CN1745174A - 植物细胞中获得的重组甲型肝炎病毒抗原 - Google Patents

植物细胞中获得的重组甲型肝炎病毒抗原 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在植物细胞中获得的重组甲型肝炎病毒抗原。更具体而言，本发明涉及基于甲型肝炎病毒(HAV)基因组的修饰片段的基因构建体的产生，使用古巴分离的菌株M2。在转基因植物中表达与合适的定位和调节信号融合的这些片段的核苷酸序列，获得的HAV重组抗原包括能够产生免疫应答的五聚体和/或空外壳。

Description

植物细胞中获得的重组甲型肝炎病毒抗原
发明领域
本发明涉及生物技术分支和更具体地说涉及重组蛋白在转基因植物细胞中的表达和这些植物作为抗原疫苗的用途。尤其是，它显示了从古巴分离的M2菌株的HAV基因组的修饰片段表达得到的转基因植物中获得的甲型肝炎病毒的重组抗原。
也证明了这些抗原以不同方式接种后在动物中发展免疫应答的有用性。
背景技术
HAV的基因组是具有正极性的简单菌种RNA。它具有大约7.5kb，编码253kDa的多蛋白(polyprotein)(Cohen等，Journal of Virology(1987)，61：3035-3039)。该多蛋白遭受翻译和翻译后加工，产生结构成熟的蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4和2A)和没有结构蛋白(2B、2C、3A、3B、3C和3D)。
该病毒多蛋白P3结构域中存在的蛋白酶3C(Pro3C)是参与HAV多蛋白切割的蛋白酶(Martin等，J Virol.(1999)，73(8)：6220-7)，允许中间体P1-2A、2BC和P3的释放，随后加工它们。因此，对于被膜的充分形成和对于HAV复制，有必要发生HAV多蛋白的差异蛋白水解加工。在P3区加工期间，仅仅3C/3D位点被有效切割。在3A/3B和/或3B/3C位点有延迟的加工，允许中间多肽3ABC蓄积(Kusov等，Journal of Virology(1999)，73：9867-9878)，其切割多肽P1-2A具有与蛋白酶3C相似的效率。这个步骤促进五聚体形成效率更高。特征形式的病毒来自病毒蛋白的统一，其三维构型对于保护性免疫应答的产生很重要。HAV的病毒粒子显示中和的免疫优势抗原位点，其在从不同地理区域分离的HAV菌种中严格保守。排列了五个构象性表位，五聚体装配后产生的五聚体中它们中的三个和两个其它的形成被膜。
人们认为这些最新的表位是由于在五聚体装配期间它们中存在的抗原位点的构象变化或由于表位片段并列而形成的。五聚体以及病毒颗粒都诱导中和抗体，因此它们可以对疫苗开发有用(Stapleton等，Journal of Virology(1993)，67：1080-1085)。使用含有HAV完全开放读框的重组杆状病毒，HAV的巨大多蛋白被表达。在昆虫细胞中加工的其它中间蛋白也被表达(Stapleton等，The Journal ofInfectious Diseases(1995)，171：9-14)。此外，构建在哺乳动物细胞中表达相同HAV多蛋白的重组牛痘病毒。这些基因构建体感染的细胞的提取物显示产生类似于HAV衣壳的衣壳的多蛋白翻译后加工(Winokur等，Journal of Virology(1994)，65：5029-5036)。有描述在杆状病毒系统和牛痘中表达的抗HAV重组疫苗变体的专利，如Winokur等专利申请WO9301279公开，1993年1月21日；专利US5294548(McLinden等，1994年3月)；专利申请WO09844122公开(Probst，2002年8月27日)；专利申请WO9111460的公开和专利US5605692(Thomas等，1997年2月25日)，其中开放读框(ORF)的序列用于免疫原性衣壳和五聚体的制备，并保护了获得HAV衣壳的方法，顺式和反式方向表达结构区和P3区的方法以及双顺反子构建体。转基因植物作为生物反应器。
80年代初期产生了起源于根杆菌属根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)基因转移的第一株转基因植物(Zambryski等，EMBO J.1983，2：2143-2150)。这个技术起初被用作获得对致病微生物有抗性(Powe11等，Science 1986，232：738-743)、对昆虫有抗性(Vaeck等，Nature 1987，328：33-37)和对除草剂有抗性(Of Block等，1987，EMBO J.6：2513-2518)的方法。但是植物细胞正确装配结构复杂性高的外来蛋白的能力的证明迅速表明其作为逐步提高工业和生物制药行业经济制备重组蛋白的新策略的价值(Barta等，Plant Mol.Biol 1986，6：347-357；Cramer等，Ann.N And Acad.Sci.1996，792：62-71；Staub等，Nature Biotechn.2001.18：333-338)。
1992年，引入了与亚单位疫苗的制备相关的新概念。它来自转基因植物可以表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的证明。基于这些发现，人们认为植物可能用来在可食用产物中产生疫苗候选物和仅由消费这些产物产生获得免疫。通过这些事实，证明了“可食用疫苗”出现(Arntzen等，Plants.Vaccine 1994，94：339-344)。后来证明了用含有HBsAg的转基因马铃薯喂养的小鼠显示出类似于用腹膜内方法施用单独剂量的商品化疫苗时获得的初次免疫应答。这些结果表明抗原在可食用植物组织中的表达可以认为是免疫的新途径(Richter等，Nature Biotechnology 2000，18：1167-1171)。
有几个专利描述了植物用于表达疫苗的用途，如，专利US5484719(Lam等，1996年1月16日)；专利US5612487(Lam等，1996年1月16日)；专利US5914123、专利US5612487的分案和专利申请PCT/US94/02332的部分继续申请(Arntzen等，1999年6月22日)；专利US6136320(Arntzen等，1999年6月22日)；专利申请WO9612801的出版物(Arntzen等，2002年5月28日)和专利申请US2002006411(Lam等，2002年6月4日)。
以前提及的文件描述了植物作为疫苗的用途，以及HBsAg在植物中表达和在一些情况下，他们使用术语“病毒性肝炎”来指乙型肝炎病毒(VHB)。VHB明显不同于甲型肝炎病毒，具有差异很大的特征，因此从分类学观点来看，它们属于不同的种类。为了获得能够产生免疫重要反应的HAV重组蛋白，有必要表达病毒基因组的几个蛋白，然后完成这种颗粒形成五聚体或空衣壳。仅仅在作为牛痘和杆状病毒的真核系统中完成免疫原性颗粒的加工和形成，但在简单系统如酵母中没有。在转基因植物中，尚未表达HAV的复杂抗原。在VHB的情况下，该抗原仅仅由在简单真核系统如酵母中有效成微粒的一个蛋白形成。由于以前揭露的论据，我们相信HBsAg表达不包括HAV五聚体或空衣壳在植物中的表达。在其它专利申请中具体描述了不同病毒抗原的表达，如Sohn等2001年8月23日的专利申请WO0161022中的人乳头瘤病毒抗原；Zhong等2001年10月31日的CN1319670中的口蹄疫发热病毒的抗原；Reads等2001年8月16日的专利申请WO0159070中的轮状病毒和Shaehar等2001年12月27日的专利申请WO0197839中的gumboro病毒。
在植物中制备重组蛋白为产生在临床医学中具有重要性的药物化合物或疫苗提供了很多潜在优点。首先，植物系统比发酵系统或生物反应器中使用的工业基础设施更经济。其次，已经可利用收获和试图将植物及其产物发展为工业规模的技术。第三，当含有重组蛋白的植物用作食物(如在可食用疫苗的情况下)时，可以消除纯化该化合物的要求。第四，有可能指导重组蛋白至某些细胞内区室如线粒体、空泡、叶绿体和内质网，或直接在这些区室中(例如在叶绿体中)表达它们。第五，人病原体污染重组产物对健康的风险最小。最后，植物作为具有药物重要性的重组蛋白的表达系统具有另外优点，事实是分泌途径的许多步骤，包括折叠、装配、在内质网水平糖基化类似于哺乳动物的细胞(May Hein，Plant Physiol.1995，109：341-346；Rayon等，J.Exp.Bot.1998，49：1463-1472；Sanderfoot y Raikhel，Plant Cell.1999，11：629-641；Vitale和Denecke，Plant Cell1999，11：615-628；Lerouge等，Pharmaceutical Biotechnology2000，1：347-354)。
发明详述
本发明目的的基本设计由基因构建体支持，其允许编码结构蛋白和突变非结构区的不同变异体的基因的组合表达，涉及能够产生免疫反应的HAV抗原五聚体和衣壳在转基因植物中的重组表达。
我们的发明的新颖性基本上归于用于新开放读框构象的病毒基因组区，该开放读框编码大小较小、由严格结构区定形的多蛋白(仅直至蛋白2A)和病毒修饰的蛋白酶，该酶由于蛋白3A/3B和3B/3C之间的切割位点突变的事实，其大小比病毒蛋白酶3C大。首次完成了转基因植物中HAV病毒衣壳在胞质和内质网中表达，特别是在使用的启动子和调节信号控制下。内质网中五聚体和衣壳中形成作为结构区和负责蛋白水解的区域的组合表达的产物证明了这个区室用于复杂结构的装配和贮存的可能性，如在HAV的情况。在植物中制备五聚体和衣壳允许我们使用它们作为获得低廉和确实疫苗的生物反应器的可能性。
通过实施例来证明本发明，其中转基因烟草、稻和胡萝卜植物首次用于在植物细胞中获得具有免疫原性的病毒衣壳和五聚体。本发明的产物HAV衣壳和五聚体可以用作抗原疫苗，也可以用于HAV检测的诊断试验。
基因构建体
获得HAV的cDNA
从古巴分离的HAV菌种M2的RNA，扩增编码病毒开放读框(ORF)的核苷酸序列，使用反转录技术-聚合酶链式反应(RT-PCR)。这个片段克隆到质粒中并测定其核苷酸序列。它呈现出差异，相对于报道的序列，在第11个氨基酸残基产生了变异。该序列的分析允许将菌种M2分为亚基因型IA的一部分，几乎所有的美国菌种都属于这类。由这个菌种的基因组，设计和构建修饰的片段，然后用于本发明目的的不同基因构建体。
在转基因植物中表达衣壳和五聚体的载体的基因构建体HAV的重组蛋白酶
为了允许病毒衣壳的形成，有必要发生多蛋白的差异蛋白水解加工，该加工允许病毒蛋白的有序释放。当中间体3ABC存在时，由于蛋白3AB与膜和病毒蛋白的疏水相互作用，衣壳形成的效率增加。将蛋白3A/3B和3A/3C之间的蛋白酶3C的切割位点突变以获得多肽3ABC，其不释放蛋白酶3C，而依次保持HAV五聚体和衣壳形成所需的蛋白水解功能。置换是在3A/3B之间用缬氨酸置换谷氨酸和在3B/3C之间用亮氨酸置换丝氨酸。这个多肽用来设计形成免疫原性衣壳和五聚体表达的新颖和不同的策略。
在植物细胞的胞质中表达衣壳和五聚体的重组HAV
在HAV中，多肽P1-2A在病毒衣壳形成中具有重要的作用。在这个多肽中，有两个调节衣壳形成的迹象。在它的羧基末端结构域发现了蛋白2A，其在衣壳装配以完成五聚体形成的第一阶段需要。它们由多肽P1-2A的五个未加工分子的组合组成。在五聚体结合和衣壳形成的第二阶段需要蛋白VP4。
对于修饰的多蛋白在植物细胞的胞质中表达，有含有修饰开放读框(ORFm)的序列的构建载体。这个构建体编码大小明显较小的多蛋白(与HAV的原始多蛋白相比)。这个序列是P1-2A多肽编码序列和编码突变蛋白酶3ABC的序列融合的结果。
用于依靠根癌土壤杆菌转化植物的质粒载体含有与编码它们在植物中表达的调节信号的核苷酸序列融合的编码HAV蛋白的DNA序列。在这种情况下，编码该蛋白的序列不与输送穿过植物细胞分泌途径的任何特殊信号融合，因此它在细胞的胞质中表达。
在植物细胞的胞质中专门表达五聚体的重组HAV
自我加工并专门形成免疫原性的病毒五聚体。五聚体相对于衣壳更小的大小允许完成高水平的表达，因为它激起较小的表达，如前所述，作为多肽VP0一部分的蛋白VP4是五聚体结合和病毒衣壳形成所需的。
从编码多蛋白ORFm的核苷酸序列，消除编码蛋白VP4的片段，产生ΔORFm序列。构建表达与调节它们在植物细胞的胞质中表达的序列融合的多蛋白ΔORFm的质粒载体。它通过用根癌土壤杆菌感染烟草叶子、稻和胡萝卜用来获得转基因植物。由这个基因构建体表达的多蛋白具有明显较小的大小并且它能够代谢在植物细胞中的电荷。获得的产物同样如同免疫原可以用于疫苗的开发。
在植物细胞的内质网中表达衣壳和五聚体的重组HAV
植物内质网中的异源蛋白的蓄积是通过使用序列驱动它们至分泌途径，并因此至内质网和使用这个细胞器中的保留信号而完成的。
作为信号肽，使用编码甘薯sporamin的N末端肽的序列。作为内质网中蛋白保留信号，使用编码位于该蛋白羧基末端的肽KDEL的序列。
甘薯sporamin信号肽与P1-2A核苷酸编码序列的5′区融合和与KDEL编码序列融合的间隔肽序列插入3′区。所产生的DNA片段在二元载体中位于植物表达信号调节下。这个载体包括在其5′末端与甘薯信号肽融合和在其3′末端与KDEL编码序列融合的突变多肽3ABC编码序列。所有这些元件也在植物表达信号调节下。两个多肽都位于内质网中，蛋白酶3ABC能够加工多肽P1-2A并完成有效颗粒形成。在植物细胞的内质网中专门表达五聚体的重组HAV
通过从P1-2A多肽编码序列除去VP4核苷酸编码序列获得多肽ΔP1-2A。这个序列在其5′末端与甘薯sporamin信号肽和在其3′末端与编码连接KDEL编码序列的间隔肽的序列融合。在相同二元载体中，编码突变多肽3ABC的序列同样在其5′末端与甘薯sporamin信号肽和在其3′末端与KDEL编码序列融合。所有元件在植物中表达的调节迹象下。
两个多肽都位于内质网中，蛋白酶3ABC能够加工多肽ΔP1-2A并完成仅五聚体的表达。这些植物显示出高水平表达以及更好的生长和发育，这注定获得更多生物质。
表达修饰的HAV的基因产物的转基因植物的鉴定
用每个二元载体转化根癌土壤杆菌并获得含有这些质粒的菌落。独立携带不同基因构建体的根癌土壤杆菌用于植物转化并最终获得对作为选择标记的卡那霉素具有抗性的植物。使用Southern印迹和PCR技术证实植物中外来DNA的整合。
从转基因植物的叶子，进行可溶蛋白的提取，用液氮在特殊的蛋白质提取缓冲液中研磨它们。使用HAV的特异性抗血清和中和单克隆抗体鉴定衣壳和五聚体。进行免疫方法如Western印迹、ELISA或免疫显微检查，它们证明转基因植物表达多蛋白或有时候表达预期多肽，以及它们被加工和装配成五聚体或衣壳。
植物高水平表达的重组蛋白被用于使用中和单克隆抗体的衣壳和五聚体纯化。
纯化的衣壳和五聚体的免疫原性测定
通过用来自烟草植物叶子和稻的纯化产品免疫的小鼠的免疫应答测定HAV衣壳和五聚体的免疫效力。也评价喂给表达HAV抗原的转基因胡萝卜的小鼠中的效力。口服途径和肠胃外方法用作导入抗原的方法。使用Elisa技术确定动物抗血清对HAV的反应性和免疫血清中和体外HAV感染的中和能力，来控制和证实免疫应答。
发明优点
我们的发明提供的最重要的优点是：作为我们的构建体的表达产物的被膜和纯化五聚体和原始病毒的抗原相似性；作为我们要求保护的构建体产物的被膜和五聚体在植物中的表达水平比HAV开放读框表达或P1-2A区和P 3区共同表达时获得的表达水平高，因为获得的作为我们的构建体表达产物的多蛋白具有比原始病毒大小明显降低的大小；多肽3ABC仅仅由蛋白3A、3B和3C组成并且在蛋白3A/3B和3B/3C之间具有突变的自我加工位点，它避免了多肽加工，因此设想由多肽本身进行的多蛋白的蛋白水解作用具有更高效率；五聚体和HAV病毒被膜在植物细胞内质网中的表达水平比在细胞质高；在植物细胞中仅表达五聚体更有效并允许最好的植物生长和发育，由于这些颗粒的大小降低；来自植物的药物蛋白的扩大和制备适于产生大量抗原；与当前使用的和在本领域现有技术中描述的其它系统相比生产成本降低；在植物中表达HAV抗原降低了影响人的病原体的污染风险；经口抗HAV的免疫显著有助于降低免疫成本，由于使用植物，无需纯化产物的可能性。
微生物保藏
质粒pBVHARE、pBΔVHARE、pBMLAm和pBΔMLAm按照布达佩斯微生物保藏条约被保藏在比利时微生物保藏中心BCCM，LMBP保藏具有在2003年5月19日保藏的LMBP 4721、LMBP 4722、LMBP 4723和LMBP4724的保藏号。
附图简述
图1.在植物细胞质中表达被膜和五聚体的基因构建体。A)M2菌种的HAV的ORF图解。B)编码结构蛋白(P1-2A)的序列的图解。C)编码3ABC区序列的图解。D)HAV的ORFm的图解。E)在用于植物表达的二元载体中克隆的目的插入物的图解。
图2.在植物细胞的胞质中表达五聚体的基因构建体。A)无编码VP4序列的ΔORFm的图解。B)在用于ΔORFm植物表达的二元载体中克隆的目的插入物的图解。
图3.在植物细胞内质网中表达被膜和五聚体的基因构建体。A)与KDEL序列融合的P1-2A序列的图解。B)在用于在内质网中表达的二元载体中克隆的目的插入物的图解。E-间隔，K-KDEL
图4.在植物细胞内质网中表达五聚体的基因构建体。A)无与KDEL序列融合的VP4序列的P1-2A序列的图解。B)在用于植物表达的二元载体中克隆的目的插入物的图解。E-间隔，K-KDEL
图5.来自转基因植物的基因组DNA的Southern印迹。
图6.来自胡萝卜和稻转基因植物的PCR产物的Southern印迹。
图7.来自用于在细胞质中表达被膜和五聚体的基因构建体转化的转基因烟草、胡萝卜和稻的植物蛋白的Western印迹。
图8.对用于在细胞质中表达HAV被膜和五聚体的基因构建体转化的烟草、胡萝卜和稻植物进行的酶联免疫试验(ELISA)。
图9.用构建体pBMLAm转化的一烟草植株的电子免疫显微镜检查。A)未转化的植物。B)转化的植物。C)转化的植物。
图10.通过腹膜内方法用HAV免疫的小鼠的血清的抑制ELISA。
图11.用从稻和烟草植物纯化的HAV五聚体口服免疫的小鼠的血清的抑制ELISA。
图12.通过用从表达HAV五聚体的植物中收集的胡萝卜喂养小鼠而口服免疫它们的血清的抑制ELISA。
实施例.
实施例1.古巴菌种M2的HAV的ORF的克隆。
图1(A)显示了质粒pMLAl的目的序列。从在古巴分离和表征的HAV菌种M2，纯化RNA并使用用于HAV的其它以前报道序列的特异性寡核苷酸(SEQ ID NO1和2)，通过反转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)扩增6.7kb的DNA片段。该条带克隆到预先用Sma I核酸内切酶消化的载体BlueScript(KS+)中。所得质粒命名为pMLA1并用于古巴M2菌种的HAV的ORF的序列测定。DNA序列(SEQ ID NO3)相对于报道过的那些表现出改变。它具有产生11个不同氨基酸的改变。这些序列的分析允许将菌种M2分至亚基因型IA内，几乎所有的美国菌种都属于这类。该序列证实了古巴菌种M2确实是不同于以前报道的HAV菌种。
实施例2.在植物细胞的胞质中表达衣壳和五聚体的基因构建体。
图1(B)显示了质粒pP1-2A的目的序列。这个质粒是通过PCR扩增编码结构蛋白(P1-2A)的序列获得的，使用分别与编码蛋白VP4的5’区序列和来自质粒pMLA1的编码蛋白2A的3’区序列互补的特异性寡核苷酸(SEQ ID NO4)。2.5kb的扩增条带(SEQ ID NO6)克隆入SmaI消化的载体BlueScript(KS+)。
为获得图1(C)所示的目的序列的质粒p3ABC，通过PCR扩增编码蛋白3A的0.2kb区，使用与这个基因的5’和3’区互补的寡核苷酸(SEQID NO7和8)。它克隆入BamHI/EcoRV消化的载体Blue Script(KS+)。然后，在同一载体中，但在EcoRV/XbaI位点当中区域，克隆编码蛋白3B的合成核苷酸序列(SEQ ID NO9和10)。获得的质粒称作p3AB。另一方面，从质粒pMLA1，使用寡核苷酸SEQ ID NO11和12，通过PCR扩增编码蛋白3C的0.65kb序列。这个条带克隆到载体P3AB的XbaI/HindIII位点当中。所得序列称作3ABC(SEQ ID NO13)。
它编码具有蛋白水解活性，但是没有自我加工可能性的多蛋白，因为分别通过C置换T和C置换G的核苷酸置换，蛋白3A/B和3B/C之间的切割位点被突变。
图1(D)显示了质粒pMLAm的目的序列。为获得它，EcoRI和ClaI消化质粒pP1-2A。EcoRI/ClaI消化提取编码突变多肽3ABC的1kb条带并克隆到预先消化的pP1-2A的适当位点。质粒pMLAm含有编码与原始多蛋白相比重量明显较轻的HAV多蛋白的修饰序列(SEQ ID NO14)。
质粒pKMLAm是通过SmaI/ClaI消化的3.4kb ORFm条带克隆到载体pKTPL-2获得的。这个载体含有2X启动子的35SCaMV启动子的序列、TEV的前导序列和35S CaMV的终止子。为克隆ORFm条带，NcoI消化质粒pKTPL-2，随后用Klenow片段消平DNA PolI和最后ClaI消化。
图1(F)显示了二元质粒pBMLAm的目的序列。这个质粒是通过质粒pKMLAm的SphI消化和用绿豆核酸酶顺序处理，产生4.7kb条带克隆到SmaI预先消化的二元载体pBin19而获得的。
所得质粒pBMLAm含有：用作赋予卡那霉素抗性的选择标记的新霉素磷酸转移酶II基因(NPTII)；通过2X 35S CaMV启动子和TEV引导子(leader)以及CaMV的终止子调节的编码修饰的HAV多蛋白的ORFm基因。它也具有T-DNA边缘序列以促进其转移至植物基因组。
实施例3.在植物细胞的胞质中表达五聚体的基因构建体。
图2(A)显示了质粒pΔMLAm的目的序列。为消除蛋白VP4和获得这个质粒，用酶SmaI/PstI切割从质粒pMLAm切除114bp片段并用恢复编码蛋白VP2的基因起始处的合成核苷酸序列(SEQ ID NO15和16)取代它。ΔORFm区的序列相应于SEQ ID NO17。SmaI/ClaI消化的条带ΔORFm(3.46kb)克隆到NcoI/Klenow/ClaI预先消化的质粒pKTPL-2获得质粒pKΔMLAm。
图2(B)显示了二元质粒pBΔMLAm的目的序列，该二元质粒是通过酶SmaI消化Bin19和然后克隆酶SphI消化和用绿豆核酸酶处理质粒pKMLAm产生的4.6kb DNA片段获得的。
所得质粒pBΔMLAm含有：用作赋予卡那霉素抗性的选择性标记的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因；通过序列2X 35S CaMV作为启动子和TEV引导子(leader)以及35S CaMV的终止子调节的编码修饰的HAV多蛋白的ORFm基因。它还含有待转移到植物基因组的左右边缘序列。
实施例4.在植物细胞内质网中表达衣壳和五聚体的基因构建体。
图3B显示了质粒pBVHARE的目的序列。为获得这个质粒，编码KDEL保留信号(retention signal)的合成片段(SEQ ID NO18和19)克隆到载体BS(+)的EcoRV/ClaI位点。另一方面，在质粒pP1-2A的StyI/EcoRI位点中，克隆修饰了蛋白2A的3’末端和在该区域消除了蛋白酶切割位点，以及引入当作该基因和编码KDEL信号联合之间的间隔棒的序列的合成片段(SEQ ID NO20和21)。随后用酶SmaI/EcoRV提取这个序列(2.5kb)并克隆到载体BS-KDEL，产生质粒pP1-2ARE(图3A，SEQ ID NO22)。质粒p3ABCRE是通过酶XhoI/Klenow/EcoRI消化p3ABC质粒并将3ABC序列克隆到EcoRI/EcoRV位点获得的(图3A，SEQ ID NO23)。
为提供目的基因的植物表达调节信号，用酶SmaI/ClaI从质粒pP1-2ARE提取的结构区P1-2A-KDEL(2.5kb)克隆到NcoI/Klenow/ClaI消化的质粒pKTPL-2。所得质粒称做pKP1-2ARE。用酶NcoI/ClaI从质粒p3ABCRE提取1kb区3ABC-KDEL并克隆到相同酶消化的质粒pKTPL-2。产生的质粒是pK3ABCRE。
最后，为完成用于通过根癌土壤杆菌转化植物的质粒，用酶SalI从质粒pK3ABCRE提取的2kb序列克隆到相同酶预先消化的二元载体pBin19。产生的质粒称作pB3ABCRE。随后，在同一载体的SphI位点中克隆SphI消化从质粒pKP1-2ARE提取的相当于序列P1-2A-KDEL的表达盒。产生的质粒pBVHARE携带分开的结构区和与位于植物表达调节信号下的内质网中的保留信号融合的具有蛋白酶作用的区域，和作为选择性标记的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因。实施例5.在植物细胞内质网中表达五聚体的基因构建体。
图4(B)显示了质粒pBΔVHARE的目的序列。这个质粒是通过用酶SmaI/Pst切割质粒pP1-2ARE并用恢复编码蛋白VP2的基因起始处的合成核苷酸序列(SEQ ID NO15和16)取代它获得的。用酶SmaI/ClaI消化所得质粒pΔP1-2ARE(图4A，SEQ ID NO24)，2.4kb的条带克隆到NcoI/Klenow/ClaI消化的载体pKTPL-2，产生质粒pKΔP1-2ARE。用SphI酶消化的表达盒克隆到质粒pB3ABCRE(含有3ABC-KDEL的二元质粒)。
所得二元质粒含有：结构区，无编码蛋白VP4的序列，与KDEL肽融合，在植物表达信号下；在相同信号下的3ABC-KDEL区和作为选择性标记的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因。实施例6.烟草转基因植物中HAV衣壳和五聚体的获得。
遵循Zambryski等，(1983)的方法进行烟草植物的基因转化。
用二元质粒(PBΔVHARE，PBVHARE，PBΔMLAm，PBMLAm)通过液氮方法(Hofgen和Willmitzer，1988)转化根癌土壤杆菌菌种At2260(Deblaere等1985)。用重组土壤杆菌转化体外培养的Petit HavanaMR1种的烟草植物的叶盘。卡那霉素(100mg/L)用作选择性标记。
实施几个程序如Southern印迹、Western印迹、ELISA和免疫显微镜检查法检测烟草植物基因组中目的基因的存在和它们的表达，以及病毒被膜或五聚体的形成。
实施例7.转基因胡萝卜植物(Daucus carota L.)中HAV衣壳和五聚体的获得。
对于使用的这个植物的转化，二元质粒(PBΔVHARE、PBVHARE、PBΔMLAm、PBMLAm)转化的根癌土壤杆菌菌种At2260用于植物转化。NEW KURODA种的发芽三周龄胚轴切成1cm小段并植入BAN-9培养基(Murashige和Skoog，1962(MS)，补充0.5mg/L NAA)三天。随后它们与含有前述的任一构建体的At悬浮液培养30分钟。再次，外植体转移到BAN-9培养基72小时。此时期后，它们植入补充卡那霉素(100mg/l)的再生培养基。3周后出现发芽，并且它们各不相同并植入也补充100mg/L卡那霉素的MS培养基。通过PCR产物的Southern印迹证实基因整合(图6)。通过ELISA(图8)和Western印迹(图7)证明多蛋白表达、它的加工和病毒衣壳和五聚体的形成。
实施例8.转基因稻植物(Oryza sativa L.)中HAV衣壳和五聚体的获得。
遵循Hiei等，(1994)使用的方法进行稻植物的基因转化。使用液氮方法，用开发的二元质粒(pBΔVHARE、pBVHARE、pBΔMLAm、pBMLAm)转化根癌土壤杆菌菌株At2260。用重组根癌土壤杆菌转化从稻escutelo获得的愈伤组织。卡那霉素(100mg/L)用作选择性标记。
为证实植物稻基因组中目的基因的存在和它们的表达，以及病毒衣壳或五聚体的形成，实施不同的步骤，在下面描述。
实施例9.转基因植物的分子特征和免疫化学。
通过Southern印迹分析。
使用Dellaporta等(1983)描述的方法获得来自烟草、胡萝卜和稻植物的用于Southern印迹目的的染色体DNA。作为样品，使用以前描述的构建体转化的显示出对选择性标记的抗性的植物叶子。未转化植物的叶子用作阴性对照。
通过标准程序进行总DNA消化、琼脂糖凝胶电泳、转入Hybond N膜和杂交(Sambrook等，1989)。通过引物-a-基因标记系统(PromegaCorp.，the USA)32P标记包括编码VP1蛋白VP1基因的1.2kb DNA片段并用作放射性探针。相同片段用作阳性对照。
图5显示了用构建体PBΔMLAm和PBMLAm转化的转基因烟草植物在细胞质中表达HAV衣壳和五聚体的Southern印迹。用SmaI和ClaI消化DNA，产生了3.4kb的条带。用SmaI I-EcoRI消化构建体PBΔVHARE和PBVHARE转化的待在内质网中表达的转基因植物的总DNA，产生2.4kb的条带。图5显示的结果证明植物的基因组中含有编码结构蛋白的序列。
在转基因胡萝卜和稻植物中，都用对应于序列SEQ ID NO4和5的寡核苷酸进行PCR扩增产物的Southern印迹。如图6所示，编码蛋白VP1的放射性标记序列与2.5kb条带的对应于期望大小的编码结构蛋白的序列互补。
通过Western印迹分析。
图7显示了Western印迹结果。根据Towbin等，(1979)描述的方法进行免疫检测重组分子的Western印迹试验。Western印迹样品由从转基因烟草、胡萝卜和稻植物提取的总可溶蛋白组成，用该构建体转化仅仅表达五聚体：克隆烟草5、胡萝卜7和稻3，构建体pBΔVHARE转化在内质网中表达五聚体；和克隆烟草25和胡萝卜10、用构建体pBΔMLAm转化，其允许在细胞质中表达五聚体。作为阴性对照，使用从未转化烟草叶子提取的蛋白。作为阳性对照，在大肠杆菌中表达的VP1蛋白。用液氮研磨叶子直至获得很细小的粉末。如Schouten等，(1997)报道，每克叶子添力1mL蛋白质提取缓冲液[Tris-HCl 61mM pH6.8、Triton 0.1％、甘油12.5％和苯甲基磺酰氟(PMSF)1mM]。以13000rpm离心除去不可溶物质。
SDS-PAGE的总蛋白转移到硝酸纤维膜并使用与碱性磷酸酶(PhoA)缀合的抗VP1多克隆抗体鉴定目的蛋白。通过比色反应进行酶检测。
图7中，能观察到所有培养中相同大小VP1蛋白的蛋白条带，以及由多蛋白不完全加工引起的其它中间产物。
酶联免疫试验(ELISA)。
图8显示了ELISA结果。进行“夹心”试验。用含10mg/mL单克隆抗体7E7的碳酸盐缓冲液(Na2CO30.015M，NaHCO3 0.028M，pH9.6)在37℃包被板(Maxisorp，Nunc)4小时。在37℃，用含5％乳的PBS(NaCl 100mM，Na2PO480mM，NaH2PO420mM，pH7.4)进行封闭2小时。随后添加对应于转化和未转化烟草、胡萝卜和稻植物(以与Western印迹所述方法相同的方法制备)的100μL样品。板在4℃孵育过夜。用PBS洗涤后，添加以1/1000稀释的与碱性磷酸酶缀合的100μL单克隆抗体7E7(1mg/mL于含有0.5％乳的PBS中)。板在37℃孵育1小时。通过添加0.1％二乙醇胺中制备的4-硝基苯磷酸酯(nitrofenilfosfatoe)(该酶的底物)显色反应。60分钟时间后，颜色出现。在分光光度计中405nm的波长下读取吸光度。ELISA每个阶段中的板的洗涤是用含有0.1％吐温20的PBS进行三次洗涤。
电子免疫显微镜检查的分析。
图9显示了免疫显微镜检查结果。来自组织培养的用质粒pBMLAm转化的烟草和未转化植物样品固定于4％甲醛溶液和随后在0.2％戊二醛中。它们在乙醇中脱水，然后在Lowicryl K 4M(Chemische Werke Lowi，Waldkraiburg)溶液中温育。超薄切片置于镍架并与单克隆抗体7E7孵育。这步之后，有用15nm金胶体颗粒(British Bio-Cell International)标记的抗小鼠IgG多克隆抗体的温育期。在Uranilacetate中处理5分钟，随后在柠檬酸铅中7分钟，使免疫标记切片形成反差，然后用发射电子显微镜(Jeol-Jem2000EX，Japan)检查。结果表明大约27nm直径的颗粒仅仅在用构建体pBMLAm转化的烟草植物中，通过在细胞质中表达蛋白。
实施例10.从转基因烟草和稻植物纯化衣壳和五聚体。
对于衣壳和五聚体的纯化，使用在CIGB实验室获得的仅仅识别颗粒和免疫原性五聚体的抗HAV单克隆抗体。
使用对于Western印迹分析所描述的方案提取植物细胞蛋白。来自离心的上清产物溶于0.5M氯化钠中并与载有抗体的亲合凝胶(Bio-rad Laboratories、Richmond、CA)混合。混合物在4℃温育16小时。用10倍体积PBS(NaCl 100mM、NaXPO480mM、NaH2PO420mM、pH7.4)洗涤凝胶并随后用甘氨酸0.2M pH2.5洗脱目的蛋白。用碱性的Tris中和洗脱物并对着PBS透析。通过ELISA检测这些叶子提取物中HAV颗粒和五聚体的存在，使用特异性识别HAV病毒衣壳和五聚体的7E 7商品化的单克隆抗体(Mediagnost)。
实施例11.通过腹膜内施用从转基因植物纯化的衣壳和五聚体的免疫原性的测定。
用两剂750EL.U从转基因烟草和稻植物中纯化的衣壳和五聚体免疫14周龄White ICR小鼠。以同样的方法，用商品化HAV抗原(Mediagnost)接种一组小鼠并用作阳性对照。用PBS接种另一组并用作阴性对照。接种后0、15、30、50和70天收集血液样品。
通过抑制ELISA测定抗体水平：5μg单克隆抗体7E7包被板，接着孵育4小时。随后它用PBS-0.1％Tween洗涤一次。添加含5％乳的PBS-0.1％Tween进行封闭并在37℃孵育2小时。该板用PBS-0.1％Tween洗涤3次。添加与HAV抗原(Mediagnoct)在37℃预先孵育20分钟的来自免疫小鼠的血清。该板在16℃孵育12小时并用PBS-0.1％Tween洗涤5次。最后，添加以1/1000以含有0.5％乳的PBS稀释的100μL与碱性磷酸酶缀合的单克隆抗体7E7。在37℃孵育1小时。通过添加在二乙醇胺中制备的4-硝基苯磷酸酯(4-nitropheniphosphate)(酶底物)进行显色反应。60分钟时间后，显色出现。在分光光度计中405nm的波长下读取吸光度。在图10中显示了用从转基因植物纯化的抗原接种的小鼠血清的平均抑制水平，从用烟草和稻植物产生的五聚体免疫的小鼠的血液中检测到。以同样的方法，在允许衣壳和五聚体表达的构建体转化的烟草和稻植物中产生的抗原免疫的小鼠中观察到类似水平的抗体。
实施例12.通过口服施用从转基因植物纯化的衣壳和五聚体的免疫原性的测定。
通过两个途径进行口服施用抗原：使用纯化抗原和用表达该抗原的胡萝卜喂养动物。
对于通过口服方法施用的纯化衣壳和五聚体的抗原性测定，给8周龄Balb/c小鼠以7500EL.U的四剂施用五聚体和衣壳。接种后0、15、30、50和70天收集200μL血液，通过ELISA抑制检测抗HAV抗体的存在。
通过先前实施例11中描述的步骤进行ELISA抑制。
根据图11所示结果，口服施用转基因植物中表达的HAV五聚体产生了免疫应答，通过实验中所用小鼠的血清的平均抑制而证明。口服施用的小鼠血清的平均抑制与腹膜内施用后获得的血清相比较低。通过植物口服施用五聚体是用5g胡萝卜(用特别为仅仅产生五聚体而设计的构建体pBΔMLAm转化)，4周期间每周一次。用未转化胡萝卜喂养的小鼠血清用作阴性对照。通过图12所示的ELISA抑制证明了这些植物引起免疫应答的能力。
                       序列表
<110>CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY
<120>植物细胞中获得的重组甲型肝炎病毒抗原.
<130>ORF.
<140>
<141>
<160>24
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>25
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(25)
<223>序列#1.
     用于通过RT-PCR扩增ORF编码序列的寡核苷酸序列#1.
<400>1
cttaatctag aatgaatatg tccaa                                            25
<210>2
<211>22
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(22)
<223>序列#2.
     用于通过RT-PCR扩增ORF编码序列的寡核苷酸序列#2.
<400>2
gaaagaaata aaggtacctc ag                                               22
<210>3
<211>6685
<212>ADN
<213>甲型肝炎病毒
<220>
<221>基因
<222>互补((1)..(6685))
<223>序列#3.
     编码Cuban M2菌株的HAV开放阅读框架(ORF)的核苷酸序列.
<400>3
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tatgaagtaa attatggcaa gaaaaaggat gttcttaata ttctcaaaga taaccagcaa   3420
aaaatagaaa aagccattga agaagcagac aatttttgca ttttgcaaat tcaagatgtg   3480
gagaaatttg atcagtatca gaaaggggtt gatttaatac aaaagctgag aactgtccat   3540
tcaatggctc aagttgaccc cagtttgggg gttcatttgt cacctctcag agattgcata   3600
gcaagagtcc atcaaaagct caagaatctt ggatctataa atcaggccat ggtaacaaga   3660
tgtgagccag ttgtttgcta tttgtatggc aaaagagggg gagggaaaag cttgacttca   3720
attgcattgg caaccaaaat ttgtaaacac tatggtgttg aacctgagaa aaatatttac   3780
accaaacctg tggcctcaga ttattgggat ggatatagtg gacaattagt ttgtattatt   3840
gatgatatcg gccaaaacac aacagatgaa gattggtcag atttttgtca attagtgtca   3900
ggatgcccaa tgagattgaa tatggcttct cttgaggaga agggcagaca tttttcctct   3960
ccttttataa tagcatcttc aaattggtca aatccaagtc caaaaacagt ttatgttaaa   4020
gaagcaattg atcgtaggct tcattttaag gttgaagtta aacctgcttc attttttaaa   4080
aatcctcaca atgatatgtt aaatgttaat ttggctaaaa caaatgatgc aattaaagac   4140
atgtcttgtg ttgatttgat aatggatgga cacaatattt cattgatgga tttacttagt   4200
tccttagtga tgacaggtga aattaggaaa cagaatatga gtgaattcat ggagttgtgg   4260
tctcagggaa tttcagatga tgacaatgat agtgcagtag ctgagttttt ccggtctttt   4320
ccatctggtg aaccatcaaa ttccaagtta tctagttttt tccaagctgt cactaatcac   4380
aagtgggttg ctgtgggagc tgcagttggt attcttggat tgctagtggg aggatggttt   4440
gtgtataagc atttttcccg caaagaggaa gaaccaattc cagctgaagg ggtttatcat   4500
ggagtgacta agcccaaaca agtgattaaa ttggatgcag atccagtaga gtctcagtca   4560
actctagaaa tagcaggatt agttaggaaa aatttggttc agtttggagt tggtgagaaa   4620
aatggatgtg tgagatgggt catgaatgcc ttaggagtga aggatgattg gttgttagta   4680
ccttctcatg cttataaatt tgaaaaggat tatgaaatga tggagtttta tttcaataga   4740
ggtggaactt actattcaat ttcagctggt aatgttgtta ttcaatcttt agatgtggga   4800
ttccaagatg ttgttctaat gaaggttcct acaattccca agtttagaga tattactcaa   4860
cattttatta agaaaggaga tgtgcctaga gccttgaatc gcttggcaac attagtgaca   4920
accgttaatg gaactcctat gttaatttct gagggacctt taaaaatgga agaaaaagcc   4980
acttatgttc ataagaagaa tgatggtact acggttgatt tgactgtaga tcaggcatgg   5040
agaggaaaag gtgaaggtc  tcctggaatg tgtggtgggg ccctagtgtc atcaaatcag   5100
tccatacaaa atgcaatttt gggtattcat gttgctggag gaaattcaat tcttgtggca   5160
aagttgatta ctcaagaaat gtttcaaaac attgataaga aaattgaaag tcagagaata   5220
atgaaagtgg aatttactca atgttcaatg aatgtagtct ccaaaacgct ttttagaaag   5280
agtcccattc atcaccacat tgataaaacc atgattaatt ttcctgcagc tatgcctttc   5340
tctaaagctg aaattgatcc aatggctatg atgttgtcta aatattcatt acctattgtg   5400
gaagaaccag aggattacaa agaagcttca gttttttatc aaaataaaat agtaggcaag   5460
actcagctag ttgatgactt tctagatctt gatatggcca ttacaggggc tccaggcatt   5520
gatgctatta atatggattc atctcctggg tttccttatg ttcaagaaaa attgactaaa   5580
agagatttga tttggttgga tgaaaatggt ttactgttag gagttcaccc aagattggcc   5640
cagagaatct tatttaatac tgtcatgatg gaaaattgtt ctgacttaga tgttgttttt   5700
acaacttgtc caaaagatga attgagacca ttagagaaag ttttggaatc aaaaacaaga   5760
gctattgatg cttgcccttt ggattataca attttatgtc gaatgtattg gggtccagct   5820
attagttatt ttcatttgaa tccagggttt cacacaggtg ttgctattgg catagatcct   5880
gatagacagt gggatgaatt atttaaaaca atgataagat ttggagatgt tggtcttgat   5940
ttagattttt ctgcttttga tgccagtctt agtccattta tgattaggga agcaggtaga   6000
atcatgagtg aattatctgg aacaccatct cattttggaa cagctcttat caatactatc   6060
atttattcta aacatctgct gtacaattgt tgttatcacg tctgtggttc aatgccttct   6120
gggtctcctt gtacagcttt gttgaattca attattaata atattaattt gtattatgtg   6180
ttttctaaaa tatttggaaa gtctccagtt ttcttttgtc aagctttgag gatcctttgt   6240
tatggagatg atgttttgat agttttttcc agagatgttc aaattgataa tcttgacttg   6300
attggacaga aaattgtgga tgagttcaaa aaacttggca tgacagccac ttcagctgac   6360
aaaaatgtgc ctcaactgaa gccagtttca gaattgactt ttcttaaaag atcttttaat   6420
ttggtggagg acagaatcag acctgcaatt tcagaaaaga caatttggtc tttgatagct   6480
tggcagagaa gtaacgctga gtttgagcag aatttagaaa atgctcagtg gtttgctttc   6540
atgcatggct atgagttcta tcagaaattc tattattttg ttcagtcctg tttggagaaa   6600
gagatgatag aatatagact taaatcttat gattggtgga gaatgagatt ttatgaccag   6660
tgtttcattt gtgacctttc atgat                                         6685
<210>4
<211>40
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(40)
<223>序列#4.
     用于通过PCR扩增P1-2A编码序列的寡核苷酸序列#5。
<400>4
ttgaattcag cttgtgaaaa taaccccttc attttcctag                            40
<210>5
<211>28
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(28)
<223>序列#5.
     用于通过PCR扩增P1-2A编码序列的寡核苷酸序列#5。
<400>5
cgcccgggtc tagaatgaat atgtccaa                                         28
<210>6
<211>2523
<212>ADN
<213>甲型肝炎病毒
<220>
<221>基因
<222>互补((1)..(2523))
<223>序列#6.
     编码M2菌株的结构性P1-2A HAV蛋白的核苷酸序列。
<400>6
atgaatatgt ccaaacaagg aattttccag actgttggga gtggccttga ccacatcctg   60
tccttggcag atattgagga agagcaaatg attcagtccg ttgataggac tgcagtgact   120
ggagcttctt atttcacttc tgtggaccaa tcttcagttc atactgctga ggttggctca   180
caccaaattg aacctttgaa aacctctgtt gataaacctg gttctaagaa aactcagggg   240
gagaagtttt tcttgattca ttctgctgat tggctcacta cacatgctct ctttcatgaa   300
gttgcaaaat tggatgtggt gaaactgctg tacaatgagc agtttgccgt ccaaggtttg   360
ttgagatacc atacttatgc aagatttggc attgagattc aagttcagat aaatcccaca   420
ccctttcagc aaggaggact aatctgtgcc atggttcctg gtgaccaaag ttatggttca   480
atagcatcct tgactgttta tcctcatggt ctgttaaatt gcaatatcaa caatgtagtt   540
agaataaagg ttccatttat ttatactaga ggtgcttatc attttaaaga tccacagtac   600
ccagtttggg aattgacaat cagagtttgg tcagagttga atattggaac aggaacctca   660
gcttatactt cactcaatgt tttagctagg tttacagatt tggagttgca tggattaact   720
cctctttcta cacagatgat gagaaatgaa tttagagtta gtactactga aaatgttgta   780
aatttgtcaa attatgaaga tgcaagggca aaaatgtctt ttgctttgga tcaggaagat   840
tggaagtctg atccttccca aggtggtgga attaaaatta ctcatttcac tacctggaca   900
tccattccaa ccttagctgc tcagtttcca ttcaatgctt cagattcagt tgggcaacaa   960
attaaagtta taccagtgga cccatacttt ttccagatga caaacactaa tcctgatcaa   1020
aaatgtataa cagccttggc ctctatttgt cagatgttct gcttttggag gggagatctt   1080
gttttcgatt tccaggtttt tccaaccaaa tatcattcag gtaggctgtt gttttgtttt   1140
gttcctggga atgagttaat agatgttact ggaattacat taaaacaggc aactactgct   1200
ccttgtgcag tgatggacat tacaggagtg cagtcaacct tgagatttcg tgttccttgg   1260
atttctgata caccctatcg agtgaatagg tacacgaagt cagcacatca aaaaggtgag   1320
tatactgcca ttgggaagct tattgtgtat tgttataata gattgacttc tccttctaat   1380
gttgcttctc atgttagagt taatgtttat ctttcagcaa ttaatttgga atgttttgct   1440
cctctttacc atgctatgga tgttaccaca caggttggag atgattcagg aggtttctca   1500
acaacagttt ctacagagca gaatgttcct gatccccaag ttggcataac aaccatgagg   1560
gatttaaaag ggaaagccaa taggggaaag atggatgtat caggagtgca ggtacctgtg   1620
ggagctatta caacaattga ggatccagtt ttagcaaaga aagtacctga gacatttcct   1680
gaattgaagc ctggagaatc cagacataca tcagatcaca tgtctattta taaattcatg   1740
ggaaggtctc atttcttgtg tacttttact tttaattcaa acaataaaga gtacacattt   1800
ccaataactc tgtcttcgac ttctaatcct cctcatggtt taccatcaac attaaggtgg   1860
ttctttaatt tgtttcagtt gtatagagga ccattggatt tgacaattat aatcacagga   1920
gccactgatg tggatggtat ggcctggttt actccagtgg gccttgctgt cgacacccct   1980
tgggtggaaa agaagtcagc tttgtctatt gattataaaa ctgcccttgg agctgttaga   2040
tttaatacaa gaagaacagg gaacattcag attagattgc catggtattc ttatttgtat   2100
gccgtgtctg gagcactgga tggcttggga gataagacag attctacatt tggattggtt   2160
tctattcaga ttgcaaatta caatcattct gatgaatatt tgtcctttag ttgttatttg   2220
tctgtcacag agcaatcaga gttctatttc cctagagctc cattaaattc aaatgctatg   2280
ttgtccactg agtccatgat gagtagaatt gcagctggag acttggagtc atcagtggat   2340
gatcccagat cagaggagga cagaagattt gagagtcata tagaatgtag gaaaccatat   2400
aaagaattga gactggaggt tgggaaacaa agaatcaaat atgctcagga agagttatca   2460
aatgaagtgc ttccacctcc taggaaaatg aaggggttat atgcttctgg aggtgaattc   2520
gat                                                                 2523
<210>7
<211>27
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(27)
<223>序列#7.
     用于通过PCR扩增3A编码序列的寡核苷酸序列#7。
<400>7
ccatgggaat ttcagatgat gacaatg                                          27
<210>8
<211>26
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(26)
<223>序列#8.
     用于通过PCR扩增3A编码序列的寡核苷酸序列#7。
<400>8
ggatatcggt tcttcctctt tgcggg                                           26
<210>9
<211>85
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>基因
<222>(1)..(85)
<223>序列#9.
     编码分别带有T被C以及G被C替换的3B蛋白的合成片段。
<400>9
tccagctgtt ggggtttatc atggagtgac taagcccaaa caagtgatta aattggatgc   60
agatccagta gagtctcagt tgact                                         85
<210>10
<211>89
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>基因
<222>(1)..(89)
<223>序列#10.
     编码分别带有T被C以及G被C替换的3B蛋白的合成片段(互补链)。
<400>10
ctagagtcaa ctgagactct actggatctg catccaattt aatcacttgt ttgggcttag    60
tcactccatg ataaacccca acagctgga                                      89
<210>11
<211>25
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(25)
<223>序列#11.
     用于通过PCR扩增3C编码序列的寡核苷酸序列#11。
<400>11
tctcagtcaa ctctagaaat agcag                                            25
<210>12
<211>21
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>引物_结合
<222>(1)..(21)
<223>序列#12.
     用于通过PCR扩增3C编码序列的寡核苷酸序列#12。
<400>12
ataagcttga tcaattttct t                                                21
<210>13
<211>978
<212>ADN
<213>甲型肝炎病毒
<220>
<221>基因
<222>互补((1)..(978))
<223>序列#13.
     相应于具有蛋白裂解活性的并且自我加工位点突变的3ABC聚蛋白区的序列。
<400>13
gaattcctgc agcccggggg atccatggga atttcagatg atgacaatga tagtgcagta   60
gctgagtttt tccggtcttt tccatctggt gaaccatcaa attccaagtt atctagtttt   120
ttccaagctg tcactaatca caagtgggtt gctgtgggag ctgcagttgg tattcttgga   180
ttgctagtgg gaggatggtt tgtgtataag catttttccc gcaaagagga agaaccaatt   240
ccagctgttg gggtttatca tggagtgact aagcccaaac aagtgattaa attggatgca   300
gatccagtag agtctcagtt gactctagaa atagcaggat tagttaggaa aaatttggtt   360
cagtttggag ttggtgagaa aaatggatgt gtgagatggg tcatgaatgc cttaggagtg   420
aaggatgatt ggttgttagt accttctcat gcttataaat ttgaaaagga ttatgaaatg   480
atggagtttt atttcaatag aggtggaact tactattcaa tttcagctgg taatgttgtt   540
attcaatctt tagatgtggg attccaagat gttgttctaa tgaaggttcc tacaattccc   600
aagtttagag atattactca acattttatt aagaaaggag atgtgcctag agccttgaat   660
cgcttggcaa cattagtgac aaccgttaat ggaactccta tgttaatttc tgagggacct   720
ttaaaaatgg aagaaaaagc cacttatgtt cataagaaga atgatggtac tacggttgat   780
ttgactgtag atcaggcatg gagaggaaaa ggtgaaggtc ttcctggaat gtgtggtggg   840
gccctagtgt catcaaatca gtccatacaa aatgcaattt tgggtattca tgttgctgga   900
ggaaattcaa ttcttgtggc aaagttgatt actcaagaaa tgtttcaaaa cattgataag   960
aaaattgaaa tcaagctt                                                   978
<210>14
<211>3489
<212>ADN
<213>甲型肝炎病毒
<220>
<221>基因
<222>互补((1)..(3489))
<223>序列#14.
     编码Cuban M2菌株的新的修饰的开放阅读框架(ORFm)的核苷酸序列。
<400>14
atgaatatgt ccaaacaagg aattttccag actgttggga gtggccttga ccacatcctg   60
tccttggcag atattgagga agagcaaatg attcagtccg ttgataggac tgcagtgact   120
ggagcttctt atttcacttc tgtggaccaa tcttcagttc atactgctga ggttggctca   180
caccaaattg aacctttgaa aacctctgtt gataaacctg gttctaagaa aactcagggg   240
gagaagtttt tcttgattca ttctgctgat tggctcacta cacatgctct ctttcatgaa   300
gttgcaaaat tggatgtggt gaaactgctg tacaatgagc agtttgccgt ccaaggtttg   360
ttgagatacc atacttatgc aagatttggc attgagattc aagttcagat aaatcccaca   420
ccctttcagc aaggaggact aatctgtgcc atggttcctg gtgaccaaag ttatggttca   480
atagcatcct tgactgttta tcctcatggt ctgttaaatt gcaatatcaa caatgtagtt   540
agaataaagg ttccatttat ttatactaga ggtgcttatc attttaaaga tccacagtac   600
ccagtttggg aattgacaat cagagtttgg tcagagttga atattggaac aggaacctca   660
gcttatactt cactcaatgt tttagctagg tttacagatt tggagttgca tggattaact   720
cctctttcta cacagatgat gagaaatgaa tttagagtta gtactactga aaatgttgta   780
aatttgtcaa attatgaaga tgcaagggca aaaatgtctt ttgctttgga tcaggaagat   840
tggaagtctg atccttccca aggtggtgga attaaaatta ctcatttcac tacctggaca   900
tccattccaa ccttagctgc tcagtttcca ttcaatgctt cagattcagt tgggcaacaa   960
attaaagtta taccagtgga cccatacttt ttccagatga caaacactaa tcctgatcaa   1020
aaatgtataa cagccttggc ctctatttgt cagatgttct gcttttggag gggagatctt   1080
gttttcgatt tccaggtttt tccaaccaaa tatcattcag gtaggctgtt gttttgtttt   1140
gttcctggga atgagttaat agatgttact ggaattacat taaaacaggc aactactgct   1200
ccttgtgcag tgatggacat tacaggagtg cagtcaacct tgagatttcg tgttccttgg   1260
atttctgata caccctatcg agtgaatagg tacacgaagt cagcacatca aaaaggtgag   1320
tatactgcca ttgggaagct tattgtgtat tgttataata gattgacttc tccttctaat   1380
gttgcttctc atgttagagt taatgtttat ctttcagcaa ttaatttgga atgttttgct   1440
cctctttacc atgctatgga tgttaccaca caggttggag atgattcagg aggtttctca   1500
acaacagttt ctacagagca gaatgttcct gatccccaag ttggcataac aaccatgagg   1560
gatttaaaag ggaaagccaa taggggaaag atggatgtat caggagtgca ggtacctgtg   1620
ggagctatta caacaattga ggatccagtt ttagcaaaga aagtacctga gacatttcct   1680
gaattgaagc ctggagaatc cagacataca tcagatcaca tgtctattta taaattcatg   1740
ggaaggtctc atttcttgtg tacttttact tttaattcaa acaataaaga gtacacattt   1800
ccaataactc tgtcttcgac ttctaatcct cctcatggtt taccatcaac attaaggtgg   1860
ttctttaatt tgtttcagtt gtatagagga ccattggatt tgacaattat aatcacagga   1920
gccactgatg tggatggtat ggcctggttt actccagtgg gccttgctgt cgacacccct   1980
tgggtggaaa agaagtcagc tttgtctatt gattataaaa ctgcccttgg agctgttaga   2040
tttaatacaa gaagaacagg gaacattcag attagattgc catggtattc ttatttgtat   2100
gccgtgtctg gagcactgga tggcttggga gataagacag attctacatt tggattggtt   2160
tctattcaga ttgcaaatta caatcattct gatgaatatt tgtcctttag ttgttatttg   2220
tctgtcacag agcaatcaga gttctatttc cctagagctc cattaaattc aaatgctatg   2280
ttgtccactg agtccatgat gagtagaatt gcagctggag acttggagtc atcagtggat   2340
gatcccagat cagaggagga cagaagattt gagagtcata tagaatgtag gaaaccatat   2400
aaagaattga gactggaggt tgggaaacaa agaatcaaat atgctcagga agagttatca   2460
aatgaagtgc ttccacctcc taggaaaatg aaggggttat tttcacaagc tgaattcctg   2520
cagcccgggg gatccatggg aatttcagat gatgacaatg atagtgcagt agctgagttt   2580
ttccggtctt ttccatctgg tgaaccatca aattccaagt tatctagttt tttccaagct   2640
gtcactaatc acaagtgggt tgctgtggga gctgcagttg gtattcttgg attgctagtg   2700
ggaggatggt ttgtgtataa gcatttttcc cgcaaagagg aagaaccaat tccagctgtt   2760
ggggtttatc atggagtgac taagcccaaa caagtgatta aattggatgc agatccagta   2820
gagtctcagt tgactctaga aatagcagga ttagttagga aaaatttggt tcagtttgga   2880
gttggtgaga aaaatggatg tgtgagatgg gtcatgaatg ccttaggagt gaaggatgat   2940
tggttgttag taccttctca tgcttataaa tttgaaaagg attatgaaat gatggagttt   3000
tatttcaata gaggtggaac ttactattca atttcagctg gtaatgttgt tattcaatct   3060
ttagatgtgg gattccaaga tgttgttcta atgaaggttc ctacaattcc caagtttaga   3120
gatattactc aacattttat taagaaagga gatgtgccta gagccttgaa tcgcttggca   3180
acattagtga caaccgttaa tggaactcct atgttaattt ctgagggacc tttaaaaatg   3240
gaagaaaaag ccacttatgt tcataagaag aatgatggta ctacggttga tttgactgta   3300
gatcaggcat ggagaggaaa aggtgaaggt cttcctggaa tgtgtggtgg ggccctagtg   3360
tcatcaaatc agtccataca aaatgcaatt ttgggtattc atgttgctgg aggaaattca   3420
attcttgtgg caaagttgat tactcaagaa atgtttcaaa acattgataa gaaaattgaa   3480
atcaagctt                                                           3489
<210>15
<211>51
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>基因
<222>(1)..(51)
<223>序列#15.
     恢复vp2蛋白的转录起点的合成片段。
<400>15
gggatggata ttgaggaaga gcaaatgatt cagtccgttg ataggactgc a               51
<210>16
<211>47
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>基因
<222>(1)..(47)
<223>序列#16.
     恢复vp2蛋白的转录起点的合成片段(互补链)。
<400>16
gtcctatcaa cggactgaat catttgctct tcctcaatat ccatccc                    47
<210>17
<211>3426
<212>ADN
<213>甲型肝炎病毒
<220>
<221>基因
<222>互补((1)..(3426))
<223>序列#17
HAV的Cuban M2菌株的修饰的开放阅读框架(ΔORFm)的编码序列。该序列不具有编码VP4蛋白的基因。
<400>17
gggatggata ttgaggaaga gcaaatgatt cagtccgttg ataggactgc agtgactgga   60
gcttcttatt tcacttctgt ggaccaatct tcagttcata ctgctgaggt tggctcacac   120
caaattgaac ctttgaaaac ctctgttgat aaacctggtt ctaagaaaac tcagggggag   180
aagtttttct tgattcattc tgctgattgg ctcactacac atgctctctt tcatgaagtt   240
gcaaaattgg atgtggtgaa actgctgtac aatgagcagt ttgccgtcca aggtttgttg   300
agataccata cttatgcaag atttggcatt gagattcaag ttcagataaa tcccacaccc   360
tttcagcaag gaggactaat ctgtgccatg gttcctggtg accaaagtta tggttcaata   420
gcatccttga ctgtttatcc tcatggtctg ttaaattgca atatcaacaa tgtagttaga   480
ataaaggttc catttattta tactagaggt gcttatcatt ttaaagatcc acagtaccca   540
gtttgggaat tgacaatcag agtttggtca gagttgaata ttggaacagg aacctcagct   600
tatacttcac tcaatgtttt agctaggttt acagatttgg agttgcatgg attaactcct   660
ctttctacac agatgatgag aaatgaattt agagttagta ctactgaaaa tgttgtaaat   720
ttgtcaaatt atgaagatgc aagggcaaaa atgtcttttg ctttggatca ggaagattgg   780
aagtctgatc cttcccaagg tggtggaatt aaaattactc atttcactac ctggacatcc   840
attccaacct tagctgctca gtttccattc aatgcttcag attcagttgg gcaacaaatt   900
aaagttatac cagtggaccc atactttttc cagatgacaa acactaatcc tgatcaaaaa   960
tgtataacag ccttggcctc tatttgtcag atgttctgct tttggagggg agatcttgtt   1020
ttcgatttcc aggtttttcc aaccaaatat cattcaggta ggctgttgtt ttgttttgtt   1080
cctgggaatg agttaataga tgttactgga attacattaa aacaggcaac tactgctcct   1140
tgtgcagtga tggacattac aggagtgcag tcaaccttga gatttcgtgt tccttggatt   1200
tctgatacac cctatcgagt gaataggtac acgaagtcag cacatcaaaa aggtgagtat   1260
actgccattg ggaagcttat tgtgtattgt tataatagat tgacttctcc ttctaatgtt   1320
gcttctcatg ttagagttaa tgtttatctt tcagcaatta atttggaatg ttttgctcct   1380
ctttaccatg ctatggatgt taccacacag gttggagatg attcaggagg tttctcaaca   1440
acagtttcta cagagcagaa tgttcctgat ccccaagttg gcataacaac catgagggat   1500
ttaaaaggga aagccaatag gggaaagatg gatgtatcag gagtgcaggt acctgtggga   1560
gctattacaa caattgagga tccagtttta gcaaagaaag tacctgagac atttcctgaa   1620
ttgaagcctg gagaatccag acatacatca gatcacatgt ctatttataa attcatggga   1680
aggtctcatt tcttgtgtac ttttactttt aattcaaaca ataaagagta cacatttcca   1740
ataactctgt cttcgacttc taatcctcct catggtttac catcaacatt aaggtggttc   1800
tttaatttgt ttcagttgta tagaggacca ttggatttga caattataat cacaggagcc   1860
actgatgtgg atggtatggc ctggtttact ccagtgggcc ttgctgtcga caccccttgg   1920
gtggaaaaga agtcagcttt gtctattgat tataaaactg cccttggagc tgttagattt   1980
aatacaagaa gaacagggaa cattcagatt agattgccat ggtattctta tttgtatgcc   2040
gtgtctggag cactggatgg cttgggagat aagacagatt ctacatttgg attggtttct   2100
attcagattg caaattacaa tcattctgat gaatatttgt cctttagttg ttatttgtct   2160
gtcacagagc aatcagagtt ctatttccct agagctccat taaattcaaa tgctatgttg   2220
tccactgagt ccatgatgag tagaattgca gctggagact tggagtcatc agtggatgat   2280
cccagatcag aggaggacag aagatttgag agtcatatag aatgtaggaa accatataaa   2340
gaattgagac tggaggttgg gaaacaaaga atcaaatatg ctcaggaaga gttatcaaat   2400
gaagtgcttc cacctcctag gaaaatgaag gggttatttt cacaagctga attcctgcag   2460
cccgggggat ccatgggaat ttcagatgat gacaatgata gtgcagtagc tgagtttttc   2520
cggtcttttc catctggtga accatcaaat tccaagttat ctagtttttt ccaagctgtc   2580
actaatcaca agtgggttgc tgtgggagct gcagttggta ttcttggatt gctagtggga   2640
ggatggtttg tgtataagca tttttcccgc aaagaggaag aaccaattcc agctgttggg   2700
gtttatcatg gagtgactaa gcccaaacaa gtgattaaat tggatgcaga tccagtagag   2760
tctcagttga ctctagaaat agcaggatta gttaggaaaa atttggttca gtttggagtt   2820
ggtgagaaaa atggatgtgt gagatgggtc atgaatgcct taggagtgaa ggatgattgg   2880
ttgttagtac cttctcatgc ttataaattt gaaaaggatt atgaaatgat ggagttttat   2940
ttcaatagag gtggaactta ctattcaatt tcagctggta atgttgttat tcaatcttta   3000
gatgtgggat tccaagatgt tgttctaatg aaggttccta caattcccaa gtttagagat   3060
attactcaac attttattaa gaaaggagat gtgcctagag ccttgaatcg cttggcaaca   3120
ttagtgacaa ccgttaatgg aactcctatg ttaatttctg agggaccttt aaaaatggaa   3180
gaaaaagcca cttatgttca taagaagaat gatggtacta cggttgattt gactgtagat   3240
caggcatgga gaggaaaagg tgaaggtctt cctggaatgt gtggtggggc cctagtgtca   3300
tcaaatcagt ccatacaaaa tgcaattttg ggtattcatg ttgctggagg aaattcaatt   3360
cttgtggcaa agttgattac tcaagaaatg tttcaaaaca ttgataagaa aattgaaatc   3420
aagctt                                                              3426
<210>18
<211>19
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(19)
<223>序列#18.
     相应于KDEL内质网保留信号序列的合成片段。
<400>18
atcaaggatg aattgtaat                                                   19
<210>19
<211>21
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(21)
<223>序列#19.
     相应于KDEL内质网保留信号序列的合成片段。
<400>19
cgattacaat tcatccttga t                                                21
<210>20
<211>55
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>D_片段
<222>(1)..(54)
<223>序列#20
     修饰2A蛋白质的3’端的合成片段，在其和KDEL信号间引入间隔物。
<400>20
cctaggaaaa tgaaggggtt atatgcttct ggaggtgaat tcgatatcaa ggatg           55
<210>21
<211>54
<212>ADN
<213>嵌合序列
<220>
<221>D_片段
<222>(1)..(54)
<223>序列#21.
     修饰2A蛋白质的3’端的合成片段，在其和KDEL信号间引入间隔物。
<400>21
aattcatcct tgatatcgaa ttcacctcca gaagcatata accccttcat tttc            54
<210>22
<211>2555
<212>ADN
<213>甲型肝炎病毒
<220>
<221>基因
<222>互补((1)..(2555))
<223>序列#22.
     编码结合内质网保留信号的结构性P1-2A蛋白的序列。
<400>22
atgaatatgt ccaaacaagg aattttccag actgttggga gtggccttga ccacatcctg   60
tccttggcag atattgagga agagcaaatg attcagtccg ttgataggac tgcagtgact   120
ggagcttctt atttcacttc tgtggaccaa tcttcagttc atactgctga ggttggctca   180
caccaaattg aacctttgaa aacctctgtt gataaacctg gttctaagaa aactcagggg   240
gagaagtttt tcttgattca ttctgctgat tggctcacta cacatgctct ctttcatgaa   300
gttgcaaaat tggatgtggt gaaactgctg tacaatgagc agtttgccgt ccaaggtttg   360
ttgagatacc atacttatgc aagatttggc attgagattc aagttcagat aaatcccaca   420
ccctttcagc aaggaggact aatctgtgcc atggttcctg gtgaccaaag ttatggttca   480
atagcatcct tgactgttta tcctcatggt ctgttaaatt gcaatatcaa caatgtagtt   540
agaataaagg ttccatttat ttatactaga ggtgcttatc attttaaaga tccacagtac   600
ccagtttggg aattgacaat cagagtttgg tcagagttga atattggaac aggaacctca   660
gcttatactt cactcaatgt tttagctagg tttacagatt tggagttgca tggattaact   720
cctctttcta cacagatgat gagaaatgaa tttagagtta gtactactga aaatgttgta   780
aatttgtcaa attatgaaga tgcaagggca aaaatgtctt ttgctttgga tcaggaagat   840
tggaagtctg atccttccca aggtggtgga attaaaatta ctcatttcac tacctggaca   900
tccattccaa ccttagctgc tcagtttcca ttcaatgctt cagattcagt tgggcaacaa   960
attaaagtta taccagtgga cccatacttt ttccagatga caaacactaa tcctgatcaa   1020
aaatgtataa cagccttggc ctctatttgt cagatgttct gcttttggag gggagatctt   1080
gttttcgatt tccaggtttt tccaaccaaa tatcattcag gtaggctgtt gttttgtttt   1140
gttcctggga atgagttaat agatgttact ggaattacat taaaacaggc aactactgct   1200
ccttgtgcag tgatggacat tacaggagtg cagtcaacct tgagatttcg tgttccttgg   1260
atttctgata caccctatcg agtgaatagg tacacgaagt cagcacatca aaaaggtgag   1320
tatactgcca ttgggaagct tattgtgtat tgttataata gattgacttc tccttctaat   1380
gttgcttctc atgttagagt taatgtttat ctttcagcaa ttaatttgga atgttttgct   1440
cctctttacc atgctatgga tgttaccaca caggttggag atgattcagg aggtttctca   1500
acaacagttt ctacagagca gaatgttcct gatccccaag ttggcataac aaccatgagg   1560
gatttaaaag ggaaagccaa taggggaaag atggatgtat caggagtgca ggtacctgtg   1620
ggagctatta caacaattga ggatccagtt ttagcaaaga aagtacctga gacatttcct   1680
gaattgaagc ctggagaatc cagacataca tcagatcaca tgtctattta taaattcatg   1740
ggaaggtctc atttcttgtg tacttttact tttaattcaa acaataaaga gtacacattt   1800
ccaataactc tgtcttcgac ttctaatcct cctcatggtt taccatcaac attaaggtgg   1860
ttctttaatt tgtttcagtt gtatagagga ccattggatt tgacaattat aatcacagga   1920
gccactgatg tggatggtat ggcctggttt actccagtgg gccttgctgt cgacacccct   1980
tgggtggaaa agaagtcagc tttgtctatt gattataaaa ctgcccttgg agctgttaga   2040
tttaatacaa gaagaacagg gaacattcag attagattgc catggtattc ttatttgtat   2100
gccgtgtctg gagcactgga tggcttggga gataagacag attctacatt tggattggtt   2160
tctattcaga ttgcaaatta caatcattct gatgaatatt tgtcctttag ttgttatttg   2220
tctgtcacag agcaatcaga gttctatttc cctagagctc cattaaattc aaatgctatg   2280
ttgtccactg agtccatgat gagtagaatt gcagctggag acttggagtc atcagtggat   2340
gatcccagat cagaggagga cagaagattt gagagtcata tagaatgtag gaaaccatat   2400
aaagaattga gactggaggt tgggaaacaa agaatcaaat atgctcagga agagttatca   2460
aatgaagtgc ttccacctcc taggaaaatg aaggggttat atgcttctgg aggtgaattc   2520
gatatcaagg atgaattgta atcgataccg tcgac                              2555
<210>23
<211>1012
<212>ADN
<213>甲型肝炎病毒
<220>
<221>基因
<222>互补((1)..(1012))
<223>序列#23.
     编码3ABC聚蛋白和内质网保留信号的序列。
<400>23
gaattcctgc agcccggggg atccatggga atttcagatg atgacaatga tagtgcagta   60
gctgagtttt tccggtcttt tccatctggt gaaccatcaa attccaagtt atctagtttt   120
ttccaagctg tcactaatca caagtgggtt gctgtgggag ctgcagttgg tattcttgga   180
ttgctagtgg gaggatggtt tgtgtataag catttttccc gcaaagagga agaaccaatt   240
ccagctgttg gggtttatca tggagtgact aagcccaaac aagtgattaa attggatgca   300
gatccagtag agtctcagtt gactctagaa atagcaggat tagttaggaa aaatttggtt   360
cagtttggag ttggtgagaa aaatggatgt gtgagatggg tcatgaatgc cttaggagtg   420
aaggatgatt ggttgttagt accttctcat gcttataaat ttgaaaagga ttatgaaatg   480
atggagtttt atttcaatag aggtggaact tactattcaa tttcagctgg taatgttgtt   540
attcaatctt tagatgtggg attccaagat gttgttctaa tgaaggttcc tacaattccc   600
aagtttagag atattactca acattttatt aagaaaggag atgtgcctag agccttgaat   660
cgcttggcaa cattagtgac aaccgttaat ggaactccta tgttaatttc tgagggacct   720
ttaaaaatgg aagaaaaagc cacttatgtt cataagaaga atgatggtac tacggttgat   780
ttgactgtag atcaggcatg gagaggaaaa ggtgaaggtc ttcctggaat gtgtggtggg   840
gccctagtgt catcaaatca gtccatacaa aatgcaattt tgggtattca tgttgctgga   900
ggaaattcaa ttcttgtggc aaagttgatt actcaagaaa tgtttcaaaa cattgataag   960
aaaattgaaa tcaagcttcg acctcgaatc aaggatgaat tgtaatcgat ac           1012
<210>24
<211>2492
<212>ADN
<213>甲型肝炎病毒
<220>
<221>基因
<222>互补((1)..(2492))
<223>序列#24
     编码结构性区域，没有VP4蛋白，而融合至内质网保留信号的序列。
<400>24
gggatggata ttgaggaaga gcaaatgatt cagtccgttg ataggactgc agtgactgga   60
gcttcttatt tcacttctgt ggaccaatct tcagttcata ctgctgaggt tggctcacac   120
caaattgaac ctttgaaaac ctctgttgat aaacctggtt ctaagaaaac tcagggggag   180
aagtttttct tgattcattc tgctgattgg ctcactacac atgctctctt tcatgaagtt   240
gcaaaattgg atgtggtgaa actgctgtac aatgagcagt ttgccgtcca aggtttgttg   300
agataccata cttatgcaag atttggcatt gagattcaag ttcagataaa tcccacaccc   360
tttcagcaag gaggactaat ctgtgccatg gttcctggtg accaaagtta tggttcaata   420
gcatccttga ctgtttatcc tcatggtctg ttaaattgca atatcaacaa tgtagttaga   480
ataaaggttc catttattta tactagaggt gcttatcatt ttaaagatcc acagtaccca   540
gtttgggaat tgacaatcag agtttggtca gagttgaata ttggaacagg aacctcagct   600
tatacttcac tcaatgtttt agctaggttt acagatttgg agttgcatgg attaactcct   660
ctttctacac agatgatgag aaatgaattt agagttagta ctactgaaaa tgttgtaaat   720
ttgtcaaatt atgaagatgc aagggcaaaa atgtcttttg ctttggatca ggaagattgg   780
aagtctgatc cttcccaagg tggtggaatt aaaattactc atttcactac ctggacatcc   840
attccaacct tagctgctca gtttccattc aatgcttcag attcagttgg gcaacaaatt   900
aaagttatac cagtggaccc atactttttc cagatgacaa acactaatcc tgatcaaaaa   960
tgtataacag ccttggcctc tatttgtcag atgttctgct tttggagggg agatcttgtt   1020
ttcgatttcc aggtttttcc aaccaaatat cattcaggta ggctgttgtt ttgttttgtt   1080
cctgggaatg agttaataga tgttactgga attacattaa aacaggcaac tactgctcct   1140
tgtgcagtga tggacattac aggagtgcag tcaaccttga gatttcgtgt tccttggatt   1200
tctgatacac cctatcgagt gaataggtac acgaagtcag cacatcaaaa aggtgagtat   1260
actgccattg ggaagcttat tgtgtattgt tataatagat tgacttctcc ttctaatgtt   1320
gcttctcatg ttagagttaa tgtttatctt tcagcaatta atttggaatg ttttgctcct   1380
ctttaccatg ctatggatgt taccacacag gttggagatg attcaggagg tttctcaaca   1440
acagtttcta cagagcagaa tgttcctgat ccccaagttg gcataacaac catgagggat   1500
ttaaaaggga aagccaatag gggaaagatg gatgtatcag gagtgcaggt acctgtggga   1560
gctattacaa caattgagga tccagtttta gcaaagaaag tacctgagac atttcctgaa   1620
ttgaagcctg gagaatccag acatacatca gatcacatgt ctatttataa attcatggga   1680
aggtctcatt tcttgtgtac ttttactttt aattcaaaca ataaagagta cacatttcca   1740
ataactctgt cttcgacttc taatcctcct catggtttac catcaacatt aaggtggttc   1800
tttaatttgt ttcagttgta tagaggacca ttggatttga caattataat cacaggagcc   1860
actgatgtgg atggtatggc ctggtttact ccagtgggcc ttgctgtcga caccccttgg   1920
gtggaaaaga agtcagcttt gtctattgat tataaaactg cccttggagc tgttagattt   1980
aatacaagaa gaacagggaa cattcagatt agattgccat ggtattctta tttgtatgcc   2040
gtgtctggag cactggatgg cttgggagat aagacagatt ctacatttgg attggtttct   2100
attcagattg caaattacaa tcattctgat gaatatttgt cctttagttg ttatttgtct   2160
gtcacagagc aatcagagtt ctatttccct agagctccat taaattcaaa tgctatgttg   2220
tccactgagt ccatgatgag tagaattgca gctggagact tggagtcatc agtggatgat   2280
cccagatcag aggaggacag aagatttgag agtcatatag aatgtaggaa accatataaa   2340
gaattgagac tggaggttgg gaaacaaaga atcaaatatg ctcaggaaga gttatcaaat   2400
gaagtgcttc cacctcctag gaaaatgaag gggttatatg cttctggagg tgaattcgat   2460
atcaaggatg aattgtaatc gataccgtcg ac                                 2492

Claims (39)

1.甲型肝炎病毒重组抗原，其中它们是从含有基于HAV基因组的修饰片段的嵌合HAV基因(SEQ ID NO 3)的基因构建体转化的植物细胞中获得的。
2.根据权利要求1的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们仅含有五聚体。
3.根据权利要求1和2的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是由含有下列元件的融合物的根据SEQ ID NO 17的嵌合基因的表达获得的：
a.编码蛋白VP2、VP3、VP1和2A的核苷酸序列(SEQ ID N025)
b.编码蛋白3A、3B、3C的核苷酸序列(SEQ ID NO 13)。
4.根据权利要求3的甲型肝炎病毒重组抗原，其中嵌合基因在合适启动子和终止子信号调节的植物细胞中表达。
5.根据权利要求4的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是在植物细胞的细胞质中获得的。
6.根据权利要求5的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们在双子叶植物中表达。
7.根据权利要求6的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们在烟草、胡萝卜和可食用植物的果实中表达。
8.根据权利要求5的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们在单子叶植物中表达。
9.根据权利要求8的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们在稻和可食用植物的果实中表达。
10.根据权利要求1的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们含有五聚体和空衣壳。
11.根据权利要求10的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是由含有下列两个元件的融合物的嵌合基因的表达获得的：
a.编码蛋白VP4、VP2、VP3、VP1和2A的根据SEQ ID NO 6的核苷酸序列，
b.根据权利要求3b的编码蛋白3A、3B和3C的核苷酸序列。
12.根据权利要求11的甲型肝炎病毒重组抗原，其中嵌合基因在合适启动子和终止子信号调节的植物细胞中表达。
13.根据权利要求12的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是在植物细胞的细胞质中获得的。
14.根据权利要求13的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从双子叶植物中获得的。
15.根据权利要求14的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们在烟草、胡萝卜和可食用植物的果实中表达。
16.根据权利要求13的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从单子叶植物中获得的。
17.根据权利要求16的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们在稻和可食用植物的果实中表达。
18.根据权利要求2的甲型肝炎病毒重组抗原，其中它们由两个嵌合基因协同表达获得：
a.一种核苷酸序列，根据编码蛋白VP2、VP3、VP1、2A的序列ID No.24，在其5′末端与信号序列融合和在其3′末端与间隔序列融合，随后是编码KDEL肽的序列，
b.一种核苷酸序列，根据权利要求3B中涉及的编码蛋白3A、3B、3C的序列ID No.23，在其5′末端与信号序列融合和在其3′末端与间隔序列融合，随后是编码KDEL肽的序列。
19.如权利要求18的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于嵌合基因在合适启动子和终止子信号调节的植物细胞中表达。
20.如权利要求18和19的甲型肝炎病毒重组抗原，其中它们是在植物细胞的内质网中获得的。
21.如权利要求20的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从双子叶植物中获得的。
22.如权利要求21的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从烟草、胡萝卜和可食用植物的果实中获得的。
23.如权利要求20的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从单子叶植物中获得的。
24.如权利要求23的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从稻和可食用植物的果实中获得的。
25.如权利要求10的甲型肝炎病毒重组抗原，其中它们由两个嵌合基因协同表达获得：
a.一种核苷酸序列，根据编码蛋白VP4、VP2、VP3、VP1、2A的序列ID No.22，在其5′末端与信号序列融合和在其3′末端与间隔序列融合，随后是编码KDEL肽的序列，
b.根据权利要求18b的核苷酸序列。
26.如权利要求25的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于嵌合基因在合适启动子和终止子信号调节的植物细胞中表达。
27.如权利要求25和26的甲型肝炎病毒重组抗原，其中它们是在植物细胞的内质网获得的。
28.如权利要求27的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从双子叶植物中获得的。
29.如权利要求28的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从烟草、胡萝卜和可食用植物的果实中获得的。
30.如权利要求27的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从单子叶植物中获得的。
31.如权利要求30的甲型肝炎病毒重组抗原，其特征在于它们是从稻和可食用植物的果实中获得的。
32.如权利要求1、3、11、18和25的甲型肝炎病毒重组抗原，它可以被纯化以通过肠胃外方法施用。
33.如权利要求32的甲型肝炎病毒重组抗原，它可以与其它病毒抗原组合施用。
34.如权利要求1、3、11、18和25的甲型肝炎病毒重组抗原，它可以通过口服方法施用。
35.如权利要求34的甲型肝炎病毒重组抗原，它可以作为冻干提取物、丸剂或胶囊施用。
36.如权利要求1、3、11、18和25的甲型肝炎病毒重组抗原，它可以以汁形式施用。
37.如权利要求1、3、11、18和25的甲型肝炎病毒重组抗原，它具有免疫原性并引起抗甲型肝炎的保护性免疫应答。
38.如权利要求32的甲型肝炎病毒重组抗原，它可以用作甲型肝炎的诊断试剂盒的一部分。
39.权利要求1至38中涉及的抗原制备单纯的和联合疫苗的用途。
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