記 KKpn- 1株が挙げられる。
本発明で使用される単球系株化細胞は、 哺乳動物由来の単球もしくは マク ロファージから樹立される細胞株の細胞であれば特に制限はなく、 公知の単球系細胞株（例えば、 ヒ ト単球由来の Τ Η Ρ _ 1、 U— 9 3 7、 Ρ 3 1 / F U J、 マウス単球由来の R AW 2 6 4 . 7、 J 7 7 4 A . 1 等） の他、 哺乳動物から単離した単球もしくはマクロファージを公知の 培養技術を用いて株化することによって新たに榭立される細胞株の細胞 も包含される。
単球系株化細胞は、 ヒ トなどの哺乳動物から単離した単球やマク ロフ ァージ、 あるいは単球から GM-CSFなどの分化誘導因子により分化させた 初代マク口ファージ等の単球系の初代培養細胞に比べて、 chsP60刺激に よる丽 P- 9発現増強の度合が顕著に高い。 従って、 より高感度のスクリ一 ユング系を提供し得るという利点を有する。 望ましくは、 Ι Ο Ο η Μの chsp60類で 4 8時間刺激したときの MMP- 9遺伝子の発現が、 chsp60類で刺 激しない場合のそれの 5倍以上、 好ましくは 1 0倍以上、 より好ましく は 2 0倍以上である単球系株化細胞が用いられる。 chsp60非刺激時の MMP- 9遺伝子の発現量については特に制限はないが、 実質的に MMP- 9遺伝 子を発現しない （即ち、 検出限界以下である） ことがより好ましい。 好ましくは、 単球系株化細胞は、 ヒ ト単球由来の THP- 1、 U— 9 3 7、 P 3 1 /F U J等の細胞株の細胞であり、特に好ましくは THP- 1細胞株の 細胞である。
単球系株化細胞は、 各細胞に適した培養液 [例えば、 所望により ゥシ 胎仔血清や抗生物質 （ペニシリ ン、 ス ト レプ トマイシンなど） を添加し た最少必須培地 （MEM) 、 ダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM) 、 R PM I 1 6 4 0培地、 1 9 9培地、 F 1 2培地等] 中で継代培養し、 維持することができる。
本発明のスク リーニング法は、 試験化合物の存在下および非存在下に 単球系株化細胞を chsp60類で刺激した場合の、 両条件下における MMP- 9遺 伝子の発現を測定 ·比較することを特徴とする。
chsp60類による刺激は、 提供される chsp60類の形態に応じて適宜選択 することができる。 即ち、 chsP60類が単離された蛋白質 （ペプチド） で ある場合は、 chsP60類を所定の濃度となるように溶解した単球系株化細 胞用培養液 （例えば、 上記参照） を用いて単球系株化細胞をインキュべ ーシヨンすることにより行うことができる。 chsp60類濃度としては、 約 1 0 0〜約 1 0 0 0 n M (chsp60を用いた場合、約 5〜約 8 0 /z g/ml) 、 好ましくは約 2 0 0〜約 4 0 0 nMが挙げられる。 インキュベーショ ン は動物細胞の培養に用いられる培養容器を用いて行うことができ、 例え ば、 9 6穴ゥエルプレート等が好ましく用いられる。 細胞密度としては 約 5 X 1 05〜約 1 X 1 06cells/mlが例示される。 ィンキュベーションは 、 例えば、 C〇2イ ンキュベーター （例： 5 % C〇2、 9 5 %大気） 中、 約 3 0〜約 4 0 °Cで約 4 0〜約 7 2時間、 好ましくは約 4 4〜約 5 0時間 行うことができる。 一方、 chsp60類がそれを産生し得る細胞の形態で提供される場合、 該 細胞の共存下に単球系株化細胞をィンキュベーションすることにより、 株化細胞を chsP60類で刺激することができる。 chsp60類を産生し得る細 胞の添加量としては、 上記濃度の chsp60類で刺激するのと同等の刺激を 与え得る量であればよく、 例えば、 天然の C p菌体を使用する場合、 約 5 X 1 0 5〜約 1 X 1 0 7IFU (Inclus ion-Forming Uni ts) /ml、 好ましくは 約 1 X I 0 6〜約 1 X I 0 7IFU (Inc lus i on-Forming Uni ts) /ml力 S挙げられ る。 ィンキュベーションは上記と同様の条件下で行うことができる。 本発明の別の実施態様においては、 chsp60類産生細胞は単球系株化細1 胞自体であってもよい。 即ち、 単球系株化細胞を宿主細胞とし、 これを 上記の方法に従って chsp60またはその部分ぺプチドをコ一ドする D N A を含有する発現ベクターで形質転換することにより得られる形質転換体 を、 上記と同様の条件下でインキュベーションすることにより、 本発明 のスク リーニングを実施することができる。
この場合、 該形質転換体は、 chsP60類を所定の条件下でのみ産生し得 るように操作されていることがより好ましい。 そのような形質転換体の 作製方法としては、 例えば、 chsp60またはその部分ペプチドをコードす る D N Aを誘導个生プロモーター （例 ： メタロチォネィンプロモーター、 熱ショックプロモーター等） の制御下に配置した発現べクターを用いる 方法、 CRE-loxP系を用いる方法などが挙げられる。 このような形質転換 体を使用する場合、 chsp60類で刺激した時とは誘導物質 （または誘導ス ト レス） を負荷した時をいい、 非刺激時とは chsp60類発現非誘導時をい 本発明のスクリ一二ングに供される試験化合物は特に制限はなく、 例 えば、 コンビナトリアルケミス トリー技術を用いて作製された化合物ラ イブラリー、 固相合成やファージディスプレイ法により作製されたラン ダムペプチドライプラリー、' あるいは微生物、 動植物、 海洋生物等由来 の天然成分等が挙げられる。
単球系株化細胞における匪 P - 9遺伝子の発現を測定する方法も特に制 限されない。 例えば、 MMP- 9をコードする塩基配列またはその一部を含有 する核酸をプローブとして用い、 該株化細胞から抽出した R N Aを铸型 としてノーザンハイブリダイゼーションを行うか、 P-9をコ一ドする塩 - 基配列の一部を含有する合成オリゴ D NAをプライマーとして用い、 該 株化細胞から抽出した R N Aを鍀型として定量的 RT - PCRを行うことによ り、 RN Aレベルでの遺伝子発現量を測定することができる。 ' MMP - 9をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸としては、 例えば、 配列番号 3で表される塩基配列または該塩基配列とハイス トリ ンジェントな条件でハイプリダイズし得る塩基配列を含有する核酸が挙 げられる。 該核酸は D N Aであっても R NAであってもよく、 D N A/ RN Aキメラでもよい。 また、 該核酸は一本鎖であっても二本鎖であつ てもよく、 一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であって もよい。 二本鎖の場合は D N A ： RNAハイプリ ッ ドであってもよい。 あるいは、 MMP- 9遺伝子の発現は、 抗 MMP - 9抗体を用いて慣用のィムノ アツセィ系により蛋白質レベルで行うこともできる。 ここで使用される 抗 MMP - 9抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であ つてもよく、 また、 完全な抗体分子の他、 F (a b，）2、 F a b '、 F a b 画分なども用い.ることができる。
丽 P- 9に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体はいず れも市販されており （例： Am e r s h a m社製など） 、 あるいは、 MMP- 9 もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （以下、 「顧 P- 9類 （MMP- 9s) J という場合もある） を抗原として用いて自体公知の抗体または抗血清の 製造法に従って製造することができる。抗原として用いられる MMP - 9蛋白 質としては、 スクリーニングに使用する単球系株化細胞と同一起源の蛋 白質が好ましいがこれに限定されない。 例えば、 ヒ ト由来の単球系株化 細胞を使用する場合には、 配列番号 4で表されるアミノ酸配列中アミノ 酸番号一 8 7 〜 6 0 1で示されるアミノ酸配列を含有する 9 2 k D aプ 口蛋白質またはァミノ酸番号 1 〜 6 0 1で示されるァミノ酸配列を含有 する 8 8 k D a活性型蛋白質が挙げられる。 MMP - 9類は、 上記 chsp60類と 同様に、 MMP- 9産生細胞 （例 ： 哺乳動物由来の単球、 マクロファージ等） から公知の蛋白質分離技術を用いて精製するか、 配列番号 4で表される アミノ酸配列情報に基づいて固相合成法により化学的に合成するか、 配' 列番号 3で表される塩基配列情報に基づいてクローニングした MMP- 9を コードする D N Aを用いて組換え生産するカ あるいは画 P- 9をコードす る核酸を铸型として無細胞合成することにより得ることができる。
MMP - 9に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、例え ば、 以下のようにして作製することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
MMP- 9類を、 温血動物に対して、 投与により抗体産生が可能な部位に、 それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与する。 投与に際して抗体産 生能を高めるため、 完全フロイン トアジュバントゃ不完全フロイン トァ ジュバン トを投与してもよい。 投与は通常 2 〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2 〜 1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モノレモッ ト、 マウス、 ラッ ト、 ヒッジ、 ャギ等の哺乳動 物 （また、 哺乳動物以外でニヮ トリ等） が挙げられるが、 マウスおよび ラッ トが好ましく用いられる。
例えば、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認め られた個体を選択し、 最終免疫の 2 〜 5 日後に脾臓またはリンパ節を採 取し、 それらに含まれる抗 産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細 胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを 調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標 識化蛋白質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性 を測定することにより行うことができる。 融合操作は、 既知の方法、 例 えば、 ケーラーとミノレスタインの方法 〔ネイチヤー (Nature)、 256、 495 (1975)] に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール (P EG) やセンダイウィルスなどが挙げられ るが、 好ましくは P E Gが用いられる。 ' 骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0、 A P— 1などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好まし く用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数 との好ましい比率は、 1 ： 1〜 2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましく は P E G 1 0 0 0〜P E G 6 00 0) 力 1 0〜8 0 %程度の濃度で添加 され、 20〜 4 0 °C、 好ましくは 3 0〜 3 7 °Cで：！〜 1 0分間インキュ ペートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリ ド一マは、 例えば、 蛋白質抗原を直 接あるいは担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハ ィプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した 抗免疫グロブリ ン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗 マウス免疫グロ.プリン抗体が用いられる） またはプロティン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；抗免疫グロプリン 抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイブリ ドーマ培養上清を 添加し、 放射性物質や酵素などで標識した蛋白質を加え、 固相に結合し たモノクローナル抗体を検出する方法； などによりスク リ一二ングする ことができる。 モノクローナル抗体の選另 は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に 従って行なうことができる。 モノ クローナル抗体の選別は、 通常 H A T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用 培地で行なうことができる。 モノクローナル抗体の選別および育種用培 地は、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いて も良い。 このような培地としては、 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0。/。の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜： 1 0 %の牛 胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイプリ ド 一マ培養用無血清培地 （S F M - 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用い' ることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約.3 7 °C である。 培養時間は、 通常 5 日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間で ある。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行うことができる。 ハイプリ ドー マ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測 定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、 自体公知の方法、 例 えば、 免疫グロブリ ンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱 着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aある いはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解 離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って分離精製することができる。 〔ポリクローナル抗体の作製〕
MMP-9に対するポリクローナル抗体は、 自体公知の方法に従って製造す ることができる。 例えば、 免疫抗原 （蛋白質抗原） 自体、 あるいはそれ とキャリアー蛋白質との複合体をつく り、 上記のモノクローナル抗体の 製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から画 P - 9に対する抗 体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行うことにより製造することが できる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァー蛋白質と の複合体に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテン との混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体 が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい が、 例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイ口グロブリン、 へモシァニ ン等を重量比でハプテン 1に対し、 0 · 1〜 2 0、 好ましくは 1〜 5の 割合でカプリングさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリ ングには、 種々の縮合剤、 例え' ばダルタルアルデヒ ドゃカルボジイミ ド、 マレイミ ド活性エステル、 チ オール ¾、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられ る。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体 あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバ ントを投与してもよい。 投与は、 通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 3〜 1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹 水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価 の測定と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上 記のモノク口一ナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製 法に従って行なうことができる。
抗 MMP- 9抗体を用いる MMP- 9またはその塩の定量法は、 特に制限される べきものではなく、 被測定液中の抗原量に対応した抗体、 抗原もしくは 抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを 既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定 法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、ネフロメ トリー、 競合法、 ィムノメ トリ ック法およびサンドィツチ法が好適に用いられる 力 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好 ましい。
具体的には、 抗 MMP - 9抗体を用いたィムノアッセィ法としては、
( i ) 抗丽 P- 9抗体と、 被検液 （インキュベーション後の培養上清） およ び標識化された匪 P - 9類とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化 された MMP - 9類の割合を測定することにより被検液中の MMP - 9またはその' 塩を定量する方法 （競合法） 、 および
( i i)被検液と担体上に不溶化した抗謹 P-9抗体および標識化された別の 抗丽 P- 9抗体とを同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標 識剤の活性を測定することにより被検液中の丽 P- 9またはその塩を定量 する方法 （サンドイッチ法） 等が挙げられる。
上記 （i i) の定量においては、 一方の抗体が MMP- 9の N端部を認識する 抗体である場合、 他方の抗体が丽 P- 9の他の部分、 例えぱ C端部を認識す る抗体であることが望ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射 性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位 元素としては、 例えば、 〔125 I〕 、 〔131 I〕 、 〔3H〕 、 〔14 C〕 などが 用いられる。上記酵素と しては、安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラク トシダーゼ、 ）8—ダルコシダーゼ、 アルカリフォス ファターゼ、パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質と しては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチ オシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノー ル、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一 （ス トレプト
) アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、. 物理吸着を用いてもよく、 また通常蛋白質を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキス トラン、 セルロース などの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミ ド、 シリコン等 の合成樹脂、 あるいはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した抗丽 P- 9抗体に被検液を反応さ せ （ 1次反応） 、 さらに標識化した別の抗 MMP-9抗体を反応させ （2次反 応） た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中 の MMP- 9またはその塩の量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行ってもよいし、 また、 同時に行っても、 時間をずらして 行ってもよい。 標識剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じること ができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相化抗 体および標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はな く、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用い てもよい。
上記サンドィツチ法による MMP- 9またはその塩の測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる抗丽 P- 9抗体は、 MMP - 9の結合する部位が 相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次反 応に用いられる.抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が匪 P - 9の C 端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部 以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
抗丽 P_9抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメ トリ ック法あるいはネフロメ トリーなどに用いることもできる, 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反 応させたのち、 未反応の標識抗原（F )と、 抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検 液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、 B Z F分離をポリエチレングリ コール、 前記抗体 （一次抗体） に対する 二次抗体などを用いる液相法、 および、 一次抗体として固相化抗体を用 いるカヽ あるいは、 一次抗体は可溶性のものを用い二次抗体として固相 化抗体を用いる固相化法とが用いられる。 液相法では、 表面プラズモン 共鳴、 蛍光偏光ィムノアツセィ、 蛍光消光ィムノアツセィ、 蛍光エネル ギ一転移ィムノアッセィ等の均一系ィムノアツセィを用いることができ る。
ィムノメ トリ ック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の 標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるい は、 被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗 原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分 離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量 する。 '
また、 ネフロメ トリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の 結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かで あり、 少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用する レーザーネフロメ トリーなどが好適に用いられる。
これら個々の.免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたつ ては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法に おける通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて MMP- 9の 測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年 発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年 発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行 ) 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7 年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭 和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) )、 |BJ書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 8 (Immunochemical Techniques (Part D ： Selected Immunoassays) ) Λ 同 書 Vol. 92 (Immunochemical rechniques (Part E ： Monoclonal Antibodies' and General Immunoassay Methodsノ)、 Vol. 121 (Immunochemical
Techniques (Part I ： Hybridoma Technology and Monoclonal
Antibodies)) (以上、 ァカデミックプレス社発行）などを参照することが できる。
あるいはまた、 MMP- 9遺伝子の発現は、 生成した MMP- 9またはその塩の 酵素活性を指標として測定することもできる。 酵素活性の測定法は特に 制限されないが、 例えば、 被検液 （インキュベーショ ン終了後の培養上 清） を MMP -9の基質 （例：ゼラチン、 タイプ I Vコラーゲン等） を含有す るゲル（例：， S D S—ポリアクリルァミ ドゲル等） 上の電気泳動に付し、 S D Sを除去して MMP- 9をリフォールディングさせた後、適当なバッファ —中で該ゲルをイ ンキュベーショ ンし、 溶解パンドの濃さを画像解析に より定量する方.法等が挙げられる。
特に好ましくは、本発明のスクリ一二ング法における讓 P- 9遺伝子発現 の測定法は、 抗匪 P - 9抗体に被検液と酵素標識した腿 P- 9類とを競合的に 反応させる競合 ELISA法である。
上記の MMP- 9遺伝子発現の測定の結果、 例えば、 chsP60刺激時の MMP- 9 遺伝子の発現量を約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましく は約 5 0 %以上減少させる 験化合物を、 chsp60による MMP- 9の発現誘導 を阻害する化合物として選択することができる。
上記のようにして選択される画 P - 9の発現誘導を阻害する化合物は、 C p感染によるマク口ファージゃ血管平滑筋細胞由来の泡沫細胞からの MMP- 9の分泌増加を阻害してプラークの線維性被膜の脆弱化を抑制し、 プ ラークの不安定化 ·破綻を防ぐことができるので、 動脈硬化症の治療お よび/またはその合併症の予防■治療に有効である。
本発明はまた、 上記のスク リ一ニング法を実施するのに好適なキッ ト を提供する。 本発明のスク リーニング用キッ トは、 単球系株化細胞と、 ' chsp60類あるいはそれを産生し得る細胞またはそれをコードする DNAを 含む発現べクターとを含んでなることを特徴とする。 単球系株化細胞お よび chsp60類あるいはそれを産生し得る細胞またはそれをコードする DNAを含む発現べクタ一としては、本発明のスクリ一二ング方法の説明に おいて上記した通りのものが使用できる。
また、 一実施態様においては、 本発明のスク リーニング用キッ トは、 chsp60類を産生し得るように操作された単球系株化細胞を含んでなる。 そのような単球系株化細胞と しては、 本発明のスクリ一二ング方法の説 明において上記した通りのものが使用できる。
本発明のスクリ一二ング用キッ トは、 MMP- 9遺伝子の発現を測定するた めの試薬類をさらに含んでいてもよい。 例えば、 MMP -9遺伝子の発現を RT - PCRを用いて.測定する場合、 該キッ トは、 例えば、 MMP- 9 RNAの断片を 増幅し得るセンス及ぴアンチセンスプライマーをさらに含むことができ る。 該プライマー対の塩基配列としては、 例えば、 上記 Vehmaan-Kreula, P.ら、 Arteri oscler. Throrab. Vase. Biol . (米国） 、 2 0 0 1年、 第 2 1巻、 p p . e 1 — e 8に記載されたプライマー等が挙げられるが、 これらに限定されず、 当業者は.、 MMP- 9をコードする核酸の塩基配列 （例 えば、 配列番号 3で表される塩基配列） に基づいて、 必要に応じて公知 のプライマー設計支援ソフ トウエアを用い、 容易に他の好適なプライマ 一を構築することができる。
また、 MMP- 9遺伝子の発現を競合 ELISA法を用いて測定する場合、 該キ ッ トは、 抗 MMP- 9抗体および酵素標識された MMP-9もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩をさらに含むことができる。 ここで抗 MMP - 9抗体および -酵素標識された MMP - 9類と しては、本発明のスクリ一二ング方法の説明に おいて上記した通りのものがそれぞれ使用できる。 該キッ トは、 さらに 抗薩 P - 9抗体 （一次抗体） を特異的に認識し得る二次抗体 （例えば、 一次 抗体がゥサギ由来抗腿 P- 9 IgG抗体の場合、 ャギ由来抗ゥサギ IgG抗血清 など） 、 抗 MMP- 9抗体または該二次抗体を固相化するための担体 （例： マ イクロタイタ一プレート、 ガラスビーズなど） を含んでいてもよい。 本発明はまた、 chsp60による哺乳動物細胞における MMP- 9遺伝子の発現 誘導を抑制し得る物質を含有してなる、 動脈硬化症の治療および Zまた はその合併症の予防，治療剤を提供する。 該予防，治療剤は、 必要に応 じて薬理学的に許容される担体を含有することができる。
ここで、 「薬理学的に許容される担体」 としては、 製剤素材として慣 用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、 固形製剤における賦形 剤、 滑沢剤、 結合剤、 崩壌剤 ； 液状製剤における溶剤、 溶解補助剤、 懸 濁化剤、 等張化剤、 緩衝剤、 無痛化剤などとして配合される。 また必要 に応じて、 防腐剤、 抗酸化剤、 着色剤、 甘味剤などの製剤添加物を用い ることもできる。
賦形剤の好適な例としては、 乳糖、 白糖、 D—マン-トール、 D —ソ ルビトール、 デンプン、 ο;化デンプン、 デキス トリン、 結晶セルロース、 低置換度ヒ ドロキシプロピノレセルロース、 カルボキシメチルセノレロース ナトリ ウム、 ァラビアゴム、 デキス トリン、 プルラン、 軽質無水ケィ酸、 合成ケィ酸アルミ二ゥム、 メタケィ酸アルミ ン酸マグネシウムなどが挙 げられる。
滑沢剤の好適な例と しては、 ステアリ ン酸マグネシウム、 ステアリ ン 酸カルシウム、 タルク、 コロイ ドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例と しては、 α化デンプン、 ショ糖、 ゼラチン、 ァラ ビァゴム、 メチノレセノレロース、 カルボキシメチルセノレロース、 力ルボキ シメチノレセノレロースナ ト リ ウム、 結晶セノレロース、 白糖、 D—マンニ ト 一ノレ、 ト レノヽロース、 デキス ト リ ン、 プノレラン、 ヒ ドロキシプロピノレセ ノレロース、 ヒ ドロキシプロピノレメチノレセノレロース、 ポリ ビニノレピロ リ ド ンなどが挙げられる。
崩壌剤の好適な例と しては、 乳糖、 白糖、 デンプン、 カルボキシメチ ノレセノレロース、 力/レポキシメチノレセノレロースカノレシゥム、 ク ロスカノレメ ロースナト リ ウム、 カルボキシメチルスターチナトリ ウム、 軽質無水ケ ィ酸、 低置換度ヒ ドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。
溶剤の好適な例と しては、 注射用水、 生理的食塩水、 リ ンゲル液、 ァ ノレコーノレ、 プロピレングリ コーノレ、 ポリエチレングリ コーノレ、 ゴマ油、 トウモロコシ油、 オリープ油、 綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例と しては、 ポリエチレンダリ コール、 プロピレ ングリ コーノレ、 D—マンニ トーノレ、 ト レ/、ロース、 安息香酸ベンジノレ、 エタノール、 ト リスァミノメ タン、 コ レステロール、 ト リエタノールァ ミン、 炭酸ナト.リ ウム、 クェン酸ナトリ ウム、 サリチル酸ナト リ ウム、 酢酸ナトリ ウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例と しては、 ステアリルトリエタノールァミン、 ラ ゥリル硫酸ナトリ ウム、 ラウリルアミノプロピオン酸、 レシチン、 塩化 ベンザルコニゥム、 塩化べンゼ トニゥム、 モノステアリ ン酸グリセリ ン などの界面活性剤 ； 例えばポリ ビニルアルコール、 ポリ ビュルピロ リ ド ン、 カノレポキシメチノレセノレロースナトリ ウム、 メチノレセノレロース、 ヒ ド 口キシメチノレセノレロース、 ヒ ドロキシェチノレセノレロース、 ヒ ドロキシプ 口ピルセルロースなどの親水性高分子 ； ポリ ソルべ一 ト類、 ポリォキシ ェチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤の好適な例と しては、 塩化ナトリ ウム、 グリセリン、 D—マ ンニ トール、 D—ソルビトール、 ブドウ糖などが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、 リン酸塩、 酢酸塩、 炭酸塩、 クェン酸塩 などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例と しては、ベンジルアルコールなどが挙げられる。 防腐剤の好適な例としては、 パラォキシ安息香酸エステル類、 クロ口 プ'タノ一ノレ、 ベンジルアルコール、 フエネチルアルコール、 デヒ ドロ酢 酸、 ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、 亜硫酸塩、 ァスコルビン酸塩などが挙 げられる。
着色剤の好適な例としては、 水溶性食用タール色素 （例、 食用赤色 2 号および 3号、 食用黄色 4号および 5号、 食用青色 1号および 2号など の食用色素） 、 水不溶性レーキ色素 （例、 前記水溶性食用タール色素の アルミニウム塩など） 、 天然色素 （例、 j3—カロチン、 クロロフィル、 ベンガラなど) などが挙げられる。
甘味剤の好適な例としては、 サッカリンナトリ ウム、 グリチルリチン 酸二カリ ウム、 アスパルテーム、 ステビアなどが挙げられる。
前記医薬組成物の剤形としては、 例えば錠剤、 カプセル剤 （ソフ ト力 プセル、 マイクロカプセルを含む） 、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などの経口剤 ； および注射剤 （例、 皮下注射剤、 静脈内注射剤、 筋肉内注射剤、 腹腔内注射剤など） 、 外用剤 （例、 経鼻投与製剤、 経皮 製剤、 軟膏剤など） 、 坐剤 （例、 直腸坐剤、 膣坐剤など） 、 ペレッ ト、 点滴剤、 徐放性製剤 (例、 ί余放性マイクロカプセルなど） 等の非経口剤 が挙げられ、 これらはそれぞれ経口的あるいは非経口的に安全に投与で さる。
医薬組成物は、 製剤技術分野において慣用の方法、 例えば日本薬局方 に記載の方法等により製造することができる。 以下に、 製剤の具体的な 製造法について詳述する。 医薬組成物中の本発明のスクリ一二ング方法 - により得られる化合物の含量は、 剤形、 該化合物の投与量などにより異 なるが、 例えば約 0 . 1ないし 1 0 0重量％である。
例えば、 経口剤は、 有効成分に、 賦形剤 （例、 乳糖、 白糖、 デンプン、 D—マンニトールなど） 、 崩壌剤 （例、 カルボキシメチルセルロース力 ルシゥムなど） 、 結合剤 (例、 α化デンプン、 アラビアゴム、 カルボキ シメチノレセノレロース、 ヒ ドロキシプロ ピノレセノレロース、 ポリ ビニノレピロ リ ドンなど） または滑沢剤 （例、 タルク、 ステアリン酸マグネシウム、 ポリエチレンダリコール 6 0 0 0など) などを添加して圧縮成形し、 次 いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性を目的として、 コーティング基剤を用いて自体公知の方法でコーティングすることによ り製造される。 ，
該コーティング基剤としては、 例えば糖衣基剤、 水溶性フィルムコー ティング基剤、 腸溶性フィルムコーティ ング基剤、 徐放性フィルムコー ティング基剤などが挙げられる。 .
糖衣基剤としては、 白糖が用いられ、 さらに、 タルク、 沈降炭酸カル シゥム、 ゼラチン、 アラビアゴム、 プルラン、 カルナバロウなどから選 ばれる 1種または 2種以上を併用してもよい。
水溶性フィルムコーティ ング基剤としては、 例えばヒ ドロキシプロピ ノレセノレロース、 ヒ ドロキシプロ ピノレメチノレセノレロース、 ヒ ドロキシェチ ノレセノレロース、 メチノレヒ ドロキシェチノレセノレロースなどのセノレロース系 高分子 ； ポリ ビュルァセタールジェチルァミノァセテ一ト、 ァミノアル キルメタァク リ レートコポリマー E 〔オイ ドラギッ ト E (商品名） 、 口 ームフアルマ社〕 、 ポリ ビニルピロリ ドンなどの合成高分子 ； プルラン などの多糖類などが挙げられる。
腸溶性フイルムコーティング基剤と しては、 例えばヒ ドロキシプ口ピ ノレメチノレセノレロース フタ レート、 ヒ ドロキシプロピノレメチノレセノレロー - ス アセテー トサクシネー ト、 カノレボキシメチノレエチノレセルロース、 酢 酸フタノレ酸セルロースなどのセノレロース系高分子 ； メタアタリノレ酸コポ リマー L 〔オイ ドラギッ ト L (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 メタァ ク リル酸コポリマー L D 〔オイ ドラギッ ト L _ 3 0 D 5 5 (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 メタアタ リル酸コポリマー s 〔オイ ドラギッ ト S
(商品名） 、 ロームフアルマ社〕 などのアク リル酸系高分子 ； セラック などの天然物などが挙げられる。
徐放性フィルムコーティング基剤と しては、 例えばェチルセルロース などのセルロース系高分子 ； ァミノアルキルメタアタ リ レートコポリマ — R S 〔オイ ドラギッ ト R S (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 、 アタ リ ル酸ェチル · メタアタ リル酸メチル共重合体懸濁液 〔オイ ドラギッ ト N E (商品名） 、 ロームフアルマ社〕 などのアク リル酸系高分子などが挙 げられる。
上記したコーティング基剤は、 その 2種以上を適宜の割合で混合して 用いてもよい。 また、 コーティングの際に、 例えば酸化チタン、 三二酸 化鉄等のよ うな遮光剤を用いてもよい。
注射剤は、 有効成分を分散剤 （例、 ポリ ソルベート 8 0、 ポリオキシ エチレン硬化ヒマシ油 6 0など、 ポリエチレングリ コール、 カルボキシ メチルセルロース、 アルギン酸ナトリ ウムなど） 、 保存剤 （例、 メチル パラベン、 プロピノレノヽ。ラベン、 ペンジノレアノレコ一ノレ、 ク ロ ロブタノ一ノレ、 フエノールなど） 、 等張化 （例、 塩化ナトリ ウム、 グリセリン、 D— マンニ トール、 D—ソルビ トール、 プドウ糖など） などと共に水性溶剤
(例、 蒸留水、 生理的食塩水、 リンゲル液等） あるいは油性溶剤 （例、 オリープ油、 ゴマ油、 綿実油、 トウモロコシ油などの植物油、 プロピレ ングリ コール等） などに溶解、 懸濁あるいは乳化することにより製造さ れる。 この際、 所望により溶解補助剤 （例、 サリチル酸ナトリ ウム、 酢 酸ナトリ ウム等） 、 安定剤 （例、 ヒ ト血清アルブミ ン等） 、 無痛化剤 （ 例、 ベンジルアルコール等） 等の添加物を用いてもよい。 注射液は、 通 常、 適当なアンプルに充填される。 ' このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 （例えば、 ヒ ト、 マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 プタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) に対して経口的にま たは非経口的に投与することができる。
該予防 ·治療剤の投与量は、 対象疾患、 重篤度、 投与対象、 投与ルー トなどにより異なるが、 例えば、 粥状動脈硬化症に罹患している成人患 者 （体重 6 O k g ) においては、 有効成分である醒 P- 9発現誘導抑制物質 の量として、 一日あたり約 0 . 1〜約 1 0 0 m g、 好ましくは約 1 . 0〜 約 5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜約 2 0 m gであり、 この量を 1 回または数回に分けて投与することができる。
本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I U P A C — I U B. Commi ss ion on Biochemical Nomenc lature による B各号 あるいは当該分野における慣用略号に基づく ものであり、 その例を下記 する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しな ければ L体を示すものとする。
D N A ： デォキシリ； ^核酸
c D N A ：相捕的デォキシリボ核酸 A ： アデニン
' T ： チミン
G ： グァニン
C ： シトシン
R N A ： リボ核酸
mR N A ： メッセンジャーリボ核酸 d A T P ： デォキシアデノシン三リ ン酸 d T T P ： デォキシチミジン三リ ン酸 d G T P ： デォキシグアノシン三リ ン酸 d C T P ： デォキシシチジン三リ ン酸
AT P ： アデノシン三リン酸
E D T A ： エチレンジァミン四酢酸
S D S ： ドデシル硫酸ナトリ ウム
G 1 y ： グリシン
A 1 a ： ァラニン
V a 1 ： ノ リン
L e u ： ロイシン
I 1 e ： イソロイシン
S e r ： セリン
T h r ： スレオニン
C y s ： システィン
Me t ： メチォニン
G 1 u ： グルタミン酸
A s p ： ァスパラギン酸
L y s ： リ ジン
A r g ： アルギニン H i s ： ヒスチジン
P h e ： フエニノレアラニン
T y r ： チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ： プロリ ン
A s n ： ァスパラギン
G 1 n ： グノレタミ ン
p G 1 ： ピログルタミン酸
S e c ： セレノ シスアイン (selenocysteine)
本願明細 の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号 1〕
クラミジァ · ニューモニエ KKpn-l株由来の chsp60をコードする DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号 2〕
クラミジァ ' ニューモニエ KKpn- 1株由来の chsp60のァミノ酸配列を示 す。 '
〔配列番号 3〕
ヒ ト MMP- 9 (プレプロ蛋白質） をコードする DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号 4〕
ヒ ト MMP-9 (プレブ口蛋白質） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号 5〕 .
クラミジァ · ニューモニエ KKpn-l株由来 chsp60をコードする D N Aを 増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオ チドの塩基配列を示す。
〔配列番号 6〕
クラミジァ . ニューモニエ KKpn- 1株由来 chsp60をコードする DNAを 増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリ ゴヌクレオ チ の塩基配列を示す。 実施例
以下に参考例および実施例を示し、本願発明をさらに詳しく説明する。 しかし、 これらは単なる例であって、 本発明を何ら限定するものではな - レ、。
尚、 以下に記載の遺伝子操作法は、 成書 （Maniatisら、 モレキュラー • クローユング、 Cold Spring Harbor Laboratory, 1989年) に記載され ている方法もしくは試薬の添付プロ トコールに記載されている方法など に従つた'。
〔実施例 1〕
参考例 1 chsp60遺伝子のクローニング
chsP60遺伝子のクローニングは Cp感染細胞より抽出された DNAを铸型 とする PCR法により行った。
HEp- 2細胞 （約 2.5X 105 Cells/ml；入手先 大日本製薬株式会社） を接 種したプレート （25cm2 flask) を炭酸ガスインキュベーター内で 37°C、 —晚培養した後、 モノ レイヤーの上清を捨て、 Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium (IMDM) 培地 (10% FBS, 100 μ g/mL streptomycin, 50 μ g/mL gentamicin, 0. 5 g/mL cycloheximide添カ卩) に調製されたクラ ミジァ * -ュ一モ-ェ （C p ) KKpn - 1株 [Kishimoto T. and Soejima R. , Intern. Med. , 32 : 934 - 937 (1993)] 菌液を接種し、 HEp- 2に感染させ ることで Cpを培養した。 72時間培養後、 セルスクレーパーで感染細胞を 回収し、 PBSで 2回洗浄後、 TE緩衝液 4mlに再懸濁し、 - 80°Cで凍結融解を 3 回繰り返すことで細胞を破砕した後にこれをフエノール処理とエタノー ル沈殿して得られた核酸画分を PCR用の铸型とした。 Cp AR - 39株由来の chsp60 (GroE 遺伝子の塩 配列 (GenBank Accession NO. M69217) を 参考に作製したフフィマー [5' -ggaaggcatatggcagcgaaaaatattaaata-3' (酉 S歹幡号： 5 ) およぴ 5' - ggaaggcatatgctagtagtccattcctgcgctt- 3， ( 酉 S列番号： 6 ) ] を各 50pmolずつ PCR反応 ί夜に添力 [1し、 KOD DNA Polymerase (東洋紡） を使用して、 Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems ) を用いて PCRを行った （反応条件： 95°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72 C で 1分間を 25サイクル） 。
上記で増幅された丽 A断片を制限酵素 Ndel (宝酒造） で消化した後、 ァ ガロースゲル電気泳動して断片を回収した。 その DNA断片とあらかじめ Ndelで切断された大腸菌発現プラスミ ド pET21a (入手先： N0VAGEN.) とを 混合し、 DNA Ligation Kit Ver.2 (宝酒造） で連結して chsP60発現用プ ラスミ ド pHSP21_lを得た。 このプラスミ ドで大腸菌 BL21(DE3)のコンビテ ントセル （東洋紡） を形質転換し、 形質転換体 Escherichia coli
BL21(DE3)/pHSP21- 1株を得た。 この大腸菌株は、 FERM BP- 8430の受託番 号を付され、 平成 1 5 ( 2 0 0 3 ) 年 7月 1 6 日付で独立行政法人 産 業技術総合研究所 特許生物寄託センター （T 305- 856'6 茨城県つくば 巿東 1 — 1 — 1 中央第 6 ) に寄託されている。
〔実施例 2〕
参考例 2 組換え chsp60の調製
参考例 1で得られた Escherichia coli BL21 (DE3) /pHSP21- 1株 1白菌耳 を種培養用培地.（1% Tryptone、 0.5% Yeast Extract, 0.5% NaClおよび 50mg/Lアンピシリン） 1Lに接種し、 30°Cでー晚培養することで種培養を 行った。 これを全量主培養培地 (1.2% Tryptone, 2.4% Yeast Extract, 0, 2% Bactopeptone, 0.05% NaCl、 1.5% Glucose, 50mg/L アンピシリ ン および 50mg/L Vitamin- Bl) 18.5Lに移植し、 経時的にクレッ トユニッ ト 値を測定しながら 37°C、 撹拌 150rpm、 通気量 20NL/tnin、 溶存酸素濃度 2. 0ppm、 pHコントロール 6. 8の条件下で主培養を開始した。 クレツ トュニ ッ'卜値 X) 80(Hこ達した日寺^;で I sopropyl β -D (-) -Thi oga lactopyranos i de (IPTG)を終濃度 ImMとなるように添加し、 さらに 4時間培養を行うことで chsp60の発現を誘導し、 6000rpm、 20min遠心して発現菌体を回収した。 得られた菌体 350gに 5mMエチレンジァミン四酢酸ニナトリ ゥム及ぴ ImM (p-ァミジノフエニル）メタンスルホニルフルオリ ドを含む 50mM トリス - /HCl (pH8. 0) 2. 7Lを加えて菌体を懸濁した後、 十分に氷冷しながら高圧 破碎機 （PANDA、 NIRO S0AVI社） を用いて 1 , 000〜 1， lOObarで菌体を破碎 した。 この菌体破砕液を遠心分離 （17，700xG、 120分間、 ベックマン社）' し、 遠心上清 3. 15Lを得た。 得られた遠心上清に 25 (w/v) °/。 ス トレプトマ イシン溶液を 300m L加えてよく攪拌し、 4°C下に 3日間静置した後、 遠心 分離 （12，227xG、 60分間、 ベックマン社） を行い、 遠心上清 3. 6Lを得た。 次いで、 この遠心上清に硫酸アンモニゥム l，062gを加えて十分に溶解し た後、 4°C下にー晚静置してから遠心分離 （12, 227xG、 60分間、 ベックマ ン社） し、 得られた沈殿物に 20mM トリ ス/ HCl (pH8. 0) 1. 5Lを加えて溶解 した。 この溶解液を 10mM トリ ス/ HC1 (PH8. 0) 10Lに対して透析後、 透析 内液を限外ろ過 （PSU、 10k、 ザルトリ ウス社） を用いて更に脱塩し、 脱 塩液 3Lを得た。 得られた脱塩液を 50mM トリ ス/ HC1 (PH8. 0)で平衡化した トヨパール DEAE-650Mカラム （ 1 1. 3cm <|) x23cm、 東ソ一社） に通液、 吸着 させた後、 50raM トリス/ HCl (pH8. 0)、 次いで 50mM塩化ナトリ ウムを含む 50mM トリス/ HCl (pH8. 0)を通液して十分にカラムを洗浄した。 洗浄後、 150mM 塩化ナトリ ウムを含む 50mM トリス/ HC1 (pH8. 0)を通液し、 chsp60 を含む溶出液 5Lを得た。 この溶出液を限外ろ過 （PSU、 10k、 ザルトリ ウ ス社） を用いて 2M尿素を含む 50mM トリス/ HC1 (pH8. 0)に置換すると共に 濃縮し、 濃縮液 2Lを得た。 次いで、 この濃縮液を 2M 尿素を含む 50mM ト リス/ HCl (pH8. 0)で平衡化した DEAE - 5PWカラム （ 10. 5cm φ x20cra、 東ソー 社） に吸着させ、 十分に洗浄した後、 10〜50% B (B=50mM トリス/ HC1、 2Μ ·尿素、 500mM塩化ナトリ ウム、 pH8. 0) の濃度勾配で 80分間、 50mL/min の流速で通液し、 chsp60溶出液 2Lを得た。 この溶出液を限外ろ過 （PSU、 10k、 ザルトリウス社） を用いて脱塩後、 脱塩液を再度 2M尿素を含む 50mM トリス/ HCl (pH8. 0)で平衡化した DEAE- 5PWカラム （ 10. 5cm φ x20cm、 東ソ 一社） に吸着させ、 十分に洗浄した後、 0〜40°/。 B (B=50mM トリス/ HC1、 2M尿素、 500mM塩化ナトリ ウム、 pH8. 0) の濃度勾配で 80分間、 50mL/min の流速で通液し、 chsp60溶出液 555mLを得た。 この溶出液をダルベッコの リン酸緩衝生理食塩水溶液で平衡化したセフアデックス G- 25カラム （5cm' φ x50cm、 アマシャムバイオサイエンス社） に通液し、 得られた ch.sp60画 分 650mLを更にダルべッコのリン酸緩衝生理食塩水溶液で平衡化したァ クチクリーンィートツタスカラム ( 5cm x20cm, Sterogene社) 【こ通液し てェンドトキシンを除去した。 最後にェンドトキシンを除去した通過液 760raLを除菌ろ過 (ステリべタスフィルター、日本ミ リポア社)して chsp60 溶液 760mLを得た。
〔実施例 3〕
参考例 3 組換え chsp60の特性解析
( a ) S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を用いた分析
参考例 2で得られた精製 chsp60に lOOmM DTTを含むサンプルバッファ [ Laeraml i , Nature, 227卷， 680頁 （1979年） ] を等量加えてよく攪拌し、 95°Cで 3分間加熱後、 パーフエク ト NTゲル 10-20% (DRC社） で電気泳動を 行った。 泳動後のゲルをクマシ一， ブリ リアント ' ブルーで染色した結 果、 約 60kDaに単一バンドが認められたことから、 精製 chsp60はほぼ単一 であることが確認された。
( b ) N末端アミノ酸配列分析
参考例 2で得られた精製 chsp60の N末端ァミノ酸配列を気相プロティ ンシーケンサー (アプライ ドバイォシステムズ社、 モデル 492型） を用い て決定した。 その結果、 得られた chsp60の N末端アミノ酸である Metが欠 失していることを除いて、 cDNAの塩基配列 （配列番号： 1 ) から推定さ れたクラミジァ ·ニューモェェ KKpn - 1株由来 HSP60の N末端ァミノ酸配列 と一致した。
〔実施例 4〕
- 試験例 1 chsp60刺激による単球系株化細胞における TNFaおよび ΜΜΡ-9 産生誘導の経日変化
単球系株化細胞の THP-1細胞は American Type Culture Collection ' (ATCC)から購入した。 1% ゥシ胎児血清添加 RPMI 1640培地 （100/i g/mL streptomycin^ 100umts/mL penicillinおよび 50 g/mL gentamicin含有 ) で調製した IX 106 cells/mLの THP_1細胞懸濁液に参考例 2で作製した chsp60を 20μ g/mL添加し、 5% C02、 37°Cの環境下で培養した。 培養 1日、 2日および 3日後にそれぞれ培養上清を吸引し、 上清中の MMP- 9量を
Amersham社製の ELISA kitおよび TNF ct量を Genzyme社製の ELISA kitで測 定した。 chsp60を添加せずに同様に培養した THP- 1細胞の培養上清を対照 として用いた。なお、これらの実験は 96 - well plateを用いて、 200μ L/well の液量で実施した。 結果を図 1に示す。 TNFaの産生誘導は培養 1日後に 最大でその後減少したのに対し、 MMP- 9の産生誘導は培養期間の経過と共 に増大した。
〔実施例 5〕
試験例 2 単球系株化細胞における MMP- 9産生誘導の chsp60濃度依存性 実施例 1 と同様に調製した IX 106 cells/mLの THP- 1細胞懸濁液に参考 例 2で作製した chsp60を 5、 10または 20μ g/mL添加し、 5% C02、 37°Cの環 境下で培養した。 培養 2 日後に培養上清を吸引し、 上清中の匿 P- 9量を Amersham社製の ELISA kitで測定した。 chsp60を添加せずに同様に培養し た THP-1細胞の培養上清を対照として用いた。 結果を図 2に示す。 MMP - 9 の'産生誘導は chsp60の濃度依存的に増大した。
産業上の利用可能性
本発明のスク リーニング方法は、 単球系株化細胞を使用することによ り、血液から単離した単球や初代マク口ファージに比べて高い MMP- 9発現
- が誘導されるという有利な効果を奏する。
本発明のスクリ一二ング方法は、 単球系株化細胞を使用することによ り、血液から単離した単球や初代マク口ファージに比べて高い MMP - 9発現 が誘導されるので、 クラミジァ ' ニューモニエ感染による動脈硬化症の 進展を抑制し得る新規動脈硬化症治療薬の高感度なスクリ一二ング系と して有効である。
配列表フリーテキス ト
配列番号： 5
クラミジァ · ニューモニエ KKpn-l株由来 chsp60をコードする DNAを 増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオ チド。
配列番号： 6
クラミジァ ' ニューモニエ KKpn - 1株由来 chsp60をコードする DNAを 増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌク レオ チド。 本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 3 - 3 1 6 5 7 2 (出願日 ： 平成 1 5年 9月 9 日） を基礎としており、 その内容は全て本明細書に包 含されるものとする。

Claims

請求の範囲
1： 単球系株化細胞と、 クラミジァ 'ェユーモニエ由来 6 0 k D a熱シ ョ ック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産 生し得る細胞 （該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なっても よい） とを用いることを特徴とする、 動脈硬化症の治療および/または その合併症の予防 ·治療物質のスクリーニング方法。
-.
2 . 試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をクラミジ ァ . ニューモニエ由来 6 0 k D a熱ショック蛋白質もしくはその部分ぺ プチドまたはその塩で刺激し、 両条件下におけるマトリックスメ タロブ' 口ティナーゼ一 9遺伝子の発現を比較することを特徴とする、 請求の範 囲 1記載のスクリ一ユング方法。
3 . 試験化合物の存在下および非存在下に単球系株化細胞をクラミジ ァ · ニューモニエに感染させ、 両条件下におけるマトリ ックスメタロプ 口ティナーゼー 9遺伝子の発現を比較することを特徴とする、 請求の範 囲 1記載のスクリーニング方法。
4 . クラミジァ ·ニューモェェ由来 6 0 k D a熱ショ ック蛋白質もしく はその部分ぺプチドまたはその塩を産生し得る単球系株化細胞における マトリ ックスメタ口プロテイ^ "一ゼー 9遺伝子の発現を、 試験化合物の 存在下および非存在下で比較することを特徴とする、 請求の範囲 1記載 のスクリーェング方法。
5 . 1 O O n Mのクラミジァ 'ニューモニエ由来 6 0 k D a熱ショ ック 蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩で 4 8時間刺激したとき のマトリ ックスメタロプロティナーゼー 9遺伝子の発現が、 非刺激時の 5倍以上である単球系株化細胞を用いることを特徴とする、 請求の範囲 1記載のスクリーニング方法。
6 . 単球系株化細胞が、非刺激時にマトリ ックスメタ口プロティナーゼ 一 9遺伝子を実質的に発現しないことを特徴とする、 請求の範囲 1記載 のスク リ一二ング方法。
7. 単球系株化細胞が、 THP— 1、 U— 9 3 7、 P 3 1 / FU J、 R AW2 6 4. 7および J 7 7 4A. 1からなる群より選択される株化細 胞である、 請求の範囲 1記載のスクリーエング方法。
8. 単球系株化細胞が THP— 1株化細胞である、請求の範囲 Γ記載の - スタ リ一二ング方法。
9. 単球系株化細胞と、 クラミジァ ·ニューモニエ由来 6 0 k D a熱シ ョ ック蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩あるいはそれを産' 生し得る細胞 （該細胞は該単球系株化細胞と同一であっても異なっても よい） とを含んでなる、 動脈硬化症の治療および/またはその合併症の 予防 ·治療物質のスクリ一ユング用キッ ト。
1 0. クラミジァ 'ニューモニエ由来 6 0 k D a熱ショ ック蛋白質もし くはその部分ぺプチドまたはその塩を産生し得る細胞がクラミジァ ' 二 ユーモニエまたは単球系株化細胞である、 請求の範囲 9記載のスク リー ユング用キッ ト。
1 1. 単球系株化細胞が、 THP— 1、 U— 9 3 7、 P 3 1 /FU J、 RAW 2 6 4. 7および J 7 74 A. 1からなる群より選択される株化 細胞である、 請求の範囲 9記載のスクリ一二ング用キッ ト。
1 2. 単球系株化細胞が THP— 1株化細胞である、請求の範囲 9記載 のスク リ一二ング用キッ ト。
1 3. クラミジァ 'ニューモニエ由来 6 O k D a熱ショック蛋白質によ る哺乳動物細胞におけるマトリ ックスメタ口プロティナーゼ一 9遺伝子 の発現誘導を抑制し得る物質を含有してなる、 動脈硬化症の治療および Zまたはその合併症の予防 ·治療剤。
1 4. クラミジァ 'ニューモニエ由来 6 O k D a熱ショック蛋白質によ る哺乳動物細胞におけるマトリ ックスメタ口プロティナーゼー 9遺伝子 の発現誘導を抑制し得る物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、 該哺乳動物における動脈硬化症の治療および/またはその合併症の予防 または治療方法。
1 5 . 動脈硬化症の治療および/またはその合併症の予防または治療 剤の製造のための、 クラミジァ · ニューモニエ由来 6 0 k D a熱ショ ッ ク蛋白質による哺乳動物細胞におけるマトリ ックスメタ口プロティナ一 ゼ一 9遺伝子の発現誘導を抑制し得る物質の使用。
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