WO2004067747A1 - Antigenos recombinantes del virus de la hepatitis a obtenidos en celulas vegetales - Google Patents

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recombinant
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Alina LÓPEZ QUESADA
Beatriz González Badillo
Guillermo Selman-Housein Sosa
Abel HERNÁNDEZ VELÁSQUEZ
Javier RÍOS BACALLAO
Yamilka Rosabal Ayon
Marlen PÉREZ MARTÍNEZ
Licel RODRÍGUEZ LAY
Rolando GARCÍA GONZÁLEZ
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Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
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Definitions

  • This invention relates to the branch of biotechnology and more specifically to the expression of recombinant proteins in transgenic plants and their use as vaccine antigens.
  • recombinant hepatitis A virus antigens obtained in transgenic plants are provided from the expression of modified fragments of the HAV virome genome of the M2 strain isolated in Cuba. It also demonstrates the usefulness of these to develop immune response in animals after being administered these by different routes.
  • the Hepatitis A Virus The Hepatitis A Virus.
  • the HAV genome is a single-stranded, positive polar RNA of approximately 7.5 kb that codes for a 253 kDa polyprotein. (Cohen, JI et al., Journal of Virology (1987), 61: 3035-3039). Polyprotein undergoes co and post-translational processes, giving rise to mature structural (VP1, VP2, VP3, VP4 and 2A) and non-structural (2B, 2C, 3A, 3B, 3C and 3D) proteins.
  • the 3C protease (P ro 3C), present in the P3 domain of the viral polyprotein, is the protease that is involved in the cleavage of the HAV polyprotein (Mart ⁇ n et al., J Virol. (1999), 73 (8): 6220-7), allowing the release of intermediaries P1-2A, 2BC and P3, which are subsequently processed. Therefore, for envelopes to form properly and HAV replication to occur, a differential proteolytic processing of HAV polyprotein must occur.
  • the 3C / 3D junction is efficiently cut and there is a delayed processing at the 3A / 3B and / or 3B / 3C sites allowing the accumulation of the 3ABC intermediate polypeptide (Kusov et al., Journal of Virology ( 1999), 73: 9867-9878), which cuts the P1-2A polypeptide with similar efficiency as the 3C protease promotes greater efficiency in the formation of the pentamers.
  • the characteristic form of the virus comes from the union of viral proteins, and its three-dimensional configuration is important for the generation of a protective immune response.
  • the HAV virion has an immunodominant neutralizing antigenic site that is strictly conserved between HAV strains isolated from various geographic areas.
  • the first transgenic plants originated from gene transfer mediated by the rhizobacterium Agrobacterium tumefaciens were produced in the early 1980s (Zambryski and cois, EMBO J. (1983), 2: 2143-2150), using this technology initially as a way to achieve resistance to pathogenic microorganisms (Powell et al., Science (1986), 232: 738-743), to insects (Vaeck et al., Nature (1987), 328: 33-37), and herbicides (De Block et al., 1987, EMBO J. 6: 2513-2518).
  • mice fed transgenic potatoes containing the AgsHB showed a primary immune response that is similar to that obtained when a single dose of the commercial vaccine is administered intraperitoneally, indicating that the expression of antigens in edible tissues of plants can be considered as a new route of immunization (Richter et al., Nature Biotechnology (2000), 18: 1167-1171).
  • Patent No. US5484719 (Lam et al., January 16, 1996); Patent No. US5612487 (Lam et al., January 16, 1996); Patent No. US5914123, div of patent No. US5612487 and continuation in part of patent application No. PCT / US94 / 02332 (Arntzen et al. June 22, 1999); Patent No. US6136320 (Arntzen et al. June 22, 1999); Patent application WO9612801 (Arntzen et al. May 28, 2002) and patent application No. US2002006411 (Lam et al. June 4, 2002).
  • HBV hepatitis B virus
  • the antigen is formed by a single protein and is efficiently particulate in simple eukaryotic systems, such as yeast.
  • simple eukaryotic systems such as yeast.
  • AgsHB does not cover the expression of pentamers or empty envelopes of HAV in plants.
  • Other patent applications specifically describe the expression of different viral antigens, such as that of the human papillomavirus in patent application No. WO0161022 of Sohn et al. of August 23, 2001; that of foot and mouth disease virus in patent application No. CN1319670 of Zhong et al. of October 31, 2001; of rotavirus in patent application WO0159070 of Lee et al. of August 16, 2001 and that of the gumboro virus in patent application No. WO0197839 of Shachar et al. of December 27, 2001.
  • recombinant proteins in plants offer many potential advantages to generate pharmaceutical compounds or vaccines of importance in clinical medicine.
  • plant systems are cheaper than industrial infrastructure used in fermentation systems or bioreactors.
  • the technology to harvest and process plants and their products on an industrial scale is now available.
  • Third, the requirement of purification of the compound can be eliminated when the plant tissue containing the recombinant protein is used as food (as in the case of edible vaccines).
  • recombinant proteins can be directed to certain intracellular compartments (such as mitochondria, vacuoles, chloroplasts and endoplasmic reticulum), or express them directly in those compartments (such as chloroplast).
  • plants as an expression system of recombinant proteins of pharmaceutical importance also have the advantage that many of the steps of the secretory pathway, including folding, assembly, glycosylation at the endoplasmic reticulum level, are similar to mammalian cells (Ma and Hein, , Plant Physiol. (1995), 109: 341-346; Rayon et al., J. Exp. Bot.
  • the base design of the object of this invention is based on genetic constructs that allow the combined expression of genes that code for different variants of structural proteins and mutated non-structural regions, directed to recombinant expression in transgenic pentamer plants and HAV antigenic envelopes capable of generating an immune response.
  • the novelty of our invention lies mainly in the regions of the viral genome that are used for the conformation of a new open reading frame that codes for a polyprotein of smaller size, consisting of strictly structural regions (only up to 2A protein) and the modified viral protease, which has a size larger than the 3C protease of the virus because the sites of cuts between 3A 3B and 3B / 3C proteins are mutated.
  • the expression of viral and pentameric envelopes of HAV in the cytosol and in the endoplasmic reticulum of transgenic plants is achieved for the first time, meaning the effectiveness of promoter and regulatory signals for the expression of these in plants.
  • the formation of pentamers and envelopes in the endoplasmic reticulum resulting from the combined expression of the structural region and the region responsible for proteolysis demonstrates the possibilities of this compartment for the assembly and storage of complex structures, such as HAV.
  • the production of pentamers and plant wraps allows us the possibility of using these as bioreactors to obtain a cheap and safe vaccine.
  • the invention is demonstrated by the examples in which transgenic tobacco, rice and carrot plants were used for the first time obtaining immunogenic envelopes and pentamers of the virus in plant cells.
  • the envelopes and pentamers of the HAV resulting from the invention can be used as vaccine antigens and also in diagnostic assays for the detection of HAV.
  • Genetic constructions Obtaining the VHA cDNA. From the RNA of the M2 strain of HAV isolated in Cuba, the nucleotide sequence coding for the open reading frame (MLA) of the virus was amplified, using the Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (TR-PCR) technique ).
  • This fragment was cloned into a plasmid and its nucleotide sequence was determined, which presents differences that generate variations in 11 amino acid residues with respect to the reported sequences.
  • the analysis of these sequences allows the strain M2 to be classified within subgenotype IA, to which almost all of the American strains belong. From the genome of this strain, modified fragments were designed and constructed that were used in the different genetic constructs that are the object of this invention.
  • the P1-2A polypeptide has an important function in the formation of the viral envelope.
  • this polypeptide there are two signals that regulate the formation of the envelope.
  • the 2A protein In the carboxyl terminal domain of this polypeptide is the 2A protein, which is required in the early stages of the assembly of the envelopes to achieve the formation of the pentamers from the union of five molecules of the P1-2A polypeptide still unprocessed.
  • the VP4 protein is required in a second stage for the association of the pentamers and the formation of the envelope.
  • vectors were constructed containing the modified open reading frame (MLAm) sequence, which codes for a polyprotein significantly lower than the original HAV polyprotein.
  • MLAm modified open reading frame
  • the plasmid vector used for plant transformation, by A. tumefaciens contains DNA sequences encoding HAV proteins fused to the nucleotide sequences regulating plant expression.
  • the sequence encoding the protein is not fused to any specific transport signal through the secretory pathway of the plant cell, so it is expressed in the cell's cytosol
  • Recombinant HAV for the expression exclusively of pentamers in the plant cell cytosol.
  • the VP4 protein as part of the VPO polypeptide is required for the association of the pentamers and the formation of the viral envelopes.
  • a plasmid vector was constructed for cytosol expression of the plant cell where the nucleotide sequence encoding the ⁇ MLAm polyprotein was fused to the sequences that regulate expression in plants and was used to obtain transgenic plants by infection with A. tumefaciens of tobacco, rice and carrot leaves.
  • the polyprotein expressed with this genetic construct is of a significantly smaller size and is capable of processing and forming exclusively immunogenic viral pentamers.
  • the smaller size of the pentamers with respect to the envelopes allows to achieve higher levels of expression since it causes a lower metabolic load in the plant cell.
  • the product obtained is equally feasible as an immunogen for the development of vaccines.
  • Recombinant HAV for the expression of envelopes and pentamers in the endoplasmic reticulum of the plant cell.
  • heterologous proteins in the endoplasmic reticulum in plants is achieved through the use of signal sequences to direct these to the secretory pathway, and therefore to the endoplasmic reticulum and retention signals in this organelle.
  • signal sequences a sequence encoding the N-terminal peptide of sweet potato sporamine was used.
  • sequence encoding the KDEL peptide located at the carboxyl end of the protein was used.
  • the nucleotide sequence encoding the polypeptide P1-2A was fused at its 5 'end to the sequence encoding the signal peptide of the sweet potato sporamine and at its 3' end to the sequence encoding a spacer peptide linked to turn to the sequence that codes for the KDEL peptide.
  • the resulting DNA fragment was placed under plant expression regulation signals and cloned into a binary vector for plant expression.
  • the sequence coding for the 3ABC mutated polypeptide was also fused at its 5 'end to the sequence coding for the sweet potato sporamine signal peptide and at its 3' end to the sequence coding for the KDEL peptide and under the regulatory signals for expression in plants.
  • the two polypeptides are located in the endoplasmic reticulum and the 3ABC protease is able to process the P1-2A polypeptide and achieve efficient particle formation.
  • Recombinant HAV for the expression exclusively of pentamers in the endoplasmic reticulum of the plant cell.
  • the nucleotide sequence corresponding to the P1-2A polypeptide was removed from the nucleotide sequence corresponding to the VP4 protein and a ⁇ P1-2A polypeptide was obtained. This sequence was fused at its 5 'end to the sequence that codes for the sweet potato sporamine signal peptide and at its 3' end to the sequence that codes for a spacer peptide linked in turn to the sequence encoding the peptide .
  • the sequence coding for the 3ABC mutated polypeptide was also fused at its 5 'end to the sequence coding for the sweet potato sporamine signal peptide and at its 3' end to the sequence coding for the KDEL peptide and under the regulatory signals for expression in plants.
  • the two polypeptides are located in the endoplasmic reticulum and the 3ABC protease is able to process the P1-2A polypeptide and achieve pentamer expression exclusively. These plants exhibit higher levels of expression and better growth and development, which leads to obtaining more biomass. Identification of the transgenic plants that express the product of the modified HAV genes.
  • A. tumefaciens was transformed with each of the binary vectors and bacterial colonies containing these plasmids were obtained.
  • the integration of DNA into plants was checked by Southern blot and PCR techniques. From the leaves of transgenic plants the extraction of soluble proteins was performed, macerating these with liquid nitrogen in a protein extraction buffer.
  • the envelopes and pentamers were identified using HAV specific antisera and a neutralizing monoclonal antibody, using immunochemical techniques, such as Western blot, Immunoenzymatic Assay (ELISA) or Immunomicroscopy, showing that transgenic plants express polyprotein or in some cases expected polypeptides and that these are processed and assembled in pentamers or envelopes. Plants that expressed higher levels of recombinant protein were used for purification of the envelopes and pentamers using a neutralizing monoclonal antibody. Determination of the immunogenicity of the envelopes and purified pentamers.
  • immunochemical techniques such as Western blot, Immunoenzymatic Assay (ELISA) or Immunomicroscopy, showing that transgenic plants express polyprotein or in some cases expected polypeptides and that these are processed and assembled in pentamers or envelopes. Plants that expressed higher levels of recombinant protein were used for purification of the envelopes and pentamers using a neutralizing monoclonal antibody. Determination of
  • the immunopotence of the sheaths and pentamers of HAV were determined by the immunological response of the mice, immunized with the purified product from leaves of tobacco and rice plants, and of mice fed with transgenic carrots expressing the HAV antigen.
  • the methods for the introduction of the antigen were the oral and parenteral route.
  • the immune response was controlled and verified using the ELISA technique to determine the reactivity of the animal antiserum against HAV and by the ability of the immune serum to neutralize infectious HAV in vitro.
  • the antigenic similarity between the envelopes and purified pentamers resulting from the expression of our constructions and the original virus is: the levels of expression of envelopes and pentamers products of the constructions that we revindicate are higher in plants than those obtained when the open reading frame of the HAV is expressed or the P1-2A region and the P3 region are coexpressed, since the polyprotein obtained as a result of the expression of our constructions is of a size significantly smaller than that of the original virus;
  • the 3ABC polypeptide is composed exclusively of the 3A, 3B and 3C proteins and has mutated the self-processing sites between the 3A / 3B and 3B / 3C proteins, which prevents the processing of this polypeptide and therefore the proteolytic function of polyprotein is assumed by it more efficiently; the expression levels of pentamers and viral envelopes of HAV in the endoplasmic reticulum of the plant cell are higher than in the cytosol; the expression exclusively of pentamers in the plant cell is
  • Plasmids pBvHARE, pB ⁇ VHARE, pBMLAm and pB ⁇ MLAm were deposited under the Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms in the Belgian Coordinated collection of Microorganisms BCCM, LMBP-COLLECTION with access number LMBP 4721; LMBP 4722; LMBP 4723 and LMBP 4724 respectively on May 19, 2003. DESCRIPTION OF THE FIGURES.
  • Figure 1 Genetic constructs for the expression of envelopes and pentamers in the plant cell cytosol.
  • Figure 2. Genetic constructs for the expression of pentamers in the cytosol of the plant cell. A) Scheme of ⁇ MLAm without the sequence coding for VP4.
  • FIG. 7 Western blotting of proteins from transgenic tobacco, carrot and rice plants, transformed with genetic constructs for expression in cytosols of envelopes and pentamers.
  • Figure 8. Immunoenzymatic assay (ELISA) performed on tobacco, carrot and rice plants, transformed with genetic constructs for the expression in cytosols of HAV envelopes and pentamers.
  • ELISA Immunoenzymatic assay
  • Figure 9 Electronic immunomicroscopy of a tobacco plant, transformed with the pBMLAm construction.
  • Figure 10 ELISA of inhibition of sera from mice immunized intraperitoneally with purified HAV pentamers from rice plants and tobacco.
  • Figure 1 ELISA for inhibition of sera from mice immunized orally with HAV pentamers purified from rice plants and tobacco.
  • FIG. 1 The sequence of interest of plasmid pMLA1 is shown in Figure 1 (A). From the M2 strain of HAV isolated and characterized in Cuba, the RNA was purified and a 6.7 kb DNA fragment was amplified by the Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (TR-PCR) technique, using specific oligonucleotides (SEQ ID NO 1 and 2 1) for other reported HAV sequences. The band was cloned into a BlueScript vector (KS +), previously digested with the Sma ⁇ enzyme. The resulting plasmid was named pMLA1 and was used for nucleotide sequencing of the HAV MLA of the Cuban M2 strain.
  • TR-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
  • the DNA sequence (SEQ ID NO 3) presents changes with respect to those reported that generate 11 amino acid changes.
  • the analysis of these sequences allows the strain M2 to be classified within subgenotype IA, to which almost all of the American strains belong. This sequence confirms that the Cuban strain M2 is really a strain of HAV different from those previously reported.
  • Example 2 Genetic constructs for the expression of envelopes and pentamers in the plant cell cytosol.
  • FIG. 1 The sequence of interest of plasmid pP1-2A is shown in Figure 1 (B).
  • This plasmid was obtained by amplifying the sequence coding for the structural proteins (P1-2A) using the PCR technique, using specific oligonucleotides (SEQ ID NO 4) complementary to the 5 'regions encoding the VP4 protein and the 3 ' region of the sequence encoding protein 2A respectively from plasmid pMLA
  • the 2.5 kb amplified band (SEQ ID NO 6) was cloned into the BlueScript vector (KS +) digested Sma ⁇
  • KS + BlueScript vector
  • FIG.C To obtain plasmid p3ABC, whose sequence of interest is shown in Figure 1 (C), the 0.2 kb sequence encoding the 3A protein was amplified by PCR, using oligonucleotides (SEQ ID NO 7 and 8) complementary to the 5 ' and 3'de region this gene and was cloned
  • a synthetic nucleotide sequence (SEQ ID NO 9 and 10) encoding the 3B protein was cloned into the _RcoRV-X £> sites, obtaining plasmid p3AB.
  • the 0.65 kb sequence encoding the 3C protein was amplified by PCR, where oligonucleotides SEQ ID NO 11 and 12 were used. This band was cloned into the P3AB vector in the Xi al-H ⁇ dlIl sites.
  • the plasmid pKMLAm was obtained by cloning the 3.4 kb MLAm band, digested with the Sma ⁇ -Cla ⁇ enzymes, into the pKTPL-2 vector, which contains the CaMV 2x 35S promoter sequence, the TEV leader sequence and the 35S terminator of the CaMV. Plasmid pKTPL-2 was digested with the enzymes col / col-Klenow-C / al. The sequence of interest of the binary plasmid pBMLAm is shown in Figure 1 (F).
  • This plasmid was obtained by digesting the plasmid pKMLAm with the Sph ⁇ enzymes, and subsequently treated with mung bean nuclease, resulting in a 4.7 kb band that was cloned into the binary vector pBin19, digested with the Sma ⁇ enzyme.
  • the resulting plasmid pBMLAm therefore contains: the neomycin phosphotransferase II (NPT II) gene which codes for the selection marker, kanamycin; the MLAm gene, which codes for modified HAV polyprotein, regulated by the 2X 35S promoter, the TEV leader, the CaMV terminator and the nucleotide sequence of the right and left edges of the T-DNA, through which these are transferred genes to the genome of the plant.
  • NPT II neomycin phosphotransferase II
  • MLAm which codes for modified HAV polyprotein, regulated by the 2X 35S promoter, the TEV leader, the CaMV terminator and the nucleotide sequence of the right and left edges of the T-DNA, through which these are transferred genes to the genome of the plant.
  • Example 3 Genetic constructs for the expression of pentamers in the plant cell cytosol.
  • the sequence of interest of plasmid p ⁇ MLAm is shown in Figure 2 (A).
  • the 114 bp fragment of the plasmid pMLA was removed by cutting with the Smal-Psil enzymes and replaced by the synthetic nucleotide sequence (SEQ ID NO 15 and 16) that restores the start of the gene that encodes for the VP2 protein.
  • the sequence of the ⁇ MLAm region corresponds to SEQ ID NO 17.
  • the plasmid pK ⁇ MLAm was obtained by cloning the ⁇ MLAm band (3.46 kb) digested with the Sma ⁇ -Cla ⁇ enzymes, in the digested plasmid pKTPL-2 col / col -Klenow-C / al
  • the sequence of interest of the binary plasmid pB ⁇ MLAm is shown in Figure 2 (B), was obtained by digesting the binary plasmid pBin19 with the Smal enzymes and a 4.6 kb DNA fragment resulting from the digestion of the plasmid was cloned in this vector pKMLAm with the Sph ⁇ enzymes and treated with mung bean nuclease.
  • the resulting plasmid pB ⁇ MLAm contains: the neomycin phosphotransferase II (NPT II) gene which codes for the selection marker, kanamycin; the MLAm gene, which codes for modified HAV polyprotein, regulated by the 2X 35S promoter, the TEV leader sequence, the CaMV 35S terminator and the nucleotide sequence of the right and left edges of the T-DNA, whereby They transfer these genes to the plant genome.
  • NPT II neomycin phosphotransferase II
  • Example 4 Genetic constructs for the expression of envelopes and pentamers in the endoplasmic reticulum of the plant cell.
  • the sequence of interest of plasmid pBVHARE is shown in Figure 3B.
  • the synthetic fragment (SEQ ID NO 18 and 19) coding for the retention signal in the endoplasmic reticulum (KDEL) was cloned into the vector BS (+) at the EcoRV-C / al sites.
  • Plasmid p3ABCRE was obtained by digesting plasmid p3ABC with the enzymes X ⁇ ol Klenow-EcoRI and cloning the 3ABC sequence at the EcoRI-EcoRV sites ( Figure 3A, SEQ ID NO 23).
  • the structural region P1-2A-KDEL (2.5 kb), extracted from plasmid pP1-2ARE with the enzymes Sma ⁇ -Cla ⁇ , were cloned separately. in the digested plasmid pKTPL-2 col / col / Klenow-C / al, resulting in plasmid pKP1-2ARE.
  • the 3ABC-KDEL 1 kb region was removed from plasmid p3ABCRE with the enzymes ⁇ / col-C / al and cloned into plasmid pKTPL-2 digested with the same enzymes, resulting in plasmid pK3ABCRE.
  • the binary vector pBin 19 was digested with the enzyme Sal ⁇ , and in this site the 2 kb sequence was cloned, extracted from the plasmid pK3ABCRE, digested with the enzyme Sa / I.
  • plasmid PB3ABCRE was obtained.
  • the resulting plasmid the pBVHARE carries the structural regions and the region with proteolytic function separately, fused to the retention signal in the reticulum and under the expression regulation signals in plants and the neomycin phosphotransferase II (NPT II) gene which code for the selection marker.
  • NPT II neomycin phosphotransferase II
  • Plasmid pB ⁇ VHARE The sequence of interest of plasmid pB ⁇ VHARE is shown in Figure 4B.
  • plasmid pP1 ⁇ 2ARE was digested with Sma ⁇ -Pst ⁇ enzymes and this fragment was replaced by the synthetic nucleotide sequence (SEQ ID NO 15 and 16), with the 5 'end of the gene coding for the VP2 protein.
  • the resulting binary plasmid contains: the structural region without the sequence coding for the VP4 protein fused to the sequence coding for the KDEL peptide, under the expression regulation signals in plants; the 3ABC-KDEL region under these same signals and the neomycin phosphotransferase II (NPT II) gene which codes for the selection marker.
  • Example 6 Obtaining envelopes and pentamers of HAV in transgenic plants of Nicotiana tabacum.
  • Nicotiana tabacum plants were carried out following the method of Zambryski et al. (1983).
  • strain AT 2260 (Deblaere et al., 1985) of Agrobacter ⁇ um tumefaciens was transformed by the liquid nitrogen method (Hofgen and Willmitzer, 1988) with the developed binary plasmids (pB ⁇ VHARE, pBVHARE, pB ⁇ MLAm, pBMLAm) and with the recombinants leaf discs of tobacco plants of the Petit Havana SR 1 variety, grown in vitro.
  • Kanamycin 100 mg / L was used as a marker for the transformation event selection.
  • Example 7 Obtaining envelopes and pentamers of HAV in transgenic plants of Carrot ⁇ Daucus carota L.)
  • Agrobacterium tumefaciens transformed with binary plasmids pB ⁇ VHARE, pBVHARE, pB ⁇ MLAm, pBMLAm
  • pB ⁇ VHARE, pBVHARE, pB ⁇ MLAm, pBMLAm binary plasmids
  • the genetic transformation of rice plants was carried out following the method used by Hiei et al. (1994). For this, the At 2260 strain of Agrobacterium tumefaciens was transformed by the method of liquid nitrogen with the developed binary plasmids (pB ⁇ VHARE, pBVHARE, pB ⁇ MLAm, pBMLAm) and with these recombinants calluses obtained from the skull were transformed. Kanamycin (100 mg / L) was used as a marker for the transformation event selection. To check the presence of the genes of interest introduced in the genome of the tobacco plant and their expression, as well as the formation of envelopes Different procedures were performed viral or pentamers, which are described below.
  • Example 9 Molecular and immunochemical characterization of transgenic plants. Southern blot analysis. To obtain the total DNA, with a view to performing Southern blot analyzes on tobacco, carrot and rice plants, a routine method described by Dellaporta et al. (1983) was used. For the analysis of the samples, leaves of transformed plants were taken with the constructions indicated above and that showed resistance to the selection marker. As negative controls, non-transformed plant leaves were used.
  • Figure 5 shows the Southern transgenic tobacco plants transformed with the constructs for the cytosol expression of HAV shells and pentamers (pB ⁇ MLAm, pBMLAm), digested S al and Cla ⁇ (resulting in a 3.4 kb band ) and in the endoplasmic reticulum (pB ⁇ VHARE, pBVHARE), digested with the Smal-EcoRI enzymes (resulting in a 2.4 kb band).
  • the results shown in Figure 5 demonstrate that plants contain in their genome the sequence they code for structural proteins.
  • the results of the Western blot are shown in Figure 7.
  • Immunodetection of the recombinant molecules obtained in the expression assay was performed by Western blot, according to the methodology described by Towbin et al. (1979).
  • the samples for the Western blot consisted of total soluble proteins extracted from different transgenic tobacco, carrot and rice plants, transformed with the constructions that allow the expression of pentamers exclusively: Clones, tobacco 5, carrot 7 and Rice 3 transformed with the construction pB ⁇ VHARE, which enables the expression of pentamers in the endoplasmic reticulum of these plants; and the clones, tobacco 25, carrot 10 transformed with the construction pB ⁇ MLAm, which allows the expression of the pentamers in the cytosol.
  • Proteins from SDS-PAGE were transferred to a nitrocellulose membrane and proteins of interest were identified using the anti-VP1 AcP conjugated to the enzyme alkaline phosphatase (PhoA). The expression of said enzyme was detected by a colorimetric reaction.
  • the results of the Western blot are shown in Figure 7 and the expression of a protein of the size of the VP1 protein can be observed in all cultures, as well as other intermediates resulting from the incomplete processing of polyprotein.
  • ELISA Immunoenzymatic assay
  • the ELISA results are shown in Figure 8. Sandwich type tests were performed.
  • the immunoassay plates (Maxisorp, Nunc) were coated with 10 ⁇ g / mL of AcM 7E7, in carbonate buffer (0.02 M Na 2 CO 3 , 0.028 M NaHCO 3 , pH 9.6), for 4 hours at 37 ° C. They were blocked for 2 hours at 37 ° C, with 5% skim milk in phosphate buffered saline (PBS) (100 mM NaCI, 80 mM Na 2 PO 4, 20 mM NaH 2 PO 4 , pH 7.4).
  • PBS phosphate buffered saline
  • tissue samples of tobacco plant leaves transformed with the plasmid pBMLAm and unprocessed plants from tissue culture were fixed in a 4% Formaldehyde solution and subsequently of 0.2% Glutaraldehyde. They were then dehydrated in ethanol and soaked in a solution of Lowicryl K 4M (Chemische Werke Lowi, Waldkraiburg).
  • the ultra-thin cuts were placed on a nickel grid and incubated with the AcM 7E7, followed by incubation with the mouse anti-lgG AcP, labeled with 15 nm colloidal gold particles (British Bio-Cell International) .
  • the immunostained sections were contrasted for 5 minutes in Uranilacetate and for 7 minutes in Lead Citrate, before being examined by the transmission electron microscope (Jeol-Jem 2000EX, Japan).
  • the results show particles of approximately 27 nm in diameters only in the tobacco plant transformed with the pBMLAm construct, whereby the protein is expressed in the cell's cytosol.
  • Example 10 Purification of wraps and pentamers from transgenic tobacco and rice plants.
  • an anti-HAV monoclonal antibody obtained in the laboratories of the CIGB was used, which exclusively recognizes the immunogenic particles and pentamers.
  • Vegetable cell proteins were extracted using the protocol described for Western blot analysis. The supernatant resulting from centrifugation was dissolved in 0.5 M sodium chloride and mixed with the gel-coupled antibody (Bio-rad Laboratories, Richmond, CA) and incubated for 16 hours at 4 ° C. The gel was washed with 10 volumes of PBS (100 mM NaCI, 80 mM Na 2 PO 4, 20 mM NaH 2 PO 4 , pH 7.4) and then the protein of interest was eluted with 0.2 M glycine, pH 2.5 The eluate was neutralized with basic Tris and dialyzed against PBS. The presence of HAV particles and pentamers from these leaf extracts were developed by ELISA, using a commercial neutralizing monoclonal 7E7 (Mediagnost), specific for the recognition of viral envelopes and pentamers of HAV.
  • Example 11 Determination of the immunogenicity of the envelopes and the purified pentamers from transgenic plants by intraperitoneal administration.
  • mice The 14-week white ICR mice were given two doses of 750 EL.U with purses and pentamers purified from transgenic tobacco and rice plants. In the same way, mice were inoculated with a commercial HAV antigen (Mediagnost), used as a positive control and with PBS (negative control). Blood samples were collected on days 0, 15, 30, 50 and 70 post-inoculation.
  • HAV antigen Mediagnost
  • the antibody levels produced were measured by an inhibition ELISA: the plate was coated with 5 ⁇ g of AcM 7E7 and incubated for 4 hours, then washed once with 0.1% PBS-Tween. It was blocked by adding 5% skim milk, diluted in 0.1% Tween PBS and incubated for 2 hours at 37 ° C. The plate was washed 3 times with 0.1% PBS-Tween. The sera of the immunized mice, previously incubated for 20 min at 37 ° C, were then added with HAV antigen (Mediagnoct). The plate was incubated for 12 hours at 16 ° C and subsequently washed 5 times with 0.1% PBS-Tween.
  • Oral administration of the antigen was carried out in two ways: using the purified antigen and supplying the animals with carrots that express the antigen.
  • For the determination of antigenicity by oral administration of the envelopes and purified pentamers 8 weeks Balb / c mice, pentamers and viral envelopes were administered for 8 weeks, in four doses of 7500 EL.U. 200 ⁇ l of blood was collected at 0, 15, 30, 50 and 70 days post-inoculation to detect the presence of anti-HAV antibodies, by means of an inhibition ELISA.
  • the inhibition ELISA was performed by the procedure described above in Example 11. According to the results shown in Figure 11, the oral administration of HAV pentamers expressed in transgenic plants produces an immune response which is demonstrated by the averages of inhibition. of the sera of the mice used in the experiment. The averages of inhibition of orally administered sera are lower when compared to those obtained after intraperitoneal administration. Oral administration of pentamers through the use of edible plants was performed by feeding the mice with 5 g of raw carrots (transformed with the pB ⁇ MLAm construct that is designed to produce only pentamers) once a week for four weeks. As a negative control, sera from mice fed with non-transformed carrots were used. The ability of these plants to elicit an antibody response was demonstrated by an inhibition ELISA shown in Figure 12. SEQUENCE LIST
  • Oligonucleotide sequence # 8 used to amplify the 3A sequence by PCR.
  • Sequence # 9 Synthetic fragment whose nucleotide sequence encodes protein 3B and where nucleotides T are replaced by C and G by C respectively ⁇ 400> 9 tccagctgtt ggggtttatc atggagtgac taagcccaaa caagtgatta aattggatgc 60 agatccagta gagtctcagt tgact 85
  • Sequence # 10 Synthetic fragment whose nucleotide sequence encodes protein 3B and where nucleotides T are replaced by C and G respectively by C (complementary chain).
  • ⁇ 400> 10 ctagagtcaa ctgagactct actggatctg catccaattt aatcacttgt ttgggcttag 60 tcactccatg ataaacccca acagctgga 89
  • Synthetic fragment that restores the start of the transcription of the VP2 protein restores the start of the transcription of the VP2 protein.
  • Synthetic fragment that modifies the 3 'end of protein 2A introduces a spacer between it and the KDEL signal.
  • Synthetic fragment that modifies end 3 ! of the prota ⁇ na 2A introduces a spacer between this one and the signal KDEL.

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Abstract

Generación de construcciones genéticas basadas en fragmentos modificados del genoma del virus de la hepatitis A (VHA), utilizando la cepa M2, aislada en Cuba. Las secuencias nucleotídicas de estos fragmentos fusionados a señales de localización y de regulación apropiadas se expresan en plantas transgénicas, dando lugar a antígenos recombinantes del VHA, compuestos por pentámeros y/o envolturas vacías, capaces de generar una respuesta inmune.

Description

ANTIGENOS RECOMBINANTES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A OBTENIDOS
EN CÉLULAS VEGETALES.
Campo de la invención Esta invención se relaciona con la rama de la biotecnología y más específicamente con la expresión de proteínas recombinantes en plantas transgénicas y su uso como antígenos vacunales. En particular se proporcionan antígenos recombinantes del virus de la hepatitis A obtenidos en plantas transgénicas a partir de la expresión de fragmentos modificados del genoma del viruas HAV de la cepa M2 aislada en Cuba. Se demuestra además la utilidad de los mismos para desarrollar respuesta inmune en animales luego de serle administrados estos por diferentes vías. Arte Previo
El Virus de la Hepatitis A. El genoma del VHA es ARN de simple cadena y polaridad positiva de aproximadamente 7.5 kb que codifica para una poliproteína de 253 kDa. (Cohén, J. I. y col., Journal of Virology (1987), 61 :3035-3039). La poliproteína sufre procesos co y post-traduccionales, dando lugar a proteínas maduras estructurales (VP1 , VP2, VP3, VP4 Y 2A) y no estructurales (2B,2C, 3A, 3B, 3C y 3D). La proteasa 3C (Pro3C), presente en el dominio P3 de la poliproteína viral, es la proteasa que interviene en el clivaje de la poliproteína del VHA (Martín y cois., J Virol. (1999), 73(8):6220-7), permitiendo la liberación de los intermediarios P1-2A, 2BC y P3, los cuales son procesados posteriormente. Por lo tanto para que se formen adecuadamente las envolturas y ocurra la replicación del VHA es necesario que ocurra un procesamiento proteolítico diferencial de la poliproteína del VHA. Durante el procesamiento de la región P3 solamente la unión 3C/3D es eficientemente cortada y existe un procesamiento retardado en los sitios 3A/3B y/o 3B/3C permitiendo la acumulación del polipeptido intermediario 3ABC (Kusov y cois., Journal of Virology (1999), 73:9867-9878), el cual corta el polipéptido P1-2A con similar eficiencia que la proteasa 3C propicia una mayor eficiencia en la formación de los pentámeros. La forma característica del virus proviene de la unión de las proteínas virales, y su configuración tridimensional es importante para la generación de una respuesta inmunológica protectora. El virión del VHA presenta un sitio antigénico de neutralización inmunodominante que está estrictamente conservado entre cepas del VHA aisladas de diversas áreas geográficas. Está formado por cinco epitopes conformacionales, tres de ellos en los pentámeros y dos que se forman una vez ensamblados los pentámeros para formar las envolturas. Se plantea que estos últimos epitopes se forman por cambios conformacionales en el sitio antigénico o por yuxtaposición de fragmentos de epitopes presentes en los pentámeros durante el ensamblaje de estos. Tanto los pentámeros como las partículas virales inducen anticuerpos neutralizantes y por tanto pueden ser útiles para el desarrollo de vacunas (Stapleton y cois., Journal of Virology (1993), 67:1080- 1085). Utilizando Baculovirus recombinantes que contenían el marco de lectura completo del VHA se expresó la poliproteína gigante del VHA además de otras proteínas intermediarias del procesamiento de esta en células de insectos (Stapleton y cois., The Journal of Infectious Diseases (1995), 171 :9-14). También se construyeron virus vaccinia recombinantes, los cuales expresaron esta misma poliproteína del VHA en células de mamífero. Los extractos de células infectadas con estas construcciones genéticas mostraron que ocurría un procesamiento post- traduccional de la poliproteína dando lugar a envolturas similares a las del VHA (Winokur y cois., Journal of Virology (1994), 65:5029-5036). Existen patentes que describen variantes de vacunas recombinantes contra VHA expresadas en sistemas de baculovirus y vaccinias, tales como: solicitud de patente No WO9301279 Winokur y cois; 21 de Enero de 1993.; patente No US5294548 (McLinden y col., marzo 1994); solicitud de patente WO09844122 (Probst, August 27, 2002); solicitud de patente WO9111460 y patente US5605692 (Thomas y col., 25 de Febrero de 1997), donde se utilizan las secuencias del marco de lectura abierto completo (MLA) para la producción de envolturas y pentámeros inmunogénicos y se revindican los métodos para la obtención de envolturas del VHA, expresando las regiones estructurales y la región P3 en una orientación cis, trans y en construcciones bicistronicas. Plantas transgénicas como biorreactores.
Las primeras plantas transgénicas originadas a partir de la transferencia de genes mediada por la rizobacteria Agrobacterium tumefaciens se produjeron a principios de la década de los 80 (Zambryski y cois, EMBO J. (1983), 2: 2143-2150), empleándose esta tecnología inicialmente como una forma de lograr la resistencia a microorganismos patogénicos (Powell y cois., Science (1986), 232: 738-743 ), a insectos (Vaeck y cois., Nature (1987), 328: 33-37), y a herbicidas (De Block y cois., 1987, EMBO J. 6: 2513-2518). Pero la demostración de la capacidad de las células vegetales de ensamblar correctamente proteínas foráneas de una alta complejidad estructural indicó rápidamente su posible valor como una nueva estrategia de escalado para la producción económica de proteínas recombinantes de interés industrial y biofarmacéutico (Barta y cois., Plant Mol. Biol (1986), 6: 347-357; Cramer y cois., Ann. N Y Acad. Sci. (1996), 792: 62-71 ; Staub y cois, Nature Biotechno. (200I). 18: 333-338).
En 1992, se introdujo un nuevo concepto en la producción de vacunas de subunidades debido a la demostración de que plantas transgénicas podían expresar el antígeno de superficie de hepatitis B (AgsHB). En las bases de esos hallazgos se pensó en la idea que las plantas podrían ser usadas para producir candidatos vacunales en tejidos comestibles y lograr inmunizar solamente consumiendo estos tejidos, de esta forma aparece la denominación de "vacunas comestibles" (Arntzen y cois., Plants.Vaccine (1994), 94:339-344. Posteriormente se demostró que ratones alimentados con papas transgénicas conteniendo el AgsHB mostraron una respuesta inmune primaria que es similar a la que se obtiene cuando se administra una dosis única de la vacuna comercial intraperitonealmente, indicando que la expresión de antígenos en tejidos comestibles de plantas puede ser considerada como una nueva vía de inmunización (Richter y col., Nature Biotechnology (2000), 18:1167-1171). Existen varias patentes que describen el uso de las plantas para la expresión de vacunas, tales como: patente No US5484719 (Lam y col., Enero 16, 1996); patente No US5612487 (Lam y col., Enero 16, 1996); patente No US5914123, divisional de la patente No US5612487 y continuación en parte de la solicitud de patente No PCT/US94/02332 (Arntzen y col. Junio 22, 1999); patente No US6136320 (Arntzen y col. Junio 22, 1999); solicitud de patente WO9612801 (Arntzen y col. mayo 28, 2002) y la solicitud de patente No US2002006411 (Lam y col. 4 de Junio, 2002). Los documentos anteriormente señalados describen además del uso de las plantas como vacunas, la expresión del AgsHB en plantas y en algunos casos utilizan el termino "hepatitis viral" para referirse al virus de la hepatitis B (VHB). El VHB difiere significativamente del virus de la hepatitis A con características muy diferentes y por tanto pertenecen a distintos géneros desde el punto de vista taxomónico. Para lograr proteínas recombinante del VHA capaces de levantar una respuesta inmunológica importante es necesario expresar varias proteínas del genoma viral y luego lograr que se formen partículas tales como pentámeros o envolturas vacías. El procesamiento y la formación de partículas inmonogénicas, solamente se ha logrado en sistemas eucarioticos como vaccíneas y baculovirus y no en sistemas más sencillos como en levaduras. En plantas transgénicas no se han expresados antígenos con la complejidad del VHA. En el caso del VHB, el antígeno está formado por una sola proteína y es particulado eficientemente en sistemas eucariotico simples, como levadura. Por lo anteriormente expuesto creemos que la expresión del AgsHB no abarca la expresión de pentámeros o envolturas vacías del VHA en plantas. En otras solicitudes de patentes se describen específicamente la expresión de diferentes antígenos virales, tales como el del virus del papiloma humano en la solicitud de patente No WO0161022 de Sohn y col. del 23 de agosto del 2001 ; el del virus de la fiebre aftosa en la solicitud de patente No CN1319670 de Zhong y col. del 31 de octubre del 2001 ; de los rotavirus en la solicitud de patente WO0159070 de Lee y col. del 16 de Agosto del 2001 y el del virus del gumboro en la solicitud de patente No WO0197839 de Shachar y col. del 27 de Diciembre del 2001.
La producción de proteínas recombinantes en plantas ofrecen muchas ventajas potenciales para generar compuestos farmacéuticos o vacunas de importancia en la medicina clínica. En primer lugar, los sistemas vegetales son más económicos que la infraestructura industrial utilizada en sistemas de fermentación o en biorreactores. En segundo lugar, ya está disponible la tecnología para cosechar y procesar plantas y sus productos a escala industrial. En tercer lugar, el requisito de la purificación del compuesto puede ser eliminado cuando el tejido de la planta que contiene la proteína recombinante se utiliza como alimento (como en el caso de las vacunas comestibles). En cuarto lugar, se puede dirigir las proteínas recombinantes a determinados compartimientos intracelulares (como mitocondrias, vacuolas, cloroplastos y retículo endoplasmático), o expresarlos directamente en esos compartimientos (como por ejemplo el cloroplasto). En quinto lugar los riesgos a la salud que se presentan por posible contaminación del producto recombinante con patógenos humanos son mínimos. Finalmente las plantas como sistema de expresión de proteínas recombinantes de importancia farmacéutica tienen como ventaja además que muchos de los pasos de la vía secretora, incluyendo plegamiento, ensamblaje, glicosilación al nivel de retículo endoplasmático son similares a las células de mamíferos (Ma y Hein, , Plant Physiol. (1995), 109: 341- 346; Rayón y cois., J. Exp. Bot. (1998), 49: 1463-1472.; Sanderfoot y Raikhel, Plant Cell. (1999), 11 : 629-641 ; Vítale y Denecke, Plant Cell (1999), 11 : 615-628; Lerouge y cois., Pharmaceutical Biotechnology (2000), 1 : 347-354).
Descripción detallada de la invención El diseño base del objeto de esta invención se apoya en construcciones genéticas que permiten la expresión combinada de genes que codifican para diferentes variantes de proteínas estructurales y regiones no estructurales mutadas, dirigidas a la expresión recombinante en plantas transgénicas de pentámeros y envolturas antigénicas del VHA capaces de generar una respuesta inmune. La novedad de nuestra invención radica fundamentalmente en las regiones del genoma viral que se emplean para la conformación de un marco de lectura abierto nuevo que codifica para una poliproteína de tamaño menor, conformada por las regiones estrictamente estructurales (solamente hasta la proteína 2A) y la proteasa viral modificada, la cual presenta una talla superior a la proteasa 3C del virus debido a que los sitios de cortes entre las proteínas 3A 3B y 3B/3C están mutados. La expresión de envolturas virales y pentámeros del VHA en el citosol y en el retículo endoplasmático de plantas transgénicas se logra por primera vez, significándose la efectividad de las señales promotoras y reguladoras para la expresión de estas en plantas. La formación de pentámeros y envolturas en el retículo endoplasmático producto de la expresión combinada de la región estructural y la región responsable de la proteólisis demuestra las posibilidades de este compartimiento para el ensamblaje y el almacenamiento de estructuras complejas, como es el caso del VHA. La producción de pentámeros y envolturas en plantas nos permite la posibilidad del empleo de estas como biorreactores para la obtención de una vacuna barata y segura.
La invención está demostrada mediante los ejemplos en los cuales se usaron plantas transgénicas de tabaco, arroz y zanahoria para la obtención por primera vez de envolturas y pentámeros inmunogénicos del virus en células vegetales. Las envolturas y pentámeros del HAV resultantes de la invención pueden ser usados como antígenos vacunales y además en ensayos diagnósticos para la detección de HAV. Construcciones genéticas. Obtención del cADN del VHA. A partir del ARN de la cepa M2 del VHA aislada en Cuba, se amplificó la secuencia nucleotídica que codifica para el marco de lectura abierto (MLA) del virus, utilizando la técnica de Trascripción Reversa- Reacción en cadena de la Polimerasa (TR- RCP). Este fragmento se clonó en un plásmido y fue determinada su secuencia nucleotídica, la cual presenta diferencias que generan variaciones en 11 residuos aminoacídicos con respecto a las secuencias reportadas. El análisis de estas secuencias permite clasificar a la cepa M2 dentro del subgenotipo IA, al cual pertenecen casi la totalidad de las cepas americanas. A partir del genoma de esta cepa se diseñaron y construyeron fragmentos modificados que se utilizaron en las diferentes construcciones genéticas que son objeto de esta invención.
Construcciones genéticas de vectores para la expresión de envolturas y pentámeros en plantas transgénicas.
Proteasa recombinante de VHA.
Para que se formen las envolturas virales es necesario que ocurra un procesamiento proteolítico diferencial de la poliproteína, que permita la liberación ordenada de las proteínas virales. La eficiencia de la formación de la envoltura aumenta cuando el intermediario 3ABC está presente debido a la interacción hidrofóbica de la proteína 3AB con la membrana y las proteínas virales. Para obtener un polipéptido 3ABC del cual no se libere la proteasa 3C y que a su vez conserve su función proteolítica, necesaria para formación de los pentámeros y envolturas del VHA, se mutaron los sitios de cortes de la proteasa 3C entre la proteínas 3A 3B, glutámico por valina y 3B/3C, serina por leucina respectivamente. Ese polipéptido se empleó en el diseño de novedosas y diferentes estrategias para la expresión de las proteínas del VHA formadoras de envolturas y pentámeros inmunogénicos.
VHA recombinante para la expresión de envolturas y pentámeros en el citosol de la célula vegetal. En el VHA, el polipéptido P1-2A tiene una función importante en la formación de la envoltura viral. En este polipéptido existen dos señales que regulan la formación de la envoltura. En el dominio carboxilo terminal de este polipéptido se encuentra la proteína 2A, que se requiere en las primeras etapas del ensamblaje de las envolturas para lograr la formación de los pentámeros a partir de la unión de cincos moléculas del polipéptido P1-2A aún sin procesar. La proteína VP4 se requiere en una segunda etapa para la asociación de los pentámeros y la formación de las envoltura. Para la expresión de la poliproteína modificada en el citosol de la célula vegetal, se construyeron vectores que contienen la secuencia del marco de lectura abierto modificado (MLAm), que codifica para una poliproteína significativamente menor que la poliproteína original del VHA. Esta secuencia es el resultado de la fusión de la secuencia que codifica para el polipéptido P1-2A y la secuencia que codifica para la proteasa 3ABC mutada.
El vector plasmídico utilizado para la transformación de plantas, mediante A. tumefaciens contiene secuencias de ADN que codifican para proteínas del VHA fusionadas a las secuencias nucleotídicas reguladoras de la expresión en plantas. En este caso la secuencia que codifica para la proteína no se encuentra fusionada a ninguna señal especifica de trasporte a través de la vía secretora de la célula vegetal, por lo que se expresa en el citosol de la célula
VHA recombinante para la expresión exclusivamente de pentámeros en el citosol de la célula vegetal. Como se ha descrito anteriormente la proteína VP4 como parte del polipéptido VPO se requiere para la asociación de los pentámeros y la formación de las envolturas virales.
De la secuencia nucleotídica codificante para la poliproteína MLAm se eliminó el fragmento que codifica para la proteína VP4, dando lugar a una secuencia denominada Δ MLAm. Se construyó un vector plasmídico para la expresión en el citosol de la célula vegetal donde la secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína Δ MLAm se fusionó a las secuencias que regulan la expresión en plantas y se usó para la obtención de plantas transgénicas mediante la infección con A. tumefaciens de hojas de tabaco, arroz y zanahoria. La poliproteína expresada con esta construcción genética es de una talla significativamente menor y es capaz de procesarse y formar exclusivamente pentámeros virales inmunogénicos. El tamaño menor de los pentámeros con respecto a las envolturas permite lograr mayores niveles de expresión ya que provoca en la célula vegetal una menor carga metabólica. El producto obtenido es igualmente factible de ser empleado como ¡nmunógeno para el desarrollo de vacunas. VHA recombinante para la expresión de envolturas y pentámeros en el retículo endoplasmático de la célula vegetal.
La acumulación de proteínas heterólogas en el retículo endoplasmático en plantas, se logra mediante el uso de secuencias señales para dirigir estas a la vía secretora, y por tanto al retículo endoplasmático y de señales de retención en este organelo. Se empleó como péptido señal, un secuencia que codifica para el péptido N-terminal de la esporamina del boniato. Como señal de retención de proteínas en el retículo endoplasmático se utilizó la secuencia que codifica para el péptido KDEL localizado en el extremo carboxilo de la proteína. La secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido P1-2A, se fusionó en su extremo 5' a la secuencia que codifica para el péptido señal de la esporamina del boniato y por su extremo 3' a la secuencia que codifica para un péptido espaciador unida a su vez a la secuencia que codifica para el péptido KDEL. El fragmento de ADN resultante se colocó bajo señales de regulación de la expresión en plantas y se clonó en un vector binario para su expresión en plantas. En este mismo vector binario se introdujo la secuencia que codifica para el polipéptido mutado 3ABC igualmente fusionado en su extremo 5' a la secuencia que codifica para el péptido señal de la esporamina del boniato y en su extremo 3' a la secuencia que codifica para el péptido KDEL y bajo las señales de regulación para la expresión en plantas. Los dos polipéptidos se localizan en el retículo endoplasmático y la proteasa 3ABC es capaz de procesar el polipéptido P1-2A y lograr una eficiente formación de partículas.
VHA recombinante para la expresión exclusivamente de pentámeros en el retículo endoplasmático de la célula vegetal. A la secuencia nucleotídica que codifica para el polipéptido P1-2A se le eliminó la secuencia nucleotídica correspondiente a la proteína VP4 y se obtuvo un polipéptido Δ P1-2A. Esta secuencia se fusionó en su extremo 5' a la secuencia que codifica para el péptido señal de la esporamina del boniato y por su extremo 3' a la secuencia que codifica para un péptido espaciador unida a su vez a la secuencia que codifica para el péptido. En este mismo vector binario se introdujo la secuencia que codifica para el polipéptido mutado 3ABC igualmente fusionado en su extremo 5' a la secuencia que codifica para el péptido señal de la esporamina del boniato y en su extremo 3' a la secuencia que codifica para el péptido KDEL y bajo las señales de regulación para la expresión en plantas. Los dos polipéptidos se localizan en el retículo endoplasmático y la proteasa 3ABC es capaz de procesar el polipéptido P1-2A y lograr la expresión de pentámeros exclusivamente. Estas plantas exhiben mayores niveles de expresión y un mejor crecimiento y desarrollo, lo que conlleva a la obtención de mayor biomasa. Identificación de las plantas transgénicas que expresan el producto de los genes del VHA modificado.
El A. tumefaciens se transformó con cada uno de los vectores binarios y se obtuvieron colonias bacterianas que contenían estos plásmidos. El A. tumefaciens, conteniendo las diferentes construcciones genéticas por separados, se utilizaron para la transformación de plantas y finalmente la obtención de plantas resistentes a la kanamicina como marcador de selección. La integración del ADN en las plantas se comprobó por las técnicas de Southern blot y PCR . A partir de hojas de plantas transgénicas se realizó la extracción de las proteínas solubles, macerando estas con nitrógeno líquido en un tampón de extracción de proteínas. Las envolturas y pentámeros se identificaron utilizando antisueros específicos al VHA y un anticuerpo monoclonal neutralizante, mediante el uso de técnicas inmunoquímicas, tales como Western blot, Ensayo Inmunoenzimático (ELISA) o Inmunomicroscopía, demostrándose que las plantas transgénicas expresan la poliproteína o en algunos casos los polipéptidos esperados y que estos son procesados y ensamblados en pentámeros o envolturas. Las plantas que expresaron mayores niveles de proteína recombinante se utilizaron para la purificación de las envolturas y los pentámeros utilizando para ello un anticuerpo monoclonal neutralizante. Determinación de la inmunogenicidad de las envolturas y pentámeros purificados.
La inmunopotencia de las envolturas y pentámeros del VHA fueron determinadas por la respuesta inmunologicas de los ratones, inmunizados con el producto purificado a partir de hojas de plantas de tabaco y arroz, y de ratones alimentados con zanahorias transgénicas que expresan el antígeno del VHA. Los métodos para la introducción del antígeno fueron la vía oral y parenteral. La respuesta inmune fue controlada y verificada utilizando la técnica de ELISA para determinar la reactividad del antisuero del animal ante el VHA y por la capacidad del suero inmune de neutralizar el VHA infectivo in vitro. VENTAJAS DE LA INVENCIÓN
Dentro de las ventajas más importantes que ofrece nuestra invención se encuentra: la similitud antigénica entre las envolturas y pentámeros purificados producto de la expresión de nuestras construcciones y el virus original; los niveles de expresión de envolturas y pentámeros productos de las construcciones que revindicamos son mayores en plantas que las obtenidas cuando se expresa el marco de lectura abierto del VHA o se coexpresa la región P1-2A y la región P3, ya que la poliproteína obtenida producto de la expresión de nuestras construcciones es de una talla significativamente menor a la del virus original; el_polipéptido 3ABC, está compuesto exclusivamente por las proteínas 3A, 3B y 3C y tiene mutados los sitios de auto procesamiento entre las proteínas 3A/3B y 3B/3C, que evita que ocurra el procesamiento de este polipéptido y por lo tanto la función proteolitica de la poliproteína es asumida por el mismo con mayor eficiencia; los niveles de expresión de pentámeros y envolturas virales del VHA, en el retículo endoplasmático de la célula vegetal son mayores que en el citosol; la expresión exclusivamente de pentámeros en la célula vegetal es más eficiente y permite un mejor crecimiento y desarrollo de la planta, debido a que estas partículas son de menor tamaño; el escalado y producción de proteínas de uso farmacéutico a partir de plantas es factible para producir grandes cantidades de antígenos; los costos de producción disminuyen con relación a otros sistemas empleados y descritos en el estado del arte; la expresión en plantas del antígeno del VHA disminuye los riesgos de contaminación con patógenos que afectan a los seres humanos; la inmunización oral contra el VHA contribuye significativamente a abaratar los costos de la inmunización por la posibilidad de usar las plantas sin necesidad de purificar completamente el producto.
Depósito de microorganismos
Los plásmidos pBvHARE, pBΔVHARE, pBMLAm y pBΔMLAm fueron depositados bajo el Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos en el Belgian Coordinated collection of Microorganisms BCCM, LMBP-COLLECTION con número de acceso LMBP 4721 ; LMBP 4722; LMBP 4723 y LMBP 4724 respectivamente el 19 de mayo, 2003. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.
Figura 1. Construcciones genéticas para la expresión de envolturas y pentámeros en el citosol de la célula vegetal. A) Esquema del MLA de la cepa M2 del VHA. B) Esquema de las secuencias que codifican para las proteínas estructurales (P1-2A) C) Esquema de las secuencias que codifican para la región 3ABC. D) Esquema del MLAm del VHA. E) Esquema del inserto de interés clonado en el vector binario para la expresión en plantas. Figura 2. Construcciones genéticas para la expresión de pentámeros en el citosol de la célula vegetal. A) Esquema del ΔMLAm sin la secuencia que codifica para VP4. B) Esquema del inserto de interés clonado en el vector binario para la expresión en plantas de ΔMLAm. Figura 3. Construcciones genéticas para la expresión de envolturas y pentámeros en el retículo endoplasmático de la célula vegetal. A) Esquema de la secuencia P1- 2A fusionada a la secuencia KDEL. B) Esquema del inserto de interés clonado en el vector binario par la expresión en el retículo endoplasmático. E- Espaciador, K- KDEL Figura 4. Construcciones genéticas para la expresión de pentámeros en el retículo endoplasmático de la célula vegetal. A) Esquema de la secuencia P1-2A, sin la secuencia VP4 y fusionada a la señal KDEL. B) Esquema del inserto de interés clonado en el vector binario para la expresión en plantas. E- Espaciador, K- KDEL Figura 5. Southern blot de ADN genómico de plantas transgénicas de tabaco. Figura 6. Southern blot de ADN de plantas transgénicas de zanahoria y arroz amplificado mediante RCP.
Figura 7. Western blot de proteínas de plantas transgénicas de tabaco, zanahoria y arroz, transformadas con construcciones genéticas para la expresión en citosols de envolturas y pentámeros. Figura 8. Ensayo inmunoenzimático (ELISA) realizado a las plantas de tabaco, zanahoria y arroz, transformadas con construcciones genéticas para la expresión en citosols de envolturas y pentámeros del VHA.
Figura 9. Inmunomicroscopía electrónica de una planta de tabaco, transformada con la construcción pBMLAm. A) planta no transformada. B) planta transformada. C) Planta transformada.
Figura 10. ELISA de inhibición de los sueros de ratones inmunizados por vía intraperitoneal con pentámeros del VHA purificados a partir de plantas de arroz y tabacos.
Figura 1. ELISA de inhibición de los sueros de ratones inmunizados oralmente con pentámeros del VHA purificados a partir de plantas de arroz y tabacos.
Figura 12. ELISA de inhibición de los sueros de ratones inmunizados oralmente mediante la alimentación de los mismos con zanahorias, cosechadas a partir de plantas que expresan pentámeros del VHA. EJEMPLOS.
Ejemplo 1. Clonación del MLA del VHA de la cepa cubana M2.
La secuencia de interés del plásmido pMLA1 se muestra en la Figura 1 (A). A partir de la cepa M2 del VHA aislada y caracterizada en Cuba, se purificó el ARN y se amplificó un fragmento de ADN de 6,7 kb mediante la técnica de Trascripción Reversa- Reacción en cadena de la Polimerasa (TR- RCP), utilizando oligonucleótidos específicos (SEQ ID NO 1 y 2 1 ) para otras secuencias reportadas del VHA. La banda fue clonada en un vector BlueScript (KS+), digerido previamente con la enzima Sma\. El plásmido resultante se denominó pMLA1 y se utilizó para la secuenciación nucleotídica del MLA de VHA de la cepa M2 cubana. La secuencia de ADN (SEQ ID NO 3) presenta cambios con respecto a las reportadas que generan 11 cambios aminoacídicos. El análisis de estas secuencias permite clasificar a la cepa M2 dentro del subgenotipo IA, al cual pertenecen casi la totalidad de las cepas americanas. Esta secuencia confirma que la cepa cubana M2 es realmente una cepa del VHA diferente a las anteriormente reportadas.
Ejemplo 2. Construcciones genéticas para la expresión de envolturas y pentámeros en el citosol de la célula vegetal.
La secuencia de interés del plásmido pP1-2A se muestra en la Figura 1(B). Este plásmido se obtuvo amplificando la secuencia que codifica para las proteínas estructurales (P1-2A) mediante la técnica de RCP, utilizando oligonucleotidos específicos (SEQ ID NO 4) complementarios para las regiones 5' que codifica para la proteína VP4 y la región 3' de la secuencia que codifica para la proteína 2A respectivamente a partir del plásmido pMLA La banda amplificada de 2,5 kb (SEQ ID NO 6) se clonó en el vector BlueScript (KS+) digerido Sma\ Para la obtención del plásmido p3ABC, cuya secuencia de interés se muestra en la Figura 1 (C), se amplificó mediante RCP la secuencia de 0,2 kb que codifica para la proteína 3A, utilizando oligonucleotidos (SEQ ID NO 7 y 8) complementarios para la región 5' y 3'de este gen y se clonó en un vector BlueScript (KS+), digerido con la enzima BamHI-EcoRV. Seguidamente en este mismo vector se clonó en los sitios _rcoRV-X£>al, una secuencia nucleotídica sintética (SEQ ID NO 9 y 10) que codifica para la proteína 3B, obteniéndose el plásmidio p3AB. Por otra parte a partir del plásmido pMLAl , se amplificó mediante RCP, la secuencia de 0,65 kb que codifica para la proteína 3C, donde se utilizaron los oligonucleótidos SEQ ID NO 11 y 12. Esta banda se clonó en el vector P3AB en los sitios Xi al-HπdlIl. Como resultado se obtuvo una secuencia 3ABC (SEQ ID NO 13), que codifica para una poliproteína con actividad proteolítica y sin posibilidades de auto procesamiento debido a que los sitios de corte entre las proteínas 3A/B y 3B/C están mutados, mediante la sustitución de los nucleótidos T por C y G por C respectivamente. La secuencia de interés del plásmido pMLAm se muestra en la Figura 1 (D). Para obtener este plásmido se digirió el plásmido pP1-2A con las enzimas EcoRl y Cla\ y se clonó en este vector la banda de 1 kb codificante para el polipéptido 3ABC mutada, sacada mediante una digestión con las enzimas EcoRI-C/al. Este plásmido contiene la secuencia modificada que codifica para la poliproteína de VHA de una talla significativamente menor a la poliproteína original (SEQ ID NO 14).
El plásmido pKMLAm, se obtuvo clonando la banda MLAm de 3,4 kb, digerida con las enzimas Sma\-Cla\, en el vector pKTPL-2, el cual contiene las secuencia promotora 2x 35S del CaMV, la secuencia lider del TEV y el terminador 35S del CaMV. El plásmido pKTPL-2 se digirió con las enzimas Λ/col-Klenow-C/al. La secuencia de interés del plásmido binario pBMLAm se muestra en la Figura 1 (F). Este plásmido se obtuvo digiriendo el plásmido pKMLAm con las enzimas Sph\, y posteriormente tratado con nucleasa mung bean, resultando una banda de 4,7 kb que se clonó en el vector binario pBin19, digerido con la enzima Sma\. El plásmido resultante pBMLAm por lo tanto contiene: el gen neomicin fosfotransferasa II (NPT II) el cual codifica para el marcador de selección, la kanamicina; el gen MLAm, que codifica para la poliproteína modificada del VHA, regulado por el promotor 2X 35S, el líder del TEV, el terminador del CaMV y la secuencia nucleotídica de los bordes derecho e izquierdo del T-ADN, por la cual se transfieren estos genes al genoma de la planta. Ejemplo 3. Construcciones genéticas para la expresión de pentámeros en el citosol de la célula vegetal.
La secuencia de interés del plásmido pΔMLAm se muestra en la Figura 2(A). Para eliminar la proteína VP4 y obtener este plásmido, se eliminó el fragmento de 114 pb del plásmido pMLA cortando con las enzimas Smal-Psíl y se sustituyó por la secuencia nucleotídica sintética (SEQ ID NO 15 y 16) que restituye el inicio del gen que codifica para la proteína VP2. La secuencia del la región ΔMLAm corresponde a la SEQ ID NO 17. El plásmido pKΔMLAm, se obtuvo clonando la banda ΔMLAm (3,46 kb) digerida con las enzimas Sma\-Cla\, en el plásmido pKTPL-2 digerido Λ/col-Klenow-C/al La secuencia de interés del plásmido binario pBΔMLAm se muestra en la Figura 2(B), se obtuvo digiriendo el plásmido binario pBin19 con las enzimas Smal y se clonó en este vector un fragmento de ADN de 4,6 kb resultante de la digestión del plásmido pKMLAm con las enzimas Sph\ y tratado con nucleasa mung bean. El plásmido resultante pBΔMLAm contiene: el gen neomicin fosfotransferasa II (NPT II) el cual codifica para el marcador de selección, la kanamicina; el gen MLAm, que codifica para la poliproteína modificada del VHA, regulado por el promotor 2X 35S, la secuencia líder del TEV, el terminador 35S del CaMV y la secuencia nucleotídica de los bordes derecho e izquierdo del T-ADN, por la cual se transfieren estos genes al genoma de planta.
Ejemplo 4. Construcciones genéticas para la expresión de envolturas y pentámeros en el retículo endoplasmático de la célula vegetal. La secuencia de interés del plásmido pBVHARE se muestra en la Figura 3B. Para la obtención de este plásmido se clonó el fragmento sintético (SEQ ID NO 18 y 19) que codifica para la señal de retención en el retículo endoplasmático (KDEL), en el vector BS(+) en los sitios EcoRV-C/al. Por otra parte en el sitio Sfyl-EcoRI del plásmido pP1-2A se clonó un fragmento sintético (SEQ ID NO 20 y 21 ) que modifica el extremo 3' de la proteína 2A eliminando el sitio de corte de la proteasa en esta región e introduciendo una secuencia que funciona como espaciador entre la unión del gen y la secuencia que codifica para la señal KDEL. Seguidamente se sacó esta secuencia (2,5 kb) con las enzimas Smal-EcoRV y se clonó en el vector BS-KDEL, resultando el plásmido pP1-2ARE (Figura 3A, SEQ ID NO 22). El plásmido p3ABCRE se obtuvo digiriendo el plásmido p3ABC con las enzimas XΛol Klenow- EcoRI y clonando la secuencia 3ABC en los sitios EcoRI-EcoRV (Figura 3A, SEQ ID NO 23).
Para dotar a los genes de interés de señales reguladoras de la expresión en plantas, se clonaron por separados la región estructural P1-2A- KDEL (2,5 kb), extraída del plásmido pP1-2ARE con las enzimas Sma\-Cla\ , en el plásmido pKTPL-2 digerido Λ/col/Klenow-C/al , resultando el plásmido pKP1-2ARE. La región 3ABC-KDEL de 1 kb se sacó del plásmido p3ABCRE con las enzimas Λ/col-C/al y se clonó en el plásmido pKTPL-2 digerido con las mismas enzimas, resultando el plásmido pK3ABCRE. Finalmente, para lograr el plásmido para la transformación de plantas mediante A. tumefaciens se digirió el vector binario pBin 19 con la enzima Sal\, y en este sitio se clonó la secuencia de 2 kb, extraída del plásmido pK3ABCRE, digerido con la enzima Sa/I. Como resultado se obtuvo el plásmido PB3ABCRE. Seguidamente se clonó en este mismo vector , en el sitio Sph\ el cásete de expresión correspondiente a la secuencia P1-2A-KDEL, extraído del plásmido pKP1-2ARE, luego de una digestión Sph\. El plásmido resultante el pBVHARE porta las regiones estructurales y la región con función proteolítica por separadas, fusionadas a la señal de retención en el retículo y bajo las señales de regulación de la expresión en plantas y el gen neomicin fosfotransferasa II (NPT II) el cual codifica para el marcador de selección. Ejemplo 5. Construcciones genéticas para la expresión de pentámeros en el retículo endoplasmático de la célula vegetal.
La secuencia de interés del plásmido pBΔVHARE se muestra en la Figura 4B. Para la obtención de este plásmido se digirió el plásmido pP1~2ARE con las enzimas Sma\-Pst\ y se sustituyó este fragmento por la secuencia nucleotídica sintética (SEQ ID NO 15 y 16), restituyéndose el extremo 5' del gen que codifica para la proteína VP2. Este plásmido resultante pΔP1-2ARE (Figura 4A, SEQ ID NO 24), se digirió Sma\-Cla\ y se clonó una banda de 2,4 kb en el vector pKTPL-2 digerido Λ col/K- C/al, resultando el plásmido pKΔP1-2ARE. Seguidamente se clonó en el plásmido pB3ABCRE (el vector binario que contiene la región 3ABC-KDEL), el cásete de expresión de 4,5 kb, a partir del plásmido pKΔP1-2ARE. digerido con la enzima Sph\,
El plásmido binario resultante contiene: la región estructural sin la secuencia que codifica para la proteína VP4 fusionada a la secuencia que codifica para el péptido KDEL, bajo las señales de regulación de la expresión en plantas; la región 3ABC- KDEL bajo estas mismas señales y el gen neomicin fosfotransferasa II (NPT II) el cual codifica para el marcador de selección.
Ejemplo 6. Obtención de envolturas y pentámeros del VHA en plantas transgénicas de Nicotiana tabacum.
La transformación genética de plantas de Nicotiana tabacum se llevó a cabo siguiendo el método de Zambryski y colaboradores (1983). Para ello se transformó la cepa AT 2260 (Deblaere y cois., 1985) de Agrobacteríum tumefaciens por el método del nitrógeno líquido (Hofgen y Willmitzer, 1988) con los plásmidos binarios desarrollados (pBΔVHARE, pBVHARE, pBΔMLAm, pBMLAm) y con los recombinantes se transformaron discos de hojas de plantas de tabaco de la variedad Petit Havana SR 1 , cultivadas in vitro. Se empleó Kanamicina (100 mg/L) como marcador de selección del evento de transformación.
Para comprobar la presencia de los genes de interés introducidos en el genoma de la planta de tabaco y la expresión de estos, así como la formación de envolturas virales o pentámeros se realizaron diferentes procedimientos, tales como, Southern blot, Western blot, ELISA e Inmunomicroscopía.
Ejemplo 7. Obtención de envolturas y pentámeros del VHA en plantas transgénicas de Zanahoria {Daucus carota L.) Para la transformación de esta planta se utilizaron cepas At 2260 de Agrobacterium tumefaciens transformadas con los plásmidos binarios (pBΔVHARE, pBVHARE, pBΔMLAm, pBMLAm). Hipocótilos de la variedad New Kuroda, de tres semanas de germinados, se cortaron en segmentos de 1 cm y se plantaron en un medio BAN-9 (Murashige Skoog, 1962 (MS), suplementado con NAA a 0,5 mg/L) durante tres días. A continuación se incubaron durante 30 minutos con una suspensión de Agrobacterium tumefaciens, conteniendo cada uno de las construcciones anteriormente descritas, y nuevamente se pasaron los explantes al medio BAN-9 durante 72 horas. Pasado este tiempo se sembraron en un medio de regeneración suplementado con kanamicina 100 mg/L. Los brotes aparecieron a partir de las 3 semanas y fueron individualizados y plantados en un medio MS, suplementado igualmente con kanamicina a 100 mg/L. La integración de los genes se pudo comprobar mediante un Southern blot de RCP (Figura 6) . La expresión de la poliproteína y su procesamiento y formación de envolturas virales y pentámeros, se demostró mediante el ELISA que se muestra en la Figura 8 y el Western blot de la Figura 7. Ejemplo 8. Obtención de envolturas y pentámeros del VHA en plantas transgénicas de Arroz (Oryza sativa L.).
La transformación genética de plantas de arroz se llevó a cabo siguiendo el método empleado por Hiei y colaboradores (1994). Para ello se transformó la cepa At 2260 de Agrobacterium tumefaciens por el método del nitrógeno líquido con los plásmidos binarios desarrollados (pBΔVHARE, pBVHARE, pBΔMLAm, pBMLAm) y con estos recombinantes se transformaron callos obtenidos a partir del escutelo. Se empleó Kanamicina (100 mg/L) como marcador de selección del evento de transformación. Para comprobar la presencia de los genes de interés introducidos en el genoma de la planta de tabaco y la expresión de estos, así como la formación de envolturas virales o pentámeros se realizaron diferentes procedimientos, los cuales se describen a continuación.
Ejemplo 9. Caracterización molecular e inmunoquímica de las plantas transgenicas. Análisis por Southern blot. Para obtener el ADN total, con vista a realizar los análisis de Southern blot en las plantas de tabaco, zanahoria y arroz, se utilizó un método rutinario descrito por Dellaporta y colaboradores (1983). Para el análisis de las muestras se tomaron hojas de plantas transformadas con las construcciones señaladas anteriormente y que mostraban resistencia al marcador de selección. Como controles negativos se utilizaron hojas de plantas no transformadas.
Las digestiones de los ADN purificados, la electroforesis en gel de agarosa, la transferencia del ADN a una membrana Hybond N y la hibridación, se realizaron según está descrito por Sambrook y colaboradores (1989). Un fragmento de ADN de 1 ,2 kb que incluye el gen que codifica para la proteína VP1 fue marcado con 32P mediante un Primer-a-Gene Labeling System (Promega Corp., EE.UU.) y usado como sonda radiactiva y como control positivo.
En la Figura 5 se muestra el Southern de plantas transgénicas de tabaco transformadas con las construcciones para la expresión en el citosol de envolturas y pentámeros del VHA (pBΔMLAm, pBMLAm), digeridas S al y Cla\ (resultando una banda de 3,4 kb) y en el retículo endoplasmático (pBΔVHARE, pBVHARE), digeridas con las enzimas Smal - EcoRI (resultando una banda de 2,4 kb). Los resultados que se muestran en la Figura 5 demuestran que las plantas contienen en su genoma la secuencia que codifican para la proteínas estructurales.
En el caso de las plantas de zanahoria y arroz, se les realizó un Southern al producto de la amplificación mediante la RCP (oligos correspondientes a las secuencias SEQ ID NO 4 y 5). Como se muestra en la Figura 6, se demostró que la secuencia que codifica para la proteína VP1 marcada radiactivamente se complementa con una banda de 2,5 kb, correspondiente a la talla de la secuencia que codifica para las proteínas estructurales. Análisis por Western blot.
Los resultados del Western blot se muestran en la Figura 7. La inmunodetección de las moléculas recombinantes obtenidas en el ensayo de expresión se realizó mediante Western blot, según la metodología descrita por Towbin y colaboradores (1979). Las muestras para el Western blot consistieron en proteínas totales solubles extraídas de diferentes plantas transgénicas de tabaco, zanahoria y arroz, transformadas con las construcciones que posibilitan la expresión de pentámeros exclusivamente: Los clones, tabaco 5, zanahoria 7 y Arroz 3 transformados con la construcción pBΔVHARE, que posibilita la expresión de los pentámeros en el retículo endoplasmático de estas plantas; y los clones, tabaco 25, zanahoria 10 transformados con la construcción pBΔMLAm, la cual permite la expresión de los pentámeros en el citosol. Como control negativo se usaron hojas de tabaco de plantas no transformadas y como control positivo la proteína VP1 expresada en E.coli. Las hojas se maceraron con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo muy fino y se les adicionó 1 mL de tampón de extracción de proteínas [Tris-HCI 61 mM pH 6,8, Trition 0,1 %, glicerol 12,5% y Fluoruro de Fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM] por gramo de hoja, tal como reporta Schouten y colaboradores (1997). El material ¡nsoluble se eliminó por centrifugación a 13 000 rpm. Las proteínas provenientes de SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y las proteínas de interés se identificaron utilizando el AcP anti-VP1 conjugado a la enzima fosfatasa alcalina (PhoA). La expresión de dicha enzima se detectó mediante una reacción colorimétrica. Los resultados del Western blot se muestran en la Figura 7 y se puede observar la expresión de una proteína de la talla de la proteína VP1 en todos los cultivos, así como otros intermediarios producto del procesamiento incompleto de la poliproteína.
Ensayo inmunoenzimático (ELISA). Los resultados del ELISA se muestran en la Figura 8. Se realizaron ensayos tipo "Sandwich" . Las placas de inmunoensayo (Maxisorp, Nunc) se recubrieron con 10 μg/mL del AcM 7E7, en tampón carbonato (Na2CO30,015 M, NaHCO30,028 M, pH 9,6), por 4 horas a 37 °C. Se bloquearon durante 2 horas a 37 °C, con leche descremada al 5% en solución salina tamponada con fosfatos (PBS) (NaCI 100 mM, Na2PO480 mM, NaH2PO420 mM, pH 7,4). Posteriormente se adicionaron 100 μL de las muestras correspondientes a plantas transformadas y no transformadas de tabaco, zanahoria y arroz (preparadas de la misma forma que se describe para el Western blot), se dejaron toda la noche a 4 °C. Se lavó y se adicionaron 100 μL del AcM 7E7 conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/1000 (1 μg/mL) en PBS que contenía leche descremada al 0,5%. La incubación fue a 37 °C por espacio de una hora. La reacción se reveló por adición del sustrato de la enzima 4-nitrofenilfosfato, preparado al 0,1 % en Dietanolamina. Se siguió la aparición de color durante 60 minutos. La absorbancia se leyó a una longitud de onda de 405nm en un espectrofotómetro SUMA. Los lavados de la placa en cada etapa del ELISA se realizara tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,1 %. Análisis por inmunomicroscopía electrónica.
Los resultados de la inmunomicroscopía se muestran en la Figura 9. Las muestras de tejido de hojas de plantas de tabaco transformada con el plásmido pBMLAm y plantas sin transformar provenientes de cultivo de tejido, se fijaron en una solución de Formaldehído al 4% y posteriormente de Glutaraldehido al 0,2%. Se deshidrataron entonces en etanol y embebieron en una solución de Lowicryl K 4M (Chemische Werke Lowi, Waldkraiburg). Los cortes ultra finos se colocaron en una rejilla de níquel y se incubaron con el AcM 7E7, seguido este paso por la incubación con el AcP anti-lgG de ratón, marcado con partículas de oro coloidal de 15 nm (British Bio-Cell International). Las secciones inmunomarcadas se contrastaron por 5 minutos en Uranilacetato y por 7 minutos en Citrato_de Plomo, antes de ser examinadas al microscopio electrónico de transmisión (Jeol-Jem 2000EX, Japón). Los resultados muestran partículas de aproximadamente 27 nm de diámetros solo en la planta de tabaco transformada con la construcción pBMLAm, mediante la cual se expresa la proteína en el citosol de la célula.
Ejemplo 10. Purificación de envolturas y pentámeros a partir de plantas transgénicas de tabaco y Arroz. Para la purificación de las envolturas y pentámeros se utilizó un anticuerpo monoclonal anti VHA obtenido en los laboratorios del CIGB, que reconoce exclusivamente las partículas y pentámeros inmunogénicos.
Las proteínas de la célula vegetal fueron extraídas utilizando el protocolo descrito para los análisis por Western blot. El sobrenadante resultante de la centrifugación fue disuelto en cloruro de sodio de 0.5 M y mezclado con el anticuerpo acoplado a un gel (Bio-rad Laboratorios, Richmond, CA) y se incubó por 16 horas a 4 °C. El gel se lavó con 10 volúmenes de PBS (NaCI 100 mM, Na2PO4 80 mM, NaH2PO4 20 mM, pH 7,4) y seguidamente se eluyó la proteína de interés con 0,2 M de glicina , pH 2,5. Se neutralizó el eluato con Tris básico y se dializó contra PBS. La presencia de partículas de VHA y pentámeros a partir de estos extractos de hojas fueron revelados mediante ELISA, utilizando un monoclonal neutralizante comercial 7E7 (Mediagnost), específico para el reconocimiento de envolturas virales y pentámeros del VHA.
Ejemplo 11. Determinación de la inmunogenicidad de las envolturas y los pentámeros purificados a partir de plantas transgénicas mediante la administración intraperitoneal.
A los ratones blancos ICR de 14 semanas se les suministraron dos dosis de 750 EL.U con envolturas y pentámeros purificados a partir de plantas transgénicas de tabaco y arroz. De la misma forma se inocularon ratones con un antígeno comercial del VHA (Mediagnost), utilizados como control positivo y con PBS (control negativo). Las muestras de sangre se recolectaron los días 0, 15, 30, 50 y 70 postinoculación.
Los niveles de anticuerpos producidos se midieron mediante un ELISA de inhibición: se recubrió la placa con 5 μg de AcM 7E7 y se incubó la misma durante 4 horas, seguidamente se lavó una vez con PBS-Tween 0,1%. Se bloqueó añadiendo leche descremada al 5%, diluida en PBS Tween 0,1 % y se incubó durante 2 horas a 37 °C. Se lavó la placa 3 veces con PBS- Tween al 0,1 %. A continuación se añadieron los sueros de los ratones inmunizados, previamente incubados por 20 min a 37 °C, con antígeno del VHA (Mediagnoct). La placa se incubó durante 12 horas a 16 °C y posteriormente se lavó 5 veces con PBS-Tween 0.1 %. Finalmente se adicionaron 100 μL del AcM 7E7 conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/1000 en PBS que contenía leche descremada al 0,5%. La incubación fue a 37 °C durante una hora. La reacción se reveló mediante la adición del sustrato de la enzima 4-nitrofenilfosfato, preparado al 0,1% en dietanolamina. Se siguió la aparición de color durante 60 minutos. La absorbancia se leyó a una longitud de onda de 405 nm en un espectrofotómetro (SUMA). En la Figura 10 se muestran los niveles promedio de inhibición de los sueros de los ratones inoculados con el antígeno purificado a partir de plantas transgénicas, detectados en sangre de los ratones inmunizados con pentámeros producidos por las plantas de tabaco y arroz. De igual forma se observaron niveles semejantes de anticuerpo en los ratones inmunizados con el antígeno producido de plantas de tabaco y arroz que se transformaron con las construcciones que permiten la expresión de envolturas y pentámeros. Ejemplo 12. Determinación de la inmunogenicidad de las envolturas y pentámeros purificados a partir de plantas transgénicas mediante la administración oral .
La administración oral del antígeno se realizó por dos vías: utilizando el antígeno purificado y suministrándole a los animales zanahorias que expresan el antígeno. Para la determinación de la antigenicidad mediante la administración oral del envolturas y pentámeros purificados, se les administraron a ratones Balb/c de 8 semanas, pentámeros y envolturas virales durante 8 semanas, en cuatro dosis de 7500 EL.U. Se colectaron 200 μl de sangre a los 0, 15, 30, 50 y 70 días post- inoculación para detectar la presencias de anticuerpos anti VHA, mediante un ELISA de inhibición.
El ELISA de inhibición se realizó mediante el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 11. De acuerdo con los resultados mostrados en la Figura 11 , 1a administración oral de pentámeros del VHA expresados en plantas transgénicas produce respuesta inmunológica lo que se demuestra por los promedios de inhibición de los sueros de los ratones utilizados en el experimento. Los promedios de inhibición de los sueros administrados oralmente son menores al ser comparados con los obtenidos después de la administración intraperitoneal. La administración oral de pentámeros mediante el uso de plantas comestibles, se realizó alimentando a los ratones con 5 g de zanahoria crudas (transformadas con la construcción pBΔMLAm que está diseñada para que se produzcan solamente pentámeros) una vez a la semana durante cuatros semanas. Como control negativo se utilizaron los sueros de ratones alimentados con zanahorias no transformadas. La capacidad de estas plantas de provocar una respuesta de anticuerpos se demostró mediante un ELISA de inhibición mostrado en la Figura 12. LISTA DE SECUENCIAS
<110> Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología <120> ANTIGENOS RECOMBINANTES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A OBTENIDOS EN PLANTAS TRANSGENICAS .
<130> MLA <140> <141>
<160> 24 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220>
<221> primer_bind <222> (1) .. (25)
<223> Secuencia # 1.
Secuencia del oligonucleotido # 1, utilizado para amplificar la secuencia MLA mediante RT-PCR. <400> 1 cttaatctag aatgaatatg tccaa 25
<210> 2 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <221> primer_bind
<222> (1) .. (22)
<223> Secuencia # 2.
Secuencia del oligonucleotido #2, utilizado para amplificar la secuencia MLA mediante RT-PCR.
<400> 2 gaaagaaata aaggtacctc ag 22
<210> 3
<211> 6685
<212> ADN
<213> Hepatitis A virus <220>
<221> gene
<222> Complement( (1) .. (6685) )
<223> Secuencia # 3.
Secuencia nucleotídica que codifica para el Marco de Lectura Abierto (MLA) del VHA de la cepa cubana M2. <400> 3 atgaatatgt ccaaacaagg aattttccag actgttggga gtggccttga ccacatcctg 60 tccttggcag atattgagga agagcaaatg attcagtccg ttgataggac tgcagtgact 120 ggagcttctt atttcacttc tgtggaccaa tcttcagttc atactgctga ggttggctca 180 caccaaattg aacctttgaa aacctctgtt gataaacctg gttctaagaa aactcagggg 240 gagaagtttt tcttgattca ttctgctgat tggctcacta cacatgctct ctttcatgaa 300 gttgcaaaat tggatgtggt gaaactgctg tacaatgagc agtttgccgt ccaaggtttg 360 ttgagatacc atacttatgc aagatttggc attgagattc aagttcagat aaatcccaca 420 ccctttcagc aaggaggact aatctgtgcc atggttcctg gtgaccaaag ttatggttca 480 atagcatcct tgactgttta tcctcatggt ctgttaaatt gcaatatcaa caatgtagtt 540 agaataaagg ttccatttat ttatactaga ggtgcttatc attttaaaga tccacagtac 600 ccagtttggg aattgacaat cagagtttgg tcagagttga atattggaac aggaacctca 660 gcttatactt cactcaatgt tttagctagg tttacagatt tggagttgca tggattaact 720 cctctttcta cacagatgat gagaaatgaa tttagagtta gtactactga aaatgttgta 780 aatttgtcaa attatgaaga tgcaagggca aaaatgtctt ttgctttgga tcaggaagat 840 tggaagtctg atccttccca aggtggtgga attaaaatta ctcatttcac tacctggaca 900 tccattccaa ccttagctgc tcagtttcca ttcaatgctt cagattcagt tgggcaacaa 960 attaaagtta taccagtgga cccatacttt ttccagatga caaacactaa tcctgatcaa 1020 aaatgtataa cagccttggc ctctatttgt cagatgttct gcttttggag gggagatctt 1080 gttttcgatt tccaggtttt tccaaccaaa tatcattcag gtaggctgtt gttttgtttt 1140 gttcctggga atgagttaat agatgttact ggaattacat taaaacaggc aactactgct 1200 ccttgtgcag tgatggacat tacaggagtg cagtcaacct tgagatttcg tgttccttgg 1260 atttctgata caccctatcg agtgaatagg tacacgaagt cagcacatca aaaaggtgag 1320 tatactgcca ttgggaagct tattgtgtat tgttataata gattgacttc tccttctaat 1380 gttgcttctc atgttagagt taatgtttat ctttcagcaa ttaatttgga atgttttgct 1440 cctctttacc atgctatgga tgttaccaca caggttggag atgattcagg aggtttctca 1500 acaacagttt ctacagagca gaatgttcct gatccccaag ttggcataac aaccatgagg 1560 gatttaaaag ggaaagccaa taggggaaag atggatgtat caggagtgca ggtacctgtg 1620 ggagctatta caacaattga ggatccagtt ttagcaaaga aagtacctga gacatttcct 1680 gaattgaagc ctggagaatc cagacataca tcagatcaca tgtctattta taaattcatg 1740 ggaaggtctc atttcttgtg tacttttact tttaattcaa acaataaaga gtacacattt 1800 ccaataactc tgtcttcgac ttctaatcct cctcatggtt taccatcaac attaaggtgg 1860 ttctttaatt tgtttcagtt gtatagagga ccattggatt tgacaattat aatcacagga 1920 gccactgatg tggatggtat ggcctggttt actccagtgg gccttgctgt cgacacccct 1980 tgggtggaaa agaagtcagc tttgtctatt gattataaaa ctgcccttgg agctgttaga 2040 tttaatacaa gaagaacagg gaacattcag attagattgc catggtattc ttatttgtat 2100 gccgtgtctg gagcactgga tggcttggga gataagacag attctacatt tggattggtt 2160 tctattcaga ttgcaaatta caatcattct gatgaatatt tgtcctttag ttgttatttg 2220 tctgtcacag agcaatcaga gttctatttc cctagagctc cattaaattc aaatgctatg 2280 ttgtccactg agtccatgat gagtagaatt gcagctggag acttggagtc atcagtggat 2340 gatcccagat cagaggagga cagaagattt gagagtcata tagaatgtag gaaaccatat 2400 aaagaattga gactggaggt tgggaaacaa agaatcaaat atgctcagga agagttatca 2460 aatgaagtgc ttccacctcc taggaaaatg aaggggttat tttcacaagc taaaatttct 2520 cttttttata cagaggacca tgaaataatg aaattttctt ggagaggagt gactgctaat 2580 actagggctt tgagaagatt tggattctct ctggctgctg gtagaagtgt gtggactctt 2640 gaaatggatg ctggagttct tactggaaga ttgatcagat tgaatgatga gaaatggaca 2700 gaaatgaagg atgataagat tgtttcatta attgaaaagt tcacaagcaa taaacattgg 2760 tctaaagtga attttccaca tggaatgttg gatcttgagg aaattgctgc caactctaaa 2820 gattttccaa atatgtctga gacagatttg tgtttcctgt tgcattggct aaatccaaag 2880 aaaattaatt tagcagatag aatgcttgga ttgtctggag tgcaggaaat taaagaacag 2940 ggtgttggac tgatagcaga gtgtagaact ttcttggatt ctattgctgg gactttgaaa 3000 tctatgattt ttgggtttca ttattctgtg actgttgaaa ttataaatat tgtgctttgt 3060 tttattaaga gtggaatcct gctttatgtc atacaacaat tgaaccaaga tgaacactct 3120 cacataattg gtttgttgag agttatgaat tatgcagata ttggctgttc agtcatttca 3180 tgtggtaaag ttttttccaa aatgttagaa acagttttta attggcaaat ggactctaga 3240 atgatggagc tgaggactca gagcttctcc aattggttaa gagatatttg ttcgggaatt 3300 actattttta aaagttttaa ggatgccata tattggttat gtacaaaatt gaaggatttt 3360 tatgaagtaa attatggcaa gaaaaaggat gttcttaata ttctcaaaga taaccagcaa 3420 aaaatagaaa aagccattga agaagcagac aatttttgca ttttgcaaat tcaagatgtg 3480 gagaaatttg atcagtatca gaaaggggtt gatttaatac aaaagctgag aactgtccat 3540 tcaatggctc aagttgaccc cagtttgggg gttcatttgt cacctctcag agattgcata 3600 gcaagagtcc atcaaaagct caagaatctt ggatctataa atcaggccat ggtaacaaga 3660 tgtgagccag ttgtttgcta tttgtatggc aaaagagggg gagggaaaag cttgacttca 3720 attgcattgg caaccaaaat ttgtaaacac tatggtgttg aacctgagaa aaatatttac 3780 accaaacctg tggcctcaga ttattgggat ggatatagtg gacaattagt ttgtattatt 3840 gatgatatcg gccaaaacac aacagatgaa gattggtcag atttttgtca attagtgtca 3900 ggatgcccaa tgagattgaa tatggcttct cttgaggaga agggcagaca tttttcctct 3960 ccttttataa tagcatcttc aaattggtca aatccaagtc caaaaacagt ttatgttaaa 4020 gaagcaattg atcgtaggct tcattttaag gttgaagtta aacctgcttc attttttaaa 4080 aatcctcaca atgatatgtt aaatgttaat ttggctaaaa caaatgatgc aattaaagac 4140 atgtcttgtg ttgatttgat aatggatgga cacaatattt cattgatgga tttacttagt 4200 tccttagtga tgacaggtga aattaggaaa cagaatatga gtgaattcat ggagttgtgg 4260 tctcagggaa tttcagatga tgacaatgat agtgcagtag ctgagttttt ccggtctttt 4320 ccatctggtg aaccatcaaa ttccaagtta tctagttttt tccaagctgt cactaatcac 4380 aagtgggttg ctgtgggagc tgcagttggt attcttggat tgctagtggg aggatggttt 4440 gtgtataagc atttttcccg caaagaggaa gaaccaattc cagctgaagg ggtttatcat 4500 ggagtgacta agcccaaaca agtgattaaa ttggatgcag atccagtaga gtctcagtca 4560 actctagaaa tagcaggatt agttaggaaa aatttggttc agtttggagt tggtgagaaa 4620 aatggatgtg tgagatgggt catgaatgcc ttaggagtga aggatgattg gttgttagta 4680 ccttctcatg cttataaatt tgaaaaggat tatgaaatga tggagtttta tttcaataga 4740 ggtggaactt actattcaat ttcagctggt aatgttgtta ttcaatcttt agatgtggga 4800 ttccaagatg ttgttctaat gaaggttcct acaattccca agtttagaga tattactcaa 4860 cattttatta agaaaggaga tgtgcctaga gccttgaatc gcttggcaac attagtgaca 4920 accgttaatg gaactcctat gttaatttct gagggacctt taaaaatgga agaaaaagcc 4980 acttatgttc ataagaagaa tgatggtact acggttgatt tgactgtaga tcaggcatgg 5040 agaggaaaag gtgaaggtct tcctggaatg tgtggtgggg ccctagtgtc atcaaatcag 5100 tccatacaaa atgcaatttt gggtattcat gttgctggag gaaattcaat tcttgtggca 5160 aagttgatta ctcaagaaat gtttcaaaac attgataaga aaattgaaag tcagagaata 5220 atgaaagtgg aatttactca atgttcaatg aatgtagtct ccaaaacgct ttttagaaag 5280 agtcccattc atcaccacat tgataaaacc atgattaatt ttcctgcagc tatgcctttc 5340 tctaaagctg aaattgatcc aatggctatg atgttgtcta aatattcatt acctattgtg 5400 gaagaaccag aggattacaa agaagcttca gttttttatc aaaataaaat agtaggσaag 5460 actcagctag ttgatgactt tctagatctt gatatggcca ttacaggggc tccaggcatt 5520 gatgctatta atatggattc atctcctggg tttccttatg ttcaagaaaa attgactaaa 5580 agagatttga tttggttgga tgaaaatggt ttactgttag gagttcaccc aagattggcc 5640 cagagaatct tatttaatac tgtcatgatg gaaaattgtt ctgacttaga tgttgttttt 5700 acaacttgtc caaaagatga attgagacca ttagagaaag ttttggaatc aaaaacaaga 5760 gctattgatg cttgcccttt ggattataca attttatgtc gaatgtattg gggtccagct 5820 attagttatt ttcatttgaa tccagggttt cacacaggtg ttgctattgg catagatcct 5880 gatagacagt gggatgaatt atttaaaaca atgataagat ttggagatgt tggtcttgat 5940 ttagattttt ctgcttttga tgccagtctt agtccattta tgattaggga agcaggtaga 6000 atcatgagtg aattatctgg aacaccatct cattttggaa cagctcttat caatactatc 6060 atttattcta aacatctgct gtacaattgt tgttatcacg tctgtggttc aatgccttct 6120 gggtctcctt gtacagcttt gttgaattca attattaata atattaattt gtattatgtg 6180 ttttctaaaa tatttggaaa gtctccagtt ttcttttgtc aagctttgag gatcctttgt 6240 tatggagatg atgttttgat agttttttcc agagatgttc aaattgataa tcttgacttg 6300 attggacaga aaattgtgga tgagttcaaa aaacttggca tgacagccac ttcagctgac 6360 aaaaatgtgc ctcaactgaa gccagtttca gaattgactt ttcttaaaag atcttttaat 6420 ttggtggagg acagaatcag acctgcaatt tcagaaaaga caatttggtc tttgatagct 6480 tggcagagaa gtaacgctga gtttgagcag aatttagaaa atgctcagtg gtttgctttc 6540 atgcatggct atgagttcta tcagaaattc tattattttg ttcagtcctg tttggagaaa 6600 gagatgatag aatatagact taaatcttat gattggtgga gaatgagatt ttatgaccag 6660 tgtttcattt gtgacctttc atgat 6685
<210> 4 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <221> primer_bind <222> (1) .. (40) <223> Secuencia # 4. Secuencia del oligonucleotido #4, utilizado para amplificar la secuencia P1-2A mediante PCR.
<400> 4 ttgaattcag cttgtgaaaa taaccccttc attttcctag 40
<210> 5 <211> 28 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> primer_bind <222> (1) .. (28) <223> Secuencia # 5. Secuencia del oligonucleotido #5, utilizado para amplificar la secuencia P1-2A mediante PCR.
<400> 5 cgcccgggtc tagaatgaat atgtccaa 28
<210> 6 <211> 2523 <212> ADN <213> Hepatitis A virus
<220> <221> gene
<222> Complement( (1) .. (2523) ) <223> Secuencia # 6.
Secuencia nucleotídica codificante para las proteínas estructurales (P1-2A) del VHA de la cepa M2
<400> 6 atgaatatgt ccaaacaagg aattttccag actgttggga gtggccttga ccacatcctg 60 tccttggcag atattgagga agagcaaatg attcagtccg ttgataggac tgcagtgact 120 ggagcttctt atttcacttc tgtggaccaa tcttcagttc atactgctga ggttggctca 180 caccaaattg aacctttgaa aacctctgtt gataaacctg gttctaagaa aactcagggg 240 gagaagtttt tcttgattca ttctgctgat tggctcacta cacatgctct ctttcatgaa 300 gttgcaaaat tggatgtggt gaaactgctg tacaatgagc agtttgccgt ccaaggtttg 360 ttgagatacc atacttatgc aagatttggc attgagattc aagttcagat aaatcccaca 420 ccctttcagc aaggaggact aatctgtgcc atggttcctg gtgaccaaag ttatggttca 480 atagcatcct tgactgttta tcctcatggt ctgttaaatt gcaatatcaa caatgtagtt 540 agaataaagg ttccatttat ttatactaga ggtgcttatc attttaaaga tccacagtac 600 ccagtttggg aattgacaat cagagtttgg tcagagttga atattggaac aggaacctca 660 gcttatactt cactcaatgt tttagctagg tttacagatt tggagttgca tggattaact 720 cctctttcta cacagatgat gagaaatgaa tttagagtta gtactactga aaatgttgta 780 aatttgtcaa attatgaaga tgcaagggca aaaatgtctt ttgctttgga tcaggaagat 840 tggaagtctg atccttccca aggtggtgga attaaaatta ctcatttcac tacctggaca 900 tccattccaa ccttagctgc tcagtttcca ttcaatgctt cagattcagt tgggcaacaa 960 attaaagtta taccagtgga cccatacttt ttccagatga caaacactaa tcctgatcaa 1020 aaatgtataa cagccttggc ctctatttgt cagatgttct gcttttggag gggagatctt 1080 gttttcgatt tc aggtttt tccaaccaaa tatcattcag gtaggctgtt gttttgtttt 1140 gttcctggga atgagttaat agatgttact ggaattacat taaaacaggc aactactgct 1200 ccttgtgcag tgatggacat tacaggagtg cagtcaacct tgagatttcg tgttccttgg 1260 atttctgata caccctatcg agtgaatagg tacacgaagt cagcacatca aaaaggtgag 1320 tatactgcca ttgggaagct tattgtgtat tgttataata gattgacttc tccttctaat 1380 gttgcttctc atgttagagt taatgtttat ctttcagcaa ttaatttgga atgttttgct 1440 cctctttacc atgctatgga tgttaccaca caggttggag atgattcagg aggtttctca 1500 acaacagttt ctacagagca gaatgttcct gatccccaag ttggcataac aaccatgagg 1560 gatttaaaag ggaaagccaa taggggaaag atggatgtat caggagtgca ggtacctgtg 1620 ggagctatta caacaattga ggatccagtt ttagcaaaga aagtacctga gacatttcct 1680 gaattgaagc σtggagaatc cagacataca tcagatcaca tgtctattta taaattcatg 1740 ggaaggtctc atttcttgtg tacttttact tttaattcaa acaataaaga gtacacattt 1800 ccaataactc tgtcttcgac ttctaatcct cctcatggtt taccatcaac attaaggtgg 1860 ttctttaatt tgtttcagtt gtatagagga ccattggatt tgacaattat aatcacagga 1920 gccactgatg tggatggtat ggcctggttt actccagtgg gccttgctgt cgacacccct 1980 tgggtggaaa agaagtcagc tttgtctatt gattataaaa ctgcccttgg agctgttaga 2040 tttaatacaa gaagaacagg gaacattcag attagattgc catggtattc ttatttgtat 2100 gccgtgtctg gagcactgga tggcttggga gataagacag attctacatt tggattggtt 2160 tctattcaga ttgcaaatta caatcattct gatgaatatt tgtcctttag ttgttatttg 2220 tctgtcacag agcaatcaga gttctatttc cctagagctc cattaaattc aaatgctatg 2280 ttgtccactg agtccatgat gagtagaatt gcagctggag acttggagtc atcagtggat 2340 gatcccagat cagaggagga cagaagattt gagagtcata tagaatgtag gaaaccatat 2400 aaagaattga gactggaggt tgggaaacaa agaatcaaat atgctcagga agagttatca 2460 aatgaagtgc ttccacctcc taggaaaatg aaggggttat atgcttctgg aggtgaattc 2520 gat 2523
<210> 7
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> primer_bind <222> (1) .. (27) <223> Secuencia # 7. Secuencia del oligonucleotido # 7, utilizado para amplificar la secuencia 3A mediante PCR.
<400> 7 ccatgggaat ttcagatgat gacaatg 27
<210> 8
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> primer_bind
<222> (1) .. (26) <223> Secuencia # 8.
Secuencia del oligonucleotido # 8, utilizado para amplificar la secuencia 3A mediante PCR.
<400> 8 ggatatcggt tcttcctctt tgcggg 26
<210> 9 <211> 85 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> <221> gene
<222> (1) .. (85) <223> Secuencia # 9. Fragmento sintético cuya secuencia nucleotídica codifica para la proteína 3B y donde se sustituyen los nucleotidos T por C y G por C respectivamente <400> 9 tccagctgtt ggggtttatc atggagtgac taagcccaaa caagtgatta aattggatgc 60 agatccagta gagtctcagt tgact 85
<210> 10 <211> 89 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220>
<221> gene
<222> (1) .. (89)
<223> Secuencia # 10. Fragmento sintético cuya secuencia nucleotídica codifica para la proteína 3B y donde se sustituyen los nucleotidos T por C y G por C respectivamente (cadena complementaría) . <400> 10 ctagagtcaa ctgagactct actggatctg catccaattt aatcacttgt ttgggcttag 60 tcactccatg ataaacccca acagctgga 89
<210> 11 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220>
<221> primer_bind
<222> (1) .. (25)
<223> Secuencia # 11.
Secuencia del oligonucleotido # 11, utilizado para amplificar la secuencia 3C mediante PCR.
<400> 11 tctcagtcaa ctctagaaat agcag 25
<210> 12
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> primer_bind <222> (1) .. (21) <223> Secuencia # 12. Secuencia del oligonucleotido # 12, utilizado para amplificar la secuencia 3C mediante PCR.
<400> 12 ataagcttga tcaattttct t 21
<210> 13 <211> 978 <212> ADN <213> Hepatitis A virus <220>
<221> gene
<222> Complement( (1) .. (978) )
<223> Secuencia # 13.
Secuencia correspondiente a la región de la poliproteína 3ABC con actividad proteolítica y donde los sitios de autoprocesamiento se encuentran mutados .
<400> 13 gaattcctgc agcccggggg atccatggga atttcagatg atgacaatga tagtgcagta 60 gctgagtttt tccggtcttt tccatctggt gaaccatcaa attccaagtt atctagtttt 120 ttccaagctg tcactaatca caagtgggtt gctgtgggag ctgcagttgg tattcttgga 180 ttgctagtgg gaggatggtt tgtgtataag catttttccc gcaaagagga agaaccaatt 240 ccagctgttg gggtttatca tggagtgact aagcccaaac aagtgattaa attggatgca 300 gatccagtag agtctcagtt gactctagaa atagcaggat tagttaggaa aaatttggtt 360 cagtttggag ttggtgagaa aaatggatgt gtgagatggg tcatgaatgc cttaggagtg 420 aaggatgatt ggttgttagt accttctcat gcttataaat ttgaaaagga ttatgaaatg 480 atggagtttt atttcaatag aggtggaact tactattcaa tttcagctgg taatgttgtt 540 attcaatctt tagatgtggg attccaagat gttgttctaa tgaaggttcc tacaattccc 600 aagtttagag atattactca acattttatt aagaaaggag atgtgcctag agccttgaat 660 cgcttggcaa cattagtgac aaccgttaat ggaactccta tgttaatttc tgagggacct 720 ttaaaaatgg aagaaaaagc cacttatgtt cataagaaga atgatggtac tacggttgat 780 ttgactgtag atcaggcatg gagaggaaaa ggtgaaggtc ttcctggaat gtgtggtggg 840 gccctagtgt catcaaatca gtccatacaa aatgcaattt tgggtattca tgttgctgga 900 ggaaattcaa ttcttgtggc aaagttgatt actcaagaaa tgtttcaaaa cattgataag 960 aaaattgaaa tcaagctt 978
<210> 14 <211> 3489 <212> ADN <213> Hepatitis A virus
<220> <221> gene
<222> Complement ( (1) .. (3489) ) <223> Secuencia # 14.
Secuencia nucleotídica que codifica para el nuevo Marco de Lectura Abierto modificado (MLAm) de la cepa cubana M2 del VHA,
<400> 14 atgaatatgt ccaaacaagg aattttccag actgttggga gtggccttga ccacatcctg 60 tccttggcag atattgagga agagcaaatg attcagtccg ttgataggac tgcagtgact 120 ggagcttctt atttcacttc tgtggaccaa tcttcagttc atactgctga ggttggctca 180 caccaaattg aacctttgaa aacctctgtt gataaacctg gttctaagaa aactcagggg 240 gagaagtttt tcttgattca ttctgctgat tggctcacta cacatgctct ctttcatgaa 300 gttgcaaaat tggatgtggt gaaactgctg tacaatgagc agtttgccgt ccaaggtttg 360 ttgagatacc atacttatgc aagatttggc attgagattc aagttcagat aaatcccaca 420 ccctttcagc aaggaggact aatctgtgcc atggttcctg gtgaccaaag ttatggttca 480 atagcatcct tgactgttta tcctcatggt ctgttaaatt gcaatatcaa caatgtagtt 540 agaataaagg ttccatttat ttatactaga ggtgcttatc attttaaaga tccacagtac 600 ccagtttggg aattgacaat cagagtttgg tcagagttga atattggaac aggaacctca 660 gcttatactt cactcaatgt tttagctagg tttacagatt tggagttgca tggattaact 720 cctctttcta cacagatgat gagaaatgaa tttagagtta gtactactga aaatgttgta 780 aatttgtcaa attatgaaga tgcaagggca aaaatgtctt ttgctttgga tcaggaagat 840 tggaagtctg atccttccca aggtggtgga attaaaatta ctcatttcac tacctggaca 900 tccattccaa ccttagctgc tcagtttcca ttcaatgctt cagattcagt tgggcaacaa 960 attaaagtta taccagtgga cccatacttt ttccagatga caaacactaa tcctgatcaa 1020 aaatgtataa cagccttggc ctctatttgt cagatgttct gcttttggag gggagatctt 1080 gttttcgatt tccaggtttt tccaaccaaa tatcattcag gtaggctgtt gttttgtttt 1140 gttcctggga atgagttaat agatgttact ggaattacat taaaacaggc aactactgct 1200 ccttgtgcag tgatggacat tacaggagtg cagtcaacct tgagatttcg tgttccttgg 1260 atttctgata caccctatcg agtgaatagg tacacgaagt cagcacatca aaaaggtgag 1320 tatactgcca ttgggaagct tattgtgtat tgttataata gattgacttc tccttctaat 1380 gttgcttctc atgttagagt taatgtttat ctttcagcaa ttaatttgga atgttttgct 1440 cctctttacc atgctatgga tgttaccaca caggttggag atgattcagg aggtttctca 1500 acaacagttt ctacagagca gaatgttcct gatccccaag ttggcataac aaccatgagg 1560 gatttaaaag ggaaagccaa taggggaaag atggatgtat caggagtgca ggtacctgtg 1620 ggagctatta caacaattga ggatccagtt ttagcaaaga aagtacctga gacatttcct 1680 gaattgaagc ctggagaatc cagacataca tcagatcaca tgtctattta taaattcatg 1740 ggaaggtctc atttcttgtg tacttttact tttaattcaa acaataaaga gtacacattt 1800 ccaataactc tgtcttcgac ttctaatcct cctcatggtt taccatcaac attaaggtgg 1860 ttctttaatt tgtttcagtt gtatagagga ccattggatt tgacaattat aatcacagga 1920 gccactgatg tggatggtat ggcctggttt actccagtgg gccttgctgt cgacacccct 1980 tgggtggaaa agaagtcagc tttgtctatt gattataaaa ctgcccttgg agctgttaga 2040 tttaatacaa gaagaacagg gaacattcag attagattgc catggtattc ttatttgtat 2100 gccgtgtctg gagcactgga tggcttggga gataagacag attctacatt tggattggtt 2160 tctattcaga ttgcaaatta caatcattct gatgaatatt tgtcctttag ttgttatttg 2220 tctgtcacag agcaatcaga gttctatttc cctagagctc cattaaattc aaatgctatg 2280 ttgtccactg agtccatgat gagtagaatt gcagctggag acttggagtc atcagtggat 2340 gatcccagat cagaggagga cagaagattt gagagtcata tagaatgtag gaaaccatat 2400 aaagaattga gactggaggt tgggaaacaa agaatcaaat atgctcagga agagttatca 2460 aatgaagtgc ttccacctcc taggaaaatg aaggggttat tttcacaagc tgaattcctg 2520 cagcccgggg gatccatggg aatttcagat gatgacaatg atagtgcagt agctgagttt 2580 ttccggtctt ttccatctgg tgaaccatca aattccaagt tatctagttt tttccaagct 2640 gtcactaatc acaagtgggt tgctgtggga gctgcagttg gtattcttgg attgctagtg 2700 ggaggatggt ttgtgtataa gcatttttcc cgcaaagagg aagaaccaat tccagctgtt 2760 ggggtttatc atggagtgac taagcccaaa caagtgatta aattggatgc agatccagta 2820 gagtctcagt tgactctaga aatagcagga ttagttagga aaaatttggt tcagtttgga 2880 gttggtgaga aaaatggatg tgtgagatgg gtcatgaatg ccttaggagt gaaggatgat 2940 tggttgttag taccttctca tgcttataaa tttgaaaagg attatgaaat gatggagttt 3000 tatttcaata gaggtggaac ttactattca atttcagctg gtaatgttgt tattcaatct 3060 ttagatgtgg gattccaaga tgttgttcta atgaaggttc ctacaattcc caagtttaga 3120 gatattactc aaσattttat taagaaagga gatgtgccta gagccttgaa tcgcttggca 3180 acattagtga caaccgttaa tggaactcct atgttaattt ctgagggacc tttaaaaatg 3240 gaagaaaaag ccacttatgt tcataagaag aatgatggta ctacggttga tttgactgta 3300 gatcaggcat ggagaggaaa aggtgaaggt cttcctggaa tgtgtggtgg ggccctagtg 3360 tcatcaaatc agtccataca aaatgcaatt ttgggtattc atgttgctgg aggaaattca 3420 attcttgtgg caaagttgat tactcaagaa atgtttcaaa acattgataa gaaaattgaa 3480 atcaagctt 3489
<210> 15
<211> 51
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> gene <222> (1) .. (51) <223> Secuencia # 15.
Fragmento sintético que restituye el inicio de la trascripción de la proteína VP2.
<400> 15 gggatggata ttgaggaaga gcaaatgatt cagtccgttg ataggactgc a 51 <210> 16
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> <221> gene <222> (1) .. (47) <223> Secuencia # 16. Fragmento sintético que restituye el inicio de la trascripción de la proteína VP2 (cadena complementaria) .
<400> 16 gtcctatcaa cggactgaat catttgctct tcctcaatat ccatccc 47
<210> 17 <211> 3426 <212> ADN
<213> Hepatitis A virus
<220> <221> gene <222> Complement( (1) .. (3426) ) <223> Secuencia # 17.
Secuencia que codifica para el nuevo Marco de Lectura Abierto modificado (DMLArα) de la cepa cubana M2 del VHA. Esta secuencia no tiene el gen que codifica para la proteína VP4.
<400> 17 gggatggata ttgaggaaga gcaaatgatt cagtccgttg ataggactgc agtgactgga 60 gcttcttatt tcacttctgt ggaccaatct tcagttcata ctgctgaggt tggctcacac 120 caaattgaac ctttgaaaac ctctgttgat aaacctggtt ctaagaaaac tcagggggag 180 aagtttttct tgattcattc tgctgattgg ctcactacac atgctctctt tcatgaagtt 240 gcaaaattgg atgtggtgaa actgctgtac aatgagcagt ttgccgtcca aggtttgttg 300 agataccata cttatgcaag atttggcatt gagattcaag ttcagataaa tcccacaccc 360 tttcagcaag gaggactaat ctgtgccatg gttcctggtg accaaagtta tggttcaata 420 gcatccttga ctgtttatcc tcatggtctg ttaaattgca atatcaacaa tgtagttaga 480 ataaaggttc catttattta tactagaggt gcttatcatt ttaaagatcc acagtaccca 540 gtttgggaat tgacaatcag agtttggtca gagttgaata ttggaacagg aacctcagct 600 tatacttcac tcaatgtttt agctaggttt acagatttgg agttgcatgg attaactcct 660 ctttctacac agatgatgag aaatgaattt agagttagta ctactgaaaa tgttgtaaat 720 ttgtcaaatt atgaagatgc aagggcaaaa atgtcttttg ctttggatca ggaagattgg 780 aagtctgatc cttcccaagg tggtggaatt aaaattactc atttcactac ctggacatcc 840 attccaacct tagctgctca gtttccattc aatgcttcag attcagttgg gcaacaaatt 900 aaagttatac cagtggaccc atactttttc cagatgacaa acactaatcc tgatcaaaaa 960 tgtataacag ccttggcctc tatttgtcag atgttctgct tttggagggg agatcttgtt 1020 ttcgatttcc aggtttttcc aaccaaatat cattcaggta ggctgttgtt ttgttttgtt 1080 cctgggaatg agttaataga tgttactgga attacattaa aacaggcaac tactgctcct 1140 tgtgcagtga tggacattac aggagtgcag tcaaccttga gatttcgtgt tccttggatt 1200 tctgatacac cctatcgagt gaataggtac acgaagtcag cacatcaaaa aggtgagtat 1260 actgccattg ggaagcttat tgtgtattgt tataatagat tgacttctcc ttctaatgtt 1320 gcttctcatg ttagagttaa tgtttatctt tcagcaatta atttggaatg ttttgctcct 1380 ctttaccatg ctatggatgt taccacacag gttggagatg attcaggagg tttctcaaca 1440 acagtttcta cagagcagaa tgttcctgat ccccaagttg gcataacaac catgagggat 1500 ttaaaaggga aagccaatag gggaaagatg gatgtatcag gagtgcaggt acctgtggga 1560 gctattacaa caattgagga tccagtttta gcaaagaaag tacctgagac atttcctgaa 1620 ttgaagcctg gagaatccag acatacatca gatcacatgt ctatttataa attcatggga 1680 aggtctcatt tcttgtgtac ttttactttt aattcaaaca ataaagagta cacatttcca 1740 ataactctgt cttcgacttc taatcctcct catggtttac catcaacatt aaggtggttc 1800 tttaatttgt ttcagttgta tagaggacca ttggatttga caattataat cacaggagcc 1860 actgatgtgg atggtatggc ctggtttact ccagtgggcc ttgctgtcga caccccttgg 1920 gtggaaaaga agtcagcttt gtctattgat tataaaactg cccttggagc tgttagattt 1980 aatacaagaa gaacagggaa cattcagatt agattgccat ggtattctta tttgtatgcc 2040 gtgtctggag cactggatgg cttgggagat aagacagatt ctacatttgg attggtttct 2100 attcagattg caaattacaa tcattctgat gaatatttgt cctttagttg ttatttgtct 2160 gtcacagagc aatcagagtt ctatttccct agagctccat taaattcaaa tgctatgttg 2220 tccactgagt ccatgatgag tagaattgca gctggagact tggagtcatc agtggatgat 2280 cccagatcag aggaggacag aagatttgag agtcatatag aatgtaggaa accatataaa 2340 gaattgagac tggaggttgg gaaacaaaga atcaaatatg ctcaggaaga gttatcaaat 2400 gaagtgcttc cacctcctag gaaaatgaag gggttatttt cacaagctga attcctgcag 2460 cccgggggat ccatgggaat ttcagatgat gacaatgata gtgcagtagc tgagtttttc 2520 cggtcttttc catctggtga accatcaaat tccaagttat ctagtttttt ccaagctgtc 2580 actaatcaca agtgggttgc tgtgggagct gcagttggta ttcttggatt gctagtggga 2640 ggatggtttg tgtataagca tttttcccgc aaagaggaag aaccaattcc agctgttggg 2700 gtttatcatg gagtgactaa gcccaaacaa gtgattaaat tggatgcaga tccagtagag 2760 tctcagttga ctctagaaat agcaggatta gttaggaaaa atttggttca gtttggagtt 2820 ggtgagaaaa atggatgtgt gagatgggtc atgaatgcct taggagtgaa ggatgattgg 2880 ttgttagtac cttctcatgc ttataaattt gaaaaggatt atgaaatgat ggagttttat 2940 ttcaatagag gtggaactta ctattcaatt tcagctggta atgttgttat tcaatcttta 3000 gatgtgggat tccaagatgt tgttctaatg aaggttccta caattcccaa gtttagagat 3060 attactcaac attttattaa gaaaggagat gtgcctagag ccttgaatcg cttggcaaca 3120 ttagtgacaa ccgttaatgg aactcctatg ttaatttctg agggaccttt aaaaatggaa 3180 gaaaaagcca cttatgttca taagaagaat gatggtacta cggttgattt gactgtagat 3240 caggcatgga gaggaaaagg tgaaggtctt cctggaatgt gtggtggggc cctagtgtca 3300 tcaaatcagt ccatacaaaa tgcaattttg ggtattcatg ttgctggagg aaattcaatt 3360 cttgtggcaa agttgattac tcaagaaatg tttcaaaaca ttgataagaa aattgaaatc 3420 aagctt 3426
<210> 18
<211> 19
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1) .. (19)
<223> Secuencia # 18.
Fragmento sintético que corresponde a la secuencia nucleotídica de la señal de retención en el retículo endoplasmático (KDEL) .
<400> 18 atcaaggatg aattgtaat 19
<210> 19 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1) .. (21)
<223> Secuencia # 19.
Fragmento sintético que corresponde a la secuencia nucleotídica de la señal de retención en el retículo endoplasmático (KDEL) .
<400> 19 cgattacaat tcatccttga t 21 <210> 20 <211> 55 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> D_segment <222> (1) .. (54)
<223> Secuencia # 20
Fragmento sintético que modifica el extremo 3' de la proteína 2A introduce un espaciador entre ésta y la señal KDEL.
<400> 20 cctaggaaaa tgaaggggtt atatgcttct ggaggtgaat tcgatatcaa ggatg 55
<210> 21 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220>
<221> D_segment <222> (1) .. (54) <223> Secuencia # 21.
Fragmento sintético que modifica el extremo 3! de la protaína 2A introduce un espaciador entre ésta y la señal KDEL.
<400> 21 aattcatcct tgatatcgaa ttcacctcca gaagcatata accccttcat tttc 54
<210> 22
<211> 2555
<212> ADN
<213> Hepatitis A virus
<220>
<221> gene
<222> Complement ( (1) .. (2555) )
<223> Secuencia # 22.
Secuencia que codifica para las proteínas estructurales (P1-2A) unidas a la señal de retención en el retículo endoplasmático.
<400> 22 atgaatatgt ccaaacaagg aattttccag actgttggga gtggccttga ccacatcctg 60 tccttggcag atattgagga agagcaaatg attcagtccg ttgataggac tgcagtgact 120 ggagcttctt atttcacttc tgtggaccaa tcttcagttc atactgctga ggttggctca 180 caccaaattg aacctttgaa aacctctgtt gataaacctg gttctaagaa aactcagggg 240 gagaagtttt tcttgattca ttctgctgat tggctcacta cacatgctct ctttcatgaa 300 gttgcaaaat tggatgtggt gaaactgctg tacaatgagc agtttgccgt ccaaggtttg 360 ttgagatacc atacttatgc aagatttggc attgagattc aagttcagat aaatcccaca 420 ccctttcagc aaggaggact aatctgtgcc atggttcctg gtgaccaaag ttatggttca 480 atagcatcct tgactgttta tcctcatggt ctgttaaatt gcaatatcaa caatgtagtt 540 agaataaagg ttccatttat ttatactaga ggtgcttatc attttaaaga tccacagtac 600 ccagtttggg aattgacaat cagagtttgg tcagagttga atattggaac aggaacctca 660 gcttatactt cactcaatgt tttagctagg tttacagatt tggagttgca tggattaact 720 cctctttcta cacagatgat gagaaatgaa tttagagtta gtactactga aaatgttgta 780 aatttgtcaa attatgaaga tgcaagggca aaaatgtctt ttgctttgga tcaggaagat 840 tggaagtctg atccttccca aggtggtgga attaaaatta ctcatttcac tacctggaca 900 tccattccaa ccttagctgc tcagtttcca ttcaatgctt cagattcagt tgggcaacaa 960 attaaagtta taccagtgga cccatacttt ttccagatga caaacactaa tcctgatcaa 1020 aaatgtataa cagccttggc ctctatttgt cagatgttct gcttttggag gggagatctt 1080 gttttcgatt tccaggtttt tccaaccaaa tatcattcag gtaggctgtt gttttgtttt 1140 gttcctggga atgagttaat agatgttact ggaattacat taaaacaggc aactactgct 1200 ccttgtgcag tgatggacat tacaggagtg cagtcaacct tgagatttcg tgttccttgg 1260 atttctgata caccctatcg agtgaatagg tacacgaagt cagcacatca aaaaggtgag 1320 tatactgcca ttgggaagct tattgtgtat tgttataata gattgacttc tccttctaat 1380 gttgcttctc atgttagagt taatgtttat ctttcagcaa ttaatttgga atgttttgct 1440 cctctttacc atgctatgga tgttaccaca caggttggag atgattcagg aggtttctca 1500 acaacagttt ctacagagca gaatgttcct gatccccaag ttggcataac aaccatgagg 1560 gatttaaaag ggaaagccaa taggggaaag atggatgtat caggagtgca ggtacctgtg 1620 ggagctatta caacaattga ggatccagtt ttagcaaaga aagtacctga gacatttcct 1680 gaattgaagc ctggagaatc cagacataca tcagatcaca tgtctattta taaattcatg 1740 ggaaggtctc atttcttgtg tacttttact tttaattcaa acaataaaga gtacacattt 1800 ccaataactc tgtcttcgac ttctaatcct cctcatggtt taccatcaac attaaggtgg 1860 ttctttaatt tgtttcagtt gtatagagga ccattggatt tgacaattat aatcacagga 1920 gccactgatg tggatggtat ggcctggttt actccagtgg gccttgctgt cgacacccct 1980 tgggtggaaa agaagtcagc tttgtctatt gattataaaa ctgcccttgg agctgttaga 2040 tttaatacaa gaagaacagg gaacattcag attagattgc catggtattc ttatttgtat 2100 gccgtgtctg gagcactgga tggcttggga gataagacag attctacatt tggattggtt 2160 tctattcaga ttgcaaatta caatcattct gatgaatatt tgtcctttag ttgttatttg 2220 tctgtcacag agcaatcaga gttctatttc cctagagctc cattaaattc aaatgctatg 2280 ttgtccactg agtccatgat gagtagaatt gcagctggag acttggagtc atcagtggat 2340 gatcccagat cagaggagga cagaagattt gagagtcata tagaatgtag gaaaccatat 2400 aaagaattga gactggaggt tgggaaacaa agaatcaaat atgctcagga agagttatca 2460 aatgaagtgc ttccacctcc taggaaaatg aaggggttat atgcttctgg aggtgaattc 2520 gatatcaagg atgaattgta atcgataccg tcgac 2555
<210> 23 <211> 1012 <212> ADN <213> Hepatitis A virus
<220> <221> gene
<222> Complement( (1) .. (1012) ) <223> Secuencia # 23.
Secuencia que codifica para la poliprotína 3ABC y la señal de retención en el retículo endoplasmático.
<400> 23 gaattcctgc agcccggggg atccatggga atttcagatg atgacaatga tagtgcagta 60 gctgagtttt tccggtcttt tccatctggt gaaccatcaa attccaagtt atctagtttt 120 ttccaagctg tcactaatca caagtgggtt gctgtgggag ctgcagttgg tattcttgga 180 ttgctagtgg gaggatggtt tgtgtataag catttttccc gcaaagagga agaaccaatt 240 ccagctgttg gggtttatca tggagtgact aagcccaaac aagtgattaa attggatgca 300 gatccagtag agtctcagtt gactctagaa atagcaggat tagttaggaa aaatttggtt 360 cagtttggag ttggtgagaa aaatggatgt gtgagatggg tcatgaatgc cttaggagtg 420 aaggatgatt ggttgttagt accttctcat gcttataaat ttgaaaagga ttatgaaatg 480 atggagtttt atttcaatag aggtggaact tactattcaa tttcagctgg taatgttgtt 540 attcaatctt tagatgtggg attccaagat gttgttctaa tgaaggttcc tacaattccc 600 aagtttagag atattactca acattttatt aagaaaggag atgtgcctag agccttgaat 660 cgcttggcaa cattagtgac aaccgttaat ggaactccta tgttaatttc tgagggacct 720 ttaaaaatgg aagaaaaagc cacttatgtt cataagaaga atgatggtac tacggttgat 780 ttgactgtag atcaggcatg gagaggaaaa ggtgaaggtc ttcctggaat gtgtggtggg 840 gccctagtgt catcaaatca gtccatacaa aatgcaattt tgggtattca tgttgctgga 900 ggaaattcaa ttcttgtggc aaagttgatt actcaagaaa tgtttcaaaa cattgataag 960 aaaattgaaa tcaagcttcg acctcgaatc aaggatgaat tgtaatcgat ac 1012
<210> 24 <211> 2492 <212> ADN <213> Hepatitis A virus <220>
<221> gene
<222> Complement ( (1) .. (2492) )
<223> Secuencia que codifica para la región estructural, exceptuando a la proteína VP4, fusionada a la señal de retención en el retículo endoplasmático.
<400> 24 gggatggata ttgaggaaga gcaaatgatt cagtccgttg ataggactgc agtgactgga 60 gcttcttatt tcacttctgt ggaccaatct tcagttcata ctgctgaggt tggctcacac 120 caaattgaac ctttgaaaac ctctgttgat aaacctggtt ctaagaaaac tcagggggag 180 aagtttttct tgattcattc tgctgattgg ctcactacac atgctctctt tcatgaagtt 240 gcaaaattgg atgtggtgaa actgctgtac aatgagcagt ttgccgtcca aggtttgttg 300 agataccata cttatgcaag atttggcatt gagattcaag ttcagataaa tcccacaccc 360 tttcagcaag gaggactaat ctgtgccatg gttcctggtg accaaagtta tggttcaata 420 gcatccttga ctgtttatcc tcatggtctg ttaaattgca atatcaacaa tgtagttaga 480 ataaaggttc catttattta tactagaggt gcttatcatt ttaaagatcc acagtaccca 540 gtttgggaat tgacaatcag agtttggtca gagttgaata ttggaacagg aacctcagct 600 tatacttcac tcaatgtttt agctaggttt acagatttgg agttgcatgg attaactcct 660 ctttctacac agatgatgag aaatgaattt agagttagta ctactgaaaa tgttgtaaat 720 ttgtcaaatt atgaagatgc aagggcaaaa atgtcttttg ctttggatca ggaagattgg 780 aagtctgatc cttcccaagg tggtggaatt aaaattactc atttcactac ctggacatcc 840 attccaacct tagctgctca gtttccattc aatgcttcag attcagttgg gcaacaaatt 900 aaagttatac cagtggaccc atactttttc cagatgacaa acactaatcc tgatcaaaaa 960 tgtataacag ccttggcctc tatttgtcag atgttctgct tttggagggg agatcttgtt 1020 ttcgatttcc aggtttttcc aaccaaatat cattcaggta ggctgttgtt ttgttttgtt 1080 cctgggaatg agttaataga tgttactgga attacattaa aacaggcaac tactgctcct 1140 tgtgcagtga tggacattac aggagtgcag tcaaccttga gatttcgtgt tccttggatt 1200 tctgatacac cctatcgagt gaataggtac acgaagtcag cacatcaaaa aggtgagtat 1260 actgccattg ggaagcttat tgtgtattgt tataatagat tgacttctcc ttctaatgtt 1320 gcttctcatg ttagagttaa tgtttatctt tcagcaatta atttggaatg ttttgctcct 1380 ctttaccatg ctatggatgt taccacacag gttggagatg attcaggagg tttctcaaca 1440 acagtttcta cagagcagaa tgttcctgat ccccaagttg gcataacaac catgagggat 1500 ttaaaaggga aagccaatag gggaaagatg gatgtatcag gagtgcaggt acctgtggga 1560 gctattacaa caattgagga tccagtttta gcaaagaaag tacctgagac atttcctgaa 1620 ttgaagcctg gagaatccag acatacatca gatcacatgt ctatttataa attcatggga 1680 aggtctcatt tcttgtgtac ttttactttt aattcaaaca ataaagagta cacatttcca 1740 ataactctgt cttcgacttc taatcctcct catggtttac catcaacatt aaggtggttc 1800 tttaatttgt ttcagttgta tagaggacca ttggatttga caattataat cacaggagcc 1860 actgatgtgg atggtatggc ctggtttact ccagtgggcc ttgctgtcga caccccttgg 1920 gtggaaaaga agtcagcttt gtctattgat tataaaactg cccttggagc tgttagattt 1980 aatacaagaa gaacagggaa cattcagatt agattgccat ggtattctta tttgtatgcc 2040 gtgtctggag cactggatgg cttgggagat aagacagatt ctacatttgg attggtttct 2100 attcagattg caaattacaa tcattctgat gaatatttgt cctttagttg ttatttgtct 2160 gtcacagagc aatcagagtt ctatttccct agagctccat taaattcaaa tgctatgttg 2220 tccactgagt ccatgatgag tagaattgca gctggagact tggagtcatc agtggatgat 2280 cccagatcag aggaggacag aagatttgag agtcatatag aatgtaggaa accatataaa 2340 gaattgagac tggaggttgg gaaacaaaga atcaaatatg ctcaggaaga gttatcaaat 2400 gaagtgcttc cacctcctag gaaaatgaag gggttatatg cttctggagg tgaattcgat 2460 atcaaggatg aattgtaatc gataccgtcg 2492

Claims

REIVINDICACIONES
1. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A caracterizado porque son obtenidos en células vegetales a partir de construcciones genéticas que contienen genes quiméricos del VHA basados en fragmentos modificados del genoma SEQ ID
NO 3.
2. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 1 caracterizado porque contiene solamente pentámeros.
3. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 1 y 2 caracterizado porque se obtienen a partir de la expresión de un gen quimérico según la SEQ ID NO 17 que contiene la fusión de los elementos siguientes: a. Un secuencia nucleotídica que codifica para las proteínas VP2, VP3, VP1 y 2A SEQ ID NO 25 b. Un secuencia nucleotídica que codifica para las proteínas 3A, 3B, 3C, Seq. Id No.13
4. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 3 caracterizado porque el gen quimérico se expresa en células vegetales regulado por señales promotoras y de terminación apropiadas.
5. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 4 caracterizado porque se obtienen en el citosol de la célula vegetal.
6. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 5 caracterizado porque se expresan en plantas dicotiledóneas.
7. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 6 caracterizado porque se expresa en tabaco, zanahoria y en frutos de plantas comestibles.
8. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 5 caracterizado porque se expresa en plantas monocotiledóneas.
9. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 8 caracterizado porque se expresa en arroz y en frutos de plantas comestibles.
10. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 1 caracterizado porque contiene pentámeros y envolturas vacías.
11. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 10 caracterizado porque se obtuvo a partir de la expresión de un gen quimérico que contiene la fusión de los dos elementos siguientes: a. Un secuencia nucleotídica según la SEQ ID NO 6 que codifica para las proteínas VP4.VP2, VP3, VP1 y 2A. b. Un secuencia nucleotídica que codifica para las proteínas 3A, 3B, 3C, según la reivindicación 3b.
12. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 11 caracterizado porque el gen quimérico se expresa en la célula vegetal regulado por señales promotoras y de terminación apropiadas.
13. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 12 caracterizado porque se obtienen en el citosol de la célula vegetal.
14. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 13 caracterizado porque se obtienen en plantas dicotiledóneas.
15. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 14 caracterizado porque se expresa en tabaco, zanahoria y en frutos de plantas comestibles.
16. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 13 caracterizado porque se expresa en plantas monocotiledóneas.
17. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 16 caracterizado porque se expresa en arroz y en frutos de plantas comestibles.
18. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 2 caracterizado porque se obtienen a partir de la expresión coordinada de dos genes quiméricos: a. Un secuencia nucleotídica, según la SEQ ID NO 24 que codifica para las proteínas VP2, VP3, VP1, 2A, fusionada en su extremo 5' a una secuencia señal y por su extremo 3' a una secuencia espadadora seguido de la secuencia que codifica para el péptido KDEL. b. Un secuencia nucleotídica, según la SEQ ID NO 23 que codifica para las proteínas 3A, 3B, 3C, referidas en la reivindicación 3b, fusionadas en su extremo 5' a una secuencia señal y por su extremo 3' a una secuencia espadadora seguido de la secuencia que codifica para el péptido KDEL.
19. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 18 caracterizado porque los genes quiméricos se expresan en la célula vegetal regulados por señales promotoras y de terminación apropiadas.
20. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 18 y 19 caracterizado porque se obtienen en el retículo endoplasmático de la célula vegetal.
21. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 20 caracterizado porque se obtienen en plantas dicotiledóneas.
22. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 21 caracterizado porque se obtienen en tabaco, zanahoria y en frutos de plantas comestibles
23. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 20 caracterizado porque se obtienen en plantas monocotiledóneas.
24. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 23 caracterizado porque se obtienen en arroz, y en frutos de plantas comestibles
25. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 10 caracterizado porque se obtienen a partir de la expresión coordinada de dos genes quiméricos: a. Un secuencia nucleotídica, según la SEQ ID NO 22 que codifica para las proteínas VP4, VP2, VP3, VP1 , 2A, fusionada en su extremo 5' a una secuencia señal y por su extremo 3' a una secuencia espadadora y seguido de la secuencia que codifica para el péptido KDEL. b. Un secuencia nucleotídica, según la reivindicación 18 b.
26. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 25 caracterizados porque los genes quiméricos se expresan en la célula vegetal regulados por señales promotoras y de terminación apropiadas.
27. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 25 y 26 caracterizados porque se obtienen en el retículo endoplasmático de la célula vegetal.
28. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 27 caracterizados porque se obtienen en plantas dicotiledóneas.
29. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 28 caracterizados porque se obtienen en tabaco, zanahoria y en frutos de plantas comestibles
30. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 27 caracterizados porque se obtienen en plantas monocotiledóneas.
31. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 30 caracterizados porque se obtienen en arroz, y en frutos de plantas comestibles
32. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según las reivindicaciones 1 , 3, 11 , 18 y 25 los cuales pueden ser purificados para ser administrados por vía parenteral.
33. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 32 que puede ser administrado en combinación con otros antígenos virales.
34. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según las reivindicaciones 1 , 3, 11 , 18 y 25 los cuales pueden ser administrados por vía oral.
35. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 34 los cuales pueden ser administrados en forma de extracto liofilizado, tableta o cápsula
36. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según las reivindicaciones 1 , 3, 11 , 18 y 25 los cuales pueden ser administrados en forma de jugo.
37. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según las reivindicaciones 1 , 3, 11, 18 y 25 los cuales son inmunogénicos y levantan respuesta inmune protectora contra la hepatitis A.
38. Antígenos recombinantes del virus de la Hepatitis A según la reivindicación 32, los cuales pueden ser utilizados como parte de un sistema diagnóstico de la hepatitis A.
39. Uso de los antígenos según las reivindicaciones 1 a la 38 para preparar composiciones vacunales simples y combinadas.
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