WO2005010031A1

WO2005010031A1 - チタン、銀、シリコンに結合能を有するペプチド

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Publication number: WO2005010031A1
Application number: PCT/JP2004/011319
Authority: WO
Inventors: Kiyotaka Shiba; Kenichi Sano
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2003-07-30
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2005-02-03
Also published as: JP4885542B2; US7498403B2; JPWO2005010031A1; EP1661910A4; CN100586959C; CN1829734A; EP1661910A1; ES2438190T3; US20070112174A1; DK1661910T3; EP1661910B1

Abstract

　ソフトマターによるチタン、銀、シリコン材料の高機能化を行うために必要なチタン、銀、シリコンへの結合能を持つペプチド配列、ファージ、人工タンパク質やキメラ分子、または前記ペプチド配列と機能性ペプチド配列を持つ、ペプチド、ファージ、人工タンパク質又はキメラ分子とチタンの複合体を提供するものである。チタン粒子等に、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子が結合したチタン粒子を遠心操作により回収し、得られたファージ粒子を菌体中で増殖させ、次いで、パニング操作を繰り返すことにより、チタンに結合するファージクローンを濃縮する。このファージクローンから、チタンに結合能を持つペプチドＲＫＬＰＤＡＰＧＭＨＴＷ等を同定する。チタン、銀、シリコンへの結合能を持つペプチドとして、ＲＫＬＰＤＡやＲＡＬＰＤＡを挙げることができる。

Description

チタン、銀、シリコンに結合能を有するペプチド技術分野

本発明は、チタンに結合能を有するぺプチドのスクリ一二ング方法や、チタン、銀及び/又はシリコンに結合能を有するペプチドや、チタン、銀及びノ又はシリコンに結合能明を有するぺプチドがチタン、銀又はシリコンと結合したチタン、銀又はシリコンとペプチドとの複合体や、チタ田

ン、銀及び/又はシリコンに結合能を有するペプチドと機能性ペプチド又は機能性タンパク質とが結合した人工タンパク質や、かかる人工タンパク質がチタン、銀又はシリコンと結合したチタン、 _艮又はシリコンと人工タンパク質との複合体や、チタン、銀及びノ又はシリコンに結合能を有するぺプチドと標識化物質若しくはべプチドタグとの結合体又は非プチド系化合物とが結合したキメラタンパク質や、かかるキメラタンパク質がチタン、銀又はシリコンと結合したチタン、銀又はシリコンとキメラタンパク質との複合体や、チタン、銀及び/又はシリコンに結合能を有するぺプチドをその粒子表面上に提示したファージゃ、かかるファージがチタン、銀又はシリコンと結合したチタン、銀又はシリコンとファージとの複合体や、チタン、銀及び又はシリコンに結合能を有するペプチド，チタン、銀及び/又はシリコンに結合能を有する人工タンパク質，チタン、銀及び Z又はシリコンに結合能を有するキメラタンパク質，チタン、銀及び Z又はシリコンに結合能を有するファージを用いるチタン、.銀又はシリコン表面の改質又はチタンの整列化方法や、銀又はシリコン粒子の形成方法や、チタン一人工タンパク質複合体を有効成分とするインプラント材料に関する。背景技術

1 9 5 2年のブローネマルクによるチタンと骨が結合組織を介することなく結合するォッセォインテグレーション現象の発見を契機に、 1 9 6 5年に初めて純チタン製のインプラン卜が臨床応用された。現在に至るまで、ォッ,セオインテグレーション現象を利用した、インプラント治療は盛んに行われているが、チタンと骨が結合するまでに要する期間は、 3〜 6ヶ月と非常に長い時間が必要になっており、その間これまでにも、この期間を短縮す.るために骨親和性を高める目的で、表面仕上げに工夫をしたり、カルシウムやハイドロキシアパタイトのチタン表面への蒸着や、材料にチタン合金を検討するなど、主に機械的な材料改変である Λ 一ドマターの再設計からのアプローチは盛んに行われているが、これまでのところ顕著な効果は得られていない。例えば、ハイド faキシァパタイトのようなセラミックの場合、被膜の減少や物理的性質上、負荷に弱い _ことが問題となる。また、合金の場合これまで多数検討されてきたが、多くの場合、有害な組織反応を引き起こしており、現在では、純チタンとその合金である、 T i ₆A 1 ₄Vが使われているに留まる。

また、インプラントと周囲粘膜の関係は、歯と歯肉の関係と異なり感染に対する抵抗力が小さい瘢痕組織であると考えられている。そのため、この問題を解決するために、チタン表面に抗菌剤をコートするなど、先述したハードマタ一の検討がなされているが、このようなハードマターからのアプローチでは、インプラントと周囲粘膜との解剖学的 ·組織学的な関係の改善は考慮されていない。

チタンは、非常に酸化されやすく、大気中 ·水中で直ちに二酸化物を形成する。二酸化チタン結晶のひとつである、アナターゼ形結晶が持つ光触媒活性を利用して、ほぼすベての有害化学物質を分解 ·無害化することができるため、シックハウスガスゃァセトアルデヒドなどの悪臭の分解、防カビ剤の様々な用途に用いられている。しかし、アナターゼ形結晶が利用できる波長は紫外域に限られているため、可視光域で利用できる光触媒の開発が望まれている。

その他、被験体に生体内利用するのに適した材料を、放出可能な形の形成した状態で含む、ォッセオインテグレーションの速度及び骨接着のパーセンテージを増加させる新規なォステオボンチン含有インプラン卜 (特表 2 0 0 2— 5 0 0 8 9 8号公報） .や、金属化合物を結合し、分子レベルでその配向や配列の制御を可能にした新規な蛋白質、蛋白質断片、ペプチドまたはこれらの変異体の誘導体を提供するため、蛋白質、蛋白質断片、ペプチド、またはこれらの変異体の有する特徴的な立体構造上に、二トリ口三酢酸構造などを有する官能基を導入することにより、結合する金属化合物の構造を分子レベルで制御する技術（特開平 1 0— 3 3. 8 7 0 0号公報）や、半導体物質に特異的に結合することができるァミノ酸オリゴマ一を有するように修飾された自己組織化生物分子を用いることにより、相や配置などの特異的な結晶的特性を有する半導体物質のナノ結晶を作製する方法（米国特許出願公開第 2 0 0 3 / 0 0 7 3 1 0 4号明細書）が提案されている。

上記のように、インプラントの分野におけるチタン材料の高機能化を、ハードマ夕一による材料改変ではなく、チタン表面に柔軟に結合することのできるソフトマターであるタンパク質などの高分子ポリマ一により行おうと考えたとき、チタン表面を特異的に認識 ·結合するようなアミノ酸モチーフは天然には存在しないという問題がある。本発明の課題は、ソフトマターによるチタン材料の高機能化を行うために必要なチタンへの結合能を持つぺプチド配列、ファージ、人工夕ンパク質やキメラ分子、または前記ペプチド配列と機能性ペプチド配列を持つ、ペプチド、ファージ、人工タンパク質又はキメラ分子とチタンの複合体を提供することにある。具体的には、前記ペプチドと石灰化促進または骨増殖 ·分化べプチドもしくは人工タンパク質 · キメラタンパク質を表面に結合した機能性チタンインプラント材料で、ォッセォインテグレーションが短期間で終了するもの、あるいは、前記ペプチドと歯肉に高い親和性を持つぺプチドもしくは人工タンパク質 · キメラタンパク質を表面に結合した機能性チタンィンプラント材料で、細菌感染等に抵抗性の高いものを提供する。または、可視光領域でも光触媒能を持つような、前記ペプチドもしくは人工タンパク質 · キメラタンパク質と二酸化チタン複合体、もしくは前記複合体とクロモフォアのような低分子化合物との複合体を提供することや、前記のペプチドと、肌にやさしいコラーゲン等とのキメラタンパク質 ·人工タンパク質を表面に結合した二酸化チタシ顔料を提供することにある。

_本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、金属チタンに水溶液中で、多様なぺプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がぺプチド配列を介して結合したチタンを遠心操作により回収し、得られたチタンに結合したファージ粒子を大腸菌中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団をチタンに再度接触させるバニング操作を繰り返すことによりチタンに結合するファージクロ一ンを濃縮し、チタンを特異的に認識する、チタンに結合能を有するぺプチドを提示すると考えられるファージライブラリーを得た。

得られたファージライブラリーをクローン化し、提示しているアミノ酸配列を調べた。前記のバニング操作を繰り返すことで、特にチタンに強く結合できる配列を提示するクローンがファージライブラリ一中に、多数を占めることが予想されるが、 R K L P D A P G M H T W (配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド）を提示するファージクローンが 4 3クローン中 3 3クローンあり、配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示するファ一ジクローンのチタンへの結合能は、配列番号 1 6〜 3 8で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを提示するファ一ジクローンの結合能を大きく上回るものであることを見い出した。

チタンに対して、得られた配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを提示するクローンが、果たして提示している配列を介して結合しているかどうかを検討する必要がある。水晶振動子形相互作用定量装置で消散を同時に測定できる Q C M— D 3 0 0 ( q_s ens e AB社ィェテポリ）を用いることで、配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるべプチドを提示するファージクローンのチタンへの結合が、提示する配列を介して特異的に結合しているかどうかを確認することができる。スァ一ジのように非常に長く伸びた分子が、水晶振動子センサーに対して垂直方向に結合したとき、結合量を表す周波数の減少に対して、消散により測定される粘弾性が極端に上昇する。また、逆に非常に長く伸びた分子であっても、水晶振動子センサ一面に水平に方向に結合したとき、周波数の減少に対して粘弹性の極端な上昇は見られない。実際に、配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示するファ一ジクローンは、チタン表面に対して、垂直方向に結合していることを示す結果を得た。水晶振動子形相互作用解析装置によるファージの結合様式を調べた例は、おそらく世界で初めてであり、この方法が固体表面に結合するファージの解析に非常に有用であることを同時に示した。

チタンは、水中でその表面は直ちに酸化され、水酸基がチタン原子に結合する。結合した水酸基は、二つのチタン原子間をブリッジする水酸基と、ひとつのチタン原子と結合したターミナルの水酸基に別れると考えられる。ブリツジの水酸基とターミナルの水酸基ではそれぞれ極性が異なるため、異なる p Kを持つ。ブリッジの水酸基は酸として、ターミナルの水酸基は塩基として作用していると考えられている。このチタン表面に配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドがどのような特異性で結合しているのかを調べることで、チタンとぺプチドの結合を制御することが可能になる。 .

一般にべプチドモチーフの特異性についての検討は、点変異の導入による機能に重要な役割を果たす残基の同定、欠失変異体の解析による機能領域の絞り込みが行われる。前者においては、ァラニンスキャニングと呼ばれる一連のァラニン置換点変異体の機能解析がしばしば行われる。電荷を持たず、メチル基がひとつだけの小さな側鎖を持つァラニンへの置換は、そのアミノ酸残基の側鎖の機能を損なうと考えられている。配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示するファージ久ローンについてァラニンスキャニングを行った。配列番号 4〜 1 4で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示する一連の点変異ファージクローンを作製し、それぞれのクローンのチタンへの結合能を調べた結果、 4番目のプロリンへの点変異体の結合能は、今回調べた中で最も大きく失われた。プロリンは、グリシンと同じくペプチドやタンパク質の主鎖が大きく折れ曲がる役割をしている。このことから、配列番号 3 で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドがチタンに結合するのに、 4 番目のプロリンに於ける主鎖の折れ曲がりが重要な役割を果たしていることが強く示唆された。また、側鎖に電荷を持つアミノ酸のうち 1番目のアルギ：！ンと 5番目のァスパラギン酸への点変異体の結合能が著しく損なわれたことから、これらの残基が前記したチタン表面の正負の電荷と相互作用していることが示唆された。 1319

ァラニンスキャニングの結果、配列番号 2の前半部、配列番号 1の領域が、チタンへの結合に重要な役割を果たしていることを支持する結果が得られたので、配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドの 7〜1 2番目を欠失した欠失変異体、すなわち配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示するファ一ジクローンを作製し、チタンへの結合能を調べた。チタンへの結合能は、欠失により影響を受けなかったことから、配列番号 1で表されるアミノ酸配列部分だけで十分にチタン結合能を有することが明らかになった。

配列番号 3のペプチド配列が、チタンに結合する際、一番目のアルギニンの側鎖の正電荷の重要性は前記の通りであるが、同時に主鎖のアミノ末端のァミノ基と協調的に働いてチタンに結合している可能性が残る。そこで、配列番号 3で表されるアミノ酸配列についてァミノ末端にァラニンを挿入した挿入変異体（配列番号 1 5 ) を作製し、チ'タンへの結合能を調べた。その結果チタンへの結合能の上昇が見られた。結合能の上昇の理由としては、配列番号 3の 2番目のリジンの側鎖の正電荷と主鎖のァミノ末端のァミノ基の正電荷間の反発が、一残基のアミノ酸の挿入により減少し、配列番号 1 5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの構造がより安定化したことによるものであると考えることができる。また、この結果は、配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドがチタンに結合するのに、必ずしもアルギニンが先頭（ァミノ末端）にある必要がないということを意味する。このことは、チタンに結合するキメラタンパク質、人エタンパク質や合成べプチドなどを作製する際、配列番号 1または 3の配置に一次構造上の制約を全く受けないことを意味する重要な知見である。

過酸化水素処理により、チタン表面により多くの水酸基が結合することは知られている。また、前記の通り配列番号 1， 3で表されるァミノ酸配列からなるぺプチドとチタン表面の相互作用は、チタンに結合した水酸基の電荷と、配列番号 1， 3の一番目のアルギニンの側鎖と 5番目のァスパラギン酸の側鎖間の静電的相互作用によるものが支配的だと考えられる。チタンに結合する水酸基の量を調節することができれば、チタンとぺプチドの結合量を調節することができる可能性がある。実際に、過酸化水素処理したチタンへの配列番号 3を提示するファージクローンの結合能は上昇した。このことは、過酸化水素処理によるチタン表面への水酸基のさらなる付加により、配列番号 3を提示するファージクローン、配列番号 3のペプチド、およびこれを含む人工タンパク質 · キメラタンパク質の結合量を増やすことができる。また、逆にチタン表面から水酸基を除いた場合、配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示するファージクローン、配列番号 3のペプチド、およびこれを含む人工タンパク質 · キメラタンパク質の結合量を減らすことができると期待される。チタン表面から水酸基を取り除く方法としては、例えばフッ化ナトリウム処理がある。これらの方法を組み合わせることで、チタンへの配列番号 3を提示するファージクローン、配列番号 3のぺプチド、およびこれを含む人工タンパク質 · キメラタンパク質の結合量を調節することができると期待される。

また、チタン結合能を有するぺプチドの金属材料への結合の特異性を調べたところ、チタン以外にも銀、シリコンに選択的に結合し、金，白金 ·銅 ·鉄 ·錫 ·亜鉛 · クロム等には結合しないことを見い出した。この金属材料結合特異性を利用して、例えば金基盤上にチタンでパターンニングを施し、機能性化合物、例えば半導体ナノ粒子を抱合したチタン結合べプチド、およびこれを含む人工タンパク質 ' キメラタンパク質を加えることで、チタン結合ペプチドを介して機能性化合物を金基盤上にパターン化することが期待できる。本発明者らは、上記知見に基づき、本発明を完成するに至った発明の開示

すなわち本発明は、（ 1 ) チタンに、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団を接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合したチタンを遠心操作により回収し、得られたチタンに結合したファージ粒子を菌体中で増殖させ、次いで、増殖させたぺプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団をチタンに接触させるバニング操作を繰り返すことにより、 .チタンに結合するファージク口 —ンを濃縮することを特徴とするチタンに結合能を有するぺプチドのスクリーニング方法や、（ 2) 上記（ 1 ) 記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とするチタンに結合能を有するぺプチドに関する。また本発明は、（ 3) 配列番号 1に示されるアミノ酸配^からなるチタンに結合能を有するペプチドや、（4) 配列番号 1に示されるァミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するぺプチドゃ、 ( 5) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1， 4, 5番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする上記（4) 記載のチタンに結合能を有するペプチドや、（ 6) 2番目のリジンがァラニンに置換された配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（ 5 ) 記載のチタンに結合能を有するペプチドや、（ 7) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるチタンに結合能を有するペプチドや、（ 8) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するペプチドや、（ 9) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列の 1， 4， 5番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする上記（ 8) 記載のチタンに結合能を有するペプチドや、（ 1 0) 1〜 5番目及び 7〜 1 2番目のアミノ酸残基がそれぞれァラニンに置換された配列番号 4〜 1 4に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記 (8) 記載のチタンに結合能を有するペプチドや、（ 1 1 ) 配列番号 3 に示されるアミノ酸配列の N末端にァラニンが付加 ·挿入された配列番号 1 5に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（ 8 ) 又は（ 9 ) 記載のチタンに結合能を有するペプチドや、（ 1.2) 配列番号 1 6〜 24に示されるアミノ酸配列からなるチタンに結合能を有するぺプチドゃ、（ 1 3) 配列番号 1 6〜 24に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するペプチドや、（ 1 4) 配列番号 2 5〜 3 8に示されるアミノ酸配列からなるチタンに結合能を有するぺプチドゃ、（ 1 5) 配列番号 2 5〜 3 8に示される'アミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するペプチドや、（ 1 6) 化学修飾されていることを特徴とする上記（2) 〜（ 1 5) のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドに関する。

さらに本発明は、（ 1 7) チタンが、金属チタン、チタン合金又は二酸化チタンであることを特徴とする上記（ 2) 〜（ 1 6) のいずれか記載のチタンに結合能を有するペプチドや、（ 1 8) 上記（ 2) 〜（ 1 6) のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドがチタンと結合したチタン一ペプチド複合体や、（ 1 9) 上記（2) 〜（ 1 6) のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドと、機能性べプチド又は機能性タンパク質との結合体であって、かつチタンに結合能を有する人工タンパク質や、（2 0) 機能性ペプチド又は機能性タンパク質が、チタンに結合能を有するぺプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるペプチド又はタンパク質であることを特徴とする上記（ 1 9) 記載の人工タンパク質や、（ 2 1 ) 機能性ペプチド又は機能性タンパク質が、細胞接着活性等の細胞認識活性をもつぺプチド配列を有するぺプチド又はタンパク質であることを特徵とする上記（ 1 9).記載の人工タンパク質や、（2 2) 上記（ 1 9) 〜（2 1 ) のいずれか記載の人工タンパク質がチタンと結合したチタン一人工タンパク質複合体や、（2 3) 上記

( 2)〜（ 1 7)のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドと、標識化物質若しくはべプチドタグとの結合体、又は非べプチド系化合物との結合体であって、かつチタンに結合能を有するキメラタンパク質や、 ( 24) 上記（ 2 3) 記載のキメラタンパク質がチタンと結合したチタン—キメラタンパク質複合体や、（ 2 5) 上記（2) 〜（ 1 7) のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドをその粒子表面上に提示し、かつチタンに結合能を有するファージゃ、（ 2 6) 上記（'2 5) 記載のファージがチタンと結合したチタン一ファージ複合体や、 ( 2 7 ) 上記 (2) 〜（ 1 7 ) のいずれか記載のチタンに結合能を有するペプチドを用いることを特徴とするチタン表面の改質又はチタン粒子の形成方法や、 (2 8) 上記（ 1 9) 〜（2 1 ) のいずれか記載のチタンに結合能を有する人エタンパク質を用いることを特徴とするチタン表面の改質、チタン粒子の形成又はチタンの整列化方法や、（2 9) 上記（2 3) 記載のチタンに結合能を有するキメラタンパク質を用いることを特徴とするチタン表面の改質又はチタン粒子の形成方法や、（ 3 0) 上記（ 2 5) 記載のチタンに結合能を有するファージを用いることを特徴とするチタンの整列化又はチタン粒子の形成方法や、（ 3 1 ) 上記（ 2 2) 記載のチタン一人工タンパク質複合体を有効成分とするインプラン卜材料に関する。

また本発明は、（ 3 2) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなる 4011319

銀に結合能を有するペプチドや、（3 3) 配列番号 1に示されるァミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ銀に結合能を有するぺプチドゃ、（ 3 4) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1 , 4, 5番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする上記（ 3 3) 記載の銀に結合能を有するペプチドや、（ 3 5) 2番目のリジンがァラニンに置換された配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（ 34) 記載の銀に結合能を有するペプチドや、（ 3 6 ) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなる銀に結合能を有するペプチドや、（3 7) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ銀に結合能を有するペプチドや、（ 3 8) 化学修飾されていることを特徴とする上記 ( 3 2) 〜（3 7 ) のいずれか記載の銀に結合能を有するプチドゃ、 ( 3 9) 上記（3 2) 〜（3 8) のいずれか記載の銀に結合能を有するプチドが銀と結合した銀一ペプチド複合体や、（4 0) 上記（ 3 2) 〜（ 3 8) のいずれか記載の銀に結合能を有するペプチドと、機能性べプチド又は機能性タンパク質との結合体であって、かつ銀に結合能を有する人工タンパク質や、（4 1 ) 上記（40) 記載の人工タンパク質が銀と結合した銀一人工タンパク質複合体や、（42) 上記（ 3 2) 〜（ 3 8 ) のいずれか記載の銀に結合能を有するペプチドと、標識化物質若しくはべプチドタグとの結合体、又は非べプチド系化合物との結合体であつて、かつ銀に結合能を有するキメラタンパク質や、（43) 上記（4 2) 記載のキメラタンパク質が銀と結合した銀一キメラタンパク質複合体や、（4.4) 上記（3 2) 〜（3 8) のいずれか記載の銀に結合能を有するペプチドをその粒子表面上に提示し、かつ銀に結合能を有するファージや、（4 5 ) 上記（44) 記載のファージが銀と結合した銀ーフ 2004/011319

ァージ複合体や、（46 ) 上記（3 2) 〜（ 3 8) のいずれか記載の銀に結合能を有するぺプチドを用いることを特徴とする銀表面の改質又は銀粒子の形成方法や、（4 7 ) 上記（40 ) 記載の銀に結合能を有する人工夕ンパク質を用いることを特徴とする銀表面の改質、銀粒子の形成又は銀の整列化方法や、（4 8) 上記（4 2) 記載の銀に結合能を有するキメラタンパク質を用いることを特徴とする銀表面の改質又は銀粒子の形成方法や、（4 9) 上記（44) 記載の銀に結合能を有するファージを用いることを特徴とする銀粒子の形成又は銀の整列化方法や、（ 5 0 ) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるシリコン,に結合能を有するペプチドや、（ 5 1 )配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシリコンに結合能を有するペプチドや、（ 5 2) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1， 4， 5番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする上記（4 9 ) 記載のシリコンに結合能を有するペプチドや、（ 5 3) 2番目のリジンがァラニンに置換された配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（ 5 0) 記載のシリコンに結合能を有するペプチドや、（ 54) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるシリコンに結合能を有するペプチドや、 ( 5 5) 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシリコンに結合能を有するペプチドや、（ 5 6) 化学修飾されていることを特徴とする上記（ 5 0 ) 〜（ 5 5) のいずれか記載のシリコンに結合能を有するペプチドや、（ 5 7) 上記（ 5 0) 〜（ 5 6) のいずれか記載のシリコンに結合能を有するペプチドがシリコンと結合したシリコン—ペプチド複合体や、（ 5 8) 上記（ 5 0) 〜（ 5 6) のいずれか記載のシリコンに結合能を有するぺプチドと、機能性べプチド又は機能

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性タンパク質との結合体であって、かつシリコンに結合能を有する人工タンパク質や、（ 5 9 ) 上記（ 5 8 ) 記載の人工タンパク質がシリコンと結合したシリコン一人工タンパク質複合体や、（6 0) 上記（ 5 0) 〜（ 5 6 ) のいずれか記載のシリコンに結合能を有するペプチドと、標識化物質若しくはペプチドタグとの結合体、又は非ペプチド系化合物との結合体であって、かつシリコンに結合能を有するキメラタンパク質や、 ( 6 1 ) 上記（ 6 0) 記載のキメラタンパク質がシリコンと結合したシリコンーキメラタンパク質複合体や、（ 6 2) 上記（ 5 0) 〜（ 5 6) のいずれか記載の.シリコンに結合能を有するぺプチドをそ粒子表面上に提示し、かつシリコンに結合能を有するファージゃ、（ 6 3)上記（ 6 2 )記載のファージがシリコンと結合したシリコン一ファージ複合体や、 (64) 上記（ 5 0) 〜（ 5 6 ) のいずれか記載のシリコンに結合能を有するぺプチドを用いることを特徴とするシリコン表面の質又はシリコン粒子の形成方法や、（ 6 5) 上記（ 5 8 ) 記載のシリコンに結合能を.有する人工夕ンパク質を用いることを特徴とするシリコン表面の改質、シリコン粒子の形成又はシリコンの整列化方法や、 ( 6 6 ) 上記（ 6 0 ) 記載のシリコンに結合能を有するキメラタンパク質を用いることを特徴とするシリコン表面の改質改質又はシリコン粒子の形成方法や、 ( 6 7 ) 上記（ 6 2) 記載のシリコンに結合能を有するファージを用いることを特徴とするシリコン粒子の形成又はシリコンの整列化方法や、（6 8) 上記（2 ) 〜（ 1 7) のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチド、上記（ 3 2) 〜（3 8) のいずれか記載の銀に結合能を有するぺプチド、又は、上記（ 5 0 ) 〜（ 5 6) のいずれか記載のシリコンに結合能を有するペプチドを原子間力顕微鏡（AFM) の探針（プローブ）として使用する方法に関する。 2004/011319

図面の簡単な説明

第 1図は D— 1 2ファージライブラリ一を用いた、チタン粒子へのパニングの結果を示す写真である。

縦軸は、溶出されてきたファ一ジのカ価を加えたファージの力価で割つた値を、対数で表したもの、横軸の数字は、バニングの回数を表す。第 2図は、 C 7 Cファージライブラリ一を用いた、チタン粒子へのパエングの結果を示す写真である。

縦軸は、溶出されてきたファ一ジのカ価を加えたファージのカ価で割つた値を、対数で表したもの、横軸の数字は、バニングの,回数を表す。第 3図は、 D _ 1 2ライブラリ一を用いて、チタン粒子に対してバニングを 3回繰り返した後に得られたクローンが提示するべプチドのアミノ酸配列を示す写真である。

一番左はクローンの名前、その横に提示配列をアミノ酸一文字表記にて示してある。

_第 4図は、 C 7 Cライブラリ一を用いて、チタン粒子に対してパニングを 3回繰り返した後に得られたクローンが提示するペプチドのアミノ酸配列を示す写真である。

一番左はクローンの名前、その横に提示配列をアミノ酸一文字表記にて示してある。なお、ここで示したアミノ酸配列には、両端に、 C 7 C ライブラリーの提示配列が環状になるために必要なチオール基を持つシスティン残基を含んでいる。

第 5図は、クローン化したファージのチ夕ンへの結合能を調べた結果を示す写真である。

縦軸は、.溶出されてきたファージのカ価を加えたファージのカ価で割つた値を、対数で表したもの、横軸は、図 3、図 4中に示す各ファージクローンを表す。第 6図は、水晶発振子形生体分子相互作用解析装置 Q C M— D 3 0 0 を用いた配列番号 3で示されるぺプチドを提示するファージクロ一ンのチタン表面への結合状態の解析結果を示す写真である。

第 7図は、チタン製水晶発振子センサー上へのファージの結合状態の模式図の写真である。

Q C M - D 3 0 0を用いたチタン表面へのファージク口一ンの結合を模式的に表した。上が、 B S Aでセンサーをブロッキングしたときの結合状態、下は、ブロッキングをしなかったときの結合状態を示している。第 8図は、実施例で用いたプライマーの塩基配列を示す^真である。この図の最初の段落の左に記されている「アルファベット一数字—ァルファベット」は、そのプライマーを使って作製した変異体の名前が書かれている。名前の由来は、 e 3 — 2 — 3の配列をアミノ酸一文字表記、そのアミノ酸残基のァミノ端からの位置を数字で表し、最後の Aは、ァラニンに置換したことを意味する。例として P 4 Aをあげると、配列番号 3の N末端から 4番目のプロリンをァラニンに置換するのに用いたプライマーのことである。

次に、 Δ 7 _ 1 2 F、 Δ 7 - 1 2 R、 K 2 A Δ 7 - 1 2 Rは、実施例 5に説明する欠失変異体作製に用いたプライマーである。それぞれ、 △ 7— 1 2 Fと Δ 7— 1 2 Rの組み合わせ、 Δ 7— 1 2 Fと Κ 2 Α Δ 7— 1 2 Rの組み合わせで P C Rに用いた。

A l a i n s e r tは、実施例 6に説明する挿入変異体作製に用いたプライマーである。

第 9図は、点変異が及ぼす配列番号 4〜 1 4で示されるぺプチドを提示するファージクローンのチタンへの結合能への影響を調べた結果を示す写真である。

縦軸は、配列番号 4〜 1 4で示されるぺプチドを提示するファージの 4 011319

チタンへの結合能を 1としたときの点変異体の結合能の値を対数で表したもの、横軸は、各点変異体を表す。

第 1 0図は、 P C R法を用いた欠失変異体作製法の模式図の写真である。 —

第 1 1図は、欠失変異と挿入変異が及ぼす配列番号 2と 1 5で示されるべプチドを提示するファージクローンのチタンへの結合能への影響を調べた結果を示す写真である。

縦軸は、配列番号 1で示されるぺプチドを提示するファージクローンのチタンへの結合.能を 1としたときの点変異体の結合能の値を表したもの、横軸は、欠失および挿入変異体を表す。

第 1 2図は、チタン粒子の過酸化水素処理によるファージ結合能への影響の結果を示す写真である。

第 1 3図は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からな ¾ペプチドを提示するファージの各種金属への結合能を調べた結果を示す写真である。

_縦軸は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを提示するファージの結合量を、提示配列を持たないファージの結合量で割つた値であり、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドによる結合の寄与を表している。銅と鉄は、どちらのファージも結合量が検出限界以下であった。

第 1 4図は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなるペプチドにおけるァラニン置換変異がチタン ·銀 · シリコンへの結合に及ぼす影響を調べた結果を示す写真である。

縦軸は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示するファージの結合量を 1として規格化した値を表す。

第 1 5図は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドのバイオミネラリゼ一ションにより生成された銀粒子の電子顕微鏡像と電子線回折パターンを示す写真である。

第 1 6図は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドのバイオミネラリゼ一シヨンにより生成されたシリカ量とペプチド濃度との関係を示す写真である。

白抜き記号と点線部のペプチド濃度条件下では、ゲル状のシリカが形成され、黒塗り記号と実線部のペプチド濃度条件下では、粒子状のシリ力が形成される。

第 1 7図は、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドのバイオミネラリゼ一ションにより生成されたシリカ粒子の透過型電子顕微鏡像と走査型電子顕微鏡像を示す写真である。

第 1 8図は、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを融合したフェリチン発現ベクター構築の模式図の写真である。

第 1 9図は、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からな 'るべプチドを融合した組換えフェリチンのチタン表面への結合結果を示す写真である。

- 発明を実施するための最良の形態

本発明のチタンに結合能を有するぺプチドのスクリーエング方法としては、チタンに、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示（ディスプレイ）したファ一ジ集団（ファージライブラリー）を接触、好ましくは水溶液中で接触させ、ファージ粒子がペプチド配列を介して結合したチタンを遠心操作により回収し、得られたチタンに結合したファージ粒子を大腸菌等の菌体中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団をチタンに接触させるパニング操作を繰り返すことにより、チタンに結合するファージクローンを濃縮するスクリーニング方法であれば特に制限されるものではなく、上記チタンとしては、粒子状、板状等の金属チタン、チタン合金、二酸化チ

8 タンなどのチタンを用いることができる。また、上記ファージライブラリ一は、化学合成したランダム D N Aをファ一ジ D N A (ファージミド ) に揷入し、宿主大腸菌に遺伝子導入することでファージウィルスを形成する分子が生合成され、ウィルス粒子の外殻タンパク質 P IIIの N末端の先にランダムペプチドが発現され、ランダム化した部分のアミノ酸残基（-Xn_, X=any amino acid) を表層に提示するファ一ジとして調製することもできるが、市販されているファ一ジライブラリ一（random 7 mer, 12 mer, cyclic 7 merなど）を用いることもできる。

本発明のチタン，銀及び/又はシリコンに結合能を有すべプチドとしては、上記本発明のチタンに結合能を有するペプチドのスクリ一ニング方法により得られるチタン、銀及び又はシリコンに結合能を有するペプチドやその変異体を挙げることができる。具体的には、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列 RKL P DAからなるチタン、銀及びシリコンに結合能を有するペプチド（Δ 7— 1.2) や、配列番号 1に示されるァミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタン、銀及び/又はシリコンに結合能を有するぺプチド (Δ 7 - 1 2変異体) を、チタン、銀及び/ 又はシリコンへの優れた結合能を有する点で好適に例示することができる。上記△ 7— 1 2変異体の中でも、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1番目（Arg) ， 4番目（Pro) , 5番目（Asp) のアミノ酸残基が保存されているペプチドが好ましく、 2番目（Lys) が Alaに置換された配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるぺプチド（K 2 A— Δ 7— 1 2) がチタン、銀及びシリコンへの優れた結合能を有する点で特に好ましい。

また、本発明のチタン、銀及び Z又はシリコンに結合能を有するぺプチドとして、配列番号 3に示されるアミノ酸配列 RKL PDAP GMH

9 TWからなるチタンに結合能を有するぺプチド（ e 3— 2— 3 ) や、配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタン、銀及び Z又はシリコンに結合能を有するぺプチド（ e 3— 2— 3変異体 ) を、チタン、銀及び Z又はシリコンへの優れた結合能をする点で好適に例示することができる。上記 e 3— 2— 3変異体としては、 1〜 5 番目及び 7〜 1 2番目のアミノ酸残基がそれぞれ Alaに置換された配列番号 4〜 1 4に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（R 1 A, K 2 A, L 3 A, P 4 A, D 5 A, P 7 A, . G 8 A, M 9 A, H I O A, T 1 1 A， W 1 2 A) や、 e 3— 2— 3の N末端に A が付加 ·挿入された配列番号 1 5に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ala insert) を挙げることができる。 Ala insertは、チタン、銀及び/又はシリコンへの優れた結合能を有する点で特に好ましい。 ' '

また、本発明のチタンに結合能を有するペプチドとして、 e 3— 2— 3_同様に、 1 2残基の直線状ランダムべプチドを提示する D 1 2ライブラリ一（New England Bio bs社、 Beverly) 由来の配列番号 1 6〜 24 に示されるアミノ酸配列からなるぺプチドゃ、配列番号 1 6〜 24に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若レくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するペプチドを例示することができる。

さらに、本発明のチタンに結合能を有するペプチドとして、 7残基の環状ランダムペプチドを提示する C 7 Cライブラリ一（New England Biolabs社）由来の配列番号 2 5〜 3 8に示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、配列番号 2 5〜 3 8に示されるアミノ酸配列において、 1 若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するぺプチドを例示することができる。

ここで、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチドが、配列番号 1や 3で示されるァミノ酸配列からなるペプチドと同様に、チタン、銀及び Z又はシリコンに結合能を有する同効物であればすべて本発明に包含される。

また、チタンとしては、金属チタン、チタン合金、不定形二酸化チタン、二酸化チタンアナタ一ゼ結晶、二酸化チタンルチル結晶、二酸化チタンブルカイト結晶を例示することができる。

上記本発明のチタンに結合能を有するペプチド群（以下、，これらぺプチドを「本件チタン結合ペプチド」という）、銀に結合能を有するぺプチド群（以下、これらペプチドを「本件銀結合ペプチド」という）、シリコンに結合能を有するペプチド群（以下、これらペプチドを「本件シリコン結合ペプチド」という）は、そのアミノ酸配列に従らて、一般的な化学合成法により製造することができる。そして、化学合成法には、通 _常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるぺプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を 1個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステツプワイズエロゲ —シヨン法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメン卜をカツプリング反応させるフラグメント · コンデンセーシヨン法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。

上記べプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、 D C C法、活性エステル法、酸化還元法、 D P P A (ジフエニルホスホリルアジド）法、 D C C +添加物（1ーヒドロキシベンゾトリアゾール、 N ーヒドロキシサクシンアミド、 N—ヒドロキシ一 5 —ノルポルネン一 2，

2 3—ジカルポキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種べプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（D M F ) 、ジメチルスルホキシド（D M S O ) 、へキサホスホロアミド、ジォキサン、テトラヒドロフラン（T H F ) 、酢酸ェチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。

上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸やべプチドにおける力ルポキシル基は、一般にはエステル化により、, 例えばメチルエステル、ェチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばべンジルエステル、 p —メトキシベンジルエステル、 p一二トロべンジルエステルァラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばの水酸基は、ァセチル基、ベンジル基、ベンジルォキシカルポニル基、第三級ブチ_ル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えば Argのグァニジノ基は、ニトロ基、トシル基、 2—メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン一 2—スルホニル基、ベンジルォキシカルポニル基、イソポルニルォキシカルボ二ル基、ァダマンチルォキシ力ルポニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本件チタン結合べプチド等におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア Zナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルォロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。

その他、本件チタン結合ペプチド等は、本件チタン結合ペプチド等をコードする D N Aの塩基配列情報により、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することもできる。このようにして得られる本件チタン結合ペプチド等は、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配ク口マトグラフィー、ゲルク口マトグラフィ一、ァフィ二ティーク口マトグラフィ一、高速液体クロマトグラフィー（H P L C ) 、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適'宜その精製を行うことができる。

また、本件チタン結合ペプチド、本件銀結合ペプチド、本件シリコン結合べプチドとして、化学修飾がなされたぺプチドを有利に用いることができる。かかる化学修飾としては、官能基を有するアミノ酸への置換からなる化学修飾や、リンカ一との結合を容易に形成させるための化学修飾を挙げることができるが、化学修飾によりチタン、銀、シリコンへの結合能が低下しない修飾が好ましい。例えば、上記リンカ一との結合を容易に形成させるための化学修飾としては、ピオチンの N—八ィドロキシサクシィミドエステル体を用いて、ぺプチドのアミノ基へのビォチ ^の共有結合を挙げることができる。かかるペプチドのピオチン化により、後述するキメラ分子を容易に作製することができる。

本発明のチタン、銀、シリコンに結合能を有する人工タンパク質としては、本件チタン結合ペプチド、本件銀結合ペプチド、又は本件シリコン結合べプチドと、機能性べプチド又は機能性夕ンパク質との結合体からなるものであれば特に制限されるものではなく、上記機能性ペプチド又はタンパク質の機能としては、ひヘリックス形成等の二次構造を形成しゃすい機能、石灰化促進機能、骨増殖分化誘導機能、クロモフォア結合機能、コラーゲン結合機能、細胞接着機能、細胞外へタンパク質を局在化させる機能、特定の細胞内小器官（ミトコンドリア、葉緑体、 E R など）にターゲットする機能、細胞膜に埋め込まれる機能、アミロイド繊維形成機能、繊維性タンパク質の形成機能、タンパク質性ゲル形成機能、タンパク質性フィルム形成機能、単分子膜形成機能、二次元結晶を自己集合で形成しうる等の自己集合機能、粒子形成機能、他のタンパク質の高次構造形成を補助する機能、ウィルス等の中和抗体を誘導する抗原機能、免疫賦活化する機能 (Nature Med i c i ne, 3 : 1266-1270, 1997 )、細胞增殖を促進又は抑制する機能、癌細胞を特異的に認 f する機能、プロテイン · トランスダクシヨン機能、細胞死誘導機能、抗原決定残基呈示機能、金属結合機能、補酵素結合機能、触媒活性機能、蛍光発色活性機能、特定の受容体に結合してその受容体を活性化する機能、信号伝達に関わる特定の因子に結合してその鳞きをモジュレートする機能、夕ンパク質， D N A， R N A , 糖などの生体高分子を特異的に認識する機能などを挙げることができる。これらの人工タンパク質は、チタンに結合能を有するペプチドに機能性べプチド又は機能性タンパク質を、アミノ酸レベルで、あるいは D N Aレベルで直接的又は間接的に結することにより作製することができる。 D N Aレベルで作製する際には、本発明 _者らにより提案されている「高分子マイクロ遺伝子重合体の作成方法」（特許第 3 4 1 5 9 9 5号公報）や「多機能塩基配列及びそれを含む人工遺伝子」（特開 2 0 0 1— 3 5 2 9 9 0号公報）に開示された人工夕ンパク質の設計技術を有利に用いることができる。

上記機能性べプチド又は機能性タンパク質の中でも、例えば、チタン、銀又はシリコンに結合能を有するペプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるべプチド又はタンパク質を用いると、その二次元結晶に沿ってチタン、銀又はシリコンをナノスケールできれいに整列化することができる人工タンパク質を構築することができる。かかるチタン、銀又はシリコンに結合能を有するぺプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるべプチド又は夕ンパク質として、ウィルス（例えば、アデノウイルス、ロタウィルス、ポリオウイルス、 H K 9 7、 C C M V 等）、フェリチンやアポフェリチンのようなフェリチンファミリー、 D p s Aタンパク質や M r g Aタンパク質を挙げることができる。その他の、二次元結晶を自己集合で形成しうるべプチド又はタンパク質としては、人工的に設計された繰り返し性に富む人工タンパク質などを挙げることができる。また、タンパク質の二次元結晶を作製する方'法としては、タンパク質溶液を水面上に単分子膜で展開させた後、固体基板に吸着させる方法などを例示することができる。

また、上記機能性ペプチド又は機能性タンパク質の中でも、例えば、細胞接着活性等の細胞認識活性をもつぺプチド配列を有す,るべプチド又はタンパク質を用いると、チタン、銀又はシリコンと細胞を同時に認識する複合活性をもつ人工タンパク質を得ることができる。かかる細胞接着活性等の細胞認識活性をもつぺプチド配列を有するぺプチド又はタンパク質としては、各種リガンド、モノクローナル抗体やその'可変領域、 1本鎖抗体等を例示することができる他、上記のような天然タンパク質限らず、細胞接着活性を有するペプチドを含む人工タンパク質を挙げることができる。

本発明のチタン、銀又はシリコンに結合能を有するキメラタンパク質としては、本件チタン結合ペプチド、本件銀結合ペプチド、又は本件シリコン結合べプチドと、単独又は他の物質と反応することにより検出可能なシグナルをもたらすことができる標識化物質又はべプチドタグとの結合体からなるキメラ分子を挙げることができる。上記標識化物質としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、放射性同位体、抗体の F c領域、等を挙げることができ、具体的には、ペルォキシダーゼ（例えば、 ho r s erad i s h pe rox i d as e) 、アルカリフォスファターゼ、 β - Ό —ガラクトシダ一ゼ、グルコースォキシダ一ゼ、グルコース一 6—ホスフエ一トデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ぺニシリナーゼ、力タラ一ゼ、アポグルコースォキシダ一ゼ、ゥレア一ゼ、ルシフェラーゼ若しくはァセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルォレスセインイソチオシァネート、フィコピリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルク口ライド若しくはテトラメチル口一ダミンイソチオシァネート等の蛍光物質、 ³H、 ¹⁴ C、 ^m I等の放射性同位体、' 化学発光物質を挙げることができる。また、ペプチドタグとしては、 H A、 F L A G、 M y c等のェピトープ夕グや、 G S T、マルトース結合タンパク質、ピオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン ( H i s ) 等の親和性タグなどの従来知られているべプチドタグを具体的に例示することできる。例えば、 H i sタグと N i —N T Aの親和性を利用すると、チタン · ぺプチドあるいはタンパク質複合体を容易に精製することができる。

また、本発明のチタン、銀、又はシリコンに結合能を有するキメラ夕ンパク質としては、本件チタン結合ペプチド、本件銀結合ぺチド、又は本件シリコン結合べプチドと、非べプチド系化合物との結合体からなるキメラ分子を挙げることができる。上記非べプチド系化合物のうち、非べプチド系低分子化合物としては、フルォレセィン、ローダミン等の蛍光色素、クロラムフエ二コール、アンピシリン等の抗生物質を、非べプチド系高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラスビーズ、シリカゲル、多糖類（誘導体を含む）、ポリエチレンダリコール等のポリアルキレングリコ一ルを具体的に例示することができる。

本発明のチタン、銀、又はシリコンに結合能を有するファージとしては、本件チタン結合ペプチド、本件銀結合ペプチド、又は本件シリコン結合べプチドをその粒子表面上に提示するファージであればどのようなものでもよく、かかるチタン、銀、又はシリコンに結合能を有するファージは、前記のスクリーニングの過程で、チタン分子、銀分子、又はシリコン分子に強く結合したぺプチド提示ファージを、その他のファージ集団から分離することにより、チタン、銀、又はシリコンに結合するファ一ジクローンとして得られる他、本件チタン結合ペプチド、本件銀結合べプチド、又は本件シリコン結合べプチドをコ一ドする D N Aを常法によりファージミドベクターに組み込んで大腸菌等の宿主'細胞を形質転換し、ヘルパ一ファージを感染させることで得ることもできる。一般的に M 1 3や f dなどの繊維状ファージは、高濃度の状態で.は液晶状態となり、規則的な整列構造をとることから、チタンを認識するペプチドファージを液晶状態にすることにより、チタンを認識するべ,プチドが規則的にナノスケールで配列した状態をつくることができる。ここにチタンを接触させると、ペプチドのチタン認識能力により、チタンを整列させることができる。

本発明のチタン、銀又はシリコンとペプチドとの複合体'や、チタン、銀又はシリコンと人工タンパク質との複合体や、チタン、銀又はシリコとキメラタンパク質との複合体や、チタン、銀又はシリコンとファージとの複合体としては、上記本発明のチタン、銀及び Z又はシリコンに結合能を有するペプチドや、上記本発明のチタン、銀及び Z又はシリコンに結合能を有する人工タンパク質や、上記本発明のチタン、銀及び/ 又はシリコンに結合能を有するキメラタンパク質や、上記本発明のチタン、銀及び/又はシリコンに結合能を有するファ一ジが、チタン、銀又はシリコンにイオン結合、パイ電子結合、ファンデルワールス結合、疎水結合などの弱い結合のいずれか、あるいは組み合わせにより結合した複合体を挙げることができる。特に、チタン一人工夕ンパク質複合体は、インプラント材料，光触媒，顔料等として有利に用いることができる。チタン結合ペプチドを融合した骨分化を促進するサイト力イン、例えば B M Pをチタン製ィンプラント材にチタン結合べプチドを介して結合したものを用いることで、チタンインプラント近傍における積極的な骨化が起こることにより、ォッセォインテグレーションの期間が短縮できることが期待される。また、チタン結合ペプチドを人工的に融合したハィドロキシァパタイトのバイオミネラリゼーシヨンを促進するペプチドあるいはタンパク質を、チタン製インプラント材にチタン ^合ペプチドを介して結合したものを用いることで、チタンインプラント表面の石灰化が促進され、ォッセオインテグレーションの期間が短縮できることが期待される。あるいは、チタン結合ペプチドを人工的に融合した抗菌作用を持つぺプチドあるいは夕ンパク質あるいは化合物を、テ夕ン製ィンプラント材にチタン結合べプチドを介して結合したものを用いることで、ォッセオインテグレーション中の感染症を低減することができる。さらに、チタン結合べプチドを融合したコラーゲンをチタン製イプラント材にチタン結合べプチドを介して結合することで、これまで'の人工歯根では見られない、人工歯根に対し垂直にコラーゲン繊維が結合したよう構造を構築することができる。これは、強い力がかかったとき、本来の歯が持つ力を分散させるメカニズムを模倣しており、これにより人工歯根に対して強い力がかかったときに、従来の人工歯根よりも高い安定性を持つことができる。

このチタン結合べプチドは、同時に銀にも結合することができるので、例えば、チタン結合ペプチドを融合したコラーゲンを、酸化チタン顔料と銀に結合させた化粧品は、高い抗菌作用を付与することができる。さらに、本発明の本件チタン結合ペプチドを用いるチタン表面の改質方法や、本件チタン結合べプチドと結合した本発明の人エタンパク質を用いるチタン表面の改質、チタン粒子の形成又はチタンの整列化方法や、本件チタン結合べプチドと結合した本発明のキメラタンパク質を用いるチタン表面の改質又はチタン粒子の形成方法や、本件チタン結合べプチドを粒子表面上に提示した本発明のファ一ジを用いるチタンの整列化又はチタン粒子の形成方法によると、チタン表面の性状やチタンの物性を改善することができ、特にタンパク質の自己集合能を利用した酸化チタンのパターンエングによる、ナノスケールのデバイス開発も可能となる。また、本件銀結合ペプチドや本件シリコン結合ペプチドを用いる銀表面ゃシリコン表面の改質又は銀粒子ゃシリコン粒子の形成方法や、本件銀結合べプチドゃ本件シリコン結合べプチドと結合した本発明の人エタンパク質を用いる銀表面ゃシリコン表面の改質又は銀粒子ゃシリコン粒子の形成、銀又はシリコンの整列化方法や、本件銀結合ペプチドや本件シリコン結合べプチドと結合した本発明のキメラタンパク質を用いる銀表面ゃシリコン表面の改質又は銀粒子ゃシリコン粒子の形成方法や、本件銀結合べプチドゃ本件シリコン結合べプチドを粒子表面上に提示した本発明のファージを用いる銀粒子ゃシリコン粒子の形成、銀又はシリコンの整列化方法によると、銀表面ゃシリコン表面の性状や銀，シリコンの _物性を改善することができる。

特に、チタン表面や銀表面やシリコン表面の改質により、生物が自身の体の内外に鉱物 (無機化合物) を作り出す生体鉱物形成能 (

biomineralization; を付するしと力きる。

また、本件チタン結合べプチドゃ本件銀結合べプチドゃ本件シリコン結合ペプチドを原子間力顕微鏡（A F M) の探針（プローブ）として用いることにより、固体材料表面を水溶液中で分析することが可能となる。例えば、本件チタン結合ペプチド、あるいはチタン結合ペプチド融合人ェタンパク質 ·キメラタンパク質を、原子間力顕微鏡の探針に、例えば金 ·チオール結合で固層化する。探針を、チタン '銀 ' シリコンの基盤に近付けることで、チタン結合ペプチドと基盤の間に相互作用が生じ、今度は探釙を離すことで相互作用が切断される。'その時に発生する張力 9 を測定することができる。また、探針を二次元にスキャンすることで、基盤表面とチタン結合べプチドの結合力を指標とした、フォースマップを作製することができる。作製したフォースマップをもとに、パターンニングに適した、材料および結晶面の選択などの幅が広がる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

(実施例 1 )

粒径 1 5 0 Mのチタン粒子 1 0 m g (住友チタニウム、兵庫）を、 1. 5 m 1エツペンドルフチューブに入れ、 5 0 0 1 の； 5 0 mMトリス (ヒドロキシメチル) ァミノメタン (以下、トリス (キシダ化学、大阪））塩酸緩衝液 P H 7. 5、 1 5 OmM塩化ナトリウム（和光純薬、大阪）溶液（以下 TB S) に、 0. 1 % ゥシ血清アルブミン（以下、 B S A) 0. 1 % Polyoxyethylenesorbi tan monolaurate ('以下、 T w e e n - 2 0 (シグマ社、 St. Louis) ) を添加した溶液で、二回洗浄した。チ_タン粒子の洗浄は、卓上遠心機 H 1 3 0 0 (コクサン) 1 3 , 0 0 0 r pm， 5秒の遠心操作により、チタン粒子を沈澱させ、上清を取り除 <ことで行った。洗浄後、ファージの非特異的吸着をブロッキングするために、さらに 1 m 1同溶液で 3 0分間、室温で、回転撹拌機 r o t a t o r RT— 5 0 (タイテック社）を用いて回転撹拌した。

卓上遠心機 H 1 3 0 0 (コクサン） 1 3， O O O r prn, 5秒の遠心操作により、チタン粒子を沈澱させ、上清を取り除いた後、ペプチド提示ファージライブラリー、 1 2残基の直線状ランダムペプチドを提示する D 1 2ライブラリー（New England Biolabs社、 Beverly) 、 1. 7 x 1 0¹¹プラーク形成単位（以下、 p f u) もしくは、 7残基の環状ランダムペプチドを提示する C 7 Cライブラリ一（New England Biolabs社） 2. O x l O ^p f uを含む 1 m l TB S , 0. 1 % B S A, 0. 1 % Twe e n - 2 0溶液を加え、二時間、室温で回転撹拌機 r o t a t o r RT— 5 0を用いて回転撹拌した。

卓上遠心機 H 1 3 0 0 (コクサン） 1 3 , O O O r pm, 5秒の遠心操作により、上清を取り除き、 1 m l TB S, 0. 1 % Twe e n— 2 0溶液で 1 0回洗浄した。洗浄は、 8 , 0 0 0 X g , 5秒の遠心操作により、チタン粒子を沈澱させることで行った。洗浄溶液を取り除いた後、 1m lの 0. 2 M グリシン（和光純薬） ·塩酸緩衝液. PH 2. 2を加え、 1 0分間、室温でタイテック社製 r o t a t o r RT— 5 0を用いて回転撹拌することでチタンに結合したファージを溶出レた。遠心操作により、チタンを沈澱させ、上清を別の 1. 5m lエツペンドルフチュ一ブに移し、さらに 1 5 0 1 の 1 M トリス ·塩酸緩衝液 p H 9. 1 を添加することで中和した後に、溶液中のファージのカ価（単位溶液あたりのプラーク形成能力）を常法（Molecular Cloning Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) こ従レ視！]定した。

_上記の操作で得られたファージ溶出液を L B培地 2 0 m 1中で対数増殖中の大腸菌 ER 2 7 3 8株 [F' lacI^qA (lacZ)M15

proA⁺B⁺zzf：： TnlO (TetR) fhuA2 supE thiA (lac-proAB) Δ

(iisdMS-mcrB)5(r_k-m_k-McrBC-)] に感染させ、振とう培養機（B R 4 0— L F、タイテック社）を用い 3 7 °Cで激しく撹拌しながら 6時間インキュべ一トした。ファージ感染菌培養液を遠心チューブ（ 5 0m l、べックマン、カルフォルニア）に移して、ベックマン遠心機（ベックマン、 J A— 1 2口一夕一）を用い 4 、 1 0分、 1 0， O O O r pmで遠心して ER 2 7 3 8株を取り除く操作を 2度行い、上清のファージ液を別のチューブに移した。ファージ液に 3. 5m l ( 1ノ6量）の 2 0 % Polyethylene glycol 6000 (以下 P EG 6 0 0 0、 Fluka社、 Buchs) 、 2. 5 M 塩化ナトリウム溶液を加え、テストチューブミキサー、 TM 2 52 (イワキ）により良く撹拌して 4°C、 1 2時間インキュベートして、ファージを沈殿させた。

沈殿したファージをベックマン遠心機で 4 t：、 1 0分、 1 0, 000 r pmで遠心して回収した。ファージ沈殿を、更に 4， 000 r pm、 1分で遠心し少量残っている上清を完全に取り除いた。得られたファ一ジ沈殿に、 11111の丁83を加ぇ、氷上で冷却した後に、穏やかにファージを懸濁した。このファ一ジ懸濁液を、 1. 5m lエツペンドルフチユーブに移し、微量高速遠心機 (AT 20 1 8 Mローター、クボタ社) を用い 5分、 1 5 , 000 r p mで遠心して上清を別のチューブに移し、懸濁されない残渣を取り除いた。ファージ液に再度、 200 1の 20 %PEG 6 000、 2. 5 M 塩化ナトリゥム溶液を加えてミキサーで良く撹拌し、氷上で 1時間インキュベートしてファージを沈殿させた。次に、微量高速遠心機により 1 0分、 1 5， 000 r pmで遠 >心してファージ沈殿を回収した。得られたファージ沈殿に 200ん 1の 0. 02 ジ化ナトリウム（和光純薬、大阪）、 TB Sを加えて完全に懸濁させた。懸濁できない残渣を微量高速遠心機により 5分、 1 5, 000 r p mで遠心し取り除いた。得られた濃縮ファージ液の力価を求めた。

上記に示すような標的分子 (この場合チタン) へのファージの結合、洗浄、回収、大腸菌による増幅といった一連の作業はパニング操作と呼ばれている。バニング操作を繰り返すことにより、標的分子へ特異的に強く結合するファージクローンを濃縮していくことが可能である。この場合も、 1回目のバニング操作後、一度大腸菌で増やしたファージを用いて、再度、チタンに対する結合、洗浄、回収、増殖の 2回目以降のパニング操作を繰り返していった。 2回目以降のバニング操作実験条件で、 1回目の操作と異なるのは以下の通りであった。すなわち、 2回目以降のバニング操作で加えるファージのカ価を、 D 1 2ライブラリー · C 7 Cライブラリーともに 2. 0 x 1 0 "、 3回目は、 D 1 2ライブラリ一 • C 7 Cライブラリ一ともに 2. 0 X 1 0¹⁰, 4回目は、 D 1 2ライブラリーでは、 4. 3 x 1 0⁹、 C 7 Cライブラリ一では、 2. 0 X 1 0¹⁰ となるように調製した。濃縮ファージを懸濁する溶液とチタンの反応溶液、及び、その洗浄溶液中の Twe e n— 2 0濃度を 2回目のバニング操作時で 0. 1 %、 3回目のバニング操作時で、 0. 3 %、 4回目のパニング操作で 0. 5 %とした。

D 1 2ライブラリーを用いたバニング実験のィンプットカ価（標的分子に加えたファージカ価）とアウトプット力価（洗浄後の襌的分子から溶出されたファージカ価）の比の値の変化を図 1に、また C 7 Cライブラリーでのバニング実験のインプットカ価とァゥトプットカ価の比の値の変化を図 2に示す。

D 1 2ライブラリー、 C 7 Cライブラリ一で 3ラウンド目に得られたファ一ジを、それそれ常法 (Phage Display A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に従いクローン化し、その提示ぺプチド部分の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には提示べプチド領域から 9 6塩基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマ

― [- 96gIII シ一ゲンシングプライマー ( 5， -^H0C C CT CATAG

TTAGC GTAAC G— 3 ') (配列番号 3 9) 、 NEB社、 Bever ] を用いて、ダイデォキシターミネイト法により決定した（CEQ DTCS Quick start kit, ベックマン社、カルフォルニア）。反応産物の泳動とデ一夕解析には、オートキヤビラリ一シーケンサー（CEQ2000、ベックマン）を用いた。

決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列を、 D 1 2ライブラリーについては図 3 (配列番号 3 , 1 6〜24) に、 C 7 Cライブラリーについては図 4 (配列番号 2 5〜 3 8) にそれぞれ示す。この中で、 D 1 2ライブラリ一から得られた e 3— 2— 3ファ一ジの提示するペプチド配列、 RKL P DAP GMHTW (配列番号 3 ) は、調べた 43個のクローンの中には同じ配列をもつものが 3 3個あった。特定のファージクローンが集団中の大多数を占めるようになることの理由の 1つに、そのファ一ジクローンが標的分子に対して強い結合能力をもつことがあげられる。

図 3 (配列番号 3 , 1 6〜 24) 、図 4 (配列番号 2 5〜 3 8) で示したべプチドを提示するファージをクロ一ン化し、クローン化状態でのチタンに対する結合能力を以下に示すように評価した。，

(実施例 2)

実施例 1で得られたファ一ジクローンを用い、チタンに対する結合能力を次のような実験から評価した。実施例 1で示したバニング操作と同じ方法で行った。実施例 1 と異なるのは、チタンとファージ'クローンの撹拌時間が 1時間であること、各溶液中の Twe e n 2 0の濃度が 0. 5 B S Aの濃度が 1 %で行ったこと、加えたファージのカ価を、 D 1 2由来のクローンは 1 0⁹p f u、 C 7 C由来のクローンは 1 O ¹¹!) f uで実施した。各ファージクローンのチタンに対する結合能を図 5にまとめた。

(実施例 3 )

実施例 2で、特にチタンと強く結合したクローン（配列番号 3のぺプチドを提示）について、水晶発振子形生体分子相互作用解析装置である Q CM-D 3 0 0 (q-sense AB社、イェテボリ）による測定でチタン表面とファ一ジの結合様式を調べた。

水晶発振子には、 Q CM— D 3 0 0純正品のチタンセンサ一を用いた。温度は 24. 9 9 °Cに設定し、実測値は、 24. 6 8 から 24. 7 0 °C付近であった。 B S Aでセンサーをブロッキングする条件とブロツキングしない条件で測定した。 B S Aでプロッキングを行わないときは、 TB Sで基準値を測定した後、ファージのカ価が 1 0¹⁽⁾p f uZm 1 となるように調整したファージ溶液を引き続き測定した。 B S Aでブロッキングを行うときは、 TB Sで基準値を測定した後、 T B S、 0. 1 % B S Aで約 1 0分間インキュベートしてブロッキングを行い、再び TB S で遊離の B S Aを洗浄した後、ファージのカ価が 1 0 ^llp f u/m 1 となるように調整したファージ溶液で引き続き測定した。そ.の結果を、図 6に示す。

図 6に示す結果から、 B S A非存在下で、センサーにフ,ァージクローンが結合したことは周波数の変化から明らかであるが、粘弹性はそれほど大きく上昇はしないことから、図 7 (下）に示すようにファージがチタン表面と水平に、固く結合していると考えられる。一方、 B S Aでセンサ一をブロックした時、センサーに結合するファージ量'は >少ないことが周波数の変化量が小さいことから分かるが、一方、粘弾性は大幅に上寻する。これらの結果は、図 7 (上) に示すように、ファージがチタン表面に対して、提示したぺプチド領域でおもに結合し、その他のファージ粒子部分はチタンとは結合することなく溶液中に存在する形で結合していることを示唆する。一方、コントロールのファージでは、 B S A非存在下におけるチタン表面への非特異的吸着は同様に見られるが、 B S Aでブロッキングを行ったときには、粘弾性の上昇は見られない。

(実施例 4)

実施例 2で、特にチタンと強く結合したクローン（配列番号 3) について、側鎖にメチル基をひとつしか持たないァラニンに置換した点変異体を作製し、各変異体ファージのチタンに対する結合能の変化を調べた。点変異体は、提示配列の 6番目にァラニンがあるため、 6番目残基を除いた残りの全ての残基について作製した。点変異体の作製は、 Ku n k e 1法 (Molecular Cloning Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) により行った。点変異体作製に用いた合成 D N Aを図 8 (配列番号 4 0〜 5 0) に示す。点変異の導入の確認は、ファージ DN Aの塩基配列を決定することにより確認した。 DNAシークェンスは、実施例 1 と同様に行った。得られた点変異体のチタンへの結合能の測定は、加えたファージ量を 1 0 ^lflp f uに合わせて、実施例 2に示す方法で行った。各点変異体のチタンに対する結合能を図 9にまとめた。

図 9に示す結果から、 1番目のアルギニン、 5番目のァスパラギン酸の側鎖の電荷が、チタンとの結合に重要な役割を果たしてると考えられる。また、 4番目のプロリンの変異体の結果から、 4番目のプロリンに於けるべプチドの主鎖の折れ曲がりが、非常に重要であることが示唆される。

(実施例 5) ' >

実施例 4の結果から、チタンとの結合に主に重要なのは配列番号 3のアミノ端部分に集中している。そこで、力ルポキシル端側の 7番目から 1 2番目までを欠失した変異体を作製し、チタンへの結合能の変化を調ベた。また、実施例 4で結合能が上昇した、 2番目のリジンをァラニンに置換した変異体についても同様の欠失変異体を作製し、チタンへの結合能の変化を調べた。

欠失変異体は、図 1 0に模式的に示した方法で作製した。各ファージクローンの二本鎖 DN A (以下 RF) を、 Q I AGEN k i tを用いて調製した。得られた R Fを錶型にして P CRを行った。この時に用いたプライマ一（図 8、配列番号 5 1〜 5 3) には、 5 ' 側に制限酵素 B a mH I切断サイ卜と B amH Iで切断が可能になるように、さらに 5 ' 側に 3残基のポリ G配列を付加した。試薬は、 Expand™ Long Tempi ate PCR System (ベーリンガー）を用いて行い、反応は、ポリメラーゼ 1 し添付の 1 0 x緩衝液 2 1 0 1、 2. 5 mM d NT P s 8 j 1、プライマ一各 1 O O pmo 1 e / IX 1を 1 1ずつ、 RF 0. 5 /z lを含む 1 0 0 1溶液で行った。 P C Rの反応は、 9 4° (：、 3 0秒、 6 0 °C、 30秒、 7 2°C、 6分を 30サイクル行った。また、サイクルの前に 9 4°C, 5分間プレヒートを行い、サイクル後に 72°C、 7'分間インキュペートした。 P CR反応後、生成物を 1 %ァガロースゲル電気泳動により分離し、目的の大きさである 7 k b付近のバンドを UV下で切り出し、 Ge n e c 1 e a n I I k i t (フナコシ）を用いて、添付のプロトコルに従い精製した。精製した DNAを、. 制限酵素 B amH,I (ベーリンガー）で 2時間、 30 °Cでインキュベート後、エタノール沈澱により B amH Iを失活させ、 DN Aを乾燥した。乾燥した DN Aを、 4 1の滅菌水、 5 1の 2 Xライゲーシヨンバッファー（プロメガ）に溶解した後、 1 n 1 T 4 DN Aライゲース (ロシュ）を加え、 '室温 30分間ライゲーシヨン反応を行い自己閉環させた。反応溶液に対して、 1 00 11 1の実施例 1に記載の大腸菌 E R 2738株のコンビテントセルを加え、氷上で 30分間静置した後、 42°C、 40秒ヒ一トショックを加えたあと、すぐに 3分間氷上に置いた。その後、 800 1の3〇（：培地を添加し、 3 7 °Cで 3時間激しく震盪培養した後、 1 , 1 0 , 1 0 0 M 1を、対数増殖期の E R 27 38株 200 ^ 1 と裩合し、 5分間静地した。その後、常法（Molecular Cloning Third Edi t ion, Cold Spr ing Harbor Laboratory Press) に従いクローン化した。欠失の導入の確認は、ファ —ジ DN Aの配列をシークェンスすることにより確認した。 DN Aシークエンスは、実施例 1と同様に行った。得られた欠失変異体のチタンへの結合能の測定は、加えたファージ量を 1 0 f uに合わせて、実施例 2に示す方法で行った。両欠失変異体のチタンに対する結合能を図 1 1にまとめた。図 1 1から、チタンに結合する配列番号 1で示されるぺプチドを提示するファージクローンは、前半部の 1一 6番目だけでも、同じ強さで結合することが分かった。

(実施例 6)

実施例 4の結果、配列番号 1の最初のアルギニンの側鎖の正電荷がチタンへの結合に重要な役割を果たしていることが分かった。しかし、このアルギニンは、ァミノ末端に位置するので、主鎖の端に正に帯電した -'

アミノ基を持つ。この正電荷が、側鎖の正電荷と強調できに働いている可能性を検討するために、ァラニンを、アルギニンの前に挿入した挿入変異体を作製し、チタン結合能への影彎を調べた。 ·，

挿入変異体の作製は、アニーリング条件を除いて実施例 4と同じ方法で行った。アニーリングは、 8 5°C、 1 0分間、 4 8°C、 1 5分間の後、ヒートブロック（AL B 1 2 1 , I WAK I ) のスィッチを切り、室温に下がるまでそのまま放置して行った。用いたプライマーめ >配列（配列番号 54) を図 8に示す。挿入変異の導入の確認は、ファ一ジ DNAの配 _列をシークェンスすることにより確認した。 DN Aシークェンスは、実施例 1と同様に行った。得られた揷入変異体のチタンへの結合能の測定は、加えたファージ量を 1 0¹⁽⁾p f uに合わせて、実施例 2に示す方法で行った。挿入変異体のチタンに対する結合能を図 1 1に示す。

実施例 6の結果は、配列番号 1 5がチタンに結合するのに、必ずしもアルギニンが先頭にある必要がないということを示している。このことは、チタンに結合するキメラタンパク質、人工タンパク質や合成べプチドなどを作製する際、配列番号 1や 3の配置に制限を受けないことを意味する重要な知見である。

(実施例 7 )

実施例 3〜 6の結果から、配列番号 3で示されるペプチドを提示するファージクローンは、チタン原子に結合した水酸基が荷電したものと結合していると考えられる。そこで、チタン表面に結合する水酸基を増やすために、過酸化水素処理を行ったチタン粒子に対する、配列番号 3で示されるぺプチドをを提示するファージクローンの結合能を調べた。チタン粒子（粒子系 1 50mm以下、住友チタニウム） 1 Omgをェッペンドルフチューブにとり、 3 %の過酸化水素（和光純）を lm l 加えた後、それぞれ、 1 20°C、 80 °C、室温（ r t ) で 1時間インキュペートした後、 TB Sで二回洗浄した後に、配列番号 3で示されるぺプチドを提示するファ一ジクローンの結合能の測定を、加えるファージ量を 1 0^1Qp f uに合わせて、実施例 2に示す方法で行つ；^。過酸化水素処理による、ファージ結合能への影響の結果を図 1 2に示す。

実施例 7の結果から分かることは、過酸化水素処理により、配列番号 3で示されるぺプチドを提示するファージクローンの結合量が増やすことができることで、このことから、チタン表面の状態を変え'ることで、ファージの結合量をコントロールできる可能性が示唆される。

(_実施例 8)

配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示するファージクローンの金属材料への結合の特異性を検討するために、金（純度 > 99. 9 % 粒系 < 1 50 m) ·銀（純度 > 9 9. 9 % 粒系く 7 5 m) ·銅（純度 > 99 % 粒系 75— 1 50 m) ' 白金（純度 > 99. 9 % 粒系く 7 5 m) ·鉄（純度 > 99. 9 % 粒系 1 50 ^ m) ·錫（純度 > 99. 9 % 粒系く 1 50 im) ·亜鉛（純度 > 9 9. 9 % 粒系 1 5 0 m) · クロム（純度 > 98 % 粒系 1 0 ^m) ·コバルト（純度 > 99 % 粒系く 7 5 m) · シリコン（純度 > 9 9 % 粒系く 1 50 zm) (高純度化学研究所 ·埼玉）各 1 Omgに対して、配列番号 3で示されるァミノ酸配列からなるペプチドを提示するファージクローン 10^{1 Q}p f u/m 1を用いて、実施例 2と同じ方法で各金属への結合能を調べた。その結果を図 1 3にまとめた。図 1 3に示される結果から、配列番号 2 で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを提示するファージクローンはチタンのみならず銀ゃシリコンにも結合することがわかった。

(実施例 9 )

配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを il示するファ —ジクローンの銀ゃシリコンへの結合様式、配列特異性がチタンに結合する場合と同様であるかどうか確かめるために、実施例 4で使用した配列番号 4, 5， 7， 8のァラニン置換変異ファージの銀 · シリコンへの結合能を実施例 2に示す方法でおこなつ.た。その結果を図, 1 4にまとめた。図 1 4に示される結果から、各ァラニン置換による銀 · シリコン結合能への影響は、チタンのときと同じ傾向を示した。このことから、配列番号 3を提示するファージクローンは、チタンに結合するときと同じ分子機構 ·配列特異的に銀 · シリコンに結合することが示唆された。

(実施例 1 0 )

_配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成ペプチドが、チタン表面に結合することを確認するために、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドのチタン粒子に対する結合能を調べた。実施例 1で用いたチタン粒子 1 Omgをエツペンドルフチューブにとり、 5 0 mM HE P E S— N a OH、 1 5 0 mM N a C 1で二回洗浄した後に、 1 0 0 1 の配列番号 3の合成ペプチド 5〜 40 Mを添加し、 2 時間、室温で回転撹拌機 r o t a t o r RT— 5 0 (タイテック社) を用いて回転撹拌した。卓上遠心機 H 1 3 0 0 (コクサン東京） 1 3， 0 0 0 r pm、 5秒の遠心操作により、上清を回収し、フルォロアルデヒド（ピアス社ロックフォードイリノイ）と混合し、分光蛍光光度計（日本分光東京）を用いて、励起波長 3 42 nm、蛍光波長 4 3 7 nmから、上清中のペプチド濃度からチタンへの結合量を求めた。チタンの比表面積は密度と平均粒子系から求めた。また、同じ方法で実施例

1 3で用いたシリコン '錫についても配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドの結合能を調べた。得られた結果に対して L a n gmu i r吸着等温式を用いてフィッティングをおこない、最大吸着量 ·解離定数を求めた結果を表 1にまとめた。

(表 1 )

Kd (μΜ) qm (mole / m ²)

Ti 11.1 ±2.8 2.5 + 0.3 X10 -⁶

Si 13.2 ±4.0 2.1 ±0.3 X10 -7

Sn ND ND

(実施例 1 1 ) ' > 無機材料結合べプチドは、多くの場合その標的材料のバイオミネラリゼーシヨン能を有する。そこで、配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドの銀のバイオミネラリゼーション能を以下の方法により調べた。 TB Sに溶解した配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成ペプチド 0. 1〜 0. 4mMに、硝酸銀水溶液を終濃度 0. 1 mMになるように添加し、 2 5 °Cで 48時間インキュベートした後、遠心操作により生成した銀を回収した。回収した銀を、蒸留水でよく洗浄した後、透過型電子顕微鏡で観察をおこなったその結果を、図 1 5にまとめた。図 1 5に示される結果から、約 5 0 O nmの大きさの結晶性の粒子が配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドにより生成されることが分かった。

(実施例 1 2)

配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドのシリコンのバイオミネラリゼ一ション能を以下の方法により調べた。 TB Sあるいは P B Sに溶解した配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成ぺプチド 2 — 1 2 mg/m 1 に、 1 mM HC 1で終濃度 0. 1 Mになるように希釈した 1ノ 1 0容量のテトラメトキシシラン（信越化学東京）を添加し、 5分間室温で静置したあと、遠心操作により生成したシリカを回収した。回収したシリカを、蒸留水でよく洗浄し、 2 0 1 の 0. 5 N N a〇H、 9 8 °C 3 0分間インキュベートにより溶解、蒸留水で 1 0 0〜 5 0 0倍に希釈した溶液2 5 0 1 に、 I O I の 1 0倍希釈 ·有害金属測定用硫酸、 1 0 1 の 1 0 %モリブデンンアンモニゥム水溶液を添加し、 2 5 °Cで 1 0分間インキュベートした後、 3 8 5 η mの吸光度から生成シリ力量の定量をおこなった。その結果を図 1 6に、また生成したシリカの形態を透過型電子顕微鏡 ·走査型電子顕微鏡で観察した結果を図 1 7にそれぞれまとめた。これらの結果がら配列番号 3で示されるアミノ酸配列からなる合成べプチドは、シリカ粒子のバイすミネラリゼ一ション能を持つことが分かった。

(実施例 1 3)

配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドの配列を持つ融合タンパク質が、チタン結合能を獲得することを示すために、配列番号 1をフェリチンタンパク質に融合した融合タンパク質（以下 TB F) を作製した。 TB Fを発現するためのプラスミド構築は、図 1 8に模式的に示した方法によりおこなった。すなわち、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチド融合組換えフェリチン発現ベクターは、ゥマリコンビナントフエリチン発現べクタ一である pMK 2/ f e r r i t i nを制限酵素 B amH I と S a c Iで切断し、ァニーリングした配列番号 5 5及び 5 6に示される合成 D N Aを揷入し、次に B amH Iで切断した。そこに、 pMK 2/ f e r r i t i nを B amH Iで切断したときに生じる短い DN A断片を揷入し作製した。

構築した TB F発現プラスミドを大腸菌 XL I _b 1 u e株に常法（ Molecular Cloning Third Edi t ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press ) に従い形質転換した。形質転換した菌株を、 5m l 1 0 0 ^ g/m 1 カルペニシリン含有 L B培地で 1 6— 20時間、 37 °Cで前培養の後、 500 m l 1 00 gZm 1カルべニシリン含有 L B培地に植え継ぎ、さらに 1 6— 1 8時間、 37 °Cで培養をおこなった。遠心操作により大腸菌を集菌したあと、 5 0mM T r i s HC l p H 8. 0緩衝液で菌体を洗浄したあと、 1 l i t e rの培養菌体あたり 20 m, 1の 50 mM T r i s H C 1 p H 8. 0緩衝液で菌体をよく分散させた後、超音波破砕装置 S o n i f e r 250 (Branson社製ダンバリー、コネティカツト）、微量チップ、出力 7、 d u t y c y c l e 50 %で 2分間破砕した後、氷冷、 2分間破砕、氷冷を繰り返し菌体を良く破枠し £。破碎後、遠心操作により可溶性画分を回収し、 7 0° ( 、 1 5分間温浴し、室温に方置して徐々に冷ました後、遠心操作により上清を回収した。回収した溶液を、陰イオン交換担体である Q— S e p h a r o s e H P (Amersham ピスカタウェイ、ニュージャージー) を用いたカラムクロマ卜グラフィ一による精製をおこなった。 0— 400 mMの塩化ナトリウムのグラジェントにより TB Fを溶出した。溶出した TB Fを限外ろ過により濃縮した後、 S e p h a c r y l S - 400 (Amersham ピスカタウェイ、ニュージャージー）を担体に用いたゲルろ過クロマトグラフィ一により、 T B Fの 24量体の溶出ピークを回収した。

この TB Fのチタンへの結合能を、実施例 3で用いた Q CMによりおこなった。対照として配列番号 1以外のチタンへの結合の寄与を、配列番号 1で示されるアミノ酸配列からなるぺプチドを含まない組換えフエリチンタンパク質（ f e r O) のチタンへの結合も調べた。その結果を図 1 9に示す。図 1 9に示される結果から、 T B Fは i e r Oよりも強くチタンに結合することが分かり、配列番号 1で示されるァミノ酸配列からなるぺプチドを含む融合タンパク質のチタンへの親和性が大幅に上昇することが示された。産業上の利用可能性

本発明によると、例えば、ォッセォインテグレーション期間を短縮するチタンィンプラント材料、歯を擬態することで細菌感染に抵抗性の高いチタンィンプラン卜材料などの医療分野、可視光城でも利用可能な光触媒能をもつ酸化チタン材料など、ナノバイォテクノロジ一、材料工学、半導体、医薬品、化粧品などに有利に用いることができるチタン複合体を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . チタンに、異なったペプチド配列をファージ粒子上に提示したファ —ジ集団を接触させ、ファージ粒子がぺプチド配列を介して結合したチタンを遠心操作により回収し、得られたチタンに結合したファージ粒子を菌体中で増殖させ、次いで、増殖させたペプチド配列をファージ粒子上に提示したファージ集団をチタンに接触させるバニング操作を繰り返すことにより、チタンに結合するファ一ジクローンを濃縮することを特徵とするチタンに結合能を有するぺプチドのスクリーニン,グ方法。

2 . 請求項 1記載のスクリーニング方法により得られることを特徴とするチタンに結合能を有するぺプチド。

3 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるチタンに結合能を有するペプチド。 '

4 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミ_ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するぺプチド。

5 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1 , 4 , 5番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする請求項 4記載のチタンに結合能を有するぺプチド。

6 . 2番目のリジンがァラニンに置換された配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 5記載のチタンに結合能を有するペプチド。

7 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるチタンに結合能を有するペプチド。

8 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するぺプチド。

9 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列の 1 , 4 , 5番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする請求項 8記載のチタンに結合能を有するぺプチド。

1 0 . 1〜 5番目及び？〜 1 2番目のアミノ酸残基がそれれァラニンに置換された配列番号 4〜 1 4に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 8記載のチタンに結合能を有するぺプチ.ド。

1 1 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列の N末端にァラニンが付加 · 揷入された配列番号 1 5に示されるアミノ酸配列からなる;ことを特徴とする請求項 8又は 9記載のチタンに結合能を有するぺプチド。

1 2 . 配列番号 1 6〜 2 4に示されるアミノ酸配列からなるチタンに結合能を有するぺプチド。

1 3 . 配列番号 1 6〜 2 4に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するぺプチド。

1 4 . 配列番号 2 5〜 3 8に示されるアミノ酸配列からなるチタンに結合能を有するぺプチド。

1 5 . 配列番号 2 5〜 3 8に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつチタンに結合能を有するペプチド。

1 6 . 化学修飾されていることを特徴とする請求項 2〜 1 5のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチド。

1 7 . チタンが、金属チタン、チタン合金又は二酸化チタンであることを特徴とする請求項 2〜 1 6のいずれか記載のチダンに結合能を有するペプチド。

1 8 . 請求項 2〜 1 6のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドがチタンと結合したチタン一ペプチド複合体。

1 9 . 請求項 2〜 1 6のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドと、機能性ペプチド又は機能性タンパク質との結合体であって、かつチタンに結合能を有する人エタンパク質。

2 0 . 機能性ペプチド又は機能性タンパク質が、チタンに結合能を有するべプチドと協働して、二次元結晶を自己集合で形成しうるべプチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項 1 9記載の人工タンパク質。

2 1 . 機能性ペプチド又は機能性タンパク質が、細胞接着活性等の細胞認識活性をもつぺプチド配列を有するぺプチド又は夕ンパク質であることを特徴とする請求項 1 9記載の人工タンパク質。

2 2 . 請求項 1 9〜 2 1のいずれか記載の人工タンパク質がチタンと結合したチタン一人工タンパク質複合体。

2 3 . 請求項 2〜 1 7のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドと、標識化物質若しくはペプチドタグとの結合体、又は非ペプチド系化合物との結合体であって、かつチタンに結合能を有するキメラタンパク質。

2 4 . 請求項 2 3記載のキメラタンパク質がチタンと結合したチタン一キメラタンパク質複合体。

2 5 . 請求項 2〜 1 7のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドをその粒子表面上に提示し、かつチタンに結合能を有するファージ。

2 6 . 請求項 2 5記載のファージがチタンと結合したチタン—ファージ複合体。

2 7 . 請求項 2〜 1 7のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチドを用いることを特徴とするチタン表面の改質又はチタン粒子の形成方法。

2 8 . 請求項 1 9〜 2 1のいずれか記載のチタンに結合能を有する人工夕ンパク質を用いることを特徴とするチタン表面の改質、チタン粒子の形成又はチタンの整列化方法。

2 9 . 請求項 2 3記載のチタンに結合能を有するキメラタンパク質を用いることを特徴とするチタン表面の改質又はチタン粒子の形成方法。

3 0 . 請求項 2 5記載のチタンに結合能を有するファージを用いることを特徴とするチタンの整列化又はチタン粒子の形成方法。

3 1 . 請求項 2 2記載のチタン一人工タンパク質複合体を有効成分とするィンプラン卜材料。

3 2 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなる銀に結合能を有するペプチド。

3 3 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ銀に結合能を有するぺプチド。 '

3 4 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1 , 4， 5番目のアミノ酸残 _基が保存されていることを特徴とする請求項 3 3記載の銀に結合能を有するぺプチド。

3 5 . 2番目のリジンがァラニンに置換された配列番号 2に示されるァミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 3 4記載の銀に結合能を有するぺプチド。

3 6 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなる銀に結合能を有するぺプチド。

3 7 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ銀に結合能を有するぺプチド。

3 8 . 化学修飾されていることを特徴とする請求項.3 2〜 3 7のいずれか記載の銀に結合能を有するぺプチド。

3 9 . 請求項 3 2〜 3 8のいずれか記載の銀に結合能を有するぺプチドが銀と結合した銀一べプチド複合体。

4 0 . 請求項 3 2〜 3 8のいずれか記載の銀に結合能を有するぺプチドと、機能性ペプチド又は機能性ダンパク質との結合体であって、かつ銀に結合能を有する人工夕ンパク質。

4 1 . 請求項 4 0記載の人工タンパク質が銀と結合した銀一人工タンパク質複合体。

4 2 . 請求項 3 2〜 3 8のいずれか記載の銀に結合能を有するぺプチドと、標識化物質若しくはペプチドタグとの結合体、又は非,ペプチド系化合物との結合体であって、かつ銀に結合能を有するキメラタンパク質。

4 3 . 請求項 4 2記載のキメラタンパク質が銀と結合した銀一キメラ夕ンパク質複合体。

4 4 . 請求項 3 2〜 3 8のいずれか記載の銀に結合能を有'す 'るべプチドをその粒子表面上に提示し、かつ銀に結合能を有するファージ。

4 5 . 請求項 4 4記載のファージが銀と結合した銀—ファ一ジ複合体。

4 6 . 請求項 3 2〜 3 8のいずれか記載の銀に結合能を有するぺプチドを用いることを特徴とする銀表面の改質又は銀粒子の形成方法。

4 7 . 請求項 4 0記載の銀に結合能を有する人工タンパク質を用いることを特徴とする銀表面の改質、銀粒子の形成又は銀の整列化方法。

4 8 . 請求項 4 2記載の銀に結合能を有するキメラタンパク質を用いることを特徴とする銀表面の改質又は銀粒子の形成方法。

4 9 . 請求項 4 4記載の銀に結合能を有するファージを用いることを特徴とする銀粒子の形成又は銀の整列化方法。

5 0 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるシリコンに結合能を有するペプチド。

5 1 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシリコンに結合能を有するぺプチド。

5 2 . 配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 1， 4 , 5番目のアミノ酸残基が保存されていることを特徴とする請求項 4 9記載のシリコンに結合能を有するペプチド。 '

5 3 . 2番目のリジンがァラニンに置換された配列番号 2に示されるァミノ酸配列からなることを特徴とする請求項 5 0記載のシリコンに結合能を有するぺプチド。

5 4 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列からなるシリコに結合能を有するペプチド。

5 5 . 配列番号 3に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシリコンに結合能を有するペプチド。 '

5 6 . 化学修飾されていることを特徴とする請求項 5 0〜 5 5のいずれ記載のシリコンに結合能を有するぺプチド。

5 7 . 請求項 5 0〜 5 6のいずれか記載のシリコンに結合能を有するぺプチドがシリコンと結合したシリコン一べプチド複合体。

5 8 . 請求項 5 0〜 5 6のいずれか記載のシリコンに結合能を有するぺプチドと、機能性べプチド又は機能性タンパク質との結合体であって、かつシリコンに結合能を有する人工タンパク質。

5 9 . 請求項 5 8記載の人工タンパク質がシリコンと結合したシリコン —人工タンパク質複合体。

6 0 . 請求項 5 0〜 5 6のいずれか記載のシリコンに結合能を有するぺプチドと、標識化物質若しくはペプチドタグとの結合体、又は非べプチド系化合物との結合体であって、かつシリコンに結合能を有するキメラタンパク質。

6 1 . 請求項 6 0記載のキメラタンパク質がシリコンと結合したシリコン—キメラタンパク質複合体。

6 2 . 請求項 5 0〜 5 6のいずれか記載のシリコンに結合能を有するぺプチドをその粒子表面上に提示し、かつシリコンに結合能を有するファーシ。

6 3 . 請求項 6 2記載のファージがシリコンと結合したシリコン—ファージ複合体。 .

6 4 . 請求項 5 0〜 5 6のいずれか記載のシリコンに結合能を有するぺプチドを用いることを特徴とするシリコン表面の改質又は,シリコン粒子の形成方法。

6 5 . 請求項 5 8記載のシリコンに結合能を有する人工タンパク質を用 'いることを特徴とするシリコン表面の改質、シリコン粒子の形成又はシリコンの整列化方法。 '

6 6 . 請求項 6 0記載のシリコンに結合能を有するキメラタンパク質を用 _いることを特徴とするシリコン表面の改質改質又はシリコン粒子の形成方法。

6 7 . 請求項 6 2記載のシリコンに結合能を有するファージを用いることを特徴とするシリコン粒子の形成又はシリコンの整列化方法。

6 8 . 請求項 2〜 1 7のいずれか記載のチタンに結合能を有するぺプチド、請求項 3 2〜 3 8のいずれか記載の銀に結合能を有するペプチド、又は、請求項 5 0〜 5 6のいずれか記載のシリコンに結合能を有するぺプチドを原子間力顕微鏡（A F M ) の探釙（プロ一ブ）として使用する方法。

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