WO2005005047A1 - Formteil zur analyse und präparation von substanzen in mikroliter- und submikroliter-volumina und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Formteil zur analyse und präparation von substanzen in mikroliter- und submikroliter-volumina und verfahren zu seiner herstellung Download PDF

Info

Publication number
WO2005005047A1
WO2005005047A1 PCT/EP2004/051416 EP2004051416W WO2005005047A1 WO 2005005047 A1 WO2005005047 A1 WO 2005005047A1 EP 2004051416 W EP2004051416 W EP 2004051416W WO 2005005047 A1 WO2005005047 A1 WO 2005005047A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
surface area
molded part
solution
tip
nylon
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/051416
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Anton Horn
Thomas Moore
Renate Bublitz
Helga Endmann
Ronny Henke
Original Assignee
Cybio Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cybio Ag filed Critical Cybio Ag
Priority to US10/564,190 priority Critical patent/US7824622B2/en
Publication of WO2005005047A1 publication Critical patent/WO2005005047A1/de

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0275—Interchangeable or disposable dispensing tips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/12—All metal or with adjacent metals
    • Y10T428/12479—Porous [e.g., foamed, spongy, cracked, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2991—Coated
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2991—Coated
    • Y10T428/2998—Coated including synthetic resin or polymer

Definitions

  • Molded part for the analysis and preparation of substances in microliter and submicroliter volumes and process for its production Molded part for the analysis and preparation of substances in microliter and submicroliter volumes and process for its production
  • the present invention relates to a molded part for the analysis and preparation of substances.
  • US 5,833,927 relates to a device with which a component can be bound from a liquid.
  • the device is designed in the form of a pipette tip.
  • the binding takes place on a membrane, which is located in the pipette tip transversely to the direction of flow.
  • WO 88/09201 relates to a device for separating and purifying molecules by adsorbing the molecules on a matrix.
  • a chromatography material is enclosed in a pipette tip.
  • a disadvantage of these devices is that they have large dead volumes, particularly when dealing with sample volumes in the microliter and
  • WO 98/37949 describes a method for producing a structure which is located within an envelope, for example a pipette tip.
  • This structure can serve as a sorbent or reactive carrier, but the relocation of the structure into the pipette tip outlet leads to serious malfunctions and poor reproducibility.
  • WO 01/07162 tries to avoid these problems by applying a coating to the inner surface of a pipette tip.
  • the pipette tip and the coating disadvantageously consist of two different materials.
  • No. 6,416,716 attempts to solve the problem of poor reproducibility and the poor discharge of WO 98/37949 by integrating parts of a separation medium into the wall of a vessel.
  • the object of the present invention was to provide molded parts for analysis and To provide preparation that meet the requirements mentioned and thereby overcome disadvantages of the prior art.
  • the object is achieved by a one-piece molded part made of plastic for the analysis and preparation of substances with at least one surface area and an inner area, the at least one surface area being an open-pore, three-dimensional network.
  • Interior is the part of the molded part that is not part of a surface area.
  • a molded part made of plastic which is suitable for the analysis and preparation of substances. At least one area with an open-pore three-dimensional network exists on the surface.
  • the molded parts are suitable for the treatment of samples in the microliter and submicroliter range.
  • the interior is preferably free of open pores.
  • plastics for the molded parts are polyamides, for example of the types PA6, PA66, PA46, PA12, polysulfones, polyesters and polycarbonates. Copolymers of the corresponding materials and mixtures thereof are also possible. The entire molded part is, however, built up in one piece from the same chemical material.
  • Reactants can be bound to the corresponding molded parts.
  • Particularly suitable reactants are:
  • Proteins, protein derivatives and peptides for example antibodies, antigens, lectins, heparins, protein A, protein G, enzymes such as proteases, phosphatases, glycosidases, lipases, etc .; o nucleic acids, eg oligo- and polynucleotides, DNA or RiMA fragments; • carbohydrates such as monosaccharides, disaccharides, glycogen, starch, dextrans and complex carbohydrates;
  • lipids such as triacylglycerols, steroids, phosphoglycerides, gangliosides;
  • Affinity ligands e.g. Chelating agent, cibacron blue; • Effectors of enzymes such as inhibitors, activators, substrates, cosubstrates.
  • Corresponding reactants can be bound to one or more surface areas of the molded part. Different reactants can also be bound to different surface areas.
  • the reactants can be bound covalently, ionically, via complex formation or by hydrophobic interaction. Binding can be immediate or with the help of linkers.
  • the molded part can be designed, for example, as a pipette tip, tube piece, rod, single or multiple vessel, microtiter plate, immersion ball or plate.
  • the invention also relates to a method for producing the molded parts.
  • a one-piece molded part made of plastic is partially detached from at least one surface area, so that an open-pore surface area is formed, which forms a three-dimensional network.
  • a chemical activation of the surface area can take place simultaneously, before or after the partial solution of the surface area.
  • the method is characterized in that the plastic surface is dissolved by a liquid reaction medium and the dissolved surface structure is retained by changing the liquid medium or a three-dimensional structure is formed by precipitation. This results in a considerable increase in surface area that can be used for the binding of substances.
  • the exposure time depends, among other things. depending on the surface material, possible previous surface treatment and the temperature. It is generally in the range from 10 sec to 10 min, preferably in the range from 30 sec to 3 min. In the case of a desired release of further reactive groups on the surface by breaking bonds in the plastic, these are typically between 1 and 10 h, preferably between 2 and 3 h. After these reaction media have acted on the surface area (s), the reaction medium conditions change. This can be done by exchanging the reaction medium or by changing the concentration by adding other substances.
  • the necessary reaction medium can be added or sucked in in a simple manner.
  • the surface area to be treated is immersed in the reaction medium.
  • the moldings according to the invention are suitable for the analysis and preparation of substances, in particular for specific concentration and sample preparation and for the enrichment of a substance in a sample, for the depletion of an interfering substance from a sample, for analyte modification, in particular for the specific cleavage or removal of modification such as phosphates, Sugar units, fatty acid units.
  • the technique of extracting viewed in relation to one another, larger vessels and eluting in much smaller vessels can achieve a concentration of the desired substance in the ratio of the volumes of the extraction to the elution vessels, as shown in FIG.
  • FIG. 1 shows a longitudinal section through an ion 6,6 tip activated with 85% formic acid (A: moist; B: dry).
  • FIG. 2 shows a longitudinal section through an IMylon-6 tube piece activated with a saturated, aqueous phenol solution (A: moist; B: dry).
  • FIG. 3 shows a separation of differently hydrophobic peptides on an activated nylon 6,6 tip.
  • FIG. 4 shows the result of desalting a peptide mixture.
  • Figure 5 shows mass spectroscopic analyzes of human albumin after cleavage with trypsin bound to a nylon 6,6 tip.
  • Figure 6 shows mass spectroscopic analyzes of the cleavage of a phosphopeptide with alkaline phosphatase bound to a nylon 6,6 tip.
  • FIG. 7 shows a mass spectrometric analysis of a glucopeptide before and after cleavage with peptide N-glucosidase F, which is bound to a nylon 6,6 tip.
  • Figure 8 shows the results of desalting a 17-mer oligonucleotide solution using an activated nylon 6,6 tip.
  • FIG. 9 shows the results of an enrichment of phosphopeptides from a solution.
  • FIG. 10 shows a basic sketch in which different reactants are bound to different surface areas of a molded part.
  • FIG. 11 shows a sketch of an application of the molded parts according to the invention, in which extraction and elution take place in different volumes in order to achieve a concentration of the substances.
  • a pipette tip made of nylon-6,6 was activated by loosening the inner wall with formic acid and subsequent precipitation of the dissolved nylon-6,6 on the inner wall by diluting the nylon-containing solution with water.
  • a pipette tip was treated with the following steps:
  • FIG. 1 A correspondingly treated pipette tip is shown in FIG. 1.
  • a nylon tip was activated with formic acid as described above. Then the tip was incubated with 2.9 M hydrochloric acid, 2.5 h at 37 ° C and washed as above. Hemoglobin was covalently bound to amino groups of the nylon via polyethylene imine spacers with glutaraldehyde. The binding was 26.5 ⁇ g / cm 2 surface (from a double determination).
  • a fourth sample was treated like sample three. Instead of hemoglobin, trypsin was covalently bound to the amino groups of the nylon. The bound amount of 26.8 ⁇ g trypsin / cm 2 was determined from an activity measurement with a fluorogenic substrate.
  • the bound peptides were then eluted with 10 ⁇ l aqueous acetonitrile solution, the acetonitrile content being gradually increased from 10 to 50%.
  • the elution solution was examined with MALDI-MS.
  • the sequences of the peptides could be compared with a Database can be determined. The so-called "Gravy Index" was calculated from the amino acid sequence of the identified peptides thus obtained as a measure of the hydrophobicity of the peptides.
  • a piece of nylon 6 tubing was activated as described under 2b).
  • the activated nylon tube with a length of 15 mm and an inner diameter of 1.9 mm was placed on a pipette tip and washed intensively with dimethylformamide, 100% acetonitrile and 80% acetonitrile.
  • the tube was then equilibrated with 0.1% aqueous trifluoroacetic acid and 10 ⁇ l of a peptide mixture (4.8 nmol / ml, 100 mM sodium chloride, 50 mM phosphate, acidified with TFA) were pipetted. After a contact time of 5 minutes, the solution was pipetted out and the tube was washed with 10 ⁇ l aqueous 0.1% TFA.
  • the bound peptides were eluted with 10 ul 80% acetonitrile in water.
  • FIG. 4A shows the MALDI MS spectrum before desalination.
  • FIG. 4B shows the MALDI spectrum after elution of the peptides from the tube.
  • the tip was incubated with 10 ⁇ l of 2.5% glutaraldehyde solution (v / v) in Pa buffer for 18 min at room temperature. After intensive washing with water and Pa buffer, the spacer polyethyleneimine (PEI) is bound by incubation with 10 ⁇ l of a 1% PEI solution in Pa buffer (w / v) for 1 h at 37 ° C. After washing with water and Pa buffer, remaining binding sites were incubated at 4 ° C for at least 2 h, better overnight, with 10 ⁇ l of an amino acid mixture of 0.5 mg phenylalanine, leucine, arginine, glycine and aspartic acid / 1 ml Pa buffer incubated.
  • PKI spacer polyethyleneimine
  • FIG. 5 shows two MALDI spectra of HSA peptides after each 10 min trypsin digestion.
  • FIG. 5A shows the cleavage result of human albumin in the first (above) and FIG. 5B in the sixth use.
  • the tips are therefore sufficiently stable for multiple use.
  • AP alkaline phosphatase
  • PNGase F from Boehringer (10 ⁇ l with 0.2 U / ml, 23 h at 4 ° C.) was bound to this. This was followed by reduction with NaBH 4 and washes as described in example 6 for trypsin binding. The nylon tip was washed thoroughly with Pa buffer after each incubation.
  • the detection of the binding of enzymatically active PNGase F was carried out by deglycosylation of a glycopeptide, which was purified chromatographically from a tryptic digestion of alkaline phosphatase.
  • FIG. 7 shows the mass spectrum before (7A) or after the incubation (7B). The carbohydrate residues are split off.
  • Example 2 An activated nylon tip as described in Example 1 was equilibrated with an aqueous 0.1% TFA solution. Then 10 ul of a solution of one
  • the module which consists of eight nylon 6 rods, was first degreased with chloroform and then immersed 15 mm deep in a saturated aqueous phenol solution for 10 min.
  • the dissolved nylon was then precipitated on the rods by immersion for 5 min in 100% acetone and then rinsed thoroughly several times with 100% ethanol.
  • FIG. 9 shows the negative MALDI spectra A) of the mixture of phosphopeptide with HSA peptides and B) after elution from the metal chelate nylon rod.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Einstückiges Formteil aus Kunststoff zur Analyse und Präparation von Substanzen mit mindestens einem Oberflächenbereich und einem Innenbereich, wobei der mindestens eine Oberflächenbereich ein offenporiges, dreidimensionales Netzwerk ist.

Description

Formteil zur Analyse und Präparation von Substanzen in Mikroliter- und Submikroliter-Volumina und Verfahren zu seiner Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Formteil zur Analyse und Präparation von Substanzen.
Die Entwicklung der Biotechnologie in den letzten Jahren, insbesondere im Bereich der Proteom- und Genom-Forschung verlangt nach effizienter Analytik bei allgemeiner Reduktion der Proben- und Reagenzienvolumina. Aufgrund der zunehmenden Parallelisierung der Untersuchungen bestehen hohe Anforderungen im Bereich einer einfachen, praktikablen und ökonomisch vertretbaren Probenvorbereitung, um eine Charakterisierung von Kleinstmengen zu erlauben.
An entsprechende Probenvorbereitungsschritte werden vielfältige Anforderungen gestellt, dabei müssen
a) Verluste an Probenmaterial gering gehalten werden, b) Möglichkeiten zu einer ausfallsicheren Automatisierung gegeben sein, c) Analysen von Analyten in niedriger Konzentration neben anderen Analyten mit höherer Konzentration möglich sein, d) Probenvolumina im μl und sub-μl Bereich verarbeitet werden können, e) möglichst universell einsetzbare Einheiten für eine Vielzahl verschiedener Verfahren geschaffen werden.
US 5,833,927 betrifft eine Vorrichtung, mit der eine Komponente aus einer Flüssigkeit gebunden werden kann. Die Vorrichtung ist in Form einer Pipettenspitze ausgebildet. Die Bindung erfolgt an einer Membran, die sich quer zur Flussrichtung in der Pipettenspitze befindet.
WO 88/09201 betrifft eine Vorrichtung zur Trennung und Reinigung von Molekülen durch Adsorption der Moleküle an einer Matrix. Hierbei ist ein Chromatographiematerial in einer Pipettenspitze eingeschlossen. Nachteilig an diesen Vorrichtungen ist, dass sie große Totvolumina aufweisen, die insbesondere beim Umgang mit Probenvolumina im Mikroliter- und
Submikroliterbereich inakzeptabel sind und dass sie aus verschiedenen Materialien zusammengesetzt sind.
Zur Überwindung der Problematik des Totvolumens beschreibt WO 98/37949 ein Verfahren zur Erzeugung einer Struktur, die sich innerhalb einer Umhüllung, beispielsweise einer Pipettenspitze, befindet. Diese Struktur kann als sorbtiver oder reaktiver Träger dienen, jedoch führt die Verlagerung der Struktur in den Pipettenspitzenauslauf zu gravierenden Funktionsstörungen und schlechter Reproduzierbarkeit.
Diese Probleme versucht die WO 01/07162 dadurch zu umgehen, dass auf der inneren Oberfläche einer Pipettenspitze eine Beschichtung aufgebracht wird. Hier bestehen jedoch nachteilhafterweise die Pipettenspitze und die Beschichtung aus zwei unterschiedlichen Materialien.
Das Problem der schlechten Reproduzierbarkeit und des schlechten Auslaufs der WO 98/37949 versucht die US 6,416,716 dadurch zu lösen, dass in die Wand eines Gefäßes Teile eines Separationsmediums eingebunden sind. Nachteilig ist jedoch auch hier, dass unterschiedliche Materialien kombiniert werden müssen.
Bei einer zunehmenden Verkleinerung der Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen, etc. ist das Einbringen eines zweiten Materials zunehmend komplizierter.
Bra∑ilian J. Med. Biol. Res (1994) 27: 1507-1516 beschreibt ein Verfahren, bei dem Nylon-6-Kugeln in Ameisensäure aufgelöst und dann präzipitiert werden, wodurch schwammartige Strukturen und kolloidale Suspensionen erhalten werden können. An diese können dann Enzyme gebunden werden. Entsprechende Schwämme und Suspensionen können nur schwer zu praktikablen Tools für die Mikroanalytik verarbeitet werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Formteile zur Analyse und Präparation bereitzustellen, die die genannten Anforderungen erfüllen und dabei Nachteile des Standes der Technik überwinden.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein einstückiges Formteil aus Kunststoff zur Analyse und Präparation von Substanzen mit mindestens einem Oberflächenbereich und einem Innenbereich, wobei der mindestens eine Oberflächenbereich ein offenporiges, dreidimensionales Netzwerk ist.
"Einstückig" im Sinne der Anmeldung bedeutet, dass das Formteil aus einem, chemisch einheitlichen Ausgangsmaterial besteht.
"Innenbereich" ist der Teil des Formteils, der nicht Teil eines Oberflächenbereichs ist.
Erfindungsgemäß wird ein Formteil aus Kunststoff bereitgestellt, das zur Analyse und Präparation von Substanzen geeignet ist. An der Oberfläche existiert mindestens ein Bereich mit einem offenporigen dreidimensionalen Netzwerk. Die Formteile eignen sich zur Behandlung von Proben im Mikroliter- und Submikroliter-Bereich.
Bevorzugt ist der Innenbereich frei von offenen Poren.
Besonders geeignete Kunststoffe für die Formteile sind Polyamide, beispielsweise der Typen PA6, PA66, PA46, PA12, Polysulfone, Polyester und Polycarbonate. Auch Copolymere der entsprechenden Materialien und Mischungen derselben sind möglich. Das gesamte Formteil ist jedoch einstücicig aus dem gleichen chemischen Material aufgebaut.
An die entsprechenden Formteile können Reaktanten gebunden sein.
Besonders geeignete Reaktanten sind:
• Proteine, Proteinderivate und Peptide, z.B. Antikörper, Antigene, Lektine, Heparine, Protein A, Protein G, Enzyme wie Proteasen, Phosphatasen, Glycosidasen, Lipasen, etc.; o Nukleinsäuren, z.B. Oligo- und Polynukleotide, DNA- oder RiMA-Fragmente; • Kohlenhydrate wie Monosaccharide, Disaccharide, Glycogen, Stärke, Dextrane und komplexe Kohlenhydrate;
• Lipide wie Triacylglycerine, Steroide, Phosphoglyceride, Ganglioside;
• Affinitätsliganden, z.B. Chelatbildner, Cibacron Blau; • Effektoren von Enzymen wie Inhibitoren, Aktivatoren, Substrate, Cosubstrate.
Entsprechende Reaktanten können an einem oder mehreren Oberflächen bereichen des Formteils gebunden sein. Es können auch verschiedene Reaktanten an verschiedenen Oberflächenbereichen gebunden sein.
Die Herstellung multifunktioneller Schichten durch mehrfach partielle Aktivierung der Oberfläche des Formteils und deren Bestückung mit unterschiedlichen Reaktanten erlaubt eine Abfolge von aufeinander folgenden Reaktionen im Mikroliterbereich ohne aufwendige Zwischenschritte. So könnte beispielsweise in einer Pipettenspit∑e in der unteren Schicht eine kovalent gebundene Protease Peptide erzeugen, die in der darüber liegenden Schicht durch hydrophobe Bindungen aus der Reaktionslösung entfernt werden und nach Elution im Massenspektrometer untersucht werden können. Dies ist in Figur 10 dargestellt.
Die Reaktanten können kovalent, ionisch, über Komplexbildung oder durch hydrophobe Wechselwirkung gebunden sein. Die Bindung kann unmittelbar erfolgen oder mit Hilfe von Linkern. Das Formteϊl kann beispielsweise als Pipettenspitze, Schlauchstück, Stab, Einzel- oder Mehrfachgefäß, Mikrotiterplatte, Tauchkörperkugel oder Platte ausgebildet sein.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der Formteile. Hierbei wird ein einstückiges Formteil aus Kunststoff an mindestens einem Oberflächen bereich partiell gelöst, so dass ein offenporiger Oberflächenbereich entsteht, der ein dreidimensionales Netzwerk bildet. Dabei kann gleichzeitig, vorher oder nachträglich zur partiellen Lösung des Oberflächenbereiches eine chemische Aktivierung des Oberflächenbereiches erfolgen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Kunststoffoberfläche durch ein flüssiges Reaktionsmedium angelöst wird und durch einen Wechsel des flüssigen Mediums die angelöste Oberflächenstruktur erhalten bleibt bzw. durch Ausfällung eine dreidimensionale Struktur entsteht. Hierdurch erfolgt eine erhebliche Oberflächenvergrößerung, die für die Anbindung von Substanzen benutzt werden kann.
Die genauen Verfahrensbedingungen sind erwartungsgemäß abhängig vom eingesetzten Kunststoff und können durch einfache Experimente für ein gegebenes Material optimiert werden. Soweit nur eine Anlösung der Oberfläche gewünscht wird, sind z.B. für Polyamide besonders geeignete Lösungsmittel gesättigte wässrige Phenollösung oder 85%ige Ameisensäure. Soweit gleichzeitig eine Freisetzung weiterer reaktiver Gruppen erfolgen soll, eignen sich insbesondere Säuren wie Salzsäure (> 2,5 M).
Die Einwirkdauer hängt u.a. ab von dem Oberflächenmaterial, möglicher vorheriger Oberflächenbehandlung und der Temperatur. Sie liegt allgemein im Bereich von 10 sec bis 10 min, bevorzugt im Bereich von 30 sec bis 3 min. Im Falle einer gewünschten Freisetzung weiterer reaktiver Gruppen an der Oberfläche durch Spaltung von Bindungen im Kunststoff betragen diese typischerweise zwischen 1 und 10 h, bevorzugt zwischen 2 und 3 h. Nach Einwirken dieser Reaktionsmedien auf den oder die Oberflächenbereiche erfolgt ein Wechsel der Reaktionsmedienbedingungen. Dies kann erfolgen durch einen Austausch des Reaktionsmediums oder durch Veränderung der Konzentration durch Zusatz weiterer Substanzen.
Im Falle von Formteilen, die zur Aufnahme von Flüssigkeiten geeignet sind (beispielsweise Pipettenspitzen, Reaktionsgefäßen, Mi kro titerplatten, Schläuchen), kann das notwendige Reaktionsmedium in einfacher Weise hineingegeben oder aufgesaugt werden. Im Falle von Tauchkörperkugeln, Stäben, etc. wird der zu behandelnde Oberflächenbereich in das Reaktiαnsmedϊum eingetaucht. Die erfindungsgemäßen Formteile eignen sich zur Analyse und Präparation von Substanzen, insbesondere zur spezifischen Konzentrierung und Probenvorbereitung und zur Anreicherung einer Substanz in einer Probe, zur Abreicherung einer störenden Substanz aus einer Probe, zur Analytmodifikation, insbesondere zur spezifischen Spaltung oder Entfernung von Modifikation wie Phosphaten, Zuckereinheiten, Fettsäureeinheiten.
Beispielsweise kann durch die Technik der Extraktion aus, im Verhältnis zueinander gesehen, größeren Gefäßen und der Elution in wesentlich kleineren Gefäßen, eine Konzentrierung der gewünschten Substanz im Verhältnis der Volumina der Extraktions- zu den Elutionsgefäßen erreicht werden, wie dies in Figur 11 dargestellt ist.
Extraktion aus Volumen Vi = 500 μl Elution aus Volumen V2 = 10 μl
ergibt eine 50fache Konzentrierung.
Figur 1 zeigt einen Längsschnitt durch eine mit 85%iger Ameisensäure aktivierte lon-6,6 Spitze (A: feucht; B: trocken).
Figur 2 zeigt einen Längsschnitt durch ein mit gesättigter, wässriger Phenollösung aktiviertes IMylon-6 Schlauchstück (A: feucht; B: trocken).
Figur 3 zeigt eine Trennung unterschiedlich hydrophober Peptide an einer aktivierten Nylon-6,6 Spitze.
Figur 4 zeigt das Ergebnis einer Entsalzung einer Peptidmischung.
Figur 5 zeigt massenspektroskopische Analysen von humanem Albumin nach Spaltung mit Trypsin, das an eine Nylon-6,6 Spitze gebunden ist.
Figur 6 zeigt massenspektroskopische Analysen der Spaltung eines Phosphopeptides mit alkalischer Phosphatase, die an eine Nylon-6,6 Spitze gebunden ist. Figur 7 zeigt eine massenspektroskopische Analyse eines Glucopeptides vor und nach einer Spaltung mit Peptid-N-Glucosidase F, die an eine Nylon-6,6 Spitze gebunden ist.
Figur 8 zeigt die Ergebnisse einer Entsalzung einer 17-mer-Oligonucleotidlösung mit Hilfe einer aktivierten Nylon-6,6 Spitze.
Figur 9 zeigt die Ergebnisse einer Anreicherung von Phosphopeptiden aus einer Lösung.
Figur 10 zeigt eine Prinzipsskizze, bei der verschiedene Reaktanten auf verschiedene Oberflächenbereiche eines Formteils gebunden sind.
Figur 11 zeigt eine Skizze einer Anwendung der erfindungsgemäßen Formteile, bei der Extraktion und Elution in verschiedenen Volumina erfolgt, um eine Konzentrierung der Substanzen zu erreichen.
Seispiel 1
Aktivierung einer Pipettenspitze
Eine aus Nylon-6,6 bestehende Pipettenspitze wurde durch Anlösen der inneren Wandung mittels Ameisensäure und nachfolgendes Ausfällen des gelösten Nylon-6,6 an der Innenwand durch Verdünnen der nylonhaltigen Lösung mit Wasser aktiviert.
Eine Pipettenspit∑e wurde mit folgenden Schritten behandelt:
a) Aufziehen von 15 μl 85%iger Ameisensäure, b) sofortiges Wachziehen von 4 μl einer gesättigten Watriumchloridlösung zur Verdünnung der Ameisensäure, c) Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min., d) Ausstoßen der Ameisensäure/Natriumchloridlösung und sorgfältiges Spülen mit Wasser.
Eine entsprechend behandelte Pipettenspitze ist in der Figur 1 dargestellt.
Beispiel 2 Aktivierung eines Schlauchteils
2a) Ein Nylonschlauch bestehend aus Nylon-6 wurde durch Zugabe einer wässrigen Phenollösung und nachfolgendes Ausfällen des gelösten Nylon-6 an der Innenwand durch Acetonzugabe behandelt. Die Aktivierung erfolgte wie folgt:
a) Aufziehen von 15 μl einer gesättigten wässrigen Phenollösung, b) Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur, c) Nachziehen von 25 μl Aceton, d) 5 min warten, e) Ausstoßen der Phenol-/ Acetonlösung und mehrfaches Spülen mit Aceton.
Ein entsprechend behandeltes Schlauchstück ist in Figur 2 dargestellt.
2b) Alternativ erfolgte eine Aktivierung des Schlauchstückes durch
a) Aufziehen mit 10 μl 85%iger Ameisensäure, b) Inkubation für 60 sec bei Raumtemperatur, c) Ausstoßen der Ameisensäure und wiederholtes Spülen mit Wasser.
Beispiel 3
Bindung von Protein an Nylon 6,6 Spitzen
Eine Nylon-6,6-Spit∑e wurde mit Dime ylforrnamid, 80%igern Acetonitril und 0,1 M Phosphatpuffer pH = 8,0 absorbanzkontrolliert bei 215 nm bis zu einer maximalen Absorbanzdifferenz von 0,04 gewaschen. Anschließend wurde die Spitze mit einer Lösung von 0,5 mg Hämoglobin/ml Phosphatpuffer 2 Stunden inkubiert. Dann wurde die verbleibende Konzentration des Hämoglobins in der Lösung photometrisch bei 215 nm gemessen und aus der Absorbanzdifferenz die gebundenen Menge berechnet. Unter diesen Bedingungen konnte keine Bindung nachgewiesen werden (0 μg/cm2 Nylonoberfläche in sechs Versuchen). In einem zweiten Experiment wurde eine Nylonspitze zunächst mit 15 μl 85%iger Ameisensäure 2 min bei Raumtemperatur, wie im Beispiel 1 beschrieben, aktiviert. Anschließend wurde wie oben gewaschen. Dann wurde die Spitze - wie oben beschrieben - mit Hämoglobin inkubiert. Aus der Absorbanzabnahme des Hämoglobins bei 215 nm ergab sich aus vier Versuchen eine Bindung von 18,4 μg/cm2 Oberfläche.
In einem dritten Experiment wurde eine Nylonspitze wie oben beschrieben mit Ameisensäure aktiviert. Dann wurde die Spitze mit 2,9 M Salzsäure, 2,5 h bei 37°C inkubiert und wie oben gewaschen. Hämoglobin wurde kovalent an Aminogruppen des Nylons über Polyethyleniminspacer mit Glutaraldehyd gebunden. Die Bindung betrug 26,5 μg/cm2 Oberfläche (aus einer Doppelbestimmung).
Eine vierte Probe wurde wie Probe drei behandelt. An Stelle von Hämoglobin wurde Trypsin kovalent an die Aminogruppen des Nylons gebunden. Die gebundene Menge von 26,8 μg Trypsin/cm2 wurde aus einer Aktivitätsmessung mit fluorogenem Substrat bestimmt.
Beispiel 4
Fraktionierte Trennung von hydrophoben Peptiden ι-6,6 Spitzen (25 μl) wurden mit 85%iger Ameisensäure 30 sec angelöst und die Säure durch mehrfaches Waschen mit Wasser entfernt. Aus humanem Serumalbumin wurde durch Spaltung mit Trypsin eine Mischung definierter Peptide hergestellt. In die aktivierte Spitze wurden 7 μl einer Lösung mit 1,4 μg Peptidrnischung in 20 mM Ammoniumbicarbonat mit einem Zusatz von Trifluoressigsäure einpipettiert und nach 5 min Kontakt∑eit ausgestoßen. Anschließend wurde die Spitze mit 50 μl einer wässrigen, 0,1% Trifluoressigsäurelösung gewaschen. Danach erfolgte die Elution der gebundenen Peptide mit je 10 μl wässriger Acetonitrillösung, wobei der Acetonitrilgehalt von 10 auf 50% schrittweise erhöht wurde. Die Elutionslösung wurde mit MALDI-MS untersucht. Die Sequenzen der Peptide konnten durch Abgleich mit einer Datenbank bestimmt werden. Aus der so erhaltenen Aminosäuresequenz der identifizierten Peptide wurde als Maß für die Hydrophobizität der Peptide der sogenannte "Gravy-Index" berechnet.
Das Verhältnis zwischen "Gravy-Index" und ansteigender Acetonitrilkonzentration ist in Figur 3 dargestellt.
Beispiel 5
Entsalzung einer Peptidmischung
Ein Nylon-6 Schlauchstück wurde wie unter 2b) beschrieben aktiviert. Der aktivierte Nylonschlauch mit einer Länge von 15 mm und einem Innendurchmesser von 1,9 mm wurde auf eine Pipettenspitze gesteckt und intensiv mit Dimethylformamid, 100% Acetonitril und 80% Acetonitril gewaschen. Dann wurde der Schlauch mit 0,l%iger wässriger Trifluoressigsäure äquilibriert und 10 μl einer Peptidmischung (4,8 nmol/ml, 100 mM Natriumchlorid, 50 mM Phosphat, angesäuert mit TFA) pipettiert. Nach 5 min Kontaktzeit wurde die Lösung auspipettiert und der Schlauch mit 10 μl wässriger 0,l%iger TFA gewaschen. Die gebundenen Peptide wurden mit 10 μl 80%igem Acetonitril in Wasser eluiert.
Figur 4A, oben zeigt das MALDI MS Spektrum vor der Entsalzung. Die Figur 4B zeigt das MALDI Spektrum nach Elution der Peptide aus dem Schlauch.
Beispiel 6
Kovalente Bindung von Tηφsin
Eine Nylon-6,6-spit∑e wurde wie folgt aktiviert: 10 μl 80%iger Ameisensäure und danach 1 μl gesättigte Kochsalzlösung wurden in die Spitze pipettiert und nach 2 min ausgestoßen. Dann wurde die Spitze mehrmals mit Wasser gespült. In die so aktivierte Nylonspitze wurden 10 μl einer 2,9 M Salzsäure pipettiert und 2,5 h bei 37°C in einer Wasserdampf gesättigten Atmosphäre inkubiert, um die Säureamidbindungen des Nylons partiell zu hydrolysieren. Wach Waschen der Spitze mit Wasser und 0,1 M Phosphatlösung pH = 8,0 (Pa-Puffer) wurde mit Glutaraldehyd umgesetzt. Dazu wurde die Spitze mit 10 μl 2,5%iger Glutaraldehydlösung (v/v) in Pa-Puffer 18 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach intensivem Waschen mit Wasser und Pa-Puffer erfolgt die Bindung des Spacers Polyethylenimin (PEI) durch Inkubation mit 10 μl einer l%igen PEI- Lösung in Pa-Puffer (w/v) für 1 h bei 37°C. Nach dem Waschen mit Wasser und Pa-Puffer wurden übrig gebliebene Bindungsstellen durch Inkubation bei 4°C für mindestens 2h, besser über Nacht, mit 10 μl einer Aminosäuremischung aus je 0,5 mg Phenylalanin, Leucin, Arginin, Glycin und Asparaginsäure / 1 ml Pa-Puffer inkubiert. Dann erfolgt eine zweite Inkubation mit Glutaraldehyd (2,5% in Pa- Puffer, 18 min bei Raumtemperatur). Nach intensivem Waschen mit Wasser und Pa-Puffer werden 10 μl einer Trypsinlösung (lmg/ml Pa-Puffer) in die Spitze pipettiert und 23 h bei 4°C inkubiert. Dann erfolgt nach Waschen mit Pa-Puffer die Reduktion der gebildeten Doppelbindungen zwischen den Aldehydgruppen des Glutaraldehyds und den Aminogruppen des Nylons, des PEI bzw. des Trypsins mit einer 0,1 M NaBH4-Lösung in Pa-Puffer (30 min bei Raumtemperatur). Die Nylonspitze wurde zum Schluss mit Wasser, Pa-Puffer, 1 M NaCI-Lösung in Pa-Puffer, 0,5% Octylglycosid in Pa-Puffer und Pa-Puffer gewaschen. Die gebundene Trypsinmenge wurde mit dem fluorogenen Trypsinsubstrat Bz-Arg-AMC*HCI bestimmt. Dazu wurden über einen Zeitrum von je 2 min jeweils 10 μl aus einem Gesamtvolumen von 150 μl einer Substratlösung (25 μM Bz-Arg-AMC-HCI in 20 mM NH4HCO3, das 0,5% n- Octylglycosid enthält) mit dem CyBi-Well Multipipettor aufgezogen und unter Schütteln auspippetiert. Das gebildete AMC wurde bei 360/440 nm mit einem Fluores∑enzreader gemessen und mit mitgeführten ÄMC Eichwerten verglichen. Der Test ergab eine gebundene Trypsinmenge von 5,9 μg.
Die Spitze wurde wiederholt zum Verdau unterschiedlich konzentrierter Humanserumalbuminlösungen (HSA) eingesetzt. Die gespaltenen Peptide wurden im MALDI-MS nachgewiesen. Figur 5 zeigt zwei MALDI-Spektren von HSA-Peptiden nach jeweils 10 min Trypsinverdau. Figur 5A zeigt das Spaltungsergebnis von humanem Albumin bei der ersten (oben) und Figur 5B bei der sechsten Benutzung. Die Spitzen sind also für mehrfachen Einsatz hinreichend stabil. Beispiel 7
Spaltung eines Phosphopeptids mit alkalischer Phosphatase
An eine NyIon-6,6 Spitze, aktiviert durch Anlösen mit 10 μl 85%iger Ameisensäure 30 sec und Ausfällen mit Wasser, wurde gereinigte alkalische Phosphatase (AP) aus Kälberdarm mit geringen Änderungen der Prozedur analog Trypsin (Beispiel 6) kovalent gebunden. Nach der zweiten Glutaraldehydaktivierung wurde die Spitze intensiv mit 20 mM NaHCO3-Lösung an Stelle des Phosphatpuffers gewaschen. Die AP wurde zur Bindung als Lösung von 1.38 mg/ml in 60 mM NaHCO3 eingesetzt. 10 μl dieser Lösung wurden in die Nylonspitze pipettiert und 23 h bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die AP-Lösung auspipettiert und später mit den Waschlösungen vereinigt. Dann wurde die Spitze mit 8 x 10 μl 25 mM Diethanolamin/HCI, pH = 9,8 (DEA) gewaschen. In den vereinigten Waschlösungen wurde die Aktivität der AP mit p- Nitrophenylphosphat als Substrat in 1 M DEA, pH = 9,8 photometrisch bestimmt und mit der eingesetzten AP-Menge verglichen. Aus der Abnahme der AP-Menge wurde in Kenntnis der spezifischen Aktivität auf die an die Spitze gebundene Menge AP von 6,5 μg geschlossen. Die Reduktion der Doppelbindungen mit NaBH4 erfolgte in 0,1 M NaHC03. NaHC03 wurde auch für die nachfolgenden Waschschritte an Stelle von Phosphatpuffer eingesetzt. Die Aktivität der gebundenen AP in der Spitze wurde durch Spaltung eines Phosphopeptids mit Hilfe der MALDI-MS untersucht. 8 μl einer Lösung von 1,6 μg eines Phosphopeptids in 20 rnM DEA pH = 9,8 wurden in die Spitze pipettiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das MALDI Spektrum der negativen Ionen nach 5 min Inkubation zeigt, dass das Phosphopeptid (rnonoisotopische Masse 1238,35 Da) nicht mehr nachweisbar ist. Das Erscheinen eines neuen Peaks (rnonoisotopische Masse 1158,35 Da) mit einer um 80 Da reduzierten Masse zeigt die Abspaltung einer Phosphatgruppe (Figur 6).
Beispiel 8
Spaltung eines Glucopepiids Eine Nylon-6,6 Spitze - analog Beispiel 7 - wurde wie folgt behandelt:
- Inkubation mit 10 μl 2,9 M HCI (2,5 h 37°C),
- Glutaraldehydbindung (10 μl 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Pa-Puffer pH = 8,0, 18 min bei Raumtemperatur), - Bindung des PEI-Spacers (10 μl l%ige PEI-Lösung in 0,1 M Pa-Puffer 1 h bei 37°C),
- Blockung mit einer Aminosäuremischung (10 μl einer Mischung aus je 0,5 mg Phenylalanin, Leucin, Arginin, Glycin und Asparaginsäure / 1 ml Pa-Puffer, 2 h bei 4°C), - Glutaraldehydbindung (wie oben)
Hieran wurde PNGase F der Firma Boehringer (10 μl mit 0,2 U/ml, 23 h bei 4°C) gebunden. Danach erfolgte die Reduktion mit NaBH4 und Waschungen wie im Beispiel 6 für Trypsinbindung beschrieben. Die Nylonspitze wurde nach jeder Inkubation gründlich mit Pa-Puffer gewaschen.
Der Nachweis der Bindung von enzymatisch aktiver PNGase F wurde durch Deglycosylierung eines Glycopeptides geführt, das aus einem tryptischen Verdau von alkalischer Phosphatase chromatographisch gereinigt wurde.
10 μl einer Lösung von 0,5 μg des Glycopeptids in 10 mM Tris/HCI pH = 8,3 wurden in die Nylonspitze pipettiert und 20 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Figur 7 zeigt das Massenspektrum vor (7A) bzw. nach der Inkubation (7B). Die Kohlenhydratreste sind abgespalten.
Beis iel 9
Entsalzung eines Oligonucleotids
Eine, wie im Beispiel 1 beschriebene, aktivierte Nylonspitze wurde mit einer wässrigen 0,1% TFA-Lösung äquilibriert. Dann wurden 10 μl einer Lösung eines
17-mer Oligonucleotids (25 pmol/lμl) in 5 mM EDTA, 100 mM NaCI, 1 mM MgCI2 und 10% Glycerol, pH = 5,2 in die Spitze pipettiert. Nach 10 min Kontaktzeit wurde die Lösung ausgestoßen und die Spitze mit 3 x 10 μl wässriger 0,1% TFA-Lösung und 3 x 10 μl 0,1% TFA / 40% Acetonitril-Lösung gewaschen. Die Elution erfolgte mit 6 μl einer Lösung von 50% Acetonitril 50 mM NH4OH pH = 9,0. Figur 8 zeigt die MALDI Spektren der Ausgangslösung (A) und (B) nach Entsalzung an der Nylonspitze.
Beispiel 10
Herstellung eines Moduls zur Anreicherung von Phosphopeptiden aus einer Peptidmischung
1) Herstellung des Moduls
a) Aktivierung mit Phenol und Salzsäure
Das Modul, das aus acht Nylon-6 Stäben besteht, wurde zunächst mit Chloroform entfettet und danach 15 mm tief für 10 min in eine gesättigte wässrige Phenollösung getaucht.
Anschließend wurde das angelöste Nylon durch Eintauchen für 5 min in 100% Aceton an den Stäben ausgefällt und danach mehrmals gründlich mit 100% Ethanol gespült.
Nach dem Spülen erfolgte eine weitere Freisetzung reaktiver Gruppen durch Inkubation für 2,5 Stunden bei 37°C mit 2,9 M HCI. Anschließend wurde mehrmals gründlich mit Wasser gewaschen.
b) Aktivierung mit Bisoxiran
Das zuvor mit Phenol und Salzsäure aktivierte Modul wurde für 20 h bei 80°C unter ständigem Schütteln in 10 ml einer Lösung aus:
• 9 ml Bisoxiran • 1 ml 100% Ethanol o 1 ml 25 mM wässrigen I atriumcarbonatlöusng (pH= 11)
inkubiert und anschließend mehrmals sorgfältig mit Wasser gewaschen. a) Immobilisation von Iminodiessigsäure (IDA)
Das zuvor mit Bisoxiran aktivierte Modul wurde für 20 h bei 50°C unter ständigem Schütteln in 10 ml einer gesättigten Lösung aus:
• l g IDA gelöst in • 10 mL einer 25 mM wässrigen Natriumcarbonatlösung (pH = 12)
inkubiert und anschließend wiederum gründlich mit Wasser gewaschen.
a) Bindung von Kupfer-(II)-Ionen
Das Modul mit immobilisiertem IDA wurde für 1 h bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln in 10 ml einer Lösung aus: • 10 mM Kupfer-(II)-Chlorid gelöst in o 50 mM Na-Acetatpuffer (pH = 5)
inkubiert, wobei die 10 ml Lösung nach 30 min gegen 10 ml der gleichen Lösung ausgetauscht wurde.
2) Einsatz des Moduls zur Phosphopeptidanreicherung
Ein Nylonstab des so hergestellten Moduls wurde etwa 10 min in 300 μl einer Lösung aus tryptischen Peptiden von Humanserumalbumin (1,28 nmol) und einem Phosphopeptid (1,8 nrnol) in 50 mM MES-Puffer (N- mαpholinoethansulfonsäure) pH = 5,5 mit 10% Acetonitril (ACN) getaucht. Der Stab wurde dreimal mit je 170 μl 45,5 mM MES-Puffer pH = 5#5 in 40% ACM und zweimal mit Wasser gewaschen. Danach wurde mit 30 μl einer 1% rJH4OH- Lösung in 40% ACN eluiert.
Figur 9 zeigt die negativen MALDI Spektren A) der Mischung von Phosphopeptid mit HSA-Peptiden und B) nach Elution vom Metall-Chelat-Nylonstab.

Claims

Patentansprüche
1. Einstückiges Formteil aus Kunststoff zur Analyse und Präparation von Substanzen mit mindestens einem Oberflächenbereich und einem Innenbereich, wobei der mindestens eine Oberflächenbereich ein offenporiges, dreidimensionales Netzwerk ist.
2. Formteil gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Innenbereich keine offenen Poren aufweist.
3. Formteil nach einem der Ansprüche 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass der Kunststoff ausgewählt wird aus Polyamiden, Polysulfonen, Polyestem, Polycarbonaten sowie Copolymeren und Mischungen derselben.
4. Formteil nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass an den mindestens einem Oberflächenbereich mindestens teilweise Reaktanten gebunden sind.
5. Formteil nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktanten ausgewählt sind aus Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, Affinitätsliganden, Effektoren von Enzymen.
6. Formteil nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktanten über reaktive Seitengruppen des Kunststoffs gebunden sind.
7. Forrnteil nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Formteil als Pipettenspitze, Mikroplatte, Schlauchstück, Stab, Einzeloder Mehrfachgefäß, Tauchkörperkugel oder Platte ausgebildet ist.
8. Verfahren zur Herstellung eines Formteils nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem ein einstückiges Formteil aus Kunststoff an mindestens einem Oberflächenbereich partiell gelöst wird, um mindestens einen offenporigen Oberflächenbereich zu erzeugen, der ein dreidimensionales Netzwerk ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet dass, vor, gleichzeitig oder nachträglich zur partiellen Lösung des Oberflächenbereiches eine chemische Aktivierung des Oberflächenbereiches erfolgt.
10. Formteil erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 8 oder 9.
11. Verwendung eines Formteils nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Analyse und Präparation von Substanzen.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Formteil zur Identifikation und Quantifikation von Analyten, insbesondere zur spezifischen Konzentrierung und Probenvorbereitung eingesetzt wird.
13. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Formteil zur Anreicherung einer Substanz in einer Probe, zur Abreicherung einer störenden Substanz aus einer Probe, zur Analytmodifikation, insbesondere zur spezifische Spaltung oder Entfernung von Modifikation wie Phosphatgruppen, Zuckereinheiten, Fettsäureeinheiten eingesetzt wird.
PCT/EP2004/051416 2003-07-10 2004-07-08 Formteil zur analyse und präparation von substanzen in mikroliter- und submikroliter-volumina und verfahren zu seiner herstellung WO2005005047A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/564,190 US7824622B2 (en) 2003-07-10 2004-07-08 Molded part for the analysis and preparation of substances in microliter and submicroliter volumes and process for the preparation thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03015777A EP1495810B1 (de) 2003-07-10 2003-07-10 Formteil zur Analyse und Präparation von Substanzen in Mikroliter- und Submikroliter-Volumina und Verfahren zu seiner Herstellung
EP03015777.0 2003-07-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005005047A1 true WO2005005047A1 (de) 2005-01-20

Family

ID=33442779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/051416 WO2005005047A1 (de) 2003-07-10 2004-07-08 Formteil zur analyse und präparation von substanzen in mikroliter- und submikroliter-volumina und verfahren zu seiner herstellung

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7824622B2 (de)
EP (1) EP1495810B1 (de)
AT (1) ATE392951T1 (de)
DE (1) DE50309687D1 (de)
WO (1) WO2005005047A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7824622B2 (en) 2003-07-10 2010-11-02 Cybio Ag Molded part for the analysis and preparation of substances in microliter and submicroliter volumes and process for the preparation thereof

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3317422B1 (de) 2015-07-01 2019-08-28 Leyser Lab GmbH Diagnostischer kit für die analyse der viskoelastizität sowie dessen verwendung
CA3018777C (en) * 2016-04-15 2023-08-29 Dynabyte Informationssysteme Gmbh Pipette tip and uses and methods thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998037949A1 (en) * 1997-02-26 1998-09-03 Millipore Corporation Cast membrane structures for sample preparation

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4282131A (en) * 1980-02-08 1981-08-04 Chapman Enterprises Corp. Car undercoating composition
US6416716B1 (en) * 2001-04-20 2002-07-09 Ashok Kumar Shukla Sample preparation device with embedded separation media
GB2399084B (en) * 2002-07-30 2007-01-31 Univ Liverpool Porous beads and method of production thereof
DE50309687D1 (de) 2003-07-10 2008-06-05 Cybio Ag Formteil zur Analyse und Präparation von Substanzen in Mikroliter- und Submikroliter-Volumina und Verfahren zu seiner Herstellung

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998037949A1 (en) * 1997-02-26 1998-09-03 Millipore Corporation Cast membrane structures for sample preparation

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7824622B2 (en) 2003-07-10 2010-11-02 Cybio Ag Molded part for the analysis and preparation of substances in microliter and submicroliter volumes and process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US7824622B2 (en) 2010-11-02
US20060275176A1 (en) 2006-12-07
DE50309687D1 (de) 2008-06-05
EP1495810A1 (de) 2005-01-12
ATE392951T1 (de) 2008-05-15
EP1495810B1 (de) 2008-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3688527T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur behandlung einer flüssigkeit.
DE69432791T2 (de) Verfahren und massenspektrometer zur desorption und ionisierung von analyten
EP1214406B1 (de) Verfahren zum anbinden von nukleinsäuren an eine festphase
DE69531667T2 (de) Festphasen, spezifisch für biologische reaktionen, ihre herstellung und anwendung
EP2084280B1 (de) Integriertes mikrofluidisches bauteil zum aufreinigen von analytmolekülen sowie verfahren zum aufreinigen
US20070017870A1 (en) Multicapillary device for sample preparation
EP0616639A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren
WO2009016431A1 (en) Sample preparation method and apparatus
DE112004000250T5 (de) Probenaufbereitungsplatte für die Massenspektrometrie
Turoňová et al. Application of microextraction in pipette tips in clinical and forensic toxicology
KR20040054609A (ko) 유전자 발현 프로파일을 단백질 발현 프로파일과연관시키는 방법
EP2252410B1 (de) Oberflächenmodifikation
WO2012062753A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur isolierung und reinigung von doppelsträngigen nukleinsäuren
EP1495810B1 (de) Formteil zur Analyse und Präparation von Substanzen in Mikroliter- und Submikroliter-Volumina und Verfahren zu seiner Herstellung
DE602004002888T2 (de) Vorrichtung und Verfahren zum Sanieren und Entsalzen von biologischen Proben
CN107297086B (zh) 一种有机整体小柱的制备及有机整体小柱和应用
EP1262759B1 (de) Mikroplatte zum Bearbeiten von Proben
AU2002359110A1 (en) Machine and method for processing biomolecules
DE10018788B4 (de) Prozessieren von Proteinen aus Gelen für massenspektrometrische Analysen
WO2008106960A1 (de) Vorrichtung zur aufnahme, behandlung und aufbewahrung kleinvolumiger proben
WO2001046686A9 (de) Chromatographiematerial und verfahren unter verwendung desselben
DE102008050588A1 (de) Monolithische Säule mit immobilisiertem monomeren Avidin zur Anreicherung und Identifizierung biotinylierter Spezies
DE19842785A1 (de) Chemisch-modifizierte, poröse Materialien mit elektroneutraler, hydrophiler Außenoberfläche
DE10053553A1 (de) Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen
Shahgholi et al. Electrospray mass spectrometric detection of chitobiose in enzyme hydrolysates of marine phytoplankton

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006275176

Country of ref document: US

Ref document number: 10564190

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase
WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10564190

Country of ref document: US