FR2929957A1 - Phycocyanines chargees en metaux divalents obtenues par l'internalisation de ces metaux par la cyanobacterie arthrospira platensis et par fixation directe. produits obtenus par ces procedes - Google Patents

Abstract

La présente invention à pour objet la fabrication d'une métalloprotéine, la Phycocyanine -métal selon deux procédés. L'un est l'extraction de cette Phycocyanine-métal à partir de cyanobactéries chargées en métal divalent.L'autre consiste en la fixation directe du métal sur une phycocyanine extraite ou commerciale.Du fait de son homologie structurelle avec l'hémoglobine, le métal de la phycocyanine-métal est biodisponible. De ces procédés sont isssus des produits qui sont les produits intermédiares par exemple la Spiruline-métal dont les applications sont la nutrition et la thérapeutique sous forme d'administration orale, et les produits finaux les phycocyanines-métal ont des applications en nutrition, cosmétique et pharmaceutique sous des formes liquides ou sèches.

Description

-1- DESCRIPTION

PHYCOCYANI NES CHARGÉES EN METAUX DIVALENTS OBTENUES PAR L'INTERNALISATION DE CES METAUX PAR LA CYANOBACTERIE ARTHROSPIRA PLA'l'ENSIS ET PAR FIXATION DIREC'T'E. PRODUITS OBTENUS PAR CES PROCEDES.

[1]. L'objet de ce brevet est de décrire un nouveau complexe protéine-métal obtenu en associant la phycocyanine à des métaux divalents. Il décrit les procédés permettant l'obtention de ces complexes et les produits obtenus. Les applications concernent la micro-nutrition , la cosmétique et la pharmacie. [2] Les cyanobactéries ont la capacité de capter et d'accumuler des métaux, notamment des métaux divalents, présents dans leur environnement. Cela tient au fait que ces micro-organismes ont gardé des gènes et les protéines des bactéries sulfo-réductrices ancestrales qui leur permettaient de respirer sans oxygène grâce à l'oxydo-réduction des métaux. Ces protéines ont été particulièrement conservées chez tous les organismes y comprit l'homme dont les cellules sont dotées de mécanismes sophistiqués de transport et de régulation des métaux divalents. [3] Toutefois normalement, l'accumulation de métal par la cyanobactérie est relativement faible. La toxicité de nombreux métaux en concentration élevée dans le milieu extérieur inhibe la croissance des cyanobactéries. Pour survivre dans des conditions de forte concentration métalliques, les cyanobactéries sont entourées d'une paroi de polysaccharides sulfatés qui s'opposent au gradient de concentration des molécules du milieu extérieur.

[4] D'autre part, des régulations complexes interviennent pour bloquer l'entrée des métaux lorsque leur concentration devient excédentaire à l'intérieur de la cellule. Ces régulations vont de l'inhibition directe des transporteurs de métaux divalents, à l'activation des processus d'exportation des métaux et à l'interruption de la synthèse des protéines de stockage des métaux. [5] Au cours de nos recherches concernant l'accumulation d'oligo-éléments par les cyanobactéries, nous avons mis au point un procédé permettant d'obtenir des cyanobactéries fortement chargées en différents métaux tels que le Chrome, le Cuivre, le Fer, le Magnésium, le Manganèse, le Molybdène, le Sélénium, le Zinc. Nous avons remarqué en analysant les observations obtenues par microscopie électronique que ces métaux s'accumulaient rapidement dans le thylacoïde (la membrane photosynthétique) des cyanobactéries et plus particulièrement dans les phycobiliprotéines. [6] Cette particularité ouvre de nouvelles applications dans les domaines de la micro- nutrition, de la cosmétique et de la thérapeutique. -2-

En effet, les phycobiliprotéines font partie de la famille des globines comme l'hémoglobine (Holm et Sanders,1993). Les globines sont connues pour être des réservoirs de métaux divalents. L'utilisation de telles métallo-protéines est la voie normale pour un organisme animal d'acquisition des oligo-éléments nécessaires à la constitution de ses propres métallo-enzymes.

[7] L'obtention de cyanobactéries fortement chargées en métaux divalents conditionne la charge en métaux divalents des phycobiliprotéines. Trois obstacles majeurs s'opposent à l'entrée de ces métaux en grande quantité. Le premier est la gaine de polysaccharides sulfatés qui entoure la cyanobactérie et tamponne l'entrée des substrats de l'environnement. Le deuxième est la présence d'oxygène moléculaire à la surface de la cyanobactérie (due à la photosynthèse) qui conduit à la formation d'oxydes insolubles à partir des sels de métaux. Troisièmement, dans les conditions de culture industrielle contrôlée, (spiruline) la présence d'une grande quantité de carbonates et de phosphates conduit au piégeage des métaux sous une forme insoluble.

[8] Ces obstacles sont levés par un procédé comprenant deux phases: 1- 1' induction physiologique , qui consiste à appliquer aux cyanobactéries un stress entraînant la rupture de la gaine de polysaccharides associé à un traitement anti-oxygène. La suppression de l'oxygène du milieu et de la surface de la cyanobactérie évite la formation très rapide d'oxydes métalliques qui souvent sont insolubles. 2-l' internalisation qui consiste à mettre les cyanobactéries en présence d'un métal dans un milieu ne contenant ni phosphate ni carbonate. L'ensemble de ce procédé ne doit durer que quelques heures car du fait de ces traitements, les cyanobactéries sont fragilisées. La culture de la ou des cyanobactéries se fait dans les meilleures conditions connues de façon à obtenir la plus grande quantité de biomasse. L'induction physiologique associe un stress (par exemple un stress salin), destiné à rendre la paroi perméable aux nutriments et à bloquer les régulations qui contrôlent l'entrée de ces nutriments, à la suppression de l'oxygène moléculaire présent à la surface des cyanobactéries et dissous dans le milieu. L'internalisation consiste à soumettre les cyanobactéries à un fort gradient de concentration du métal désiré. La présence d'une source d'azote est indispensable pour permettre le transport des métaux du milieu externe à l'intérieur de la cyanobactérie. Ces deux étapes sont adaptées au type de cyanobactérie traitée.

[9] La phycocyanine est ensuite extraite à partir des cyanobactéries chargées en métal par des moyens classiques d'extraction des protéines, comportant une étape de broyage, et des étapes de fractionnement de ce broyat. La fraction contenant la phycocyanine-métal est par la suite traitée en fonction des utilisations potentielles, soit une purification par chromatographie, soit un conditionnement liquide, soit encore un séchage par atomisation ou lyophilisation. -3-

[10] L'avantage de ce procédé est de permettre le traitement des cyanobactéries en dehors du processus de croissance. De ce fait cela permet d'induire l'entrée de métaux toxiques, et d'utiliser des cyanobactéries qui se sont multipliées dans un milieu et dans des conditions optimisées et adaptées.

[11] Exemple : La spiruline (Arthrospira platensis) est cultivée industriellement dans des bassins agités (Raceway) en milieu Zarrouk de façon à obtenir le maximum de biomasse. En culture continue, la spiruline est en phase de croisssance permanente. On peut donc obtenir journalièrement une importante quantité de biomasse. Cette biomasse est récupérée par filtration sur toile (tamis de 50 microns). Elle est lavée par 10 volumes d'eau distillée sur le même tamis. - Induction physiologique : La biomasse est mise en suspension dans 5 à 10 volumes d'eau distillée contenant 0,2M de NaCl, 0,1M de sulfite de sodium et incubée à l'obscurité pendant 20 à 60 minutes. Elle est ensuite récupérée sur toile filtrante (tamis de 25 microns) . - Internalisation : La biomasse traitée est suspendue dans un milieu minimum contenant du nitrate de sodium 2,5g/1, du sulfate de potassium lg/1, du chlorure de sodium lg/1, plus le métal désiré à une concentration de 5 à 20g/l. Le pH est ajusté à 9,5 pour la spiruline avec du Na OH. L'incubation dans ce milieu est de 1 à 2h.

A la fin de l'incubation, la biomasse induite en métal est récupérée par filtration sur toile (tamis de 25 microns) lavée par 10 volumes d'eau distillée. La biomasse est ensuite séchée. Une prise d'échantillon permet de doser le métal contenu dans la biomasse par spectrophotométrie d' absorption atomique. Nous avons démontré que le métal était stocké à l'intérieur de la cellule et nous proposons de l'appeler "métal internalisé " par opposition au métal chélaté ou fixé sur la paroi par liaison ionique.

Le procédé simplifié décrit ci-dessus comporte donc trois étapes : a. La culture proprement dite, b. L'induction physiologique, c. L'internalisation du métal.

[12] L'utilisation de ce procédé permet d'obtenir des cyanobactéries fortement chargées en métal choisi. Ainsi nous avons obtenu les concentrations suivantes : Spiruline û Chrome de 1 à 6% Spiruline û Cuivre de 6 à 15% Spiruline û Fer de 9 à 27% Spiruline û Magnésium de 1 à 5% Spiruline û Manganèse de 1 à 4% Spiruline û Molybdène de 1 à 5% Spiruline û Sélénium de 0,1 à 3% Spiruline û Zinc de 7 à 19% Ces produits seront désigné par le terme Spiruline-métal. -4-

Il convient d'apporter quelques précisions. Dans le cas des cyanobactéries , il est important d'éliminer du milieu d'induction toute trace de carbonate et de phosphate. En effet la plupart des métaux divalents donnent lieu à la formation de carbonates et de phosphates de métaux insolubles ce qui fausse la mesure des métaux contenus dans les filtrats et les cellules. Dans l'application du procédé, l'induction physiologique et l'internalisation se font à l'obscurité et à une température comprise entre 20 et 30°C.

[13] Pour démontrer l'internalisation des métaux nous avons utilisé la microscopie optique qui permet de voir les agrégats métalliques dans le milieu et au contact des cyanobactéries. Dans le cas de leur absence, la microscopie à épifluorescence montre une modification du thylacoide (membrane photosynthétique) avec une condensation des phycobiliprotéines. Une durée plus longue de l'étape d'internalisation conduit à la fragmentation des trichomes (filaments contenant plusieurs dizaines de cellules identiques) dans le cas de la spiruline.

[14] Ceci nous a amené à l'observation en microscopie électronique. Dans cette technique, une accumulation de métal peut être détectée par une augmentation du contraste par rapport au fond. Cette observation montre que le thylacoïde est effectivement désorganisé et que celui-ci est plus contrasté qu'un témoin sans métal. Cette membrane étant composée principalement de phycobilisomes qui sont une accumulation de phycobiliprotéines , nous avons fait l'hypothèse que les phycobiliprotéines accumulaient des métaux. De plus d'autres protéines ou structures sont visibles sous forme condensées.

[15]La spiruline par exemple contient en majorité une phycobiliprotéine, la phycocyanine de couleur bleue. L'extraction de la phycocyanine est réalisée par une méthode classique (Gantt et Lipschultz ,1971). Une lyse par des cycles de congélation et décongélation de la biomasse est suivi d'une centrifugation pour éliminer les parois. Le surnageant est fractionné par précipitations avec du sulfate d'ammonium. Le précipité recueilli entre 15 et 35% de saturation de sulfate d'ammonium est la phycocyanine brute. Une dialyse contre un tampon physiologique permet d'éliminer le sulfate d'ammonium.

[16] Nous avons donc réalisé les extractions à partir de spirulines chargées en différents métaux et avons obtenus les résultats suivants à partir de : Spiruline û Chrome de 1 à 6% Phycocyanine û Chrome 1,1% Spiruline û Cuivre de 6 à 15% Phycocyanine û Cuivre 3 à 7,2% Spiruline û Fer de 9 à 27% Phycocyanine û Fer 1, 3 à 7% Spiruline û Manganèse de 1 à 4% Phycocyanine- Manganèse 1,6% Spiruline û Molybdène de 1 à 5% Phycocyanine û Molybdène 1,3% Spiruline û Sélénium de 0,1 à 3% Phycocyanine û Selénium 2% Spiruline û Zinc de 7 à 19% Phycocyanine û Zinc 3,2 à 9% Ces produits seront désignés par le terme Phycocyanine-métal -5-

[17] On constate donc que la phycocyanine fixe bien des métaux divalents. Comme la phycocyanine représente chez la spiruline environ 12% des protéines, la quantité de métal accumulé par la phycocyanine est relativement faible. Il existe d'autres mécanismes de stockage des métaux chez les cyanobactéries décrits dans la littérature. Toutefois cette protéine est très intéressante car elle est classée structuralement dans la famille des globines (Holm et Sanders,1993). De plus, la cyanobiline, qui est le pigment (le groupement prosthétique) de la protéine, est constituée lors de la première étape de la dégradation de l'hème de l'hémoglobine.

[18] Le métal est fixé solidement puisque ni la dialyse, ni la précipitation à l'acétone, ni la précipitation par des sels, ni la précipitation à l'acide perchlorique ne permet de le retirer.

[19] L'ensemble de ce travail et l'analyse de la littérature - où l'on s'aperçoit que pour amorcer la cristallisation de la phycocyanine dans le but d'en établir la structure tridimensionnelle, les auteurs (Moreno et al. 1997) utilisent un cristal de sel métallique le Sulfate de Magnésium par exemple- nous a donné l'idée que, puisque la phycocyanine accumulait des métaux divalents, on pouvait tenter de faire de la Phycocyanine-métal à partir de phycocyanine obtenue à partir de cyanobactéries non chargées en métal.

[20] Pour cela nous avons extrait la phycocyanine à partir de la biomasse obtenue en fin de culture selon la méthode décrite précédemment. La phycocyanine obtenue est donc exempte de métal. Nous avons ajouté à une solution physiologique contenant 30 mg de phycocyanine par millilitre des quantités croissantes de solution de sel de métal sous agitation douce Le pH doit rester neutre et donc doit être contrôlé pendant la réaction. La température est comprise entre 20 et 37°C. A 20°C la réaction de fixation est réalisée entre 1 et 2 heures

[21]La fixation suit une cinétique en deux temps. Une étape rapide permet de fixer jusqu'à 3% de métal. Elle correspond à la fixation du métal sur les cyanobilines. Une étape lente suit, permettant une fixation comprise entre 3 et 7% de métal. Cette étape est accompagnée de la dénaturation partielle de la phycocyanine. Elle correspond à la fixation du métal sur les ponts di-sulfure. Les métaux divalents fixés sont le Chrome, le Cuivre, le Fer, le Magnésium, le Manganèse, le Molybdène, le Sélénium, le Zinc. Le taux de fixation est dépendant des concentrations respectives de phycocyanine et de métal dans le milieu réactionnel.

[22] Après fixation, le complexe phycocyanine-métal est dialysé ou ultrafiltré puis précipité par de l'acétone à 50% V/V final, séché et analysé par spectrométrie d'absorption atomique.. Pour les applications commerciales, la phycocyanine-métal est séchée par atomisation ou lyophilisation. Le métal reste fixé lors de précipitations salines, acétoniques, alcooliques et aussi lorsque l'on soumet la Phycocyaninemétal à une dialyse prolongée. -6-

[23] Le procédé de fixation directe du métal peut se réaliser sur de la phycocyanine commerciale en poudre, atomisée ou lyophilisée. Seuls les métaux divalents ou apparentés divalents peuvent se fixer, il est impossible de fixer Fe3+. La phycocyanine est donc un réservoir des métaux divalents à la différence de la ferritine qui stocke ces métaux sous forme trivalente.

[24] Il est aussi intéressant de savoir si le métal fixé par la phycocyanine est ou non biodisponible. En toute rigueur la biodisponibilité suppose de pouvoir injecter un produit directement dans le sang et de comparer avec le même produit administré par voie orale. Pour des raisons liées à la toxicité du Zinc, du Cuivre, du Chrome, et à la réactivité des protéines nous ne pouvons pas réaliser ce protocole.

[25] Il existe une alternative qui consiste à cultiver sur un support poreux des cellules caco-2 qui vont se différencier pour reconstituer la membrane basale de la paroi intestinale. La membrane délimite deux espaces l'un, supérieur, qui correspond à la lumière de l'intestin, l'autre, inférieur, qui correspond au compartiment sanguin. Si l'on dépose un produit dans le compartiment supérieur, on peut suivre l'accumulation du produit dans les cellules intestinales, et aussi mesurer dans l'espace inférieur ce qui a été transporté à travers l'épithélium intestinal, équivalent au système circulatoire de l'organisme. (P.Planes et al.2002). Il existe des variantes du système notamment certains auteurs (R.P. Glahn et al.1996) ne regardent que ce qui est accumulé dans les cellules.

[26] Nous avons choisi deux métaux biochimiquement importants , le Zinc et le Fer comme exemple. Biodisponibilité du Zinc: Comme témoins, nous prendrons le sulfate de Zinc et le gluconate de Zinc, les deux étant sous forme d'une solution à 1%. La phycocyanine-Zinc initiale est à 10mg/ml de protéine et contient 5 % de zinc en poids sec. Ces solutions sont diluées dans du milieu de culture et placées dans le compartiment supérieur. Le taux de dilution est indiqué. Les concentration en métaux sont en ppb. On calcule le pourcentage de métal transféré dans les cellules et transféré dans le compartiment inférieur par rapport à la quantité de métal initiale placée dans le compartiment supérieur. Le gluconate de Zinc, quelque soit sa concentration n'est pas biodisponible. Le sulfate de zinc est biodisponible avec une réserve qui est que la dilution au 1/2 entraîne la mort cellulaire. Il n'est pas impossible qu'à la concentration de 1/4 on ait une mortalité partielle. La phycocyanine-Zinc est biodisponible. Il n'y a pas eu de mort cellulaire même avec des quantités de zinc plus élevées qu'avec le sulfate. Toutefois le transfert est bien meilleur avec l'échantillon dilué au 1/8. Biodisponibilité du Fer: On prend comme témoin du sulfate de fer (ferreux) à 1% et de la phycocyanine-fer (10mg/ml de protéines) contenant 3% de fer en poids sec. Le sulfate de fer est fortement absorbé par les cellules, toutefois on n'a pas observé de transfert dans le compartiment inférieur. Pour la -7- phycocyanine-Fer, bien que la quantité absorbée par les cellules soit moyenne, on a eu un transfert mesurable dans le compartiment inférieur. Zninit Cells %in cells milieu % transfert (P=5mg/ml) inférieur Zn gin 1/2 205990 0 0 Zn gin 1/20 20910 0 0 ZnSO41/4 1504930 132565 8,8 38050 2,5 Zn SO4 1/40 107950 1050 9,75 689 0,64 phy Zn 1/2 6297280 8570 0,13 19100 0,33 phy Zn 1/2 ND 7849680 25290 0,32 5540 0,08 phy Zn 1/4 3929820 29360 0,74 7140 0,19 Phy Zn 1/8 1795530 21030 1,2 12480 0,69 [27] La conclusion de ces deux expériences est que les métaux fixés sur la Phycocyanine-métal sont biodisponibles. L'analyse fine des résultats, indique aussi que les mécanismes de transport et du stockage du fer et du zinc sont différents d'une part et que pour le zinc il y a une régulation dépendante de la quantité de métal fournie. Dans tous les cas, la phycocyanine-métal permet le transfert des métaux au compartiment intérieur sans montrer de cytotoxicité.

[28] Utilisation des produits intermédiaires par l'industrie alimentaire et pharmaceutique: Ces produits bases sont destinés à entrer dans des compositions administrées oralement ou la proportion de spiruline -métal est variable. Ces mélanges doivent être conforme à la réglementation concernant l'apport de métal à l'organisme consommateur ou utilisateur. Pour cela les produits bases ont des concentrations standardisées en métal. Ces concentrations sont réalisées par mélange de poudre de spiruline-Métal et de poudre de spiruline non chargée en métal. -8- Norme quantité de par gellule, pour 4 spiruline-métal/j gellules/jour Spiruline-métal à 5% Fe 14mg/ j 280mg 70mg Zn 15mg/ j 300mg 75mg Spiruline-métal à 1% Cu 2mg/ j 200mg 50mg Mn 2,5mg/ j 250mg 62,5mg Spiruline-métal à 0,1% Mo 150 tg / j 150mg 37,5mg Se 50 g/ J 50mg 12,5 mg Cr 25 g / j 25mg 6,25 mg Spiruline-métal à 0,01% Cr 25 g/ j 250mg 62,5mg Se 50 pg / j 500mg 125mg [29] L'apport en oligo-éléments se répartit en trois catégories: pour le Fe, le Zn il est compris entre 10 et 20mg/jour, pour le CU et le Mn il est compris entre 1 et 10 mg/jour, pour le Cr, le Mo, le Se il est compris entre 2 et 200 g/jour. Ceci définit trois catégories de produit base : la spiruline chargée à 5% de métal pour ,Fe,Zn, la spiruline chargée à 1% pour le Cu et le Mn, et la spiruline chargée à 0,1% en métal pour le Cr, le Mo et le Se. [30] Destinés à la micronutrition, ces produits sont composés de spiruline séchée en poudre dont la composition en métal est connue. Cette poudre est conditionnée en gélules chargées à 250mg. L'apport maximum journalier en oligo-éléments fixé par l'OMS est réalisé par l'ingestion de 4 gélules par jour. La spiruline en elle-même apporte différentes vitamines B,D,E en plus de la provitamine A (béta-carotène), des lipides et des acides aminés essentiels, des molécules anti-radicalaires. C'est donc un vecteur de choix pour apporter des oligo-éléments à l'organisme. [31] Des compositions comportant des mélanges de différentes spirulines-métal peuvent être réalisées permettant un apport équilibré des différents oligoéléments -9-

[32] Pour des applications thérapeutiques, les charges en métal peuvent être plus importantes, dans ces cas un contrôle médical est nécessaire. les spirulines chargées en métaux peuvent être utilisées en apport complémentaire d'autres traitements, soit comme suppléments, soit associés avec des molécules actives.

[33] L'utilisation de la phycocyanine chargée en métal est plus universelle que l'utilisation de la spiruline-Métal. Elle s'étend de la micronutrition à la cosmétique et la pharmacie. On peut obtenir la phycocyanine sous forme sèche (atomisée ou lyophilisée) et sous forme liquide avec filtration stérilisante. Sous la forme sèche, sa conservation est de plusieurs mois voire d'une année. Cette forme sèche est parfaitement soluble. Cette forme est recommandée pour une administration orale. Sous forme liquide, on peut intégrer la phycocyanine-Métal dans des crèmes, des gels et des lotions. La protéine supporte le mélange avec des détergents, de l'alcool à des concentrations inférieures à 20%.

[34]Les produits bases sont la phycocyanine à 3% pour tous les métaux divalents, Des taux plus bas peuvent être obtenus soit par une réaction adaptée soit par mélange de la phycocyanine-métal avec de la phycocyanine pure. Exceptionnellement des très forts taux en métal (6 à 9%) sont réalisables, mais dans ce cas la réaction est plus complexe du fait de la dénaturation de la protéine. Compte-tenu de la biodisponibilité prouvée, la phycocyanine-métal est une molécule biologiquement active.

[35] On peut réaliser des mélanges des différentes phycocyanines-métal pour réaliser des produits spécifiques et procurer un apport équilibré en différents oligo-éléments. On peut aussi mélanger les différentes phycocyanines-métal avec d'autres composés biologiquement actifs sous forme de comprimés, de gélules et de crèmes pour des applications thérapeutiques.

[36]. Bibliographie Gantt E., Lipschultz C.A.(1971) J.Cell Biol.54:313-324 Glahn R.P.et al.(1996)J. of Nutrition 332-339 Holm L;, Sanders C.(1993)FEBS Letters 315:301-306 Moreno A et al.(1997) Acta Cryst.D53:321-326 Planes P. et al.(2002)Food Chem.77,213-218 10 15 20 25 30 35 40 45

Claims (4)

1. REVENDICATIONS1. Phycocyanine-métal à très forte teneur en métal caractérisée par l'association d'une protéine constitutive des cyanobactéries, la phycocyanine, avec un métal divalent, le dit métal étant choisi parmi le Chrome, le Cuivre, le Fer, le Magnésium, le Manganèse, le Molybdène, le Sélénium, le Zinc, l'association étant constituée d'une liaison du dit métal aux cyanobilines et aux ponts di-sulfures de la phycocyanine.
2. 2. Procédé d'obtention de la phycocyanine-métal selon la revendication 1 consistant à : -a) la culture d'une cyanobactérie, de préférence Arthrospira platensis, en milieu optimal de façon à disposer après filtration d'une abondante biomasse, -b) une induction physiologique consistant au traitement de cette biomasse dans un milieu distinct (milieu d'induction) associant un générateur de stress à un fixateur d'oxygène, dans le cas d'Arthrospira platensis le générateur de stress étant du NaCl à 0,2M et le fixateur d'oxygène étant le sulfite de sodium à O,1M et l'incubation étant de 20 minutes à une heure à 25°C. -c) une étape d'internalisation du métal divalent dans la cyanobactérie dans un milieu ne contenant ni carbonate ni phosphate, à un pH compris entre 7 et 9,5, dans lequel le dit métal est dissous à une concentration de 1 à 2 % en poids (milieu d'internalisation), l'incubation étant de 1 à 2 heures à une température comprise entre 20 et 30°C qui conduit après filtration et lavage à une cyanobactérie fortement chargée en métal contenant le dit métal sous forme de métallo-protéines dont l'une est la phycocyanine-métal, -d) après filtration et lavage, une étape d'extraction de la phycocyanine-métal par des méthodes classiques , broyage et précipitations au sulfate d'ammonium par exemple suivi d'une dialyse ou d'une ultrafiltration pour éliminer le sel et le métal non fixé, -e) un séchage de la phycocyanine-métal par atomisation ou lyophilisation.
3. 3. Cyanobactéries-métal obtenues à l'étape c) du procédé de la revendication 2 consistant en des intermédiaires de fabrication caractérisés en ce que la cyanobactérie est la spiruline (Arthrospira platensis) contenant l'un des métaux divalents internalisé à concentration élevée par exemple la spiruline-Chrome contenant entre 1 à 6% de Cr, la spiruline-Cuivre contenant entre 6 à 15% de Cu, la spiruline-Fer contenant entre 9 et 27 % de Fe, la spiruline-Magnésium contenant entre 1 et 5 % de Mg, la spiruline-Manganèse contenant entre 1 et 5% de Mn, la spiruline-Molybdène contenant entre 1 et 5 % de Mo , la spiruline-Sélénium contenant entre 0,1 et 3 % de Se ou la spiruline-Zinc contenant entre 5 et 19 % de Zn, le pourcentage étant le rapport du poids de métal pur et du poids sec de la spiruline.10 5. 15 6. 20 25 7. 30 35 8. 40 45
4. 4. Produits bases standardisés obtenus par mélange de l'une des spirulines métal telles que définies dans la revendication 3 avec des spirulines non induites ne contenant pas de métaux et consistant en: la spiruline-Fer à 5% de Fe, la spiruline-Zinc à 5% de Zn, la spiruline-Cuivre à 1% de Cu, la spiruline-Magnésium à 1% de Mg, la spiruline-Manganèse à 1% de Mn, la spiruline-Molybdène à 0,1% de Mo, la spiruline-Sélénium à 0,1% de Se, la spiruline-Chrome à 0,1% de Cr, la spiruline-Chrome à 0,01% de Cr ou la spiruline Sélénium 0,01% de Se en poids de métal par poids sec de spiruline Utilisation des spirulines-métal standardisées telles que définies dans la revendication 4 pour la préparation de compositions destinées à la micro-nutrition humaine ou animale et à la thérapeutique consistant en des assemblages de diverses spirulines-métal entre elles ou un mélange de celles-ci avec d'autres produits. Procédé d'obtention de la phycocyanine-métal selon la revendication 1 par fixation directe des dits métaux sur de la phycocyanine pure extraite (forme liquide) ou de la phycocyanine commerciale atomisée ou lyophilisée (forme sèche), la phycocyanine étant solubilisée dans un tampon salin à pH neutre à une concentration connue à laquelle on ajoute une quantité connue de sel de métal divalent (sulfate ou chlorure), la réaction durant 1 à 2 heures à 20°C sous agitation douce et contrôle de pH au cours du temps, le taux de métal fixé étant directement dépendant des quantités de phycocyanine et de métal placés dans le réacteur, la phycocyanine-métal obtenue est ensuite dialysée ou ultrafiltrée pour éliminer l'excès de métal non fixé puis séchée par atomisation ou lyophylisation. Phycocyanine-métal selon la revendication 1 ou obtenue selon le procédé de l'une des revendications 2 ou 6 consistant en la phycocyanine-Chrome ou la phycocyanine-Cuivre ou la phycocyanine-Fer ou la phycocyanine-Magnésium ou la phycocyanine-Manganèse ou la phycocyanine-Molybdène ou la phycocyanine-Sélénium ou la phycocyanine-Zinc dans lesquelles les taux en métal fixé vont de 1 à 9% en poids de métal par poids sec de phycocyanine, les taux obtenus dépendant uniquement de la stoechiométrie de la réaction. Utilisation de la phycocyanine-métal selon l'une des revendication 1 ou 7 ou obtenue selon le procédé de l'une des revendications 2 ou 6 pour la préparation de compositions destinées à la micro-nutrition, la cosmétique et la thérapeutique, ces compositions pouvant comporter un mélange des diverses phycocyanines-métal entre elles avec des principes actifs connus. -11-