WO2004081213A1 - 植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有するdna及びその利用 - Google Patents

植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有するdna及びその利用 Download PDF

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WO2004081213A1
WO2004081213A1 PCT/JP2004/003219 JP2004003219W WO2004081213A1 WO 2004081213 A1 WO2004081213 A1 WO 2004081213A1 JP 2004003219 W JP2004003219 W JP 2004003219W WO 2004081213 A1 WO2004081213 A1 WO 2004081213A1
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WO
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promoter
gene
dna
plant
expression
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/003219
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English (en)
French (fr)
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Hiromi Higo
Hironori Mano
Kayo Tsuruya
Lisa Monna
Original Assignee
Plant Functional Genomics Co. Ltd.
Plant Genome Center Co. Ltd.
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Publication date
Application filed by Plant Functional Genomics Co. Ltd., Plant Genome Center Co. Ltd. filed Critical Plant Functional Genomics Co. Ltd.
Publication of WO2004081213A1 publication Critical patent/WO2004081213A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters

Definitions

  • the present invention relates to DM having promoter activity in callus cells of a plant and use thereof.
  • Non-Patent Documents 1 to 7 One of them is a method using two types of T-DNA cassettes. In this method, first, the gene to be introduced and the selectable marker gene are inserted into separate T-DNA cassettes and co-transformed to integrate the two genes into independent sites. Then, in the next generation, both genes are separated and individuals with a selection marker-free are selected.
  • the disadvantage of this method is that it requires a lot of time and effort.
  • a second method is to remove the selectable marker ⁇ gene by site-specific excision using the cre / lox system or R / RS system after transformation (Non-patent Documents 8 to 1). 1).
  • an important point is to control the timing at which the ere gene or R gene that induces excision of the selectable marker is expressed.
  • One solution is to ligate these genes to an inducible promoter and, at the appropriate time, Induction of gene expression controls excision of the selectable marker gene.
  • a third method is to obtain a marker-free individual using a corn Ac / Ds transposon (Non-Patent Documents 12).
  • this method also has the drawback that, similarly to the first method, the target individual can be obtained for the first time in the next generation, which takes too much time and effort.
  • a fourth method is to use a promoter that is activated only in callus cells but not in plants regenerated from callus cells. This method has recently been reported in a model experiment using a promoter that is expressed only in callus tissue (Patent Document 1, Non-patent Document 13). This method has the advantage that complicated procedures such as those described above are not required after the transformation of callus cells.
  • Patent Document 1 Patent No. 2003 265182
  • Non-Patent Document 1 Depicker A, Herman L, Jacobs A, Schell J, Van Montagu M
  • Non-patent document 2 McKnight TD, Lillis MT, Simpson RB (1987) Plant Mol Biol 8: 439-445, De Block M, Debrouwer D (1991) Theor Appl Genet 82: 257-263
  • Non-patent document 3 De Block M, Debrouwer D (1991) Theor Appl Genet 82: 257-26
  • Non-Patent Document 6 De Framond AJ, Back EW, Chilton WS, Kayes L, Chilton MD
  • Non-Patent Document 7 Deley M, Knauf VC, Sumraerfelt KR, Turner JC (1998) Plant Cell Rep 17: 489-496
  • Non-Patent Document 8 Odell J, Caimi P, Sauer B, Russell S (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378
  • Non-Patent Document 9 Dale EC, Ow DW (199l) Proc Natl Acad Sci USA 88: 10558-105 62
  • Non-Patent Document 11 Gleave AP, Mitra DS, Morris BAM (1999) Plant Mol Biol 40: 223-235
  • Non-Patent Document 1 2 Yoder JI, Goldsborough AP (1994) Biotechnology 12: 263-267, Goldsbrough AP, Lastrella CN, Yoder JI (1993) Biotechnology 11: 1286-1 292
  • Non-Patent Document 13 Huang N., Wu L., Nandi S., Bowman E., Huang J., Sutlif f T., Rodriguez R. L. (2001) Plant Science 161: 589-595
  • transgenic plants When transgenic plants are produced, they are often performed via calli. Especially, the main grains are monocotyledonous plants. Therefore, there is a need for a promoter for a selectable marker gene that is stably expressed at high levels in monocotyledonous plants.
  • the promoters currently used are mainly derived from viral dicotyledonous plants, which may not always show sufficient activity in monocot cells (McElroy D, Bret tell RIS (1994) Trends Biotechnol 12: 62-68, Wilmink A, van de Ven BC., Dons JJ. (1995) Plant Mol Biol 28: 949-955).
  • promoters derived from monocotyledonous plants have been proven to have high expression in monocotyledonous plant cells as expected (Jang IC., Choi WB., Lee I., Song SI., Nairn I., Kim JK.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a novel promoter that activates callus cells specifically.
  • the present invention provides a promoter derived from a monocotyledonous plant. It is a further object of the present invention to produce a useful transformant using the promoter.
  • the present inventors prepared a cDNA library for the callus in the rice growth phase, and selected the RezA gene from clones with high expression frequency. As a result of examining the expression of the RezA gene by RT-PCR, it was found that it was expressed in the callus during the growth and regeneration stages, and hardly expressed in the leaves and roots. Then, next, the putative promoter region of the RezA gene consisting of 2527 bp was cloned, and in order to determine the portion that governs callus expression activity, the putative promoter portion was cut stepwise from the 5 'end. Then, a reporter analysis using sGFP was performed.
  • a 233 bp DNA fragment 5 'upstream from the coding region is a necessary and sufficient region to maintain promoter activity in calli, and even a 135 bp DNA fragment is ⁇ ! It was found to show half the promoter activity.
  • the GUS gene was ligated and introduced into rice to examine the promoter activity of 233b and 135bp in rice seeds. As a result, the GUS gene was not expressed in the endosperm in either promoter. However, in the aleurone layer, the promoter of 233 bp promoted weak expression, and the expression of GU S by 135 bp was very low or not.
  • a recombinant can be produced that does not accumulate unnecessary selectable marker gene products in the endosperm corresponding to the portion to be eaten.
  • four or eight tandem fragments of the En Vansa derived from the Ca V35S promoter known to have a function to enhance expression in plants, have been shown to be 351-84. After binding, promoter activity was measured. As a result, it was found that the 135 bp promoter exhibited the same promoter activity as the CaMV35S promoter, and showed a higher expression effect by increasing the number of enhancers added. Therefore, a 135 bp promoter in which four or eight enhancers are added in tandem is expected to have the same high selection efficiency as the CaMV35S promoter.
  • the present invention relates to the use of a promoter that is stably and highly expressed in callus cells, and more specifically, provides the following invention.
  • a transformed plant comprising the transformed plant cell according to (10) or (11).
  • transgenic plant which is a progeny or clone of the transgenic object according to (12).
  • the promoter in the present invention is not particularly limited as long as it has promoter activity in plant callus cells.
  • the leaves and / or roots of plants regenerated from callus cells have substantially no promoter activity.
  • “substantially has no promoter activity” refers to an activity of 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 1% or less (eg, 0.5%, 0% or less) of the activity in callus cells. 3%, 0.1% or less).
  • the promoter of the present invention includes 2527 bp upstream of the translation initiation site shown in SEQ ID NO: 2.
  • a DNA consisting of a base sequence containing at least a base sequence of 135 bp upstream of the translation initiation site is preferred.
  • Such DNA includes a DNA consisting of a base sequence of 2527 bp upstream of the translation start site shown in FIG.
  • SEQ ID NO: 2 a DNA consisting of a base sequence of 997 bp upstream of the translation start site, comprising DNA, consisting of the translation initiation point upstream 233b P base sequence DNA (SEQ ID NO: 1), you Yopi translation initiation upstream 135 bp (SEQ ID NO: 1 2)
  • Ru contains DNA consisting of the nucleotide sequence.
  • DNA consisting of a base sequence of 233 bp upstream of the translation start site (SEQ ID NO: 1) is suitable from the viewpoint that it is short and has high motor activity, and consists of a base sequence of 135 bp upstream of the translation start site.
  • DNA (SEQ ID NO: 12) is inferior to DNA consisting of a 233 bp base sequence in promoter activity, it is preferred from the viewpoint that it is expressed only in callus and has high specificity in the expression site.
  • the promoter in the present invention is preferably derived from a monocotyledon for the purpose of producing a transformed monocotyledonous plant.
  • the monocotyledon is typically rice, but may be another monocotyledon.
  • DNA having a function equivalent to that of the rice-derived DNA shown in SEQ ID NO: 12 can be isolated from the monocotyledonous plant of the above.
  • a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions.
  • stringent hybridization conditions include 6 M urea, 0.4% SDS, 0.5 XSSC, or 0.1% SDS (60 ° C, 0.3 m ol NaCl, 0.03M sodium taenoate) or the equivalent stringency of hybridization 3 conditions. Under conditions of higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, and 0.1 ⁇ SSC, it is expected that more homologous DNA can be isolated.
  • the DNA isolated in this way has significant homology to the rice-derived DNA shown in SEQ ID NO: 12.
  • the significant homology is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, most preferably 90% or more (eg, 95, 96, 97, 98, 99% or more).
  • the nucleotide sequence identity can be determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 2264-2268., Karlin, S. & Altschul, SF., Proc Natl. Acad Sci. USA) , 90, 5873.).
  • a program called BLASTN based on the BLAST algorithm has been developed (Altschul, SF.
  • one or more bases may be substituted, deleted, added, and Z or inserted in the base sequence of SEQ ID NO: 12 as long as the promoter activity is exhibited in callus cells.
  • It may be a DNA consisting of a base sequence.
  • the “plurality of bases” is preferably within 30 bases, more preferably within 10 bases, even more preferably within 5 bases (eg, within 3 bases).
  • Methods well known to those skilled in the art for preparing such DNA include, for example, mutations by site-directed mutagenesis (Kramer, W. & Fritz, Hj., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.). Can be mentioned. Base mutations in DNA can also occur in nature.
  • Whether or not the prepared DNA has the promoter activity can be examined, for example, by a well-known reporter assay using a reporter gene.
  • a reporter assay a vector is prepared in which a reporter gene is operably linked downstream of the prepared DNA, and the vector is introduced into callus cells to measure the reporter activity in the cells.
  • the reporter gene is not particularly limited as long as its expression is detectable.
  • GFP gene, CAT gene, lacZ gene, luciferase gene, and -dalcuronidase hereinafter, referred to as commonly used in the art
  • GUS -dalcuronidase
  • the expression level of the reporter gene can be measured by detecting the fluorescence of the GFP protein.
  • the reporter gene is a CAT gene
  • the expression level of the reporter gene can be measured by detecting acetylamyl chloramphenicol by the gene product.
  • the promoter DNA in the present invention may be genomic DNA or chemically synthesized DNA. Preparation of genomic DNA can be carried out by a person skilled in the art using conventional means.
  • genomic DNA for example, genomic DNA is extracted from plant cells, and a genomic library (plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as a vector) is prepared, and is described in SEQ ID NO: 12.
  • a genomic library plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc. can be used as a vector
  • primers specific to these DNAs and to perform genomic DNA extracted from plant cells by performing PCR to form III.
  • the promoter DNA of the present invention can enhance its promoter activity by binding to an enhancer.
  • the phrase "functionally linked" between the promoter DNA and the enhancer in the present invention means that the promoter DNA having the promoter activity of the present invention is linked to the enhancer so that the promoter activity is enhanced. Say. Therefore, even if the distance between the promoter DM and the enhancer is large or another gene is inserted between them, if the promoter activity of the promoter DNA of the present invention increases,
  • the enhancer may be present either upstream or downstream of the promoter DNA of the present invention.
  • the enhancer is a messenger RNA OnR generated by transcription.
  • Enhancer is a nucleotide sequence that has the effect of promoting the action of a promoter, and generally has a sequence of around 100bp. Enhancers can promote transcription regardless of sequence orientation. Also, enhancers themselves do not have promoter activity, but enhancers can activate transcription from thousands of base pairs away. In addition, enhancers are present upstream, downstream, and within the gene to be transcribed, and can activate transcription. Further, as described above, the enhancer of the present invention is not limited as long as it increases the amount of mRNA generated by transcription, and thus inhibits degradation of mRNA or stabilizes mRNA after transcription of mRN-A. Thus, the enhancer of the present invention also includes those that increase the amount of mRNA present in a cell and increase the translation efficiency of amino acid.
  • the enhancer used in the present invention may be of one type, or two or more of the same enhancers may be used in combination, or different enhancers may be used in combination.
  • the enhancer used in the present invention is not limited, but is preferably an enhancer derived from the CaMV35S promoter, and more preferably the -351 to -84 portion of the enhancer.
  • the promoter activity can be further enhanced by increasing the number of the enhancers added to the tandem.
  • the number to add is Promo The activity is not limited as long as the activity is increased, but is more preferably 4 or 8.
  • a vector in which an arbitrary gene is functionally linked to the promoter is prepared, and this is introduced into plant cells. Then, a plant is regenerated from the plant cell.
  • “functionally linked” means that any gene is linked to the promoter of the present invention so that any gene is expressed under the control of the promoter of the present invention.
  • the gene linked downstream of the promoter is not particularly limited, and is a desired gene to be expressed in plant cells.
  • a selectable marker gene is particularly preferably used, but is not limited thereto, and may include a gene encoding a useful protein, an antisense gene, a gene expressing double-stranded RNA or ribozyme RNA, and the like. Use is also conceivable.
  • Selectable marker genes include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene that is resistant to the antibiotic hygromycin, the neomycin phosphotransferase gene that is resistant to kanamycin or gentamicin, and acetyltransferase that is resistant to the herbicide phosphinothricin. Erase gene and the like.
  • Genes that confer agriculturally superior traits include, for example, disease resistance, insect resistance, virus resistance, bacterial resistance, mold resistance, stress resistance, flower color-related genes, genes involved in morphogenesis,
  • biosynthetic genes for bioactive substances and genes for producing useful substances include vaccine genes, antibody genes, and pharmaceutical raw material production genes.
  • genes involved in the production of useful substances for example, biosynthetic genes of fats and oils, industrial enzyme genes, and the like can be considered.
  • genes required for research on gene expression mechanisms can be considered. These may be genes cloned from natural organisms, chemically synthesized genes, or combinations or modified genes thereof.
  • the number of genes to be introduced into plant cells is not limited to one, but may be plural depending on the purpose.
  • the vector preferably contains a selectable marker gene in addition to the gene of interest.
  • the target gene may be governed by a promoter different from the promoter of the present invention.
  • Transformed plant cells can also be selected by introducing a vector containing the desired gene into a plant cell together with a vector containing the selected gene.
  • the “plant cell” into which the vector is introduced includes various forms of plant cells, for example, callus cells, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and the like. Preferably, it is a callus cell.
  • the plant cells are preferably derived from monocotyledonous plants, most preferably from rice.
  • a particle gun method a polyethylene glycol method, an electroporation method (electroporation method), and a method via an agglomerator
  • a method can be used.
  • a method via an agrobacterium eg, EHA101
  • an ultra-rapid monocot transformation method Japanese Patent No. 3141084
  • the particle gun method it is possible to use, for example, a device of Piola, and as the gene introduction device, for example, a GIE-III type IDEM (Tanaka) can be used.
  • a method for producing transformed plants in rice includes a method in which a gene is directly introduced into cells by a particle gun method to regenerate plants (Ch ristou P, et al: Biotechnology 9: 957, 1991), polyethylene, and the like. Gene transfer into protoplasts using glycol to regenerate plants (Indian rice varieties are suitable.) (Datta SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg, Eds) pp.
  • a method for regenerating plants Japanese rice varieties are suitable) by introducing genes into protoplasts using electric pulses (To ki S, et al: Plant Physiol 100: 1503, 1992), and a method of regenerating plants by introducing a gene through ⁇ agrobataterium (Hiei Y, et al: Plant J 6: 271, Some technologies have already been established and widely used in the technical field of the present invention. In the present invention, these methods can be suitably used.
  • progeny can be obtained from the plant by sexual or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tubers, roots, strains, calli, protoplasts, etc.) from the plant, its progeny or clones, and mass-produce the plant based on them. It is possible.
  • FIG. 1 is a photograph showing a comparison of expression levels in leaf, limb and callus tissues of each gene by RT-PCR. Extraction of total RNA from rice (japonica) shoots, roots, callus grown in the presence of 2.4D (2 mg / l), and callus cultured in the presence of NM (lmg / l) + BA (2 mg / l) Then, the expression level of the RezA gene was compared by RT-PCR.
  • Fig. 2 is a photograph showing the results of isolation of the 5, untranslated region of the RezA gene by long PCR. M indicates a marker.
  • Lane 1 a PCR fragment (arrow) of 2527 bp 5 'upstream of the RezA gene was amplified.
  • FIG. 3 is a diagram showing a delay mutant used for promoter analysis of the RezA gene.
  • sGFP indicates a reporter gene
  • tNOS indicates one sequence of the NOS terminator.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of a transient expression assay of the RezA gene promoter using cultured rice calli cells.
  • A is a fluorescence photograph of rice callus cells showing transient expression. The gene was introduced using a particle gun. Statistical processing by sampling 20 cells that emit fluorescence for each delay mutant did.
  • B shows the results of measuring the fluorescence intensity of transient expression of GFP. Expression decreases from about 200 bp or less.
  • FIG. 5 is a photograph showing RezA gene promoter activity in a transformant rice seed. It can be seen that the promoter is not expressed in the promoter of the 135 bp DM fragment in (a), and that it is expressed only in the aleurone layer in the promoter of the 233 bp DNA fragment in (b).
  • C Transformed rice seed into which a 233 bp long promoter has been introduced is cut vertically. No expression in the endosperm has occurred.
  • FIG. 6 is a photograph showing the expression of a 135 bp promoter with an enhancer added in rice callus.
  • 1 is 135bp only, 2 is 2 enhancers added, 3 is 4 enhancers added, 4 is 8 enhancers added, 5 is positive control (CaMV35S promoter expression activity) Show.
  • FIG. 7 is a photograph showing the difference in the expression site between the CaMV35S promoter and the RezA gene promoter (I35bp with eight enhancers) in rice seeds.
  • the results of clustering the clones expressed in each tissue were shown as a histogram and compared between tissues.
  • the RezA gene was selected from clones that were particularly highly expressed in calli.
  • Example 3 Expression level comparison of RezA gene in each tissue by RT-PCR Shoots and roots of rice (japonica) 2.4D (2 mg / l). Proliferating callus cultured in the presence of NM (lmg / l l) Total RA was extracted from callus during regeneration in the presence of + BA (2 mg / l) using Sepasol RNA I CAT. NO. 306-55 (nacalai tesque) according to the manual. cDNA was synthesized using the kit (GIBC0 BRL) of Superscript TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning CAT. NO. 182448-031. The following primers were used for detection of expression levels in leaves, roots, growing calli and re-eating calli of the RezA gene by RT-PCR.
  • This primer pair amplifies 318 bp of coding region 3 of RezA gene.
  • PCR was performed using PCR SuperMix High Fidelity, CAT. NO. 1090-020 (GIBC0 BRL) for 30 seconds at 94 ° C, followed by 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 58 ° C, 72 ° C. 25 cycles of 30 seconds at C.
  • a homology search was performed using the RezA gene sequence to obtain a genome sequence (GenBank accession number: AP000570) and annotation. Based on these information, it was predicted that EST existed at the position 5-25 at the position -2541 from the start of the coding region of the RezA gene, so the promoter region of the RezA gene was assumed to be at most 2541 bp. From the reported cDNA information of the full-length RezA gene (GenBank accessionNumber: U46138), the transcription start point was predicted to be -65 of the translation start point (ATG).
  • the full length 2527 bp including the 5 ′ UTR was estimated as a promoter site, and the PCR primer (5 tcaagcttgaccgctaccctgggcc3 Zsc column number: 5, 5 gctct agatcggatcactcgatcggacggc3 ′ Z Zori selfie: 6) was placed on the 5, side.
  • the Hindlll site was added to the third, and the Xbal site was added to the side.
  • Genomic DNA was extracted from rice (japonica) leaves and used as a template for PCR ( Figure 2).
  • PCR was performed using PCR SuperMix High Fidelity, CAT. NO. 1090-020 (GIBCO BRL) at 94 ° C for 30 seconds, followed by 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 25 cycles of 2 minutes 30 seconds at 72 ° C were performed, and the product was purified and recovered by ethanol precipitation.
  • the purified and recovered DNA fragment is treated with the restriction enzymes Hindlll and Xbal, treated with CaMV35S-sGFP (S65T) -N0S3 '(produced by Dr. Yasuo Niwa from Shizuoka Prefectural University graduate School) into a vector opened with Hindlll and Xbal and sequenced. Confirmed.
  • plasmid DNA was coated on 1 ⁇ M gold particles CAT. NO. 165-2263 (Bio Rad) using a gene transfer device GIE-III type IDERA (Tanaka) to callus cells or leaves. I typed it in.
  • the plasmid DNA to be introduced is purified and extracted using the plasmid mini Kit CAT. NO. 12125 (QIAGEN), and the coating is performed with DNAlO zg and gold suspension buffer (0.3 mg gold particles / 50 1 water; and 2.5 M CaCl2).
  • the mixture was mixed with 50 1 and 0.1 M spermidine 20 ⁇ 1 and stirred for 30 minutes. After stirring, the gold particles were washed twice with 70% ethanol, and suspended by adding 50 ⁇ l of 100% ethanol.
  • the gene transfer conditions were as follows: vacuum pressure -80 Kpa, He pressure 0.6 Mpa, distance from the sample 9 cm, ejection time 0.025 seconds, gold particle liquid 5 ⁇ 1 (plasmid DNA amount 1 ⁇ g).
  • the sample after the transfection treatment was cultured at 28 ° C- ⁇ in a hormone-free LS medium.
  • Promoter activity was measured using a fluorescence camera (CoolSNAP NipponRoper) with sGFP fluorescence detected under a fluorescence microscope (OLYMPUS 1X70), and the image signal was analyzed using a fluorescence intensity measurement software (Proper scienceTM RSimage versionl. 73). It was measured. The measurement was performed by selecting 20 cells in one delay mutant. A quasi-error value was given.
  • the GUS gene was ligated and introduced into rice (Fig. 5). As a result, it was clarified that the GUS gene was not expressed in the endosperm of either promoter. However, the 233 bp promoter showed weak expression in the aleurone layer. + In contrast, GUS expression at 135 bp was very low or even zero in the aleurone layer. This result indicates that when 135 bp is used for the selection promoter, a recombinant can be produced that does not accumulate unnecessary selectable marker gene products in the endosperm corresponding to the part to be eaten.
  • the strength of the 135bp promoter activity in calli is about half that of 35S, so it is too weak to use as it is for selection.
  • Enhancers derived from the CaMV 35S promoter are known to have a function to enhance expression in plants (Odell JT, Knowlton S., Lin W., Mauvais CJ (1988) Plant Molecular Biology 10: 26 3-272). . Therefore, as a device for enhancing the expression, four or eight Enhancer'-351-84 parts (SEQ ID NO: 13) derived from the CaMV35S promoter were linked in tandem. As a result, the 135 bp promoter increased to the same strength as the CaMV 35S promoter.
  • a 135bp promoter with 4 or 8 enhancers in tandem has the same high selection efficiency as the CaMV 35S promoter. There is expected.
  • the expression of the 135 bp promoter was greatly enhanced in callus cells by the enrichment of Enhansa derived from the Ca 35S promoter, but was examined by transient expression in endosperm of rice seeds to determine whether it has or was not effective.
  • Results As a result, expression of 135 bp was not observed in endosperm even with the addition of eight Enhancers (Fig. 7).
  • the 135bp upstream region of the RezA gene contains 5, UTR of 95bp (KOME database Accession No. AX069098 http: //ww.nias.affrc.go.jp), and in fact 40bp is regarded as a motor.
  • PLACE data base Hi go K., Uga a Y., Iwamoto M., Korenaga T. (1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) da tabase. 27: 397-300
  • Dof-1 which is a plant bZIP protein
  • this promoter does not have a TATA sequence, but instead contains an initiator element-like sequence, and is of the TATA-less type.
  • the technology for producing transformed plants is not limited to breeding of cultivated cereals, but also for various purposes such as production of industrial raw materials with plants as production plants, functional foods with preventive medicinal effects, and purification of soil and air pollutants. Is about to be used. However, there are many technical problems to be solved in order to produce a transformable product that can be used for these applications.
  • One of the challenges is the development of promoters that allow the transgene to function stably only at the intended location and time.
  • tissue that requires the expression of the selectable marker gene is often a callus growing. It is important to suppress the expression of unnecessary marker genes in tissues other than callus from the viewpoint of considering the effects on the environment and humans.Development of a promoter that expresses callus specifically in the growth phase is an effective means to solve this It is.
  • the promoter of the RezA gene found by the present inventors has high activity in the callus of rice in the growing phase, it is expected to be used as a vector for transforming many monocots including rice.
  • the 135 bp sequence in the upstream region of the RezA gene of the present invention exhibits a promoter activity equivalent to that of the CaMV35S promoter by binding to an enhancer derived from the CaMV35S promoter.
  • the use of the promoter of the present invention is expected not only for selective expression but also for protein production using callus cells having high proliferation ability.

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Abstract

　イネの増殖期カルスのcDNAライブラリーから発現頻度の高いRezA遺伝子のクローンを選択した。RT-PCRによりRezA遺伝子の発現を検討した結果、増殖期及び再分化期カルスで発現し、葉、根ではほとんど発現しないことが判明した。RezA遺伝子の推定プロモータ領域をクローニングし、この推定プロモータ部分を5'端から段階的に削り、その活性に必要な領域の同定を行った結果、コーデイング領域から5'上流の135bpのDNA断片が、カルスにおいてプロモータ活性を維持するのに充分な領域であることが明らかとなった。また135bpのDNA断片は、CaMV３５Sプロモータ由来のエンハンサーを結合させることによって、よりプロモータ活性を示すことがわかった。　この135bpの領域を含むDNA断片は、形質転換植物の作出において、特に選択マーカーを発現するための新規プロモータとして好適に利用しうる。

Description

明細書 植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有する DNA及びその利用 技術分野
本発明は、 植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有する DM及ぴその利 用に関する。 背景技術
形質転換体植物を作出する場合、 導入したい目的遺伝子以外に選択マーカー遺 伝子も同時に導入する必要がある。 このため、 現在、 作出された形質転換植物の 多くは選択マーカー遺伝子を発現している。 し力 し、 特に形質転換体植物が農作 物である場合、 選択マーカー遺伝子が食用となる組織で発現することは不必要か つ望ましくない形質である。 そのため選択マーカー遺伝子を発現しない形質転換 植物体を取得するための工夫がレ、くつか考案されている。
そのうちの一つは、 二種類の T- DNAカセットを用いる方法である（非特許文献 1〜7 )。 この方法においては、 まず、 導入したい遺伝子と選択マーカー遺伝子 を別々の T- DNAカセットに挿入して共形質転換することにより両遺伝子を独立し た箇所に組み込ませる。 そして、 次世代で両遺伝子を分離させて選択マーカーフ リーの個体の選抜を行う。 この方法には、 多くの時間と労力を必要とするという 欠点が存在する。
二つ目の方法としては、 形質転換後に cre/lox系や R/RS系を利用した部位特 異的切り出しによつて選択マーカー遗伝子を除去する方法が挙げられる（非特許 文献 8〜1 1 )。 この方法においては、 選択マーカーの切り出しを誘導する ere 遺伝子や R遺伝子を発現させるタイミングの制御が重要なボイントとなる。 1つ の解決策として、 誘導性のプロモータにこれら遺伝子を連結し、 適切な時期に遺 伝子発現の誘導を行うことで、 選択マーカー遺伝子の切り出しを制御している。 三つ目の方法としては、 トウモロコシの Ac/Ds トランスポゾンを利用してマー カーフリ一の個体を取得する方法が挙げられる（非特許文献 1 2)。 しかし、 この 方法の場合も、 一つ目の方法と同様に、 目的の個体は次世代で初めて取得するこ とができるため、 時間と労力がかかり過ぎるという難点がある。
四つ目の方法としては、 カルス細胞でのみ活性化し、 カルス細胞から再生され た植物体では活性化しないプロモータを用いる方法が挙げられる。 この方法に関 しては、 最近になり、 カルスの組織でのみ発現するプロモータを利用したモデル 実験での報告がなされた （特許文献 1、 非特許文献 13) 。 この方法には、 カル ス細胞の形質転換後に上記の方法のような煩雑な操作を行う必要がないという利 点がある。
〔特許文献 1〕 特許第 2003 265182
〔非特許文献 1〕 Depicker A, Herman L, Jacobs A, Schell J, Van Montagu M
(1985) Mol Gen Genet 201: 477-484
〔非特許文献 2〕 McKnight TD， Lillis MT, Simpson RB(1987) Plant Mol Biol 8:439—445、 De Block M, Debrouwer D(1991) Theor Appl Genet 82:257—263 〔非特許文献 3〕 De Block M, Debrouwer D(1991) Theor Appl Genet 82:257-26
3
〔非特許文献 4〕 De Neve M, De Buck S, Jacobs A, Van Montagu M, Depicker A (1997) Plant J 11:15—29
〔非特許文献 5〕 Komari T, Hiei Y， Saito Y， Murai N, Kumashiro T(1996) PI ant J 10:165-174
〔非特許文献 6〕 De Framond AJ, Back EW, Chilton WS, Kayes L, Chilton MD
(1986) Mol Gen Genet 202:125—131
〔非特許文献 7〕 Deley M， Knauf VC, Sumraerfelt KR， Turner JC(1998) Plant C ell Rep 17 :489-496 〔非特許文献 8〕 Odell J, Caimi P， Sauer B， Russell S (1990) Mol Gen Genet 223 : 369-378
〔非特許文献 9〕 Dale EC, Ow DW (199l) Proc Natl Acad Sci USA 88 : 10558-105 62
〔非特許文献 1 0〕 Russell SH， Hoopes JL, Odell JL (1992) Mol Gen Genet 23 4：49-59
〔非特許文献 1 1〕 Gleave AP, Mitra DS, Morris BAM (1999) Plant Mol Biol 4 0 : 223-235
〔非特許文献 1 2〕 Yoder JI， Goldsborough AP (1994) Biotechnology 12： 263-2 67、 Goldsbrough AP, Lastrella CN, Yoder JI (1993) Biotechnology 11 : 1286-1 292
〔非特許文献 1 3〕 Huang N.， Wu L. , Nandi S. , Bowman E. , Huang J. , Sutlif f T. , Rodriguez R. L. (2001) Plant Science 161 : 589-595
発明の開示
形質転換体植物を作出する場合、 多くはカルスを経由して行なわれる。 特に主 要な穀物は単子葉植物が多レ、。 それ故単子葉植物の力ルス細胞で安定して高発現 する選択マーカー遺伝子用プロモータが必要である。 し力 し、 現在のところ主に 使用されているプロモータはウィルス力双子葉植物由来のものであり、 これらは 単子葉植物細胞内で必ずしも十分な活性を示さない場合がある（McElroy D, Bret tell RIS (1994) Trends Biotechnol 12 : 62 - 68、 Wilmink A, van de Ven BC.， D ons JJ. (1995) Plant Mol Biol 28 : 949-955)。 それに対して単子葉植物由来の プロモータは単子葉植物細胞内で期待どおりの高発現をすることが証明されてい る（Jang IC. , Choi WB. , Lee ΚΗ. , Song SI. , Nairn ΒΗ. , Kim JK. (2002) Plant Physiology 129 : 1473—1481、 McElroy D, Blowers AD, Jenes B, Wu R (1991) Mol Gen Genet 231： 150-160、 Kyozuka J, McElroy D, Hayaka a T, Xie Y, Wu R, Shimamoto K(1993) Plant Physiol 102 : 991-1000、 Jang I- C， Nahm BH, KiraJ-K (1999) Mol Breed 5 :453-461、 Uchimiya H, Iwata M, Nojiri C, Smarajeewa PK， Takamatu S, Ooba S, Anzai H, Christensen AH, Quail PH, Toki S (1993) Bio/ Techology 11： 835 - 836)。 しカ し、 実用化されているプロモータの種類は今のと ころ圧倒的に少ないのが現状である。 さらに、 目的の形質転換体をつくるために 複数個の遺伝子を導入しなければならない場合には（Ye X.， Al-Babili S. , Klot i A. , Zhang J. , Lucca P. , Beyer P. , Potrykus I. (2000) Science 287 : 303-30 5、 Dhankher 0. P, , Li Y. , Rosen B. P. , Shi J. , Salt D. , Senecoff J. F. , Sas hti N. A. , Meagher R. B. (2002) Nature Biotechnology 20： 1140-1145)、 選択用 プロモータも複数必要となり、 新たなプロモータへの需要は高い。
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 カルス 細胞特異的に活性化する新規プロモータを提供することにある。 好ましい態様に おいて、 本発明は、 単子葉植物由来のプロモータを提供する。 該プロモータを利 用して有用な形質転 m¾物を作出することも本発明のさらなる目的である。
本発明者らは、 増殖期カルスで高発現するプロモータを得る目的で、 イネの増 殖期カルスの cDNAライブラリ一を作成し、 発現頻度の高いクローンの中から Re zA遺伝子を選択した。 RT- PCRにより RezA遺伝子の発現を検討した結果、 増殖期 及び再分化期カルスで発現し、 葉、 根ではほとんど発現しないことが判明した。 そこで、 次に、 2527bpからなる RezA遺伝子の推定プロモータ領域をクローニン グし、 さらにカルスでの発現活性を支配する部分を決定するために、 この推定プ 口モータ部分を 5' 端から段階的に削り、 sGFPを利用したレポーター解析を行つ た。 その結果、 コーディング領域から 5' 上流の 233bpの DNA断片が、 カルスに おいてプロモータ活性を維持するのに必要充分な領域であり、 135bpの DNA断片 でも^！半分のプロモータ活性を示すことが分かった。 次に、 イネ種子における 2 33b と 135bpのプロモータ活性を調べるために GUS遺伝子を結合してイネに導 入した。 その結果、 どちらのプロモータでも GUS遺伝子が胚乳部分では発現しな いが、 糊粉層においては 233bpのプロモータは弱い発現を促し、 135bpによる GU S発現は非常に低いかゼ口であった。 このことより、 135bpの DM断片を選択用 プロモータに利用した場合、 食べる部分に相当する胚乳では不要な選択マーカー 遺伝子産物は蓄積しないような組換え体を作成することができると考えられる。 さらに、 135bpの DNA断片のプロモータ活性を高めるために、 植物において発 現を高める機能を持つことが知られている Ca V35Sプロモータ由来のェンハンサ 一- 351〜- 84部分をタンデムに 4個または 8個結合して、 プロモータ活性を測定 した。 その結果、 135bpプロモータは CaMV35Sプロモータと同等なプロモータ活 性を示し、 ェンハンサ一の付加する個数を多くすることにより、 より高い発現効 果を示すことがわかった。 従って、 ェンハンサーをタンデムに 4個または 8個付 加した 135bpプロモータは CaMV35Sプロモータと同程度の高い選択効率を持つこ とが期待される。
以上の結果は、 この 135bpの領域を含む DNA断片が、 形質転換植物の作出にお いて、 特に選択マーカーを発現するための新規プロモータとして好適に利用しう ることを示すものである。
即ち、 本発明は、 カルス細胞で安定かつ高発現するプロモータおょぴその利用 に関し、 より詳しくは、 下記発明を提供するものである。
( 1 ) 植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有する、 下記 （a ) 〜 （d ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列からなる DNA
( b ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェント な条件下でハイブリダイズする DNA
( c ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列において、 1または複数の塩基が . 置換、 欠失、 付加、 および/または挿入された塩基配列からなる D
NA
( d ) 配列番号： 2に記載の塩基配列における、 少なくとも配列番号： 1 2に記載の塩基配列を含む塩基配列からなる DNA
(2) 植物の葉で実質的に活性ィ匕しない、 （1) に記載の DNA。
(3) 植物の根で実質的に活性化しない、 （1) に記載の DNA。 ·
(4) 植物が単子葉植物である、 （1) に記載の DNA。
(5) (1) 力、ら （4) のいずれかに記載の DNAを含むベクター。
(6) (1) から （4) のいずれかに記載の DNAに、 ェンハンサ一が機能的に結 合している (5) に記載のベクター。
(7) ェンハンサ一が CaMV35Sプロモータ由来のェンハンサーである、 （6) に 記載のベクター。
(8) (1) から （4) のいずれかに記載の DNAに任意の遺伝子が機能的に結合 している （5) から （7) のいずれかに記載のベクター。
(9) 任意の遺伝子が選択マーカー遺伝子である、 （8) に記載のベクター。
(10) (8) に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
(1 1) 単子葉植物由来である、 （10) に記載の形質転 物細胞。
(12) (10) または （11) に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物 体。
(13) (12) に記載の形質転^ f物体の子孫またはクローンである、 形質転 換植物体。
(14) (12) または （13) に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
本発明におけるプロモータとしては、 植物のカルス細胞においてプロモータ活 性を有するものであれば特に制限はない。 好ましくはカルス細胞から再生させた 植物の葉および/または根で実質的にプロモータ活性を有しない。 ここで 「実質 的にプロモータ活性を有しない」 とは、 カルス細胞における活性の 5%以下の活 性、 耔ましくは 3%以下の活性、 より好ましくは 1%以下 （例えば、 0.5%、 0. 3%、 0.1%以下） の活性であることを意味する。
本発明のプロモータとしては、 配列番号： 2に示す翻訳開始点上流 2527bpの 塩基配列からなるプロモータ領域において、 少なくとも翻訳開始点上流 135bpの 塩基配列を含む塩基配列からなる DNAが好ましい。 このような DNAには、 図 3に 示す翻訳開始点上流 2527bpの塩基配列からなる DNA (配列番号： 2 ) 、 翻訳開 始点上流 997bpの塩基配列からなる DNA、 翻訳開始点上流 478bpの塩基配列から なる DNA、 翻訳開始点上流 233bPの塩基配列からなる DNA (配列番号： 1 ) 、 お ょぴ翻訳開始点上流 135bp (配列番号： 1 2 ) の塩基配列からなる DNAが含まれ る。 この中でも翻訳開始点上流 233bpの塩基配列からなる DNA (配列番号： 1 ) は短鎖でかつプ口モータ活性が高レ、という観点から好適であり、 また翻訳開始点 上流 135bpの塩基配列からなる DNA (配列番号： 1 2 ) は、 プロモータ活性は 23 3bpの塩基配列からなる DNAよりも劣るが、 カルスのみに発現し発現部位に高い 特異性を持つという観点から好適である。 本発明におけるプロモータとしては、 単子葉植物の形質転換植物体を作出する目的では、 単子葉植物由来のものである ことが好ましい。 単子葉植物としては、 代表的にはイネであるが、 他の単子葉植 物であってもよい。
配列番号： 1 2に示す塩基配列を有するイネ由来の DNAと同等の機能を示す、 イネあるいは他の単子葉植物由来の DNAを単離する場合には、 一般的なハイプリ ダイゼーシヨン技術 (Southern, EM. , J Mol Biol, 1975, 98， 503. ) 、 または PCR技術 （Saiki, RK. et al.， Science, 1985, 230， 1350.、 Saiki, RK. et a l.， Science, 1988, 239, 487. ) を利用することができる。 即ち、 当業者であれ ば、 配列番号： 1 2 (あるいは配列番号： 2 ) に示す DNAもしくはその一部をプ ローブとして、 または、 該 DNAに特異的にハイブリダィズするオリゴヌクレオチ ドをプライマーとして、 所望の単子葉植物から配列番号： 1 2に示すイネ由来の DNAと同等の機能を有する DNAを単離することができる。 このような DNAを単離 するためには、 好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション 反応を行う。 本発明においてストリンジェントなハイブリダィゼーション条件と しては、 6M尿素、 0. 4% SDS、 0. 5 XSSCの条件、 または 0. 1% SDS (60°C、 0. 3m ol NaCl、 0. 03M タエン酸ソーダ） のハイブリダィゼーシヨン条件、 あるいはこ れらと同等のストリンジェンシ一のハイブリダイゼーン 3ン条件を指す。 よりス トリンジエンシーの高い条件、 例えば、 6M尿素、 0. 4% SDS、 0. 1 X SSCの条件 下では、 より相同性の高い DNAを単離できることが期待される。
このようにして単離された DNAは配列番号： 1 2に示すィネ由来の DNAと有意 な相同性を有する。 有意な相同性とは、 塩基配列全体で好ましくは 50%以上、 さらに好ましくは 60%以上、 さらに好ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 8 0%以上、 最も好ましくは 90%以上 （例えば、 95， 96， 97， 98， 99%以上） の配列の 同一性を指す。 塩基配列の同一性は、 カーリンおよびアルチユールによるアルゴ リズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 2264-2268.、 Karl in, S. & Altschul, SF.， Proc Natl Acad Sci USA, 90， 5873. ) を用いて決定でき る。 BLASTのアルゴリズムに基づいた BLASTNと呼ばれるプログラムが開発され ている （Altschul, SF. et al. , J Mol Biol, 1990, 215， 403. ) 。 BLASTNを用 いて塩基配列を解析する場合は、 パラメータ一は、 例えば score= 100、 wordlen gth=12とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、 各プログラ ムのデフォルトパラメーターを用いる。 これらの解析方法の具体的な手法は公知 である (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/) 0
また、 本発明におけるプロモータとしては、 カルス細胞においてプロモータ活 性を示す限り、 配列番号： 1 2に記載の塩基配列において、 1または複数の塩基 が置換、 欠失、 付加、 および Zまたは挿入された塩基配列からなる DNAであって もよい。 ここで 「複数の塩基」 とは、 好ましくは 30塩基以内、 より好ましくは 10塩基以内、 さらに好ましくは 5塩基以内 （例えば、 3塩基以内） である。 この ような DNAを調製するために当業者によく知られた方法としては、 例えば、 sit e - directed mutagenesis (Kramer, W. & Fritz, Hj. , Methods Enzymol, 1987, 154, 350. ) による変異の導入を挙げることができる。 また、 DNAにおける塩基 の変異は、 自然界において生じることもある。 調製された DNAがプロモータ活性を有する力否かは、 例えば、 レポーター遺伝 子を用いた周知のレポーターァッセィにより検討することが可能である。 レポ一 ターァッセィにおいては、 調製された DNAの下流にレポーター遺伝子が発現可能 に結合されたベクターを作製し、 これをカルス細胞に導入して、 該細胞内のレポ 一ター活性を測定する。 レポーター遺伝子としては、 その発現が検出可能なもの であれば特に制限されず、 例えば、 当業者において一般的に使用される GFP遺伝 子、 CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子、 および —ダルクロニ ダーゼ（以下、 GUS)遺伝子等を挙げることができる。 レポーター遺伝子の発現レ ベルは、 該レポーター遺伝子の種類に応じて、 当業者に公知の方法により測定す ることができる。 例えば、 レポーター遺伝子が GFP遺伝子である場合には、 GFP タンパク質による蛍光を検出することにより、 レポーター遺伝子の発現レベルを 測定することができる。 また、 レポーター遺伝子が CAT遺伝子である場合には、 該遺伝子産物によるクロラムフエ二コールのァセチルイ匕を検出することによって、 レポ一ター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
本発明におけるプロモータ DNAは、 ゲノム DNAであっても、 化学合成 DNAであ つてもよい。 ゲノム DNAの調製は、 当業者にとって常套手段を利用して行うこと が可能である。 ゲノム DNAは、 例えば、 植物細胞からゲノム DNAを抽出し、 ゲノ ミックライブラリー （ベクターとしては、 プラスミド、 ファージ、 コスミド、 BA C、 PAC等が利用できる） を作製し、 配列番号： 1 2に記載のイネ由来の DNAま たは他の単子葉植物由来の対応する DNAを基に調製したプローブを用いてコロニ 一ハイプリダイゼーション、 あるいはプラークハイブリダイゼーシヨンを行うこ とにより調製することが可能である。 また、 これら DNAに特異的なプライマーを 作成し、 植物細胞から抽出されたゲノム DNAを錶型に PCRを行うことによつて調 製す ことも可能である。
また、 本発明のプロモータ DNAは、 ェンハンサーを結合することで、 そのプロ モータ活性を高めることが出来る。 本発明におけるプロモータ DNAとェンハンサ一とが 「機能的に結合している」 とは、 プロモータ活性が高まるように、 本発明のプロモータ活性を有するプロモ ータ DNAとェンハンサ一とが結合していることをいう。 従って、 プロモータ DM とェンハンサ一の距離が離れていたり、 間に他の遺伝子が挿入された場合であつ ても、 本発明のプロモータ DNAのプロモータ活性が高まるのであれば、 上記の
「機能的に結合している」 の意に含まれる。 ェンハンサ一は本発明のプロモータ DNAの上流下流どちらに存在していても良い。
本発明においてェンハンサ一とは、 転写により生成するメッセンジャー RNA OnR
NA)の量を結果的に増加させるものであれば限定されない。 ェンハンサ一はプロ モータの作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、 一般的には lOObp前後から なるものが多い。 ェンハンサ一は配列の向きにかかわらず転写を促進することが できる。 又、 ェンハンサー自体はプロモータ活性を持っていないのであるが、 ェ ンハンサ一は数千塩基対も離れた所から転写を活性化することができる。 さらに、 ェンハンサ一は転写される遺伝子領域の上流、 下流、 および遺伝子内にも存在し、 転写の活性化することができる。 また、 上述したように本発明のェンハンサ一は、 転写により生成する mRNAの量を増加させるものであれば限定されないので、 mRN— Aの転写後に mRNAの分解を阻害したり、 mRNAを安定化することによって、 細胞 内に存在する mRNAの量を増加させ、 ァミノ酸の翻訳効率を上げるものも本発明 のェンハンサ一に含まれる。
本発明で用いられるェンハンサ一は 1種類でもよく、 又、 2つ以上の同一のェ ンハンサーを複数用いたり、 あるいは異なる複数のェンハンサーを組み合わせて 用いても良い。
本発明において用いられるェンハンサ一としては種類は限定されないが、 好ま しく CaMV35Sプロモータ由来のェンハンサーであり、 より好ましくは該ェンハ ンサ一の- 351〜- 84部分である。 該ェンハンサ一は、 タンデムに付加する個数を 多くすると、 プロモータ活性をより高めることが出来る。 付加する個数はプロモ ータ活性を高める限り限定されるものではないが、 より好ましくは 4個または 8 個である。
このようにして調製されたプロモータを利用して植物体において任意の遺伝子 を発現させるには、 該プロモータに任意の遺伝子が機能的に結合しているベクタ 一を作製し、 これを植物細胞に導入し、 該植物細胞から植物体を再生させる。 こ こで 「機能的に結合している」 とは、 任意の遺伝子が本発明のプロモータの制御 下で発現するように、 任意の遺伝子と本発明のプロモータが結合していることを 意味する。 プロモータの下流に連結する遺伝子としては、 特に制限はなく、 植物 細胞内で発現させたい所望の遺伝子である。 本発明の目的からして選択マーカー 遺伝子が特に好適に用いられるが、 これに限られず、 有用タンパク質をコードす る遺伝子、 アンチセンス遺伝子、 2本鎖 RNA又はリボザィム RNAを発現する遺伝' 子などを用いることも考えられる。 選択マーカー遺伝子としては、 例えば、 抗生 物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ 遺伝子、 カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホト ランスフェラーゼ遺伝子、 および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるァセチ ルトランスフエラーゼ遺伝子等が挙げられる。 農業的に優れた形質を付与する遺 伝子としては、 例えば、 耐病性、 耐虫性、 耐ウィルス性、 細菌抵抗性、 カビ抵抗 性、 ストレス耐性、 花色関連遺伝子、 形態形成に関与する遺伝子、 生理活性物質 の生合成系遺伝子、 有用物質生産遺伝子等がある。 医薬産業等において有用な物 質の生産に関与する遺伝子としては、 ワクチン遺伝子、 抗体遺伝子、 医薬原料生 産遺伝子等が挙げられる。 化学工業等においては、 有用な物質の生産に関与する 遺伝子、 例えば、 油脂の生合成系遺伝子、 工業用酵素遺伝子等が考えられる。 研 究目的では、 遺伝子発現機構の研究に必要とされる遣伝子等が考えられる。 これ らは自然界の生物からクローン化した造伝子、 化学合成遗伝子、 あるいはそれら の組み合わせやそれらの改変遺伝子でも良い。 植物細胞に導入する遺伝子の数も 1つに限らず、 目的に応じて複数であってもよい。 形質転換された植物細胞を効 率的に選択するためには、 ベクターは、 目的の遺伝子の他に選抜マーカー遺伝子 を含むことが好ましい。 この場合、' 目的の遺伝子は、 本発明のプロモータと異な るプロモータに支配されていてもよい。 目的の遺伝子を含むぺクタ一を選抜マ一 力一遺伝子を含むベクターと共に植物細胞へ導入することにより、 形質転換され た植物細胞の選抜を行うこともできる。
ベクターを導入する 「植物細胞」 には、 種々の形態の植物細胞、 例えば、 カル ス細胞、 懸濁培養細胞、 プロトプラスト、 葉の切片などが含まれる。 好ましくは カルス細胞である。 植物細胞は、 好ましくは単子葉植物由来であり、 最も好まし くはイネ由来である。
植物細胞へのベクターの導入には、 パーティクルガン法、 ポリエチレングリコ ール法、 電気穿孔法 （エレク ト口ポレーシヨン法） 、 ァグロパクテリゥムを介す る方法など、 当業者に公知の種々の方法を用いることができる。 ァグロパクテリ ゥム （例えば、 EHA101) を介する方法においては、 例えば、 超迅速単子葉形質転 換法 （特許第 3141084号） を用いることが可能である。 また、 パーティクルガン 法においては、 例えば、 パイオラッ 社のものを用いることが可能であり、 遺伝 子導入装置としては、 例えば、 GIE- III型 IDEM (タナカ社） を用いることがで さる。
' 形質転換植物細胞からの植物体の再生は、 植物細胞の種類に応じて当業者に公 知の方法で行うことが可能である （Toki S, et al : Plant Physiol 100： 1503, 1995) 。 例えば、 イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、 パー ティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、 植物体を再生させる方法 （Ch ristou P， et al : Biotechnology 9： 957, 1991) 、 ポリエチレングリコールを 用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、 植物体 （インド型イネ品種が適してい ό) 再生 せる方法 (Datta SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg, Eds) pp. 66-74, 1995) 、 電気パルスによりプロトプラスト へ遺伝子導入し、 植物体 （日本型イネ品種が適している） を再生させる方法 （To ki S, et al : Plant Physiol 100： 1503, 1992) 、 およぴァグロバタテリゥムを 介して遺伝子を導入し、 植物体を再生させる方法 （Hiei Y, et al : Plant J 6： 271, 1994) など、 いくつかの技術が既に確立し、 本願発明の技術分野において 広く用いられている。 本発明においては、 これらの方法を好適に用いることがで きる。
ゲノム内に目的の遺伝子が導入された形質転 m«物体が一旦得られれば、 該植 物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。 また、 該植物 体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料 （例えば、 種子、 果実、 切穂、 塊茎、 塊根、 株、 カルス、 プロトプラストなど） を得て、 それらを基に該植物体を量産 することも可能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 RT- PCRによる各遺伝子の葉、 挺、 カルス組織における発現レベルの 比較を示す写真である。 イネ （japonica) のシュート、 根、 2. 4D (2mg/l)存在下 で培養した増殖期カルス、 NM(lmg/l) +BA(2mg/l)存在下で培養したカルスから全 RNAを抽出し RT- PCRによって RezA遺伝子の発現レベルを比較した。
図 2は、 ロング PCRによる RezA遺伝子の 5， 端側非翻訳領域の単離の結果を 示す写真である。 Mはマーカーを示す。 Lane 1では、 RezA遺伝子の 5' 側上流域 2527bpの PCR断片 （矢印） が増幅された。
図 3は、 RezA遺伝子のプロモータ解析に用いたディレーシヨンミュータント を示す図である。 s GFPはレポータ遺伝子を示し、 tNOSは N0Sターミネータ一配 列を示す。
図 4は、 イネカルス培養細胞を用いた RezA遺伝子プロモータの一過的発現ァ ッセィの結果を示す図である。 （a ) は、 一過的発現を示すイネカルス細胞の蛍 光写真である。 遺伝子はパーティクルガンを用いて導入した。 各ディレーシヨン ミユータントについて蛍光を発する細胞を 20個ずつサンプリングして統計処理 した。 （b ) は、 GFPの一過的発現の蛍光強度を測定した結果を示す図である。 約 200bp以下の個所から発現が低下している。
図 5は、 形質転換体イネ種子における RezA遺伝子プロモータ活性を示す写真 である。 (a) の 135bpの DM断片のプロモータにおいては発現していないこと がわかり、 （b) の 233bpの DNA断片のプロモータでは、 糊粉層のみで発現して いることがわかる。 （c) 233bpの長さのプロモータを導入した転換体イネ種子 を縦割に切ったものを示す。 胚乳部分での発現は起こっていない。
図 6は、 イネカルスにおけるェンハンサーを付加した 135bpのプロモータの発 現を示す写真である。 1は 135bpのみ、 2はェンハンサーを 2個付加したもの、 3はェンハンサーを 4個付加したもの、 4はェンハンサーを 8個付加したもの、 5はポジティブコント口ール （CaMV35Sプロモータの発現活性） を示す。
図 7は、 イネ種子における CaMV35Sプロモータと RezA遺伝子プロモータ （8 個のェンハンサーを付カ卩した I35bp) の発現部位の違いを示す写真である。
(a) は CaMV35Sプロモータの発現部位を示し、 胚乳部位で発現していることが わかる。 （b) は RezA遺伝子プロモータの発現部位を示し、 胚乳部位では発現せ ず、 糊粉層のみで発現していることがわかる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により、 さらに本発明を詳細に説明するが、 本発明は実施例に制 限されるものではない。
[実施例 1 ]イネの cDNAライブラリ一作成
イネ （japonica) の各組織 （根、 葉、 穂、 カルス） から mR Aを抽出し SuperS cript TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning CAT. NO. 18 2448-031の kit (GIBCO BRL社） を用いて instruction Manualに従って作成し た。 ベクターに cDNAをクローユングする際、 Okubo et. al 1992の方法（Okubo K: Hori N, Matoba R, NiiyamaT, Fukushima A, Kojima Y, Matubara K(1992) Nat ure genetics 2 : 173- 179)を利用して 3， UTRをクローユングし，クラスタリング し匆ヽ し ] 。
[実施例 2；]カルス培養細胞で高発現する遺伝子の探索
各組織ごとに発現しているクローンをクラスタリングした結果をヒストグラム で示し、 組織間で比較した。 カルスでとくに高発現しているクローンの中から R ezA遺伝子を選択した。
[実施例 3 ]RT- PCRによる RezA遺伝子の各組織における発現レベル比較 イネ （japonica) のシュート、 根、 2. 4D (2mg/l).存在下で培養した増殖期カル ス、 NM(lmg/l) +BA(2mg/l)存在下で培養した再分化期カルスから全 R Aを Sepas olRNA I CAT. NO. 306-55 (nacalai tesque) を用いてマニュアルに従って抽出し た。 cDNA は Superscript TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning CAT. NO. 182448- 031の kit (GIBC0 BRL社） を用いて合成した。 RT - PC Rによる RezA遺伝子の葉、 根、 増殖期カルスと再分ィヒ期カルスにおける発現レ ベルの検出には、 次のプライマーを用いた。
5 cgacgacgacgccatccatcc3 ' /配列番号： 3
5 actcgggtacgtggtgaaacc3 ' Z酉己列番号： 4
このプライマー対は RezA遺伝子のコーディング領域 3， 側の 318bpを増幅す る。 PCRは PCR SuperMix High Fidelity, CAT. NO. 1090-020 (GIBC0 BRL社） を 用いて 94°Cで 30秒を 1サイクルに続いて 94°Cで 30秒， 58°Cで 30秒， 72°Cで 30 秒を 25サイクル行なった。
その結果、 増殖期カルスと再分化期カルスにおいて予想通りのサイズである 3 18bpの PCR産物が検出された。 増殖期カルスと再分化期カルスとの間での発現 レベルはほとんど差異はみとめられなかつた。 葉と根においては RezA遺伝子の 発現は検出以下であつたが、 PCRサイクルを 25回から 30回にふやすと葉と根に おいても低いレベルではあるが発現しているといえる結果を得た （図 1 ) 。 この 結果からカルス特異的発現をする RezA遺伝子の 5' 上流域にはカルスで活性の 高いプロモータ機能を持つ配列があると予想出来る。
[実施例 4 ] RezA遺伝子の推定プロモータ部位のクローニング
RezA遺伝子配列を用いてホモロジ一検索をしゲノムシーケンス (GenBank acc ess ion Number : AP000570) とァノテーションを求めた。 それらの情報より RezA 遺伝子コーディング領域開始点から - 2541位の 5， 上流には ESTが存在すること が予想されていたため、 RezA遺伝子のプロモータ領域は最大で 2541bpと仮定し た。 また報告されている （GenBank accessionNumber : U46138) 完全長 RezA遺伝 子の cDNA情報から転写開始点は翻訳開始点 (ATG)の - 65位であることが予想され た。 翻訳開始点からこの 5 ' UTRを含む全長 2527bpをプロモータ部位と推定し、 PCR用プフイマ一 (5 tcaagcttgaccgctaccctgggcc3 Zsc列番号： 5 , 5 gctct agatcggatcactcgatcggacggc3 ' Z酉己歹幡号： 6 )を、 5， 側に Hindlllサイトを 3， 側に Xbal サイトを付加するように設計した。
イネ （japonica) の葉からゲノミック DNAを抽出しこれをテンプレートにして PCRを行なった （図 2 ) 。 PCRは PCR SuperMix High Fidelity, CAT. NO. 1090-02 0 (GIBCO BRL社） を用いて 94°Cで 30秒を 1サイクル、 続いて 94°Cで 30秒， 5 8°Cで 30秒， 72°Cで 2分 30秒を 25サイクル行ない、 この生成産物はェタノール 沈殿によって精製回収した。
精製回収した DNA断片は制限酵素の Hindlllと Xbalで酵素処理し CaMV35S- sG FP (S65T) -N0S3' (丹羽康夫博士 静岡県立大学大学院より分譲）を Hindlllと Xb alで開いたベクターに組み込みシーケンスして確認した。
[実施例 5 ] RezA遺伝子推定プロモータ部位を 5 ' 端から段階的に削ったディレ ーションミュータント作成
クローニングした 2527bpのシーケンスデーターに基づいて 997bpのディレー シヨン；ユータント用プフイマ一 (ϋ tcaagcttttctagggaagataaagcg3 ' Z酉己歹1 J 番号： 7 , ΰ gctctagatcggatcactcgatcggacggc3 ' Z酉己列番^" : 6 ) 、 478bp CO ティレーシヨンミュータント用プライマー (5 tcaagctttaggaactaattacacaacg 7 -
3' /配列番号： 8 , 5， gctctagatcggatcactcgatcggacggc3' /配列番号： 6 ) 、 233bpのティレ一ンョンミュータント用プライマー (5 tcaagcttccctcgacccgtc acg3 Z酉己列番号 : 9 , o gctctagatcggatcactcgatcggacggcS /酉己列番 ： 6 ) 、 135bpのディレーシヨンミュータント用フ。ライマー (55 tcaagcttcgcctc tttaaatgcg3' Z酉己歹 U番号： 1 0 , 5 gctctagatcggatcactcgatcggacggc3 Z酉己 列番号： 6 ) 、 95bpのディレーシヨンミュータント用プライマー （5' tcaagctt cacagagctcacaagcc5 /酉己列番号 : 1 1 , 5 gctctagatcggatcactcgatcggacggc 3， Z配列番号.： 6 ) を合成して PCRを行い Hindlllと Xbalで開いた CaMV35S-s GFP (S65T) -N0S3' にクロー-ングした。 各ディレーシヨンミュータント （図 3 ) はシーケンスを行なつて塩基配列の確認を行なつた。
[実施例 6 ]ディレーシヨンミユータントの一過的発現によるプロモータ活性の 測定
遺伝子導入においては、 遺伝子導入装置 GIE- III型 IDERA (タナカ社） を用い て 1 μ Mの金粒子 CAT. NO. 165-2263 (Bio Rad社） にプラスミド DNAをコートして カルス細胞あるいは葉に打ち込んだ。 導入するプラスミド DNAの精製は plasmid mini Kit CAT. NO. 12125 (QIAGEN社） で精製抽出し、 コーティングは DNAlO z g と金 ¾ι子 suspension buffer (0. 3mg gold particles/50 1 water;と 2. 5M CaCl2
50 1と 0. 1M spermidine 20 ^ 1を混合し、 30分攪拌して行なった。 攪拌後 金 粒子は 70%エタノールで二回洗浄し 50 μ 1 .の 100%エタノールを加えて懸濁した。 遺伝子導入条件は真空圧- 80Kpa， He圧 0. 6Mpa、 試料との距離 9cm, 噴出時間 0. 02 5秒， 金粒子液 5 μ 1 (プラスミド DNA量 1 μ g)で行なつた。 導入処理後の試料は ホルモン無添加の LS培地で 28°C—晚培養した。
プロモータ活性は、 蛍光顕微鏡下 （OLYMPUS 1X70) で検出した sGFP蛍光を CC Dカメラ（CoolSNAP NipponRoper)に取り込み、 画像シグナルを蛍光強度測定用ソ フト（Proper scienceTM RSimage versionl. 7· 3)を利用して測定した。 測定は一 つのディレーシヨンミュータントにっき 20個の細胞を選んで行い、 平均値と標 準誤差値を出した。
その結果、 カルスにおける発現は 233bpの DNA断片 (配列番号： 1 ) で必要充 分な活性をもつことが明らかとなり (図 4 ) 、 135bpの DNA断片 (配列番号： 1 2 ) では半分のプロモータ活性を持つことがわかった。 一方、 葉での発現は最長 の 2527bpから全てのディレーシヨンミュータントが最短の 95bpの DNA断片と同 程度の低い値を示した （データは示していない） 。 これら一過的発現による組織 特異性の違いは RT - PCRの結果とも一致している。
[実施例 7 ]形質転換体種子における 233bp， 135bpの発現
イネ種子における 233bpと 135bpのプロモータ活性を調べるために GUS遺伝子 を結合してイネに導入した （図 5 ) 。 その結果、 どちらのプロモータでも GUS遺 伝子が胚乳部分では発現していないことが明らかとなった。 しかし 233bpのプロ モータは糊粉層で弱い発現を示していた。 +これに対して 135bpによる GUS発現は 糊粉層においても非常に低いかゼロであった。 この結果より 135bpを選択用プロ モータに利用した場合、 食べる部分に相当する胚乳では不用な選択マーカー遺伝 子産物は蓄積しないような組み換え体をつくることが出来ることがわかる。
[実施例 8 ] 135bpプロモータへの CaMV 35S由来のェンハンサ一の付加
カルスでの 135bpプロモータ活性の強さは図 4 (b)に示したように 35Sの約半 分であるので選択用にそのまま使うには弱すぎる。 CaMV 35Sプロモータ由来のェ ンハンサ一は植物で発現を高める機能を持つことが知られている （Odell J. T. , Knowlton S.， Lin W.， Mauvais C. J. (1988) Plant Molecular Biology 10： 26 3-272) 。 そこで発現を高める工夫として CaMV 3 5 Sプロモータ由来のェンハン サ' ~- 351〜- 84部分 (配列番号： 1 3 ) をタンデムに 4個又は 8個結合した。 そ の結果 135bpプロモータは CaMV 35Sプロモータと同等な強さにまで上昇した
(図 6 ) 図 6に示すようにェンハンサ一の効果は付加する個数を多くするとよ り高レ、発現効果を示した。 従ってェンハンサーをタンデムに 4個又は 8個付カロし た 135bpプロモータは CaMV 35Sプロモータと同程度の高い選択効率をもつこと が期待される。
[実施例 9 ]ィネ種子におけるェンハンサーを付加した 135bpDM断片のプロモ ータ活性
135bpプロモータの発現は Ca 35Sプロモータ由来のェンハンサ一の付カロに よってカルス細胞では大いに高められたがイネ種子の胚乳においてもェンハンサ 一効果があるのかあるいは無いのかを知るために一過的発現で調べた。 その結果、 135bpの発現はェンハンサ一が 8個付加されていても胚乳での発現は認められな かった （図 7 ) 。
しかし糊粉層での発現が新たに検出された。 この糊粉層での発現が果たしてェ ンハンスされた結果、 検出可能の程度にまで高められたのかあるいはェンハンサ 一に含まれているといわれているシス（Benfey PN.， Ren L.， Chua NH. (1990) T he EMBO Journal 9: 1677- 1684)が働いて新たに糊粉層でも発現するようになった のかは現在のところどちらともいえない。 ただし胚乳において 135bpプロモータ は CaMV 35Sプロモータ由来のェンハンサ一の付加とは無関係に依然として発現 が無く、 対照的に 1個の同ェンハンサーを含む CaMV 3 5 Sプロモータは胚乳で 発現が認められている （図 7 ) ことから胚乳の組織に関して言えば付加したェン ハンサ一は組織特異性を変えるようなシスを持っていないといえる。
RezA遺伝子の上流域 135bpには 95bpの 5， UTRが含まれており （KOME databa se Accession No. AX069098 http: //ww . nias. affrc. go. jp) 、 実質は 40bpがプ 口モータとみなされるがここを PLACE data base (Hi go K. , Uga a Y. , Iwamoto M. , Korenaga T. (1999) Plant cis - acting regulatory DNA elements (PLACE) da tabase. 27 : 397-300)でサーチすると plant bZIP proteinである Dof-1の bindi ng siteを一箇所持っていると予測しているので、 カルスで高発現する少なくと も一律類以上の bZIPに類する転写因子によつて発現が制御されているのであろ う。 またこのプロモータには TATA配列は存在せず代わりに initiator element 様配列を含んでレ、るので TATA- lessタイプのものである。 産業上の利用の可能性
形質転換植物の作出技術は、 栽培穀物の品種改良のみならず植物を生産工場に 見立てた産業用原材料生産、 予防医薬効果をもつ機能性食品そして土壌や大気中 の汚染物質の浄化等様々な目的をもって利用されようとしている。 しかしながら、 これら応用例に対して実用化可能な形質転^ it物を作出するには、 多くの解決す べき技術的課題が残されている。 この課題の一つは、 導入遺伝子を安定に目的の 場所と時期でのみ機能させるプロモータの開発である。
形質転換植物を作出する場合、 選抜操作が必須である。 そして、 選抜マーカー 遺伝子の発現を必要とする組織は多くの場合増殖期カルスである。 カルス以外の 組織において不必要なマーカー遺伝子発現を抑えることは環境や人への影響を考 慮する観点からも重要であり、 増殖期カルス特異的発現するプロモータの開発は これを解決する有効な手段である。
本発明者らが見出した RezA遺伝子のプロモータは、 イネ増殖期カルスで高い 活性を有するため、 イネをはじめとする多くの単子葉穀物の形質転換用ベクター に利用されることが期待される。
RezA遺伝子の上流域 135bp配列のプロモータ活' I"生は、 35Sプロモータの活性と 比較すると半分程度の活性を有していた。
また本発明の RezA遺伝子の上流域 135bp配列は、 CaMV35Sプロモータ由来の ェンハンサーを結合することで、 CaMV35Sプロモータと同等なプロモータ活性を 示すことがわかった。 本発明のプロモータの利用は選択マ一力一発現用のみなら ず増殖能の高いカルス細胞を利用したタンパク質生産などへの応用も期待される。

Claims

請求の範囲
1 . 植物のカルス細胞においてプロモータ活性を有する-. 下記 （a ) 〜 ( d ) の いずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列からなる DNA
( b ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列からなる DMとストリンジェントな 条件下でハイプリダイズする DNA
( c ) 配列番号： 1 2に記載の塩基配列において、 1または複数の塩基が置 換、 欠失、 付加、 および Zまたは挿入された塩基配列からなる DNA
( d ) 配列番号： 2に記載の塩基配列における、 少なくとも配列番号： 1 2 に記載の塩基配列を含む塩基配列からなる DNA
2 . 植物の葉で実質的にプロモータ活性を有しない、 請求項 1に記載の DNA。
3 . 植物の根で実質的にプロモータ活性を有しなレ、、 請求項 1に記載の DNA。
4 . 植物が単子葉植物である、 請求項 1に記載の DNA。
5 . 請求項 1から 4のいずれかに記載の DNAを含むベクター。 .
6 . 請求項 1から 4のいずれかに記載の DNAに、 ェンハンサ一が機能的に結合し ている請求項 5に記載のベクター。
7. ェンハンサ一が CaMV35Sプロモータ由来のェンハンサーである、 請求項 6に 記載のベクター。
8 . 請求項 1カゝら 4のいずれかに記載の DNAに任意の遺伝子が機能的に結合して いる請求項 5から 7のいずれかに記載のベクター。
9 . 任意の遺伝子が選択マーカー遺伝子である、 請求項 8に記載のベクター。
1 0 . 請求項 8に記載のべクタ一を保持する形質転 物細胞。
1 1 .. 単子葉植物由来である、 請求項 1 0に記載の形質転換植物細胞。
1 2 . 請求項 1 0または 1 1に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
1 3 . 請求項 1 2に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、 形質転 灘物体。
請求項 1 2または 1 3に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN100457906C (zh) * 2006-04-06 2009-02-04 北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司 一个水稻愈伤组织特异性启动子及其应用

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121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase