WO2004092364A1 - ジャーミン様タンパク４遺伝子プロモーター、およびその利用 - Google Patents

ジャーミン様タンパク４遺伝子プロモーター、およびその利用 Download PDF

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WO2004092364A1
WO2004092364A1 PCT/JP2004/005161 JP2004005161W WO2004092364A1 WO 2004092364 A1 WO2004092364 A1 WO 2004092364A1 JP 2004005161 W JP2004005161 W JP 2004005161W WO 2004092364 A1 WO2004092364 A1 WO 2004092364A1
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dna
plant
promoter
gene
cell
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PCT/JP2004/005161
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English (en)
French (fr)
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Hironori Mano
Hiromi Higo
Kayo Tsuruya
Lisa Monna
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Plant Functional Genomics Co., Ltd.
Plant Genome Center Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8227—Root-specific

Definitions

  • Germin-like protein 4 gene promoter and its use
  • the present invention relates to a promoter for introducing a foreign gene into a plant and specifically expressing the gene in a root. More specifically, the present invention relates to a method for specifically expressing a foreign gene in roots using the promoter region of rice germin-like protein 4 gene (GER4) or a single tone thereof.
  • GER4 rice germin-like protein 4 gene
  • roots In addition to supporting plants, roots play a role in absorbing and transporting water and nutrients, synthesizing plant hormones, or accumulating nutrients. Roots are also sites of damage from nematodes and pathogens and stresses such as flooding, drought, malnutrition and overnutrition.
  • the appropriate gene in the root of the plant By expressing the appropriate gene in the root of the plant, it can grow on nematode-, disease-, flood-, and drought-resistant plants, or in soils that are deficient in certain nutrients or in excess soil. It is possible to produce plants. In addition, plants that can efficiently absorb harmful substances such as cadmium can be used for soil purification. Alternatively, it has a wide range of applications for expressing foreign genes in roots, such as nutritional modification of root vegetables and production of raw materials such as pharmaceuticals and biodegradable plastics, and is highly useful.
  • Ci MV cauliflower mosaic virus
  • the 35S promoter is strong but lacks tissue specificity and is not necessarily It is not always suitable for producing optimally transformed plants. For example, abnormal expression may occur due to expression at an unnecessary site, or undesired traits such as gene silencing may occur due to excessively high expression intensity. It is also desirable not to introduce unnecessary traits when producing recombinant crops, and promoters that allow the expression of target genes in non-necessary tissues have great applications in plants. It will be restricted.
  • Non-Patent Documents 1 to 13 and 17 to 21 Several genes are known to be expressed mainly in roots of plants (see Non-Patent Documents 1 to 13 and 17 to 21), but promoters that specifically control gene expression in plant roots are not known. There are few types in the prior art (see Patent Literatures 1 to 3 and Non-Patent Literatures 14 to 16, 22, and 23), and their specificity is low at present.
  • Non-Patent Document 1 the rice RCc2 gene was found to be specifically expressed in roots by Northern analysis, but when the upstream region of the RCc2 gene was used as a promoter, the exogenous gene was converted to the root division region. , And expressed in the vascular bundle of leaves. As in this example, even if a gene that expresses root-specific expression is obtained by Northern analysis or the like, it is not easy even for those skilled in the art to obtain a part of the promoter that causes root-specific expression of a foreign gene.
  • Jarmin is isolated as a protein that appears specifically during germination of wheat and is thought to have oxalate oxidation activity, but its function is unknown.
  • Germin-like protein is a generic term for proteins that have homology to germin. Its expression pattern is different from germin, has no oxalate oxidizing activity, and its function is unknown.
  • Germin and germin-like proteins have been isolated from many plants such as wheat, barley, rice, Arabidopsis, morning glory, tobacco, potato, and tomato, and their expression site depends on genes such as whole shoots, leaves, stems and roots. Various.
  • Non-Patent Documents 24 to 34 there are environmental stresses (salts, heavy metal ) And those whose expression is increased by infection with a pathogenic bacterium, or whose expression shows a potentian rhythm (see Non-Patent Documents 24 to 34).
  • a plurality of germin and germin-like proteins have been isolated from rice (see Non-Patent Document 35), and the coding region of the gene isolated by the present inventors is a germin-like protein of rice. 4 (GER4: germin-like protein 4), with high homology (95%), but no report has been made on its expression mode or gene function.
  • Patent Document 1 U.S. Patent Application Publication No. 2001/0016954
  • Patent Document 2 U.S. Patent No. 6271437
  • Non-Patent Document 1 Xu, Y., Buchholz, W. G., DeRose, RT., And Hall, TC.
  • Non-Patent Document 2 Yamaguchi, IJ, and Futsuhara, Y., "Characterizatio and expression of GASR1, a root-specific GASTl-like protein in rice", Rice Genet. Newsl., Vol. 14, p. 150 -152, 1997
  • Non-Patent Document 3 Tsay, YF, Schroeder, JI, Feldmann, K. ⁇ , and Craw ford, NM, ⁇
  • Non-Patent Document 4 John, 1, ⁇ , Held, ⁇ . Urt., Wurtele, ⁇ . S., and Colbert, J. ⁇ ., “Isolation and characterization of root-preferential cDNA clones from Zeam mays.” , J. Cell Biochem., 15A, p. 133, 1991
  • Non-Patent Document 5 John, I., Wang, H., Held, BM, Wurtele; ES, and Colbert, JT, ⁇ An mRNA that specifically accumulates in maize roots del ineates a novel subset of developing cortical cellsj, Plant Mol. Biol.,
  • Non-Patent Document 7 Conkling, MA, Cheng, CL, Yamamoto, YT, and Goodman, HM, "Isolation of transcriptionally regulated root-specific genes from tobacco", Plant Physiol., Vol. 93, p. 1203 -1211, 1990
  • Non-Patent Document 8 Lerner, D.R. and Raikhel, N.V., ⁇ Cloning and Characterization of Root-Specific Barley LectinJ, Plant Physiol., Vol. 91, p. 124-129, 1989
  • Non-Patent Document 9 Evans, LM, Swinhoe, R., Gatehouse, J.A., and Boulter,
  • Non-Patent Document 10 Yazaki, K., Matsuoka, ⁇ ., Shinomura, ⁇ ., Bechthold, A. and Sato, F., ⁇ A Novel Dark-Inducible Protein, LeDI-2, and Its Invol vement in Root-Specific Secondary Metabolism in Lithospermum erythororniz onj, Plant Physiol., Vol. 125, p. 1831-1841, 2001
  • Non-Patent Document 11 Belouchi, A., Cellier, M., Kwan, T., Saini, HS, Lero ux, G., and Gros, P., "The macropharge-specific membrane protein Nra mp controlling natural resistance to infections in mice has homologous ex pressed in the root system of plantj, Plant Mol. Biol., Vol. 29, p. 1181-1196, 1995
  • Non-Patent Document 1 2 Luschnig, C., Gaxiola, RA, Grisafi, P., and Gerald, RF, ⁇ EIR1, a root-specific protein involved in auxin transport, is required for gravitropism in Arabidopsis thalianaj, Genes & Dev., Vol. 12, p. 2175-2187, 1998 (Non-Patent Document 13) de Pater, BS and Schilperoort, .A, ⁇ Structure and expression of root-specific rice genej, Plant Mol.Biol., Vol. 18, p. 161-164, 1992
  • Non-patent Document 14 Taylor, BH and Scheuring, CF, ⁇ A molecular marker for lateral root initiation: The RSI-1 gene of tomato (Lycopersico nesculentum Mill) is activated in early root primordialj, Mol.Gen. Gen. et., Vol. 243, p, 148-147, 1994
  • Non-Patent Document 15 Yamamoto, Y. ⁇ ., Taylor, CG, Acedo, G. ⁇ ., Cheng, CL, and Conkling, ⁇ . ⁇ ., ⁇ Characterization of cis-acting sequence s regulating root-specific gene expression in tobaccoj, The Plant Cell, Vol. 3, p. 371-382, 1991
  • Non-Patent Document 16 Cho, H.-T. and Cosgrove, DJ, "Regulation of Route Hair Initiation and Expansin Gene Expression in ArabidopsisJ, The Plan t Cell, Vol. 14, p. 3237-3253, 2002 Year
  • Non-Patent Document 17 Choi, DW, Song, JY, Kwon, YM and Kim, SG, ⁇ Cha racterization of a cDNA encoding a proline-rich 14 kDa protein in develop ing cortical cells of the roots of bean (Phaseolus vulgaris) seedlings, Plant Mol. Biol., Vol. 30, No. 5, p. 973-982, 1996
  • Non-Patent Document 18 Held, BM, John, I, Wang, H., Moragoda, L., Tirimanne, TS, Wurtele, ES and Colbert T., "Zrp2: a novel maize gene whose mRNA accumulates in the root cortex and mature stems. ", Plant Mol. Biol., Vol. 35, No. 3, p. 367-75, 1997
  • Non-Patent Document 19 Bogusz, D., Appleby, CA, Landsmann, J., Dennis, ES, Trinick, MJ and Peacock, WJ, "Functioning haemoglobin genes in non-nodulating plants", Nature, Vol. 331, Vol. 6152, p. 178-80, 1988
  • Non-Patent Document 20 Montoliu, L., Rigau, J. and Puigdomenech, P., ⁇ A tand em of alpha—tubulin genes preferentially expressed in radicular tissues from Zea maysj, Plant Mol. Biol., Vol. 14, No. 1, p. 1—15, 1989
  • Non-Patent Document 21 Montoliu, L., Puigdomenech, P. and Rigau, J., “The Tub alpha 3 gene from Zea mays: structure and expression in dividing pi ant tissues”, Gene ⁇ Vol. .94, No. 2, p. 201-207, 1990
  • Non-Patent Document 22 Miao, GH, Hirel.B., Marsolier, MC, Ridge, RW and Verma, DP, ⁇ Ammonia-: regulated expression of a soybean gene encoding cytosolic glutamine synthetase in transgenic Lotus corniculatus '', The Plant Cell, Vol. 3, No. 1, p. 11-22, 1991
  • Non-Patent Document 23 Bogusz, D., Llewellyn, D., Craig, S., Dennis, ES, Appleby, CA and Peacock, WJ, ⁇ Nonlegume hemoglobin genes retain org an-specific expression in heterologous transgenic plants. ", The Plant Ce 11, Vol. 2, p. 633-641, 1990
  • Non-Patent Document 24 Carter, C., Graham, RA and Thornburg, RW, "Ara bidopsis tha liana contains a large family of germin-like proteins: characterization of cDNA and genomic sequences encoding 12 unique family members s. ", Plant Mol. Biol., Vol. 38, No. 6, p. 929-43, 1998.
  • Non-Patent Document 25 Membre, N., Berna, A., Neutelings, G., David, A., David,
  • Non-Patent Document 2 6 Staiger, D., Apel, K. and Trepp, G. al., "The At g er3 pr omoter confers circadian clock-regulated transcription with peak expressi on at the beginning of the night. ", Plant Mol. Biol., Vol. 40, No. 5, p. 873-82, 1999
  • Non-Patent Document 27 Ono, M., Sage-Ono, K., Inoue, ⁇ ⁇ , Karaada, H.
  • Non-Patent Document 28 Hurkman WJ, Tao, PH and Tanaka CK, ⁇ Germin-1 ike polypeptides increse in Barley Roots during salt stress '', Plant Physiol., Vol. 97, p. 366-374, 1991
  • Non-Patent Document 29 Hurkman WJ and Tanaka C. K., ⁇ Effect of Salt Stres s on Germin Gene Expression in Barley Roots. '', Plant Physiol., Vol. 110, No. 3, p. 971-977. , 1996
  • Non-Patent Document 30 Dumas, ⁇ ⁇ , Freyssinet, G. and Pallett, KE, “Tissue-Specific Expression of Germin-shi ike Oxalate Oxidase during Development and Fungal Infection of Barley Seedlings.”, Plant Physiol. , Vol. 107, No. 4, p. 1091-1096, 1995
  • Non-Patent Document 3 Hurkman WJ and Tanaka CK, ⁇ Germin Gene Express! On Is Induced in Wheat Leaves by Powdery Mildew Infection. '', Plant Physiol., Vol. 111, No. 3, p. 735-739 , 1996
  • Non-Patent Document 32 Michalowski, CB and Bohnert HJ, ⁇ Nucleotide sequence of a root-specific transcript encoding a germin-like protein from t he halophyte Mesembryanthemum crystalliumj, Plant Physiol., Vol. 100, p. 537 -538, 1992
  • Nec tarin I is a novel, soluble germin-like protein expressed in the nectar of Nicotiana sp. '', Plant Mol.Biol., Vol. 41, No. 2, p. 207-16, 1999
  • Non-Patent Document 34 Carter, C. and Thornburg, R.W., ⁇ The nectary-speci fic pattern of expression of the tobacco Nectarin I promoter is regulated by multiple promoter elements. '', Plant Mol. Biol., Vol. 51, o. 4, p. 4
  • Non-Patent Document 35 by embre, N. and Bernier, F., ⁇
  • the rice genome expresses at least six different genes for oxalate oxidase / germm-like proteins (Accession Nos.AF032971, AF032972, AF032973, AF032974, AF032975 , and AF0 32976) (PGR98-021) J, Plant Physiol., Vol. 116, No. 2, p. 868, 1998 Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a promoter useful for specifically controlling gene expression in plant roots, an expression vector containing the promoter, a transformed plant or plant containing the expression vector, and a method for producing the same. Is to provide.
  • the present inventors isolated the 5 ′ upstream region of the germin-like protein 4 (probable germin protein 4; GER4) gene that is specifically expressed in the root from rice roots, and analyzed the DNA in this upstream region. As a result of repeated studies, the inventors succeeded in specifying a DNA sequence having a promoter function of the germin-like protein 4 gene, and completed the present invention. By utilizing the promoter isolated by the present inventors, it is possible to actually express a foreign gene in a root-specific manner.
  • the germin-like protein 4 probable germin protein 4
  • the present invention relates to the following [1] to [15].
  • DNA for use as a promoter including the DNA of (a), (b) or (c) above, or
  • a transformed cell comprising the vector according to any one of [5].
  • a transformed plant which is a progeny or clone of the transformed plant of [9].
  • [5] A method comprising the step of introducing the vector according to any of [5] into a plant cell, and regenerating a plant from the plant cell.
  • (13) a method for expressing a foreign gene in a plant root, which comprises a step of introducing the DNA according to (2) or the vector according to (4) or (5) into cells of the plant Method.
  • a method comprising determining that the test compound modulates the promoter activity of the DNA according to [1], when the test compound changes the expression level of the reporter gene.
  • the present inventors have prepared cDNA libraries from various parts of rice. 3334 clones were isolated from one cDNA library created from roots, and 8875 clones were isolated from one cDNA library created from tissues other than roots and sequenced.
  • a clone was selected that appeared three times in the root-derived library, and never appeared in any other non-root-derived library, and was sequenced using the BLAST program based on the GenBank / EMBL database. Homozygous search revealed that this clone matched the sequence predicted to be the germin protein 4 (GER4) gene. The expression of the germin-like protein 4 gene was examined by reverse transcription PCR and found to be root-specific.
  • GER4 germin protein 4
  • the present invention first provides a germin-like protein 4 gene promoter (DNA).
  • the promoter of the present invention can express a downstream gene in a root-specific manner, and is extremely useful.
  • the nucleotide sequence of the germin-like protein 4 gene promoter DNA isolated by the present inventors is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention more specifically provides a promoter (a DNA having a promoter activity) containing any one of the following DNAs (a) to (c).
  • the “promoter” of the present invention means a DNA containing a specific base sequence necessary for the initiation of the synthesis (transcription) of mRNA whose DNA is type III. In addition to DNA that exists in nature, it also means artificial DNA such as recombination. Includes DNA created by various modifications. Further, the promoter of the present invention is preferably an expression-inducible promoter in a plant cell.
  • the present inventors obtained a fragment containing the 2072 bp sequence shown in SEQ ID NO: 2 from the genomic sequence existing upstream of the rice jammin-like protein 4 gene by PCR to obtain the promoter of the present invention. did. Downstream of this fragment, a chimeric gene construct linked with a green fluorescent protein (GFP) gene was created as a reporter gene capable of easily monitoring gene expression in plants, and the chimeric gene construct was constructed via an agrobacterium. When introduced into rice and Arabidopsis thaliana plants, the expression of the GFP gene was not detected in the Arabidopsis thaliana plants, and the expression of the GFP gene was specifically observed in the roots of rice.
  • GFP green fluorescent protein
  • this fragment was progressively deleted from the upstream side, and a chimeric gene construct in which each fragment was linked to the GFP gene was introduced into rice and Arabidopsis thaliana plants and analyzed. It was determined that a fragment consisting of at least 627 bp (fragment Z consisting of the sequence from position 1446 to position 2072 of the sequence listing, SEQ ID NO: 1) sufficiently functions for induction. That is, the present invention provides a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, or a DNA containing the DNA and having a promoter activity.
  • the promoter of the present invention comprises not only a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 but also a nucleotide sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and DNA that has the ability to function as a promoter, or the base sequence of SEQ ID NO: 1 with a base sequence that increases translation efficiency added to its 3 'end or its 5' end without losing promoter activity Includes those missing.
  • the number of bases into which a mutation such as deletion or substitution is introduced is not particularly limited as long as the mutated DNA has promoter activity, but is usually within 20 base pairs, preferably 10 base pairs. Within 5 base pairs, most preferably within 3 base pairs.
  • the plant promoter of the present invention includes a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has the ability to function as a plant promoter.
  • stringent conditions are particularly limited The conditions are, for example, 42 ° C., 2 ⁇ SSC (300 mM NaCl, 30 mM citrate), 0.1% SDS, preferably 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS. The conditions are more preferably 65 ° C., 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA with higher homology can be obtained more efficiently as the temperature is increased. Several factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. It is.
  • the present invention provides a DNA having a structure in which a foreign gene and a terminator are operably linked downstream of the promoter of the present invention.
  • a foreign gene is not particularly limited, and a desired gene can be used.
  • the terminator of the present invention generally refers to a plant-derived terminator (plant terminator), and is a DNA sequence arranged adjacent to a promoter region that controls plant tissue-specific expression of the present invention.
  • plant terminator a terminator derived from a force reflower mosaik virus or a terminator derived from a nopaline synthase gene can be exemplified, but if it has a function as a terminator, it is particularly preferable to use these. Not restricted.
  • operably linked refers to a state in which a foreign gene downstream of the promoter is linked to the promoter so as to receive transcription from the promoter, or the foreign gene is linked to the promoter by a terminator. Refers to a state in which a foreign gene is linked to a terminator so that expression is terminated. "Functionally linked" a promoter and a foreign gene or terminator can be easily performed by those skilled in the art using general genetic engineering techniques.
  • a DNA having one promoter activity which is composed of the DNA described in any one of (a) to (c) above, can be mentioned.
  • the promoter activity is appropriately evaluated by those skilled in the art by a method known in the art (for example, a method of measuring the expression of the gene using a reporter gene described below as an index).
  • the present invention further provides a vector containing the above-mentioned promoter of the present invention, a vector containing a gene insertion site and a terminator downstream of the promoter of the present invention, and a vector containing the above-mentioned DNA of the present invention.
  • the vector of the present invention is usually one in which the promoter of the present invention is inserted into a vector that can replicate in plant cells.
  • a vector that can be amplified by Escherichia coli, such as a pUC derivative, a shuttle vector that can be amplified by both Escherichia coli and Agrobacterium, such as pPZP2H-lac, and the like can be mentioned.
  • plant viruses such as cauliflower mosaic virus can be used.
  • Those skilled in the art can appropriately select a vector that can be replicated in a plant cell according to each host cell.
  • the method of inserting the promoter of the present invention into a vector follows a conventional method of inserting a normal gene into a vector.
  • the present invention also provides a transformed cell comprising the promoter of the present invention, the DNA of the present invention, or the vector of the present invention.
  • the cell of the present invention is not particularly limited, but is preferably a microbial cell or a plant cell.
  • the transformed plant cell of the present invention is a plant cell transformed by introducing the DNA or vector of the present invention into a host cell.
  • the host cell include plant cells such as leaves, roots, stems, flowers, and scutellum in seeds, calli, suspension cultured cells, and the like.
  • the plant species from which the cells are derived are not particularly limited, but include, for example, tobacco, petunia, wheat, rice, oats, corn, soybean, rapeseed, radish, sugar beet, kabochia, kiuri, tomato, peta, etc. Is mentioned.
  • a preferable example of the present invention is rice.
  • the present invention also provides a method for producing a transformant, comprising the steps of introducing a promoter of the present invention, a DNA or a vector of the present invention into a plant cell, and regenerating a plant from the plant cell.
  • a method for producing a transformant comprising the steps of introducing a promoter of the present invention, a DNA or a vector of the present invention into a plant cell, and regenerating a plant from the plant cell.
  • Various techniques can be used to introduce the DNA or vector of the present invention into host plant cells. These techniques include transformation of plant cells with T-DNA using agrobacterium rhizogerws or agrobacterium rhizogerws as a transforming factor, or direct introduction into protoplasts (injection method, electroporation). And the like, a particle gun method, and other known methods. For direct introduction into protoplasts, usually no special vector is required. C For example, simple plasmids such as pUC derivatives can be used. Depending on the method used to introduce the gene of interest into plant cells, other DNA sequences may be required.
  • Ti or Ri plasmid when Ti or Ri plasmid is used for transformation of plant cells, at least the sequence at the right end of the T-DNA region of Ti and Ri plasmids, usually the sequence at both ends, is used to transfer the gene to be introduced. Must be connected to be adjacent to each other.
  • Agrobacterium When Agrobacterium is used for transformation, the gene to be introduced must be cloned into a special plasmid, ie, an intermediate or binary vector. Intermediate vectors are not replicated in Agrobacterium. The intermediate vector is transferred into Agrobacterium by helper plasmid or electoporation. Since the intermediate vector has a region homologous to the sequence of T-DNA, it is incorporated into Ti or Ri plasmid of Agrobacterium by homologous recombination. Agrobacterium used as a host must contain the vir region. Usually, Ti or ⁇ plasmid contains a vir region, which allows the transfer of T-DNA to plant cells.
  • a special plasmid ie, an intermediate or binary vector.
  • Intermediate vectors are not replicated in Agrobacterium.
  • the intermediate vector is transferred into Agrobacterium by helper plasmid or electoporation. Since the intermediate vector has a region homologous to the sequence of T-DNA, it
  • a binary vector can be replicated and maintained in Agrobacterium, if it is incorporated into Agrobacterium by helper plasmid, electroporation, or freeze-thawing, Functions of the host vir region
  • T-DNA on a binary vector can be transferred to a plant cell.
  • the intermediate vector or the binary vector thus obtained, and microorganisms such as Escherichia coli containing the same, are also objects of the present invention.
  • the above-mentioned vector contains an appropriate selection marker gene or is introduced into a plant cell together with a plasmid vector containing the selection marker gene.
  • Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene, which is resistant to the antibiotic hygromycin, the neomycin phosphotransferase, which is kanamycin or gentamicin resistant, and the acetyl, which is resistant to the herbicide phosphinothricin Transferase genes and the like can be mentioned.
  • the plant cells into which the vector has been introduced are placed and cultured on a selection medium containing a selection agent corresponding to the introduced selection marker. As a result, transformed plant cells can be obtained.
  • the transformed plant of the present invention is a transformed plant regenerated from the transformed plant cell of the present invention.
  • the method of regenerating an individual from transformed plant cells varies depending on the type of plant cells. For example, in rice, the method of Fujimura et al. (Fujimura et al. (1995), Plant ssue Culture Lett., Vol. 2: p74-), maize In the method of Shillito et al. (Shillito et al. (1989), Bio / Technology, vol. 7: p581-), for potatoes, Visser et al. (Visser et al. (1989), Theor. Appl. Genet., Vol.
  • a transformed plant cell is obtained by introducing the DNA or vector of the present invention into a host cell, and the transformed plant is regenerated from the transformed plant cell. And obtaining a plant seed from the obtained transformed plant, and producing a plant from the plant seed.
  • the step of obtaining plant seeds from the transformed plant includes, for example, collecting the transformed plant from a rooting medium, transplanting the plant into a pot containing soil containing water, growing the plant at a certain temperature, and growing a flower. This refers to the step of forming and finally forming seeds. Also, the step of producing a plant from seeds means, for example, that when the seeds formed on the transformed plant have matured, they are isolated, sown on soil containing water, and grown under a constant temperature and illuminance. This refers to the process of producing a plant.
  • the plant promoter of the present invention can be prepared and used, for example, as follows. Unless otherwise specified, the experimental methods are "Cloning and Sequence” (edited by Tadashi Watanabe, edited by Masahiro Sugiura, Rural Culture Co., Ltd. (1989)) and "Molecular Cloning (Sambrook et al. (1989), Cold Spring follow laboratory documents such as Harbor Laboratory Pres s) J.
  • DNA of the present invention includes natural or isolated 'purified genomic DNA, and chemically synthesized!) NA. Preparation of genomic DNA can be carried out by a person skilled in the art using conventional means.
  • the DNA of the present invention can be obtained by extracting and purifying genomic DNA from a target plant, for example, a rice tissue, and isolating the obtained DNA as a type III by PCR.
  • a primer pair is a square
  • PCR can be performed by a technique known to those skilled in the art, based on the guidelines of manufacturers of commercially available kits and devices. Methods for preparing a gene library, cloning methods for genes, and the like are well known to those skilled in the art. For example, experiments such as "Claw Juning and Sequence” (edited by Tadashi Watanabe, edited by Masahiro Sugiura, rural Culture Company (1989)) and "Molecular Cloning (Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)" See also.
  • the nucleotide sequence of the obtained gene can be determined using a nucleotide sequence analysis method known in the art or a commercially available automatic sequencer.
  • the DNA of the present invention also includes a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 that can be isolated by PCR or hybridization technology.
  • the promoter isolated and identified by the above-described screening exhibits root-specific gene expression inducibility is as follows. Can be analyzed. The above sequence is ligated upstream of a reporter gene such as GFP, for example, and incorporated into a vector such as pPZP2H-1ac.
  • a reporter gene such as GFP, for example, and incorporated into a vector such as pPZP2H-1ac.
  • CAT chloramphene-coal acetyltransferase
  • LOC luciferase
  • GUS beta-glucurodase
  • the chimeric gene construct prepared as described above can be introduced into a plant such as Arabidopsis thaliana via Agrobacterium to analyze its function.
  • pPZP2H-lac is used as a vector
  • the recombinant containing the chimeric gene For example, the plasmid is introduced into the EHA101 strain of Agrobacterium ummefaciens using a freeze-thawing method, and the resulting transformant is subjected to, for example, the vacuum infiltration method (supervised by Isao Shimamoto et al. Infects plants such as Arabidopsis thaliana by the “protocol” (separate volume of plant cell engineering, plant cell science series 4) published by Shujunsha in April 1996.
  • the vacuum infiltration method supervised by Isao Shimamoto et al. Infects plants such as Arabidopsis thaliana by the “protocol” (separate volume of plant cell engineering, plant cell science series 4) published by Shu
  • Seeds obtained from the infected plants are sown on a medium containing a drug suitable for the vector such as hygromycin, and the expression of the GFP gene is analyzed using the obtained drug-resistant individuals. By observing with a fluorescence microscope, it is expected that the fluorescence of GFP will be specifically detected in the root.
  • the promoter of the present invention or an expression vector containing the same can be used as follows.
  • An expression vector is constructed by inserting a chimeric gene in which a target gene, for example, a nutrient transporter gene is linked downstream of the promoter of the present invention, into, for example, pPZP2H-lac.
  • This vector is introduced into plants such as rice through agrobacterium.
  • the transporter gene of the nutrient is expected to be specifically expressed in the roots by the action of the promoter of the present invention, so that the nutrient can be efficiently taken up. In this case, since it is not expressed in unnecessary tissues such as the 35S promoter, it is expected that other unfavorable traits will not appear.
  • the gene (foreign gene) that can be controlled by the promoter of the present invention is not limited to the above-described transporter gene. It can be applied to any gene that is significant for its specific expression in roots.
  • the function of the promoter of the present invention can be modified by linking another expression control sequence to the promoter of the present invention.
  • expression control sequences include enhancer sequences, repressor sequences, insulator sequences, and the like.
  • a chimeric promoter in which a repressor sequence whose repression is released in response to a drug is linked to the promoter of the present invention is prepared, and a construct in which a target gene is linked downstream thereof is introduced into a plant. In transformants, under the absence of drug 04 005161
  • the expression of the target gene is suppressed, but it is expected that the administration will release the suppression and the target gene will be expressed in the root.
  • Examples of the method for transforming plant cells in the present invention include, in addition to the above-described methods via agrobacterium, the electoral poration method in which protoplasts are subjected to electric pulse treatment to introduce a plasmid into plant cells, and small cell and cell methods. Examples include a method using lysosomes and protoplasts, a microinjection method, a polyethylene glycol method, and a particle gun method.
  • the target gene can be introduced into a plant by using a plant virus as a vector.
  • Available plant viruses include, for example, cauliflower mosaic virus. That is, first, the virus genome is inserted into an E. coli-derived vector or the like to prepare a recombinant, and then these target genes are inserted into the virus genome.
  • These target genes can be introduced into plants by excising the thus modified virus genome from the recombinants with restriction enzymes and inoculating the plants (Hohn et al. (1982), Molecular Biology of Plant Tumors (Academic Press, New York) pp549, U.S. Pat. No. 4,407,956).
  • the present invention also provides a method for expressing a foreign gene in a plant root.
  • the method comprises a step of introducing into a plant a DNA having a structure in which a foreign gene and a plant terminator are operably linked downstream of the promoter of the present invention.
  • the method can also be carried out by introducing the DNA into a plant cell and regenerating the cell into a plant.
  • the DNA can be introduced into a plant or a plant cell by the above-described method.
  • the present invention provides a method for evaluating whether or not a test compound regulates the promoter activity of a DNA having the promoter activity of the present invention (for example, a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1). .
  • This evaluation method is a method for screening a compound that regulates the promoter activity of a promoter-active DNA of the present invention. Can be used for
  • test compound used in the evaluation method of the present invention is not particularly limited.
  • a single compound such as a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a protein, or a peptide, and a compound library or a gene library are expressed. Examples include products, cell extracts, cell culture supernatants, fermentation microorganism products, marine organism extracts, plant extracts, prokaryotic cell extracts, eukaryotic single cell extracts, animal cell extracts, and the like.
  • a test compound is brought into contact with a cell or cell extract containing DNA having a structure in which a DNA having the promoter activity of the present invention and a reporter gene are functionally linked.
  • “functionally linked” has the promoter activity of the present invention so that expression of a reporter gene is induced by binding of a transcription factor to DNA having the promoter activity of the present invention. It means that DNA and reporter gene are linked.
  • Examples of "cells containing DNA having a structure in which a DNA having a promoter activity of the present invention and a reporter gene are functionally linked" in the present method include, for example, cells into which a vector containing the above DNA has been introduced. .
  • the vector can be prepared by a method well known to those skilled in the art.
  • the introduction of the vector into cells can be performed by a general method, for example, a calcium phosphate precipitation method, an electric pulse perforation method, a lipofectamine method, a microinjection method and the like.
  • a cell containing a DNA having a structure in which a DNA having a promoter activity of the present invention and a reporter gene are functionally linked includes a cell having the DNA inserted into a chromosome. Insertion of DNA into the chromosome can be performed by a method generally used by those skilled in the art, for example, a gene transfer method using homologous recombination.
  • the “cell extract containing DNA having a structure in which the DNA having the promoter activity of the present invention and the reporter gene are functionally linked” in the present method is, for example, a cell extract contained in a commercially available in vitro transcription / translation kit.
  • the solution was added with DNA having a structure in which the DNA having the promoter activity of the present invention and the reporter gene were functionally linked to each other. Can be mentioned.
  • the “contacting” in the present method may be performed by adding a test compound to a culture medium of cells containing DNA having a structure in which a promoter gene of the present invention and a reporter gene are functionally linked, or
  • the test can be performed by adding a test compound to the above-mentioned commercially available cell extract containing DNA.
  • the test compound is a protein, it can be carried out, for example, by introducing a vector containing DNA encoding the protein into the cell, or adding the vector to the cell extract.
  • the expression level of the reporter gene is then measured.
  • Those skilled in the art can measure the expression level of a reporter gene in consideration of the type of the reporter gene.
  • the test compound when the test compound changes the expression level of the reporter gene as compared to the case where the test compound is measured in the absence of the test compound, the test compound modulates the promoter activity of the DNA of the present invention. Is determined.
  • a plurality of test compounds are evaluated for their ability to regulate the promoter activity of the DNA of the present invention, and a compound that regulates the promoter activity is selected.
  • a compound that efficiently regulates promoter activity can be screened.
  • the compound obtained by the screening method can control the root-specific expression of a gene and is very useful.
  • FIG. 1 is a photograph in which the relative expression level of the germin-like protein 4 gene in each tissue was examined by RT-PCR.
  • FIG. 1 shows a diagram showing a gene map of a plasmid constructed by cutting out a sequence of a promoter: GFP: terminator from a rasmid and inserting it into a multi-cloning site of a plant binary vector PPZP2H-lac.
  • FIG. 3 is a diagram in which a series of DNA fragments obtained by cutting the DNA fragments of the present example from the upstream (5 ′ side) was prepared, and each of them was ligated to a vector.
  • FIG. 4 is a photograph for verifying the result of expression of a gene by the promoter of the present invention in rice. 3 shows a fluorescence image of a rice root by a fluorescence microscope.
  • CDNA libraries were prepared from various parts of rice.
  • the library was prepared basically according to (Okubo et al. Large-scale cDNA sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression, nature genetics 2: 173-179 (1992)).
  • 3334 from cDNA library created from roots Were isolated and 8875 clones were isolated from a cDNA library created from non-root tissues and sequenced.
  • the nucleotide sequence was determined by performing a reaction using a PCR product Pre-Sequencing Kit (USB) and a DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for MegaBACE (amaersham pharraacia biotech), and using MegaBACElOOOO.
  • a homology search was performed on the base sequences of this group using the BLAST program based on the GenBank / EMBL database.
  • RNA was extracted from rice roots, leaves, and calli in a conventional manner, and reverse transcription was performed (conditions: 25 ° C for 10 minutes, 42 ° C for 1 hour, and 99 ° C for 5 minutes).
  • a primer Toyobo's Oligod (T) primer was used, and as a reverse transcriptase, GibcoBRL's SuperScriptll was used. A part of this reverse transcription reaction solution was used as a type III, and a PCR reaction was performed using GibcoBRL SuperMix High Fidelity and the following primer pair.
  • the PCR reaction conditions were as follows: denaturation at 95 ° C for 5 minutes; The conditions were as follows: repeat for 30 seconds, 30 for 40 seconds, and 72 for 1 minute for 25 or 30 cycles, and finally incubate at 72 ° C for 3 minutes.
  • a pair of primers (GER4Fc; 5'-CCGACTTGGCGTCCCCGGTG-3 '(SEQ ID NO: 3) and GER4Rc; 5'-GGCCTTGGCGAGGACGTCGG-3' (sequence No .: 4) was synthesized.
  • a pair of primers (actFc; 5, -CTGGGTTCGCCGGAGATGAT-3, based on the sequence of the known actin gene (accession number: X16280)
  • GER4Rx a pair of primers (GER4Rx; 5, -ggtctagacgaacagcgcgtggttg_3, (Torigatanata: 7) and GER4Fs; 5, -tggccgcggagctgaccaactcttgcac-3, (SEQ ID NO: 8)) was synthesized.
  • GER4Fs is a forward primer and has a restriction enzyme Sacll site (ccgcgg) at the 5 'end.
  • GER4Rx is a reverse primer having a restriction enzyme Xbal site (tctaga) at the 5 'end.
  • Genomic DNA of rice (cultivar: Nipponbare) was prepared according to a conventional method. Using this pair of primers, PCR was performed using this DNA as type III to obtain an amplified DNA fragment. It was confirmed that the desired DNA was amplified by digestion of the amplified DNA with a restriction enzyme or by sequencing according to a conventional method.
  • the vector pBluescript SK (Stratagene) was added to a mutant sGFP (S65T) of green fluorescent protein that emits strong fluorescence in plants (Yasuo Niwa: Plant Cell Engineering Series 4, Model Plant Experiment Protocol, ppll7-121, Shujun) And pblue-sGFP (S65T)-NOS SK (distributed by Dr. Yasuo Niwa from Shizuoka Prefectural University graduate School), a plasmid incorporating Nos terminator, and a plasmid incorporating the DNA fragment obtained by PCR. Created (Fig. 2).
  • This plasmid is further cut with Sacl and Kpnl, PPZP2H-lac, a recombinant vector (provided by Dr. Masahiro Yano, National Institute for Agrobiological Resources) (Fuse et al. (2001) Plant Biotechnology 18 (3): 219-222) By inserting a sequence of -Nos terminator, a binary vector for plant transformation for assaying the activity of the promoter region was completed (Fig. 2).
  • the prepared vector was introduced into Agrobacterium 'Emmefaciens EHA101 by freeze-thaw method.
  • the freeze-thaw method is a method in which a plasma solution is added to frozen EHA101 competent cells and the mixture is incubated at 37 ° C for 5 minutes.
  • the gene was introduced into Arabidopsis thaliana (variety: Columbia) and rice (variety: Haru Nihon) using the strain into which the target vector was introduced.
  • Arabidopsis thaliana was introduced basically according to the method described in “Transformation by vacuum infiltration method (Takaru Araki)” (Plant Cell Engineering Series 4, Experimental Protocol for Model Plants, ppl09_113, Shujunsha, 1996). . However, the decompression process described was omitted.
  • GFP expression can be observed directly with a fluorescence microscope on plants grown on an agar medium in a petri dish.
  • Fluorescence microscope is IX-FLA (Olympus), U-MNIBA filter Observation was performed using -2 1-.
  • Fig. 4 shows the fluorescence image of rice. [Example 6] Narrowing of promoter region
  • the reverse primer uses GER4Rx having the restriction enzyme Xbal site (tctaga) at the 5 'end, and the forward primer Primer having restriction enzyme SacII site (ccgcgg) (GER4F15S; 5'-TGGGCCGCgggaaacttggcttgttttgat-3 '(SEQ ID NO: 9), GER4F10s; 5'-GGCCGCggacgattttgc tatacatttat-3, (SEQ ID NO: 11), GER4 -TGGCCGCggtagtcccgtaacc gtagc _3, (SEQ ID NO: 10) GER4F036s; 5, one TGGCCGCGgtctatctccagcaatttatg g
  • DNA that functions as a promoter useful for specifically controlling gene expression in plant roots an expression vector containing the promoter, a transformed cell into which the expression vector has been introduced, and a transformed plant Further, there is provided a method for regulating the expression level of a gene under the control of the motor.
  • the target gene By causing the promoter of the present invention to function in a transformed plant, the target gene can be specifically expressed in root tissues.
  • the target gene any gene can be selected.
  • the promoter of the present invention shows strong expression activity over the whole rice root, it can be expected to be used for a wide range of applications.
  • a nutrient absorption-related gene, a nutrient starvation resistance gene, a drought resistance gene, a pathogen resistance gene, an insect resistance gene, or the like is selected as the gene expressed by the promoter of the present invention, the gene is adaptable to various poor soils. It is possible to grow tall plants.
  • a protein which is a product of the target gene and a substance produced in a cell by the action thereof is a culture of a transformed cell or a tissue such as a hairy root comprising the cell, or a cultivated harvest of the transformed plant can be used.
  • the gene of the present invention responds to the drug and induces gene expression in a specific manner. It is possible to construct a promoter that can be used.

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Abstract

　イネの根で特異的に発現をするジャーミン様タンパク4（probable germin protein 4）遺伝子の５'上流域を単離し、この上流域のDNAを解析し、鋭意検討を重ねた結果、根特異的に遺伝子の発現を制御するプロモーター機能を有するDNA配列を特定することに成功した。本発明のプロモーターを用いることにより、外来遺伝子を根特異的に発現させることが可能である。

Description

ジャーミン様タンパク 4遺伝子プロモーター、 およびその利用 技術分野
本願発明は、 植物に外来遺伝子を導入して根で特異的に発現させるプロモータ 一に関する。 さらに詳しくは、 イネのジャーミン様タンパク 4遺伝子 （probable germin protein 4 gene ; GER4) のプロモーター領域、 もしくはその一音を用いて 根で特異的に外来遺伝子を発現させる方法に関する。 背景技術
根は植物を支える役割のほかに、 水や養分などの吸収と輸送、 植物ホルモンの 合成、 あるいは養分を蓄積する役割などを担っている。 また、 根は線虫や病原菌 からの被害や、 冠水、 乾燥、 栄養欠乏、 栄養過剰などのス トレスを受ける部位で もある。
このため植物の根において適切な遺伝子を発現させることで、 線虫抵抗性、 耐 病性、 耐冠水、 耐乾燥の植物、 あるいは特定の栄養素が欠乏した土壌、 過剰な土 壌などでも生育可能な植物を作出できる可能性がある。 また、 カドミウムなどの 有害物質を効率的に吸収できる植物を作出することで、 土壌浄化に利用すること も出来る。 あるいは、 根菜類の栄養改変や、 医薬品や生分解性プラスチックなど の原料の生産など、 根において外来遺伝子を発現させることによる応用範囲は広 く、 有用性は高い。
一般に、 植物ではその活性が強いことから、 カリフラワーモザイクウィルス（Ca MV)の 35Sプロモーターがよく利用されており、 実際、 除草剤耐性植物やウィルス 抵抗性植物の作出に用いられている。
しかしながら、 35Sプロモーターは、 強力であるが組織特異性がなく、 必ずしも 最適な形質転換植物の作出に適しているとは限らない。 例えば、 不必要な部位で の発現によつて成長異常などをきたしたり、 発現強度が高すぎることによってジ —ンサイレンシング等の好ましくない形質が現れたりすることがある。 また、 組 換え作物の作出に際しては、 必要のない形質を持ち込まないことが望まれており、 目的遺伝子を必要な組織以外においても発現させてしまうプロモーターでは植物 体への適用に際する用途が大きく制限されたものとなる。
このような問題の解決手段として、 特定の組織、 とりわけ根組織に特異的に目 的の遺伝子を制御するプロモーターを用いることが望ましい。 植物の主に根で発 現するとされている遺伝子はいくつか知られているが （非特許文献 1〜13、 17〜2 1参照） 、 植物の根で特異的に遺伝子発現を制御するプロモーターは従来技術にお いてはまだ種類が少なく （特許文献 1〜 3および非特許文献 14〜 16、 22、 23参 照） 、 しかもその特異性は低いのが現状である。
また、 非特許文献 1によると、 イネの RCc2遺伝子はノザン解析によって根に特異 的発現をすることがわかったが、 RCc2遺伝子の上流域をプロモーターとして使用 した場合は、 外来遺伝子を根の分裂域以外、 および葉の維管束で発現させること がわかった。 この例のように、 ノザン解析などで、 根特異的発現をする遺伝子を 取得しても、 外来遺伝子根特異的に発現させるプロモータ一部位を取得するのは 当業者であっても容易ではない。
ジャーミンは、 コムギの発芽時に特異的に出現するタンパク質として単離され、 シユウ酸酸化活性を持つと考えられているが、 その機能は不明である。 ジャーミ ン様タンパクは、 ジャーミンと相同性を持つタンパク質の総称で、 発現パターン はジャーミンと異なり、 シユウ酸酸化活性も持たず、 機能は不明である。 ジャー ミン、 及びジャーミン様タンパクはコムギ、 ォォムギ、 イネ、 シロイヌナズナ、 アサガオ、 タバコ、 ジャガイモ、 トマトなど多くの植物から単離されており、 発 現部位は、 芽ばえ全体、 葉、 茎、 根など遺伝子によって様々である。 また、 ジャ 一ミン、 及ぴジャーミン様タンパクの中には、 環境ストレス（塩、 重金属ストレ ス）や病原菌の感染で発現が増加するもの、 あるいは発現がサ一力ディアンリズム を示すものも報告されている（非特許文献 2 4〜3 4参照)。 また、 イネからは複 数のジャーミン、 及びジャーミン様タンパクが単離されており（非特許文献 3 5参 照）、 本発明者らが単離した遺伝子のコーディング領域は、 イネのジャーミン様タ ンパク 4 (GER4： germin-like protein 4) と高い相同性（95%)があったが、 その 発現様式や遺伝子の機能に関する報告はなされていない。
〔特許文献 1〕 米国特許出願公開第 2001/0016954号明細書
〔特許文献 2〕 米国特許第 6271437号明細書
〔特許文献 3〕 特開 2002_142766号公報
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〔非特許文献 2 9〕 Hurkman W. J.および Tanaka C. K,著、 「Effect of Salt Stres s on Germin Gene Expression in Barley Roots.」 、 Plant Physiol. 、 Vol. 110、 No. 3、 p. 971- 977、 1996年
〔非特許文献 3 0〕 Dumas, Β· ， Freyssinet, G.および Pallett, K. E.著、 「Tiss ue-Specif ic Expression of Germin-し ike Oxalate Oxidase during Development and Fungal Infection of Barley Seedlings.」 、 Plant Physiol. 、 Vol. 107、 No. 4、 p. 1091-1096、 1995年
〔非特許文献 3 1〕 Hurkman W. J.および Tanaka C. K.著、 「Germin Gene Express! on Is Induced in Wheat Leaves by Powdery Mildew Infection.」 、 Plant Physi ol. 、 Vol. 111、 No. 3、 p. 735- 739、 1996年
〔非特許文献 3 2〕 Michalowski, C. B.および Bohnert H. J.著、 「Nucleotide seq uence of a root-specific transcript encoding a germin - like protein from t he halophyte Mesembryanthemum crystalliumj 、 Plant Physiol. 、 Vol. 100、 p. 5 37-538、 1992年
〔非特許文献 3 3〕 Carter, C. ， Graham, R. A. および Thornburg, R. W.著、 「Nec tarin I is a novel, soluble germin - like protein expressed in the nectar o f Nicotiana sp.」 、 Plant Mol. Biol. 、 Vol. 41、 No. 2、 p. 207 - 16 、 1999年
〔非特許文献 3 4〕 Carter, C. および Thornburg, R. W,著、 「The nectary- speci fic pattern of expression of the tobacco Nectarin I promoter is regulated by multiple promoter elements.」 、 Plant Mol. Biol.、 Vol. 51、 o. 4、 p. 4り 1一 457、 2003年
〔非特許文献 3 5〕 embre, N. および Bernier, F.著、 「The rice genome express es at least six different genes for oxalate oxidase/germm-like proteins (Accession Nos. AF032971, AF032972, AF032973, AF032974, AF032975, and AF0 32976) (PGR98-021) J 、 Plant Physiol.、 Vol. 116、 No. 2、 p. 868、 1998年 発明の開示
本発明の目的は、 植物の根で特異的に遺伝子の発現を制御するのに有用なプロ モーター、 該プロモーターを含有する発現ベクター、 該発現ベクターを含む形質 転換植物もしくは植物体、 およびその作製方法を提供することにある。
本発明者らはイネの根から、 根で特異的に発現をするジャーミン様タンパク 4 (probable germin protein 4； GER4) 遺伝子の 5 '上流域を単離し、 この上流域 の DNAを解析し、 鋭意検討を重ねた結果、 ジャーミン様タンパク 4遺伝子のプロモ 一ター機能を有する DNA配列を特定することに成功し、 本発明を完成するに至った。 本発明者らによって単離されたプロモーターを利用することによって、 実際に外 来遺伝子を根特異的に発現させることが可能である。
すなわち、 本発明は、 以下の 〔1〕 〜 〔1 5〕 に関する。
〔1〕 下記の （a ) 、 ( b ) または （c ) の DNAを含むプロモーター。
( a ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA
( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列において 1もしくは複数の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列からなり、 かつプロモーター機能を 有する DNA
( c ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件 下にハイブリダィズし、 かつプロモーター機能を有する DNA 本発明は、 より詳しくは、 以下に関する。
〔l b〕 上記 （a ) 、 ( b ) または （c ) の DNAを含む、 プロモーターとして 使用するための DNA、 または
〔l c〕 上記 （a ) 、 ( b ) または （c ) の DNAのプロモーターとしての使用 c 〔2〕 〔1〕 に記載のプロモーターの下流に、 外来遺伝子および植物ターミネ 一ターが機能的に連結した構造を有する DNA。
〔3〕 〔1〕 に記載のプロモーターを含むベクター。
〔4〕 〔1〕 に記載のプロモーターの下流に外来遺伝子揷入部位および植物タ ーミネーターを含む、 〔3〕 記載のベクター。
〔5〕 〔2〕 に記載の DNAを含むベクター。
〔6〕 〔1〕 に記載のプロモーター、 〔2〕 に記載の DNA、 または 〔3〕 〜
〔5〕 のいずれかに記載のベクターを含む、 形質転換細胞。
〔7〕 微生物である、 〔6〕 に記載の形質転換細胞。
〔8〕 植物細胞である、 〔6〕 に記載の形質転換細胞。
〔9〕 〔8〕 に記載の細胞を含む、 形質転換植物体。
〔1 0〕 〔 9〕 に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、 形質転 換植物体。
〔1 1〕 〔9〕 または 〔1 0〕 に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔1 2〕 〔9〕 または 〔1 0〕 に記載の形質転換植物体の作製方法であって、 〔1〕 に記載のプロモーター、 〔2〕 に記載の DNA、 または 〔3〕 〜
〔5〕 のいずれかに記載のベクターを植物細胞へ導入し、 該植物細胞か ら植物体を再生させる工程を含む方法。
〔1 3〕 植物の根において外来遺伝子を発現させる方法であって、 〔2〕 に記 載の DNA、 または 〔4〕 もしくは 〔5〕 に記載のベクターを該植物の細胞 へ導入する工程を含む方法。
〔1 4〕 被験化合物について、 〔1〕 に記載の DNAのプロモーター活性を調節す 04 005161
- 1 o - るか否かを評価する方法であって、
( a ) 〔1〕 に記載の DNAとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を 有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、 被験化合物を接触させる 工程、
( b ) 該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、 被験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場 合に、 被験化合物が 〔1〕 に記載の DNAのプロモーター活性を調節すると 判定される方法。
〔1 5〕 以下の工程 （a ) および （b ) を含む、 〔1〕 に記載の DNAのプロモー ター活性を調節する化合物のスクリ一二ング方法。
( a ) 〔1 4〕 に記載の評価方法により、 被験化合物について、 〔1〕 に 記載の DNAのプ口モータ一活性を調節するか否かを評価する工程 ( b ) 被験化合物から、 該 DNAのプ口モータ一活性を調節すると評価された 化合物を選択する工程
以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明者らは、 イネの様々な部位からそれぞ れ cDNAライプラリ一を作成した。 根から作成した cDNAライブラリ一から 3334個の クローンを単離、 根以外の組織から作成した cDNAライブラリ一からは 8875個のク ローンを単離して塩基配列を決定した。
根由来のライブラリ一に 3回出現し、 根以外の糸且織由来のライブラリ一には一 度も出現しなかったクローンを選択し、 GenBank/EMBLデータベースを元に BLASTプ ログラムを用いて塩基配列のホモ口ジー検索を行つたところ、 このクローンがジ ヤーミン様タンパク 4 (germin protein 4； GER4) 遺伝子と推定される配列に一致 することが判明した。 ジャーミン様タンパク 4遺伝子の発現を逆転写 PCRによって 調べたところ、 根に特異的であることが確認された。 ジャーミン様タンパク 4遺伝 子の 5' 上流域を単離し、 上流側から段階的に欠損させた断片と GFP遺伝子を連結 させたキメラ遺伝子構築物をイネ、 およびシロイヌナズナ植物体に導入すること で、 ジャーミン様タンパク 4遺伝子 （GenBankァクセッション番号： AP003020) 力、 らプロモーター領域を単離することに成功したものである。
本発明はまず、 ジャーミン様タンパク 4遺伝子プロモーター（DNA)を提供する。 本発明のプロモーターは、 下流の遺伝子を根特異的に発現させることが可能であ り、 極めて有用である。 本発明者らによって単離されたジャーミン様タンパク 4遺 伝子プロモーター DNAの塩基配列を、 配列番号： 1に示す。
本発明は、 より具体的には、 下記の （a ) 〜 （c ) のいずれかの DNAを含むプロ モーター （プロモーター活性を有する DNA) を提供する。
( a ) 配列番号： 1で示される塩基配列からなる DNA
( b ) 配列番号： 1で示される塩基配列において 1もしくは複数の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列からなり、 かつプロモーター機能を有す る DNA
( c ) 配列番号： 1で示される塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下 にハイブリダィズし、 かつプロモーター機能を有する DNA
本発明の 「プロモーター」 とは、 DNAを铸型とした mRNAの合成 （転写） の開始に 必要な特定塩基配列を含む DNAを意味し、 自然界に存在する DNAの他、 組換えなど の人工的な改変操作により作成された DNAを含む。 また、 本突明のプロモーターは、 植物細胞において発現誘導型プロモーターであることが好ましい。
本発明者らは、 本発明のプロモーターを得るために、 イネのジャ一ミン様タン パク 4遺伝子の上流に存在するゲノム配列から、 配列番号： 2に示す 2072bpの配列 を含む断片を PCRにより取得した。 この断片の下流に、 植物体において遺伝子発現 を容易にモュターすることが可能なレポーター遺伝子として、 緑色蛍光タンパク 質 （GFP) 遺伝子を連結したキメラ遺伝子構築物を作成し、 ァグロパクテリゥムを 介してイネ、 およぴシロイヌナズナの植物体へ導入したところ、 GFP遺伝子の発現 がシロイヌナズナの植物体では検出されず、 イネでは根に特異的に GFP遺伝子の発 現が観察された。 さらに、 この断片を上流側から段階的に欠損させ、 それぞれの断片と GFP遺伝子 を連結させたキメラ遺伝子構築物をイネ、 およぴシロイヌナズナ植物体に導入し て解析を行ったところ、 根における発現の誘導には少なくとも 627bpからなる断片 (配列表の配列番号： 2の 1446番目から 2072番目までの配列からなる断片 Z配列 番号： 1 ) で十分機能することを突き止めた。 すなわち本発明は、 配列番号： 1 に記載の塩基配列からなる DNA、 もしくは該 DNAを含むプロモーター活性を有する D NAを提供する。
本発明のプロモーターは、 配列番号： 1の塩基配列からなる DNAだけでなく、 配 列番号： 1の塩基配列において 1もしくは複数の塩基が欠失、 置換もしくは付加 された塩基配列からなり、 かつ植物プロモーターとして作用する.能力を有する DNA、 または、 配列番号： 1の塩基配列において、 その 3 '末端に翻訳効率を上げる塩基 配列などを付加したものや、 プロモーター活性を失うことなく、 その 5 '末端を欠 失したものを含む。
上記 DNAを調製するために、 当業者によりょく知られた方法としては、 ハイプリ ダイゼーシヨン技術 （Southern, EM. , J Mol Biol, 1975， 98， 503. ) やポリメラ ーゼ連鎖反応 (PCR) 技術 (Saiki, RK. et al.， Science, 1985, 230, 1350.、 Sa iki, RK. et al. , Science, 1988, 239, 487. ) の他に、 例えば、 該 DNAに対し、 s ite - directed mutagenesis法 (Kramer, W. & Fritz, HJ . , Methods Enzymol, 198 7, 154, 350. ) により変異を導入する方法が挙げられる。
本発明において欠失、 置換等の変異が導入される塩基の数は、 変異を導入され た DNAがプロモーター活性を有する限り、 特に制限されないが、 通常、 20塩基対以 内、 好ましくは 10塩基対以内、 より好ましくは 5塩基対以内、 最も好ましくは 3塩 基対以内である。
さらに、 本発明の植物プロモーターは、 配列番号： 1の塩基配列からなる DNAと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ植物プロモーターとして作 用する能力を有する DNAを含む。 ここで、 ストリンジェントな条件とは、 特に制限 されるものではないが、 例えば 42°C、 2 X SSC (300mM NaCl、 30mMクェン酸） 、 0. 1%SDSの条件であり、 好ましくは 50°C、 2 X SSC 、 0. 1%SDSの条件であり、 さらに 好ましくは、 65°C、 0. 1 X SSCおよび 0. 1%SDSの条件である。 これらの条件におい て、 温度を上げる程に高い相同性を有する DNAが効率的に得られることが期待でき る。 ハイブリダィゼーションのストリンジエンシーに影響する要素としては温度 や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択する ことで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。
さらに本発明は、 本発明のプロモーターの下流に、 外来遺伝子およびターミネ 一ターが機能的に連結した構造を有する DNAを提供する。 本努明において外来遺伝 子とは、 特に制限されず、 所望の遺伝子を用いることができる。
また、 本発明のターミネータ一とは、 通常、 植物由来ターミネータ一 （植物タ ーミネーター） を言い、 本発明の植物組識特異的な発現を制御するプロモーター 領域に隣接して配置される DNA配列であり、 例えば、 力リフラワーモザィクウィル ス由来のターミネータ一、 あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネータ 一等を例示することができるが、 ターミネータ一としての機能を有するものであ れば、 これらに特に制限されない。
本発明において 「機能的に連結」 とは、 プロモーターの下流の外来遺伝子がプ 口モーターからの転写を受けるように該プロモーターと結合している状態、 ある いは、 ターミネータ一によつて外来遺伝子の発現が終結するように外来遺伝子が ターミネータ一と結合した状態を指す。 プロモーター、 外来遺伝子おょぴターミ ネーターを 「機能的に連結」 させることは、 当業者においては一般的な遺伝子ェ 学技術を用いて、 簡便に行い得ることである。
また、 本発明のプロモーターの一例としては、 上記 （a ) 〜 （c ) のいずれか に記載の DNAからなるプロモータ一活性を有する DNAを挙げることができる。 プロ モーター活性は、 当業者においては公知の方法 （例えば、 後述のレポーター遺伝 子を用いて該遺伝子の発現を指標に測定する方法） によって適宜、 評価すること 1
- 1 4 - ができる。
さらに本発明は、 上記本発明のプロモーターを含むベクター、 本発明のプロモ 一ターの下流に遺伝子挿入部位およびターミネータ一を含むベクター、 並びに、 本発明の上記 DNAを含むベクターを提供する。
本発明のベクターは、 通常、 本発明のプロモーターを植物細胞内で複製可能な ベクターに挿入したものである。 この複製可能なベクターとしては、 公知の種々 のべクターを用いることができる。 例えば、 pUC誘導体などの大腸菌で増幅可能な ベクター、 pPZP2H - lacなどの大腸菌とァグロパクテリゥムの双方で増幅可能なシ ャトルべクタ一などが挙げられる。 また、 植物ウィルス、 例えば、 カリフラワー モザイクウィルスを利用することもできる。 当業者においては、 植物細胞内で複 製可能なベクターを、 各々の宿主細胞に応じて適宜選択することができる。 なお、 本発明のプロモーターをベクターに挿入する方法は、 通常の遺伝子をべクターに 挿入する常法に従う。
また本発明は、 本発明のプロモーター、 本発明の DNA、 または本発明のベクター を含む形質転換細胞を提供する。
本発明の細胞は、 特に制限されるものではないが、 好ましくは微生物細胞ある いは植物細胞である。
本発明の形質転換植物細胞は、 本発明の DNAもしくはベクターを宿主細胞に導入 し、 形質転換させた植物細胞である。 宿主細胞としては、 例えば葉、 根、 茎、 花 および種子中の胚盤等の植物細胞、 カルス、 懸濁培養細胞等が挙げられる。 細胞 の由来する植物種としては、 特に制限されるものではないが、 例えば、 タバコ、 ペチュニア、 コムギ、 イネ、 ォォムギ、 トウモロコシ、 ダイズ、 ナタネ、 ダイコ ン、 テンサイ、 カボチヤ、 キユウリ、 トマト、 ヮタなどが挙げられる。 尚、 本発 明における好ましい例として、 イネを挙げることができる。
また本発明は、 本発明のプロモーター、 本発明の DNAまたはベクターを植物細胞 へ導入し、 該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む、 形質転換体の作製方 法に関する。
本発明の DNAもしくはベクターを宿主植物細胞中に導入するために、 さまざまな 手法を用いることができる。 これらの手法には、 形質転換因子としてァグロパク テリウム 'ッメファシェンス ( grobacteriwn tumefaciens)または、 ァグロバクテ リウム . リゾゲネス Agrobacterium rhizogerws を用いた T- DNAによる植物細胞 の形質転換、 プロトプラストへの直接導入（インジェクション法、 エレクトロボレ ーシヨン法など）、 パーティクルガン法などや、 その他の公知の方法が含まれる。 プロトプラストへの直接導入では、 通常、 特別に必要とされるベクターはない c 例えば、 pUC誘導体のような単純なプラスミ ドを用いることができる。 目的の遺伝 子を植物細胞に導入する方法によっては、 他の DNA配列が必要になることもある。 例えば Tiまたは Riプラスミ ドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、 Tiおよび R iプラスミ ドの T-DNA領域の少なくとも右端の配列、 大抵は両側の端の配列を、 導 入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
ァグロパクテリゥム属菌を形質転換に用いる場合には、 導入すべき遺伝子を、 特別のプラスミ ド、 すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクターの中にクロ 一-ングする必要がある。 中間ベクターはァグロパクテリゥム属菌の中では複製 されない。 中間ベクターは、 ヘルパープラスミ ドあるいはエレクト口ポレーショ ンによってァグロバクテリウム属菌の中に移行される。 中間ベクターは、 T - DNAの 配列と相同な領域をもっため、 相同的組換えによって、 ァグロバクテリウム属菌 の Tiまたは Riプラスミ ド中に取り込まれる。 宿主として使われるァグロバタテリ ゥム属菌には、 vir領域が含まれている必要がある。 通常 Tiまたは ^プラスミ ドに vir領域が含まれており、 その働きにより、 T - DNAを植物細胞に移行させることが できる。
一方、 バイナリーベクターはァグロパクテリゥム属菌の中で複製、 維持され得 るので、 ヘルパープラスミ ドあるいはエレクトロポレーシヨン法あるいは凍結溶 解法によってァグロパクテリゥム属菌中に取り込まれると、 宿主の vir領域の働き によって、 バイナリーベクター上の T-DNAを植物細胞に移行させることができる。 なお、 このようにして得られた中間ベクターまたはバイナリーベクター、 およ ぴこれを含む大腸菌ゃァグロパクテリゥム属菌等の微生物も本発明の対象である また、 本発明の DNAもしくはベクターの導入によって形質転換された植物細胞を 効率的に選択するために、 上記ベクターは、 適当な選抜マーカー遺伝子を含む、 もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターとともに植物細胞へ導入 することが好ましい。 この目的に使用される選抜マーカー遺伝子は、 例えば、 抗 生物質ハイグロマイシン耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ 遺伝子、 カナマイシンまたはゲンタマイシン耐性であるネオマイシンホスホトラ ンスフェラーゼ、 および除草剤ホスフイノスリシン耐性であるァセチルトランス フェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。
上記ベクターを導入した植物細胞は、 導入した選抜マーカーに応じた選抜用薬 剤を含む選抜用培地に置床し培養する。 これにより、 形質転換された植物細胞を 得ることができる。
本発明の形質転換植物体とは、 本発明の形質転換植物細胞から再生された形質 転換植物体である。 形質転換された植物細胞から個体を再生する方法は植物細胞 の種類により異なるが、 例えばイネでは Fujimuraら （Fujimuraら（1995) , PlantTi ssue Culture Lett. , vol. 2 : p74 -） の方法、 トウモロコシでは、 Shillitoら （Shi llitoら（1989)， Bio/Technology, vol. 7 : p581- ) の方法、 ジャガイモでは、 Visse rら （Visserら（1989)， Theor. Appl. Genet. , vol. 78 :p589 -） の方法、 シロイヌ ナズナでは Akamaらの方法 (Akamaら（1992) , Plant Cell Rep. , νο1· 12 : ρ7- ) が挙 げられる。 これらの方法により作出された形質転換植物体またはその繁殖材料 (例えば種子、 果実、 塊茎、 切穂、 塊根、 株、 カルス、 プロトプラストなど） 力 ら得た形質転換植物体も本発明の対象である。 一旦、 染色体内に本発明のプロモ 一ター (DNA)が導入された形質転換植物体が得られれば、 該植物体から有性生殖ま たは無性生殖により子孫を得ることが可能である。 また、 該植物体やその子孫あ るいはクローンから繁殖材料を得て、 それらを基に該植物体を量産することも可 能である。
本発明の植物体を作製する方法の好ましい態様においては、 本発明の DNAまたは べクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、 該形質転換植物細胞か ら形質転換植物体を再生し、 得られた形質転換植物体から植物種子を得て、 該植 物種子から植物体を生産する工程を含む。
形質転換植物体から植物種子を得る工程とは、 例えば、 形質転換植物体を発根 培地から採取し、 水を含んだ土を入れたポットに移植し、 一定温度下で生育させ て、 花を形成させ、 最終的に種子を形成させる工程をいう。 また、 種子から植物 体を生産する工程とは、 例えば、 形質転換植物体上で形成された種子が成熟した ところで、 単離して、 水を含んだ土に播種し、 一定温度、 照度下で生育させるこ とにより、 植物体を生産する工程をいう。
本発明の植物プロモーターは、 例えば、 以下のようにして作製し、 利用するこ とができる。 なお、 実験手法に関しては、 特に記載のない限り、 「クローニング とシークェンス」 （渡辺格監修、 杉浦昌弘編集、 農村文化社 （1989年） ） や、 「M olecular Cloning (Sambrookら (1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Pres s) J などの実験書に従う。
本発明の DNAには、 天然あるいは単離 '精製されたゲノム DNA、 および化学合成!） NAが含まれる。 ゲノム DNAの調製は、 当業者にとって常套手段を利用して行うこと が可能である。
本発明の DNAは、 目的とする植物、 例えば、 イネの組織よりゲノム DNAを抽出し 精製し、 得られた DNAを铸型として PCRによって単離することができる。
本発明における、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA、 およびこれとス トリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ根特異的発現を示すプロモー タ一を単離するためには、 例えば、 配列番号： 2に記載の塩基配列からなる DNA上 の配列であって、 本発明のプロモーターを増幅するためのプライマー対を用いる ことができる。 このプライマ一対を用いて、 植物のゲノム DNAを铸型として PCRを 行い、 その後、 得られた増幅 DM断片をプローブとして用いて、 同じ植物のゲノム ライブラリーをスクリーエングすることができる。 そのようなプライマー対の例 として、 正方 |ロ」プフィマー (GER4Fs； 5 - tggccgcggagctgaccaactcttgcac -3 (配列番号： 8 ) ) と、 逆方向プライマー （GER4Rx； 5' - ggtctagacgaacagcgcgt ggttg -3' (配列番号： 7 ) ) との組合せが挙げられる。
PCRは、 市販のキットおよび装置の製造者の指針に基づいて行う力、 当業者に周 知の手法で行い得る。 遺伝子ライブラリ一の作製法、 および遺伝子のクローニン グ法なども当業者に周知である。 例えば、 「クローユングとシークェンス」 （渡 辺格監修、 杉浦昌弘編集、 農村文化社 （1989年） ） や、 「Molecular Cloning (Sa mbrookら（1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Press) 」 などの実験鲁を参照 のこと。 得られた遺伝子の塩基配列は、 当該分野で公知のヌクレオチド配列解析 法または市販されている自動シーケンサーを利用して決定し得る。 PCR技術やハイ ブリダィゼーシヨン技術によって単離し得る、 配列番号： 1に記載の塩基配列か らなる DNAとハイブリダィズする DNAもまた、 本発明の DNAに含まれる。
上記のようなスクリーエングによって単離および同定されたプロモーター （す なわち、 配列番号： 1に示されるプロモーター、 およびホモログ） が根特異的遺 伝子発現誘導性を示すことは、 以下のようにして解析することが可能である。 上記の配列を、 例えば、 GFPなどのレポーター遺伝子の上流に連結し、 pPZP2H - 1 acなどのベクターに組み込む。 レポーター遺伝子としては、 GFP遺伝子の他にクロ ラムフエ-コール ァセチルトランスフェラーゼ （CAT) 遺伝子や、 ルシフェラー ゼ （LUC) 遺伝子、 ベータ グルクロ-ダーゼ （GUS) 遺伝子なども利用が可能で ある。
上記のようにして作成されたキメラ遺伝子構築物は、 例えば、 ァグロバタテリ ゥムを介してシロイヌナズナなどの植物に導入してその機能を解析することが可 能である。 pPZP2H - lacをベクターとして用いた場合は、 キメラ遺伝子を含む組換 えプラスミドを、 例えば、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスの EHA101株に 凍結溶解法を用いて導入し、 得られた形質転換菌を、 例えば、 減圧浸潤法 （島本 功ら監修、 「モデル植物の実験プロトコール」 （植物細胞工学別冊、 植物細胞ェ 学シリーズ 4 ) 秀潤社 1996年 4月発行） によりシロイヌナズナなどの植物体に感染 させる。 感染処理した植物より得られた種子を、 ハイグロマイシンなど用いたベ クターに適した薬剤を含む培地に播種し、 得られた薬剤耐性個体を用いて GFP遺伝 子の発現について解析する。 蛍光顕微鏡で観察することにより、 GFPの蛍光が根で 特異的に検出されることが期待される。
本発明のプロモーターまたはそれを含む発現ベクターは、 以下のようにして利 用することが可能である。 本発明のプロモーターの下流に目的の遺伝子、 例えば、 養分のトランスポーター遺伝子を連結したキメラ遺伝子を、 例えば、 pPZP2H-lac に揷入し発現ベクターを構築する。 このべクタ一をァグロバクテリゥムを介して イネなどの植物体に導入する。 得られた形質転換植物においては、 本発明のプロ モーターの働きにより根において養分のトランスポーター遺伝子が特異的に発現 し、 養分を効率的に取り込むことができるようになることが期待される。 この場 合、 35Sプロモーターのように不要な組織においても発現することがないため、 他 の好ましくない形質が現れないことが期待される。
本発明のプロモーターで制御可能な遺伝子 （外来遺伝子） としては、 上記のト ランスポーター遺伝子に限定されない。 根において特異的に発現させることに意 義のあるあらゆる遺伝子に応用が可能である。
また、 本発明のプロモーターに他の発現制御配列を連結して本発明のプロモー ターの機能を改変することが可能である。 このような発現制御配列としては、 ェ ンハンサー配列ゃリプレッサー配列、 インスレーター配列などが挙げられる。 例 えば薬剤に応答して抑制が解除されるリプレッサー配列を本発明のプロモーター と連結したキメラプロモーターを作成し、 その下流に目的の遺伝子を連結した構 築物を植物に導入すると、 得られた形質転換体では、 薬剤が存在しない条件下で 04 005161
- 2 0 - は目的遺伝子の発現が抑制されているが、 薬剤を投与することによつて抑制が解 除され、 目的遺伝子が根で発現するようになることが期待される。
なお、 本発明における植物細胞の形質転換方法としては、 上記のァグロバクテ リゥムを介した方法の他に、 プロトプラストに電気パルス処理してプラスミドを 植物細胞へ導入するエレクト口ポレーシヨン法や、 小細胞、 細胞、 リソソームな どとプロトプラストとの 合法、 マイクロインジェクション法、 ポリエチレング リコール法、 あるいは、 パ一テイクルガン法などの方法が挙げられる。
また、 植物ウィルスをベクターとして利用することによって、 目的遺伝子を植 物体に導入することができる。 利用可能な植物ウィルスとしては、 例えば、 カリ フラワーモザイクウィルスが挙げられる。 すなわち、 まず、 ウィルスゲノムを大 腸菌由来のベクターなどに揷入して糸且換え体を調製した後、 ウィルスのゲノム中 に、 これらの目的遺伝子を挿入する。 このようにして修飾されたウィルスゲノム を制限酵素によつて該組換え体から切り出し、 植物体に接種することによって、 これらの目的遺伝子を植物体に導入することができる （Hohnら （1982) 、 Molecul ar Biology of Plant Tumors (Academic Press、 New York) pp549, 米国特許第 4, 407， 956号） 。
また本発明は、 植物の根において外来遺伝子を発現させる方法を提供する。 本 方法の好ましい態様においては、 本発明のプロモーターの下流に外来遺伝子およ ぴ植物ターミネータ一が機能的に連結した構造を有する DNAを、 植物へ導入するェ 程を含む方法である。 本方法においては、 該 DNAを、 植物細胞へ導入し、 該細胞を 植物へ再生させることによつても行うことができる。 該 DNAの植物もしくは植物細 胞への導入は、 上述の方法によって実施することができる。
さらに本発明は、 被験化合物について、 本発明のプロモーター活性を有する DNA (例えば、 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA) のプロモーター活性を調 節するか否かを評価する方法を提供する。 この評価方法は、 本発明のプロモータ 一の活·生を有する DNAのプロモーター活性を調節する化合物のスクリ一二ング方法 に利用することができる。
本発明の評価方法に用いられる被検化合物としては、 特に制限はなく、 例えば、 天然化合物、 有機化合物、 無機化合物、 タンパク質、 ペプチド等の単一化合物、 並びに、 化合物ライブラリー、 遺伝子ライブラリーの発現産物、 細胞抽出物、 細 胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 原核細胞抽出物、 真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。
この方法においては、 まず、 本発明のプロモーター活性を有する DNAとレポータ 一遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、 被験化合物を接触させる。
本発明において、 「機能的に結合した」 とは、 本発明のプロモーター活性を有 する DNAに転写因子が結合することにより、 レポーター遺伝子の発現が誘導される ように、 本発明のプロモーター活性を有する DNAとレポーター遺伝子とが結合して いることをいう。 本方法における 「本発明のプロモーター活性を有する DNAとレポ 一ター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」 として、 例えば、 上記 DNAを含むベクターを導入した細胞を挙げることができる。 該ベクターは、 当 業者に周知の方法により作製することができる。 ベクターの細胞への導入は、 一 般的な方法、 例えば、 リン酸カルシウム沈殿法、 電気パルス穿孔法、 リポフエク タミン法、 マイクロインジェクション法等によって実施することができる。
また、 「本発明のプロモーター活性を有する DNAとレポーター遺伝子とが機能的 に結合した構造を有する DNAを含む細胞」 には、 染色体に該 DNAが挿入された細胞 も含まれる。 染色体への DNAの挿入は、 当業者に一般的に用いられる方法、 例えば、 相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
本方法における 「本発明のプロモーター活性を有する DNAとレポーター遺伝子と が機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞抽出液」 とは、 例えば、 市販の試 験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、 本発明のプロモーター活性を有 する DNAとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを添カ卩したも のを挙げることができる。
本方法における 「接触」 は、 本発明のプロモ一ター活性を有する DNAとレポ一タ —遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞の培養液に被験化合物 を添加する、 または該 DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被験化合物を添カロ することにより行うことができる。 被験化合物がタンパク質の場合には、 例えば、 該タンパク質をコードする DNAを含むベクターを、 該細胞へ導入する、 または該べ クターを該細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。
本方法においては、 次いで、 該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。 レ ポーター遺伝子の発現レベルは、 当業者においては、 該レポーター遺伝子の種類 を考慮して、 測定することができる。
本方法においては、 被験化合物の非存在下において測定した場合と比較して、 被験化合物がレポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合に、 被験化合物が 本発明の DNAのプロモータ一活性を調節したと判定される。
さらに、 本発明においては、 上記評価方法を利用して、 複数の被験化合物につ いて、 本発明の DNAのプロモーター活性を調節する力否かを評価し、 プロモーター 活性を調節する化合物を選択することにより、 効率的にプロモーター活性を調節 する化合物をスクリーニングすることができる。 該スクリーニング方法によって 取得される化合物は、 遺伝子の根特異的な発現を制御することが可能であり、 非 常に有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 ジャーミン様タンパク 4遺伝子の組織別の相対的な発現量を RT-PCRによ つて調べた写真である。
図 2は、 配列番号： 2に示したジャーミン様タンパク 4遺伝子のプロモーター部 分を切り出し、 pblue- sGFP (S^T) - NOS SKに含まれる緑色蛍光タンパク （GFP) 遺 伝子の上流に連結することによって構築したプラスミドの遺伝子地図と、 そのプ ラスミドからプロモーター： GFP：ターミネータ一のひとつながりを切り出し、 植 物用バイナリーベクターである PPZP2H- lacのマルチクローニングサイトに挿入す ることによって構築したプラスミドの遺伝子地図を示した図である。
図 3は、 本実施例の DNA断片を上流 （5 '側） から削った DNA断片のシリーズを作 製しそれぞれをベクターに連結した図である。
図 4は、 イネにおける本発明のプロモーターによる遺伝子の発現結果を検証す る写真である。 蛍光顕微鏡によるイネの根の蛍光像を示す。
1 . 蛍光顕微鏡による根の蛍光像。
2 . 通常光下における、 カルスから再分化中のイネの写真。
3 . 2の蛍光像。 根とカルスは蛍光を発しているが、 葉は全く蛍光を発していな い。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する力 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。 なお、 ゲノム DNAの調製、 mRNAの調製、 DNAの切断、 連結、 大腸菌の形質転換、 遺伝子の塩基配列決定等一般の遺伝子組換えに必要な 方法は、 特に記載のない限り、 各操作に使用する市販の試薬、 機器装置等に添付 されている説明書や、 実験書 （例えば rMolecular Cloning (Sambrookら（1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Pressリ 」 ) に¾本的に従った。
〔実施例 1〕 根特異的発現をする遺伝子の探索
( a ) cDNAライブラリーの作成
イネの様々な部位からそれぞれ cDNAライブラリーを作成した。 ライブラリーの 作成は (Okubo et al. Large scale cDNA sequencing for analysis of quantita tive and qualitative aspects of gene expression, nature genetics 2 : 173-1 79 (1992) ) に基本的に従って行った。 根から作成した cDNAライブラリーから 3334 個のクローンを単離、 根以外の組織から作成した cDNAライブラリ一からは 8875個 のクローンを単離して塩基配列を決定した。 塩基配列の決定には、 PCR product P re-Sequencing Kit (USB)と DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Seuencing Kit f or MegaBACE (amaersham pharraacia biotech)で反応を行レヽ、 MegaBACElOOOを用レヽ て行った。
それらのクローンを塩基配列によるクラスタリングにより、 グループ分けをし、 根由来のライブラリーに 3回出現し、 根以外の組織由来のライブラリーには 1回 も出現しなかったグループを選択した。
このグループの塩基配列を GenBank/EMBLデータベースを元に BLASTプログラムを 用いてホモロジ一検索を行ったところ、 このクローンがジャーミン様タンパク 4
(germin protein 4； GER4) 遺伝子と推定される配列に一致することが判明した。 ( b ) ジャ一ミン様タンパク 4遺伝子の発現
イネの根、 葉、 およびカルスから常法に従って RNAを抽出し、 逆転写反応 （条 件： 2 5 °C10分、 4 2 °C1時間、 9 9 °C5分） を行った。 プライマーは東洋紡の Oli go d (T)プライマーを、 逆転写酵素は GibcoBRLの SuperScriptllを用いた。 この逆 転写反応液の一部を铸型として、 GibcoBRLの SuperMix High Fidelityと下記のプ ライマー対を用いて PCR反応を行った。 この際の PCR反応条件は、 9 5 °Cで 5分間 の変性の後、 9 4。じで 3 0秒間、 6 4でで 3 0秒間、 そして 7 2 で 1分間を 2 5、 あるいは 3 0サイクル繰り返し、 最後に、 7 2 °Cで 3分間インキュベーショ ンを行う条件であった。
公知のイネ PACライブラリ一の配列 （ァクセッション番号： AP003020) に基づい て一対のプライマー （GER4Fc； 5' - CCGACTTGGCGTCCCCGGTG-3' (配列番号： 3 ) および GER4Rc ; 5' - GGCCTTGGCGAGGACGTCGG-3' (配列番号： 4 ) ) を合成した。 コントロールとして公知のィネアクチン遺伝子の配列 （ァクセッション番号： X16 280) に基づいて一対のプライマー （actFc； 5， - CTGGGTTCGCCGGAGATGAT - 3，
(配列番号： 5 ) および actRc； 5' - TGAGATCACGCCCAGCAAGG -3' (配列番号： 6 ) ) を合成した。
この結果、 図 1に示したように、 コントロールのァクチン遺伝子は根、 葉、 お よびカルスでほぼ一定に発現しているのに対し、 ジャーミン様タンパク 4遺伝子で は根に特異的にバンドが検出された。
〔実施例 2〕 ジャ一ミン様タンパク 4遺伝子のプロモーター領域の単離
公知のイネ PACライブラリーの配列 （ァクセッション番号： AP002971) に基づい て一対のプライマー (GER4Rx； 5， - ggtctagacgaacagcgcgtggttg _3， （酉己歹幡 号： 7 ) および GER4Fs； 5， - tggccgcggagctgaccaactcttgcac -3， （配列番号： 8 ) ) を合成した。 GER4Fsは、 正方向プライマーであり、 5 ' 末端側に制限酵素 S acll部位 （ccgcgg) を有する。 GER4Rxは、 逆方向プライマーであり、 5 ' 末端側 に制限酵素 Xbal部位 （tctaga) を有する。 このプライマー対を用いると、 ジャー ミン様タンパク 4遺伝子の翻訳開始点より上流 2072bpが増幅される。
常法に従って、 イネ （品種； 日本晴） のゲノム DNAを調製した。 上記のプライマ 一対を用い、 この DNAを鎳型として PCRを行い、 増幅 DNA断片を得た。 増幅された DN Aを、 制限酵素による切断と、 あるいは常法に従って塩基配列決定により目的の部 位が増幅されたことを確認した。
〔実施例 3〕 ジャーミン様タンパク 4遺伝子のプロモーター領域活性検定用べク ターの作成
まず、 ベクター pBluescript SK (Stratagene) に、 植物体内で強い蛍光を発す る緑色蛍光タンパク質の変異型 sGFP (S65T) (丹羽康夫：植物細胞工学シリーズ 4、 モデル植物の実験プロトコール、 ppll7- 121、 秀潤社、 1996) と Nosターミネータ 一を組み込んだプラスミドである pblue- sGFP (S65T) - NOS SK (丹羽康夫博士 静岡 県立大学大学院より分与） に、 PCRによって得られた DNA断片を組み込んだプラス ミドを作成した （図 2 ) 。 さらにこのプラスミドを Saclと Kpnlで切断し、 バイナ リーベクターである pPZP2H-lac (矢野昌裕博士農業生物資源研究所より分与） (Fuse et al. (2001) Plant Biotechnology 18 (3) : 219 - 222) のマルチクロー二 ングサイトにプロモーター領域- GFP-Nosターミネータ一のひとつながりの配列を 挿入することで、 プロモーター領域の活性を検定するための植物形質転換用バイ ナリーベクターを完成させた （図 2 ) 。
〔実施例 4 ] 植物への遺伝子導入
作成したべクターは凍結解凍法によりァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス 菌 EHA101に導入した。 凍結解凍法とは凍結した EHA101のコンビテントセルにプラ スミ ド溶液を加え、 3 7 °Cで 5分間保温する方法のことをいう。 目的のベクター が導入された菌株を用いてシロイヌナズナ （品種： Columbia) とイネ （品種： 日 本晴） に遺伝子を導入した。
シロイヌナズナヘの導入は、 「減圧浸潤法による形質転換 （荒木崇） 」 （植物 細胞工学シリーズ 4、 モデル植物の実験プロトコール、 ppl09_113、 秀潤社、 199 6) に記載の方法に基本的に従って行った。 ただし、 記載されている減圧の過程は 省いて行った。
イネへの導入は、 イネのカルス化と植物体の再生に関して、 「イネのカルス形 成と植物体再生 （西村哲、 島本功） 」 （植物細胞工学シリーズ 15、 新版モデル植 物の実験プロトコール、 pp78- 81、 秀潤社、 2001) を参考に、 ァグロバタテリゥム による形質転換は、 「ァグロバタテリゥムによる方法 （横井修二、 鳥山欽哉） 」
(植物細胞工学シリーズ 15、 新版モデル植物の実験プロトコール、 pp78- 81、 秀潤 社、 2001) を参考にして行った。
〔実施例 5〕 植物体で発現した GFPの観察
GFPの発現はシャーレにいれた寒天培地上で育てた植物体を、 直接蛍光顕微鏡で 観察することができる。 蛍光顕微鏡は IX- FLA (ォリンパス） で、 U- MNIBAフィルタ - 2 1 - 一を用いて観察を行った。 イネにおける蛍光像を図 4に示した。 〔実施例 6〕 プロモーター領域の絞込み
プ口モーターの活性領域を絞り込むために、 図 3に示したようにプロモーター 領域を上流側から段階的に欠損させたシリーズを作成した。 翻訳開始点より上流 2 072塩基の断片を作成した場合と同様に、 逆方向プライマーは 5 ' 末端側に制限酵 素 Xbal部位 (tctaga) を有する GER4Rxを用い、 正方向プライマーは 5 ' 末端側に 制限酵素 SacII部位 （ccgcgg) を有するプライマー （GER4F15S； 5' - TGGCCGCggga aacttggcttgttttgat-3' (配列番号： 9 ) 、 GER4F10s； 5' - GGCCGCggacgattttgc tatacatttat -3， （配列番号： 1 1 ) 、 GER4F06s； 5， - TGGCCGCggtagtcccgtaacc gtagc _3， （配列番号 : 1 0 ) GER4F036s； 5， 一 TGGCCGCGgtctatctccagcaatttatg gt -3' (配列番号： 1 2 ) 、 GER4F022s； 5， - TGGCCGcggcggcggcttcgtccg -3， (配歹 (J番号： 1 3 ) 、 GER4F014s； 5' - TGGCCGCggtgaactgatcaattattagttg -3， (配列番号： 1 4) ) をそれぞれ用いて、 翻訳開始点より上流 1508塩基、 1043塩基、 627塩基、 356塩基、 223塩基、 140塩基の断片を作成した。
これらの DNA断片と GFP遺伝子を連結させたキメラ遺伝子構築物 （図 3の②、 ③、 ④、 ⑤、 ⑥、 ⑦） をイネとシロイヌナズナの植物体に導入した。
その結果、 ②、 ③、 ④を導入したシロイヌナズナでは①と同様に GFPの蛍光は観 察されず、 イネでは根が特異的に光っているのが観察された。 このことから、 ィ ネの根における発現の誘導には、 627bpからなる断片 （配列表の配列番号： 2の 14 46番目から 2072番目までの配列からなる断片） で十分機能することを突き止めた。 また⑤、 ⑥、 ⑦を導入したイネとシロイヌナズナでは GFPの有意な蛍光は観察され なかったことから、 627bpからなる断片 （配列表の配列番号： 2の 1446番目から 20 72番目までの配列からなる断片） に含まれる 272bpからなる配列 （配列表の配列番 号： 2の 1446番目から 1717番目までの配列からなる断片） の一部、 または全部が イネの根で特異的な発現をするプロモーターのシス領域として必須であることを 突き止めた。 産業上の利用の可能性
本発明により、植物の根で特異的に遺伝子の発現を制御するのに有用なプロモ 一ターとして機能する DNA、 該プロモーターを含む発現ベクター、 該発現ベクター を導入した形質転換細胞および形質転換植物体、 更には該プ口モーターの制御下 にある遺伝子の発現量を調節する方法が提供される。
形質転換植物体において、 本発明のプロモーターを機能させることにより、 根 組織で特異的に目的遺伝子を発現させることができる。 目的遺伝子としては、 あ らゆる遺伝子の選択が可能である。
本発明のプロモーターは、 イネの根全体にわたる強い発現活性が見られること から、 幅広い用途への利用が期待できる。 例えば、 本発明のプロモーターで発現 させる遺伝子として栄養吸収関連遺伝子、 栄養飢餓耐性遺伝子、 旱魃耐性遺伝子、 耐病原菌性遺伝子、 耐虫性遺伝子などを選択した場合は、 多様な不良土壌にも適 応性の高い植物を育成することが可能となる。
更に、 該プロモーターの制御下にある目的遺伝子の発現量を調節する方法によ つて、 目的遺伝子の産物であるタンパク質やその働きによって細胞内で生じる物 質を効率的に生産させることができ、 この生産には、 形質転換細胞あるいはその 細胞からなる毛状根など組織の培養物、 あるいは形質転換植物体の栽培収穫物が 利用可能となる。
カロえて、 本発明のプロモーターに他の発現制御配列、 例えば、 薬剤に応答して 抑制が解除されるリプレッサー配列などを連結することにより、 薬剤に応答し、 かつ特定の様式で遺伝子発現を誘導するプロモーターの構築が可能になる。
ただし、 シロイヌナズナではプロモーター活性がなかったことから、 利用でき る植物種は限られる可能性が高い。 しかし逆に活性を持つ植物種が少ないという ことは、 開放系の環境において遺伝子の流出 （他の生物への組み込み） による危 険性が小さくなるため安全性は高いといえる。

Claims

請求の範囲
I . 下記の （a ) 、 ( b ) または （c ) の DNAを含むプロモーター。
( a ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNA
( b ) 配列番号： 1に記載の塩基配列において 1もしくは複数の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列からなり、 かつプロモーター機能を有 する DNA
( c ) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとス トリンジェントな条件下 にハイブリダィズし、 かつプロモーター機能を有する DNA
2 . 請求項 1に記載のプロモーターの下流に、 外来遺伝子および植物ターミネ 一タ一が機能的に連結した構造を有する DNA。
3 . 請求項 1に記載のプロモーターを含むベクター。
4 . 請求項 1に記載のプロモーターの下流に外来遺伝子揷入部位および植物タ ーミネーターを含む、 請求項 3記載のベクター。
5 . 請求項 2に記載の DNAを含むべクタ一。
6 . 請求項 1に記載のプロモーター、 請求項 2に記載の DNA、 または請求項 3〜 5のいずれかに記載のベクタ一を含む、 形質転換細胞。
7 . 微生物である、 請求項 6に記載の形質転換細胞。
8 . 植物細胞である、 請求項 6に記載の形質転換細胞。
9 . 請求項 8に記載の細胞を含む、 形質転換植物体。
1 0 . 請求項 9に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、 形質転 換植物体。
I I . 請求項 9または 1 0に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
1 2 . 請求項 9または 1 0に記載の形質転換植物体の作製方法であって、 請求 項 1に記載のプロモーター、 請求項 2に記載の DNA、 または請求項 3〜5の いずれかに記載のベタター'を植物細胞へ導入し、 該植物細胞から植物体を 再生させる工程を含む方法。
植物の根において外来遺伝子を発現させる方法であって、 請求項 2に記 載の DNA、 または請求項 4もしくは 5に記載のベクターを該植物の細胞へ導 入する工程を含む方法。
被験化合物について、 請求項 1に記載の DNAのプロモーター活性を調節す るか否かを評価する方法であって、
( a ) 請求項 1に記載の DNAとレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を 有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、 被験化合物を接触させるェ 程、
( b ) 該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、 被験化合物が該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させた場合 に、 被験化合物が請求項 1に記載の DNAのプロモーター活性を調節すると判 定される方法。
以下の工程 （a ) および （b ) を含む、 請求項 1に記載の DNAのプロモー ター活性を調節する化合物のスクリーニング方法。
( a ) 請求項 1 4に記載の評価方法により、 被験化合物について、 請求項 1 に記載の DNAのプロモーター活性を調節するか否かを評価する工程
( b ) 被験化合物から、 該 DNAのプロモーター活性を調節すると評価された化 合物を選択する工程
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