WO2004070044A1 - Micro-organismes photosynthetiques enrichis en molecules biologiquement actives, leur procede de preparation, et leurs utilisations - Google Patents

Micro-organismes photosynthetiques enrichis en molecules biologiquement actives, leur procede de preparation, et leurs utilisations Download PDF

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Peggy Hours-Linares
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Peggy Hours-Linares
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    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present invention describes a process allowing trace elements and biologically active molecules to be internalized by photo synthetic microorganisms (cyanobacteria and microalgae) in order to propose vectors of drugs or biologically active molecules allowing, by their qualities a reduction in the side effects of these products, a buffering effect and their complementation by an intake of vitamins, essential fatty acids and anti-free radicals.
  • photo synthetic microorganisms cyanobacteria and microalgae
  • microorganisms are cyanobacteria and / or fractions of cyanobacteria, and / or microalgae and / or fractions of microalgae.
  • MOP Photosynthetic Microorganisms
  • the associated drugs can be metal ions (such as trace elements), or complex biologically active molecules of natural or synthetic origin (such as analgesics, antibiotics, anticancer drugs, steroid hormones, antivirals, bioactive peptides, phenolic compounds , phorbo-esters, polyamines, etc ...), molecules which cause unwanted side reactions.
  • MOPs contain two types of microorganisms belonging to two different kingdoms. Cyanobacteria are prokaryotes (reign of bacteria) while unicellular algae are eukaryotic plants.
  • spirulina Arthrospira platensis, SpiruUna major
  • Nostoc which are already consumed by humans
  • Synechocystis Synechococcus, which are single-celled and perform very well in industrial culture.
  • chlorella Chlamydomonas, Scenedesmus, Haematococcus, Dunaliella, Chlorococcum, Nanochloropsis, Rhodella, Rhodosorus, Porphyridium and Tetraselmis which are unicellular microalgae. All these species can be cultivated under artificial conditions, in closed environments and controlled from the point of view of physico-chemical parameters and microbiological quality.
  • MOPs provide biologically active molecules (vitamins, essential lipids, polysaccharides, pigments, proteins ”) which have beneficial actions on the healthy and sick organism. Some of these components have special properties.
  • the polysaccharides extracted from these photosynthetic microorganisms contain carboxyl and sulphate functions, ionizable and reactive functions which allow the ionic or chemical fixation of molecules.
  • glucuronic acid plays a very important role in mammals by allowing the elimination of toxic molecules possessing an alcohol function, for example phenol or mo hine.
  • Certain sugars are sulphated and this sulphate function makes it possible to trap the divalent positive ions. This is precisely the case for most trace elements, essential metals. But this is also the case for toxic metals such as lead and mercury.
  • Sulphated polysaccharides have significant biological activities in mammals: anti-thrombic, anti-viral, anti-inflammatory, immunomodulatory, anti-metastatic ...
  • Polysaccharides constitute a filter and a place of storage of active molecules which allows the control of their internalization.
  • MOPs are rich in linoleic acid and gamma-linolenic acid of cis form (only biologically active form), which are essential lipids not synthesized by animals. They are necessary for normal growth, skin development, gestation and lactation, transport of cholesterol, synthesis of progesterones. The oxidation of unsaturated lipids is inhibited by vitamin K which is also found in MOPs. Carotenoids have anti-free radical activity, and anti-cancer and anti-inflammatory activities are reported in scientific publications. Beta-carotene is provitamin A.
  • phycobiliproteins which represent a significant proportion of the dry weight in cyanobacteria and red microalgae, have. activities recognized as anti-radical, immuno-modulating and anti-inflammatory. Mention may also be made of the superoxide dismutase present in MOPs.
  • MOPs a set of interesting qualities for use as a co-drug in human medicine, veterinary medicine, cosmetics, or as a dietary supplement.
  • a set of cofactors such as phycobiliproteins and carotenoids • exerting anti-radical and anti-inflammatory activities, increases tolerance to particularly aggressive drugs such as antibiotics, antifungals, anticancer e
  • the present invention essentially stems from the discovery by the inventors of the fact that MOPs are capable of fixing the abovementioned biologically active molecules to internalize them, and of transporting these molecules while protecting them towards their target cells, thus avoiding the phenomena of peaks of these molecules, and the possible side effects of the latter, without altering the chemical structures and the biological effects of said molecules.
  • the subject of the invention is a process for the preparation of whole or ground photosynthetic microorganisms (MOPs) in association with one or more biologically active molecules which are fixed and / or internalized in the above-mentioned MOPs, characterized in that it comprises a stage of culture of said microorganisms in an appropriate culture medium, to make it possible to obtain a high biomass, and a stage of physiological induction of the fixing or the internalization of said molecules in MOPs, by incubation of these MOPs with a solution comprising sodium chloride NaCl at a concentration of between 0.2 and 1 M, in particular 0.5 M.
  • the invention relates more particularly to a process for the preparation of whole photosynthetic microorganisms enriched with biologically active molecules as defined above, characterized in that it comprises the following stages:
  • Microalgae are cultivated in photobioreactors in the environments which are most favorable to them in order to obtain a large biomass. Shortly before the stationary phase, the MOPs are harvested and concentrated by filtration. They are then incubated in concentrated form for 1 to 12 hours in a specific culture medium intended to induce modifications.
  • the physiological induction medium contains the biologically active molecule (s).
  • a physiological induction medium based on sea water will advantageously be used to create a salt shock.
  • the whole cells are then harvested by filtration and dried by lyophilization (freeze-drying), atomization (spray-drying) or desiccation to be preferably packaged in the form of capsules. Only active molecules attached or complexed to microalgae will therefore be useful.
  • the use of the physiological induction medium promotes the destructuring of the polysaccharides of the wall to allow the integration of these molecules either in the membrane system or in the organelles.
  • the invention also relates to a process for the preparation of ground photosynthetic microorganisms enriched with biologically active molecules according to claim 1, characterized in that it comprises the following steps:
  • This variant is used to obtain a preparation containing a known quantity of active product (therefore with a therapeutic objective), while benefiting from the beneficial contribution of the induced MOPs.
  • the choice of MOP in this case depends on the desired effect and on the biodegradability of the active molecule.
  • This variant of the process also allows the use of other components of the cell, in particular proteins and lipids as vectors for drugs and / or ions, and to obtain better protection against side effects of certain drugs.
  • the microalgae are cultivated in photobioreactors in the media which are favorable to them and harvested at the end of the growth phase by filtration, washed and induced in a suitable medium then are reconcentrated in physiological buffer to be mechanically ground.
  • To the ground material is added with gentle stirring biologically active molecules in known quantity which can be natural (obtained by aqueous extraction of plants) or synthetic.
  • This incubation lasts 1 to 8 hours at 4 degrees Celsius.
  • incubation is carried out in the dark.
  • the solution is then dried either by spray-drying or by freeze-drying to be packaged in capsules. In this case, all of the active molecules will be present in the extract.
  • the invention also relates to a method as defined above, characterized in that:
  • the MOPs are chosen from cyanobacteria, such as Arthrospira, SpiruUna, Nostoc, Synechocystis, Synechococcus, or from unicellular micro-algae, such as Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Hematococcus, Nanochloropsis, Porphyridium, Rhodella ,
  • the biologically active molecules are chosen from trace elements, essential amino acids, lipids, vitamins, analgesics, antibiotics, anti-cancer drugs, anti-inflammatories, antivirals, hormones, beta- blockers, antiarrhythmics, anti-parasitics, bioactive peptides, of natural or synthetic origin, polyamines.
  • the invention more particularly relates to a process as defined above, characterized in that: - the MOPs are chosen from Arthrospira, SpiruUna, Chlamydomonas, Chlorella,
  • - and the biologically active molecules are chosen from:
  • anti-inflammatory drugs such as acetylsalicylic acid or its derivatives, anti-cyclooxygenase 2, .
  • vitamins such as vitamin C
  • antivirals such as 3'Azido-3'deoxythymidine (AZT) or its derivatives, ribavirin,
  • antibiotics such as macrolides, or sulfonamides
  • anti-cancer drugs such as vinblastine, or taxol derivatives
  • trace elements and divalent metals such as chromium, copper, iron, magnesium, manganese, molybdenum, selenium, zinc,
  • bioactive peptides such as peptide hormone analogs, neuropeptides,. polyamines, such as thioproline.
  • the invention also relates to the application of the methods as defined above, to the preparation of pharmaceutical compositions for human or veterinary use, of cosmetic compositions, or of food supplements, comprising whole or ground photosynthetic microorganisms (MOP) enriched in one or more biologically active molecules as defined above.
  • MOP photosynthetic microorganisms
  • the invention further relates to photosynthetic microorganisms (microalgae or cyanobacteria) enriched with biologically active molecules as defined above, characterized in that the proportion of said molecules linked to the wall of the microorganism, or accumulated inside the micro-organism, or integrated into one of the components of the micro-organism cell, or linked to the constituents of the ground material of the micro-organism, represents at least about 50% of the quantity of said molecules used for setting. implementation of the method and its variant.
  • the invention relates to all photosynthetic microorganisms (MOP) (microalgae or cyanobacteria) enriched in biologically active molecules as defined above, characterized in that:
  • the MOPs are chosen from cyanobacteria, such as Arthrospira, SpiruUna, Nostoc, Synechocystis, Synechococcus, or from unicellular micro-algae, such as Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Hematococcus, Nanochloropsis, Porphyridium, Rhodella , - and the biologically active molecules are chosen from trace elements, essential amino acids, lipids, vitamins, analgesics, antibiotics, anti-cancer drugs, anti-inflammatories, antivirals, hormones, beta -blockers, antiarrhythmics, antiparasitics, bioactive peptides, of natural or synthetic origin, and polyamines.
  • the subject of the invention is more particularly the photosynthetic microorganisms enriched in biologically active molecules as defined above, characterized in that:
  • the MOPs are chosen from Arthrospira, SpiruUna, Chlamydomonas, Chlorella, Tetraselmis, or Scenedesmus,
  • - and the biologically active molecules are chosen from:
  • anti-inflammatory drugs such as acetylsalicylic acid or its derivatives, anti-cyclooxygenase 2,
  • vitamins such as vitamin C
  • antivirals such as 3'Azido-3'deoxy ymidine (AZT) or its derivatives, ribavirin,
  • antibiotics such as macrolides, or sulfonamides
  • anti-cancer drugs such as vinblastine, or taxol derivatives
  • trace elements and divalent metals such as chromium, copper, iron, magnesium, manganese, molybdenum, selenium, zinc,
  • bioactive peptides such as peptide hormone analogs, neuropeptides,
  • polyamines such as thioproline.
  • the invention also relates to any pharmaceutical, veterinary, cosmetic, or dietary supplement composition, characterized in that they comprise photosynthetic microorganisms enriched with biologically active molecules such as. defined above, in association with a physiologically acceptable vehicle. ..
  • compositions of the invention are in a form which can be administered orally, in particular in the form of capsules, or by a "topical route, in particular in the form of creams.
  • the product being in powder, nothing prevents making compositions by mixing several complexes obtained by the process described above or associating them with active products, and using them as medicinal products. human, veterinary medicine, or as a food supplement, or as a cosmetic product.
  • the present invention also relates to the use of whole or ground induced photosynthetic microorganisms (MOP) enriched in biologically active molecules, for the preparation of pharmaceutical compositions for human or veterinary use, cosmetic compositions, or food supplements. .
  • MOP whole or ground induced photosynthetic microorganisms
  • Experimental bases of the invention 1- Protective role of phycobiliproteins vis-à-vis the iononhore action of an antibiotic: case of valinomycin. Valinomycin causes toxic effects on cells. We have shown using a flow cytometry technique that it causes cell death at
  • Spirulina is cultivated in photobioreactor in the middle of Zarrouk (Hours MC et al, (1998), Biotechnology Letters, Vol. 20, pp 557-560) until a concentration of lg is obtained. dry per liter.
  • the spirulina is then collected by filtration on a 50 micron sieve and washed with a sterile solution.
  • the washed pellet is taken up in approximately 1/5 of fresh medium composed of 50% Zarrouk medium and 50% of NaCl IM added with Zinc, at 0.05 g / L.
  • Methionine this accumulates in the very active form of S-Adenosyl-Metmonine in the vacuole or vacuoles. This can be verified by UV fluorescence microscopy.
  • an active molecule for example acetylsalicylic acid
  • the entire preparation is dried either by freeze-drying (freeze-drying) or by spray-drying.
  • Packaging in capsules or tablets will be carried out to obtain a known dose of active product.
  • This variant of the process is used to obtain a preparation containing a known quantity of active product (therefore with a therapeutic objective), while benefiting from the beneficial contribution of MOPs.
  • MOP sulfated polysaccharides vis-à-vis the mucous membranes and the anti-radical effects of. carotenoids, phycobiliproteins and superoxide dismutase.
  • MOP the protective effect of sulfated polysaccharides vis-à-vis the mucous membranes and the anti-radical effects of. carotenoids, phycobiliproteins and superoxide dismutase.

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Abstract

photosynthétiques enrichis en molécules biologiquement actives, leur procédé de préparation, et leurs utilisations, notamment sous forme de compositions pharmaceutiques, vétérinaires, cosmétiques, ou comme complément alimentaire. Ce procédé comporte principalement une étape permettant d'obtenir un maximum de biomasse et une étape d'induction physiologique permettant d'obtenir l'intériorisation de la ou des molécules biologiquement actives.

Description

MICRO-ORGANISMES PHOTOSYNTHETIQUES ENRICHIS EN MOLECULES BIOLOGIQUEMENT ACTIVES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION, ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention décrit un procédé permettant aux oligo-éléments et aux molécules biologiquement actives d'être internalisées par des micro-organismes photo synthétiques (cyanobactéries et micro-algues) afin de proposer des vecteurs de médicaments ou de molécules biologiquement actives permettant, par leurs qualités une diminution des effets secondaires de ces produits, un effet tampon et une complémentation de ceux-ci par un apport de vitamines, d'acides gras essentiels et d' antiradicalaires.
Ces vecteurs sont des cyanobactéries et/ou des fractions de cyanobactéries, et/ou des micro-algues et/ou des fractions de microalgues. Cet ensemble de micro-organismes est regroupé sous l'abréviation MOP (Micro-Organismes Photosynthétiques). Les médicaments associés peuvent être des ions métalliques (tels que des oligo-éléments), ou des molécules biologiquement actives complexes d'origine naturelle ou de synthèse (tels que les analgésiques, antibiotiques, anticancéreux, hormones stéroïdes, antiviraux, peptides bioactifs, composés phénoliques, phorbo-esters, polyamines, etc...), molécules qui provoquent des réactions secondaires non désirées.
La plupart des molécules actives citées provoquent un arrêt de la division cellulaire du vecteur et ne peuvent donc pas être ajoutées directement au milieu de culture. Ceci nous conduit à proposer un procédé en deux étapes principales dissociant la fonction de croissance du micro-organisme de la fqnction accumulation et interhalisation des molécules actives.
Les MOP comportent deux types de micro-organismes appartenant à deux règnes différents. Les cyanobactéries sont des procaryotes (règne des bactéries) tandis que les algues unicellulaires sont des végétaux eucaryotes.
Parmi les cyanobactéries on utilisera preférentiellement la spirulinè (Arthrospira platensis, SpiruUna major) et Nostoc qui sont déjà consommées par l'homme,
Synechocystis, Synechococcus, qui sont unicellulaires et sont très performantes en culture industrielle. Parmi les algues, on utilisera preférentiellement la chlorelle (Chlorella vulgaris) qui est aussi consommée par l'homme, Chlamydomonas, Scenedesmus, Haematococcus, Dunaliella, Chlorococcum, Nanochloropsis, Rhodella, Rhodosorus, Porphyridium et Tetraselmis qui sont des microalgues unicellulaires. Toutes ces espèces peuvent être cultivées en conditions artificielles, en milieux clos et contrôlés du point de vue des paramètres physico-chimiques et de la qualité microbiologique. Il est à noter qu'à cette date, seuls Arthrospira, SpiruUna et Chlorella sont universellement autorisés à la consommation humaine. Les MOP ont des compositions très différentes tant du point de vue des membranes, que de leur proportion en pigments et en vitamines, ce qui permet de proposer des formulations très ciblées.
Il est connu que les MOP apportent des molécules biologiquement actives (vitamines, lipides essentiels, polysaccharides, pigments, protéines...) qui ont des actions bénéfiques sur l' organisme sain et malade. Certains de ces composants ont des propriétés particulières.
Les polysaccharides extraits de ces micro-organismes photosynthétiques comportent des fonctions carboxyles et sulfates, fonctions ionisables et réactives qui permettent la fixation ionique ou chimique de molécules. Ainsi l'acide glucuronique joue un rôle très important chez les mammifères en permettant l'élimination de molécules toxiques possédants une fonction alcool, par exemple le phénol ou la mo hine. Certains sucres sont sulfatés et cette fonction sulfate permet de piéger les ions positifs divalents. C'est justement le cas de la plupart des oligo-éléments, métaux essentiels. Mais c'est aussi le cas de métaux toxiques comme le plomb et le mercure.
Cette propriété de piège de métaux est exploitée dans les procédés de bioremédiation (dépollution de sites) de "biomining" (récupération assistée des métaux). Les polysaccharides sulfatés ont chez les mammifères des activités biologiques non négligeables: anti-thrombique, anti- virale, anti-inflammatoire, immunomodulatrice, anti-métastasique... Les polysaccharides constituent un filtre et un lieu de stockage des molécules actives ce qui permet le contrôle de leur intériorisation.
Les lipides sont aussi très intéressants, les MOP sont riches en acide linoléique et en acide gamma-linolénique de forme cis (seule forme biologiquement active), qui sont des lipides essentiels non synthétisés par les animaux. Ils sont nécessaires à la croissance normale, au développement de la peau, à la gestation et à la lactation, au transport du cholestérol, à la synthèse des progestérones. L'oxydation des lipides insaturés est inhibée par la vitamine K que l'on trouve aussi dans les MOP. Les caroténoïdes ont une activité antiradicalaire, et des activités anti-cancéreuses et anti-inflammatoires sont signalées dans les publications scientifiques. Le béta- carotène est la provitamine A.
Parmi les protéines, les phycobiliprotéines, qui représentent une proportion importante du poids sec chez les cyanobactéries et les microalgues rouges, ont . des activités reconnues en tant qu'anti-radicalaire, immuno-modulatrice et anti- inflammatoire. On peut aussi citer la superoxyde-dismutase présente chez les MOP.
L'ensemble de ces caractéristiques confère aux MOP un ensemble de qualités intéressantes pour une utilisation comme co-médicament en médecine humaine, en médecine vétérinaire, en cosmétique, ou comme complément alimentaire.
Ces caractéristiques sont:
Leur capacité à complexer des molécules actives ou des ions dans leur paroi polysaccharidique puis de les internaliser.
- Ces mêmes polysaccharides exercent un rôle protecteur de la muqueuse et un effet tampon lors de la délivrance de ces molécules actives ou ces ions, et donc limitent leurs effets secondaires.
- Ces polysaccharides peuvent aussi empêcher l'internalisation des molécules actives
La présence de métalloprotéines et de transporteurs de métaux qui sont aussi reconnus comme transporteurs de molécules neuro-actives.
Un ensemble de cofacteurs, comme les phycobiliprotéines et les caroténoïdes • exerçant des- activités anti-radicalaires et anti-inflammatoires, augmente la tolérance à des médicaments particulièrement agressifs comme les antibiotiques, les antifongiques, les anticancéreux e| les antiviraux. La présence de vitamines, et de lipides essentiels améliorant sensiblement l'état général de l'organisme.
Enfin d'autres composants cellulaires sont capables de fixer des molécules biologiquement actives et aussi de les transporter vers les cellules cibles.
La présente invention découle essentiellement de la mise en évidence par les inventeurs du fait que les MOP sont capables de fixer les molécules biologiquement actives susmentionnées de les internaliser, et de transporter ces molécules en les protégeant vers leurs cellules cibles, évitant ainsi les phénomènes de pics plasmatiques de ces molécules, et les éventuels effets secondaires de ces dernières, sans pour autant altérer les structures chimiques et les effets biologiques desdites molécules. L'invention a pour objet un procédé de préparation de micro-organismes photosynthétiques (MOP) entiers ou broyés en association avec une ou plusieurs molécules biologiquement actives qui sont fixées et/ou intériorisées dans les MOP susmentionnés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture desdits micro- organismes dans un milieu de culture approprié, pour permettre d'obtenir une forte biomasse, et une étape d'induction physiologique de la fixation ou de l'internalisation desdites molécules dans les MOP, par incubation de ces MOP avec une solution comprenant du chlorure de sodium NaCl à une concentration comprise entre 0,2 et 1 M, notamment de 0,5 M. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de micro-organismes photosynthétiques entiers enrichis en molécules biologiquement actives tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en culture desdits micro-organismes dans un milieu de culture approprié, pour permettre d'obtenir une forte biomasse, - récolte des micro-organismes obtenus à l'étape précédente,
- mise en présence des micro-organismes obtenus à l'étape précédente avec des molécules biologiquement actives, le cas échéant à l'abri de la lumière, pendant un temps compris entre 1 et 12 heures dans une solution comprenant du NaCl à une concentration comprise entre 0,2 et 1 M, utilisée en tant que milieu d'induction spécifique permettant à ces molécules soit d'être fixées par la paroi du micro-organisme soit d'être accumulées à l'intérieur du micro-organisme, soit encore d'être intégrées dans l'un des composants de la cellule,
- récolte des cellules entières de micro-organismes après l'étape précédente, par filtration, , - et séchage par lyophilisation, atomisation ou dessication.
Ce procédé est une évolution d'une partie du procédé d'induction physiologique décrit dans les brevets FR 2789399 et FR 2827301. Les microalgues sont cultivées en photobioréacteurs dans les milieux qui leur sont le plus favorable afin d'obtenir une biomasse importante. Peu de temps avant la phase stationnaire, les MOP sont récoltés et concentrés par filtration. Ils sont ensuite incubés sous forme concentrée pendant 1 à 12 heures dans un milieu de culture spécifique destiné à induire des modifications. Dans ce cas précis le milieu d'induction physiologique contient la ou les molécules biologiquement actives. Dans certains cas, on utilisera avantageusement un milieu d'induction physiologique basé sur l'eau de mer pour créer un choc salin. Les cellules entières sont ensuite récoltées par filtration et séchées par lyophilisation (freeze-drying), atomisation (spray-drying) ou dessication pour être conditionnées preférentiellement sous forme de gélules. Seules les molécules actives fixées ou complexées aux microalgues seront donc utiles. L'utilisation du milieu d'induction physiologique favorise la déstructuration des polysaccharides de la paroi pour permettre l'intégration de ces molécules soit dans le système membranaire, soit dans les organites.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation de microorganismes photosynthétiques broyés enrichis en molécules biologiquement actives selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en culture desdits micro-organismes dans un milieu de culture approprié, pour permettre d'obtenir une forte biomasse,
- récolte des micro-organismes obtenus à l'étape précédente,
- traitement d'induction des micro-organismes obtenus à l'étape précédente pendant un temps compris entre 1 et 12 heures dans une solution comprenant du NaCl à une concentration comprise entre 0,2 et 1 M,
- récolte des cellules entières de micro-organismes après l'étape précédente, par filtration,
- reprise et broyage des micro-organismes dans un tampon physiologique, - incubation du broyât obtenu à l'étape précédente, avantageusement à froid pendant un temps de 1 à 8 heures, le cas échéant à l'abri de la lumière, avec une quantité connue de molécules biologiquement actives, milieu d'induction spécifique permettant à ces molécules soit d'être fixées par la paroi du micro-organisme soit d'être accumulées à l'intérieur du micro-organisme, soit encore d'être intégrées dans l'un des composants de la cellule,
- et séchage par lyophilisation, atomisation ou dessication.
Cette variante est utilisée pour obtenir une préparation contenant une quantité connue de produit actif (donc avec un objectif thérapeutique), tout en bénéficiant de l'apport bénéfique des MOP induits. Notamment l'effet protecteur des polysaccharides sulfatés vis-à-vis des muqueuses et les effets anti-radicalaires des caroténoïdes, des phycobiliprotéines et de la superoxide-dismutase qui dans cette variante sont libérés donc immédiatement actifs. Le choix du MOP est dans ce cas dépendant de l'effet recherché et de la biodégradabilité de la molécule active. Cette variante du procédé permet aussi l'utilisation d'autres composants de la cellule, notamment les protéines et les lipides comme vecteurs de médicaments et/ou d'ions, et d'obtenir une meilleure protection contre des effets secondaires de certains médicaments. Dans ce cas, les microalgues sont cultivées en photobioréacteurs dans les milieux qui leur sont favorables et récoltées en fin de phase de croissance par filtration, lavées et induites dans un milieu adapté puis sont reconcentrées dans du tampon physiologique pour être broyées mécaniquement. Au broyât est ajouté sous agitation douce des molécules biologiquement actives en quantité connue qui peuvent être naturelles (obtenues par extraction aqueuse de plantes) ou synthétiques. Cette incubation dure 1 à huit heures à 4 degrés Celsius. Pour éviter la photo-oxydation des molécules biologiquement actives, l'incubation est réalisée à l'obscurité. La solution est alors séchée soit par atomisation (spray-drying) soit par lyophilisation (freeze-drying) pour être conditionnée en gélules. Dans ce cas la totalité des molécules actives sera présente dans l'extrait. On profite alors de l'addition des propriétés des composants des microalgues , des molécules actives fixées et des propriétés des molécules actives servant de médicaments.
L'invention concerne également un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que :
- les MOP sont choisis parmi les cyanobactéries, telles que Arthrospira, SpiruUna, Nostoc, Synechocystis, Synechococcus, ou parmi les micro-algues unicellulaires, telles que Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Hematococcus, Nanochloropsis, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Tetraselmis,
- et les molécules biologiquement actives sont choisies parmi les oligo-éléments, les acides aminés essentiels, les lipides, les vitamines, les analgésiques, les antibiotiques, les anti-cancéreux, les anti-inflammatoires, les antiviraux, les hormones, les béta-bloquants, les anti-arythmiques, les anti-parasitaires, les peptides bioactifs, d'origine naturelle ou synthétique, les polyamines.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que : - les MOP sont choisis parmi Arthrospira, SpiruUna, Chlamydomonas, Chlorella,
Tetraselmis, ou Scenedesmus,
- et les molécules biologiquement actives sont choisies parmi :
. les anti-inflammatoires, tel que l'acide acétylsalicylique ou ses dérivés, les anti-cyclooxygénase 2, . les "vitamines, telle que la vitamine C,
. les antiviraux, tel que le 3'Azido-3'déoxythymidine (AZT) ou ses dérivés, la ribavirine,
. les antibiotiques, tels que les macrolides, ou les sulfamides, . les anti-cancéreux, telle que la vinblastine, ou les dérivés du taxol,
. les oligo-éléments et les métaux bivalents, tels que le chrome, le cuivre, le fer, le magnésium, le manganèse, le molybdène, le sélénium, le zinc,
. les peptides bioactifs, tels que les analogues d'hormones peptidiques, les neuropeptides, . les polyamines, telle que la thioproline.
L'invention concerne également l'application des procédés tels que définis ci- dessus, à la préparation de compositions pharmaceutiques à usage humain ou vétérinaire, de compositions cosmétiques, ou de compléments alimentaires, comprenant des micro-organismes photosynthétiques (MOP) entiers ou broyés enrichis en une ou plusieurs molécules biologiquement actives tels que définis ci-dessus.
L'invention a, de plus, pour objet les micro-organismes photosynthétiques (microalgues ou cyanobactéries) enrichis en molécules biologiquement actives tels que définis ci-dessus, caractérisés eri ce que la proportion desdites molécules liée à la paroi du micro-organisme, ou accumulée à l'intérieur du micro-organisme, ou intégrée dans l'un des composants de la cellule du micro-organisme, ou liée aux constituants du broyât du micro-organisme, représente au moins environ 50% de la quantité desdites molécules utilisée pour la mise. en oeuvre du procédé et de sa variante.
L'invention concerne tous les micro-organismes photosynthétiques (MOP) (microalgues ou cyanobactéries) enrichis en molécules biologiquement actives tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que :
- les MOP sont choisis parmi les cyanobactéries, telles que Arthrospira, SpiruUna, Nostoc, Synechocystis, Synechococcus, ou parmi les micro-algues unicellulaires, telles que Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Hematococcus, Nanochloropsis, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Tetraselmis, - et les molécules biologiquement actives sont choisies parmi les oligo-éléments, les acides aminés essentiels, les lipides, les vitamines, les analgésiques, les antibiotiques, les anti-cancéreux, les anti-inflammatoires, les antiviraux, les hormones, les béta-bloquants, les anti-arythmiques, les anti-parasitaires, les peptides bioactifs, d'origine naturelle ou synthétique, et les polyamines. L'invention a plus particulièrement pour objet les micro-organismes photosynthétiques enrichis en molécules biologiquement actives tels que définis ci- dessus, caractérisés en ce que :
- les MOP sont choisis parmi Arthrospira, SpiruUna, Chlamydomonas, Chlorella, Tetraselmis, ou Scenedesmus,
- et les molécules biologiquement actives sont choisies parmi :
. les anti-inflammatoires, tel que l'acide acétylsalicylique ou ses dérivés, les anti-cyclooxygénase 2,
. les vitamines, telle que la vitamine C, . les antiviraux, tel que le 3'Azido-3'déoxy ymidine (AZT) ou ses dérivés, la ribavirine,
. les antibiotiques, tels que les macrolides, ou les sulfamides, . les anti-cancéreux, telle que la vinblastine, ou les dérivés du taxol, . les oligo-éléments et les métaux bivalents, tels que le chrome, le cuivre, le fer, le magnésium, le manganèse, le molybdène, le sélénium, le zinc,
. les peptides bioactifs, tels que les analogues d'hormones peptidiques, les neuropeptides,
. les polyamines, telle que la thioproline. L'invention concerne également toute composition pharmaceutique, vétérinaire, cosmétique, ou complément alimentaire, caractérisé en ce qu'ils comprennent des micro-organismes photosynthétiques enrichis en molécules biologiquement actives tels que. définis ci-dessus, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable. ..
Avantageusement, les compositions susmentionnées de l'invention se présentent sous une forme administrable par voie orale, notamment sous forme de gélules, ou par voie" topique, notamment sous forme de crèmes.
Le produit (complexes MOP-molécules actives) étant en poudre, rien n'interdit de réaliser des compositions par mélange de plusieurs complexes obtenus par le procédé décrit ci-dessus ou de les associer à des produits actifs, et de les utiliser comme médicaments en médecine humaine, vétérinaire, ou comme complément alimentaire, ou comme produit cosmétique.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des micro-organismes photosynthétiques (MOP) induits entiers ou broyés enrichis en molécules biologiquement actives, pour la préparation de compositions pharmaceutiques à usage humain ou vétérinaire, de compositions cosmétiques, ou de compléments alimentaires. . Bases expérimentales de l'invention. 1- Rôle protecteur des phycobiliprotéines vis-à-vis de l'action iononhore d'un antibiotique: cas de la valinomycine. La valinomycine provoque des effets toxique sur les cellules. Nous avons montré en utilisant une technique de cytométrie en flux qu'elle provoquait la mort cellulaire à
60% des thymocytes de rat lorsque ceus -ci sont incubés pendant 4 heures en présence de 25 microgramme par millilitre. Lorsque l'on incube les thymocytes en présence de valinomycine à 25microgramme par ml et en présence de 10% d'un extrait brut de phycocyanine, pendant 4 heures, la mort cellulaire ne représente plus que 26% des cellules. Dans cette expérience, les thymocytes non traités (témoin) ont 20% de mort cellulaire et 80% de cellules normales. Ces expériences reproduites plusieurs fois montrent que la phycocyanine a un effet protecteur sur les cellules. Les résultats obtenus avec d'autres produits, notamment la tubercidine montrent des résultats identiques. 2- Enrichissement en Zinc. Sélénium et Molybdène de la spiruline selon le procédé: La spiruline est cultivée en photobioréacteur en milieu de Zarrouk (Hours M.C. et al, (1998), Biotechnology Letters, Vol. 20, pp 557-560) jusqu'à obtenir une concentration de lg sec par litre. La spiruline est alors récoltée par filtration sur un tamis de 50 microns et lavée par une solution stérile. Le culot lavé est repris dans environ 1/5 de milieu frais composé de 50%de milieu Zarrouk et 50% de NaCl IM additionné de Zinc, à 0,Q5g/L. Sélénium 0,16mg/l, Molybdène .0,16 mg/1 . (1.. litre . correspond à lg sec de spiruline). L'induction dure 12 heures dans les conditions de culture initiale. Après 12h, la biomasse est récoltée par filtration et séchée. " Les résultats font apparaître une fixation importante de ces oligo-éléments:
Culture normale Culture induite
Zinc 2,l mg/100g sec 1384mg/100g sec
Sélénium 0,002mg/100g sec 6,5 mg/100g sec •
Molybdène < 0,001mg/100g sec 0,17 mg/100g sec De même pour un enrichissement de la spiruline en fer selon ce même procédé, on obtient:
Culture normale Culture induite
Fer 0,08 mg/lOOg sec 0,66 mg/lOOg sec Appliqué à une microalgue comme Chlorella ou Tetraselmis selon ce même procédé, on montre par exemple que l'on peut obtenir une importante fixation du cuivre, du Zinc, du Nickel et du cadmium. Les quantités fixées sont comprises entre 0,1 et 3 g pour 100g sec. L'enrichissement par ce procédé n'est pas limité aux métaux. 3 - Modification de la composition lipidique d'une algue
En effet des expériences montrent que si l'on cultive la microalgue Chlamydomonas déficient en l'un des lipides constitutif de la membrane du thylacoïde, en présence de liposomes fabriqués avec ce seul lipide insaturé spécifique du thylacoïde, celui-ci est peu à peu incorporé à la membrane du thylacoide. La composition globale en lipide de cette membrane est modifiée d'une façon importante, et sa fonction normale est rétablie. Il est à noter que pour intégrer cette membrane, le lipide doit franchir la paroi, la membrane cytoplasmique et la membrane chlofbplastique ce qui indique la présence d'un système de transport actif et sélectif de lipides. 4- Enrichissement en Méthionine selon le procédé. De même lors de l' enrichissement d'une culture de la microalgue Tetraselmis en
Méthionine, celle-ci s'accumule sous forme très active de S-Adénosyl-Métmonine dans la vacuole ou les vacuoles. Ceci est vérifiable par microscopie à fluorescence dans l'UV.
5 - Enrichissement en vitamine C selon le procédé. Enfin, nous avons réalisé avec la microalgue Scenedesmus, une expérience de fixation de la vitamine C en ajoutant celle-ci dans son milieu de culture et en incubant sans lumière pendant unenuit. En ajoutant 0,04g/l d'acide ascorbique, on peut suivre.sa disparition dans le milieu de culture en mesurant la densité optique du milieu à 280nm. L'expérience montre que la quasi totalité de la vitamine C a disparu du milieu en 12h. " La même expérience réalisée sur la spiruline dans les mêmes conditions, montre que seul 40% de la vitamine C a disparu du milieu, et les 60% restant sont stables pendant au moins 24h prouvant que la vitamine C n'est pas dégradée dans le milieu, et qu'il n'y a pas métabolisation. Il y a donc bien fixation spécifique de la vitamine C par la spiruline et la quantité d'acide ascorbique fixé est proportionnelle à la quantité de biomasse de spiruline. On peut doser la vitamine C accumulée dans ces deux MOP par spectrophotométrieUN différentielle entre un témoin non induit et le MOP induit. De plus l'ascorbate induit fortement la mort cellulaire chez le thymocyte de rat et nous avons montré que l'extrait méthanolique de spirulines induites en vitamine C induisait aussi la mort cellulaire chez le thyrnocyte. Le produit fixé est donc biologiquement actif.
6- Enrichissement en molécules biologiquement actives selon la variante du procédé. Comme exemple, reprenons la chlorelle. Celle ci est cultivée en photobioréacteur, jusqu'au début de la phase stationnaire. L'avantage par rapport à la spiruline est qu'elle est cultivée à un pH acide. Elle est récoltée par filtration sur un tamis de 10 microns et lavée à l'eau stérile. Elle est ensuite reprise dans du tampon d'induction à pH 5 à une concentration de 3 volumes de tampon par volume de chlorelle humide sous agitation douce contenant un oligo-élément. Elle est ensuite reconcentrée, lavée puis broyée à froid par des moyens mécaniques. Un contrôle de pH est nécessaire pour vérifier qu'après broyage le pH est acide. A ce broyât on ajoute une concentration définie d'une molécule active par exemple de l'acide acétylsalicylique, sous agitation et à froid en absence de lumière pour éviter la photo-oxydation, et ce pendant une à huit heures. Au delà, l'action des protéases et des hydrolases risque de dénaturer à la fois les produits actifs et les composants de la micro-algue. La totalité de la préparation est séchée soit par lyophilisation (freeze-drying) soit par atomisation (spray-drying). Le conditionnement en gélule ou en comprimé sera réalisé pour obtenir une dose connue de produit actif. Cette variante du procédé est utilisée pour obtenir une préparation contenant une quantité connue de produit actif (donc avec un objectif thérapeutique), tout en bénéficiant de l'apport bénéfique des MOP. Notamment l'effet protecteur des polysaccharides sulfatés vis-à-vis des muqueuses et les effets anti-radicalaires des . caroténoïdes, des phycobiliprotéines et de la superoxide-dismutase. Le choix du MOP est dans ce cas dépendant de l'effet recherché et de la biodégradabilité de la molécule active. Parmi ces molécules actives on peut citer, la vitamine C, l'acide acétylsalicylique, la glucosamine, la caféine (et les dérivés phénoliques), les phorboesters, certains antibiotiques, les dérivés osidiques de bases puriques et pyrimidiques, les hormones, qui toutes ont des interactions avec les polysaccharides ou avec les membranes cytoplasmiques ou le thylacoide. Certaines de ces molécules ont des activités secondaires importantes, ne serait-ce que l'aspirine qui est prescrit aux personnes âgées à forte dose et pendant longtemps. Il est donc utile de disposer d'un vecteur permettant d'une part la protection des muqueuses et d'autre par la libération plus progressive de la molécule active. Dans ce cas, l'apport de vitamines contribue aussi à l'efficacité du traitement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de micro-organismes photosynthétiques (MOP) entiers ou broyés en association avec une ou plusieurs molécules biologiquement actives qui
5 sont fixées et/ou intériorisées dans les MOP susmentionnés, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de culture desdits micro-organismes dans un milieu de culture approprié, pour permettre d'obtenir une forte biomasse, et une étape d'induction physiologique de la fixation ou de l'internalisation desdites molécules dans les MOP, par incubation de ces MOP avec une solution comprenant du chlorure de sodium NaCl à 10 une concentration comprise entre 0,2 et 1 M, notamment de 0,5 M..
2. Procédé de préparation de micro-organismes photosyhthétiques entiers enrichis ' en molécules biologiquement actives selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
15 - mise en culture desdits micro-organismes dans un milieu de culture approprié, pour permettre d'obtenir une forte biomasse,
- récolte des micro-organismes obtenus à l'étape précédente,
- mise en présence des micro-organismes obtenus à l'étape précédente avec des molécules biologiquement actives, le cas échéant à l'abri de la lumière, pendant un
20 temps compris entre 1 et 12 heures dans une solution comprenant du NaCl à une concentration comprise entre 0,2 et 1 M, utilisée en tant que milieu d'induction - . . spécifique. permettant à. ces molécules soit.d'être fixées par la paroi du micro-organisme soit d'être accumulées à l'intérieur du micro-organisme, soit encore d'être intégrées dans l'un des composants de la cellule, ,
25 - récolte des cellules entières de micro-organismes après l'étape précédente, par filtration,
- et séchage par lyophilisation, atomisation ou dessication.
3. Procédé de préparation de micro-organismes photosynthétiques broyés enrichis 30 en molécules biologiquement actives selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en culture desdits micro-organismes dans un milieu de culture approprié, pour permettre d'obtenir une forte biomasse,
- récolte des micro-organismes obtenus à l'étape précédente, - traitement d'induction des micro-organismes obtenus à l'étape précédente pendant un temps compris entre 1 et 12 heures dans une solution comprenant du NaCl à une concentration comprise entre 0,2 et 1 M,
- récolte des cellules entières de micro-organismes après l'étape précédente, par _ filtration,
- reprise et broyage des micro-organismes dans un tampon physiologique,
- incubation du broyât obtenu à l'étape précédente, avantageusement à froid pendant un temps de 1 à 8 heures, le cas échéant à l'abri de la lumière, avec une quantité connue de molécules biologiquement actives, milieu d'induction spécifique permettant à ces molécules soit d'être fixées par la paroi du micro-organisme soit d'être accumulées à l'intérieur du micro-organisme, soit encore d'être intégrées dans l'un des composants de la cellule,
- et séchage par lyophilisation, atomisation ou dessication.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que :
- les MOP sont choisis parmi les cyanobactéries, telles que Arthrospira, SpiruUna, Nostoc, Synechocystis, Synechococcus, ou parmi les micro-algues unicellulaires, telles que Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Hematococcus, Nanochloropsis, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Tetraselmis, - et les molécules biologiquement actives sont choisies parmi les oligo-éléments, les acides aminés essentiels, les lipides, les vitamines, les analgésiques, les antibiotiques, les. anti-cancéreux, les anti-inflammatoires, les antiviraux, .les hormones, les béta-bloquants, les anti-arythmiques, les anti-parasitaires, les peptides bioactifs, d'origine naturelle ou synthétique, les polyamines. ,
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que :
- les MOP sont choisis parmi Arthrospira, SpiruUna, Chlamydomonas, Chlorella, Tetraselmis, ou Scenedesmus,
- et les molécules biologiquement actives sont choisies parmi : . les anti-inflammatoires, tel que l'acide acétylsalicylique ou ses dérivés, les anti-cyclooxygénase 2,
. les vitamines, telle que la vitamine C,
. les antiviraux, tel que le 3Αzido-3'déoxythymidine (AZT) ou ses dérivés, la ribavirine,
. les antibiotiques, tels que les macrolides, ou les sulfamides,
. les anti-cancéreux, telle que la vinblastine, ou les dérivés du taxol,
. les oligo-éléments et les métaux bivalents, tels que le chrome, le cuivre, le fer, le magnésium, le manganèse, le molybdène, le sélénium, le zinc, . les peptides bioactifs, tels que les analogues d'hormones peptidiques, les neuropeptides,
. les polyamines, telle que la thioproline.
6. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 5, à la préparation de compositions pharmaceutiques à usage humain ou vétérinaire, de compositions cosmétiques, ou de compléments alimentaires, comprenant des micro-organismes photosynthétiques (MOP) entiers ou broyés enrichis en une ou plusieurs molécules biologiquement actives tels que définis dans l'une des revendications 1 à 5.
7. Micro-organismes photosynthétiques enrichis en molécules biologiquement actives, tels qu'obtenus par mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisés en ce que la proportion desdites molécules liée à la paroi du microorganisme, ou accumulée à l'intérieur du micro-organisme, ou intégrée dans l'un des composants de la cellule du micro-organisme, ou liée aux constituants du broyât du micro-organisme, représente au moins environ 50% de la quantité desdites molécules utilisées pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 5.
8. Micro-organismes photosynfhétiques enrichis en molécules biologiquement actives selon la revendication 6, caractérisés en ce que : , - les MOP sont choisis parmi les cyanobactéries, telles que Arthrospira, SpiruUna,
Nostoc, Synechocystis, Synechococcus, ou parmi les micro-algues unicellulaires, telles que Chlamydomonas, Chlorella, Chlorόcoccum, Dunaliella, Hematococcus, Nanochloropsis, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Tetraselmis,
- et les molécules biologiquement actives sont choisies parmi les oligo-éléments, les acides aminés essentiels, les lipides, les vitamines, les analgésiques, les antibiotiques, les anti-cancéreux, les anti-inflammatoires, les antiviraux, les hormones, les béta-bloquants, les anti-arythmiques, les anti-parasitaires, les peptides bioactifs, d'origine naturelle ou synthétique, et les polyamines.
9. Micro-organismes photosynthétiques enrichis en molécules biologiquement actives selon la revendication 7 ou 8, caractérisés en ce que :
- les MOP sont choisis parmi Arthrospira, SpiruUna, Chlamydomonas, Chlorella, Tetraselmis, ou Scenedesmus, - et les molécules biologiquement actives sont choisies parmi :
. les anti-inflammatoires, tel que l'acide acétylsalicylique ou ses dérivés, les anti-cyclooxygénase 2,
. les vitamines, telle que la vitamine C,
. les antiviraux, tel que le 3'Azido-3'déoxythymidine (AZT) ou ses dérivés, la ribavirine,
. les antibiotiques, tels que les macrolides, ou les sulfamides, . les anti-cancéreux, telle que la vinblastine, ou les dérivés du taxol, . les oligo-éléments et les métaux bivalents, tels que le chrome, le cuivre, le fer, le magnésium, le manganèse, le molybdène, le sélénium, le zinc, . les peptides bioactifs, tels que les analogues d'hormones peptidiques, les neuropeptides,
. les polyamines, telle que la thioproline.
10. Composition pharmaceutique, vétérinaire, cosmétique, ou complément alimentaire, caractérisé en ce qu'ils comprennent des micro-organismes photosynthétiques enrichis en molécules biologiquement actives selon l'une des revendications 7 à 9, en association avec un véhicule physiologiquement acceptable.
11. Utilisation de micro-organismes photosynthétiques enrichis en molécules biologiquement actives selon l'une des revendications 7 à 9, pour la préparation de compositions pharmaceutiques à usage humain ou vétérinaire, de compositions cosmétiques, ou de compléments alimentaires.
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