WO2004072281A1 - グリオキシル酸の生化学的製造方法 - Google Patents

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WO2004072281A1
WO2004072281A1 PCT/JP2004/001577 JP2004001577W WO2004072281A1 WO 2004072281 A1 WO2004072281 A1 WO 2004072281A1 JP 2004001577 W JP2004001577 W JP 2004001577W WO 2004072281 A1 WO2004072281 A1 WO 2004072281A1
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WO
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dna
amino acid
aldehyde oxidase
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/001577
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English (en)
French (fr)
Inventor
Akira Iwasaki
Takehiko Matsumoto
Motohisa Washida
Hiroshi Watanabe
Junzou Hasegawa
Sakayu Shimizu
Original Assignee
Kaneka Corporation
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Filing date
Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing glyoxylic acid from glioxal by using microorganisms and Z or enzymes derived from microorganisms.
  • Daroxylic acid is used as a raw material for synthesizing vanillin and ethyl vanillin, and is also a useful compound as an intermediate in the synthesis of agricultural chemicals and pharmaceuticals.
  • Oxidases that oxidize aldehyde groups have been confirmed to exist mainly in animals and plants, but there is no report that these enzymes show activity against dalioxal.
  • some white-rot fungi such as Phane roc ha etechrysosporium produce extracellular enzymes (called dalyoxal oxidase) that have the activity of reacting with dalioxal to generate hydrogen peroxide.
  • dalyoxal oxidase extracellular enzymes that have the activity of reacting with dalioxal to generate hydrogen peroxide.
  • an object of the present invention is to provide a microorganism having an activity of converting dalioxal to dalioxylic acid, an enzyme having the activity, or an enzyme having the activity, and a method for efficiently producing dalioxylic acid using the same.
  • the present inventors have conducted intensive studies to develop an efficient method for producing daloxylic acid.As a result, the present inventors have found microorganisms having an activity of converting dalyoxal to daloxylic acid, and obtained those microorganisms and Z or those obtained from the microorganisms. A detailed study of dalioxylic acid synthesis using the enzyme solution The invention has been completed.
  • the present invention relates to an oxidoreductase capable of converting dalioxal to dalioxylic acid, or a culture solution of a microorganism capable of producing the oxidoreductase, a supernatant of the culture solution, the cells, and the treated cells.
  • the present invention relates to a method for producing dalioxylic acid, which comprises reacting one or more of them with glyoxal to convert it to dalioxylic acid.
  • the oxidoreductase is preferably oxidase.
  • the oxidoreductases may be of the genus Stenotrophomonas, the genus Streptomyces, the genus Pseudomonas, or the microbacterium. um) genus, acromono, acta (.Ac hr omob acter) genus, cellulomonas (Cel 1 u1 omo nas) genus, cellulosi microbeam (Cel 1 u1 os imi cr ob um) genus, moleganella (M or It is preferably an enzyme obtained from at least one microorganism selected from the group consisting of the genus gane lla).
  • the microorganism is Stenotrophomonas sp.
  • KNK 235 deposited by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Tsukuba East, Ibaraki, Japan, 1 Chome No. 1 1 Chuo No. 6 (Postal code 305-8566), Deposit date September 6, 2002, Accession number FERM P-19002, Streptomyces species KNK 269 ((Deposited Organization National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Patent Organism Depositary Center, Address: 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan Deposit date: September 6, 2002 No. F ERM BP— 08556), Pseu domona ss p.
  • KNK058 (Depositary Institution Sangyo National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center, Address: 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan Deposit date: December 13, 2002, Deposit number: FERM BP—08555 ), Pseudomonas Species KNK254 ((Depositary Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, Address: 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) September 6, 2002, Accession number FERM P-19003), Microbacterium sp. (Kr.
  • KN 011 (Deposited organization: Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Center 1, Address 1 Tsukuba, Higashi 1-chome, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6 (Zip code 305-8566), Deposit date December 13, 2002, Accession number FERM BP—08554) Spices (Ac hr omo bacters p.) I FO 13495 (Deposited organizations: National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Division, Biotechnology Resources Division (NBRC), address: 292—0818 Kazusa, Kazusa, Kisarazu, Chiba, Japan 2-5-8), Cellulomonas' Speci (Ce l 1 u).
  • JCM 2471 Depositary organization RIKEN Microorganisms Strain Conservation Facility (JCM), Address ⁇ 351—0198 Hirosawa, Wako-shi, Saitama, Japan 2-1—) C e 1 1 u
  • I FO 15012 (Depositary Institution: National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Division, Biological Genetic Resources Division (NBRC), Address ⁇ 292— 0818 Kazusa, Kasusa, Kisarazu-shi, Chiba, Japan 2— 5-8), Cell mouth Monas Tabayu I FO 15014 (Depositary organization Biotechnology Division, Biotechnology Division, National Institute of Technology and Evaluation, Genetic Resources Division (NBRC), Kisarazu, Chiba, Japan 292-0818, Japan Kazusa Ichika 2-5-8), Cellulomonas, Evening Bata IFO 1 4001577
  • catalase coexist during the reaction.
  • the present invention also relates to a microorganism-derived aldehyde oxidase that acts on dalioxal to produce dalioxylic acid.
  • the activity for daloxylic acid is 1/0 or less times the activity for daloxal.
  • the aldehyde oxidase is selected from the group consisting of Stenotrophomonas, Streptomyces, Pseudomonas, Microbacterium, and achromopactor. 2004/001577
  • the microorganisms include Stenotrophomonas sp. KNK235 (FERM P_19002), Streptomyces sp. KNK 269 (FERM BP-08556), and Pseudomonas sp. KN K058 (FERM BP-08555). , Pseudomonas sp.
  • the aldehyde oxidase is preferably aldehyde oxidase produced by a microorganism of the genus Streptomyces having the following physicochemical properties (1) to (3).
  • the aldehyde oxidase has the following physicochemical properties (1) to (3). 2004/001577
  • the 7 is preferably an aldehyde oxidase produced by a microorganism belonging to the genus Pseudomonas.
  • the aldehyde oxidase is preferably an aldehyde oxidase produced by a microorganism of the genus Microbacterium having the following physicochemical properties inside and outside the cells.
  • the aldehyde oxidase is preferably an aldehyde oxidase produced by a microorganism of the genus Cellulosi micropium having the following physicochemical properties inside and outside the cells.
  • the microorganism belonging to the genus Streptomyces is preferably Streptomyces species KNK269 (FERM BP-08556).
  • the microorganism belonging to the genus Pseudomonas is preferably Pseudomonas sp. KNK058 (FERM BP-08555).
  • the microorganism belonging to the genus Micropacterium is preferably Micropakterium species KNK011 (FERM BP-08554).
  • microorganism belonging to the genus Pium belonging to the genus Cellulosicum sp. Is Cellulosimicrobium cellulans IF 15516.
  • the aldehyde oxidase is a protein of the following (a) or (b): JP2004 / 001577
  • the aldehyde oxidase has a quality as a subunit.
  • the aldehyde oxidase is preferably an aldehyde oxidase having a protein encoded by the following DNA (a) or (b) as a subunit.
  • the aldehyde oxidase is preferably an aldehyde oxidase having the following amino acid sequence (a) or (b).
  • the aldehyde oxidase is preferably an aldehyde oxidase encoded by the following DNA (a) or (b).
  • the present invention also relates to a DNA encoding the aldehyde oxidase.
  • the DNA contains any of the following (a) or (b): 4001577
  • the DNA comprises a DNA encoding the aldehyde oxidase subunit.
  • the DNA is preferably a DNA encoding the aldehyde oxidase, which comprises any of the following (a) or (b):
  • the DNA aldehyde oxidase subunit wherein the DNA comprises any one of amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, or 3. It is preferably a DNA encoding
  • the aldehyde oxidase wherein the DNA comprises any one of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 11, or 12;
  • the DNA is a DNA that encodes BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing the principle of a method for measuring the activity of an oxidase reaction.
  • FIG. 2 is a diagram showing the optimum pH of the reaction of the enzyme derived from the KNK269 strain of the present invention.
  • As buffer 0.1M Macllbine buffer (Qin), 0.1M phosphate buffer ( ⁇ ), 0.1M Tricine buffer ( ⁇ ), or 0.1M PT / JP2004 / 001577
  • FIG. 3 is a diagram showing the thermostability of the enzyme derived from the KNK 269 strain of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the optimal reaction temperature of the enzyme derived from the KN K058 strain of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the optimum pH of the reaction of the enzyme derived from the KNK058 strain of the present invention.
  • a buffer a 0.1 M Maclline buffer (: parable), a 0.1 M phosphate buffer ( ⁇ ), or a 0.1 M Triline buffer (X) was used.
  • the reaction represented by the above formula 1 is a case where oxidase or a microorganism containing the oxidase is present, and the reaction represented by the above formula 2 is a reaction containing dehydrogenase or the dehydrogenase.
  • the conversion of dalioxal to dalioxylic acid includes conversion by either of the reactions shown in the above formulas 1 and 2. Therefore, the oxidoreductase having the ability to convert glyoxal to dalioxylic acid means oxidase or dehydrogenase, and any enzyme capable of converting aldehyde to carboxylic acid may be used.
  • the detection and quantification of the desired oxidase activity in the present invention is carried out by converting hydrogen peroxide produced by the oxidation reaction into 4-aminoantipyrine (hereinafter referred to as 41 AA) and N-ethyl- (2-hydroxyl).
  • the reaction can be carried out by reacting with 3-sulfopropyl) -m-toluidine (hereinafter referred to as TOOS) and detecting and quantifying the resulting quinonimine dye.
  • the quantification of dalioxal and dalioxylic acid can be performed by high performance liquid chromatography.
  • Analysis by high performance liquid chromatography for example, using a BioRad Aminex HPX- 87H (7. 8mm X 300mm) column, have use a 5 mM of H 2 S 0 4 aqueous solution as a solvent, at a flow rate of 0. 4m 1 / min Can do it.
  • Detection is performed by measuring the absorbance at 230 nm or the differential refractive index. Under these conditions, dalioxal elutes in 16 minutes and dalioxylic acid elutes in 15 minutes.
  • the microorganism having the desired oxidase activity can be obtained, for example, by the following screening.
  • Carbon sources include dalioxal, ethylene glycol, propylene glycol or glycol aldehyde 10 g, ammonium nitrate 2 g, dipotassium hydrogen phosphate 1 g, monosodium hydrogen phosphate, yeast extract 0.1 lg, magnesium sulfate heptahydrate
  • S medium pH 7
  • the culture solution in which the bacteria had grown was applied to an S medium plate containing 2% agar in an amount of 0.1 ml each, and cultured at 28 ° C for 3 to 7 days. After that, the grown colonies were again statically cultured on an S medium plate containing 2% agar medium, and the strains whose growth was confirmed were assimilated to each carbon source. After that, these assimilating bacteria were examined for the activity of converting dalioxal to dalioxylic acid.
  • oxidase-bearing bacteria when the oxidation of dalyoxal is catalyzed by the above-mentioned oxidase, hydrogen peroxide is generated at the same time as dalioxylic acid, so that oxidase-bearing bacteria can be found by detecting hydrogen peroxide generated during the reaction. That is, 0.1 ml of a cell suspension of cells obtained by culturing in the S medium contains 5 OmM glyoxal, 1.34 mM 4-AA, 2.18 mM TO OS, 4 U / m 1 peroxidase.
  • the reaction solution After adding to 0.1 ml of mM phosphate buffer and shaking at 28 ° C for 2 hours, the reaction solution turned purple, that is, the strain in which hydrogen peroxide was generated by the reaction to dalioxal was selected. It is possible to obtain a strain possessing oxal oxidase activity.
  • Microorganisms capable of converting glyoxal to glyoxylic acid include Stenotrophomonas, Streptomyces, Pseudomonas, Microbacterium, Achromopactor, Cellulomonas, Cellulosimicropium, Morganella, and the like.
  • the microorganisms to which they belong can be mentioned.
  • Representative microorganisms among them are Stenotrophomonas sp. KNK235 (FERM P— 19002), Streptomyces sp. KNK269 (FERM BP—08556), and Pseudomonas sp. KNK058 (FERM BP—).
  • IFO 13495, IFO 15012, IFO 15014, IFO 15015, IFO 15013, IFO 15516, and IFO3848 are known, and Biotechnology, Inc. Headquarters ⁇ Biological Genetic Resources Division (NBRC) (: ⁇ 292-0818 Kisarazu, Chiba, Japan) Kazusa 2-5-8 JCM 2471 and JCM 6201 are also known and are readily available from the Independent Administrative Law, Institute of Physical and Chemical Research, Microbial Strain Conservation Facility (JCM) ( ⁇ 2-1-0198 Hirosawa, Wako, Saitama, Japan). Can be.
  • NBRC Biological Genetic Resources Division
  • JCM Microbial Strain Conservation Facility
  • KNK235 strain Pseudomonas sp. Seeds KNK058 (hereinafter sometimes simply referred to as KNK058 strain), Supidomonas sp. Species KNK254 (hereinafter sometimes simply referred to as KNK254 strain), and micropaques.
  • KNK254 strain Seeds KNK058 (hereinafter sometimes simply referred to as KNK058 strain), Supidomonas sp. Species KNK254 (hereinafter sometimes simply referred to as KNK254 strain), and micropaques.
  • Table 1 shows the bacteriological properties of 1 (hereinafter sometimes simply referred to as KNK011 strain). table 1
  • KNK269 strain The identification of Streptomyces species KNK269 strain (hereinafter sometimes simply referred to as KNK269 strain) was carried out based on the following well-known method. A region of about 500 bp at the 5 'end of the 16S liposome RNA gene (16S rDNA) of the strain was amplified by PCR, the nucleotide sequence was determined, and MicroSeqBac terial 500 1 ibra ry v. 002 3 (Applied Biosystems, CA, USA) A homology search was performed using a database to prepare a molecular phylogenetic tree.
  • the aldehyde oxidase preferably has the following physicochemical properties (1) to (3) of aldehyde oxidase produced by a microorganism of the genus Streptomyces.
  • Streptomyces sp. Seeds KNK269 (FERM BP-08556) is preferred.
  • aldehyde oxidase is aldehyde oxidase produced by a microorganism belonging to the genus Pseudomonas, it preferably has the following physicochemical properties (1) to (3).
  • Pseudomonas sp. KNK058 (FERM BP-08555) is preferred.
  • the aldehyde oxidase is an aldehyde oxidase produced by a microorganism of the genus Microbacterium inside or outside the cells, it preferably has the following physicochemical properties.
  • Microbacterium species KNK 011 (FERMBP-085554) is preferable.
  • the aldehyde oxidase is an aldehyde oxidase produced by a microorganism of the genus Cellulosimicropium inside or outside the cells, it preferably has the following physicochemical properties.
  • Cellulosimicropium cellulans IFO 150516 is preferable.
  • the medium for culturing a microorganism capable of producing oxidoreductase having the ability to convert darixol to glyoxylic acid is not particularly limited as long as the microorganism can grow.
  • carbon sources include carbohydrates such as glucose and sucrose, ethanol, glycerol, alcohols such as ethylene glycol and propylene glycol, aldehydes such as dalioxal, oleic acid and stearic acid, etc.
  • Fatty acids and their esters oils such as rapeseed oil and soybean oil; ammonium sources such as ammonium sulfate, sodium nitrate, peptone, gazamino acids, yeast extract, meat extract and corn steep liquor; inorganic salts such as magnesium sulfate; Ordinary liquid medium containing malt extract, meat extract, etc. may be used, such as sodium chloride, calcium carbonate, hydrogen phosphate phosphate, and hydrogen phosphate dihydrogen. 1577
  • the method for producing dalicholate includes: a culture solution of the oxidoreductase or a microorganism capable of producing the oxidoreductase; a microbial cell isolated from the culture solution; a treated microbial cell; When the oxidase is produced outside the microbial cells, any one of the culture supernatants is allowed to act on dalioxal to convert and accumulate it into dalioxylic acid.
  • the processed product of microbial cells means, for example, freeze-dried cells, acetone-dried cells, crushed cells, or crude enzyme solutions.
  • the term “crude enzyme solution” includes, for example, a solution crushed or dissolved by a physical crushing method using glass beads of a bacterial cell, a biochemical method using an enzyme, or the like, and a solution obtained by centrifugation or the like. And a cell-free extract obtained by removing the solid matter.
  • an enzyme obtained by partially purifying the above cell-free extract using a method commonly used by those skilled in the art, for example, by using alone, in combination with, for example, precipitation, ammonium sulfate precipitation, and chromatography is also referred to as a “crude enzyme solution”. include.
  • the processed product of microorganisms can be immobilized and used by known means.
  • the immobilization can be performed by a method well known to those skilled in the art (for example, a crosslinking method, a physical adsorption method, an entrapment method, and the like).
  • the reaction conditions vary depending on the enzyme, the microorganism, or the processed product, but the optimal reaction condition is a temperature of 10 to 80, preferably 20 to 40 ° C from the viewpoint of thermal stability. , PI ⁇ pH4 to 12, preferably in the range of pH6 to 10 from the viewpoint of pH stability.
  • the reaction is preferably carried out under shaking and stirring conditions.
  • Hydrogen peroxide When the reaction is catalyzed by oxidase, hydrogen peroxide is produced in the reaction system. Hydrogen peroxide may deactivate enzymes or decompose dalioxylic acid into formic acid.Addition of catalase decomposes and removes hydrogen peroxide generated by the reaction, and inactivates the enzyme. It is possible to prevent decomposition.
  • an enzyme showing only a low activity against dalioxylic acid is desirable.
  • the enzyme of the present invention preferably has an activity against dalioxylic acid that is 1/10 or less times the activity against dalioxal, more preferably 120 times or less, and 1Z 100 times or less.
  • the oxidase of the present invention is characterized not only in converting dalioxal to dalioxylic acid, but also having low activity for dalioxylic acid. Dalioxaloxidase, which is produced by wood-rotting fungi that is known to be active against dalioxal, also shows high activity against dalioxylic acid.
  • Table 2 shows the activities of the enzyme of the present invention and the enzyme produced by wood-rotting fungi, respectively, against glioxal and daloxylic acid.
  • the enzyme of the present invention has a very low activity on dalioxylic acid as compared with dalioxal.
  • the present invention provides a method for encoding the aldehyde oxidase which can be used for effectively recombinantly producing the aldehyde oxidase.
  • the present invention relates to a DNA encoding an aldehyde oxidase subunit consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, 5, or 6, and further comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with any one of the DNAs is also provided, as long as the protein having the protein encoded by the DNA as a subunit has the activity of converting glyoxal to glyoxylic acid.
  • the present invention also relates to a DNA encoding an aldehyde oxidase consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 13, or 14, and further a nucleotide complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence.
  • DNAs that hybridize under stringent conditions with any one of the DNAs comprising the sequence also include the DNA of the present invention as long as the protein encoded by the DNAs has the activity of converting dalioxal to dalioxylic acid. included.
  • a DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 is also described.
  • a protein having a protein encoded by DNA as a subunit has an activity of converting dalioxal to dalioxylic acid, it is included in the DNA of the present invention.
  • the protein encodes a protein comprising any one of amino acid sequences in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 11, or 12.
  • DNA is also included in the DNA of the present invention as long as the protein encoded by the DNA has the activity of converting darixol to glyoxylic acid.
  • the present invention relates to an aldehyde oxidase having, as a subunit, a protein encoded by a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, 5, or 6, or SEQ ID NO: 9, 10, 13, or 1
  • the present invention also relates to an aldehyde oxidase encoded by a DNA consisting of the base sequence of 4.
  • aldehyde oxidase having, as a subunit, a protein encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with any one of the DNAs consisting of 21 sequences; a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9, 10, 13 or 14; Aldehydroxidase encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a complementary base sequence is also included in the oxidase of the present invention, as long as it has an activity of converting dalyoxal to glyoxylic acid.
  • Hybridization can be performed by operations well known to those skilled in the art. For example, specifically, a double-stranded DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, 5, 6, 9, 10, 13, or 14 is labeled with 32 P by nick translation method as a probe DNA. (Molecular C 1 on inng 3rd edition 2001) (Co 1d Spirng Harbor
  • the aldehyde oxidase gene that can be used in the present invention can be detected by immobilizing the DNA on a filter and detecting the DNA binding to the probe DNA with an autoradiograph.
  • Stringent conditions for hybridization include the use of DNA fixed to nitrocellulose fill overnight and labeled probe DNA in 6XSSC, 5X Denhardt's reagent, 0.5% SDS, 1 ⁇ , g / mpo Hybridize at 68 ° C in a buffer consisting of 1 y (A), 10 O ⁇ g / ml salmon sperm DNA, and rinse with a buffer consisting of 2XSSC, 0.5% SDS. 2004/001577
  • the conditions for stringent end are 1XSSC, 0.5% SDS. This is the case where washing is performed 4 times at 65 ° C for 30 minutes using a buffer solution consisting of SDS.
  • 1 XSSC is 0.15 M sodium chloride
  • IX Denhardt's reagent is 0.02% Ficoll 400 (manufactured by Sigma-A1 dric Corporation), 0.02% Polybierpyrrolidone, 0.02% bovine It consisted of serum albumin (Sigma-Aldrich Corporation, FractionV).
  • the present invention also relates to an aldehyde oxidase having, as a subunit, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 11 or 12. It also relates to an aldehyde oxidase consisting of a noic acid sequence.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 7 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 11 or 12.
  • amino acid sequence of ⁇ , ⁇ , or subunit of aldehyde oxidase represented by 1, 2, or 3 one or more amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added
  • the protein containing the protein as a subunit is also included in the oxidase of the present invention as long as the protein having the protein as a subunit has an activity of converting dalioxal into glyoxylic acid.
  • a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 8, 11 or 12 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added also converts dalyoxal to dalioxylic acid. As long as it has activity, it is included in the oxidase of the present invention.
  • a synthetic amino acid sequence containing a nucleotide sequence in which a codon of a specific amino acid has been deleted, or a codon of another amino acid has been substituted, or a codon of another amino acid has been added As a method for deleting, substituting or adding a specific amino acid, a synthetic amino acid sequence containing a nucleotide sequence in which a codon of a specific amino acid has been deleted, or a codon of another amino acid has been substituted, or a codon of another amino acid has been added.
  • ⁇ Enzymes prepared by known methods such as PCR using primers or chemical DNA synthesis
  • a conventionally known method such as a method in which a native gene is ligated to a vector for gene expression and recombinantly expressed using Escherichia coli or the like as a host is used, and can be easily implemented by those skilled in the art.
  • Enzymes secreted outside the microbial cell of a microorganism generally have a secretory signal sequence encoded at a portion corresponding to several tens of amino acids from the initiation codon of the gene, and the enzyme protein synthesized in the microbial cell is extracellularly isolated. It is known that the secretory signal sequence is cleaved in the process of secretion into a mature enzyme. Some of the enzymes described in the present invention secrete active enzymes extracellularly.In the recombinant production of these enzymes, a gene from which a secretory signal sequence has been artificially removed is used. As a result, the enzyme protein can be produced and used in the cells of the host microorganism.
  • the present invention also provides enzyme genes (SEQ ID NOS: 10 and 14) from which the secretory signal sequence has been removed, which can be used for this purpose.
  • a gene containing a secretory signal sequence (SEQ ID NOS: 9 and 13) can also be used for the purpose of producing the enzyme outside the host microorganism in recombinant expression of the enzyme.
  • the gene of the enzyme that can be used in the present invention can be obtained by the method described below.
  • an enzyme protein is purified from the cells or culture of a microorganism that produces an enzyme that converts dalioxal into dalioxylic acid, and the partial amino acid sequence is determined using a peptide obtained by digesting the enzyme protein with protease. .
  • a primer synthesized based on these partial amino acid sequences by a well-known method a part of the enzyme gene is amplified by performing PCR with genomic DNA as type III, and the nucleotide sequence inside the gene is amplified. Can be determined. Perform inverse PCR using DNA primers synthesized from the N-terminal amino acid sequence or the amino acid sequence near the C-terminal.
  • the signal sequence, N-terminal amino acid sequence, C-terminal amino acid sequence, and the like can be determined (Ce11 Science 1990, vo1.6 No. 5 370-376) '.
  • the aldehyde oxidase gene whose nucleotide sequence has been determined can be easily obtained using PCR.
  • it can be obtained from a chromosomal DNA or genomic DNA of a microorganism by a known method using a partial sequence of the gene.
  • the enzyme used in the present invention may be a natural enzyme or an enzyme obtained by a recombinant technique.
  • Recombinant techniques include, for example, inserting an enzyme gene into a plasmid vector, a phage vector, etc., and using a host such as bacteria such as E. coli, microorganisms such as yeast fungi, animals, plants, or animal and plant cells. Is effective.
  • Liquid medium consisting of ethylene glycol 10 g, yeast extract lg, NUTR I ENT BR OTH (manufactured by Difco) 8 g, monopotassium hydrogen phosphate 3 g, dipotassium hydrogen phosphate 7 g (each per liter) 5 ml of (EG-NB medium (pH 7)) was dispensed into a large test tube, and sterilized by high pressure steam with 121 at 20 minutes.
  • One platinum loop of the microorganisms shown in Table 3 was aseptically inoculated into this medium and cultured at 28 ° C for 2 days to obtain a pre-culture solution.
  • 1 ml of the obtained preculture was inoculated into 100 ml of the sterilized EG-NB medium in 500 ml of Osaka Roflasco, and cultured at 28 for 3 days.
  • the cells were collected from 100 ml of the obtained culture by centrifugation, washed with 10 OmM Tris-HC1 buffer (pH 8.0), and suspended in 5 ml of the same buffer ( ⁇ 8.0).
  • the cell suspension was disrupted with a mini-beat peter (manufactured by BI OSPEC) and centrifuged to obtain a supernatant (cell-free extract).
  • Pseudomonas sp. ⁇ ⁇ 254 prepared by the same method as in Example 1, Microbacterium sp. KNK 011 strain, Cellulomonas sp. IFATA 015 and Cellulomonas sp. JCM The cells were collected by centrifugation from 100 ml of the culture solution of 2471 strain, washed with 0.1 mM phosphate buffer (pH 7), and suspended in 5 ml of the same buffer. In a test tube, add 0.50 mM Daryoxal aqueous solution to 0.45 ml of the bacterial cell suspension. 05 ml was added and the reaction was carried out by shaking for 4 hours.
  • aldehyde oxidase having an activity of converting dalioxal to dalioxylic acid was purified from Streptomyces sp. Strain KNK269.
  • a medium consisting of 10 g of ethylene glycol, 3 g of yeast extract, 8 g of Nutrientbroth, 3 g of dibasic hydrogen phosphate and 7 g of dibasic hydrogen phosphate (both per liter)
  • a loopful of Streptomyces sp. KNK 269 was inoculated and shake-cultured at 28 ° C for 3 days to obtain a preculture solution.
  • a predetermined amount of ammonium sulfate was added to 2.5 L of the obtained cell-free extract with stirring under ice cooling with a stirrer, and the protein precipitated at 30-55% saturation with ammonium sulfate was collected by centrifugation.
  • the obtained protein was dissolved in 0.05M phosphate buffer (PH7), and After dialysis with a buffer solution, this was charged into a DE AE-Toyopearl 650M (manufactured by Tosoichi Co., Ltd.) column (130 ml), which had been equilibrated with the same buffer solution, and the fraction passed through was removed. Elution was carried out with 0.05 M phosphate buffer (pH 7) containing M sodium chloride, and the active fraction was collected.
  • PH7 0.05M phosphate buffer
  • ammonium sulfate was added to a concentration of 0.6 M, and Phenyl 1 monotoyopearl 650 M (East) pre-equilibrated with a 0.05 M phosphate buffer containing 0.6 M ammonium sulfate was added.
  • the mixture was charged into a column (300 ml, manufactured by Soichi Co., Ltd.) and eluted with a linear gradient of 0.6 to 0.1 M ammonium sulfate, and the active fraction was collected.
  • the resulting enzyme solution was dialyzed against a 0.05M phosphate buffer (pH 7), charged onto a DEAE-Toyopearl 6 50M column (130ml) previously equilibrated with the same buffer, and then subjected to a 0 to 0.25M chloride solution. Elution was carried out with a sodium linear concentration gradient, the active fraction was collected, ammonium sulfate was added until 60% saturation was reached, and the precipitated protein was collected by centrifugation. The solution was dissolved in a solution (pH 7) and dialyzed against the same buffer.
  • the enzyme solution after the dialysis was applied to a Benzami dine Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) column (10 ml) previously equilibrated with a 0.05 M phosphate buffer ( ⁇ 7). , And eluted with a linear concentration gradient of 0 to 0.1 M sodium chloride, and the active fraction was collected.
  • the enzyme solution was concentrated by ultrafiltration, and Supered ex 200HR 16/60 (Am ersh am Ph a rmac was previously equilibrated with 0.05 M phosphate buffer (pH 7) containing 0.15 M sodium chloride. ia Biotech) column (120 ml), and eluted with the same buffer.
  • aldehyde hydroxidase having an activity of converting daryoxal to daloxylic acid was purified from Microbacterium sp. Strain KNK011.
  • 3 L of the medium having the above composition was placed in a 5-liter mini-jar, sterilized by high-pressure steam, and inoculated with 3 Om1 of the pre-culture solution, 28 ° C., aeration 0.5 V vm, and stirring at 400 rpm 28 Culture was performed for hours.
  • This mini-jar culture was repeated to obtain 69 L of a culture solution, and then the cells were collected from 69 L of the culture solution by centrifugation and suspended in 0.05 M phosphate buffer (pH 7).
  • the obtained cell suspension was disrupted with a Dynomill (Dyno-Mi 11), and the cell residue was removed by centrifugation to obtain 2 L of a cell-free extract.
  • a predetermined amount of ammonium sulfate was added to 2 L of the obtained cell-free extract under ice-cooling while stirring with a stirrer, and proteins precipitated at 20 to 40% saturation with ammonium sulfate were collected by centrifugation.
  • the obtained protein is dissolved in a 0.05M phosphate buffer (pH 7), dialyzed with the same buffer, and charged onto a DE AE-Toyopearl 650M column (300ml) pre-equilibrated with the same buffer. And 0-0.
  • the active fraction was eluted with a linear gradient of 6 M sodium chloride and collected.
  • a predetermined amount of ammonium sulfate was added so that the concentration of ammonium sulfate became 0.7 M, and the mixture was preliminarily equilibrated with a 0.05 M phosphate buffer ( ⁇ 7) containing 0.7 M ammonium sulfate.
  • the column After charging the Phenyl 1-Toyopearl 650M column (160 ml), the column was eluted with a 0.7 to 0 M ammonium sulfate linear concentration gradient, and the active fraction was collected.
  • the obtained enzyme solution was dialyzed against a 0.05 M phosphate buffer (pH 7). Then, the enzyme solution after the dialysis was charged into a 6 ml Resouce Q (Amersham Pharmamacia Biotech) column pre-equilibrated with 0.05 M phosphate buffer, and 0.15-0. Elution was performed with a linear gradient of 45 M sodium chloride, and the active fraction was collected.
  • the obtained enzyme solution was concentrated by ultrafiltration, ammonium sulfate was added to a concentration of 0.3 M, and then the solution was added with 0.05 M phosphate buffer (pH 7) containing 0.3 M ammonium sulfate.
  • a pre-equilibrated Resource Phe (Amersham Pharmacia Biotech) column (6 ml) was charged and eluted with a 0.3 to 0 M ammonium sulfate linear concentration gradient to collect the active fraction. I did.
  • aldehyde oxidase which converts dalioxal to dalioxylic acid was purified from Pseudomonas sp. Strain KNK058.
  • a medium consisting of 10 g of ethylene glycol, 8 g of NUTR IENT BROTH, 7 g of dipotassium hydrogen phosphate, and 3 g of potassium dihydrogen phosphate (each per liter) is subjected to high-pressure steam sterilization in a large test tube.
  • Pseudomonas species KNK058 was inoculated with a platinum loop and cultured at 28 ° C for 2 days. The culture was then inoculated into a sterilized 2 L shake flask containing 500 ml of the above medium. The mixture was cultured with shaking at 28 ° C. for 18 hours to obtain a preculture.
  • the cells were inoculated into a jar fermenter containing 60 L of the sterilized medium, and cultured at 28 ° (: aeration lvvm, stirring at 200 rpm for 40 hours. Centrifugation was performed from 60 L of the obtained culture solution. The cells were collected and suspended in 0.02 M phosphate buffer (pH 7.) The obtained cell suspension was crushed with an Inconator 201 M ultrasonic crusher (manufactured by Kubota Seisakusho Co., Ltd.) for 60 minutes. Thereafter, a predetermined amount of ammonium sulfate was added to the obtained cell-free extract while cooling and stirring with a stirrer to obtain a cell-free extract. Protein precipitated at 60% saturation was collected by centrifugation.
  • the obtained protein was dissolved in a 0.02M phosphate buffer (pH 7), dialyzed with the same buffer, and 1.5 L of DEAE-Sephac e 1 resin was added to the enzyme solution, followed by 4 t After stirring for 1 hour at room temperature, the unadsorbed protein solution was removed by filtration, and then the enzyme protein adsorbed on the resin with 1 M sodium chloride was eluted.
  • the resulting enzyme solution was dialyzed against 0.02 M phosphate buffer (pH 7), and then equilibrated with 0.02 M phosphate buffer (pH 7).
  • Hi Prep 16 / 10—Q — XL Ame The product was charged into a column (16 ml) and eluted with a linear gradient method of 0 to 1 M sodium chloride to collect an active fraction. To this active fraction, add a predetermined amount of ammonium sulfate so that the concentration of ammonium sulfate becomes 1.2 M, and equilibrate in advance with a 0.02 M phosphate buffer (PH7) containing 1.2 M ammonium sulfate.
  • PH7 0.02 M phosphate buffer
  • Ph e ny 1 S uperose HR 10 Z 10 (Ame rsh am Pha rma cia B iosci enc e Column (10 ml) and eluted with a linear gradient method of 1.2 to 0 M ammonium sulfate to collect the active fraction.
  • the obtained enzyme solution was dialyzed against a 0.02 M phosphate buffer, and then equilibrated with the same buffer.
  • Mono Q HR 10/10 (Amersham Pharmacia Bioscienc e) column (10 ml), and eluted by a linear concentration gradient method of sodium chloride, and the active fraction was collected.
  • the resulting enzyme solution was equilibrated with a 0.02 M phosphate buffer containing 0.02 M sodium chloride, and the resulting solution was prepared as HiPrep Sepacyl S—200 16/6 0 (Amersh am Pharma cia Bioscience) column (60 ml), and eluted with the same buffer.
  • the active fraction was collected, dialyzed against a 0.05M phosphate buffer (pH 7), and charged onto a Hydroxyapite (Seikagaku Corporation) column (10 ml) pre-equilibrated with the same buffer. Elution was performed by the linear concentration gradient method of 0.005 to 0.5 M phosphate buffer.
  • the active fraction was collected, dialyzed against a 0.005 mM phosphate buffer, and then equilibrated with the same buffer.
  • aldehyde deoxidase that converts dalioxal to dalioxylic acid was purified from the culture supernatant of Cellulosimicrobium cellulans IFO15516 strain.
  • Protein precipitated in the range of 0-60% ammonium sulfate was collected by centrifugation.
  • the obtained protein is dissolved in 2 OmM phosphate buffer (PH7), dialyzed against a sufficient amount of the buffer, and then DE AE-Toyopearl 650M color pre-equilibrated with the buffer. (300 ml), and eluted with a concentration gradient of sodium chloride 0.5 to 0.5 M, and the active fraction was collected.
  • Ammonium sulfate was added to this active fraction to a final concentration of 1M, and charged to Phenyl 1-Toyopearl 650M (6 Oml) previously equilibrated with 2 OmM potassium phosphate buffer PH7 containing 1 M ammonium sulfate.
  • the active fraction was eluted with a linear concentration gradient of 1 to 0.5 M ammonium sulfate.
  • the resulting enzyme solution was dialyzed against 2 OmM potassium phosphate buffer, pH 7, and then charged onto a Resource Q (Amersh am Pharmacia Biotec) column (6 ml) previously equilibrated with the same buffer.
  • a cell-free extract of the KNK 235 strain and the KNK058 strain obtained by the method described in Example 1 was charged onto a Resource Q column (6 ml) previously equilibrated with a 0.05 M phosphate buffer (pH 7). Elution was carried out with a 0.5 M sodium chloride linear concentration gradient, and the active fraction was collected. Crude enzyme solutions of these 35 strains of KNK235 and KNK058 and the Streptomyces sp. KNK269 strains obtained in Examples 4, 5 and 7 and Microbacterium sp.
  • KNKO 11 strains and cellulosic micropium strains Using purified enzymes obtained from Cellulans IFOl 5516 strain, their oxidase activities against dalioxal and dalioxylic acid were measured. Enzyme activity was measured in 10 OmM phosphate buffer (pH 7) in 10 mM dalioxal or dalioxylate, 4-AA 0.67 mM, TOOS 1.09 mM, POD 2U / m1, and crude purification of KNK 235 and KNKO 58 strains A 1.0 ml reaction mixture containing the enzyme or purified enzymes obtained from the KNK 269, KNKO 11 and IF ⁇ 15516 strains obtained in Examples 4, 5 and 7 was reacted at 30 ° C, and the wavelength of 555 nm This was done by measuring the increase in absorbance of the sample. Table 5 shows a comparison of the activity of each enzyme on dalioxal and dalioxylic acid. Table 5
  • Each of the enzymes showed lower activity on dalioxylic acid than dalioxal.
  • the activity was measured in the range of pH 5 to 9 using daloxal as a substrate.
  • Figure 2 shows the results.
  • the optimum pH was 6-9.
  • the physicochemical properties of the enzyme obtained from Pseudomonas sp. KNK058 obtained in Example 6 were examined.
  • the measurement of enzyme activity is basically It carried out by the method of Example 8.
  • the molecular weight of this enzyme was about 150,000 when measured using a TSK-G3000 SW column (manufactured by Tosoh Corporation).
  • the activity was measured at a temperature in the range of 25-75 using dalioxal as a substrate.
  • Fig. 4 shows the results. High activity was exhibited in the range of 60 to 70 ° C.
  • Example 12 Cellulomonas evening stalk IF 15012 strains, Cellulomonas evening stag IF 150501 strains, cellulosic microbeams and cellulance IF 1503 shares, cellulosic microbeams and cellulance IF 15516
  • the cells were collected from the resulting culture by centrifugation, washed twice with 100 mM potassium phosphate buffer, pH 7, and suspended in 5. Oml of the same buffer. Add 0.15 ml of 133 mM daryoxal aqueous solution and 0.05 ml of 50,000 U / m1 catalase solution to 1.0 ml of this bacterial cell suspension, and shake in a test tube at 28 for 4 hours. The obtained reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography. As a result, glyoxylic acid was produced from glyoxal in all strains.
  • Extracellular secretion of aldehyde oxidase was confirmed using the culture supernatant of the micropacterium species KNK011 strain and the cellulosimicrobeam cellulans IFO 15516 strain prepared in Example 12. .
  • the culture solution is centrifuged, and the culture supernatant from which the cells have been removed is concentrated by ultrafiltration using Amicon Centrip 1 us YM-10 (manufactured by MILLI PORE), and the buffer solution is 10 OmM potassium phosphate buffer. The pH was changed to 7, and a 12-fold concentrated solution was prepared.
  • the amino acid sequence of the aldehyde oxidase of Streptomyces species KNK269 purified in Example 4 was determined by the following method. Reversed phase HPLC was used to separate the three subunits that make up the enzyme. The column used was a YMC—Pack PROTE IN—RP column (250 X 4.6 mm) (manufactured by YMC). The mobile phase was 0.1% trifluoroacetic acid, and the purified enzyme 300 was charged. The subunits were separated by elution with a linear gradient of 56% (flow rate 1 ml Z min, 110 min).
  • a retention time of about 85 minutes elutes a molecular weight of 250,000 (hereinafter subunita), a molecular weight of about 350,000 (subunit / 3) in about 90 minutes, and a molecular weight of 80,000 (subunit 0;) in about 92 minutes was done.
  • Prot ein Sequenccing System 490 prcocise Appl ied B i
  • the N-terminal amino acid sequence was determined by the Edman degradation method using the above-mentioned method. Next, the internal amino acid sequence of each subunit protein was determined. After denaturation of the remaining amount of each subunit protein with 9 M urea, the buffer was exchanged with 0.3 M Tris-HCl buffer pH 9.0 and digested with lysyl endopeptidase at 30 ° C for 19 hours. Decomposes YMC—Pac PROTE
  • the peptide was eluted with a linear concentration gradient from 10 to 48% of acetonitrile. Each eluted peak was collected, and the amino acid sequence inside the subunit was determined in the same manner.
  • the main amino acid sequences obtained are shown in SEQ ID NOs: 15 to 20.
  • a mixed DNA primer (SEQ ID NOs: 21 to 26) was synthesized, and Streptomyces species KNK 26 was synthesized.
  • PCR was performed using TAKARA LA Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) in GC buffer (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) using genomic DNA of 9 strains as type I.
  • the amplified DNA thus obtained was subjected to agarose gel electrophoresis, and a band-forming DNA was extracted using a QI Aquick Gel Extraction kit (manufactured by QIAGEN).
  • SEQ ID NO: 21 The amplified DNA sequence obtained by performing PCR with the primers (1) and (2), (3) and (4), and (5) and (6) shown in After conversion, collation with the amino acid sequence determined in Example 14, and alignment, the genes encoding the three types of subunits were adjacent or partially overlapped on the genome in the order of ⁇ , a, / 3 from the upstream. Existed.
  • the nucleotide sequence of the mixed primer was determined by the same method using the surrounding nucleotide sequence as a primer.
  • nucleotide sequence of the genomic region encoding all of the subunita,, j3 genes except for the vicinity of the N-terminus of the subunita and the C-terminus of the subunit ⁇ was determined.
  • the amino acid sequence derived from the obtained nucleotide sequence completely matched the partial amino acid sequence of each subunit obtained in Example 14.
  • the amino acid sequences of the determined subunits a and j3 are shown in SEQ ID NOs:! To 3, and the nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs.
  • SEQ ID NOs: 1 and 4 show the amino acid sequence after the N-terminus and the nucleotide sequence from G1u12 to the stop codon of the purified protein of Subunita, respectively.
  • SEQ ID NOs: 2 and 5 show the entire amino acid sequence of subunit ⁇ and the entire nucleotide sequence from the start codon to the stop codon, respectively.
  • SEQ ID NOS: 3 and 6 show the amino acid sequence from the subunit Met1 to Thr693 and the nucleotide sequence from the initiation codon to Arg685, respectively.
  • the N-terminal amino acid sequence of the subunit ⁇ of the purified enzyme derived from the KNK 269 strain shown in SEQ ID NO: 18 started from A1a5 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 determined from the gene sequence.
  • the amino acid sequence of the micropacterium species KNK011 strain aldehyde oxidase purified in Example 5 was determined.
  • the N-terminal amino acid sequence was determined by the same method as that used in Example 14 using 1 O ⁇ g of the purified enzyme desalted using an ultrafiltration membrane.
  • the amino acid sequence of the protease digested peptide of the purified enzyme was determined. After denaturing 100 ⁇ g of the purified enzyme with 9 M urea, the buffer was exchanged with 0.2 M Tris-HCl buffer pH 9.0 and digested with lysyl endopeptidase at 30 ° C for 16 hours.
  • the digested peptide mixture thus obtained was separated in the same manner as in Example 14 by reverse phase HPLC using a YMC-Pac PROTEIN-RP column (250 X 4.6 mm). The eluted peaks were collected, the amino acid sequence was determined in the same manner, and the internal amino acid sequence of the enzyme protein was determined. The main amino acids obtained are shown in SEQ ID NOs: 27 to 29.
  • a mixed DNA primer (SEQ ID NOS: 30 to 33) was synthesized, and Microbacterium sp.
  • PCR was performed in the same manner as in Example 15 using the genome DNA of 11 strains as type III.
  • the amplified DNA is subjected to agarose gel electrophoresis, and the banded DNA is extracted using the QIAQ Quick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), and then directly or directly to the pT7B1ue-2 for TA staining. After that, DNA sequencing was performed to determine the nucleotide sequence.
  • the obtained amplified DNA was ligated to pT7B1ue-2, and the nucleotide sequence was determined in the same manner. Sequence from the upstream of the start codon to the N-terminal downstream of the purified enzyme from the amplified band of about 650 bases obtained by the Inverse PCR using the PvuI digest of the genomic DNA, and the inverse PC using the Apal digest The nucleotide sequence around the stop codon was determined from the amplified band of about 1.9 k bases obtained in R. The total length of the gene from the start codon to the stop codon determined in this way was 3348 bases, and the amino acid sequence was 1115 residues.
  • the amino acid derived from this nucleotide sequence was completely identical to the amino acid sequence obtained by amino acid sequence analysis of the purified enzyme.
  • the N-terminus of the enzyme purified from the cells was the 47th Va1 counted from the start codon Metl. Since Microbacterium sp.KNK011 also produces the same enzyme in the culture supernatant, it is clear that between Me1 and Ala46 is cleaved during the secretion process as a secretory signal sequence. Became.
  • the determined amino acid sequence and the entire amino acid sequence and the entire base sequence of the enzyme gene are shown in SEQ ID NOs: 7 and 9, respectively.
  • the entire amino acid sequence of the mature enzyme after secretion and the nucleotide sequence encoding it are shown in SEQ ID NOs: 8 and 10.
  • the aldehyde oxidase gene of Micropacterium sp. KNK011 strain whose gene sequence was determined in Example 17 was used as an expression vector. After cloning, expression experiments were performed. A1 a46 codon was replaced with the start codon atg, a restriction primer Nde I recognition sequence was added to the synthetic primer (SEQ ID NO: 34), and a restriction enzyme Eco RI recognition sequence was added to 63 to 68 bases downstream of the stop codon. Using a synthetic primer of the complementary sequence (SEQ ID NO: 35), PCR was performed using the genomic DNA of Microbacterium species KNK011 as a type III, and an amplified band of about 3.7 kb was obtained.
  • the DNA having this band formed was subjected to agarose gel electrophoresis, extracted using a QI Aquick Gel Extraction kit (manufactured by QIAGEN), and digested with NdeI and EcoRI.
  • the digested DNA was similarly extracted by agarose gel electrophoresis, ligated to expression vector pUCNT (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-116552) digested with NdeI and EcoRI, and transformed into E. coli DH5. did.
  • the obtained transformant was cultured overnight in LB medium containing 100 / g of ampicillin, subcultured and cultured in a fresh medium, and 2 hours later, 1 mM IPTG was added, and the cells were cultured for 5 hours.
  • the cultured bacterial cells were treated with SDS, and the whole protein was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. As a result, a band of the enzyme protein was confirmed at a position of about 11 kDa
  • the amino acid sequence was determined using aldehyde oxidase of Cellulosimicrobium cellulans IFO15516 obtained in Example 7. Using 10 g of the purified enzyme desalted using an ultrafiltration membrane, the amino acid sequence was determined using Protein Quenching System Model 490 Prosize (manufactured by Applied Biosystems). Next, 100 g of the purified enzyme was denatured with 9 M urea, the buffer was exchanged with 0.2 M Tris-HCl buffer, pH 9.0, and digested with lysyl endopeptidase at 30 ° C for 16 hours. .
  • the digest was purified by a reversed-phase HP LC method using a YMC—Pack PROTE IN—; RP column (manufactured by YMC). 0.1% trifluoro for mobile phase
  • the peptide was eluted with acetic acid with a linear concentration gradient of acetonitrile from 10 to 55%. Each eluted peak was collected and the amino acid sequence inside the protein was determined in the same manner.
  • the main amino acid sequences obtained are shown in SEQ ID NOs: 36 to 38.
  • DNAs were directly or TA-cloned into pT7Blue-2 and then subjected to DNA sequencing to determine the nucleotide sequence.
  • the obtained nucleotide sequence was compared with the amino acid sequence, and a nucleotide sequence of about 2.5 kb excluding the N-terminal and C-terminal regions was determined in the same manner as in Example 15.
  • the nucleotide sequences around the N-terminal and C-terminal of the purified enzyme were determined by inverse PCR in the same manner as in Example 17. After treating genomic DNA with various restriction enzymes, self-ligation was performed at a final concentration of 2.5 ng / ml, and PCR was performed using a primer synthesized from a base sequence near each end.
  • the resulting amplified DNA was ligated to pT7B1ue-2, and the nucleotide sequence was determined in the same manner. Sequence from the upstream of the initiation codon to the N-terminal downstream of the purified enzyme from the amplified band of about 1 kb obtained by inverse PCR using the NaeI digest of the genomic DNA, and the inversion using the NcoI digest. The base sequence around the stop codon was determined from the amplified band of about 1.1 kb obtained by the source PCR. The total length of the gene from the start codon to the stop codon determined in this way was 3324 bases and 1107 residues in amino acid sequence.
  • the amino acid derived from this nucleotide sequence completely matched the amino acid sequence obtained by amino acid sequence analysis of the purified enzyme.
  • the N-terminus of the enzyme purified from the cells was the 39th Asp counted from the start codon Met1.
  • A1a38 from Met1 was cleaved during secretion as a secretory signal sequence.
  • the determined enzyme proteins, the entire amino acid sequence and the entire base sequence of the enzyme gene are shown in SEQ ID NOS: 11 and 13.
  • the entire amino acid sequence of the mature enzyme after secretion and the nucleotide sequence encoding the same are shown in SEQ ID NOS: 12 and 14.
  • SEQ ID NO 1 Amino acid sequence of subunitnitase of aldehyde oxidase-sequence
  • SEQ ID NO 2 Amino acid sequence of subunitite of aldehyde oxidase-se jS
  • SEQ ID NO 3 Amino acid sequence of subunitit of aldehyde Sequence
  • SEQ ID NO: 4 DNA sequence of aldeoxydase-subunititine
  • SEQ ID NO: 5 DNA sequence of aldeoxydide-ze :::) 3 DNA sequence of SEQ ID NO: 6: Aldeoxydide-zet subunitit ⁇
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid of aldehyde oxidase containing signal peptide Array
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 9 DNA sequence of aldehyde oxidase containing signal peptide
  • SEQ ID NO: 10 DNA sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 11 Amino acid sequence of aldehyde oxidase containing signal peptide
  • SEQ ID NO: 12 Amino acid sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 13 DNA sequence of aldehyde oxidase containing signal peptide
  • SEQ ID NO: 14 DNA sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 15 ⁇ -terminal amino acid sequence of aldehyde oxidase subunit ⁇
  • SEQ ID NO: 16 ⁇ -terminal amino acid sequence of aldehyde oxidase subunit ⁇
  • SEQ ID NO: 17 Amino acid sequence of subunit ⁇ of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 18 N-terminal amino acid sequence of aldehyde oxidase subunit a
  • SEQ ID NO: 19 Amino acid sequence of subunit of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 20 Amino acid sequence of subunit of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 21 Mixed DNA primer corresponding to the N-terminal amino acid sequence of Aldehydroxidase subunit of Streptomyces sp. KNK269 strain
  • SEQ ID NO: 22 Complementary mixed DNA primer corresponding to the amino acid sequence of subunit ⁇ of Aldehydroxidase of Streptomyces sp. KNK269 strain (A s 251 to ⁇ 1a258)
  • SEQ ID NO: 23 Mixed DNA primers corresponding to the amino acid sequence of subunit ⁇ of Asdehydroxidase of Streptomyces species KNK269 (A s ⁇ p 251 to ⁇ 1a 258) (3)
  • SEQ ID NO: 24 a mixed DNA primer complementary to the amino acid sequence of subunit ⁇ of Aldehydroxidase (Klein strain KNK269) (Leu 274 to G1u281)
  • SEQ ID NO: 25 Streptomyces ⁇ Species A mixed DNA primer corresponding to the amino acid sequence (Leu 274 to G1u281) of the subunit of aldehydroxidase from the KNK269 strain (5)
  • SEQ ID NO: 26 Mixed DNA primer complementary to amino acid sequence (Leu 686 to G1 u 693) of subunit a of aldehyde oxidase from Streptomyces sp. KNK269 (6)
  • SEQ ID NO: 27 N-terminal amino acid sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 28 Internal amino acid sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 29 Internal amino acid sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 30 Mixed DN corresponding to the N-terminal amino acid sequence of aldehyde oxidase derived from Micropacterium species KNK011
  • SEQ ID NO: 31 Complementary mixed DNA primer corresponding to the amino acid sequence of aldehyde oxidase from Aspergillus species KNK011 (Asp 513 to Phe 521) (2)
  • SEQ ID NO: 32 Amino acid sequence of aldehyde oxidase derived from Micropacterium 'species KNK011 strain (As p 513 to Phe 521) Mixed DNA primers for (3)
  • SEQ ID NO: 33 Complementary mixed DNA primer corresponding to the amino acid sequence of aldehyde oxidase from Microbacterium 'species KNK011 (Phe 959 to Thr 969) (4)
  • SEQ ID NO: 34 DNA primer containing NdeI restriction site for cloning of aldehyde oxidase from Microbacterium species KNK011
  • SEQ ID NO: 35 DNA primer containing an EcoRI restriction site for cloning of aldehyde oxidase from Micropacterium species KNK011 strain
  • SEQ ID NO: 36 N-terminal amino acid sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 37 Internal amino acid sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 38 Internal amino acid sequence of aldehyde oxidase
  • SEQ ID NO: 39 Mixture corresponding to the N-terminal amino acid sequence of aldehyde oxidase derived from cellulosimicrobium cellulans IFO 15516 strain
  • SEQ ID NO: 40 Complementary mixed DNA primer corresponding to the amino acid sequence (I1e350-Va1358) of aldehyde oxidase derived from cellulosimicrobium cellulans IF015516 strain (2)
  • SEQ ID NO: 41 Mixed DNA primer corresponding to the amino acid sequence (Thrl 76 to Thr 83) of aldehyde oxidase derived from cellulosimicropium cellulans I F ⁇ 15516 strain (3)
  • SEQ ID NO: 42 Complementary mixed DNA primer corresponding to the DNA sequence of aldehyde oxidase from Microbacterium sp. KNK011 (2521 to 2545) (4)

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Abstract

　本発明は、工業的に有利なグリオキサールからのグリオキシル酸の生化学的製造方法を提供する。詳しくは、グリオキサールをグリオキシル酸へ変換する能力を有するオキシダーゼおよびデヒドロゲナーゼなどの酸化還元酵素をグリオキサールに作用させ、グリオキシル酸へ変換することを特徴とするグリオキシル酸の製造方法を提供する。

Description

T/JP2004/001577
糸田 書 ダリォキシル酸の生化学的製造方法 技術分野
本発明は微生物および Zまたは微生物由来の酵素を用いることによるグ リォキサールからグリォキシル酸を製造する方法に関する。 ダリォキシル 酸はバニリン、 ェチルバ二リンなどの合成原料として用いられ、 農薬、 さ らには医薬品の合成の中間体としても有用な化合物である。 背景技術
従来よりダリォキシル酸の製造方法としては、 ダリォキサールの硝酸酸 化などの化学的手法が知られており、 また現在はダリオキシル酸のほとん どがこれら化学的手法により製造されている。 しかしながら、 ダリオキサ ールの硝酸酸化などの化学的手法はグリオキシル酸以外の有機酸などの副 生成物を生じやすく、 製造されたダリオキシル酸の品質に好ましくない影 響を与え、 これらを除去するためには煩雑な工程を必要とする。 また、 大 量に使用された硝酸などの中和工程で生成する大量の塩類廃棄物の処理が 問題となる。
ダリオキシル酸の生化学的製造方法としては、 植物由来のダリコール酸 ォキシダ一ゼを用いグリコール酸をグリォキシル酸へ変換する方法 （特許 特表平 7— 5 0 2 8 9 5号公報、 特表平 8— 5 0 8 1 5 9号公報を参照） や、 微生物によるグリコ一ル酸からのダリォキシル酸への変換方法などが 知られている （特開平 7— 1 6 3 3 8 0号公報、 特開平 8— 3 2 2 5 8 1 号公報参照） 。 し力、し、 エチレングリコ一ルゃァセトアルデヒドより容易 に合成され、 安価に入手可能な化合物であり、 ダリオキシル酸の化学的な 合成法における原料としても用いられているダリオキサールからダリオキ シル酸への生化学的手法による合成方法は、 報告されていない。
また、 アルデヒド基を酸化するォキシダーゼが、 おもに動物、 植物など に存在することが確認されているが、 それら酵素がダリオキサールに対し 活性を示すとの報告はない。 また、 Phane r o c ha e t e c h r y s o s p o r i umなどの白色腐朽菌の一部が、 ダリオキサールと反応 し過酸化水素を生成する活性を有する酵素 （ダリォキサールォキシダーゼ と呼ばれている） を菌体外に産生することが知られている （J ou r n a 1 o f Bac t e r i o l ogy, (1987) , 169, 2195 一 2201、 P r o. Na t l . Ac ad. S c i. (1990) , 87 ， 2936— 2940参照） 。 しかし、 これら白色腐朽菌が産生する酵素 によるグリォキサールの酸化反応時の生成物の同定はなされておらず、 こ れら木材腐朽菌の酵素は、 グリォキシル酸に対してもグリォキサールと同 程度の酸化活性を有するため、 これらの酵素によりダリオキサールをグリ ォキシル酸へと変換 ·蓄積させることは難しい。 なお、 これら木材腐朽菌 の酵素以外の、 ダリォキサールを酸化する微生物由来のォキシダーゼは報 告されていない。
したがって、 本発明は、 ダリオキサールをダリオキシル酸へ変換する活 性を有する微生物およびノまたは当該活性を有する酵素、 ならびにこれら を用いた効率的なダリオキシル酸の製造方法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、 ダリォキシル酸の効率的な製造方法を開発すべく鋭意検 討を行なった結果、 ダリォキサールをダリォキシル酸へ変換する活性を有 する微生物を見出し、 それら微生物および Zまたは該微生物から得た酵素 液を用いたダリオキシル酸合成について詳細な検討を行なうことにより本 発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 ダリオキサールをダリオキシル酸へ変換する能力 を有する酸化還元酵素、 または該酸化還元酵素の産生能を有する微生物の 培養液、 培養液上清、 菌体および菌体処理物のいずれか 1種もしくは 2種 以上のそれらの混合物をグリォキサールに作用させ、 ダリオキシル酸へ変 換することを特徴とするダリオキシル酸の製造方法に関する。
前記酸化還元酵素は、 ォキシダーゼであることが好ましい。
前記酸化還元酵素は、 ステノトロフォモナス （S t e no t r opho mo n a s ) 属、 ストレプトミセス （S t r e p t omyc e s) 属、 シ ユードモナス （P s e u d omo n a s) 属、 ミクロバクテリゥム （M i c r obac t e r i um) 属、 ァクロモノ、クタ一 (.Ac h r omob a c t e r) 属、 セルロモナス （Ce l 1 u 1 omo n a s ) 属、 セルロシ ミクロビゥム （Ce l 1 u 1 o s imi c r ob i um) 属、 モレガネラ (M o r gane l l a) 属からなる群から選ばれる少なくとも 1つの微 生物から得られた酵素であることが好ましい。
前記微生物は、 ステノトロフォモナス ·スピ一シーズ （S t e n o t r ophomona s s p. ) KNK 235 ( (寄託機関 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ一、 あて名 日本国茨城県つく ば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、 寄託日 平成 14年 9月 6日、 受託番号 FERM P— 19002) 、 ストレ プトミセス ·スピーシーズ （S t r e p t omy c e s s p. ) KNK 269 ( (寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ ンター、 あて名 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵 便番号 305— 8566) 、 寄託日 平成 14年 9月 6日、 受託番号 F ERM BP— 08556) 、 シユードモナス ·スピーシ一ズ （P s e u domona s s p. ) KNK058 ( (寄託機関 独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター、 あて名 日本国茨城県つくば市 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、 寄託日 平 成 14年 12月 13日、 受託番号 FERM BP— 08555) 、 シュ ードモナス ·スピーシーズ KNK254 ( (寄託機関 独立行政法人産業 技術総合研究所 特許生物寄託センター、 あて名 日本国茨城県つくば市 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、 寄託日 平 成 14年 9月 6日、 受託番号 FERM P— 19003 ) 、 ミクロバク テリゥム ·スピーシーズ (Mi c r ob ac t e r i um s p. ) KN K 011 ( (寄託機関 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センタ一、 あて名 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ( 郵便番号 305 - 8566) 、 寄託日 平成 14年 12月 13日、 受託番 号 FERM BP— 08554) 、 ァクロモバク夕一'スピ一シ一ズ （ Ac h r omo b a c t e r s p. ) I FO 13495 (寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 ·生物遺伝資 源部門 （NBRC) 、 あて名 〒292— 0818 日本国千葉県木更津 市かずさ 鎌足 2— 5— 8) 、 セルロモナス 'スピーシ一ズ （Ce l 1 u
1 omon a s s p. ) J CM 2471 (寄託機関 独立行政法人理 化学研究所微生物系統保存施設 （ J CM) 、 あて名 〒 351— 0198 日本国埼玉県和光市広沢 2— 1) 、 セルロモナス ·夕バタ （C e 1 1 u
1 omon a s t u r b a t a) I FO 15012 (寄託機関 独立 行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジ一本部 ·生物遺伝資源部 門 （NBRC) 、 あて名 〒 292— 0818 日本国千葉県木更津市か ずさ 鎌足 2— 5— 8) 、 セル口モナス ·タバ夕 I FO 15014 (寄 託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイォテクノロジー本部 ·生 物遺伝資源部門 （NBRC) 、 あて名 〒292— 0818 日本国千葉 県木更津市かずさ 鎌足 2— 5— 8 ) 、 セルロモナス ·夕バタ I F O 1 4001577
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5015 (寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロ ジー本部 ·生物遺伝資源部門 （NBRC) 、 あて名 〒 292— 0818 日本国千葉県木更津巿かずさ 鎌足 2— 5— 8) 、 セルロシミクロピウ ム ·セリレランス (Ce l l u l o s imi c r ob i um e e l 1 u 1 an s) I FO 15013 (寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤 機構バイオテクノロジー本部 ·生物遺伝資源部門 （NBRC) 、 あて名 〒 292— 0818 日本国千葉県木更津巿かずさ 鎌足 2 _ 5— 8) 、 セルロシミクロピウム 'セルランス I F〇 15516 (寄託機関 独立 行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 ·生物遺伝資源部 門 （NBRC) 、 あて名 〒 292— 0818 日本国千葉県木更津市か ずさ 鎌足 2— 5— 8) 、 セルロシミクロビゥム 'セルランス J CM 6 201 (寄託機関 独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設 （J C M) 、 あて名 〒 351— 0198 日本国埼玉県和光市広沢 2— 1 ) 、 モルガネラ ·モルガニイ （M o r gane l l a mo r g a n i i ) I FO 3848 (寄託機関 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテ クノロジ一本部'生物遺伝資源部門 （NBRC) 、 あて名 〒292— 0 818 日本国千葉県木更津巿かずさ 鎌足 2— 5— 8) であることが好 ましい。
前記ダリォキシル酸の製造方法は、 反応時にカタラーゼを共存させるこ とが好ましい。
また、 本発明は、 ダリオキサールに作用し、 ダリオキシル酸を生成する 微生物由来のアルデヒドォキシダーゼに関する。
前記ダリォキシル酸に対する活性は、 ダリォキサールに対する活性の 1 /\ 0倍以下の活性であることが好ましい。
前記アルデヒドォキシダーゼは、 ステノトロフォモナス属、 ストレプト ミセス属、 シユードモナス属、 ミクロバクテリウム属、 ァクロモパクター 2004/001577
6 属、 セル口モナス属、 セルロシミクロピウム属、 モルガネラ属からなる群 から選ばれる少なくとも 1つの微生物が産生するものであることが好まし い。
前記微生物は、 ステノトロフォモナス 'スピ一シ一ズ KNK235 (F ERM P_19002) 、 ストレプトミセス ·スピーシ一ズ KNK 26 9 (FERM BP— 08556) 、 シユードモナス ·スピーシ一ズ KN K058 (FERM BP— 08555) 、 シユードモナス 'スピ一シー ズ KNK254 (FERM P- 19003) 、 ミクロパクテリゥム 'ス ピ一シ一ズ KNK011 (FERM BP— 08554) 、 ァクロモバク 夕一 'スピーシーズ I FO 13495、 セルロモナス 'スピ一シーズ J CM 2471、 セル口モナス ·タバタ I FO 15012、 セル口モナ ス 'タバ夕 1 〇 15014、 セル口モナス ·タバタ I FO 1501 5、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 15013、 セルロシミ クロビゥム ·セルランス I FO 15516、 セルロシミクロビゥム ·セ ルランス J CM 6201、 モルガネラ ·モルガニイ I FO 3848で あることが好ましい。
前記アルデヒドォキシダーゼは、 以下 （1) 〜 （3) の理化学的性質を 有するストレプトミセス属微生物が産生するアルデヒドォキシダ一ゼであ ることが好ましい。
(1) 至適 pH： 6〜9
(2) 熱安定性： pH7. 2で 60 、 20分処理したのち、 90 %以上 の活性を保持している
(3) 分子量：ゲル濾過分析において約 11万であり、 SDS—ポリアク リルアミドゲル電気泳動分析において、 約 2. 5万、 約 3. 5万、 約 8万 の 3つのサブュニットタンパク質を有する
前記アルデヒドォキシダーゼは、 以下 （1) 〜 （3) の理化学的性質を 2004/001577
7 有するシユードモナス属に属する微生物が産生するアルデヒドォキシダー ゼであることが好ましい。
( 1 ) 分子量：ゲル濾過分析において約 15万
(2) 反応至適温度： 60〜70°C
(3) 反応至適 pH： 5〜7
前記アルデヒドォキシダーゼは、 以下の理化学的性質を有するミクロバ クテリゥム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドォキシダ ーゼであることが好ましい。
分子量： SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 11万 の単一タンパク質
前記アルデヒドォキシダーゼは、 以下の理化学的性質を有するセルロシ ミクロピウム属微生物が菌体内および菌体外に産生するアルデヒドォキシ ダ一ゼであることが好ましい。
分子量： SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 9〜1 0万の単一タンパク質
前記ストレプトミセス属に属する微生物は、 ストレプトミセス ·スピー シーズ KNK269 (FERM B P— 08556 ) であることが好まし い。
前記シユードモナス属に属する微生物は、 シュ一ドモナス ·スピ一シ一 ズ KNK058 (FERM B P— 08555 ) であることが好ましい。 前記ミクロパクテリゥム属に属する微生物は、 ミクロパクテリゥム ·ス ピーシーズ KNK011 (FERM B P— 08554) であることが好 ましい。
前記セルロシミク口ピウム属に属する微生物は、 セルロシミクロビゥム •セルランス I F〇 15516であることが好ましい。
前記アルデヒドォキシダーゼは、 以下の （a) または （b) のタンパク JP2004/001577
8 質をサブュニットとして有するアルデヒドォキシダーゼであることが好ま しい。
(a) 配列番号 1、 2もしくは 3で表されるアミノ酸配列からなるタンパ ク質
(b) アミノ酸配列 （a) において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置 換または付加されたアミノ酸配列のいずれか 1つを含むタンパク質
前記アルデヒドォキシダ一ゼは、 以下の （a) または （b) の DNAに よってコードされるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドォ キシダ一ゼであることが好ましい。
(a) 配列番号 4、 5もしくは 6の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DN Aのいずれか 1つとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN A
前記アルデヒドォキシダーゼは、 以下の （a) または （b) のアミノ酸 配列からなるアルデヒドォキシダーゼであることが好ましい。
(a) 配列番号 7、 8、 1 1もしくは 12で表されるアミノ酸配列
(b) アミノ酸配列 （a) において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置 換または付加されたアミノ酸配列
前記アルデヒドォキシダーゼは、 以下の （a) または （b) の DNAに よってコードされるアルデヒドォキシダーゼであることが好ましい。
(a) 配列番号 9、 10、 13もしくは 14の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の塩基配列からなる DNAと相補 な塩基配列からなる DN Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA
さらに、 本発明は、 前記アルデヒドォキシダ一ゼをコードする DNAに も関する。
詳しくは、 前記 DNAは、 以下の （a) または （b) のいずれかを含ん 4001577
9 でなる、 前記アルデヒドォキシダーゼのサブュニットをコ一ドする DNA であることが好ましい。
(a) 配列番号 4、 5もしくは 6の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DN Aのいずれか 1つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A
前記 DNAは、 以下の （a) または （b) のいずれかを含んでなる、 前 記アルデヒドォキシダ一ゼをコードする DNAであることが好ましい。
(a) 配列番号 9、 10、 13もしくは 14の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DN Aのいずれか 1つとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN A
前記 DNAは、 配列番号 1、 2または 3で表わされるアミノ酸配列にお いて 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列 のいずれかを含んでなる、 前記アルデヒドォキシダーゼのサブュニットを コードする DN Aであることが好ましい。
前記 DNAは、 配列番号 7、 8、 11または 12で表わされるアミノ酸 配列において 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミ ノ酸配列のいずれかを含んでなる、 前記アルデヒドォキシダーゼをコ一ド する DN Aであることが好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 ォキシダ一ゼ反応の活性測定法の原理を示す図である。 図 2は、 本発明の KNK269株由来酵素の反応至適 pHを示す図である。 緩衝液 として、 0. 1M Ma c l l v i ne緩衝液 （秦） 、 0. 1 M リン酸 緩衝液 （〇） 、 0. 1M T r i c i ne緩衝液 （△) 、 または 0. 1M P T/JP2004/001577
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G 1 y c i ne-HC 1緩衝液 （X) を使用した。 図 3は、 本発明の K NK 269株由来酵素の熱安定性を示す図である。 図 4は、 本発明の KN K058株由来酵素の反応至適温度を示す図である。 図 5は、 本発明の K NK058株由来酵素の反応至適 pHを示す図である。 緩衝液として、 0 . 1M Ma c l l v i ne緩衝液 （：譬） 、 0. 1 M リン酸緩衝液 （〇 ) 、 または 0. 1M T r i e i ne緩衝液 （X) を使用した。 発明を実施するための最良の形態
本発明のダリオキサールのダリオキシル酸への変換反応を式 1および式 2に示す。
(式 1) ダリ
Figure imgf000011_0001
O 2 H202
CHO デヒドロゲナーゼ CHO
CHO C02H
(式 2) ダリ才キサ一 グリ才キシル酸
酸化型補酵素 還元型補酵素 前記式 1に示される反応は、 ォキシダーゼまたは該ォキシダーゼを含有 する微生物が介在する場合であり、 前記式 2に示される反応は、 デヒドロ ゲナ一ゼまたは該デヒドロゲナーゼを含有する微生物が介在する場合であ る。 本明細書において、 ダリオキサールからダリオキシル酸への変換は、 前記式 1および式 2に示されるどちらの反応による変換をも包含しする。 したがって、 グリオキサールからダリオキシル酸へ変換する能力を有する 酸化還元酵素とは、 ォキシダ一ゼまたはデヒドロゲナ一ゼを意味し、 アル デヒドをカルボン酸に変換する酵素であればいずれでも良い。 とくに、 グ TJP2004/001577
11 リォキシル酸を蓄積するという点で、 ダリォキシル酸に対しては活性を有 さないか、 または低い活性しか有さない酵素が好ましい。
また、 該酸化還元酵素の酸性能を有する微生物の培養液、 培養上清、 菌 体および菌体処理物のいずれか 1種または 2種以上の混合物を用いて、 グ ルォキサールからダリォキシル酸への変換することも可能である。 反応が デヒドロゲナーゼにより触媒される場合 （式 2) 、 基質以外に補酵素、 （ たとえば、 NAD (ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチド) や NAD P (ニコチンアミド-アデニンジヌクレオチドリン酸） ） が必要である。 一方、 反応がォキシダ一ゼにより触媒される場合は （式 1) 、 基質である グリオキサール以外に酸素があれば反応が進行するため、 コスト的観点か らォキシダーゼを用いることが有利である。
反応がォキシダーゼにより触媒される場合、 ダリォキシル酸以外に過酸 化水素が生成され、 この過酸化水素を検出することにより目的のォキシダ ーゼ活性は容易に検出できる。 本発明における目的のォキシダーゼ活性の 検出、 定量は、 図 1に示すように、 酸化反応により生成する過酸化水素を 4ーァミノアンチピリン （以下 4一 AA) と N—ェチルー （2—ヒドロキ シ一 3—スルフォプロピル） —m—トルイジン （以下 TOO S) と反応さ せ、 生成するキノンィミン色素を検出、 定量することにより行なうことが できる。
• 具体的には以下の組成を含有する 10 OmMリン酸緩衝液 （pH 7) 0 . 9mlに、 菌体懸濁液または酵素液 0. 1mlを添加し、 30°Cでの波 長 555 nmの吸光度の増加を測定することにより行なう。 本発明におい て、 1分間に 1 mo 1の H202を生成する酵素活性を 1 un i tと定 義する。
(組成）
グリオキサール 2 OmM 1577
12
4-AA 0. 67mM
TOOS 1. 09mM
ヮサビ由来ペルォキシダーゼ (以下 POD) 2U/mL
また、 ダリオキサールおよびダリオキシル酸の定量は、 高速液体クロマ トグラフィ一で行なうことができる。 高速クロマトグラフィーによる分析 は、 たとえば、 バイオラッド ·アミネックス HPX— 87H (7. 8mm X 300mm) カラムを用い、 溶媒として 5 mMの H2 S 04水溶液を用 い、 流速 0. 4m 1 /分で行なうことができる。 検出は 230 nmの吸光 度または示差屈折率を測定することにより行なう。 本条件により、 ダリオ キサールは 16分、 ダリオキシル酸は 15分に溶出される。
目的のォキシダ一ゼ活性を有する微生物は、 たとえば、 以下のようなス クリーニングにより取得することができる。 炭素源として、 ダリオキサー ル、 エチレングリコール、 プロピレングリコールまたはグリコールアルデ ヒド 10 g、 硝酸アンモニゥム 2 g、 リン酸水素二カリウム 1 g、 リン酸 水素一ナトリウム、 酵母エキス 0. l g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 2 g、 塩化カルシウム二水和物 0. l g (いずれも 1L当り） の組成から なる、 高圧蒸気殺菌された （121°C、 20分間） の S培地 （pH7) 5 mlに、 日本国内より採取した土壌サンプル各 2 gを 10mlの生理食塩 水に懸濁後の上清液 0. 2mlを加えて、 28 で 3〜7日間集積培養を 行なった。 菌が生育した培養液を 2%寒天を含む S培地プレートに 0. 1 mlずつ塗布し、 28 °Cで 3〜 7日間培養を行なった。 そののち、 生育し たコロニーについて、 再度 2 %寒天培地を含む S培地プレートにて静置培 養を行ない、 生育が確認された菌株を各炭素源に対する資化性菌とした。 そののち、 これら資化性菌について、 ダリオキサールのダリオキシル酸へ の変換活性を調べた。 それぞれの菌体を試験管中 S培地 5 m 1で 28 °C、 3〜5日間振とう培養後、 菌体を遠心分離により集め、 生理食塩水で洗浄 したのち、 l O OmM T r i s— HC 1緩衝液 （pH8) 0. 5mlに 懸濁した。 その菌体懸濁液 0. 1 m 1を 50 mMダリォキサールを含む 1 0 OmM T r i s— HC 1緩衝液 （pH8) 0. 2mlに添加し、 28 :で 6〜12時間振とうさせた。 そののち、 反応液を遠心分離し、 上澄液 を高速液体クロマトグラフィ一により分析し、 ダリォキシル酸の生成の確 認ぉよび定量を行なつた。
また、 ダリォキサールの酸化が前記ォキシダーゼにより触媒される場合、 ダリオキシル酸と同時に過酸化水素が生じるので、 反応時に生成する過酸 化水素を検出することによりォキシダーゼ保有菌を見出すこともできる。 すなわち、 前記 S培地で培養して得られた菌体の菌体懸濁液 0. 1mlを 5 OmMグリオキサール、 1. 34mM 4— AA、 2. 18mM TO OS, 4 U/m 1ペルォキシダーゼ含有する 100 mMリン酸緩衝液 0. lmlに添加し、 28°Cで 2時間振とうし、 反応液が紫色になったもの、 すなわちダリオキサールに対する反応により過酸化水素が生じた株を選別 することにより、 ダリォキサールォキシダーゼ活性を保有する菌株を取得 することが可能である。
グリォキサールをグリォキシル酸へと変換する能力を有する微生物とし ては、 ステノトロフォモナス属、 ストレプトミセス属、 シユードモナス属、 ミクロバクテリウム属、 ァクロモパクター属、 セル口モナス属、 セルロシ ミクロピウム属、 モルガネラ属等に属する微生物をあげることができる。 それらのなかで代表的な微生物として、 ステノトロフォモナス ·スピーシ ーズ KNK235 (FERM P— 19002) 、 ストレプトミセス ·ス ピーシーズ KNK269 (FERM BP— 08556) 、 シユードモナ ス ·スピーシ一ズ KNK058 (FERM BP— 08555) 、 シユー ドモナス 'スピーシ一ズ KNK254 (FERM P— 19003) 、 ミ クロバクテリゥム .スピーシーズ KNK011 (FERM BP— 085 54) 、 ァクロモバクタ一 'スピ一シーズ I FO 13495、 セルロモ ナス ·スピ一シーズ J CM 2471、 セル口モナス ·タバタ I FO 1 5012、 セルロモナス ·夕バタ I FO 15014、 セルロモナス ·夕 バタ I F〇 15015、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 1 5013、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 15516、 セル ロシミクロビゥム ·セルランス J CM 6201、 モルガネラ ·モルガ二 ィ I FO 3848などをあげることができる。 これらの微生物のうち I FO 13495、 I FO 15012、 I FO 15014、 I FO 15015、 I FO 15013、 I FO 15516、 I FO 384 8は公知であり、 独立行政法人製品評価技術基盤機構バイォテクノロジ一 本部 ·生物遺伝資源部門 （NBRC) (：〒 292— 0818 日本国千葉 県木更津巿かずさ 鎌足 2— 5— 8) から容易に入手することができる。 J CM 2471および J CM 6201もまた公知であり、 独立行政法 人理化学研究所微生物系統保存施設 （J CM) (〒 351— 0198 日 本国埼玉県和光市広沢 2— 1) から容易に入手することができる。 その他 の微生物は本発明者により土壌から新たに分離，同定され、 それぞれ前記 寄託番号にて独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター （=Γ 3 05 - 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に 寄託されている。 前記ステノトロフォモナス ·スピーシーズ KNK235
(以下、 単に KNK235株という場合もある） 、 シユードモナス 'スピ —シーズ KNK058 (以下、 単に KNK058株という場合もある） 、 シュ一ドモナス 'スピーシーズ KNK254 (以下、 単に KNK254株 という場合もある） およびミクロパクテリゥム ·スピ一シーズ KNK01
1 (以下、 単に KNK011株という場合もある） の菌学的性質を表 1に 示す。 表 1
ΚΝΚ235 KNK254 KNK058 KNK011 桿菌 桿菌 桿菌 桿菌 細胞の形態 (0. 8χ (0. 7〜0. 8x (0. 8x (0. 7〜0. 8x
2. 0〜3. Ο β ΐη) 2. 0〜2. δ τη) 1. 5~2. Ο μ πι) 1. 0〜1. 2 μ πι) ダラム染色 一 ― 一 + 胞子形成 ― 一 一 ― 蓮動性 + + + 一
円形 円形 全縁なめらか 全縁滑らか 全縁滑らか 全縁滑らか コロニーの形態 低凸状 低凸状 低凸状 低凸状
光沢あり 光沢あり 光沢あり 光沢あり 黄色 黄色 黄色 黄色 培養温度 + (37°C) 一 (37°C) + (37°C) + (37 ）
― (45°C) 一 (45°C) 一 (45°C) 一 (45°C) カタラーセ + + + + ォキシタ"ーセ， ― + ― ―
OFテスト (グルコース） ― 一 ― ― 硝酸塩還元 ― ― 一 ― ヒ。ラシ'ナミタ'ーセ' + ヒ。ロリドエルァリルアミダーセ' ― β -ク'ルコロユタ'ーセ' ― β -力'ラ外シタ'ーセ' + + +
-ク "ルコシタ"ーセ' +
N-ァセチル- β -ダルコサミニタ'— ― エスクリン（/3 -ダルコシダ—セ'） + + アルキ 'ニンシ 'ヒト 'ラーセ' ― ― ―
チトクロムォキシタ'ーセ' ― + 一
ゥレアーセ' ― ― 一 ― ゼラチン加水分解 + + + + インドール産生 ― 一 一
発酵性
フ'ドウ糖 + + + リホ'ース 一 キシロース + マンニトール 一 + マルト—ス + + 一 +
D-マンノース + + +
L-ァラビノース ― ― +
D-マンニトール ― +
Ν-ァセチル -D-ダルコサミン + ― ―
ダルコン酸カリウム ― ― +
η-カプリン酸 ― ― +
ァシ'ピン酸 ― ― 一
リンゴ酸 + +
クェン酸ナトリウム + + +
酢酸フエエル ― ―
乳糖 一 白糖 + グリコーゲン ― 4001577
16 ストレプトミセス ·スピーシーズ KNK269株 （以下、 単に KNK2 69株という場合もある） の同定は以下の周知の方法にもとづき行なった。 該菌株の 16 Sリポゾ一マル RNA遺伝子 （16 S rDNA) のうち 5 ' 末端側約 500 bpの領域を PC Rで増幅して、 塩基配列を決定し、 M i c r oS e q B ac t e r i a l 500 1 i b r a ry v. 002 3 (Ap p l i e d B i o s y s t ems社、 CA， USA) データべ ースを用いて相同性検索を行ない、 分子系統樹を作製する方法で行なった。 前記アルデヒドォキシダーゼが、 ストレプトミセス属微生物が産生する アルデヒドォキシダーゼの塲合、 以下 （1) 〜 （3) の理化学的性質を有 することが好ましい。
(1) 至適 pH： 6〜9
(2) 熱安定性： pH7. 2で 60 、 20分処理したのち、 90 %以上 の活性を保持している
(3) 分子量：ゲル濾過分析において約 11万であり、 SDS—ポリアク リルアミドゲル電気泳動分析において、 約 2. 5万、 約 3. 5万、 約 8万 の 3つのサブュニットタンパク質を有する
また、 ストレプトミセス属微生物のなかでも、 ストレプトミセス 'スピ —シーズ KNK269 (FERM B P— 08556 ) が好ましい。
前記アルデヒドォキシダーゼが、 シユードモナス属に属する微生物が産 生するアルデヒドォキシダ一ゼの場合、 以下 （1) 〜 （3) の理化学的性 質を有することが好ましい。
( 1 ) 分子量：ゲル濾過分析において約 15万
(2) 反応至適温度： 60〜70
(3) 反応至適 pH： 5〜7
また、 シユードモナス属微生物のなかでも、 シユードモナス，スピーシ —ズ KNK058 (FERM B P— 08555 ) が好ましい。 前記アルデヒドォキシダーゼが、 ミクロバクテリゥム属微生物が菌体内 および菌体外に産生するアルデヒドォキシダーゼの場合、 以下の理化学的 性質を有することが好ましい。
分子量： S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 1 1万 の単一タンパク質
また、 ミクロバクテリゥム属微生物のなかでも、 ミクロバクテリウム スピーシ一ズ KNK 0 1 1 (F E RM B P— 0 8 5 5 4 ) が好ましい。 前記アルデヒドォキシダーゼが、 セルロシミクロピウム属微生物が菌体 内および菌体外に産生するアルデヒドォキシダーゼの場合、 以下の理化学 的性質を有することが好ましい。
分子量： S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 9〜1 0万の単一タンパク質
また、 セルロシミクロピウム属微生物のなかでも、 セルロシミクロピウ ム ·セルランス I F O 1 5 5 1 6が好ましい。
本発明において、 ダリオキサ一ルをグリオキシル酸へ変換する能力を有 する酸化還元酵素の産生能を有する微生物を培養するための培地は、 その 微生物が増殖し得るものであれば特に限定されない。 たとえば、 炭素源と して、 グルコースおよびシュ一クロースなどの糖質、 エタノール、 グリセ ロール、 エチレングリコールぉよびプロピレングリコ一ルなどのアルコ一 ル類、 ダリオキサールなどのアルデヒド類、 ォレイン酸およびステアリン 酸などの脂肪酸ならびにそのエステル類、 菜種油および大豆油などの油類 ；窒素源として、 硫酸アンモニゥム、 硝酸ナトリウム、 ペプトン、 ガザミ ノ酸、 酵母エキス、 肉エキスおよびコーンスチープリカーなど；無機塩類 として、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 炭酸カルシウム、 リン酸一 水素力リゥムおよびリン酸ニ水素力リゥムなど；その他に、 麦芽エキス、 肉エキスなどを含有する通常の液体培地が使用され得る。 1577
18 本発明によるダリコール酸の製造方法は、 前記酸化還元酵素、 または該 酸化還元酵素の産生能を有する微生物の培養液、 培養液から分離した微生 物菌体、 微生物菌体処理物、 さらには微生物菌体外にも前記酸化酵素が産 生される場合は培養液上清のいずれかをダリオキサールに作用させ、 ダリ ォキシル酸へと変換蓄積せしめることを特徴とする。
ここで、 微生物菌体処理物とは、 たとえば、 凍結乾燥菌体、 アセトン乾 燥菌体、 それら菌体の破砕物、 または粗酵素液などを意味する。 用語 「粗 酵素液」 には、 たとえば、 菌体のグラスビーズなどを用いる物理的破砕方 法、 酵素などを用いる生化学的方法などにより破砕または溶解した溶液、 さらには遠心分離などにより該溶液中の固形物を除去して得た無細胞抽出 液が含まれる。 また、 さらには、 当業者が通常用いる方法、 たとえば、 透 析、 硫酸アンモニゥム沈澱、 クロマトグラフィーを単独でまたは組合わせ て用い、 前記無細胞抽出液を部分的に精製した酵素も 「粗酵素液」 に含ま れる。 また、 微生物菌体処理物は、 公知の手段で固定化して用いることも できる。 固定化は当業者に周知の方法 （たとえば、 架橋法、 物理的吸着法、 包括法など） で行ない得る。
反応条件は使用する酵素、 微生物またはその処理物により異なるが、 最 適な反応条件としては、 温度は 1 0〜8 0で、 好ましくは熱安定性の観点 から 2 0〜4 0 °Cの範囲、 p I^ p H 4〜1 2、 好ましくは p H安定性の 観点から p H 6〜l 0の範囲である。 反応は振とう、 撹拌条件下で実施す るのが好ましい。
反応がォキシダーゼにより触媒される場合、 反応系に過酸化水素が生成 する。 過酸化水素は酵素を失活させたり、 ダリオキシル酸をギ酸へと分解 する場合もあるが、 カタラーゼを添加することにより、 反応により生じた 過酸化水素を分解除去し、 酵素の失活ゃグリオキシル酸の分解を防ぐこと が可能である。 本発明の酵素としては、 ダリオキシル酸に対しては、 低い活性しか示さ ないものが望ましい。 とくに、 本発明の酵素は、 ダリオキシル酸に対する 活性が、 ダリオキサールに対する活性の 1 / 1 0倍以下であるものが好ま しく、 1 2 0倍以下であることがより好ましく、 1 Z 1 0 0倍以下であ ることがさらに好ましい。 ォキシダ一ゼのダリォキシル酸に対する活性が、 ダリオキサールに対する活性の l Z i 0倍をこえると、 ダリオキサールが 酸化されて生成したダリォキシル酸がさらに酸化されるため、 反応系にグ リオキシル酸が蓄積されない、 または蓄積量が低下する傾向がある。 この ように、 本発明のォキシダーゼは、 ダリオキサールをダリオキシル酸へ変 換することだけでなく、 ダリォキシル酸に対し活性が低いことが特徴であ る。 ダリオキサールに対し活性を示すことが知られている木材腐朽菌が産 生するダリオキサールォキシダーゼは、 ダリオキシル酸に対しても高い活 性を示す。 表 2に本発明酵素と木材腐朽菌が産生する酵素それぞれの、 グ リォキサールとダリォキシル酸に対する活性を示す。 本発明酵素はダリォ キサールに比べ、 ダリオキシル酸には非常に低い活性しか示さない。 表 2
Figure imgf000020_0001
さらに、 本発明は、 前記アルデヒドォキシダ一ゼを効果的に組換え生産 するため使用することができる前記アルデヒドォキシダ一ゼをコ一ドする
D NAに関する。 詳しくは、 本発明は、 配列番号 4、 5または 6の塩基配 列からなるアルデヒドォキシダーゼのサブュニットをコードする D N Aに 関し、 さらには、 該塩基配列からなる D N Aと相補的な塩基配列からなる D NAのいずれか 1つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D NAも、 該 D NAによってコードされるタンパク質をサブュニットとし て有する夕ンパク質が、 グリォキサールをグリォキシル酸へ変換する活性 を有する限りにおいて、 本発明の D NAに含まれる。
また、 本発明は、 配列番号 9、 1 0、 1 3または 1 4の塩基配列からな るアルデヒドォキシダーゼをコ一ドする D N Aにも関し、 さらには該塩基 配列からなる D N Aと相補的な塩基配列からなる D N Aのいずれか 1つと ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aも、 該 D NAによ つてコードされるタンパク質が、 ダリオキサールをダリオキシル酸へ変換 する活性を有する限りにおいて、 本発明の D N Aに含まれる。
また、 配列番号 1、 2または 3で表わされるアミノ酸配列において 1ま たは数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列のいずれ かを含んでなるタンパク質をコードする D NAも、 該 D NAによってコ一 ドされるタンパク質をサブユニットとして有するタンパク質が、 ダリオキ サールをダリオキシル酸へ変換する活性を有する限りにおいて、 本発明の D NAに含まれる。
さらに、 配列番号 7、 8、 1 1または 1 2で表わされるアミノ酸配列に おいて 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配 列のいずれかを含んでなるタンパク質をコードする D NAも、 該 D NAに よってコードされるタンパク質が、 ダリオキサ一ルをグリオキシル酸へ変 換する活性を有する限りにおいて、 本発明の D NAに含まれる。
本発明は、 配列番号 4、 5もしくは 6の塩基配列からなる D NAによつ てコ一ドされるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドォキシ ダーゼ、 または配列番号 9、 1 0、 1 3もしくは 1 4の塩基配列からなる D NAによってコードされるアルデヒドォキシダーゼにも関する。 さらに は、 配列番号 4、 5もしくは 6の塩基配列からなる D NAと相補的な塩基 7
21 配列からなる DNAのいずれか 1つとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズする DNAによってコードされるタンパク質をサブュニットとし て有するアルデヒドォキシダーゼ、 配列番号 9、 10、 13もしくは 14 の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリン ジェントな条件下でハイブリダィズする D N Aによってコードされるアル デヒドォキシダ一ゼも、 ダリォキサールをグリォキシル酸へ変換する活性 を有する限りにおいて、 本発明のォキシダーゼに含まれる。
ハイブリダィゼーションは、 当業者に周知の操作により実施することが できる。 たとえば、 具体的には、 配列番号 4、 5、 6、 9、 10、 13、 または 14に示した塩基配列の 2本鎖 DNAをニックトランスレーション 法により 32 Pで末端標識した DNAをプローブ DNAとして用いたサザ ンハイブリダィゼーシヨンにより実施できる （Mo l e c u l a r C 1 on i ng 第 3版 2001年 （Co 1 d Sp r i ng Ha r bo r
Labo r a t o ry P r e s s、 Co l d S p r i ng H a r bo r、 New Yo r k, USA) , Vo 1. 1、 チャプター 6. 5 0〜55参照） 。 任意の生物、 微生物から調製した染色体 DNA、 ゲノム DNA、 プラスミド DNA、 人工的に作製されたベクター DNA、 または これらの DNAを適当な制限酵素で消化した D N A断片をァガロースゲル 電気泳動で分離後、 ニトロセルロースフィルターに固定し、 前記プローブ DN Aと結合する DN Aをオートラジオフラフィ一で検出することで、 本 発明に使用しうるアルデヒドォキシダーゼの遺伝子を検出することができ る。 ハイブリダィゼーションにおけるストリンジェントな条件としては、 ニトロセルロースフィル夕一に固定した DN Aと標識プロ一ブ DN Aを 6 XSSC、 5 Xデンハルト試薬、 0. 5% SDS、 1 μ, g/m p o 1 y (A) 、 10 O^g/mlサケ精子 DNAからなる緩衝液中、 68°Cで ハイブリダィズし、 2XSSC、 0. 5%SDSからなる緩衝液でリンス 2004/001577
22 した後、 2XSSC、 0. 1 %SDSからなる緩衝液を用い、 30°Cで 3 0分の洗浄を 2回行なう場合であり、 さらにストリンジエンドな条件とし ては 1 XSSC、 0. 5%SDSからなる緩衝液を用い、 65°Cで 30分 の洗浄を 4回行なう場合である。 1 XSSCは 0. 15 M塩化ナトリウム、
0. 015Mクェン酸ナトリウムからなる水溶液で、 I Xデンハルト試薬 は、 0. 02%F i c o l l 400 (S i gma-A 1 d r i c C o r p o r a t i on製） 、 0. 02 %ポリビエルピロリドン、 0. 02 %牛血清アルブミン （S i gma-A l d r i c h Co r p o r a t i o n製、 F r a c t i o nV) からなる。
また、 本発明は、 配列番号 1、 2もしくは 3で表されるアミノ酸配列か らなるタンパク質をサブユニットとして有するアルデヒドォキシダーゼ、 または配列番号 7、 8、 11もしくは 12で表されるアミノ酸配列のアミ ノ酸配列からなるアルデヒドォキシダーゼにも関する。 さらに、 配列番号
1、 2または 3で表されるアルデヒドォキシダ一ゼのサブユニットァ、 β または αのアミノ酸配列において、 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換 または付加されたアミノ酸配列のいずれか 1つを含む夕ンパク質も、 該夕 ンパク質をサブユニットとして有するタンパク質が、 ダリオキサールをグ リオキシル酸へ変換する活性を有する限り、 本発明のォキシダーゼに含ま れる。 また、 配列番号 7、 8、 11または 12で表されるアミノ酸配列に おいて、 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸 配列を含むタンパク質も、 ダリオキサールをダリオキシル酸へ変換する活 性を有する限り、 本発明のォキシダーゼに含まれる。
特定のアミノ酸を欠失、 置換または付加する方法としては、 特定アミノ 酸のコドンを欠失、 または他のアミノ酸のコドンに置換、 または他のアミ ノ酸のコドンを付加した塩基配列を含む合成 D Ν Αプライマーを使用した PCR、 または化学的な DN A合成法などの公知の方法により作製した酵 素の遺伝子を、 遺伝子発現用のベクターに連結し、 大腸菌などを宿主とし て組換え発現する方法などの従来公知の方法が用いられ、 当業者であれば 容易に実施し得る。
微生物の菌体外に分泌される酵素では、 一般に遺伝子の開始コドンから 数十アミノに相当する部分に分泌シグナル配列がコ一ドされており、 菌体 内で合成された酵素タンパク質が菌体外に分泌される過程で分泌シグナル 配列は切断されて成熟型の酵素となることが知られている。 本発明に記載 されている酵素のうちのいくつかでは菌体外にも活性な酵素が分泌される が、 これらの酵素の組換え生産においては、 分泌シグナル配列を人為的に 除去した遺伝子を用いることにより、 酵素タンパク質を宿主となる微生物 の菌体内に生産させて使用することができる。 本発明はこの目的において 使用できる分泌シグナル配列を除去した酵素遺伝子 （配列番号 1 0および 1 4 ) も提供する。 また、 一方では、 酵素の組換え発現において宿主微生 物の菌体外に酵素を生産させる目的で、 分泌シグナル配列を含んだ遺伝子 (配列番号 9および 1 3 ) を用いることもできる。 さらには、 本来の分泌 シグナル配列を宿主微生物に適した分泌シグナル配列に置換したキメラ遺 伝子を作製して使用することも当業者に公知の方法により可能である。 本発明に使用できる酵素の遺伝子は以下に述べる方法で得ることができ る。 すなわち、 ダリオキサールをダリオキシル酸に変換する酵素を生産す る微生物の菌体または培養液から酵素タンパク質を精製し、 酵素タンパク 質をプロテア一ゼ消化して得られるペプチドを用いて部分アミノ酸配列を 決定する。 次に、 周知の方法により、 これらの部分アミノ酸配列をもとに 合成したプライマーを用いて、 ゲノム D NAを錶型として P C Rを行なう ことによって酵素遺伝子の一部を増幅し、 遺伝子内部の塩基配列を決定す ることができる。 N—末端アミノ酸配列、 または C一末端近傍のアミノ酸 配列から合成した D NAプライマーを用いてィンバース P C Rを行なうこ とでシグナル配列、 N—末端アミノ酸配列および C一末端アミノ酸配列な どを決定することができる （C e 1 1 S c i e nc e 1990、 vo 1. 6 No. 5 370— 376)'。 塩基配列を決定したアルデヒドォ キシダ一ゼの遺伝子は PC Rを用いて容易に取得できる。 また、 遺伝子の 一部の配列を利用して公知の方法により微生物の染色体 DN Aまたはゲノ ム DN Aから取得することが可能である。
本発明に用いる酵素は、 天然酵素であってもよく、 また組換え技術によ り得られた酵素であってもよい。 組換え技術の方法としては、 たとえば、 酵素の遺伝子をプラスミドベクタ一、 ファージベクターなどに挿入し、 大 腸菌などの細菌、 酵母ゃカビなどの微生物、 動物、 植物、 または動植物の 細胞などの宿主を形質転換する方法などが有効である。
以下、 実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれら 実施例になんら限定されるものではない。
(実施例 1)
エチレングリコール 10 g、 酵母エキス l g、 NUTR I ENT BR OTH (D i f c o社製） 8 g、 リン酸水素一カリウム 3 g、 リン酸水素 二カリウム 7 g (いずれも 1L当り） の組成からなる液体培地 （EG— N B培地 （pH7) ) 5mlを大型試験管に分注し、 121 で 20分間高 圧蒸気殺菌した。 この培地に表 3に示す微生物を無菌的に一白金耳植菌し、 28°Cで 2日間培養し、 前培養液を得た。 ついで、 500ml容坂ロフラ スコ中 100 m 1の殺菌処理後の E G— N B培地に、 得られた前培養液を lml植菌し、 28 で 3日間培養した。 得られた培養液 100mlより 遠心分離により菌体を集め、 10 OmMTr i s一 HC 1緩衝液 （pH8 . 0) で洗浄後、 同緩衝液 （ρΗ8· 0) 5mlに懸濁した。 本菌体懸濁 液をミニビートピーター （B I OSPEC社製） で破砕後、 遠心分離によ り上澄液 （無細胞抽出液） を得た。 得られた無細胞抽出液 0. 8mlに 5 0 OmMダリオキサール水溶液 0. lml、 50, O O OUZmlのカタ ラーゼ溶液を 0. 1ml添加し、 試験管中で、 28°Cで 4時間振とう反応 を行ない、 得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。 グリォキシル酸の生成量を表 3にまとめた。 表 3
Figure imgf000026_0001
(実施例 2 )
実施例 1で調製した表 3記載の微生物の無細胞抽出液 0. 1 m 1に、 試 験管中で 4一 AA1. 34mM、 TOOS 2. 19mM、 POD 6U/m 1を含む 0. 1Mリン酸緩衝液 （pH7) 0. 05mlを添加した。 さら に 100 mMダリォキサール水溶液または水を 0. 05ml添加し、 28 °C、 2分間振とうし、 反応液の色の変化を観察した。 その結果を表 4に示 す。 いずれの微生物を用いた反応においても、 ダリオキサール水溶液を添 01577
26 加したものは反応液が濃い紫色に着色したが、 ダリォキサール水溶液の代 わりに水を添加した場合、 反応液は変色しなかった。 ダリオキサールの酸 化反応時に過酸化水素が生成することがわかり、 このことよりダリォキサ ールの酸化反応を触媒している酵素はォキシダーゼであることが判った。 表 4
反応液の着色
菌株 ダリオキサ -ルダリオキサーノレ
添加 ■ 無添加 ステノトロフォモナス'スピーシーズ KNK 235 + ―
ストレプトミセス'スピ一シ一ズ KNK 269 + ―
シユードモナス 'スピーシーズ KNK 254 + ―
シユードモナス 'スピーシーズ KNK 058 + 一
ミクロバクテリウム.スピ一シーズ KNK011 + ―
了クロモノくクタ' ~ ·スピ一シ一ズ IFO 13495 + ―
セルロモナス 'スピーシ一ズ JCM 2471 + 一
セルロモナス'タバタ IFO 15012 + ―
セルロモナス'タバタ IFO 15014 + ―
セル口モナス'タパタ IFO 15015 + ―
セルロシミクロビゥム 'セルランス IFO 15013 + ―
セルロシミクロピウム.セルランス IFO 15516 + ―
セルロシミクロビゥム .セルランス JCM 6201 + ―
モルガネラ'モルガニイ IFO 3848 + ―
(実施例 3 )
実施例 1と同様な方法で調製したシユードモナス ·スピーシーズ ΚΝΚ 2 5 4株、 ミクロバクテリウム ·スピーシ一ズ KNK 0 1 1株、 セルロモ ナス ·夕バタ I F 0 1 5 0 1 5株およびセルロモナス ·スピーシーズ J C M 2 4 7 1株の培養液 1 0 0 m 1より遠心分離により菌体を集め、 0 . 1 mMリン酸緩衝液 （p H 7 ) で洗浄後、 同緩衝液 5 m lに懸濁した。 試験 管中、 本菌体懸濁液 0 . 4 5 m 1に 5 0 0 mMダリォキサール水溶液 0 . 05mlを添加し、 4時間振とうして反応を行なった。 反応後の上澄みを HPLCで分析し、 生成したダリオキシル酸を算出した。 その結果シユー ドモナス ·スピ一シ一ズ KNK254株では 2 OmM、 ミクロバクテリウ ム ·スピーシーズ KNK011株では 14mM、 セルロモナス ·夕バタ I FO 15015株では 3 OmM、 セルロモナス ·スピ一シーズ J CM 24 71株では 33 mMのダリオキシル酸が生成していた。
(実施例 4)
以下の方法に従って、 ストレプトミセス ·スピ一シ一ズ KNK269株 より、 ダリオキサールをダリオキシル酸へ変換する活性を有するアルデヒ ドォキシダーゼの精製を行なった。
エチレングリコール 10 g、 酵母エキス 3 g、 Nu t r i e n t b r o t h 8 g、 リン酸水素二力リウム 3 g、 リン酸水素二力リウム 7 g (い ずれも 1 Lあたり） の組成よりなる培地 （pH7) 50mlを 500ml 容坂ロフラスコにいれて高圧蒸気殺菌後、 ストレプトミセス ·スピ一シ一 ズ KNK 269株を一白金耳植菌し、 28 °Cで 3日間振とう培養し、 前培 養液を得た。 ついで、 10リツトルミニジャーに前記組成の培地 6 Lをい れて高圧蒸気殺菌後、 前培養液 50mlを植菌し、 28°C、 通気 0. 5 v vm、 撹拌 300 r pmで 2日間培養を行なった。 本ミニジャー培養を繰 り返し 95 Lの培養液を取得し、 ついで得られた培養液 95 Lから遠心分 離により菌体を集め、 0. 05Mリン酸緩衝液 （pH7) 3Lに懸濁した。 得られた菌体懸濁液をダイノミル （Dyno— Mi 1 1社製） で破砕後、 遠心分離により菌体残渣を除き、 無細胞抽出液 2. 5Lを得た。 得られた 無細胞抽出液 2. 5 Lに氷冷下スターラーで撹拌しながら、 所定量の硫酸 アンモニゥムを添加し、 硫酸アンモニゥム 30— 55 %飽和で沈殿する夕 ンパク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を 0. 05Mリン酸緩衝液 （PH7) で溶解し、 同 緩衝液により透析を行なったのち、 これを同緩衝液で予め平衡化した D E AE—トヨパール 650M (東ソ一株式会社製） カラム （130ml) に チャージし、 素通り画分を除去後、 0. 5 M塩化ナトリウムを含む 0. 0 5Mリン酸緩衝液 （pH7) で溶出し、 活性画分を集めた。 得られた酵素 液に、 硫酸アンモニゥムを 0. 6 Mになるように添加し、 0. 6M硫酸ァ ンモニゥムを含む 0. 05Mリン酸緩衝液で予め平衡化した Ph e ny 1 一トヨパール 650M (東ソ一株式会社製） カラム （300ml) にチヤ ージし、 0. 6〜0. 1Mの硫酸アンモニゥム直線濃度勾配により溶出し、 活性画分を集めた。 得られた酵素液を 0. 05Mリン酸緩衝液 （pH7) により透析を行ない、 予め同緩衝液で平衡化した DEAE—トヨパール 6 50Mカラム （130ml) にチャージし、 0〜0. 25 Mの塩化ナトリ ゥム直線濃度勾配により溶出を行ない、 活性画分を集めたのち、 硫酸アン モニゥムを 60%飽和になるまで添加し、 遠心分離により、 沈殿するタン パク質を集め、 0. 05Mリン酸緩衝液 （pH7) で溶解し、 同緩衝液に より透析を行なった。 ついで、 この透析後の酵素液を、 0. 05Mリン酸 緩衝液 （ρΗ7) で予め平衡化した B e n z ami d i ne S e pha r o s e (Am e r s am Pha rma c i a B i o t e c h社製 ) カラム （10ml) にチャージし、 0〜0. 1Mの塩化ナトリウム直線 濃度勾配により溶出を行ない、 活性画分を集めた。 本酵素液を限外濾過に より濃縮して、 0. 15 M塩化ナトリウムを含む 0. 05Mリン酸緩衝液 (pH7) で予め平衡化した S u p e r d ex 200HR 16/60 ( Am e r s h am Ph a rmac i a B i o t e c h社製) カラム ( 120ml) にチャージし、 同緩衝液で溶出を行なった。 分子量 17万に 相当する画分に、 280 nmのタンパク質吸収と活性が一致する溶出ピ一 クを得た。 本活性画分を未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した ところ、 単一バンドを形成した。 また、 本酵素を SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したとこ ろ、 分子量約 2. 5万、 3. 5万、 8万に相当する 3づのタンパク質バン ドを形成した。 これらのことより、 本酵素は分子量約 2. 5万、 3. 5万、 8万のサブュニット構造を有することがわかった。
(実施例 5 )
以下の方法に従って、 ミクロバクテリゥム ·スピーシ一ズ KNK011 株より、 ダリォキサールをダリォキシル酸へ変換する活性を有するアルデ ヒドォキシダーゼの精製を行なった。
酵母エキス 5 g、 硝酸アンモニゥム 2 g、 リン酸水素二カリウム 2 g、 リン酸水素ーナトリゥムニ水和物 1 g、 硫酸マグネシウム ·七水和物 0. 2 g、 塩化カルシウム ·二水和物 0. 1 g (いずれも 1 Lあたり） の組成 よりなる培地 （pH7) 50m 1を 500m 1にいれて高圧蒸気殺菌後、 ミクロバクテリゥム ·スピーシ一ズ KNKO 11株を一白金耳植金し、 2 8°Cで 3日間振とう培養し、 前培養液を得た。 ついで、 5リットルミニジ ヤーに前記組成の培地 3 Lをいれて高圧蒸気殺菌後、 前培養液 3 Om 1を 植菌し、 28°C、 通気 0. 5 V vm、 撹拌 400 r pmで 28時間培養を 行なった。 本ミニジャー培養を繰り返し 69 Lの培養液を取得し、 ついで 得られた培養液 69 Lから遠心分離により菌体を集め、 0. 05Mリン酸 緩衝液 （pH7) に懸濁した。 得られた菌体懸濁液をダイノミル （Dyn o— Mi 1 1社製） で破砕後、 遠心分離により菌体残渣を除き、 無細胞抽 出液 2 Lを得た。 得られた無細胞抽出液 2 Lに氷冷下、 スターラーで撹拌 しながら、 所定量の硫酸アンモニゥムを添加し、 硫安アンモニゥム 20— 40 %飽和で沈殿するタンパク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を 0. 05Mリン酸緩衝液 （pH7) で溶解し、 同 緩衝液により透析を行なったのち、 これを同緩衝液で予め平衡化した D E AE—トヨパール 650Mカラム （300ml) にチャージし、 0〜0. 6 Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出し、 活性画分を集めた。 こ の活性画分に硫酸アンモニゥム濃度が 0. 7 Mになるように所定量の硫酸 アンモニゥムを添加し、 予め 0. 7 M硫酸アンモニゥムを含む 0. 05M リン酸緩衝液 （ρΗ7) で平衡化した P h e ny 1一トヨパール 650M カラム （160ml) にチャージ後、 0. 7〜0Mの硫酸アンモニゥム直 線濃度勾配により溶出し、 活性画分を集めた。 得られた酵素液を 0. 05 Mリン酸緩衝液 （pH7) により透析を行なった。 ついで、 この透析後の 酵素液を 0. 05 Mリン酸緩衝液で予め平衡化した R e s o u c e Q ( Ame r s h am Pha rmac i a B i o t e c h社製) カラム 6ml ) にチャージし、 0. 15〜0. 45 Mの塩化ナトリウム直線濃度 勾配により溶出を行ない、 活性画分を集めた。 得られた酵素液を限外濾過 により濃縮を行ない、 0. 3 M濃度になるように、 硫酸アンモニゥムを添 加後、 0. 3 M硫酸アンモニゥムを含む 0. 05Mリン酸緩衝液 （pH7 ) で予め平衡化した R e s ou c e Phe (Ame r s h am P h a rmac i a B i o t e c h社製） カラム （6ml) にチャージし、 0 . 3〜0Mの硫酸アンモニゥム直線濃度勾配により溶出し、 活性画分を集 めた。
得られた酵素液を S D S一ポリァクリルアミドゲル電気泳動に供したと ころ、 分子量約 11万に相当する単一のタンパク質バンドを形成した。 (実施例 6)
以下の方法に従って、 シユードモナス ·スピ一シーズ KNK058株よ り、 ダリオキサールをダリオキシル酸へ変換するアルデヒドォキシダーゼ の精製を行なった。
エチレングリコール 10 g、 NUTR I ENT BROTH8 g、 リン 酸水素二カリウム 7 g、 リン酸二水素カリウム 3 g (いずれも 1Lあたり ) の組成よりなる培地 （pH7) 5mlを大型試験管中で高圧蒸気殺菌後、 シュ一ドモナス ·スピ一シーズ KNK058株を一白金耳植菌し、 28°C で 2日間培養後、 ついで、 本培養液を滅菌済みの前記培地 500m 1を含 んだ 2 L振盪フラスコに植菌し、 28°C、 18時間、 振盪培養し、 前培養 液を得た。 ついで、 殺菌済みの前記培地 60Lを含んだジャーファメンタ 一に植菌し、 28° (：、 通気 l vvm、 撹拌 200 r pmで 40時間培養を 行なった。 得られた培養液 60Lから遠心分離により菌体を集め、 0. 0 2Mリン酸緩衝液 （pH7) に懸濁した。 得られた菌体懸濁液を I n c o n a t o r 201 M超音波破砕装置 （株式会社久保田製作所製） で 60 分間破砕後、 遠心分離により菌体残渣を除き、 無細胞抽出液を得た。 得ら れた無細胞抽出液を冷却下、 スターラー撹拌しながら、 所定量の硫酸アン モニゥムを添加し、 硫酸アンモニゥム 20-60%飽和で沈殿するタンパ ク質を遠心分離により集めた。
得られたタンパク質を 0. 02Mリン酸緩衝液 （pH7) で溶解し、 同 緩衝液により透析を行なったのち、 その酵素液に 1. 5Lの DEAE— S e phac e 1樹脂を添加し、 4tで 1時間撹拌後、 未吸着のタンパク質 液を濾過により除いたのち、 1 M塩化ナトリゥムで樹脂に吸着した酵素夕 ンパク質の溶出を行なった。
得られた酵素液を 0. 02 Mリン酸緩衝液 （ p H 7 ) で透析後、 0. 0 2Mリン酸緩衝液 （pH7) で平衡化した H i P r e p 16/10—Q — XL Ame r s h am Pha rma c i a B i o s c i enc e 社製） カラム （16ml) にチャージし、 0〜1Mの塩化ナトリウムの直 線濃度勾配法により溶出を行ない、 活性画分を集めた。 この活性画分に硫 酸アンモニゥム濃度が 1. 2 Mになるように所定量の硫酸アンモニゥムを 添加し、 予め、 1. 2Mの硫酸アンモニゥムを含む 0. 02Mリン酸緩衝 液 （PH7) で平衡化した Ph e ny 1 S u p e r o s e HR 10 Z 10 (Ame r s h am Pha rma c i a B i o s c i enc e 社製） カラム （10ml) にチャージし、 1. 2〜0Mの硫酸アンモニゥ ムの直線濃度勾配法に溶出を行ない、 活性画分を集めた。 次に、 得られた 酵素液を 0. 02 Mリン酸緩衝液で透析後、 同緩衝液で平衡化した M o n o Q HR 10/10 (Ame r s h am Pha rma c i a B i o s c i e nc e社製） カラム （10ml) にチャージし、 塩化ナトリウ ムの直線濃度勾配法により溶出を行ない、 活性画分を集めた。 さらに得ら れた酵素液を 0. 02 Mの塩化ナトリゥムを含む 0. 02 Mリン酸緩衝液 で平衡化した H i P r e p S e p ac r y l S— 200 16/6 0 (Am e r s h am Pha rma c i a B i o s c i en c e社製 ) カラム （60ml) にチャージし、 同緩衝液で溶出を行なった。 活性画 分を集め、 これを 0. 005Mリン酸緩衝液 （pH7) で透析後、 同緩衝 液で予め平衡化した Hy d r oxyap a t i t e (生化学工業株式会社 製） カラム （10ml) にチャージし、 0. 005〜0. 5 Mリン酸緩衝 液の直線濃度勾配法により溶出を行なった。 活性画分を集め、 これを 0. 005mMリン酸緩衝液で透析後、 同緩衝液で平衡化した B i o-S c a
1 e CHT5 - I (B i o— Rad社製） カラム （6. 4ml) にチヤ ージし、 0. 005〜0. 5Mリン酸緩衝液の直線濃度勾配法により溶出 を行ない、 活性画分を集めた。 本活性画分を未変性ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に供したところ、 単一バンドを形成した。
(実施例 7)
以下の方法に従って、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 155 16株の培養上清からダリオキサールをダリオキシル酸に変換するアルデ ヒドォキシダーゼの精製を行なった。
酵母エキス 10 g、 硫酸アンモニゥム 2 g、 リン酸水素 2カリウム 1 g、 リン酸水素 1ナトリウム 1 g、 硫酸マグネシウム · 7水和物 0. 2 g、 塩 化カルシウム · 2水和物 0. l g (いずれも 1リットル当り） の組成より なる培地 （pH7) 60mlを 500m 1容坂ロフラスコに入れ高圧蒸気 滅菌後、 セルロシミクロビゥム ·セルランス NBRC 15516株を 1白 金耳植菌し、 28°Cで 2日間振とう培養し、 前培養液を得た。 ついで、 5 Lミニジャーに前記組成の培地 3 Lを入れ、 高圧蒸気滅菌後、 前培養液 6 Omlを植菌し、 28°C、 通気 0. 5 V vm、 撹拌 400 r pmで 27時 間培養を行なった。 同様の培養を繰返して得た合計 45 Lの培養液を pH 7に調整し、 遠心分離により 45 Lの培養上清を得た。 得られた培養上清 を撹拌型ウルトラホルダー UHP 150 (ァドパンテック東洋株式会社製 ) を用いて 2. 4 Lに濃縮後、 氷冷下、 撹拌しながら所定量の硫酸アンモ 二ゥムを添加し、 硫酸アンモニゥム 0〜60%飽和の範囲で沈澱するタン パク質を遠心分離により集めた。 得られたタンパク質を 2 OmMリン酸力 リウム緩衝液 （PH7) で溶解し、 充分量の同緩衝液に対して透析を行な つたのち、 同緩衝液で予め平衡化した DE A E—トヨパール 650Mカラ ム （300ml) にチャージし、 塩化ナトリウム 0〜0. 5 Mの濃度勾配 で溶出し、 活性画分を集めた。 この活性画分に硫酸アンモニゥムを終濃度 1Mとなるよう添加し、 予め 1M硫酸アンモニゥムを含む 2 OmMリン酸 カリウム緩衝液 PH7で平衡化した Ph e ny 1一トヨパール 650M ( 6 Oml) にチャージし、 硫酸アンモニゥム 1〜0. 5 Mの直線濃度勾配 で溶出し、 活性画分を集めた。 得られた酵素液を 2 OmMリン酸カリウム 緩衝液 pH 7に透析し、 ついで、 予め同緩衝液で平衡化した R e s o u r c e Q (Am e r s h am Pha rma c i a B i o t e c 社製) カラム （6ml) にチャージし、 塩化ナトリウム 0. 35Mを含む同緩衝 液で洗浄後、 塩ィヒナトリウム 0. 35〜0. 5 Mの直線濃度勾配で溶出し、 活性画分を集めた。 得られた酵素液を限外濾過濃縮し、 0. 15M塩化ナ トリゥムを含む 20 mMリン酸カリゥム緩衝液 p H 7で平衡化した Sup e r d e X 20 OHRカラム （24m 1 ) (Ame r s h am P h a r ma c i a B i o t e c h社製） にチャージし、 同緩衝液で溶出した。 得られた活性画分を用いて S D S一ポリァクリルアミドゲル電気、泳動を行 なった結果、 分子量 9〜10万の単一バンドを形成した。
(実施例 8)
実施例 1記載の方法により得た KNK 235株、 KNK058株の無細 胞抽出液を 0. 05Mリン酸緩衝液 （pH7) で予め平衡化した Re s o u c e Qカラム （6ml) にチャージし、 0〜0. 5 Mの塩化ナトリウ ム直線濃度勾配により溶出を行ない、 活性画分を集めた。 これら KNK2 35株および KNK058株の粗精製酵素液と実施例 4、 5および 7で得 たストレプトミセス ·スピーシ一ズ KNK269株、 ミクロバクテリゥム •スピーシ一ズ KNKO 11株およびセルロシミクロピウム ·セルランス I FOl 5516株から得られた精製酵素を用い、 それらのダリオキサ一 ル、 ダリオキシル酸に対するォキシダーゼ活性を測定した。 酵素活性測定 は 10 OmMリン酸緩衝液 （pH7) 中、 ダリオキサールまたはダリオキ シル酸 10mM、 4-AA0. 67mM、 TOOS 1. 09mM、 POD 2U/m 1、 および KNK 235株および KNKO 58株の粗精製酵素ま たは実施例 4、 5および 7で取得した KNK 269株、 KNKO 11株お よび I F〇 15516株からの精製酵素を含む 1. 0mlの反応液を 30 °Cで反応させ、 波長 555 nmの吸光度の増加を測定することにより行な つた。 各酵素のダリオキサールとダリオキシル酸に対する活性の比較を表 5に示す。 表 5
Figure imgf000036_0001
各酵素ともダリオキシル酸には、 ダリオキサールに比べ低い活性しか示 さなかった。
(実施例 9)
実施例 4で得たストレブトミセス ·スピーシ一ズ KNK269株から得 た酵素の理化学的性質について検討した。 酵素活性の測定は、 基本的には、 実施例 8記載の方法により行なつた。
(至適 pH)
p H 5〜 9の範囲で基質としてダリォキサールを用いて活性測定を行な つた。 その結果を図 2に示す。 至適 pHは 6〜 9であった。
(熱安定性）
0. 05Mリン酸緩衝液 （pH7. 2) 中、 30〜7 Ot:の各温度で 2 0分間処理したのち、 ダリオキサールを基質にして本酵素の残存する活性 測定を行なった。 その結果を図 3に示す。 70°Cの処理で 90%以上の活 性が残存していた。
(実施例 10)
実施例 6で得たシユードモナス ·スピーシーズ KNK058株から得た 酵素の理化学的性質について検討した。 酵素活性の測定は、 基本的には、 実施例 8記載の方法により行なった。
(分子量）
本酵素の分子量は TSK— G3000 SWカラム （東ソ一株式会社製） を用いて測定した場合、 約 15万であった。
(至適温度）
基質としてダリオキサールを用いて、 温度 25〜75 の範囲で活性測 定を行なった。 その結果を図 4に示す。 60〜70°Cの範囲で高い活性を 示した。
(至適 pH)
緩衝液として Mc I 1 V i n e緩衝液、 リン酸緩衝液または T r i c i n e緩衝液を用いて p H 4〜 9の範囲で基質としてダリオキサールを用い て活性測定を行なった。 その結果を図 5に示す。 pH5〜7の範囲で高い 活性を示した。
(実施例 11 )
実施例 4、 5、 6および 7で得たストレプトミセス 'スピ一シ一ズ KN K269株由来酵素、 ミクロバクテリゥム ·スピーシーズ KNK011株 由来酵素、 シユードモナス ·スピーシーズ KNK058株由来酵素、 およ びセルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 15516株由来酵素を用い、 ダリオキサールを基質として反応を行なった。 各株由来の酵素 0. 2U/ ml、 グリオキサール 50mM、 力タラ一ゼ 5000 UZm 1を含む 10 OmMトリス— HC 1緩衝液 lm 1を試験管に加え、 30°C、 3時間振と う反応を行なった。 反応後、 高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ ろ、 KNK269株由来酵素では 7. 6mM、 KNKO 1 1株由来酵素 では 25mM、 KNKO 58株由来酵素では 5. 7mM、 I F01551 6株由来酵素では 26 mMのダリォキシル酸が生成した。
(実施例 12) 以下の方法によりセルロモナス ·夕バタ I F〇 15012株、 セルロモ ナス ·夕バタ I F〇 1 5014株、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I F〇 1 50 13株、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I F〇 15516 株、 セルロシミクロビゥム ·セルランス J CM620 1株、 ミクロバクテ リウム ·スピ一シーズ KNK01 1株の培養菌体のアルデヒドォキシダ一 ゼ活性を測定した。
硝酸アンモニゥム 2 g、 リン酸水素二カリウム 1 g、 リン酸水素ーナト リウム 1. 3 g、 酵母エキス 5 g、 硫酸マグネシウム 7水和物 0. 2 g、 塩化カルシウム 0. 1 g (いずれも 1 Lあたり） pH 7の組成からなる培 地 5m lを大型試験管に分注し、 高圧蒸気殺菌した。 前記の菌株を白金耳 植菌し、 28 で 2日間の前培養を行なった。 ついで、 500ml容坂ロ フラスコ中 60m 1の同培地に、 得られた前培養液を lml植菌し、 28 °Cで 2日間培養した。 得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、 1 00 mMリン酸カリゥム緩衝液 p H 7で 2回洗浄後、 同緩衝液 5. Oml に懸濁した。 本菌体懸濁液 1. 0 m 1に 133 mMダリォキサール水溶液 0. 45ml、 50， 000 U/m 1のカタラーゼ溶液を 0. 05ml添 加し、 試験管中で、 28 で 4時間振とう反応を行ない、 得られた反応液 を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。 その結果、 いずれの菌株 でもグリォキサールからグリォキシル酸が生成していた。
また、 菌体懸濁液 0. 1 m 1を 50 mMグリォキサール、 1. 34mM
4-AA, 2. 18mMTOOS、 4 U/m 1 ペルォキシダ一ゼを含 有する 100 mMリン酸カリゥム緩衝液 0. lmlに添加し、 28でで 2 時間振とうし、 反応液の発色を目視する方法でォキシダーゼ活性の判定を 行なった。 対照としてダリオキサール無添加の同一反応系を同時に行なつ た。 その結果、 いずれの菌株でもダリオキサールを添加した場合のみォキ シダーゼ活性による発色が観察され、 ダリォキサールがォキシダ一ゼによ つて酸化されることが明らかになった。 これらの結果を表 6にまとめた。 表 6
Figure imgf000039_0001
(実施例 13)
実施例 12で調製したミクロパクテリゥム ·スピ一シーズ KNK011 株、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 15516株の培養液上清 を用いてアルデヒドォキシダーゼの菌体外への分泌を確認した。 培養液を 遠心し、 菌体を除いた培養上清をアミコン C e n t r i p 1 u s YM— 10 (MI LL I PORE社製） を用いた限外濾過により濃縮、 緩衝液を 10 OmMリン酸カリウム緩衝液 pH 7に交換し、 12倍濃縮液を調製し た。 こうして得た培養上清濃縮液 0. 1mlを用いて実施例 12と同様に ダリオキサールを基質として発色によるォキシダーゼ活性の判定を行なつ た。 その結果、 表 7に示した通り、 培養上清も菌体懸濁液と同等の酵素活 性を示した。 表 7
反応液の発色
菌株
菌体懸濁液 培養上清濃縮液 セルロシミクロピウム.セルランス IFO 15013 ++++ ++++ ミクロバタテリゥム.スピーシーズ KNK011 +++ +++ (実施例 14)
実施例 4で精製したストレプトミセス ·スピーシーズ KNK269株の アルデヒドォキシダ一ゼのアミノ酸配列を以下の方法で決定した。 酵素を 構成する 3種類のサブュニットを分離するために逆相 HP L Cを用いた。 カラムは YMC— Pa c k PROTE I N— RPカラム （250 X4. 6mm) (YMC社製） を使用し、 移動相には 0. 1%トリフルォロ酢酸 を用い、 精製酵素 300 をチャージしたのち、 ァセロニトリル 0〜5 6% (流速 lml Z分、 110分） の直線濃度勾配で溶出する方法でサブ ユニットを分離した。 保持時間約 85分で分子量 2. 5万 （以下サブュニ ットァ） 、 約 90分で分子量 3. 5万 （以下サブユニット /3) 、 約 92分 で分子量 8万 （以下サブユニット 0；) が溶出された。 分取した各サブュニ ットタンパク質の 1/10を使用して、 P r o t e i n S e q u e n c i n g Sy s t em 490 p r o c i s e (App l i e d B i
0 s y s t ems社製） を用いたエドマン分解法で N末端アミノ酸配列を 決定した。 次に、 各サブユニットタンパク質の内部アミノ酸配列を決定し た。 各サブユニットタンパク質の残り全量を 9 M尿素で変性後、 緩衝液を 0. 3Mトリス塩酸緩衝液 pH9. 0に交換し、 リジルエンドべプチダー ゼで 30°C、 19時間消化した。 分解物を YMC— P a c k PROTE
1 N— RPカラムを用いて逆相 HPLC法により精製した。 移動相に 0.
1 %トリフルォロ酢酸を用い、 ァセロニトリル 10〜48%までの直線濃 度勾配でペプチドを溶出した。 溶出した各ピークを分取し、 同様の方法で サブュニット内部のアミノ酸配列を決定した。 得られたアミノ酸配列のう ち主なものを配列番号 15〜20に示した。
(実施例 15 )
決定した部分アミノ酸配列をもとにミックスト DNAプライマ一 （配列 番号 21〜26) を合成し、 ストレプトミセス ·スピーシーズ KNK 26 9株のゲノム DNAを铸型として、 TAKARA LA Ta q DNA ポリメラーゼ （宝酒造株式会社製） を用い、 GC緩衝液 （宝酒造株式会社 製） 中で PC Rを行なった。 得られた増幅 DNAをァガロースゲル電気泳 動し、 Q I Aqu i c k Ge l E x t r a c t i o nキット （Q I A GEN社製） を用いてバンドを形成した DNAを抽出した。 得られた DN Aを用いて、 直接シークェンシング、 または pT7B l u e— 2 (Nov a g e n社製） に T Aクローニングしたのち、 プラスミドを用いて DNA シークェンシングを行ない、 塩基配列を決定した。 配列番号 2 1〜26に 示したプライマー (1) と (2) 、 (3) と (4) および （5) と (6) の組合せで PCRを行なって得られた増幅 DNAの配列をアミノ酸に変換 し、 実施例 14で決定したアミノ酸配列と照合し、 整列した結果、 3種類 のサブユニットをコードする遺伝子は、 上流からァ、 a, /3の順にゲノム 上に隣接、 または一部重複して存在していた。 ミックストプライマー部分 の塩基配列決定には周辺の塩基配列をプライマーとして用いて同様の方法 で決定した。 こうしてサブユニットァ、 , j3の全遺伝子をコ一ドするゲ ノム領域のうちサブユニットァの N末端近傍とサブユニット αの C末端近 傍を除いた全塩基配列を決定した。 得られた塩基配列から導かれたァミノ 酸配列は実施例 14で得られた各サブュニットの部分アミノ酸配列と完全 に一致した。 決定したサブユニットァ、 a, j3のアミノ酸配列を配列番号 ：!〜 3に、 塩基配列を配列番号 4〜 6に示した。 配列番号 1および 4は、 それぞれ、 サブユニットアの精製タンパク質の N末端以降のアミノ酸配列、 および G 1 u 12から終止コドンまでの塩基配列を示している。 配列番号 2および 5は、 それぞれ、 サブュニット βの全アミノ酸配列、 および開始 コドンから終止コドンまでの全塩基配列を示している。 配列番号 3および 6は、 それぞれ、 サブユニット の Me t 1から Th r 693までのアミ ノ酸配列、 および開始コドンから A r g 685までの塩基配列を示してい る。 配列番号 18に示す精製した KNK 269株由来酵素のサブュニット αの N末端アミノ酸配列は、 遺伝子配列から決定した配列番号 3のァミノ 酸配列の A 1 a 5から始まっていた。
(実施例 16)
実施例 5で精製したミクロパクテリゥム ·スピーシーズ KNK011株 アルデヒドォキシダーゼのアミノ酸配列を決定した。 限外濾過膜を用いて 脱塩した精製酵素 1 O^gを使用し、 実施例 14で用いたのと同様の方法 で N末端アミノ酸配列を決定した。 次に、 タンパク質内部のアミノ酸配列 を決定するため、 精製酵素のプロテア一ゼ消化ペプチドのアミノ酸配列決 定を行なった。 精製酵素 100 ^ gを 9 M尿素で変性後、 緩衝液を 0. 2 Mトリス塩酸緩衝液 p H 9. 0に交換し、 リジルェンドぺプチダ一ゼで 3 0°C、 16時間消化した。 こうして得た消化ペプチド混合物を YMC— P a c k PROTE I N— RPカラム （250 X4. 6mm) を用いた逆 相 HPLCにより実施例 14と同様の方法で分離した。 溶出した各ピーク を分取し、 同様の方法でアミノ酸配列を決定し、 酵素タンパク質の内部部 分アミノ酸配列を決定した。 得られたアミノ酸の主なものを配列番号 27 〜29に示した。
(実施例 17)
決定した部分ァミノ酸配列をもとにミックスト DNAプライマー （配列 番号 30〜33) を合成し、 ミクロバクテリウム ·スピーシーズ KNK0
11株のゲノム DN Aを錶型として実施例 15と同様の方法で PC Rを行 なった。 増幅 DNAをァガロースゲル電気泳動し、 Q I AQ u i c k G e l Ex t r a c t i o nキット （Q I AGEN社製） を用いてパンド を形成した DNAを抽出し、 直接、 または pT 7 B 1 u e— 2に TAクロ 一二ングしたのち、 DN Aシークェンシングを行なって塩基配列を決定し た。 配列番号 30〜 33のプライマ一 （1) と （2) 、 (3) と （4) の 組合せの P CRから得られた塩基配列とアミノ酸配列を照合し、 実施例 1 5と同様の方法によつて精製酵素の N末端と C末端周辺を除く約 2. 8 k bの塩基配列を決定した。 精製酵素 N末端と C末端周辺の塩基配列決定は、 インバース PC R法によって行なった （C e 1 1 S c i enc e 19 90、 Vo l. 6 No. 5 370 - 376参照） 。 ゲノム DNAを各 種の制限酵素で処理したのち、 終濃度 2. 5 ng/mlでセルフライゲ一 ションし、 各末端近傍の塩基配列から合成したプライマーを用いて PCR を行なった。 得られた増幅 DNAを pT 7 B 1 u e— 2にライゲーシヨン したのち、 同様に塩基配列を決定した。 ゲノム DNAの P vu I消化物を 用いたインパース PC Rで得られた約 650塩基の増幅バンドから開始コ ドン上流から精製酵素の N末端下流の配列、 Ap a I消化物を用いたイン バース PC Rで得られた約 1. 9 k塩基の増幅バンドから終止コドン周辺 の塩基配列を決定した。 こうして決定した開始コドンから終止コドンまで の遺伝子全長は 3348塩基、 アミノ酸配列にして 1115残基であった。 この塩基配列から導かれたァミノ酸は精製酵素のァミノ酸配列分析で得ら れたアミノ酸配列と完全に一致していた。 一方、 菌体から精製した酵素の N末端は、 開始コドン Me t 1から数えて 47番目の V a 1であった。 ミ クロバクテリゥム ·スピ一シ一ズ KNK011株は培養液上清にも同一の 酵素を産生していることから、 Me t 1から A l a 46間は分泌シグナル 配列として分泌過程で切断されることが明らかになった。 決定した酵素夕 ンパク質、 酵素遺伝子の全アミノ酸配列、 全塩基配列を配列番号 7、 9に 示した。 分泌後の成熟型酵素の全アミノ酸配列とこれをコードする塩基配 列を配列番号 8、 10に示した。
(実施例 18 )
実施例 17で遺伝子配列を決定したミクロパクテリゥム ·スピーシーズ KNK011株のアルデヒドォキシダーゼの遺伝子を発現用ベクターにク ローニングし、 発現実験を行なった。 A 1 a 46のコドンを開始コドン a t gに置換し、 制限酵素 Nde I認識配列を付加した合成プライマー （配 列番号 34 ) と終止コドン下流 63 ~ 68塩基に制限酵素 E c o R I認識 配列を付加した相補配列の合成プライマー （配列番号 35) を用い、 ミク ロバクテリウム ·スピ一シーズ KNK011株のゲノム DNAを铸型にし た PCRを行ない、 約 3. 7 kbの増幅バンドを得た。 このバンドを形成 した DN Aをァガロースゲル電気泳動し、 Q I Aqu i c k Ge l E x t r a c t i o nキット （Q I AGEN社製） を用いて抽出し、 Nde Iおよび E c oR Iで消化した。 消化 DNAをァガロースゲル電気泳動し て同様に抽出し、 Nd e Iおよび Ec oR I消化した発現べクタ一 pUC NT (特開 2003- 116552) にライゲ一ションし、 E. コリ DH 5ひに形質転換した。 得られた形質転換株をアンピシリン 100 / gを含 む LB培地で一晩培養後、 新しい同培地に継植して培養し、 2時間後に 1 mMの I PTGを添加して 5時間培養後、 培養菌体を S D S処理して全夕 ンパク質の SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった結果、 約 11 kD aの位置に酵素タンパク質のバンドが確認できた。
(実施例 19)
実施例 7で得られたセルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 1551 6株のアルデヒドォキシダ一ゼを用いてアミノ酸配列の決定を行なった。 限外濾過膜を用いて脱塩した精製酵素 10 gを使用し、 プロティンシー クェンシングシステム モデル 490プロサイズ （App l i e d B i o s y s t ems社製） を用いてアミノ酸配列を決定した。 次に、 精製酵 素 100 gを 9 M尿素で変性後、 緩衝液を 0. 2 Mトリス塩酸緩衝液 p H9. 0に交換し、 リジルエンドべプチダ一ゼで 30°C、 16時間消化し た。 分解物を YMC— P a c k PROTE I N— ; RPカラム （YMC社 製） を用いて逆相 HP LC法により精製した。 移動相に 0. 1%トリフル ォロ酢酸を用い、 ァセロニトリル 10〜55%までの直線濃度勾配でぺプ チドを溶出した。 溶出した各ピ一クを分取し、 同様にタンパク質内部のァ ミノ酸配列を決定した。 得られたアミノ酸配列の主なものを配列番号 36 〜38に示した。
(実施例 20)
実施例 19で決定した部分ァミノ酸配列をもとに合成したミックスト D NAプライマ一 （配列番号 39〜41) 、 およびミクロバクテリウム ·ス ピ一シ一ズ KNK011株のアルデヒドォキシダ一ゼの遺伝子の 2521 〜2545塩基の相補鎖 DNAのミックスト DNAプライマ一 （配列番号 42) を用いて、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I F〇 15516株 のゲノム DNAを铸型として PCRを行なった。 配列番号 39〜42のプ ライマー （1) と （2) 、 (3) と （4) の組合せの PC Rで得られた増 幅 DNAをァガロースゲル電気泳動し、 Q I Aq u i c k Ge l Ex t r a c t i onキット （Q IAGEN社製） を用いてバンドを形成した DNAを抽出した。 これらの DNAを、 直接、 または pT7B l ue— 2 に TAクローニングしたのち、 DNAシークェンシングを行なって塩基配 列を決定した。 得られた塩基配列を、 アミノ酸配列と照合し、 実施例 15 と同様の方法によって精製酵素の N末端と C末端周辺を除く約 2. 5 kb の塩基配列を決定した。 精製酵素 N末端と C末端周辺の塩基配列決定は実 施例 17と同様にインバース PCR法によって行なった。 ゲノム DNAを 各種の制限酵素で処理したのち、 終濃度 2. 5ng/mlでセルフライゲ ーシヨンし、 各末端近傍の塩基配列から合成したプライマ一を用いて PC Rを行なった。 得られた増幅 DNAを pT7 B 1 u e - 2にライゲ一ショ ンしたのち、 同様に塩基配列を決定した。 ゲノム DNAの Na e I消化物 を用いたィンバース P C Rで得られた約 1 k bの増幅バンドから開始コド ン上流から精製酵素の N末端下流の配列、 Nc o I消化物を用いたインバ ース P C Rで得られた約 1 . 1 k bの増幅バンドから終止コドン周辺の塩 基配列を決定した。 こうして決定した開始コドンから終止コドンまでの遺 伝子全長は 3 3 2 4塩基、 アミノ酸配列にして 1 1 0 7残基であった。 こ の塩基配列から導かれたアミノ酸は精製酵素のアミノ酸配列分析で得られ たアミノ酸配列と完全に一致していた。 菌体から精製した酵素の N末端は、 開始コドン M e t 1から数えて 3 9番目の A s pであった。 培地中に分泌 された酵素では M e t 1から A 1 a 3 8は分泌シグナル配列として分泌過 程で切断されていた。 決定した酵素タンパク質、 酵素遺伝子の全アミノ酸 配列、 全塩基配列を配列番号 1 1、 1 3に示した。 分泌後の成熟型酵素の 全アミノ酸配列とこれをコードする塩基配列を配列番号 1 2、 1 4に示し た。 産業上の利用可能性
本発明による微生物、 酵素を用いたダリオキサールからのダリオキシル 酸の製造方法によれば、 温和な条件でダリォキシル酸を製造することが可 能であり、 従来の硝酸酸化法などの化学的合成方法で問題点であつた大量 の塩類の生成などなくグリォキシル酸を製造できる。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 ： ：アルデヒドォキシダ- -ゼのサブュニニットァのアミノ酸配列 配列番号 2 ： ：アルデヒドォキシダ -ゼのサブュニニット jSのアミノ酸配列 配列番号 3 ：アルデヒドォキシダ- -ゼのサブュ：:ニットひのアミノ酸配列 配列番号 4 ：アルデヒドォキシダ- -ゼのサブュニニットァの D N A配列 配列番号 5 ：アルデヒドォキシダ -ゼのサブュ：: ：ット )3の D NA配列 配列番号 6 ：アルデヒドォキシダ -ゼのサブュニニット αの D NA配列 配列番号 7 ：シグナルべプチドを含むアルデヒドォキシダーゼのァミノ酸 配列
配列番号 8 ：アルデヒドォキシダ一ゼのアミノ酸配列
配列番号 9 ：シグナルペプチドを含むアルデヒドォキシダーゼの DN A配 列
配列番号 10 ：アルデヒドォキシダーゼの DN A配列
配列番号 1 1 ：シグナルペプチドを含むアルデヒドォキシダ一ゼのァミノ 酸配列
配列番号 12 ：アルデヒドォキシダ一ゼのアミノ酸配列
配列番号 13 ：シグナルペプチドを含むアルデヒドォキシダーゼの DNA 配列
配列番号 14 ：アルデヒドォキシダ一ゼの DN A配列
配列番号 15 ：アルデヒドォキシダーゼのサブュニット γの Ν末端アミノ 酸配列
配列番号 16 ：アルデヒドォキシダーゼのサブュニット βの Ν末端アミノ 酸配列
配列番号 1 7 ：アルデヒドォキシダーゼのサブュニット βのアミノ酸配列
(A l a 231〜A l a 266)
配列番号 18 ：アルデヒドォキシダーゼのサブュニット aの N末端アミノ 酸配列
配列番号 19 ：アルデヒドォキシダーゼのサブュニットひのアミノ酸配列
(L e u 26 1〜G 1 u 298)
配列番号 20 ：アルデヒドォキシダーゼのサブュニットひのアミノ酸配列
(G 1 y 659〜Th r 693)
配列番号 21 ：ストレブトミセス ·スピ一シ一ズ KNK269株のアルデ ヒドォキシダ一ゼのサブュニット Ύの N末端アミノ酸配列に対応するミツ クスト DNAプライマー （1) 配列番号 22 ：ストレブトミセス ·スピ一シーズ KNK269株のアルデ ヒドォキシダーゼのサブュニット βのアミノ酸配列 （A s ρ 251〜Α 1 a 258) に対応する相補的なミックスト DNAプライマ一 （2) 配列番号 23 ：ストレプトミセス ·スピ一シーズ KNK269株のアルデ ヒドォキシダーゼのサブュニット βのアミノ酸配列 （A s ρ 251〜Α 1 a 258) に対応するミックスト DNAプライマ一 （3)
配列番号 24 ：ストレプトミセス ·スピーシーズ KNK269株のアルデ ヒドォキシダ一ゼのサブュニット αのアミノ酸配列 （L e u 274〜G 1 u 281) に対応する相補的なミックスト DNAプライマー （4) 配列番号 25 ：ストレプトミセス ·スピーシーズ KNK269株のアルデ ヒドォキシダ一ゼのサブュニットひのアミノ酸配列 （L e u 274〜G 1 u 281) に対応するミックスト DNAプライマー （5)
配列番号 26 ：ストレプトミセス ·スピ一シ一ズ KNK269株のアルデ ヒドォキシダ一ゼのサブュニット aのアミノ酸配列 （L e u 686〜G 1 u 693) に対応する相補的なミックスト DNAプライマー （6) 配列番号 27 ：アルデヒドォキシダーゼの N末端アミノ酸配列
配列番号 28 ：アルデヒドォキシダ一ゼの内部アミノ酸配列
配列番号 29 ：アルデヒドォキシダ一ゼの内部アミノ酸配列
配列番号 30 ：ミクロパクテリゥム ·スピーシーズ KNK011株由来の アルデヒドォキシダ一ゼの N末端アミノ酸配列に対応するミックスト DN
Aプライマー （1)
配列番号 31 ：ミクロパクテリゥム ·スピーシーズ KNK011株由来の アルデヒドォキシダーゼのアミノ酸配列 （As p 513〜Phe 521) に対応する相補的なミックスト DNAプライマ一 （2)
配列番号 32 ：ミクロパクテリゥム 'スピ一シーズ KNK011株由来の アルデヒドォキシダーゼのアミノ酸配列 （As p 513〜Phe 521) に対応するミックスト DN Aプライマー (3)
配列番号 33 ：ミクロバクテリゥム 'スピーシーズ KNK011株由来の アルデヒドォキシダ一ゼのアミノ酸配列 （Ph e 959〜Th r 969) に対応する相補的なミックスト DNAプライマ一 （4)
配列番号 34 ：ミクロバクテリウム ·スピーシ一ズ KNK011株由来の アルデヒドォキシダ一ゼの、 クローニングのための N d e I制限部位を含 む DNAプライマ一
配列番号 35 ：ミクロパクテリゥム ·スピーシーズ KNK011株由来の アルデヒドォキシダーゼの、 クローニングのための E c o R I制限部位を 含む DNAプライマ一
配列番号 36 ：アルデヒドォキシダーゼの N末端アミノ酸配列
配列番号 37 ：アルデヒドォキシダ一ゼの内部アミノ酸配列
配列番号 38 ：アルデヒドォキシダーゼの内部アミノ酸配列
配列番号 39 ：セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 15516株由 来のアルデヒドォキシダーゼの N末端アミノ酸配列に対応するミックスト
DNAプライマー （1)
配列番号 40 ：セルロシミクロビゥム ·セルランス I F015516株由 来のアルデヒドォキシダ一ゼのアミノ酸配列 （I 1 e 350〜Va 1 35 8) に対応する相補的なミックスト DNAプライマー （2)
配列番号 41 ：セルロシミクロピウム ·セルランス I F〇 15516株由 来のアルデヒドォキシダ一ゼのアミノ酸配列 （Th r l 76〜Th r l 8 3) に対応するミックスト DNAプライマ一 （3)
配列番号 42 ：ミクロバクテリウム ·スピ一シ一ズ KNK011由来のァ ルデヒドォキシダ一ゼの DNA配列 （2521〜 2545) に対応する相 補的なミックスト DNAプライマー （4)

Claims

言青求の範囲
1. ダリォキサールをダリォキシル酸へ変換する能力を有する酸化還元酵 素、 または該酸化還元酵素の産生能を有する微生物の培養液、 培養液上 清、 菌体および菌体処理物のいずれか 1種もしくは 2種以上のそれらの 混合物をダリオキサールに作用させ、 ダリオキシル酸へ変換することを 特徴とするダリオキシル酸の製造方法。
2. 前記酸化還元酵素がォキシダ一ゼである請求の範囲第 1項記載のダリ ォキシル酸の製造方法。
3. 前記酸化還元酵素がステノトロフォモナス属、 ス卜レブトミセス属、 シユードモナス属、 ミクロバクテリウム属、 ァクロモバクタ一属、 セル 口モナス属、 セルロシミクロピウム属、 モルガネラ属からなる群から選 ばれる少なくとも 1つの微生物から得られた酵素である請求の範囲第 1 項または第 2項記載のダリォキシル酸の製造方法。
4. 前記微生物が、 ステノトロフォモナス 'スピ一シーズ KNK235 ( FERM P— 19002) 、 ストレプトミセス ·スピ一シ一ズ KNK 269 (FERM BP— 08556) 、 シユードモナス ·スピ—シー ズ KNK058 (FERM BP— 08555) 、 シユードモナス -ス ピ一シ一ズ KNK254 (FERM P— 19003) 、 ミクロバクテ リウム .スピ一シーズ KNK011 (FERM BP— 08554) 、 ァクロモバクタ一 ·スピ一シーズ I FO 13495、 セルロモナス ' スピーシーズ J CM 2471、 セル口モナス ·夕バタ I F〇 150 12、 セルロモナス ·タバ夕 I FO 15014、 セルロモナス ·夕バ 夕 I FO 15015、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 1 5013、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 15516、 セ ルロシミクロピウム ·セルランス J CM 6201、 モルガネラ 'モル ガニイ I FO 3848である請求の範囲第 3項記載のダリオキシル酸 の製造方法。
5. 反応時に力夕ラーゼを共存させる請求の範囲第 1項記載のダリオキシ ル酸の製造方法。
6. ダリオキサールに作用し、 グリオキシル酸を生成する微生物由来アル デヒドォキシダーゼ。
7. ダリォキシル酸に対する活性が、 ダリォキサールに対する活性の 1 Z 10倍以下の活性である請求の範囲第 6項記載のアルデヒドォキシダー ゼ。
8. 前記アルデヒドォキシダ一ゼが、 ステノトロフォモナス属、 ストレブ トミセス属、 シユードモナス属、 ミクロバクテリウム属、 ァクロモバク 夕一属、 セル口モナス属、 セルロシミクロピウム属、 モルガネラ属から なる群から選ばれる少なくとも 1つの微生物が産生する請求の範囲第 6 項または第 7項記載のアルデヒドォキシダーゼ。
9. 前記微生物が、 ステノトロフォモナス ·スピ一シーズ KNK235 ( FERM P— 19002) 、 ストレプトミセス 'スピーシ一ズ KNK 269 (FERM BP— 08556) 、 シュ一ドモナス 'スピ一シ一 ズ KNK058 (FERM BP— 08555) 、 シユードモナス 'ス ピーシーズ KNK254 (FERM P— 19003) 、 ミクロバクテ リウム ·スピーシーズ KNK011 (FERM BP— 08554) 、 ァクロモバク夕一 ·スピーシーズ I F〇 13495、 セルロモナス · スピ一シーズ J CM 2471、 セル口モナス ·タバ夕 I F〇 150 12、 セルロモナス ·夕バタ I FO 15014、 セルロモナス ·タバ 夕 I F〇 15015、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I F〇 1 5013、 セルロシミクロビゥム ·セルランス I FO 15516、 セ ルロシミクロピウム ·セルランス J CM 6201、 モルガネラ，モル ガニイ I FO 3848である請求の範囲第 8項記載のアルデヒドォキ シダ一ゼ。
10. 以下 （1) 〜 （3) の理化学的性質を有するストレプトミセス属微生 物が産生する請求の範囲第 8項記載のアルデヒドォキシダ一ゼ。
(1) 至適 pH： 6〜9
(2) 熱安定性： pH 7. 2で 60°C、 20分処理したのち、 90 %以 上の活性を保持している
(3) 分子量：ゲル濾過分析において約 11万であり、 SDS—ポリア クリルアミドゲル電気泳動分析において、 約 2. 5万、 約 3. 5万、 約 8万の 3つのサブュニッ卜タンパク質を有する
11. 以下 （1) 〜 （3) の理化学的性質を有するシユードモナス属に属す る微生物が産生する請求の範囲第 8項記載のアルデヒドォキシダーゼ。
( 1 ) 分子量：ゲル濾過分析において約 15万
(2) 反応至適温度： 60〜70°C
(3) 反応至適 pH： 5〜7
12. 以下の理化学的性質を有するミク口パクテリゥム属微生物が菌体内お よび菌体外に産生する請求の範囲第 8項記載のアルデヒドォキシダーゼ。 分子量： SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 1 1 万の単一タンパク質
13. 以下の理化学的性質を有するセルロシミク口ピウム属微生物が菌体内お よび菌体外に産生する請求の範囲第 8項記載のアルデヒドォキシダーゼ。 分子量： SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 9〜 10万の単一タンパク質
14. ストレプトミセス属に属する微生物がストレプトミセス ·スピーシ一 ズ KNK269 (FERM B P— 08556 ) である請求の範囲第 1 0項記載のアルデヒドォキシダ一ゼ。
15. シユードモナス属に属する微生物がシユードモナス ·スピ一シ一ズ K NK058 (FERM BP— 08555) である請求の範囲第 1 1項 記載のアルデヒドォキシダーゼ。
16. ミクロバクテリウム属に属する微生物がミクロバクテリゥム ·スピー シ一ズ KNK011 (FERM B P— 08554) である請求の範囲 第 12項記載のアルデヒドォキシダーゼ。
17. セルロシミクロピウム属に属する微生物がセルロシミクロピウム ·セ ルランス I FO 15516である請求の範囲第 13項記載のアルデヒ ドォキシダーゼ。
18. 以下の （a) または （b) のタンパク質をサブユニットとして有する 請求の範囲第 6項記載のアルデヒドォキシダ一ゼ。
(a) 配列番号 1、 2もしくは 3で表されるアミノ酸配列からなるタン パク質
(b) アミノ酸配列 （a) において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列のいずれか 1つを含むタンパク質
19. 以下の （a) または （b) の DNAによってコードされるタンパク質 をサブユニットとして有する請求の範囲第 6項記載のアルデヒドォキシ タ一ゼ。
(a) 配列番号 4、 5もしくは 6の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる D N Aのいずれか 1つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA
20. 以下の （a) または （b) のアミノ酸配列からなる請求の範囲第 6項 記載のアルデヒドォキシダーゼ。
(a) 配列番号 7、 8、 11もしくは 12で表されるアミノ酸配列
(b) アミノ酸配列 （a) において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列
21. 以下の （a) または （b) の DNAによってコードされる請求の範囲 第 6項記載のアルデヒドォキシダーゼ。
(a) 配列番号 9、 10、 13もしくは 14の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N A
22. 以下の （a) または （b) のいずれかを含んでなる、 請求の範囲第 6 項記載のアルデヒドォキシダーゼのサブュニットをコードする DNA。
(a) 配列番号 4、 5もしくは 6の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる D N Aのいずれか 1つとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNA
23. 以下の （a) または （b) のいずれかを含んでなる、 請求の範囲第 6 項記載のアルデヒドォキシダ一ゼをコードする DNA。
(a) 配列番号 9、 10、 13もしくは 14の塩基配列からなる DNA
(b) (a) の塩基配列からなる DNAと相補的な塩基配列からなる D N Aのいずれか 1つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA
24. 配列番号 1、 2または 3で表わされるアミノ酸配列において 1または 数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列のいずれか を含んでなる、 請求の範囲第 6項記載のアルデヒドォキシダ一ゼのサブ ュニットをコードする DNA。
25. 配列番号 7、 8、 11または 12で表わされるアミノ酸配列において 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列の いずれかを含んでなる、 請求の範囲第 6項記載のアルデヒドォキシダ一 ゼをコードする DNA。
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