WO2004074477A1

WO2004074477A1 - ホモシステインの測定方法

Info

Publication number: WO2004074477A1
Application number: PCT/JP2004/000787
Authority: WO
Inventors: Nobuyoshi Esaki; Tohru Yoshimura; Naoto Matsuyama; Koji Mizuno; Takayuki Bogaki; Toshitaka Minetoki; Kenji Ozeki
Original assignee: Alfresa Pharma Corporation
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2004-01-28
Publication date: 2004-09-02
Also published as: JPWO2004074477A1; ATE412907T1; EP1595950A1; EP1595950A4; US20060166300A1; CA2516029A1; DE602004017424D1; EP1595950B1; JP2006149203A; EP1595950B9; US7135306B2

Abstract

本発明の方法は、試料中のホモシステインを検出または測定する方法であって、（ａ）試料中に存在するＤ−アミノ酸にＤ−アミノ酸変換酵素を作用させて、該Ｄ−アミノ酸を、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程；（ｂ）該試料中のホモシステインをチオール化合物で還元処理する工程；（ｃ）該還元されたホモシステインに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たにＤ−アミノ酸を生じさせる工程；および（ｄ）該生成したＤ−アミノ酸に、ＳＨ試薬の存在下で、該Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはＤ−アミノ酸アセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成ヘ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程を含む。

Description

明細書ホモシスティンの測定方法

技術分野

本発明は、試料中のホモシスティンを検出または測定する方法に関する。より詳細には、試料中に存在する D—アミノ酸を予め除去する工程を含む、ホモシスティンの測定方法に関する。

背景技術

ホモシスティンを測定するための方法として、試料中のホモシスティンにホモシスティンメチノレトランスフェラーゼぉょぴ D—メチォニンメチルスノレホニゥムを作用させた後、生成した D—メチォニンを D—アミノ酸ォキシダーゼで検出する方法が報告されている (国際公開第 0 2 / 0 2 8 0 2号パンフレット参照）。しかし、生体試料中には少量ながら D—ァラニンや D—セリンなどの D—アミノ酸が含まれており、これらは腎疾患等の場合に増加することが知られている（例えば、 Fukushima, T.、 Biol. Pharm. Bull.， 1995 年，第 18卷，第 8号， p. 1130- 1132参照) 。 D—アミノ酸ォキシダーゼの基質となり得る D—ァラニンおょぴ D—セリンは、上記のホモシスティンの測定方法では正の影響を及ぼすと考えられる。したがって、上記国際公開第 0 2 / 0 2 8 0 2号パンフレツト中にも記載されているように、試料中に元来存在する内因性 D—アミノ酸の影響を回避するためには、ホモシスティンメチルトランスフェラーゼを含まないこと以外は全く同様に操作を行つて測定し、その値を同酵素を含む場合の測定値から差し引く必要がある。すなわち、各試料についてそれぞれ別に検体ブランクを設け、内因性 D—アミノ酸量を測定する必要があった。発明の開示

本発明の目的は、内因性 D—アミノ酸の影響を受けない、すなわち検体ブランクをとる必要のないホモシスティンの測定方法を提供することにある。上記の目的を達成するために検討を重ねた結果、 D—ァラニンおよび/または D—セリンを酵素作用によりホモシスティン測定原理の反応系外に導くことにより、内因性 D—アミノ酸の影響を受けない、すなわち検体ブランクをとる必要のないホモシスティンの測定方法を提供することが可能となった。本発明は、試料中のホモシスティンを検出または測定する方法を提供し、該方法は、（a ) 試料中に存在する D—アミノ酸に D—アミノ酸変換酵素を作用させて、該 D—アミノ酸を、 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程；

( b ) 該試料中のホモシスティンをチオール化合物で還元処理する工程；

( c ) 該還元されたホモシスティンに、メチル転移酵素およびメチル供与体を作用させ、新たに D—アミノ酸を生じさせる工程；および ( d ) 該生成した D—アミノ酸に、 S H試薬の存在下で、該 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程、を含む。

好適な実施態様では、上記工程（a ) は、試料中に存在する D—ァラニンに、アデノシン三リン酸の存在下で D—ァラニルー D—ァラニンリガーゼ (以下、 D d 1ともいう) を作用させて D—ァラエル一D—ァラニンに変換する工程おょぴ Zまたは試料中に存在する D—セリンに、 D—セリンデヒドラターゼ（以下、 D s dともいう）を作用させてピルビン酸に変換する工程である。

好適な実施態様では、上記メチル転移酵素は、ホンスフェラーゼであり、そして上記メチ/レ供与体は、 D—メチォニンメチノレスノレホニゥムである。

好適な実施態様では、上記工程（d ) において、上記生成した過酸化水素を、パーォキシダーゼおよぴ酸ィヒ系発色剤により発色させて検出または測定する。

本発明はまた、 D—ァラニル一 D—ァラニンリガーゼおよぴ /または D— セリンデヒドラターゼ；チオール化合物；メチル転移酵素；メチル供与体； D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼ； S H試薬；および酸化系発色剤を含む、ホモシスティン測定用試薬キットを提供する。

本発明はさらに、試料中に存在する D—アミノ酸に D—アミノ酸変換酵素を作用させて、該 D—アミノ酸を、 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—ァミノ酸ァセチルトランスフェラーゼの基質とならない物質に変換する工程を含むことを特徴とする、試料中のホモシスティンを検出または測定する方法を提供する。

図面の簡単な説明

図 1は、ホモシスティントランスフェラーゼぉよぴ D -メチォニンメチノレスルホ二ゥムを用いるホモシスティン測定の反応概略図である。

図 2は、発現ベクター p K d 1 Aの構築を示す模式図である。

図 3は、発現ベクター p K d 1 Bの構築を示す模式図である。

図 4は、 D—ァラニルー D—ァラエンリガーゼ濃度とホモシスティン測定感度との関係を示すグラフである。

図 5は、 D—セリンデヒドラターゼ濃度とホモシスティン測定感度との関係を示すグラフである。

図 6は、それぞれ ( a ) 従来 1チャンネル法、 ( b ) 従来 2チャンネル法、および（c ) 本発明法によるホモシスティン測定濃度と HPLC法による測定濃度との相関性を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

ホモシスティンの測定原理：

本発明のホモシスティンの測定方法は、試料中のホモシスティンをチォール化合物で還元処理し、メチル供与体存在下でメチル転移酵素を作用させた

(第一工程）後、生成する D—アミノ酸または D—アミノ酸誘導体を測定する（第二工程）という原理に基づく。例えば、図 1に示すように、第一工程で生成した D—メチォニンに、第二工程において D—アミノ酸ォキシダーゼを作用させた場合には、過酸化水素が生成するため、これを S H試薬の存在下で通常用いられる酸化系発色剤に導き比色定量することができる。また、

D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼを作用させた場合には、生成するコェンザィム Aをァシルコェンザィム Aシンセターゼ [EC 6. 2. 1. 3]およびァシルコェンザィム A酸化酵素 [EC 1. 3. 3. 6]を用いて過酸化水素に導き、これを同様にして定量することができる。

本発明のホモシスティンを検出または測定する方法は、 D—アミノ酸を測定するにおいて内因性の D—アミノ酸の影響を排除するために、まず最初に、試料中に存在する D—アミノ酸に D—アミノ酸変換酵素を作用させて、該 D 一アミノ酸を、 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラ一ゼの基質とならない物質に変換することを特徴とする。

具体的には、本発明のホモシスティンの検出または測定方法は、

( a ) 試料中に存在する D—アミノ酸に D—ァミノ酸変換酵素を作用させて、該 D—アミノ酸を、 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼの基質にならない物質に変換する工程；

( b ) 試料中のホモシスティンをチオール化合物で還元処理する工程； (c) 該還元されたホモシスティンに、メチル転移酵素おょぴメチル供与体を作用させ、新たに D—アミノ酸を生じさせる工程；および

(d) 該生成した D—アミノ酸に、 SH試薬の存在下で、該 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程、を含む。

本発明の方法によって検出または測定され得る試料としては、ホモシステインを含むと考えられる試料であればいずれでもよい。また、ホモシスティンの存在様式としては、還元型ホモシスティンのみならず、蛋白結合型、ホモシスティン 2量体、ホモシスティン一システィン 2量体などジス/レフイド結合で他の分子に結合した酸化型ホモシスティンのいずれでもよい。例えば、血清、血漿、血液、尿、およびそれらの希釈物などが挙げられる。

(a) 工程 :

本発明の方法において使用される D_アミノ酸変換酵素としては、 D—ァミノ酸に作用して、 D—アミノ酸を、 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D— アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼの基質にならない物質に変換してホモシスティン測定原理の反応系外に導くことのできるものであればよい。本発明においては、 D—ァラニンおよび/または D—セリンに作用するものが好ましい。 D—ァラニンに作用する酵素としては、例えば D—ァラニルー D— ァラニンリガーゼ [EC 6.3.2.4] 、 D—ァラニンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ [EC 2.1.2.7] 、 D—ァラニン一 γ—グルタミルトランスフェラーゼ [EC 2.3.2.14] などを使用することができる。 D—セリンに作用する酵素としては、例えば、 D—セリンデヒドラターゼ [EC 4.3.1.18] 、ジァミノプロピオネートアンモニア一リアーゼ [EC 4.3.1.18] などを使用することができる。これらの酵素は必要に応じて単独または組み合わせて用いることができる。 D—ァラニンに作用する酵素として D—ァラニル一D—ァラニンリガーゼを、 D—セリンに作用する酵素として D—セリンデヒドラターゼを使用することが好適である。

本発明の方法で使用される D—ァラエル一D—ァラニンリガーゼ（D d 1 ) は、 2分子の D—ァラニンを縮合し D—ァラニルー D—ァラユンを生成するものであればどのような由来のものでも使用できる。例えば、ほとんどすべての細菌が有している D d 1を利用することができる。好ましくは、大腸菌由来の酵素である。本明細書でいう大腸菌とは、 Bergey' s Manual of D eterminative Bacteriology, 第 8版 (R. E. Buchanan, N. E. Gibbons編， Th e Williams & Wilkins Company, Baltimore, 295〜296頁， 1974年）に記載される Escherichia coliならびにその変異株おょぴ改変体である。

本発明の方法で用いられる D d 1としては、好ましくは、 Biochemistry 3 0: 1673 1682 (1991)に記載の GenBank Accession No. J05319または Journal of Bacteriology 163 : 809-817 (1986)に記載の GenBank Accession No. AE00 0118 REGION: 18688. . 19608の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を有する大腸菌由来の酵素が用いられる。また、 Bacillus属、 Enterococcus属、およぴ Lactobac i 1 lus属などの微生物に由来する酵素も使用され得る。そして D d 1活性が消失しない限りは、いくつかのァミノ酸の改変 (例えば、 1または 2以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換) があってもよい。 D d 1 は、例えば、大腸菌 (例えば、細菌などから取得した d d 1遺伝子を導入して形質転換した大腸菌株）の培養菌体内容物から、粗酵素を調製し次いで各種クロマトグラフィーによって精製する方法など、当業者によく知られている方法によって得られ得る。

本発明の方法で使用される D—セリンデヒドラターゼ（D s d ) は、 D— セリンアンモニア一リアーゼ、 D—セリンデハイドラーゼ、 D—ハイドロキシアミノ酸デヒドラターゼ、 D—セリンヒドラーゼ、 D—セリンデアミ^ "一ゼなどとも呼ばれる酵素であり、 D—セリンを脱ァミノ化しピルビン酸を生成するものであればどのような由来のものでも使用できる。好ましくは、 J.

Bacteriol. 154 (3)， 1508 - 1512 (1983)に記載の GenBank Accession No. J 01603の塩基配列から推定されるァミノ酸配列を有する大腸菌由来の酵素が用レヽられ - 。また、 Pseudomonas腐、 Bacillus属、 Salmonella属、 Fusobacte rium属、 Vibrio属、 Shigella属、 Ralstonia属などの微生物に由来する D s dを使用できる。そして D s d活性が消失しない限りは、いくつかのァミノ酸の改変（例えば、 1または 2以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換）があってもよい。 D s dは、例えば、大腸菌（例えば、細菌などから取得した d s d遺伝子を導入して形質転換した大腸菌株）の培養菌体内容物から、粗酵素を調製し次いで各種クロマトグラフィーによって精製する方法など、当業者によく知られている方法によって得られ得る。

上記 d d 1遺伝子おょぴ d s d遺伝子は、上記推定アミノ酸配列に基づいて当業者が通常用レヽる方法で得られる。例えば、 D d 1もしくは D s dをコ一ドする遺伝子またはこれらを含む遺伝子の一部またはすベてをプローブとして使用し、プラークハイブリダィゼーシヨン、コロニーハイブリダィゼーシヨン、 F C Rなどの手段を行う方法が挙げられる。また、. D d lもしくは D s dの遺伝子源は、大腸菌に限らず、他の細菌種であってもよい。

本明細書において、 d d 1遺伝子とは、 D d 1の特徴を示す D d 1活性を有するポリぺプチドをコ一ドする D N A鎖または D N A配列をいい、そして d s d遺伝子とは、 D s dの特徴を示す D s d活性を有するポリぺプチドをコードする D NA鎖または D NA配列をいう。いずれも、上述のように生理活性が変化しない程度のアミノ酸の改変（例えば、付加、欠失、または置換）を有するポリペプチドをコードしていてもよい。また、縮重などにより、同じポリペプチドをコードする配列は複数種あり得る。さらに、 d d l遺伝子もしくは d s d遺伝子は、天然物由来であっても、全合成または半合成のものであってもよレヽ。得られた d d 1遺伝子もしくは d s d遺伝子は、例えば、大腸菌などの宿主において増殖可能な発現ベクターに連結され、宿主に導入される。ここで用いられる発現ベクターは、大腸菌に対して通常用いられるものであればどのようなものでもよく、例えば、 C o l E l、 p C R l、 B R 3 2 2 , p MB 9などが好適に用いられる。

D d 1もしくは D s dをコードする D N Aを大腸菌内で大量に発現させるために、あるいは発現量を増加させるために、転写および翻訳を制御するプ口モーターをベクターの D NA鎖の 5，上流域におよび Zまたはターミネ一ターを 3，下流域に組み込んでもよい。このようなプロモーターおよび Zまたはターミネータ一としては、 d d 1遺伝子もしくは d s d遺伝子自体に由来するもの、 β—ガラクトシダーゼ遣伝子などの既に知られている遗伝子に由来するもの、またはそれらを人工的に改良したものが挙げられる。そのため、発現ベクターとしては、このような制御配列が組み込まれているものが好適に用いられ、例えば、 p T r c 9 9 Αゝ KK 2 2 3 - 3 (以上、アマシャム .ファルマシァ社製) 、 p E T— 3、 p E T - 1 1 (以上、ストラタジーン社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。

D d 1もしくは D s dを発現させるための宿主となり得る微生物としては、どのような微生物でもよいが、好ましくは細菌、さらに好ましくは大腸菌である。 D d 1もしくは D s dを発現させるための形質転換体の作成は、遣伝子工学の分野で通常用いられる方法によって行われ、例えば、塩化ルビジゥム法 (J. Mol. Biol. , 166: 557， 1983) が挙げられる。このようにして得られた D d 1もしくは D s d発現能力が高められた大腸菌の形質転換体を培養して、 D d 1もしくは D s dを得ることができる。

以上のようにして得られた D d 1もしくは D s dは、必要に応じて単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。

D d 1をホモシスティン測定試薬に応用した場合には、生成する D—ァラニル一 D—ァラニンは D—アミノ酸ォキシダーゼの基質とならないため、試料に含まれる D—ァラニンを除くことが可能である。使用酵素量は、サンプル中の D—ァラニンを除去できる濃度であれば特に制限はなく、例えば 0. 01 〜： 100 U/mL、好ましくは 0. 1〜： 10 U/mLである。なお、本発明において、 D d 1の l Unitは、 D—ァラニンを基質として 37°Cにおいて 1分間に 1 μ πιοΐの D—ァラ-ルー D—ァラニンを生成する酵素量として定義する。また活性努現のために必要な AT Ρおよび M gイオンの使用量も、 D—ァラニンの除去が達成できる濃度であれば特に制限はなく、例えば A T Pは 0. 1〜： L0mM、 M gイオンは 0.：!〜 20mMである。この酵素による試料の処理は単独で行うこともでき、以下の（b ) および（c ) 工程と同時に行うこともできる。

D s dをホモシスティン測定試薬に応用した場合には、試料に含まれる D —セリンをピルビン酸に変換することによって D—セリンを反応系外に除くことができる。使用酵素量は、サンプル中の D—セリンを除去できる濃度であれば特に制限はなく、例えば 0. 001〜10 U/mL、好ましくは 0. 01〜1 U/mLで使用できる。なお、本発明において、 D s dの l Unitは、 37°Cにおいて 1分間に 1 μ ιηοΐの D—セリンを分解する酵素量として定義する。この酵素による試料の処理は単独で行うこともでき、以下の（b ) および ( c ) 工程と同時に行うこともできる。

( b ) 工程：

本発明の方法における ( b ) 工程は、試料中の種々の形態のホモシスティンをチオール化合物で還元して還元型ホモシスティンとする工程である。本発明の方法で用いられるチオール化合物は特に限定されず、例えば、ジチオスレィトール、メルカプトエタノール、 N—ァセチルシスティン、ジチォエリスリトール、チォダリコール酸などが挙げられる。チオール化合物の濃度は、酸化型ホモシスティンを還元型ホモシスティンに変換できる範囲であればいずれでもよく、好ましくはチオール基として 0. ImM以上、より好ましくは l mM以上の濃度であればよい。

( c ) 工程：

本発明の方法の（C ) 工程は、上記（b ) 工程で還元されたホモシスティンに、メチル転移酵素おょぴメチル供与体を作用させ、新たに D—ァミノ酸を生じさせる工程である。本発明においては、メチル転移酵素およびメチル供与体として、それぞれ、ホモシスティンをメチル受容体とするメチル転移酵素およびメチル供与体の D—メチォニンメチルスルホニゥムを用いることが好ましい。すなわち、試料中の還元されたホモシスティンに、メチル転移酵素および D—メチォニンメチルスルホニゥムを作用させて、 D—メチォュンを生成させる。

メチル転移酵素としては、 D—メチォニンメチルスルホニゥムに作用し、 D—メチォニンの生成を触媒するものであればどのようなものでもよく、例えば、ホモシスティンメチノレトランスフェラーゼ [EC 2. 1. 1. 10] 、 5—メチルテトラヒドロ葉酸—ホモシスティン S—メチルトランスフェラーゼ [EC 2. 1. 1. 13] 、 5—メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸-ホモシスティン S—メチルトランスフェラーゼ [EC 2. 1. 1. 14] が挙げられる。好ましくは、ホモシスティンメチルトランスフェラーゼ [EC 2. 1. 1. 1 0] が使用される。この酵素は、 G. Grue- Sorensenら (J. Chem. Soc. Perki n Trans. I 1091-7 (1984) ) により報告されているように、特異性は低いものの D—メチォニンメチルスルホニゥムをメチル供与体とし、 D—メチォニンを生成する。使用するホモシスティンメチルトランスフェラーゼは、 D— メチォニンメチルスルホ-ゥムをメチル供与体とするものであればどのような由来のものでも使用できる。例えば、細菌、酵母、ラットなどに由来する酵素が使用できる。なお、本発明において、ホモシスティンメチルトランスフェラーゼの 1 Unitは、ホモシスティンおょぴ D—メチォニンメチルスルホ -ゥムを基質として 37°Cにおいて 1分間に 1 ju molの D—メチォニンを生成する酵素量として定義する。

( d ) 工程：

本発明の方法の（d ) 工程は、上記（c ) 工程により生成した D—アミノ酸に、 S H試薬の存在下で、 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、この生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程である。

D—アミノ酸に、 D—アミノ酸ォキシダーゼ [EC 1. 4. 3. 3] を作用させることにより、過酸化水素が生成する。これを S H試薬の存在下で通常用いられる酸化系発色剤に導き比色定量することができる。 D—アミノ酸ォキシダーゼは、どのような由来のものを使用してもよい。例えば、動物の臓器、細菌類、および真菌類由来のものを用いることができる。好適には、ブタ腎臓由来のものが使用され得る。なお、本発明において、 D—アミノ酸ォキシダーゼの 1 Unitは、 37°Cにおいて 1分間に 1 / molの D—ァラニンをピルビン酸に変換する酵素量として定義する。

D—アミノ酸に、 D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼ [EC 2. 3. 1. 3 6] を作用させた場合には、生成するコェンザィム Aをァシルコェンザィム Aシンセターゼ [EC 6. 2. 1. 3] およぴァシルコェンザィム A酸化酵素 [EC 1. 3. 3. 6] を用いて過酸化水素に導き、これを同様にして定量することができる。 D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼは、どのような由来のものを使用してもよい。例えば、酵母由来のものを用いることができる。

S H試薬としては、生化学辞典（第 3版、 p. 182、東京化学同人、 1998年）にも記載されるとおり、エルマン試薬などの酸化剤、 P—メリクル安息香酸などのメルカプト形成剤、ョ一ド酢酸、 N—ェチルマレイミドなどのアルキル化剤が挙げられる。好ましくはアルキルィ匕剤を、さらに好ましくはマレイミド化合物を、もっとも好ましくは N—ェチルマレイミドを使用することができる。発生した過酸化水素は、パーォキシダーゼにより通常の酸化系発色剤を発色させることができる。酸化系発色剤としては、種々のトリンダー試薬を力ップラー試薬と組み合わせて利用できる。この方法はトリンダ一法とも呼ばれ、臨床化学分析の分野では一般に用いられており、ここでは詳細に説明しないが、好ましくはカップラー試薬として 4ーァミノアンチピリンを用い、そしてトリンダー試薬として ADOS [N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ - 3—スルホプロピル) — 3—メトキシァニリン] 、 DAOS [N—ェチル一 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル) —3， 5—ジメトキシァニリン] 、 HDAO S [N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル) 一 3, 5—ジメトキシァユリン] 、 MAOS [N—ェチル一 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）一3， 5—ジメチルァニリン] 、 TOOS [N—ェチル一 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル) 一 3—メチルァニリン] などが用いられる。また、力ップラー試薬を必要としない、 o—トリジン、 o—ジァニシジン、 DA- 67 [10- (カノレボシキメチルァミノ力ノレポエル） -3, 7一ビス (ジメチルァミノ）フエノチアジンナトリウム、和光純薬工業（株）製] 、 TPM— PS [N, N, N，， N' ， N" ， N" 一へキサ (3—スルホプロピル) —4， 4，， 4" —トリアミノトリフエニルメタン 6ナトリウム塩、同仁化学研究所] などのロイコ型発色試薬も同様に用いることができる。特に、 DA— 67および TPM— P Sは、上記トリンダー試薬と比べてモル吸光係数が大きいため、より感度よく測定することができる。

ホモシスティン測定用試薬キット：

本発明では、上記の各工程で必要とされる（a) D—ァラ-ルー D—ァラェンリガーゼおよび Zまたは D—セリンデヒドラクーゼ、 (b) チオール化合物、 (c) メチル転移酵素およびメチル供与体、ならびに（d) D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼ +ァシルコェンザィム Aシンセターゼ +ァシルコェンザィム A酸化酵素、 S H試薬、および酸ィ匕系発色剤を含む、ホモシスティン測定用試薬キットが提供される。これらの（a) 〜（d) は、通常は別々に提供されるが、（a) 〜（c) は予め緩衝液中に混合して調製された測定試薬として提供されてもよい。

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。

[実施例 1 ] 大腸菌由来の組換え D—ァラニル— D—ァラニンリガーゼ (A) (D d 1 A) の調製

(1 - 1 ) プローブの合成おょぴ d d 1 A遺伝子の取得

D d 1 A活性を有する酵素をコードする大腸菌の d d 1 A遺伝子の塩基配歹 IJ情報 (Biochemistry 30: 1673 - 1682 (1991) 、 GenBank Accession No. J05 319) をもとに、 EcoRIおよび Pstl認識部位をそれぞれ含む配列番号 1および 2に示す合成プライマーを作成した。これらのプライマー各 3 nmol (lOOpmo 1 1、 0 μΐ) を用い、 2 1の大腸菌 JM109の染色体 DNAをテンプレートとして、緩衝液（K0D DNAポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製；以下、 ΚΟ Dという） 2 μ 1、 10XKOD緩衝液 10μ1、 dNTP混合物 10μ 1、 DMS05 μ ΐ, および蒸留水 5 μ 1) 中で P CRを行って、 d d 1 A構造遺伝子を含む 1.09k bの DNAを得た。

( 1 - 2) d d 1 A遺伝子を含むプラスミドの調製

上記のようにして得られた d d 1 A遺伝子を、大腸菌 C o 1 E 1の DNA 複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌ベクター pUC 1 9 の Smal切断物に連結し、塩化ルビジウム法（J. Mol. Biol. , 166： 557, 198 3) によって大腸菌 JM109中に導入して、 d d 1 Α遺伝子を有する組換えブラスミド含む形質転換体を得た。なお、実施例で用いた制限酵素は、いずれもタカラバィォ社より入手した。上記形質転換体中の組換えプラスミドを用いて、蛍光標識プライマーを用ぃたジデォキシターミネータ一法による 377 Automate Sequencing System (パーキンエルマ一社製) によって塩基配列を決定した。 d d l Aは、 10 95塩基の構造遺伝子領域を有し、 364個のアミノ酸をコードし、これは上記 d d 1 A遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。

(1-3) d d 1 A遺伝子を含む発現べクタ一およぴ形質転換体の作成上記の糸且換えプラスミドを、制限酵素 EcoRIおよび Pst! [で切断して DNA 断片を切り出し、 d d 1 Aの DNAを含む 1.09kbの DNA断片を、ァガロースゲル電気泳動によって精製した。アンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌発現ベクター pKK233 -3 (アマシャム · フアルマシア社製) を、制限酵素 EcoRIおよび Ps 1で切断し、得られた 1.09kbの D N A断片を連結して、発現ベクター p K d 1 Aを得た (図 2を参照のこと) 。この発現ベクター p K d 1 Aは、イソプロピル一 ]3— D_チォガラクトビラノシド (以下、 IPT G) により D d 1 Aの発現が誘導される。

得られた発現ベクター p Kd 1 Aを、塩化ルビジゥム法によって大腸菌 JM

109中に導入し、 Dd l Aを発現するものを選択して、形質転換体 JM109- ddl A- 3を得た。

(1-4) 発現した D d 1 Aの活性の確認

得られた形質転換体 JM109-ddlA- 3を、アンピシリンを含む LB液体培地 (1%酵母エキス、 2%バタトペプトン、 2%グルコース） 3 ml中、 37°Cにて約 4時間振盪培養した。このうちの 0.3mlを、 10mlの LB液体培地に添カロして、 37°Cにて 3時間振盪培養し、 IPTG (タカラバイオ社製）を最終濃度 ImM となるように加えて、さらに 4時間培養した。培養液を、 8000rpmにて 15分間遠心分離して菌体を回収し、 lOOmMビストリスー塩酸緩衝液 (pH7.4) lml にて 1回洗浄した後、菌体の 10倍量の可溶化液（lOOmMビストリス一塩酸緩衝液 (pH7.4) 、 ImM EDTA、 5raM MgCl,, 100μ g/mlリゾチーム）に懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミー精ェ社製、 UD- ²00型）を用いて、目盛 1 にて 10秒間処理を 2回行うことによって、菌体を破碎した。 lSOOOrpmにて 10 分間遠心分離して上清を得、これを Dd 1活性測定の試料とした。なお、対照として、組換えられていない p KK 223 _3にょる大腸菌 109株の形質転換体を、同様に処理したものを用いた。

酵素活性の測定を、次のように行った。まず、菌体破碎液 (50^1) に、活性測定試薬 (20mM D—ァラニン 100 1、 20mM ATP、 lOOmM HEPES、 40mM MgCl₂ 40mM KC1 50^1) を加え、 37°Cにて 1時間反応させた。シリカゲル薄層に、反応液の 2 μ1をスポットした後、展開溶媒としてエタノール： 25%アンモニア水 =74： 26 (w/w) を用いて、密閉容器中で展開した。展開終了後、ニンヒドリン液（0.2%ニンヒドリンを含む 11—ブタノール飽和 0.1Mクェン酸緩衝液）を噴霧して、生成した D—ァラニルー D—ァラニンを検出した。組換え体の菌体破砕液による D—ァラエルー D—ァラニンの生成は、対照の菌体破砕液と比較して著量であった。

(1-5) D d 1 Aの調製

上記（1一 3) で得られた D d 1 A高生産組換え大腸菌を、アンピシリンを含む LB培地（1%酵母エキス、 2%バタトペプトン、 2%グルコース) 200mlに植菌し、 37°Cにて 15時間予備培養した。培養液を、アンピシリンを含む LB培地 1.8Lを入れた 5L容ジヤーファーメンターに接種し、 37°Cにて 1 00分間通気攪拌培養した。培養液に IPTGを最終濃度 1 mMとなるように加えて、さらに 4時間培養した。培養液を、 8000r_Pmにて 10分間遠心分離して菌体を回収し、菌体の 9倍容の緩衝液（20raMピストリス一塩酸緩衝液 (pH7.4) 、 1 mM EDTA_S 5raM MgCl₂) に菌体を懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミ一精エネ土製、 UD-200型）を用いて超音波処理を行うことによって、菌体を破砕した。破砕後、 15000rpmにて 10分間遠心分離して、破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。得られた粗酵素液に対して 5 %飽和となるように硫酸ァンモニゥムを氷冷下攪拌しながら添加した後、 30分間放置し、その後 14000rpmにて遠心分離した。得られた上清に、 45%飽和となるように硫酸ァンモニゥムを氷冷下攪拌しながら添加した後、 30分間放置し、その後 OOOrpmにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝液（20ηιΜピストリス一塩酸緩衝液 (ρΗ7.4) 、 ImM EDTA、 5raM MgCl₂) に対して 1晚透析した。

次いで、透析した粗酵素液を、 Q-セファロース FF (アマシャム · フアルマシァ社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（吸着：緩衝液 A (20mMビストリスー塩酸緩衝液 (pH7.4) 、 ImM EDTA、 5mM MgCl₂) 、溶出：緩衝液 A— 0·0〜0.6Μ塩化ナトリウムグラジェント）により精製した。 D d 1活性画分を集め、さらにセフアクリル S- 100 (アマシャム · フアルマシア社製）ゲル濾過カラムクロマトグラフィ一により精製を行った。得られた活性画分を、 SDS—ポリアタリルァミドゲル電気泳動に供し、クマシープリリアントブル一染色することによって、 D d 1 Aがほぼ単一パンドにまで精製されたことを確認した。

[実施例 2] 大腸菌由来の組換え D—ァラニルー D—ァラニンリガーゼ (B) (Dd 1 B) の調製

(2-1) プローブの合成および d d 1 B遺伝子の取得

Dd 1 B活性を有する酵素をコードする大腸菌の d d 1 B遺伝子の塩基配歹¹ J情報 (Journal of Bacteriology 163 :809 - 817 (1986) 、 GenBank Accessi on No. AE000118 REGION: 18688..19608) をもとに、配列番号 3および 4に示す合成プライマーを作成した。これらのプライマー各 3nmol (Ι00ριηο1//ζ 1、 30 μΐ) を用い、 2 /ιΐの大腸菌 JM109の染色体 DNAをテンプレートとして、緩衝液 (KOD 2 ju

dNTP混合物 10μ 1、 DMS 05 μ1、および蒸留水 5 1) 中で PCRを行って、 d d l B構造遺伝子を含む 0.92kbの D N Aを得た。

(2-2) d d 1 B遺伝子を含むプラスミドの調製

上記のようにして得られた d d 1 B遺伝子を、大腸菌 C o 1 E 1の DNA 複製起点おょぴアンピシリン耐性遺伝子を有する大腸菌べクタ一: pUC19 の Smal切断物に連結し、塩化ルビジウム法（J. Mol. Biol., 166:557， 198 3) によって大腸菌 JM109中に導入し T、 d d 1 B遺伝子を有する組換えブラスミド含む形質転換体を得た。

上記形質転換体中の組換えプラスミドを用いて、蛍光標識プライマーを用レヽたジデ才キシターミネータ一法による 377 Automate Sequencing System (パーキンエルマ一社製）によって塩基配列を決定した。 d d l Bは、 92

1塩基の構造遺伝子領域を有し、 306個のアミノ酸をコードし、これは上記 d d 1 B遺伝子の塩基配列情報と完全に一致していた。

(2-3) d d 1 B遺伝子を含む発現べクタ一および形質転換体の作製大腸菌発現べクタ一 p K K 233-3 (アマシャム · ブアルマシア社製）を制限酵素 EcoRIで切断後、 DNA Blunting Kit (タカラバイオ社製) を用いて平滑末端化し、さらにアルカリフォスファターゼ (タカラバイオ社製) を用いて脱リン酸ィヒし、（2—1) の d d 1 B構造遺伝子断片を連結して、発現ベクター pKd 1 Bを得た (図 3を参照のこと) 。この発現ベクター p K d 1 Bは、 IPTGにより、 Dd 1 Bの発現が誘導される。

得られた発現ベクター p Kd 1 Bを、塩ィ匕ルビジウム法によって大腸菌 JM

109中に導入し、 Dd 1 Bを発現するものを選択して、形質転換体 JM109-ddl B-1を得た。

(2-4) D d 1 Bの調製

上記（2_3) で得られた Dd 1 B高生産組換え大腸菌を、 'アンピシリンを含む LB培地（1%酵母エキス、 2%バクトペプトン、 2%グルコース） 200mlに植菌し、 37°Cにて 15時間予備培養した。培養液を、アンピシリンを含む L B培地 1. 8Lを入れた 5 L容ジヤーファーメンターに接種し、 37°Cにて 1 00分間通気攪拌培養した。培養液に IPTGを最終濃度 I mMとなるように加えて、さらに 4時間培養した。培養液を、 SOOOrpmにて 10分間遠心分離して菌体を回収し、菌体の 9倍容の緩衝液（20mMビストリスー塩酸緩衝液 (pH7. 2) 、 1 raM EDTA、 5mM MgCl₂) に菌体を懸濁した。懸濁液に、超音波発生装置（トミ一精エネ土製、 UD - 200型）を用いて超音波処理を行うことによって、菌体を破砕した。破碎後、 15000rpmにて 10分間遠心分離して、破砕残渣を取り除き、粗酵素液を得た。

得られた粗酵素液に対して 25%飽和となるように硫酸ァンモニゥムを氷冷下攪拌しながら添加した後、 30分間放置し、その後 14000rpmにて遠心分離した。得られた上清に、 50%飽和となるように硫酸ァンモニゥムを氷冷下攪拌しながら添加した後、 30分間放置し、その後 OOOrpmにて遠心分離した。得られた沈殿を、緩衝液（20 ビストリスー塩酸緩衝液 (pH7. 2) 、 lniM EDTA、 5mM MgCl₂) に対して 1晚透析した。

次いで、透析した粗酵素液を、 Q-セファロース FF (アマシャム ·フアルマシァ社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（吸着：緩衝液 A (²0mMビストリス—塩酸緩衝液 (pH7. 2) 、 ImM EDTA、 5mM MgCl₂) 、溶出：緩衝液 A— 0. 0〜0. 6M塩化ナトリゥムグラジェント) により精製した。 D d 1活性画分を集め、さらにセファタリル S-100 (アマシャム · フアルマシア社製) ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより精製を行った。得られた活性画分を、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシ一ブリリアントブル一染色することによって、 D d 1 Bがほぼ単一バンドにまで精製されたことを確認した。

[実施例 3 ] 大腸菌由来の組換え D—セリンデヒドラターゼ（D s d ) の ( 3 - 1 ) d s d遺伝子を含む発現ベクターおよび形質転換体の作製 D s d活性を有する酵素をコードする大腸菌の d s d遺伝子の塩基配列情報をもとに、次の 2種類の合成プライマー（配列番号 5および 6 ) を作成した。

これらのプライマーを用いて大腸菌のゲノム D NAを铸型として P C Rを行った。得られた D NAフラグメントを EcoRIおよひ、HindIIIで処理し、同じ制限酵素で処理したべクタ一 PUC118に連結した。これを塩化ルビジゥム法によって大腸菌 JM109中に導入して、 d s d遺伝子を有する組換えプラスミド含む形質転換体を得た。

( 3 - 2 ) D s dの調製

上記で得られた D s d発現株を、 lOO ^u g/mlのアンピシリンを含む LB培地約 10L中で培養した。酵素精製は J. Biol. Chem. , 263， 16926-16933, 1988 に記載の方法に準じて実施した。菌体ペーストをほぼ同容の SPE lysis buff er (20% ショ糖、 20 EDTA、 30mM リン酸カリウム、 0. 5mg/mL リゾチーム、 pH7. 8) に懸濁し、インキュベート後、プロテアーゼ阻害剤およびピリドキサル 5 ' —リン酸（PLP) を含む水を加えて溶菌させた。氷冷し、さらにほぼ同容の緩衝液 B (1M リン酸カリウム、 800 Μ PLP、 50raM EDTA、 lOraM DTT、 pH7. 5)を加え、 18000rpm、 30分間の遠心分離により細胞残渣を除いた。得られた上清液を pH7. 3に調整後、 1% Polymin Pにより核酸を沈殿させ遠心分離により上清液を得た。 70%飽和となるように硫酸ァンモニゥムを添加して溶解後、 40分間撹拌し、その後 18000rpmにて 2時間遠心分離した。得られた沈殿は少量の緩衝液 C (lOmM リン酸カリゥム、 80 _J M PLP、 IraM EDTA、 ImM DT T、 pH7. 2) に懸濁し、同緩衝液に対して 1晚透析した。

次いで、透析した粗酵素液を、 DEAE- Toyopearl (東ソ一社製）を用いた力ラムクロマトグラフィーにより精製した。吸着は緩衝液 Cを用い、溶出は同緩衝液をベースに KC1を 0から 200mM に増加させて行った。 D s d活性画分を集め、 70%飽和硫酸アンモユウムにて沈殿させ回収した。少量の緩衝液じに溶解し、同緩衝液に対して 1晚透析し、硫酸アンモニゥムを除去した。さらに、緩衝液 D (ImM リン酸カリウム、 ImM DTT、 pH7. 0) に対して 3〜4時間透析した。

透析した部分精製酵素液を、さらにハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー（ギガパイト、東亜合成化学社製、生化学工業販売）により精製した。緩衝液 Dで平衡ィヒさせたカラムに同酵素液をアプライし、カラム容量の 3倍量の同緩衝液にて洗浄し、緩衝液 E (lOmM リン酸カリウム、 80 μ Μ PLP、 ImM EDTA、 pH7. 8) にて溶出させた。溶出各画分に 1/10容量の緩衝液ィを加え、 D s d活性画分を集め、 70%飽和硫酸アンモ-ゥムにて沈殿させ回収した。得られた沈殿は少量の緩衝液 F (lOOmM リン酸カリウム、 80 μ Μ PLP、 ImM EDTA、 ImM DTT、 pH7. 8) に懸濁し、同緩衝液に対して透析し精製酵素を得た。

( 3 - 3 ) D s dの活'["生の測定

D s dの活性の測定は、 D—セリンから生成するピルビン酸を、 NADHの存在下での乳酸脱水秦酵素とのカツプリングを測定することにより実施した。すなわち、 37°Cにおいて lOOmM D—セリン、 0. 5mM NADH、および 5 U乳酸脱水素酵素に、 0. 01〜0. 1 U D s dを加えて反応を開始し、 340nmの吸光度の減少を追跡した。

[実施例 4 ] D d 1 A、 D d 1 Bおよび D s dによる D—ァラエンの影響回避

試料（1〜5 ) を次のように調製した：

試料 1 ：正常コント口ール血清セラタリア HE (ァズウェルネ土製）試料 2 ：試料 1にホモシスチンを 25 / M (ホモシスティン換算値 50 M) 添加試料 3 ：試料 2に D—ァラエンを 100 At M添加

試料 4 ：試料 2に D—セリンを 500 ίζ Μ添カロ

試料 5 ：試料 2に D—ァラニンを ΙΟΟίί Μおよび D—セリンを 500 // Μ添加。第一試薬（I〜V) および第二試薬を次のように調製した：

第一試薬：

試薬 I ： 50 mM Bicine (pH 8. 0)、 123 U/Lホモシスティンメチルトランスフェラーゼ（細菌由来）、 5. 6 mM ジチオスレィトール、 0. 06 mM D—メチォェンメチルスルホニゥム、 1 mM臭化亜鉛、 0. 3 mM DA-67_N 1 mM ATP、 1 m M塩化マグネシウム

試薬 II：試薬 Iに D d 1 Bを 0. 2285 mg protein/mL添カロ

試薬 III：試薬 Iに D d 1 Aを 2. 0875 mg protein/mL添加

試薬 IV：試薬 Iに D s dを 1 U/mL添カロ

試薬 V：試薬 Iに D d 1 Bを 0. 2285 mg protein/mLおよび D s dを 1 U/mL 同時に添加。

一 5¾薬：

50 mM クェン酸（pH 5. 6)、 23mM匪、 6. 4 U/mL ブタ腎臓由来 D—ァミノ酸ォキシダーゼ、 5. 5 U/mLパーォキシダーゼを含む試薬。

測定は日立 7170を使用して次のように行った。各試料 1〜5 15 Lにいずれかの第一試薬 180 Lを添加して混合し、 37°Cで 5分間反応させた。次に第二試薬 120 z Lを添加混合し、さらに 37°Cで 5分間反応させた。測定ポイント 16から 34における吸光度 (主波長 660nm、副波長 750皿）変化を測定した。まず、試料 1および 2を、試薬 I〜Vを用いてそれぞれ測定し、その場合の試料に添加したホモシスティンに対する測定感度をそれぞれ 1 0 0 %とした。次いで、試料 3〜 5を試薬 I〜Vを用いてそれぞれ測定した場合、試料 3〜5の測定感度は、以下の表 1のとおりであった。表 1

これらの結果から明らかなように、コントロールでは、 D—ァラニンおよび D—セリンの影響のため、測定値が高く出たが、測定試薬中に D d 1 Bまたは D d 1 Aを含有させることによってサンプル中の D—ァラニンの影響を軽減し、そして D s dを含有させることによって D—セリンの影響を軽減した。また、両者を同時に使用することによって、 D—ァラニンおょぴ D—セリンの影響を同時に軽減できることも明らかである。

[実施例 5 ] D d 1および D s dによる D—ァラニンおょぴ D—セリンの消去

試料（4種類）を次のように調製した：

試料 1 ：正常コント口ール血清セラクリア HE (ァズゥェル社製）

試料 2 ：試料 1にホモシスチンを 25 M (ホモシスティン換算値 50 μ Μ) 添加試料 6 ：試料 2に D—ァラニンを 200 μ Μ添加

試料 7 ：試料 2に D—セリンを 1000 Μ添加。

第一試薬および第二試薬を次のように調製した：

第一試薬：

50 mM Bicine (pH 8. 0)、 123 U/Lホモシスティンメチノレトランスフェラーゼ（細菌由来）、 5.6 mM ジチオスレィトール、 0.06 raM D—メチォニンメチルスルホユウム、 1 mM臭化亜鉛、 0.3 mM DA- 67、 5 mM ATP、 10 mM塩化マグネシウムを含む試薬に、 0(1 18を0、 0.073、 0.145、 0.29および 0.58 U/mL添加した試薬および D s dを 0、 0.125、 0.25および 0.5 U/mL添加した試第二試薬：

50 mM クェン酸（pH 5.6)、 23mM ΝΈΜ、 6.4 U/mL ブタ腎臓由来 D—ァミノ酸ォキシダーゼ、 5.5 U/mLパーォキシダーゼを含む試薬。

測定は日立 7170を使用して次のように行った。試料 15 AiLに第一試薬 180 μ Lを添加して混合し、 37°Cで 5分間反応させた。次に第二試薬 120 /xLを添カロして混合し、さらに 37°Cで 5分間反応させた。測定ポイント 16から 34における吸光度 (主波長 660nm、副波長 750ηηι) 変化を測定した。

結果を図 4おょぴ図 5に示す。

図 4は、横軸に Dd 1 Bの濃度、および縦軸にホモシスティン測定時の相対感度を示した。約 0.5 U/mLの D d 1 Bを用いることにより、 200 mM D - ァラエンの影響はほぼ回避できることがわかった。

図 5は、横軸に D s dの濃度、および縦軸にホモシスティン測定時の相対感度を示した。約 0.2 U/mLの D s dを用いることにより 1000 mM D—セリンの影響をほぼ回避することができた。

[実施例 6 ] D d 1および D s dによる試料中の D—アミノ酸の影響回避試料は、 EDTA血漿 12検体を用いた。スタンダードとしては、コントロール血清に 50 μ M D—メチォニンを添加したものを用いた。

第一試薬 3種類（i〜iii) および第二試薬 1種類（共通）を次のように調製した。

第一試薬：試薬 i ： 50 mM Bicine (pH 8. 0)、 126 U/Lホモシスティンメチルトランスフェラーゼ（細菌由来）、 5. 6 mM ジチオスレィトール、 0. 06 mM D—メチォ-ンメチルスルホユウム、 1 mM臭化亜鉛、 0. 3 mM DA- 67

試薬 ii：試薬 iからホモシスティンメチルトランスフェラーゼを除く試薬 iii：試薬 iに 5 mM ATP、 10 mM塩化マグネシウム、 0. 58 U/mL D d

1 B、 1 U/mL D s dを添加。

第二試薬：

50 mM クェン酸（pH 5. 6)、 23mM NEM、 6. 4 U/mL ブタ腎臓由来 D—ァミノ酸ォキシダーゼ、 5. 5 U/mLパーォキシダーゼを含む。

測定は日立 7170を使用して次のように行つた。試料 15 にいずれかの第一試薬 180 _β Lを添加して混合し、 37°Cで 5分間反応させた。次に第二試薬 12 0 Lを添加して混合し、さらに 37°Cで 5分間反応させた。測定ポイント 16から 34における吸光度 (主波長 660nm、副波長 750nm) 変化を測定した。スタンダードの吸光度変化から試料中のホモシスティン濃度を算出した。試薬 Aのみを用いて測定した値を従来 1チャンネル法とし、試薬 iと試薬 iiとの差をとって測定した値を従来 2チャンネル法とし、そして試薬 iiiを用いて測定した値を本発明法とした。それぞれの値を HPLC法による測定値と比較した。図 6からわかるように、従来 1チヤンネル法に比較して、本発明法は、 HP LC法との相関性が改善され、そして従来 2チヤンネル法に劣らない相関性を示した。

産業上の利用可能性

本発明の方法によれば、内因性 D—アミノ酸の影響を受けず、かつ検体ブランクをとる必要なく、ホモシスティンを測定することができる。すなわち、操作が簡便でありかつ正確なホモシスティンの測定が可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 試料中のホモシスティンを検出または測定する方法であって、

( a ) 試料中に存在する D—アミノ酸に D—アミノ酸変換酵素を作用させて、該 D—アミノ酸を、 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチノレトランスフェラ一ゼの基質とならない物質に変換する工程；

( c ) 該還元されたホモシスティンに、メチル転移酵素おょぴメチル供与体を作用させ、新たに D—アミノ酸を生じさせる工程；および

( d ) 該生成した D—アミノ酸に、 S H試薬の存在下で、該 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフエラーゼを作用させて、過酸化水素生成へ導き、該生成した過酸化水素を酸化系発色剤により発色させる工程、

を含む、方法。

2 . 前記工程 ( a ) が、試料中に存在する D—ァラニンに、アデノシン三リン酸の存在下で D—ァラニル一 D—ァラニンリガーゼを作用させて D—ァラニル一 D—ァラニンに変換する工程および/または試料中に存在する D—セリンに、 D—セリンデヒドラターゼを作用させてピルビン酸に変換する工程である、請求項 1に記載の方法。

3 . 前記メチル転移酵素が、ホモシスティンメチルトランスフェラーゼであり、そして前記メチル供与体が、 D—メチォニンメチルスルホニゥムである、請求項 2に記載の方法。

4 . 前記工程（d ) において、前記生成した過酸化水素を、パーォキシダーゼおよぴ酸ィ匕系発色剤により発色させて検出または測定する、請求項 2または 3に記載の方法。

5 . D—ァラ二ルー D—ァラユンリガーゼおよぴ Zまたは D—セリンデヒドラターゼ；チオール化合物；メチル転移酵素；メチル供与体； D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフェラーゼ； S H試薬；および酸化系発色剤を含む、ホモシスティン測定用試薬キット。

6 . 試料中のホモシスティンを検出または測定する方法であって、試料中に存在する D—アミノ酸に D—アミノ酸変換酵素を作用させて、該 D—アミノ酸を、 D—アミノ酸ォキシダーゼまたは D—アミノ酸ァセチルトランスフエラーゼの基質とならない物質に変換する工程を含むことを特徴とする、方法。