WO2004040302A1 - ＲＡＰＬ・Ｒａｐ１相互作用制御 - Google Patents

ＲＡＰＬ・Ｒａｐ１相互作用制御 Download PDF

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WO2004040302A1
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Tatsuo Kinashi
Hiroshi Shikama
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Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.
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    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to controlling the biological activity induced by interacting with P ⁇ ) (ie, RAPL).
  • the present invention relates to a technique for controlling, for example, inhibiting or promoting the binding between Rapl and p30, and a technique for using the same. Tall.
  • Rapl has been reported to function as an antagonist for i »H-Ras, but recently it has been revealed that it is an intracellular regulation of molecular integrins.
  • Rapl positively regulates the kannity of b2-intedarin, such as LFA-1, expressed in immune cells, migrates and localizes leukocytes and vascular endothelial cells on the fiber, and expresses antigens. It has an important effect on »presenting cells.
  • Such functional determination of Rapl as an integrin ## regulatory molecule is expected to be closely related to the pathological conditions of immune diseases such as inflammation, allergy, autoimmune diseases, cancer immunity, and transplant immunity.
  • p30 has been identified as being involved in the control of integrins by Rapl (#Patent Document 1).
  • the present invention is a.
  • (1) (1) (a) an active polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, its partial peptide or its salt, And an amino acid sequence containing the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence of the amino acid sequence, which is the twelfth glycine force variant of the amino acid sequence represented by Rooster No. 2, or the point-mutated amino acid sequence.
  • 'One polypeptide selected from the group consisting of awake polypeptides A polypeptide selected from the group consisting of a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof, and (c) a test sample;
  • [2] (1) a step of contacting one polypeptide selected from the group (a), one polypeptide selected from the group (b) and a test sample,
  • One polypeptide selected from the group (b), which binds to one polypeptide selected from the group (a), is a primary antibody against the polypeptide of the group (b) or the (b) (1) to (1) to (2) to detect the interaction and the formation of Z or bond of these polypeptides by detecting or measuring using a primary antibody against another peptide fused to the polypeptide of (1) to (3).
  • the screening method according to any one of the above;
  • one polypeptide selected from the group (a), which binds to one polypeptide selected from the group (b), is a primary antibody against the polypeptide of the group (a) or the (a) (1) to (1) to (1) to (2) to detect the formation or Z or interaction of these polypeptides by detecting or measuring using a primary antibody against another peptide fused to the polypeptide of (1) to (3).
  • the screening method according to any one of the above;
  • one polypeptide selected from the group (bound to one polypeptide selected from the group (a)) is a primary antibody against the polypeptide of the group (b) or Detection or measurement using a primary antibody against another peptide fused to the polypeptide and a secondary antibody against the primary antibody allows detection of the binding form and Z or interaction of these polypeptides Any one of the above-mentioned [1] to [3], wherein
  • a polypeptide obtained by fusing glutathione-S-transferase to the N-terminal side of a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Alternatively, a glutamic acid-S-transferase fused to the N-terminal side of a polypeptide having an amino acid sequence which is the twelfth glycine of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or a salt thereof, wherein the polypeptide of group (b) is obtained by fusing a Myc epitope on the N-5 ⁇ ⁇ side of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the screening kit according to the above [9] which is a polypeptide or a salt thereof;
  • a pharmaceutical composition comprising the compound of the above-mentioned [13] or a salt thereof;
  • a g3 ⁇ 4 composition comprising the compound of the above-mentioned [14] or a salt thereof.
  • a diagnostic method comprising using the monoclonal antibody according to [18];
  • a diagnostic kit comprising the monoclonal antibody according to [18]; [21] a polynucleotide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 A polypeptide or a salt thereof that functions as a dominant-suppressing type of intracellular peptide
  • X is —CT ⁇ R 1 group or —C ( ⁇ W 1 ) W 2 R 2 group
  • R 1 is an alkyl group, a haloalkyl group, an alkoxycarbonylalkyl group, an alkenyl group, a loalkenyl group, a phenyl group.
  • X is an alkenylcarbonyl group substituted with an alkoxycarbonylalkylcarbinyl group, an alkenylcarbonyl group, a phenyl group, a cycloalkylcarbonyl group, an indanylcarbonyl group, a furancarbonyl group, a thiophene group.
  • a medicament comprising as an active ingredient a compound having an activity of inhibiting the interaction between p30 and Rapl;
  • a medicament characterized in that it contains the p30 P and the harmful agent according to the above [44] or [45] as an active ingredient;
  • a medicament comprising the p30 activator according to [47] or [48] as an active ingredient
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of p30 and its gene structure. At the same time, the amino acid sequence of Norel is also shown.
  • FIG. 2 shows the cage results for the association of p30 with Rapl. This is a photograph of a chemical film exposed by the BCL luminescence method.
  • FIG. 3 is (A) an electrophoresis photograph showing the results of the current distribution of p30 by RT-PCR. (B) is an electrophoretic photograph showing the results of Western blot using an anti-p30 specific antibody for various cells.
  • FIG. 4 shows the results of examining the effect of if ⁇ on cell migration in which both wild-type p30 or a mutant of the p30 RBD domain and Rapl were expressed. On the right is an electrophoretic photograph showing the results of the Western plot.
  • FIG. 5 shows the effect of p30 on chemokine-induced cell migration.
  • Figure 6 shows (A) the effect of p30 on LFA-1 regulation.
  • (B) shows the control effect of LF A-1 based on mutant p30. Only E37G, which retains the binding activity to p30, showed an increase in LFA-1 to ICAM-1.
  • (C) del taNp30 suppresses adhesion of LFA-1 to ICAM-1 induced by TCR in a feed-dependent manner.
  • the lower panel is an electrophoresis photograph showing the expression of deltaNp30.
  • FIG. 7 shows the results of a test conducted on the effect of the compound 1 on the binding between Rapl and p30.
  • Figure 8 is a micrograph showing the result of observation of the f good of the microtubule by P 30 in a confocal laser microscope «.
  • FIG. 9 is a photomicrograph showing the results of local confocal laser observation of p30 and LFA-1 between T cells and antigen presenting cells.
  • the relevant predecessor activities include microtubule or microtubule induction, leading edge and / or uropod formation, and increased LFA-1 activity
  • Chemokine stimulation increases T cell migration activity, increases cell proliferation, induces cell migration, redistributes CXCR4 and / or CD44 (redistri but ion) antibody to T cell receptor (TCR) complex Pollution of cells by cross-linking of the body or cross-linking of chemokines, clustering at the leading edge of LFA-1, polarization of LFA-1, Localization, clustering of LFA-1 at the leading edge and co-localization of P30, formation of conjugates between antigen-presenting cells (APCs) and LFA- Co-accumulation of 1 and p30, Integrin-dependent promotion of migration ability, T cell polarity formation, T cell SMA formation, and the like.
  • APCs antigen-presenting cells
  • ⁇ 'p30 was named RAPL (regulator for cell adhesion and polarization enriched in lymphoid tissues) (Koko Katagiri et al., Nature Immunol ogy s August 4, 2003 (8): 741-748) .
  • p30 and RAPL are the same polypeptide and have an amino acid sequence represented by Rooster J number: 4. In the following description, p30 indicates MPL.
  • p30 is biological activities involving Les, the force anything ability to detect or measure the interaction between the detection or P 30 be cowpea to measuring the active 's Awakening Rapl the Zureka. If this technology is used, the interaction between 30 and alive Rapl and Z or bond cranes ij or An accelerator can be screened, and a drug can be developed using the identified inhibitor or accelerator. According to the present technology, it is also possible to regulate the binding between P30 and active Rapl and to control the interaction between them, and to regulate impeachment and screening of compounds involved in the regulation. It is possible to study various physiological phenomena and biological activity phenomena, and it is possible to develop pharmaceuticals related to them.
  • the interaction and / or binding between the active tt polypeptide of the polypeptide Rap1 represented by SEQ ID NO: 2 and the polypeptide p30 represented by SEQ ID NO: 4 is inhibited or inhibited by the I3 ⁇ 4S technique.
  • a method for screening a promoting compound comprises the steps of: (a) an active polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a partial peptide thereof or a salt thereof;
  • the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by No. 2 is an active polypeptide containing an amino acid sequence in which the glycine at position 12 is valine or an amino acid sequence substantially identical to the point-mutated amino acid sequence.
  • polypeptide selected from the group consisting of one polypeptide selected from the group or a partial peptide thereof or a salt thereof) or the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by Rooster No. 4 Screening test in the presence of one polypeptide selected from the group consisting of a polypeptide containing an amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof This is done by coexisting the sample.
  • the polypeptide of the above-mentioned group (a) or the polypeptide of the above-mentioned group (b) those obtained as recombinant proteins by genetic and recombination techniques are used, and these polypeptides are used. It is also possible to use a co-expressed cell or an extract thereof.
  • the active ft polypeptide of the group (a) refers to a polypeptide that can bind to p30.
  • the polypeptides of group (a) in the active form are prepared using GTP or GTP analog such as GTP JS or GppNHp in a buffer solution. By treating at ⁇ 37 ° C for 10 minutes and for 1 hour, it can be more active. Activation by GTP analogs such as GTPyS and GppNHp is preferable, and activation by GTPyS is more preferable.
  • the polypeptide of group (a) is expressed intracellularly: ⁇ indicates that the cell is cross-linked to a T-cell receptor-1 (TCR) complex by an antibody. It is the ability of the polypeptide to become an active garden by dispersing.
  • TCR T-cell receptor-1
  • the cross-linking of the TCR complex with an antibody can be an example of IJ intensification by treatment with an anti-CD3 monoclonal antibody.
  • chemokine-induced IJ intensities include treatment with SLC (secondary y lymphoid tissue chemokine), CCL21 (chemokine cc motif ligand 21), and SDF-1 (stromal cel l-derived factor-1).
  • SLC secondary y lymphoid tissue chemokine
  • CCL21 chemokine cc motif ligand 21
  • SDF-1 stromal cel l-derived factor-1
  • the ability to screen a test sample by various methods for example, (l) (a) the amino acid sequence represented by the rooster sequence number: 2 An active polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the above, or a partial peptide thereof or a salt thereof, and valine is the twelfth daricin in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a method for coexisting the polypeptide of the group (a), the polypeptide of the group (b) and the test sample a method of simultaneously contacting three persons, Or the polypeptide of (b).
  • Use cells that co-express these polypeptides choose these methods by adjusting the timing of expression of each polypeptide and the timing of contact between test samples and IT cells It is possible to do.
  • substantially the same amino acid sequence means about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably 90% or more, Preferably, it refers to an amino acid sequence having about 95% or more homology.
  • the original amino acid sequence of “the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4” is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • Polypeptide containing an amino acid sequence substantially identical to an amino acid sequence is a polypeptide containing the aforementioned “substantially identical amino acid sequence” and having the original amino acid sequence. Polypeptides substantially the same as the above are preferred. In the present invention
  • substantially equivalent means that the activities of the proteins, eg, binding activity, physiological activity, and biological activity are substantially the same. Furthermore, the meaning of the term also includes those having substantially the same activity. Examples of the substantially same activity include control of cell 3 ⁇ 43 ⁇ 4, cell migration, cell polarization, and the like. I can help you. Said substantially equivalent activities indicate that those activities are of the same nature in nature. For example, activities such as binding activity are equivalent (eg, about 0.001 to about 1000 times, preferably about 0.01 to about 100 times, more preferably about 0.1 to about 20 times, and more preferably (About 0.5 times to about 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • binding activity are equivalent (eg, about 0.001 to about 1000 times, preferably about 0.01 to about 100 times, more preferably about 0.1 to about 20 times, and more preferably (About 0.5 times to about 2 times), but the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different
  • the polypeptide of the group (a) or the group (b) of the present invention may be one having a preferable change such as amino acid substitution, deletion, insertion, addition, or the like. Characteristics or chemical characteristics may be changed.
  • the polypeptide having the substitution, deletion, insertion or addition may be one which is assumed to be substantially the same as that having no such substitution, deletion, insertion or addition.
  • Substantially identical substitutes for the amino acid in the amino acid sequence may be selected from other amino acids of the class to which the amino acid belongs.
  • examples of @ (hydrophobic) amino acids include alanine, phenylalanine, leucine, isoleucine, valine, proline, tributofan, and methionine
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, and the like.
  • examples include cystine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • examples of positively charged amino acids include arginine, lysine, and histidine.
  • examples of negatively charged amino acids (acidic amino acids) include Aspartic acid, glutamic acid and the like.
  • the polypeptide of the present invention can modify the amino acid residue contained in the polypeptide by a ligological method, and can also be used for peptidases, such as pepsin, chymotrypsin, papain, bromelain, and endopeptidase. It can be modified by using enzymes such as zeo or exopeptidase, or partially degraded to make it a destructive book.
  • a photographic peptide or polypeptide (or protein) is one in which one or more amino acid residues differ from the natural one in terms of identity, It may be different.
  • One or more amino acid residues in Rapl or p30 protein for example, 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, particularly 1 ⁇ 10) Missing Missing ⁇ !
  • One or more of the analogs or unique amino acid residues eg, 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, especially 1 to 10 Etc.
  • Addition analogs having up to 20 amino acids, especially 1 to 10 amino acid residues, and 1 or more (for example, 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 10) Insertions having 40, more preferably 1 to 20, especially 1 to 10) amino acid residues are also included in the polypeptides of the present invention.
  • the position of the amino acid sequence insertion, deletion or substitution that is inserted, deleted or substituted is not particularly limited.
  • test sample can be screened based on the inhibition of the binding between Rapl and p30, instead of the biological activity as the interaction between Rapl and p30.
  • the polypeptide of group (a) used for tf ⁇ is not particularly limited as long as it has an activity of binding to wild-type p30.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence modified by substitution, deletion Z or addition of an amino acid residue as described above. It may be a polypeptide having There is no particular limitation on the polypeptide of group (b) which is i ⁇ ffl to ⁇ as long as it has an activity of binding to wild-type Rapl. It may have lost the biological activity of p30.
  • Test samples include, for example, proteins, peptides, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, plant extracts, wild extracts of animals, etc., and cell extracts.
  • test compound used in the test sample may preferably include an anti-p30 antibody, an enzyme inhibitor, a cytotoxic agent, a compound having various inhibitory activities, particularly a synthetic compound, and the like. These compounds may be new compounds or known compounds. Representative compounds include, for example, various diamino trifluoromethyl pyridine derivatives disclosed in JP-A-6-263735. The screening can be performed according to a conventional method for measuring binding activity or biological activity.
  • any of the active polypeptides in the group (a), the polypeptides in the group (b), and a test sample are brought into contact with each other.
  • the interaction between the polypeptides of both groups is detected by detecting or measuring the biological activity involving p30, and the selection is made of a compound that promotes or inhibits the interaction between the polypeptides. Screening purified compounds, etc .: t ⁇ may be omitted in the selection step.
  • the predecessor activity involving P30 includes microtubule development or microtubule development. Induction, leading edge and / or uropod form) ⁇ induction, increase of LFA-1 3 ⁇ 4 # activity, increase of T cell migration activity by chemokine stimulation, increase of cell adhesion Induction of cell migration, CX—CR 4 and / or CD44 redistribution, antibody-mediated cross-linking of T cell complex receptor (TCR) complex (TCR) complex or chemokine, etc.
  • TCR T cell complex receptor
  • TCR TCR complex receptor
  • Another embodiment of the screening method of the present invention is that the polypeptide of any of the active #S in the group (a), the polypeptide in the group (a), and the test sample are brought into contact with each other. It is performed by detecting the formation of the polypeptide bonds of the group and selecting a compound that promotes or inhibits the formation of 13 ⁇ 4Yoshigo. Screening purified compounds, etc .: ff ⁇ , the selection step may be omitted. If activation of the polypeptide of group (a) is necessary, use GTP inducer as described above. When the polypeptide is immobilized on the solid phase, activation may be performed before or after immobilization, but more preferably after immobilization.
  • the polypeptide used in the present invention can be used by binding to an adjuvant book.
  • the polypeptide may be immobilized on the support by a standard method.
  • the bond to which the polypeptide is bound include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, cellulose, and synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon. More specifically, commercially available beads and plates manufactured using them as raw materials are used. If ⁇ of the beads, these strongly packed columns or the like may be used. Plate of multiwell Plates (96-well multi-well plate, etc.) and biosensors per chip o
  • a commonly used method utilizing a ligand bond, physical adsorption, or the like may be used.
  • an antibody that specifically recognizes the polypeptide can be bound to a branch tree in advance, and the antibody can be bound to the polypeptide.
  • binding can be enhanced via avidin / pyotin.
  • the binding between the polypeptide of the group (a) and the polypeptide of the group (b) is usually performed in a buffer.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a Tris buffer, or the like is used.
  • Incubation conditions include conditions that have already been used, for example, incubating at 4 ° C to room temperature for 1 second to 3 hours, preferably 3 seconds to 2 hours, more preferably 10 seconds to 30 minutes. Chillon is strongly mentioned. Washing after the incubation is not particularly limited as long as it does not hinder protein binding.
  • a buffer containing a surfactant is used.
  • a surfactant for example, 0.05% Tween20 is used.
  • specific binding is performed by incubating the polypeptide of the group (a), the polypeptide of the group (b) and the test sample under appropriate conditions, and then washing. And the ability to separate extraordinary bonds. What is necessary is just to face the bonding state between the polypeptide of the group (a) and the polypeptide of the group (b).
  • the polypeptide to be bound to the support book may be either the polypeptide of the group (a) or the polypeptide of the group (b). That is, the polypeptide of the above (a) group is bound to an adjuvant book: l ⁇ contains the polypeptide of the above (a) group after immobilization, and is combined with the polypeptide of the above (b) group.
  • the test sample may be mixed in advance, or the polypeptide of group (b) may be added after the test sample is added.
  • the age at which the polypeptide of group (b) is immobilized on a support is also determined by mixing the polypeptide of group (a) with a test sample in advance or after adding the test sample.
  • Polypeptides of the group may be added.
  • the polypeptide of the group (a), the polypeptide of the group (b) and the test sample added in the above order are incubated under appropriate conditions, and the polypeptide of the group (a) and the polypeptide are added.
  • a control group may be provided together with a group in which the test sample is brought into contact with the polypeptide.
  • a negative control group and / or a positive control group that does not contain the test sample can be used.
  • the bound polypeptide When detecting or measuring the bound polypeptide in the present invention, the bound polypeptide may be simply detected, or the bound polypeptide may be quantitatively measured. By comparing these ii ⁇ , the results obtained in the negative control group without the test sample, the results obtained in the group containing the test, and the results obtained in the Z or random control group, The ability to detect
  • results can be obtained as numerical values, and by comparing those numerical values, the activity of the target compound can also be measured.
  • the ability to detect the target compound by comparing the values obtained in the control group without the test sample with those obtained in the group to which the test sample was applied. I can do it. If the obtained value increases or decreases as compared to the shade, it can be determined that the test sample contains the target.
  • a cryptic control group containing a known amount of a compound which is strongly known to inhibit the binding of the polypeptide of group (a) to the polypeptide of group (b) Can be based on the standard curve created by the numerical values obtained in. When the amount of bound polypeptide is large, the activity of the compound that inhibits the binding of the polypeptide is low, while the amount of bound polypeptide is small, the binding of the polypeptide is reduced.
  • a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon can be used as a means for detecting or measuring the bound polypeptide.
  • a sensor using the surface plasmon resonance phenomenon can observe the interaction between polypeptides in real time as a surface plasmon resonance signal without labeling the interaction between the polypeptides.
  • a biosensor such as BIAcore. That is, a cell obtained by immobilizing one of a combination of the polypeptide of the group (a) and the polypeptide of the group (b). The other polypeptide of the combination is brought into contact with the sensor chip, and the polypeptide that binds to one of the immobilized polypeptides is detected as a change in resonance signal.
  • the sensor chip CM5 (manufactured by Biosensor) is activated to immobilize one of the combination of the ⁇ group polypeptide and the (b) group polypeptide on one sensor chip. That is, after the sensor chip was activated with an EDC / NHS aqueous solution (2 OOmM BDC (N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbonate hydrochloride), 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimi de)), the HBS buffer was removed. Wash the sensor chip with buffer (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.05% Tween20).
  • buffer 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.05% Tween20).
  • an appropriate amount of the interacting polypeptide dissolved in the HBS buffer is brought into contact with the sensor chip and immobilized. After washing the sensor chip with an HBS buffer, the remaining activity on the sensor chip is blocked with an ethanolamine solution (1 M ethanolamine chloride, pH 8.5). Wash the sensor chip again with HBS buffer and use for binding Wjffi. Next, an appropriate amount of the polypeptide dissolved in the HBS buffer is injected. At this time, the amount of the polypeptide having an interaction that binds to the polypeptide immobilized on the sensor chip is observed as an increase in the resonance signal value.
  • a test sample is injected into the other polypeptide having an interaction with one of the polypeptides.
  • a control group may be set up together with the group into which the test sample is injected.
  • the control group can include a negative control group, a positive control group, or both groups that do not contain the test sample.
  • the bound polypeptide can be measured as a change in resonance signal value. This: ti ⁇ , by comparing the results obtained with the group of negative controls without the test sample, the results obtained with the group containing the test sample and / or the results obtained with the positive control group The ability to detect and determine the target compound.
  • a means for detecting or measuring the bound polypeptide it is possible to label the polypeptide I, or to use the label of the bound polypeptide. For example, in the above-described screening method, one of the polypeptides was added together with the test sample. The other polypeptide to be brought into contact with the sample is labeled in advance, and the sample is incubated with the test sample, and then washed to detect the bound polypeptide.
  • test sample and the other labeled polypeptide are preferably brought into contact with one of the polypeptides bound to the support. After incubating, the plate may be washed, and the label of the bound polypeptide may be detected or measured.
  • the polypeptide used in the present invention can be labeled by a generally known method.
  • the labeling substance include radioisotope, enzymes, fluorescent substances, biotin / avidin and the like.
  • labeling substances commercially available labeling substances can be used.
  • radioisotopes for example 3 2 P, 3 3 P, 1 3 1 1, 1 2 5 I, 3 H, 1 4 C, 3 5 S and the like.
  • the enzyme include alkaline phosphatase, horseradish powder (HRP), 3 galactosidase, and 3 / 3-glucosidase.
  • the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC) and rhodamine power.
  • the substrate is added, and the enzymatic change of the substrate, for example, color development is detected or measured by an absorbance meter.
  • Fluorescent substance ⁇ Detected or measured by fluorimeter.
  • one of the polypeptides of the group (a) and the polypeptide of the group (b) is specifically recognized by a combination of the polypeptides.
  • the primary antibody is preferably labeled with a labeling substance. Specifically, it can be performed as follows. That is, add an intense night containing some polypeptide to the plate and place it. After washing the plate, block with, for example, BSA to prevent nonspecific binding of the polypeptide. Wash again and add the test sample and the other polypeptide to the plate. At the same time, place a negative control group containing no test sample and a Z or positive control group, and incubate them. After the incubation, wash and add the antibody against the polypeptide added with the test sample. After a suitable incubation, the plate is washed and the polypeptide is detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the polypeptide.
  • 3 ⁇ 4 isotope of dimensional isotope is detected or measured by liquid scintillation.
  • its substrate is added, and the enzymatic change of the substrate, for example, color development is detected or measured by an absorptiometer.
  • Detect or measure with a fluorometer for fluorescent substances By comparing these results with the values obtained in the control group, the target compound can be determined.
  • a primary antibody that specifically recognizes another peptide fused to the polypeptide used in the present invention can be used as a means for detecting or measuring the bound polypeptide.
  • the other polypeptide is brought into contact with the other polypeptide along with the test
  • the peptide is detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the other peptide fused to the polypeptide. That is, preferably, a test funnel and the other polypeptide are attached to one of the polypeptides bound to the book. After incubating, washing and binding, the other polypeptide is fused with the polypeptide and features other polypeptides. What is necessary is just to detect or measure by the primary antibody which recognizes differently.
  • the primary antibody is preferably labeled with a labeling substance. Specifically, you can do the following: That is, a pool containing any of the polypeptides is added to the plate and left overnight. After washing the plate, e.g. B to prevent differential binding of the polypeptide
  • Block with SA Wash again and add the test and the other polypeptide fused to the other peptide to the plate. At the same time, place a negative control group containing no test sample and a Z or positive control, and incubate them. After the incubation, the antibody is washed, and an antibody against another peptide fused with the polypeptide added together with the test sample is added. After an appropriate incubation, the plate is washed and the polypeptide is detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the other peptide fused to the polypeptide. For detection or measurement, detection or measurement is performed using liquid scintillation of the same element.
  • the enzyme's substrate is added, and the enzymatic change of the substrate, eg, color development, is detected or measured by an absorptiometer.
  • absorptiometer For fluorescent substances: Detect or measure with a fluorometer.
  • the target compound can be determined by comparing these results with the values obtained in the control group.
  • a primary antibody that specifically recognizes the polypeptide to be ifffled in the present invention and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody. it can.
  • one of the polypeptides is brought into contact with the other polypeptide together with the test sample, incubated with the test sample, and then washed to separate the bound polypeptide into a specific one.
  • Detection or measurement is performed using a primary antibody that recognizes the above and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody. That is, a sample and another polypeptide are preferably brought into contact with one of the polypeptides bound to the book.
  • the polypeptide may be detected or measured with a primary antibody that specifically recognizes the polypeptide and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance. Specifically, it can be performed as follows. That is, a pool containing some polypeptide is added to the plate and left overnight. After washing the plate, block it with eg BSA to prevent unusual binding of the polypeptide. Wash again and remove the test sample Add the other polypeptide to the plate. At the same time, place a negative control group containing no test sample and a Z or positive control group, and incubate them.
  • the antibody is washed and a primary antibody against another peptide fused with the polypeptide added together with the test sample is added. After a suitable incubation, the plate is washed and then a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody is added. After appropriate incubation, washing is performed, and the polypeptide is detected or measured by a secondary antibody that specifically recognizes a primary antibody that specifically recognizes the polypeptide. For detection or measurement, detect or measure by liquid scintillation of 4 dimensional diisocyanate. In the case of an enzyme, the substrate is added, and the enzymatic change of the substrate, for example, color development is detected or measured by an absorbance meter. Age of fluorescent substance, Detected or measured by fluorometer. By comparing these results with the values obtained in the control group, it is possible to select the target compound.
  • a primary antibody that specifically recognizes another polypeptide fused with the polypeptide and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody are used.
  • I can be powerful.
  • one of the polypeptides is inoculated with one of the polypeptides together with the test sample, incubated with the test 1 ⁇ , and then washed and bound.
  • Detection or measurement is performed using a secondary antibody that specifically recognizes the antibody and the primary antibody. That is, the test sample and the other polypeptide are preferably brought into contact with one of the polypeptides, preferably bound to a strip. After incubation, the plate may be washed and then detected or measured with the bound primary antibody and a secondary antibody that specifically recognizes the primary antibody.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
  • the plate is washed, and the polypeptide is detected or measured by a secondary antibody that specifically recognizes a primary antibody that specifically recognizes another polypeptide fused to the polypeptide.
  • a secondary antibody that specifically recognizes a primary antibody that specifically recognizes another polypeptide fused to the polypeptide.
  • radioactive isotope liquid scintillation For detection or measurement, use radioactive isotope liquid scintillation to detect or measure.
  • the enzyme's substrate is added and the enzymatic change of the substrate, eg, color development, is detected or measured by an absorptiometer. It is detected or measured with an age fluorescent meter of the fluorescent substance. By comparing these results with the values obtained in the control group, the target compound can be determined.More specifically, the present invention is particularly preferably carried out by ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).
  • each well was washed three times with the washing buffer, and the polypeptide of the group (b) fused with another peptide, for example, FLAG, diluted with a dilution buffer (1% BSA, 0.5% Tween 20, PBS).
  • a dilution buffer 1% BSA, 0.5% Tween 20, PBS.
  • wash buffer 100 ⁇ l of Algaric phosphatase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by ZYMED) diluted 1000-fold with dilution buffer to each well, and add 1 hour at room temperature. Incubate. With wash buffer one was washed 5 times each well a chromogenic soluble liquid (substrate buffer;. Ltd.
  • the screening method of the present invention can use High Throughput Screening (HTS). More specifically, up to blocking can be performed manually, and the subsequent reactions can be automated using robots, which can be used to realize high throughput screen in. That is, other peptides, for example, the fused with 6 xHis (a) a group of the polypeptide to immobilized buffer (0. 1M NaHC0 3, 0. 02 % NaN PH9. 6) by dilution. This water pool diluted in each well of a 96-well Imno plate (manufactured by Nunc) is subjected to proper incubation at 4 ° C.
  • HTS High Throughput Screening
  • EL404 microplate washer manufactured by Bio Tek
  • a SPECTRA max 250 plate reader (Molecular Devices) can be used.
  • the program is set to perform the following operations. That is, wash each well three times with the washing buffer, and mix the test sample with another peptide diluted with dilution buffer (1% BSA, 0.53 ⁇ 4 Tween20, PBS), such as MBP (maltose binding polypeptide).
  • dilution buffer 1% BSA, 0.53 ⁇ 4 Tween20, PBS
  • MBP maltose binding polypeptide
  • a commercially available antibody or an antibody contained in a commercially available kit can be used as the antibody to be ffflfled, and a monoclonal antibody or a polyclonal antibody obtained by known means can also be used.
  • the monoclonal antibody is used to ifffl a desired sensitizing antigen, immunize it according to a conventional immunization method, fuse the obtained cell-free cells with a known parent cell by a conventional cell fusion method, and perform a conventional screening. It can be prepared by screening monoclonal antibody producing cells by the method.
  • a combination of the polypeptide of the above-mentioned group (a) and the polypeptide of the above-mentioned group (b) may be used to detect both polypeptides.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer between fluorescent proteins
  • Fluorescence resonance energy transfer between adjacent fluorescent protein molecules Is used to detect the binding between the polypeptides of groups (a) and (b), for example, the fusion of the polypeptide of group (a) with the yellow fluorescent protein (YFP).
  • YFP yellow fluorescent protein
  • Click protein (CFP) and YFP and CFP fusion polypeptides contacting the. Both groups of the polypeptide is fused to any if binding of a state of close proximity.
  • Fluorescence resonance energy transfer is based on the two-molecule system as described above, as well as the fusion polypeptide of the (a) group and the yellow light photoprotein (YFP) in one molecule.
  • Peptide and ⁇ Fluorescent Protein (CFP) Occurs in molecules that exist between powerful molecules, and the detection sensitivity in this case can be adjusted by adjusting the length of the molecules It is.
  • CFP Fluorescent Protein
  • the above-mentioned fusion polypeptide with the fluorescent protein is expressed in the cell (co-expression of the two-molecule system).
  • the cell can be used for the screening of the present invention. It is possible to simultaneously perform the detection or measurement of the binding of the polypeptides of the groups (a) and (b) and the detection or measurement of the biological activity involved in p30.
  • 1 N. Mochizuki et al. Nature vol. 411: 1065-1068, edited by Atsushi Miyawaki GFP and bioimaging Cells that can be performed according to the method described in Yodosha and can be used for screening
  • the above-described detection or measurement can be performed by cultivating the DNA in the presence or absence of a test sample.
  • polypeptide may refer to any of the polypeptides described below. The basic structure of polypeptides is well known and is described in numerous references and other publications in the art.
  • polypeptide as used herein is intended to include any amino acid containing two or more amino acids such that they are linked to each other by a peptide bond or a modified peptide bond. Or any protein.
  • polypeptide includes in the art, for example, short chains also referred to as peptides, oligopeptides, or peptide oligomers, and proteins that are commonly referred to as many forms. Both long-strength ones that are well known may usually mean.
  • Polypeptides may often contain amino acids other than amino acids, which are usually referred to as natural amino acids (natural amino acids: or gene-encoded amino acids).
  • Polypeptides may also be processed and otherwise altered (or modified) after many of their amino acid residues, including the terminal amino acid residue, have been translated, and only by natural processes. It will be understood that the above polypeptides can be modified (modified) by chemical modification techniques well known to those skilled in the art. Modifications made to the polypeptide
  • Modification is described in many forms, and they are described in detail in basic reference books and more detailed articles in the art, as well as in many research literatures. Is well known. Especially the usual modification of the power For example, alkylation, acylation, esterification, amidation, glycosylation, lipid binding, sulfation, phosphorylation, carboxylation of glutamic acid residue, hydroxylation and ADP-ribosylation, etc. For example, TE Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, Second Edition, WH Freeman and Company, New
  • Representative P30 proteins of the present invention include the amino acid sequence of the polypeptide of FIG. 1 or a polypeptide having an amino acid sequence substantially equivalent thereto, for example, at least 5 amino acids of the amino acid sequence. Has up to 213 consecutive amino acid residues and has a biological activity including substantially equivalent biological activities such as Rapl binding activity ttX having a dominant inhibitory function, equivalent antigenicity, etc. Or at least 50% homology, or at least more than 60%, homology, or at least 70% homology with each one of the domains of FIG. Or at least 80% homology, or at least 90% homology, or at least 95% homology, or at least 98% homology Shall, etc., and force new ones.
  • substantially equivalent biological activities such as Rapl binding activity ttX having a dominant inhibitory function, equivalent antigenicity, etc.
  • the number is preferably at least 80, more preferably at least 90, most preferably at least 100, and more preferably at least 110.
  • P30-related ports of the present invention 11 May have a portion of the amino acid sequence of FIG. 1 or may have a Met corresponding to the start codon. Any having such an arrangement may be included.
  • the nucleic acid encoding the P30 protein or the polypeptide to be treated in the present invention typically encodes the peptide shown in FIG. 1 and a part of the contiguous amino acid sequence thereof.
  • Those containing a base sequence, or containing a base sequence composed of at least the H region of the peptide code of the base sequence (including those that code only specific domains) codes A sequence in which a start codon (codon for coding Met) and a stop codon are added, and the base sequence has an amino acid sequence having at least 50% homology with the protein to be coded, and FIG. Has at least a specific amino acid residue which is closely related to the amino acid sequence, and the Rapl-binding activity ttX has a dominant-suppressing function.
  • the biological activity of Meta may be any so long as it contains the same effect of the nucleotide sequence and which was at the a peptide co Solo de with biological activity.
  • the nucleic acid encoding the protein is a single-stranded DM, , RNA, DNA: Nucleic acids such as RNA hybrids and synthetic DNAs, and may be any of human genomic DNA, human genomic DNA library, cDNA derived from human paper tissue cells, and synthetic DNA.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding the protein can be modified (eg, added, removed, substituted, etc.), and such modified ones can be included.
  • the nucleic acid of the present invention may encode the peptide of the present invention or a part thereof, and is preferably DNA.
  • the “equivalent base sequence” refers to, for example, 5 or more base sequences, preferably 10 or more base sequences, more preferably 15 or more base sequences of the base sequence under stringent conditions. And more preferably those which hybridize with a base sequence of 20 or more nucleotides and encode an amino acid sequence substantially equivalent to the protein.
  • One embodiment of a method for obtaining and isolating a functionally equivalent protein is as follows: Methods for introducing mutations into amino acids in protein are well known to those skilled in the art.
  • proteins are usually within 50 amino acids of all amino acids, preferably within 30 amino acids, more preferably within 10 amino acids, and even more preferably within 3 amino acids.
  • Amino acid modification can be performed, for example, by using “Transformer Site-directed uta genesis Kit” or “Excite PGR-Based Site-directed Mutagenesis Kit” (manufactured by CI ontech) for mutation or substitution. If it is a deletion, it can be done by using "Qimntum leap Nested Deletion Kitj (Clontech ⁇ ⁇ )". , “Chemical Experiment Course 1, Genetic Research Method II”, P105 (Susumu Hirose), Tokyo Kagaku Dojin (1986); Japanese Biochemical Society, “New Biochemical Experiment Course 2, Nucleic Acid III (Recombinant DNA Technology)”, p233 OS Susumu), Tokyo Kagaku Doujin (1992); R. Wu, L.
  • site-directed mutagenesis using a synthetic oligonucleotide (site-directed mutagenesis) (Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et al., Ucl. Acids Res. , 13: 4331, 1986), cassette mutagenesis (Wells et al., Gene , 34: 315, 1985), restriction selection mutagene sis: Wells et al., Phi los. Trans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986), alanine.scan.
  • substantially the same activity indicates that those activities are of the same nature in nature, for example, that they are physiologically, pharmacologically or biologically equivalent.
  • activities such as binding activity are equivalent (for example, about 0.001 to about 1000 times, preferably about 0.01 to about 100 times, more preferably about 0.1 to about 20 times, and more preferably about 0.1 to about 20 times. (0.5 to about 2 times), and the quantitative factors of these activities, such as Mg and protein molecular weight, may be different.
  • the peptide (X is a polypeptide) When the peptide (X is a polypeptide) is obtained as a non-active form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and At the age obtained as a salt, it can be converted to an awake or another salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the salt of the peptide (or polypeptide) is physiologically acceptable or pharmaceutically acceptable, but is not limited thereto.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid. ⁇ , ⁇ , maleic acid, fumaric acid, succinic acid, cunic acid, tartaric acid, malic acid, salts with organic acids such as benzoic acid, methanesulfonic acid, P-toluenesulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like.
  • examples of the salt include an ammonium salt, for example, a salt with an organic base such as ethylamine, dimethylamine, trimethylamine, and hydroxyethylamine.
  • an ammonium salt for example, a salt with an organic base such as ethylamine, dimethylamine, trimethylamine, and hydroxyethylamine.
  • it is expressed as a fusion protein when produced by a genetic engineering method, and has a biological activity substantially equivalent to that of a natural protein of the present invention in vitro or in vivo. Converted ⁇ May be processed. The ability to use fusion production methods commonly used in genetic engineering. These fusion proteins can be purified by affinity mouth chromatography using the fusion.
  • Such fusion proteins include those fused to a histidine tag, ⁇ -galactosidase (/ 3-gal), maltose-binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST), Examples include those fused to the amino acid sequence of thioredoxin (TRX) or Cre Recombinase.
  • a polypeptide can be tagged with a heterogeneous epitope, such that purification by immunoaffinity chromatography using an antibody that specifically binds to the epitope can be accomplished.
  • the epitope tag may be, for example, AU5, c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu-Glu, HA, Ha.
  • the fusion protein may be labeled so as to be a detectable protein.
  • the detectable label may be a biotin Avi Tag of the biotin Z streptavidin type, a fluorescent substance, or the like.
  • the fluorescent substance examples include a green jellyfish (Aequorea vie torea) and other luminescent jellyfish-derived threads ife fluorescent protein (green fluorescent protein). : GFP), mutants thereof (GFP variants) such as EGFP (Enhanced-hum anized GFP), rsGFP (red-shift GFP), yellow fluorescent protein (YFP), and fluorescent protein (green fluorescent protein: GFP), cyan fluorescent protein (CFP), Wfe fluorescent protein (BFP), and GFP derived from Reni lla reniformis. ⁇ Atsufumi Waki, Ed., Experimental Medicine Separate Volume, Experimental Lecture in the Post-Genome Era 3 -GFP and Nokuoi Iging, Yodosha (2000)).
  • Detection can also be performed using an antibody (including a monoclonal antibody and a fragment thereof) that specifically recognizes the fusion tag.
  • an antibody including a monoclonal antibody and a fragment thereof
  • a suitably protected amino acid is sequentially bound to a desired amino acid sequence on the resin by various known condensation methods using, for example, a protein or peptide synthesizing element.
  • condensation reaction the ability to use various activations known per se is preferred, and as such, for example, carposimids such as dicyclohexylcarposimid can be preferably used.
  • a product power protecting group it is possible to obtain the desired product by removing the protecting group as appropriate. ,
  • the protein can be prepared by a method known to those skilled in the art as a natural protein or as a recombinant protein prepared by using a recombinant technique.
  • a natural protein is prepared by immunizing a small animal such as a mouse or a rabbit with the prepared recombinant protein and binding the antibody to an appropriate adsorbent (CNBr-activated agarose or tosyl-activated agarose).
  • CNBr-activated agarose or tosyl-activated agarose an appropriate adsorbent
  • Rikikawa is a method of preparing a column and using the resulting column to purify a protein extract of cells.
  • the recombinant protein can be obtained by a conventional method, for example, by inserting a DNA encoding the protein into an appropriate expression vector, introducing the vector into an appropriate cell, and purifying from the transformed cell. It is powerfully possible to prepare.
  • cells used for producing a recombinant protein include plant cells, animal cells such as Escherichia coli and yeast, animal cells, and insect cells.
  • vectors for expressing a recombinant protein in cells include, for example, plasmids “pBI121” and “pBI101” (Clontech ⁇ ⁇ ⁇ t) for plants and yeast cells, and plasmids for E. coli.
  • the transfer of the DNA to the vector can be performed by a conventional method, for example, the method described in Molecular Cloning (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratry Press).
  • the introduction of the vector into the host cell can be carried out by a conventional method according to the host cell, such as an electrification method, a microinjection method, or a no-tickle gun method.
  • Purification of the desired recombinant protein from the resulting transformed cells can be performed by salting out, precipitation with an organic solvent, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or column chromatography using an immunoadsorbent, depending on the properties of the protein. , Gel filtration, SDS electrophoresis, isoelectric focusing, etc.
  • the recombinant protein when expressed as a fusion protein with a label such as glutathione S-transferase, it can be purified by affinity chromatography or the like on the label.
  • DNA encoding a protein or the like used in connection with control of p30-Rapl binding and binding angle is used.
  • the DNA is not particularly limited as long as it can encode the desired protein according to the present invention, and includes genomic DNA, cDNA, DNA synthesized by DNA, and the like.
  • Genomic DNA is obtained by using a genomic DM prepared according to a method known in the art as a ⁇ type and a primer prepared based on a predetermined DNA base sequence (for example, the base sequence described in FIG. 1). It can be prepared by performing polymerase chain reaction (PCR) using the enzyme.
  • PCR polymerase chain reaction
  • cDNA mRNA is prepared from cells by a conventional method (Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratry Press), and reverse transcription is performed. 03 013937
  • genomic DNA and cDNA a genomic DNA library or cDNA library is prepared by a conventional method, and this library is synthesized based on, for example, the base sequence of the DNA (eg, the base sequence shown in Figure 1). It can also be prepared by screening using the probe thus prepared.
  • PCR generally refers to a method described in Saiki et al., Science, 239: 487 (1988); U.S. Pat. No. 4,683,195, for example, It refers to a method for enzymatically amplifying the desired nucleotide sequence at the mouth.
  • PCR involves repeating two oligonucleotide primers capable of hybridizing preferentially to a type I nucleic acid, and repeating the cycle to perform a bramer-elongation synthesis.
  • the primers used in the PCR method can: (1) use a primer that is complementary to the internal nucleotide sequence to be amplified; Both ends are preferably complementary to each other, or are capable of causing the nucleotide sequence to be amplified to preferably ffl.
  • the primer at the end side should be selected so as to amplify at least the power containing the initiation codon, or the primer at the 3 'end side.
  • the primer is preferably an oligonucleotide consisting of 5 or more bases, more preferably an oligonucleotide consisting of 10 or more bases, and more preferably an oligonucleotide consisting of 18 to 35 bases.
  • PCR can be performed by a method known in the art or a method substantially similar to or a modification thereof.
  • a method known in the art for example, in addition to the above-mentioned literature, R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; HA Brlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989; DM Glover et al. Ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practica 1 Approach Series), IRL Press, Oxford Universi ty Press (1995); MA Inn is et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Aca demic Press, New York (1990)); MJ McPherson, P.
  • PCR can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR, and can also be performed according to a protocol specified by a kit manufacturer or a kit distributor.
  • PCR is typical; Ifi ⁇ include, for example ⁇ (for example, DNA was synthesized in ⁇ the mRNA; 1st strand DNA, etc.) and a primer one designed based on ⁇ 1, 10X reaction buffer (attached to Taq DNA polymerase), dNTPs (doxynucleoside triphosphate dATP, dGTP, dCTP, (mixture of ⁇ ), Taq DNA polymerase and deionized distilled water
  • the cycle is repeated 25 to 60 times under general PCR cycle conditions using an automated thermal cycler, such as the GeneAmp 2400 PCR system, Perkin-Elmer / Cetus, for example.
  • the number of cycles for PCR can be set to an appropriate number according to the purpose ..
  • PCR cycle conditions include, for example, denaturation at 90 to 95 ° C for 5 to 100 seconds, and annealing at 40 to 60 ° C for 5 to 100 ° C. 150 sec, extension 65-75 ° C 30-300 sec cycle, preferably denaturing 94. C 15 , Annealing 58.C 15 seconds, elongation 72 ° C 45 seconds cycle power is strong, the reaction and time of the annealing can be selected appropriate value by perfect experiment, denaturation reaction and elongation The appropriate time can be selected according to the expected length of the PCR product.
  • the ring reaction is usually changed according to the Tm value of the hybrid between the primer and type I DNA.
  • the time for the extension reaction is generally about 1 minute per lOObp of chain length, but it is possible to select a shorter time with ⁇ .
  • oligonucleotide is a relatively short strand, single strand or single strand. And preferably a polynucleotide. De O carboxymethyl nucleotides can be mentioned, Angew. C Hem. Int. Ed. Engl., Vol. 28, p. 716-734 (1989). Method, a phosphoramidite method, a phosphonate method and the like.
  • synthesis is strongly known to be conveniently performed on a modified solid support, for example, using an automated synthesizer, which is commercially available.
  • the oligonucleotide may or may contain a further modified, for example, it may contain an unnatural base such as inosine or a tritinolated base, or depending on the case. It may contain a strong base.
  • hybridization techniques In order to identify a given nucleic acid, it is possible to use hybridization techniques. The hybridization can be carried out by the method described in the literature which discloses the above-mentioned "Genetic and Recombination Technology", or a method substantially similar to or a modification thereof.
  • a sample containing nucleic acid such as DNA is transferred to a carrier including a membrane such as a nylon filter, and then subjected to denaturation treatment, immobilization treatment, washing treatment, etc., as necessary.
  • the reaction is carried out by reacting the DNA transcribed on the carrier (for example, a membrane) with the denatured labeled probe DNA fragment, if necessary, in an amplification buffer.
  • the hybridization process is usually performed at about 35 to about 80 ° C, more preferably about 50 to about 65, for about 15 minutes to about 36 hours, more preferably about 1 to about 24 hours. This can be done by selecting the optimal conditions. For example, the hybridization process is performed at about 55 ° C. for about 18 hours.
  • the hybridization buffer can be selected from those commonly used in the field, and for example, a rapid hybridization buffer (Amersham) can be used.
  • Examples of the denaturation treatment of the transferred carrier include a method of thinning an alkali denaturing solution. After the treatment, a treatment with a neutralizing solution or a buffer is preferable.
  • the immobilization treatment of the carrier is usually performed at about 40 to about 100 ° C, more preferably about 70 to about 90 ° C, for about 15 minutes to about 24 hours, more preferably about It is possible to select the force and the child's condition by baking for 1 to about 4 hours.
  • Phil Immobilization is carried out by baking a carrier such as a carrier at about 80 ° C for about 2 hours. Washing of the transferred carrier (eg, membrane) includes washing solutions commonly used in the art, such as 50 mM Tris-HC1 buffer containing 1 M NaCl, lmM EDTA, and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). , H8.0, etc. can be used for washing.
  • a carrier including a membrane such as a nylon filter
  • a carrier selected from those commonly used in this field can be used.
  • alkali denaturing solution neutralizing solution and buffer solution
  • examples of the alkali denaturing solution include 0.5M NaOH and 1.5M NaCl.
  • examples of the neutralizing solution include a 1.5 M NaCl-containing 0.5 M Tris-HCl buffer, H8.0, and the like.
  • Examples of the buffer include XSSPE (0. 36M NaCU 20mM NaH 2 P0 4 and 2 ⁇ M EDTA) may Ku force possible and the like.
  • the transferred carrier for example, a membrane or the like
  • a prehybridization treatment is performed, for example, in a pre-hybridization overnight [50% formamide.
  • Power to do The hybridization can be carried out by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the stringent condition in the present specification is, for example, about 15 to about 50 mM, preferably with respect to sodium concentration. Is about 19 to about 40, more preferably about 19 to about 20 mM, for about 35 to about 85 ° C, preferably about 50 to about 70 ° C, more preferably about 60 to about 65 ° C. Show.
  • the detection process can be strengthened.
  • the washing treatment of the carrier such as a filter can be carried out by selecting and using those commonly used in the art.For example, 0.5 XSSC containing 0.1% SDS (0.15M NaCl, Acid) It can be carried out by washing at night.
  • the hybridized nucleic acid can be typically detected by autoradiography, but it can also be used for detection by selecting from the methods used in this field.
  • nucleic acid bands corresponding to the detected signal a suitable buffer, if example embodiment, SM solution (lOOmM NaCl and 10 mM MgSO 4 containing 50 mM Tris-HCl buffer, H7. 5) was suspended in like, then the suspension After appropriate dilution, the desired nucleic acid can be isolated, purified, and subjected to further processing.
  • SM solution lOOmM NaCl and 10 mM MgSO 4 containing 50 mM Tris-HCl buffer, H7. 5
  • a cloned human-derived cDNA library for example, various human-derived paper woven or cultured cells (particularly, human kidney, brain, pineal gland, posterior pituitary gland, god of the sun, retina, Reticulum cells, retinal sinusoids, thymus, blood vessels, endothelial cells, vascular smooth muscle cells, blood cells, macrophages, lymphocytes, testes, ovaries, ova, intestine, heart, liver, kidney, small intestine , Large intestine, gingival-related cells, skin-related cells, glomerular cells, tubule cells, connective filament cells, etc., and various types of UK thread!
  • a commercially available cDNA library derived from various yarns and fibers can be used directly.
  • a cDNA library commercially available from Stratagene, Invrogen, Clontech, etc. You can use force.
  • a typical example is a gene library prepared from human thread cells, such as a human PI artificial chromosome genomic library (Human Genome Mapping Resource Center) ⁇ a human tissue cDNA library (for example, from Clontech). (Available).
  • a human genomic DNA library or a human-derived cDNA library constructed from various human tissues or cultured cells can be screened with a probe.
  • a commercially available labeling kit for example, a random prime DNA labeling kit (Boehringer Mannheim) can be used.
  • Random- priming kit Pharmacia LKB, Inc., UPPS ala
  • DNA probe [- 3 2 P] dCTP Amersham Corp. was-labeled, etc., to obtain the probes with radioactive it can.
  • Phage particles, recombinant plasmids, ligated vectors, etc., which carry the nucleic acid of the standard J, can be purified and separated by methods commonly used in the art. Purification can be carried out by an ultracentrifugal separation method (Molecular Cloning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989), electrophoresis, or the like. Such as from phage particles, it is possible to purify separating DNA in a way that is commonly used in the art, for example, resulting phage TM sickle (10 mM MgSO 4 containing 50 mM Tris -.
  • the target DNA can also be obtained by subcloning or the like. For example, subcloning can be carried out using a bacterium as a host and a plasmid vector.
  • the DNA obtained by such subcloning can be purified and separated by methods such as centrifugation, phenol extraction, and ethanol precipitation in the same manner as described above.
  • the force depending on the length of the age target sequence such as “high homology” is, for example, 50% or more, further 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and specific. It may be at least 95%, particularly preferably at least 97%.
  • the “equivalent nucleotide sequence” may be, for example, one that hybridizes with a sequence having a problem under stringent conditions.
  • nucleic acids can also be obtained by DNA synthesis. The fragments may be chemically synthesized and linked together by enzymes. In the present specification, the obtained nucleic acid (including DNA) such as a PCR product is usually subjected to 1 to agarose gel electrophoresis, cut out from the gel as a specific band, for example, ene clean kit (Bio 101) or the like. Extract using a commercially available extraction kit.
  • the extracted DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, purified if necessary, and further, if necessary, phosphorylated at the 5 'end with T4 polynucleotide kinase or the like, and then pUC vector such as pUC18. Ligate to a suitable plasmid vector, such as one, and transform a suitable competent cell.
  • p-Direct C1 ontech
  • pCR-Script TM SK (+) (Stratagene)
  • GEM-T Promega
  • pAmp TM Gibco-BRL
  • a commercially available plasmid vector can be used.
  • phage vector For transformation of host cells, for example, use of phage vector, calcium method, rubidium / calcium method, calcium / manganese method, high-efficiency TFB, FSB freezing cell method, rapid colony method
  • the method can be performed by a method known in the art such as electroporation or a method substantially similar thereto (D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557, 1983, etc.).
  • 3 ⁇ 4ife- ⁇ PCR polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • MCE is described in, for example, M, A. Innis et al. Ed., "PCR Protocols" (MA Frohman, "a guide to methods and applications"), pp. 28-38, Academic Press, New York (1990). And the like.
  • the DNA can be cloned as required, and for example, plasmid, sphage, cosmid, P1 phage, F factor, YAC and the like can be used.
  • sphage For example, Charon 4A, Charon 21A, AgtlO, gtl DASHI K S FIXI I, A EMBL3, ⁇ ⁇ ⁇ TM (Stratagene) and the like can be used.
  • the obtained DNA is transformed into a suitable vector as described in detail below, for example, a vector such as plasmid pEX, pMAMneo, pKG5, etc., into a suitable host as described in detail below.
  • Cells for example, E.
  • the DNA fragment may be used as it is or as a DNA fragment to which an appropriate control sequence has been added, or may be inserted into an appropriate vector, and then introduced into an animal to express a transgene expressing a predetermined gene.
  • a transgenic animal can be prepared by introducing the DNA fragment into a fertilized egg of an animal such as a mouse.
  • the confirmation of the predetermined gene product can be carried out using an animal packet suitable for the transfection of the gene, such as 293T cells and COS-1 cells.
  • a method for introducing a gene into an animal cell such as a mammal can be carried out by a method known in the art or a method substantially similar thereto.
  • the cane phosphate method for example, FL Graham et al.) al., Virology, 52: 456, 1973
  • DEAE-dextran method eg, D. Warden et al., J. Gen. Virol., 3: 371, 1968
  • electroporation method eg, E. Neumann et al., ⁇ J, 1: 841, 1982
  • microinjection method eg, ribosome method, virus infection method, phage particle method, and the like.
  • plasmids there are 5 types of host cells commonly used in engineering (eg, prokaryotic host cells such as E. coli, Bacillus subtilis, etc., eukaryotic host cells such as yeast, 293T cell, CH0 cell, COS cell, etc. Any plasmid that can express the DNA force in insect cell host such as Sf21 may be used.
  • prokaryotic host cells such as E. coli, Bacillus subtilis, etc.
  • eukaryotic host cells such as yeast, 293T cell, CH0 cell, COS cell, etc.
  • Any plasmid that can express the DNA force in insect cell host such as Sf21 may be used.
  • a modified gene suitable for expression in the selected host It can contain a codon force, a restriction enzyme site can be provided, and control sequences and facilitating sequences for facilitating the expression of the target gene.
  • Sequences useful for binding such as linkers and adapters, as well as controlling material resistance, metabolism, and selection (including those encoding hybrid proteins and fusion proteins) ) It can be powerful.
  • an appropriate promoter for example, a plasmid using Escherichia coli as a host, includes tryptophan promoter (trp), lactose promoter (lac), tryptophan 'lactose promoter (tac), lipoprotein promoter (lpp). ), the Sufaji P L promoter, First, the bra Sumi de an animal cell is used as the host, SV40 late promoter, MMTV LTR promoter, RSV LTR promoter one coater, CMV promoter mono-, the SRa promoter, the yeast as a host plasmid For example, the GALK GAL10 promoter may be used.
  • control systems such as CYC1, HIS3, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TP1, and A0X1 can also be used.
  • An enhancer can be inserted into the vector to promote transcription of the DNA encoding the desired polypeptide, and such enhancers act on the motor to promote transcription. Elements having a cis action of usually about 10 to 100 bp. It is known from many mammalian genes such as Enhansa globin, elastase, albumin, a-fetoprotein, and insulin.
  • cell-infectious viruses such as SV40 enhancer (100-270 bp) in the rate region of the replication origin, and the enhancer of the early cytomegalovirus promoter. 1, Enhansa in the late shell of the polio replication origin, Enhansa of the adenovirus, and the like. If necessary, a signal rooster B ⁇ ij suitable for the host can be added, and these can be those well known to those skilled in the art.
  • Plasmid vectors suitable for expression in E. coli include, for example, pAS, pI (K223 (Pharmacia), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B (Invitrogen), etc.
  • Plasmids include, for example, SV40 vector, poliovirus, virus vector, vaccinia virus vector, retrovirus vector, etc. Specifically, pcD, pcD-SRa, CDM8, pCBV4, pB18S, PBC12BI, pSG5 (Stratagene), etc. Examples of plasmids using yeast as a host include Yip type vector, YEp type vector, YRp type vector, YCp type vector, and the like. For example, pGPD-2, etc.
  • Examples of the host cell include those derived from a bacterium of which the host cell is a free bacterium, for example, a strain derived from the K12 strain, for example, 533, XL1-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5, DH10B, thigh 01, MC1061, JM109, STBL2, B834
  • Examples of strain origin include BL21 (DE3) pLysS etc.
  • Yado Soda is a yeast 3 ⁇ 4.
  • Inner cells ⁇ 1 spores are i ⁇ ⁇ of animal cells, such as COS-7 cells, COS-1 cells, CV-1 cells derived from African green monkey fibroblasts, and human kidney cells 293 Cells, human cell lines * A4 31 cells, human colon-derived 205 cells, mouse blastoma-derived COP cells, MOP cells, W0P cells, Chinese hamster cell-derived CH0 cells, CH0 DHFR-cells, and human HeLa Cells, C127 cells derived from mouse cells, NIH 3T3 cells derived from mouse cells, mouse L cells, 9BHK, HL-60, U937, HaK, Jurkat cells, other transformed cell lines, normal diploid cells Invito mouth is derived from primary culture paper weave Cell strains and the like.
  • animal cells such as COS-7 cells, COS-1 cells, CV-1 cells derived from African green monkey fibroblasts, and human kidney cells 293 Cells, human cell lines * A4 31 cells, human colon-derived 205 cells, mouse blastoma-derived
  • Insect cells include Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and its derivatives or other appropriate ones, and Spodoptera frugiperda (caterpi l lar), Aedes aegyp ti (mosqui to) , Aedes albopictus (mosqui to), Drosophi la melangaster (frui tf ly), silkworm larvae or cultured silkworm cells, such as BM-N cells (Eg, Luckow et al, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988); Setlow, JK et al. (Eds.), Genetic Engineering, Vol. 8, pp.
  • Restriction enzymes include, for example, RJ Roberts, Nucleic Acids Res., 13: rl65, 1985; S. Linn et al. Ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982.
  • RJ Roberts, D. Mace is, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991 and the like.
  • a transformant transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding a polypeptide (or protein) can be repeatedly cloned using an appropriate selection marker if necessary. Therefore, it is possible to obtain a cell line stably having a high expression ability.
  • the dhfr preference was used as a selection marker, and cultivation was carried out by gradually increasing the TX concentration to select a resistant strain. Amplifying the DM encoding the polypeptide of the present invention, and obtaining a cell line that can obtain higher expression.
  • the transformant of the present invention can be cultured under conditions in which a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention can be expressed to produce and accumulate the desired product.
  • the transformant can be cultured in a medium commonly used in this field.
  • a transformant using a prokaryotic host such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, or a yeast as a host can suitably use a liquid medium.
  • the medium contains a carbon source, a nitrogen source, no shelves and others necessary for the growth of the transformant.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitric acid: ⁇ , corn chip liqueur, peptone, casein, meat extract, and malt.
  • Inorganic or fragile substances such as extracts, soybean meal, potato extract, etc., include, for example, canolesum chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, calcium carbonate and the like.
  • yeast vitamins, casamino acids, growth promoting factors and the like may be added.
  • a drug such as 3 / 3-indolinoleacrinoleic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the pH of the ground is about 5 to about 8 force.
  • cultivation of Escherichia coli is usually carried out at about 15 to about 45 ° C for about 3 to about 75 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • a MEM medium containing about 5 to about 20% fetal bovine serum, PR1640 ⁇ ground, DMEM medium and the like are used as a medium.
  • the pH is from about 6 to about 8.
  • Culture is usually performed at about 30 to about 40 ° C for about 15 to about 72 hours. Aeration and stirring are added as necessary.
  • Transformants that express a given product can be used as they are, but they can also be used as their cell homogenates, but a given gene product can be isolated and used.
  • the cells or cells are collected by known methods after culture, suspended in an appropriate buffer, and sonicated, lysozyme and / or freeze-thaw, etc. After the cells are destroyed, a method of obtaining a crude extract by centrifugation or filtration can be used.
  • Some buffers include protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride, and Triton X-100 (trade name).
  • Surfactants such as Zwien-20 (trade name) may be added.
  • the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • the target substance contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods, such as the ammonium sulfate precipitation method.
  • Salt filtration gel filtration by Sephadex, etc., for example, a methylaminoethyl group, ion exchange chromatography using a carrier having a carboxymethyl group, etc., for example, butyl group, octyl group, A carrier with hydrophobic 3 ⁇ 4S such as phenyl group is used.
  • purification and separation can be carried out by polyacrylamide gel electrophoresis, affinity 1 'chromatography with immobilized ligands and the like.
  • gelatin-agarose-affinity chromatography, heparin-agarose-chromatography and the like can be mentioned.
  • the resulting protein (including peptides or polypeptides) is then immobilized by binding it to a suitable carrier or solid phase by known methods such as enzyme immunoassay. You can be powerful.
  • the solid-phased protein and solid-phased peptide can be conveniently used for screening of binding substances.
  • the related proteins disclosed herein, fragments thereof, and nucleic acids (including mRNA oligonucleotides), including DNA can also be used in reticulum or organically, and further using antisense technology, It can be applied to genomics and proteomics technology in combination with antibodies, including monoclonal antibodies, and transgenic animals.
  • RNAi RNA interference
  • dsRNA strand RNA
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • protein arrays 3 ⁇ 4Existing rice cake loaf, relic 5? Functional analysis, protein-protein interaction analysis, related gene ! It becomes possible to make a loaf.
  • a cDNA library is used, or the DNA obtained by the PCR technology is placed at a high density using a spotting device based on the DNA obtained by the PCR technology, and the sample is analyzed using a hybridization.
  • the arraying is performed by using a needle or a pin, or by using an ink jet printing technique or the like, by attaching DNA to a unique position on a substrate such as a slide glass, a silicon plate, or a plastic plate with a strong force of DNA. I can do it.
  • Data is obtained by observing a signal obtained as a result of hybridization on the nucleic acid array.
  • the signal is a label such as a fluorescent dye (eg, For example, it may be obtained from Cy3, Cy5, BODIPY, FITC, Alexa Fluor dyes (trade name), Texas red (trade name), etc.
  • a laser-scanner may be used for the detection, and the obtained data may be processed by a computer system equipped with a program according to an appropriate algorithm.
  • the protein array technology may utilize tagged recombinant expressed protein products, such as two-dimensional electrophoresis (2-DE), mass spectrometry (MS) including enzyme digestion fragments (MS) ( This includes techniques such as electrospray ionization (ESI), matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI), and other techniques such as MALDI-T0F analyzers.
  • ESI electrospray ionization
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • MALDI-T0F analyzers such as MALDI-T0F analyzers.
  • ESI triple quadrupole analyzer, ES toion trap analyzer, etc. may be used), staining technology, isotope labeling and analysis, image processing technology, etc. can be used. Therefore, the present invention may include the above-described p30 and its related analogs, and the like, and software and databases related to antibodies thereto.
  • a predetermined DNA for example, DNA encoding p30 or Rapl
  • it is generally used as a DNA fragment or by binding the DNA downstream of a promoter capable of expressing the DNA in animal cells.
  • the DNA is introduced into a mouse: ⁇ , a gene construct linked to the downstream of one of various promoters capable of expressing the DNA derived from an animal having a high homology to animal cells in a fertilized egg of a target animal, for example.
  • the mouse is not particularly limited to a pure mouse, for example, C57BL / 6, Balb / C, C3H, (BDF,) and the like.
  • a promoter for example, a virus-derived promoter, a ubiquitous expression promoter such as metamouth thionein, or the like can be preferably used.
  • the DNA is introduced: ⁇ , the recombinant fermentation can be carried out using the recombinant retrovirus.
  • ⁇ Preferably, the mouse fertilized egg into which the human DNA has been introduced may be, for example, a foster mouse such as ICR. It can be used to grow.
  • the DNA at the fertilized egg cell stage (for example, DN encoding p30 or Rapl)
  • the metastasis of A) is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of DNA power that encodes the protein in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that the offspring of the produced animal have DNA encoding the protein in all of its germ cells and somatic cells. means. Progeny of such animals that have inherited the gene have the potential to express the protein in all of their germinal and somatic cells. After confirming that the DNA-transferred animal stably retains the gene by mating, the animal can be reared in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal.
  • Homozygous animals having the transfected fei on both homologous chromosomes are obtained by breeding male animals, and all are bred by breeding this fiber animal. Offspring can be propagated to carry the DNA.
  • the animal guided by the DNA has high expression of the protein and is useful as an animal for screening (inhibitor) against the protein and the protein. Further, it is useful as an antisense oligonucleotide capable of inhibiting the expression of the gene, for example, an animal for screening antisense DNA or the like.
  • the transgenic animal can also be used as a cell source for tissue culture.
  • ⁇ 30 Cells of the fiber producing the protein are cultured by standard tissue culture techniques, and these cells are used to produce, for example, vascular cells such as brain, thymus, intravascular cells, blood cells, testis, brain, intestine, kidney and others. Thread! ⁇ Functions of cells derived from tissue can be studied. By using the cells, it is also possible to contribute to the development of a drug that enhances the functions of various tissues, for example. If there is a high expression cell line, the protein can be isolated and purified therefrom.
  • antibody may be used in a broad sense, and may be a monoclonal antibody against the P30 protein, its constituent polypeptides and related peptide fragments as desired by Toji J A single antibody or an antibody composition having specificity for various epitopes, and further includes a monovalent antibody or a multivalent antibody, and a polyclonal antibody and a monoclonal antibody. It also refers to native (intact) molecules and fragments and fragments thereof, including fragments such as F (ab ') 2 , Fab' and Fab, plus at least two antigens or epitopes.
  • Chimeric or hybrid antibodies having the ⁇ position, or bispecific recombinant antibodies such as, for example, quadromes and triomes, interspecific hybrid antibodies, anti-idiotypic antibodies
  • Antibodies obtained using the conventional techniques known in the art such as antibodies obtained using antibodies, or antibodies prepared using DNA recombination techniques, target antigenic substances or target epitopes as described and defined herein. For example, antibodies that have neutralizing properties or antibodies that have binding properties may be included.
  • Particularly preferred antibodies of the present invention include those capable of specifically modulating a polypeptide selected from the N-terminal region of P30.
  • Monoclonal antibodies produced against the antigenic substance can be produced using any method that allows the production of antibody molecules to be controlled by a series of cell lines during culture. Shushoku Go Monoclonal refers to the character of a lie antibody when it is obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and the antibody must be produced by any specific method. Do not assume that there is.
  • Each monoclonal antibody contains a population of antibodies that are identical except that there may be small amounts of variants that may occur naturally.
  • Monochrome nanore Antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site.
  • each monoclonal antibody In contrast to a conventional (polyclonal) antibody preparation, which typically contains a variety of antibodies directed against different antigenic determinants (epitopes), each monoclonal antibody is It is directed against a single antigenic determinant on the original. In addition to their specificity, monoclonal antibodies are also excellent in that they are synthesized by fermentation, and are free or low in 3-1 of other immunoglobulins. Monoclonal antibodies include hybrid antibodies and recombinant antibodies. They replace the variable region domain with a constant region domain, replace the light chain with a heavy chain, or replace certain chains, regardless of their origin or immunoglobulin class I subclass, as long as they exhibit the desired biological activity.
  • Suitable methods for producing monoclonal antibodies include the hybridoma method (G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp. 95-497 (1975)); the human B cell hybridoma method (Kozbor et al. al., Immunology Today, 4, pp. 72-79 (1983); Kozbor,
  • antibodies derived from the species A force that is the same or homologous to the corresponding sequence of the antibody belonging to the class or subclass, while the remainder of the chain corresponds to the corresponding sequence of the antibody derived from another species or belonging to another antibody class or subclass.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used for cell fusion techniques using myeoma cells (eg, G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp. 495-497 (1975)).
  • the antibody may be a monoclonal antibody obtained by using the following method. For example, it can be produced by the following steps.
  • the ability to use the isolated P30 polypeptide or a fragment derived therefrom can be used.
  • the determined amino acid sequence of the p30 protein can be used as the antigen. Based on this, it is possible to chemically synthesize appropriate oligopeptides and use them as antigens.
  • a peptide having at least five intermittent amino acids among the amino acid residues present in FIG. 1 is mentioned. For example, selecting an appropriate portion from a specific sequence, for example, an amino acid sequence on the terminal side or the like can be mentioned.
  • the antigen may be used in the form of a strong conjugate which can be used to immunize animals by mixing it with an appropriate adjuvant as it is;
  • the antigen used as the immunogen is a fragment obtained by fragmenting the protein, or a characteristic sequence region selected based on the amino acid sequence, and a synthetic polypeptide obtained by designing and chemically synthesizing the polypeptide. It may be a fragment.
  • the fragment can be bound to various carrier proteins via an appropriate condensing agent to form an immunogenic conjugant such as peptide protein, which can be used to react with only a specific sequence. It can also be used to design monoclonal antibodies (or recognize only specific sequences).
  • a cysteine residue or the like can be added to the polypeptide to be designed in advance so that the immunogenic conjugate can be prepared at a reasonable price.
  • the carrier proteins Upon binding to carrier proteins, the carrier proteins can first be activated.
  • the ability to introduce an activating linking group in such activation is mentioned.
  • the activated linking group include (1) an activated ester or an activated carboxyl group, for example, a nitrophenyl ester group, a pentafluorophenyl ester group, a tribenzotriazole ester group, an N-succinimide ester group, (2)
  • An activated dithio group for example, a 2-pyridyldithio group.
  • carrier proteins include keyhole 'limpet' hemocyanin (KLH :), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, polypeptides such as glopurine and polylysine, and bacterial cell components such as BCG.
  • KLH keyhole 'limpet' hemocyanin
  • BSA bovine serum albumin
  • ovalbumin polypeptides such as glopurine and polylysine
  • bacterial cell components such as BCG.
  • Immunization can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, Shigeru Muramatsu, et al., Experimental Biology ⁇ ! Maru 14, Immunology, Maruzen Co., Ltd., 1985, Ed. Experimental Lecture 5 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the immunizing agent and the adjuvant or adjuvant are administered to a mammal multiple times by subcutaneous thigh or intracavity incision.
  • the immunizing agent include those containing the above antigen peptide or its related peptide fragment.
  • the immunizing agent is a protein known to be immune in the mammal being immunized
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG, Lipid KA, Liposomal, aluminum hydroxide, silica, and the like. Immunization is performed using mice, such as BALB / c, hamsters, or other suitable animals.
  • the dose of the antigen is, for example, about 1 to about 400 ⁇ g / animal for the mouse, which is generally measured in the host animal's shiki or subcutaneously, and thereafter every 1 to 4 weeks, preferably 1 to 2 Booster immunizations are performed 2 to 10 times weekly, subcutaneously, subcutaneously, intravenously or intramuscularly.
  • the immunizing mouse may be a BALB / c mouse or an F1 mouse of a BALB / c mouse and another mouse. If necessary, an antibody titer can be prepared and the antibody titer can be measured to confirm the animal immunity.
  • the antibody of the present invention may be obtained from the immunized animal obtained as described above, and includes, for example, purified antibodies, polyclonal antibodies, and the like.
  • the infinitely proliferative strain (® ⁇ cell strain) used for cell fusion can be selected from cell lines that do not produce immunoglobulin.
  • P3-NS-1-Ag4-1 NS-1, Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976
  • SP-2 / 0-Agl4 SP-2, Nature, 276: 269-270, 1978
  • P3-X63-Ag8 derived from mouse myeloma MOPC-21 cell line -Ul (P3U1, C urr. topics Microbiol.
  • the 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line is prepared by adding a substance such as penicillin or amikacin, fetal calf serum (FCS), etc. to cells such as Dulbecco's MEM ⁇ medium (DMEM medium) and RPMI-1640 medium.
  • An animal for example, a mouse immunized according to the above step 2 is excised from 2 to 5 days after the final immunization, and then a spleen cell suspension is obtained.
  • lymph node cells from various parts of the body can be obtained and used for cell fusion.
  • the thus obtained spleen cell suspension and the myeloma cell line obtained according to the above step 3 are placed in a cell medium such as a minimum essential medium (MEM ⁇ : 1), DMEM medium, RPMI-1640 medium and the like.
  • a cell fusion agent such as polyethylene glycol is added. Other cell fusion agents known in the art can be used.
  • cell fusion agents include inactivated Sendai virus (HVJ: Hemagglutinating Virus of Japan).
  • HVJ Hemagglutinating Virus of Japan
  • 0.5 to 2 ml of, for example, 30 to 60% of polyethylene glycol can be added, and polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 8,000 can be used strongly. 4,000 polyethylene glycols are more preferred.
  • concentration of polyethylene glycol in the fusion medium be, for example, 30-60%.
  • a small amount of dimethyl sulfoxide for example, can be used to promote fusion.
  • the ratio of spleen cells (lymphocytes) to be transformed into a myeloma cell line is, for example, from 1: 1 to 20: 1. ⁇ Forced force, more preferably 4: 1 to 7: 1. "it can.
  • the selection medium examples include a medium such as MEM medium containing FCS and RPMI-1640 medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine, so-called HAT ⁇ medium.
  • the method of replacing the selective medium is generally the same as the volume dispensed to the culture plate, added to the next day, and then replaced every half day in HAT ⁇ ground every 1 to 3 days. «: This can be done with some modifications.
  • the aminopterin is removed, and the medium can be replaced with a so-called HT medium every 1 to 4 days.
  • a feeder for example, mouse thymocytes may be used, which is preferred: ⁇ .
  • the ability of the hybridoma to grow and the culture supernatant of the culture medium can be analyzed using a measurement system such as radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or fluorescent immunoassay (FIA), or a fluorescence-inducing cell assay.
  • a measurement system such as radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or fluorescent immunoassay (FIA), or a fluorescence-inducing cell assay.
  • Screening is performed by using a predetermined fragment peptide as an antigen with a Philips device (FACS) or the like, or by measuring a target antibody using a labeled anti-mouse antibody.
  • Cloning can be achieved by the ability to pick up colonies in an agar medium, or by limiting dilution. It can be performed more preferably by the limiting dilution method. Cloning can be performed multiple times.
  • the obtained hybridoma strain is cultured in an appropriate growth medium such as MEM medium containing FCS or RPMI-1640 ⁇ ground, and the culture medium is used to obtain the desired monoclonal antibody from the culture medium. I can do it.
  • an appropriate growth medium such as MEM medium containing FCS or RPMI-1640 ⁇ ground
  • the culture medium is used to obtain the desired monoclonal antibody from the culture medium. I can do it.
  • Each hybridoma is transplanted into the transmigration of an animal derived from the myeoma cell line and / or a tissue-compatible animal. Transplanted, allowed to sprout, and produced in 13 ⁇ 41 ascites It can be obtained by collecting oral antibodies.
  • the animal can administer a mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) into the airplane.
  • the ascites fluid may be used as it is or by a conventionally known method, for example, salt filtration such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using Sephadex, etc., ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, It can be purified by T-chromatography and high-performance liquid chromatography and used as a monoclonal antibody.
  • the ascites containing the monoclonal antibody can be purified and separated by fractionating with ammonium sulfate and then treating it with an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose and an affinity column such as a protein column.
  • affinity chromatography in which an antigen or an antigen fragment (eg, a synthetic peptide, a recombinant antigen protein or peptide, a site specifically recognized by an antibody) is immobilized, and protein A is immobilized.
  • an antigen or an antigen fragment eg, a synthetic peptide, a recombinant antigen protein or peptide, a site specifically recognized by an antibody
  • protein A is immobilized.
  • transgenic mice or other organisms such as other mammals, can be used to express antibodies, such as humanized antibodies, to the immunized polypeptide products of the present invention.
  • nucleic acid sequence encoding an antibody obtained from a hybridoma strain is isolated by a conventional method, for example, using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the heavy chain of a mouse antibody or a gene encoding a light chain. (J can be determined. Once isolated, the DNA is put into an expression vector as described above, and CH0,
  • the DNA can be placed in a host cell such as COS.
  • the DNA can be modified by, for example, substituting a human heavy or light chain constant region domain with a coding sequence instead of a homogenous mouse sequence (Morrison et al. , Proc. Natl.
  • Antibodies can also be modified, such as by preparing chimeric or hybrid antibodies, by applying chemical protein synthesis, including the use of the following condensing agents. Humanized antibodies are capable of being performed using techniques known in the art (eg,
  • Human monoclonal antibodies can also be obtained by techniques known in the art.Human myeloma cells / human / mouse heteromyeloma cells for producing human monoclonal antibodies are known in the art. (Kozbor, J. Immunol., 133, pp. 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Technologies and Applications, pp.
  • Antibodies can be tested in any of the known methods, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp). 147-158 (CRC Press, Inc., 1987) Any method known in the art can be used to conjugate antibodies to detectable groups, for example, David et al. , Biochemistry, 13, 1014-1021 (1974); Pain et al, J. Immunol. Meth., 40: pp. 219-231 (1981); and "Methods in Enzymology", Vol. 184 pp. 138-. 163 (1990), etc.
  • an IgG fraction As the antibody to be labeled, an IgG fraction, and further, specific binding ⁇ Fab 'obtained by reducing after reducing pepsin are used.
  • these 3 ⁇ 4 ⁇ labeled substances include enzymes (peroxidase, alkali) Phosphatases or yS-D-galactosidases), diagenetic substances, fluorescent substances, and radioisotopes.
  • Detection and measurement in the present invention can be carried out by immunostaining, for example, fiber staining, cell staining, atsay, for example, competitive or noncompetitive immunoassay, and radioimmunoassay, ELISA, etc. Can be used to perform the BF separation or to perform the measurement without it.
  • a radioimmunoassay and an enzyme immunoassay and further include a sandwich type assay.
  • sandwich-type assay one is an antibody against the protein of the present invention and its related peptide fragment, the is an antibody against the N-terminal residue of the protein, and the other is detectably labeled.
  • Another antibody that can recognize the same antigen is immobilized on the solid phase. Incubate the sample to allow the labeled antibody and solid-phased antibody to react sequentially if necessary. Separate the unbound antibody here and measure the label. The amount of label measured is proportional to the amount of antigen, ie, the polypeptide fragment antigen.
  • this assay it is called a simultaneous sandwich type assay, a forward sandwich type assay, or a reverse sandwich type assay according to the order of addition of an insolubilized antibody or a labeled antibody. For example, washing, shaking, shaking, filtration, or pre-extraction of antigens, etc. are used in these procedures under certain circumstances.
  • Other measurements such as the specific concentration of the buffer, the concentration of the buffer solution, or the incubation time, can be varied according to factors such as the concentration of the antigen in the sample and the properties of the sample.
  • Many carriers capable of immobilizing an antigen or antibody are known, and in the present invention, they can be appropriately selected and used therefrom.
  • the carrier various types of carriers which are ⁇ M in the antibody reaction or the like are known, and in the present invention, of course, those known ones can be selected and used. Particularly preferably used are, for example, glass, for example, inorganic materials such as active glass, porous glass, silica gel, silica mono-alumina, alumina, magnetized iron, and magnetic alloy, polyethylene, polypropylene, and poly.
  • glass for example, inorganic materials such as active glass, porous glass, silica gel, silica mono-alumina, alumina, magnetized iron, and magnetic alloy, polyethylene, polypropylene, and poly.
  • PVC Nyl polyvinylidene fluoride, polyvinyl acetate, polymethacrylate, polystyrene styrene-butadiene copolymer, polyacrylamide, cross-linked polyacrylamide, styrene-methacrylate copolymer, polyglycidyl methacrylate, acrolein-ethylene glycol Mono- or methacrylate copolymers, such as cross-linked albumin, collagen, gelatin, dextran, lygarose, cross-linked agarose, cellulose, microcrystalline cellulose, carboxymethyl cellulose, cellulose acetate, etc., natural or denatured cellulose, cross-linked dextran, nylon, etc.
  • High quality organic materials such as polyamides, polyurethanes and polyepoxy resins, and those obtained by emulsion polymerization of them, cells, erythrocytes, etc. Like force that are introduced with a functional group in such coupling agents.
  • filter paper, beads, the inner wall of the test container for example, test tubes, cells made of synthetic materials such as titer plates, titer cells, glass cells, synthetic resin cells, glass rods, rods made of synthetic material, and ends
  • a solid material such as a stick that is thickened or thinned, a stick with a round or projection at its end, or a stick with a flat projection, or a stick that is shaped like an acknowledgment.
  • An antibody can be bound to these carriers, and preferably, a monoclonal antibody that specifically reacts with the antibody obtained in the present invention can be bound thereto.
  • the binding between the carrier and those involved in the antigen-antibody reaction can be performed by physical methods such as adsorption, chemical methods using a condensing agent, activated substances, or the like. It can be performed by a method that uses the chemical bonding reaction of
  • Labels include enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, prostheses, coenzymes, enzyme precursors, apoenzymes, fluorescent substances, coloring substances, chemiluminescent compounds, luminescent substances, coloring substances, magnetic substances, metal particles, for example. Radioactive materials such as gold colloid can be mentioned.
  • enzymes include oxidoreductases such as SfeK enzyme, reductase, and oxidase.
  • Yoshii a hydrolytic enzyme that hydrolyzes glycoside bonds, ether bonds, peptide bonds, etc., lyase, iso Melase, ligase, etc. can be mentioned.
  • the enzyme can be used for detection by using a plurality of enzymes in combination. For example, you can use a modest cycling.
  • the standard ⁇ ) 3 ⁇ 4 isotopes typical person M dimensions substance, [3 2 ⁇ ], [ 1 2 5 ⁇ ], [1 3, ⁇ ],
  • Representative enzyme labels include peroxidases such as horseradish peroxidase.
  • -Galactosidase such as E. coli 3-D-galactosidase, maleate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, darcosoxidase, glucoamylase, acetylcholinesterase, catalase, (4) Pancreatic phosphatase such as small intestine alfa lipophosphatase and Escherichia coli alba lipophosphatase.
  • phospholipases such as: lf ⁇ , 4-methylphenylphosphoric acid, etc., phosphorylation phenotypes, such as dinitrophenylphosphonate, etc. It can be measured by the generated light, luminescence, etc., using a substrate such as a DNA probe, an enzymatic cycling system using NADP, a luciferin derivative, or a dioxetane probe. Noreciferin and luciferase systems can also be used. Since it reacts with hydrogen peroxide using hydrogen peroxide to generate oxygen, the oxygen can also be drained at an electrode or the like.
  • the electrode may be a glass electrode, an ion electrode using a hardly soluble metal, a compact electrode, a polymer membrane electrode, or the like.
  • the enzyme label can be replaced with a biotin-labeled enzyme and enzyme-labeled avidin (streptavidin).
  • the sign can also indicate several different views. Such multiple measurements can be made fiber-wise, 'or non-consecutively, and simultaneously or separately.
  • a signal is formed by using 4-hydroxyphenylacetic acid, 1,2-phenylenediamine, tetramethinolebenzidine and the like, and horseradish peroxidase, campbelliferyl galactoside, nitrophenyl galactoside and the like.
  • Enzymes such as S-D-galactosidase, glucose-6-phosphate and dehydrogenase! ⁇ Combination
  • quinol compounds such as hydroquinone, hydroxybenzoquinone, and hydroxyanthraquinone, thiolyl conjugates such as lipoic acid and daltathione, phenol-inducing compounds, and ferrocene-inducing compounds can be formed by the action of enzymes and the like. With the use of power
  • fluorescent substance or the chemiluminescent compound examples include fluorescein salts, such as rhodamine B isothiosinate, and rhodamine inducers such as tetramethyl-l-damin isothiocyanate, dansyl chloride lid, dansyl noreoli ,, de, full-blown resamine, phycobiliprotein, acridinium salt, luminol such as lumifurin, noresiferase, and aequorin, imidazole, oxalate, rare ⁇ 11 chelate compound, coumarin reference, etc. Is mentioned.
  • Labeling can be carried out using a reaction between a thiol group and a maleimide group, a reaction between a pyridyl disulfide group and a thiol group, a reaction between an amino group and an aldehyde group, and the like.
  • a condensing agent that can be used for producing the above-described insoluble complex, a condensing agent that can be used for binding to a carrier, and the like can be used.
  • condensing agent examples include formaldehyde, glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, hexamethylene diisothiocyanate, ⁇ , ⁇ '-polymethylene bis-acetamide, ⁇ , ⁇ '-ethylene bismaleimide, ethylene glycol —Rubis succinimidyl succinate, bis diazobenzidine, tolethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, succinimidyl 3- (2-pyridyl dithio) probionet (SPDP), N-succinimidyl 4 -(N-maleimide methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-sulfosuccinimidyl 4--(N-maleimide methyl) cyclohexane-tricarboxylate, N-succinimidyl (4- (Acetyl acetyl) Amino benzoate, N-
  • a labeled antibody such as a monoclonal antibody in which a substance to be measured is labeled with an enzyme or the like can be sequentially reacted with an antibody bound to a carrier, or simultaneously. You can also. It depends on the type of carrier system selected.
  • sensitized plastic or other beads first transfer the labeled antibody, such as a monoclonal antibody labeled with an enzyme, to a suitable test tube together with a sample orchid containing the substance to be measured. Thereafter, the measurement can be performed by adding beads such as the sensitized plastic.
  • the force used in the immunoassay is a solid support such as polystyrene, polycarbonate, polypropylene or polyvinyl balls, microspheres, and microspheres that absorb proteins such as antibodies well.
  • a solid support such as polystyrene, polycarbonate, polypropylene or polyvinyl balls, microspheres, and microspheres that absorb proteins such as antibodies well.
  • Various materials and forms such as plates, sticks, fine particles or test tubes can be arbitrarily selected and selected.
  • the measurement can be performed in an appropriate buffer system so as to maintain the optimum pH, for example, about pH 4 to about 9.
  • buffers include, for example, acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, tris buffer, triethanolamine buffer, borate buffer, glycine buffer, carbonate buffer And Tris-HCl buffer. Buffers can be used by mixing them at any ratio.
  • the antigen-antibody reaction can be performed at i3 ⁇ 4g between about 0 and about 60 ° C.
  • Antibodies such as monoclonal antibodies labeled with enzymes, etc. and antibodies bound to carriers, and incubation of the substances to be measured can be performed until they reach The solid phase and the liquid phase can be separated and the reaction can be stopped after a limited incubation process at a time point earlier than when the ⁇ fi is achieved.
  • the ability to measure the presence of enzymes and other markers is powerful.
  • the measurement operation can be powerfully performed using an automated measurement device, and the display signal generated by the action of a substrate or nitrogen is converted using a luminescence detector, a photo detector, or the like. Detect and measure Can also be. Used in antigen-antibody reactions!
  • EDTA ethylenediaminetetraacetate
  • a blocking treatment commonly used in the art or known to those skilled in the art to prevent an unusual binding reaction for example, normal serum proteins from mammals, albumin, skim milk, milk fermentation Can be treated with substances, collagen, gelatin, etc. These methods are not particularly limited and can be used as long as the purpose is to prevent an unusual binding reaction.
  • any form of staying night, colloid separation, or a filler sample can be used.
  • a sample derived from a living organism for example, thymus, testis, intestine, kidney, brain , Breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, blood, serum, plasma, synovial fluid, cerebrospinal fluid, serum, bile fluid, saliva, amniotic fluid, urine, other body fluids, cell culture, tissue culture, thread And tissue biomodnates, biopsy samples, tissues, cells and the like.
  • a sample derived from a living organism for example, thymus, testis, intestine, kidney, brain , Breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, blood, serum, plasma, synovial fluid, cerebrospinal fluid, serum, bile fluid, saliva, amniotic fluid, urine, other body fluids, cell culture, tissue culture, thread And tissue biomodnates, biopsy samples, tissues, cells and the like.
  • Epitope mapping can also be performed using the anti-p30 antibody of the present invention (anti-human p30 antibody, anti-mouse p30 antibody, etc.), particularly a monoclonal antibody, and an antibody that recognizes each epitope can be used. For example, it can detect and measure the protein and its related peptide fragments.
  • the antibody particularly a monoclonal antibody, may be used to detect (0) detect a fragmentation or cell-related disorder, abnormality and / or disease caused by the p30-Rapl interaction, or (ii) detect the p30-Rapl 3S transformation, cell migration, invasion, migration and / or metastasis due to the interaction of p30-Rapl, or the possibility thereof, and (iii) migration of cells or cells involved in the p30-Rapl interaction.
  • Detect related disorders, abnormalities and Z or diseases or their potential (iv) measure the expression of the relevant p30 protein; (V) detect changes in the binding of activated Rapl to P30 And (vi) search for compounds that control the p30-Rapl binding, etc., and detect the activity of Z or (vii) the compounds that control the p30 protein production and Useful for Z or measurement. Answer, inflammation, angiogenesis, blood coagulation, healing, regenerative processes, carcinogenesis, cancer cell infiltration, metastasis, autoimmune processes, hematological processes, cell abnormalities, tissue abnormalities, rikkun It is expected that it can be used to determine the degree of mobility, invasiveness, chemotaxis and / or metastasis.
  • a method for detecting and / or measuring Z or measurement of the abnormal phenomena of a tissue, a cell or a protein by the protein can be used.
  • the compounds found by the screening method of the present invention have effects such as suppression of cytoplasm, suppression of cell migration, suppression of immunity, suppression of cytokine production, suppression of apoptosis occurrence, suppression of cell proliferation, and the like. Therefore, those compounds are anti-inflammatory, immune disease cure; ⁇ IJ However, it can be used as a cancer metastasis inhibitor.
  • the effects of these compounds can be confirmed by the following methods. They are not intended to limit, or to limit, the scope of the invention disclosed herein.
  • Test for pyloric ligation ulcer can be performed according to the description on page 249 of Reference 3.
  • Model preparation Rats (140 to 200 g) are fasted for 48 hours or 72 hours (free drinking), then open under anatomical anesthesia and ligated the pylorus. After closing the abdomen, put it under fasting.
  • Administration of the test substance Immediately after ligation of the pylorus, it is administered into the work space or into the duodenum.
  • Cleavage method 13 to 17 hours later, lethal under anesthesia, and fix the removed stomach with a 10% buffered formalin water scythe.
  • Rats' limbs are tied to a wire mesh, and cold water is applied to the lower sternum in an upright position.
  • test substance Intra-oral or oral administration 10 minutes before restraint in water.
  • Words ⁇ 1 method After completion of water immersion restraint, lethal under anesthesia, and perform in the same manner as in the above [1] (1) Hffi method.
  • Rats (22 to 230 g) are fasted for 24 hours, and then indomethacin (Sigma) 30 mg / kg is administered subcutaneously.
  • test substance Administer orally orally 10 minutes before indomethacin administration. Aspect: 8 hours after administration of indomethacin, the animal is sacrificed under anesthesia, and the procedure is performed in the same manner as in [1] (1).
  • Rats (Wistar male) are fasted for 24 hours and then subcutaneously administered with Cysteamine 300-400 mg / kg.
  • test substance Administer intraperitoneally or orally 10 minutes before administration of indomethacin.
  • Language 18 hours after cysteamine administration, the animals were sacrificed under anesthesia, and the above [1] (1)
  • Testing for ulcers due to sex substances can be performed according to the method described in Ref. 3, page 251.
  • Rats are fasted for 24 hours ⁇ After 7k, orally administer pure ethanol, 0.6N HCU 25% NaCl, 80mM St-succinic acid or high.
  • Administration of test substance Intra-oral administration or oral administration 30 minutes before administration of the active substance.
  • the test for acetic acid ulcer can be performed according to the method described in the preparation of a model on page 251 of Reference 3.
  • Animal model Rats are laparotomized under ether anesthesia and 0.04 to 0.06 ml of 20% acetic acid solution is injected submucosally at the border of the forestomach and glandular stomach.
  • Test substance Administer mouth by mouth for 14 days from the day after acetic acid injection.
  • Method 5 On the day after the last administration of the test substance, the animal is sacrificed under anesthesia, and the evaluation is performed in the same manner as in the evaluation method in [1] (1).
  • Test for ulcer size can be performed according to the method described in Reference 5.
  • Model preparation Rats are allowed to freely drink 3% DSS (dextran sodium sodium salt) aqueous solution for 11 days and then 1% DSS aqueous solution for 14 days.
  • DSS extract sodium sodium salt
  • Test substance administration Repeated oral administration once daily for 14 days during 1% DSS scythe administration o
  • the test for Crohn's disease can be performed according to the method described in Reference 6.
  • Rats are injected with TNBS (160 mg / kg in 50% ethanol) from the terminal ileum to produce small i ⁇ .
  • test substance Repeat oral administration once a day for 7 days after production of enteritis.
  • Appraisal method 7 days after the preparation of enteritis, the animals are sacrificed under anesthesia, and a histopathological examination (visual observation) is performed. In addition, formalin-fixed E-stained specimens are prepared (Ref. 44, p. 10), and pathological examination (microscopic observation) is performed. For each lesion found in both ⁇ ⁇ ⁇ , none: 0, minor: 0.5, mild: 1.0, moderate: 2.0, altitude: 3.0 After quantification, tabulate the numerical values for each group and compare between the test substance administration group and the non-administration group. To compare.
  • C0PD chronic obstructive collapse disease
  • Model construction Guinea pigs are exposed to commercial cigarettes for 30 minutes / day, 5 days / week for 4 weeks using cigarettes (INH06-CIGR01, Inc. I.P.S.).
  • Test substance administration Repeat oral administration once a day during the 4-week cigarette smoke exposure period.
  • ffi's method After termination of the administration period, the animals are sacrificed under anesthesia, and the lungs are subjected to histopathological examination (visual observation). In addition, formalin-fixed itHE-stained paper woven specimens are prepared (Ref. 19, page 10) and pathological examination (microscopic observation) is performed. For each disease observed in both tests, none was identified: 0, minor: 0.5, mild: 1.0, moderate: 2.0, and altitude: 3.0. After quantification, tabulate the values for each group and compare between the test substance administration group and the non-administration group.
  • Model preparation Mice (C57BL / 6N, early) 5 ⁇ 10 4 cells / 0.2 ml of B16 mouse melanoma cell suspension are administered to the tail vein.
  • test substance Repeated oral administration or intranasal administration from the day of B16 cell administration to 21 days later o
  • Advisory method B16 cells administered 21 days after administration, killed under anesthesia, and fixate the removed lungs in 10% of the formalin-water for overnight. Slice the fixed specimen and visually count the number of metastatic foci of B16 cells. The number of metastatic foci is compared between the test substance administration group and the non-administration group.
  • the test for epidermal dermatitis can be performed as described in reference 14.
  • mice (BALB / C) are actively sensitized by injecting DNP-OVA + Alum (Dini tropanol-Ovalbu min + Aluminum hydroxide gel) into the air. 14 days after sensitization Apply DNFB (Dini trofluorobenzene) to the auricle of the ear.
  • DNP-OVA + Alum Di tropanol-Ovalbu min + Aluminum hydroxide gel
  • Administration of test substance Repeated oral or intracavitary administration for three periods, from sensitization to challenge, from challenge to testing, or from sensitization to testing.
  • ⁇ iffi method Measure the thickness of the pinna at 1 hour, 24 hours and 8 days after induction. The pinna thickness is compared between the test substance-administered group and the non-administered group.
  • Tests for rhergolytic rhinitis can be performed as described on page 225 of Reference 2.
  • the test for asthma can be performed as described in reference 16.
  • Model preparation Guinea pigs (Hartley strain) are sensitized by intravenously injecting 0.5 ml OVA + Alum (10 i OVA + lOmgAlum) into Dayl and Dayl4.
  • Test substance administration The test substance is orally administered 14 days after the final sensitization.
  • Advisory method 30 minutes after administration of the test substance, 10 mg / kg pyrilamine (a histamine antagonist) is administered into the gut. Thirty minutes later, a 10 mg / ml OVA PBS (-) solution is inhaled for 10 minutes to elicit. Four hours after the induction of 0VA, 400 / g / ml of methacholine was inhaled for 1 minute, and Penh was measured as a ⁇ I resistance parameter using an unrestrained respiratory function angle system, and the test substance administration group and the non-administration group were measured. Compare between.
  • a rat was opened under anesthesia with ether, and the inferior vena cava was ligated.
  • the heart is excised by injecting and draining from the arterial vein, ligating the superior vena cava and pulmonary vein together, and removing the heart and storing it in Ringer's lactate.
  • incision is made in the skin of the right neck of the recipient rat, which is to be transplanted.
  • the right external jugular vein is dissected, and the stump is cuffed.
  • the right common carotid artery is dissected, and a cuff (body part 1.8 thigh, ridge, 0 / D 0.99 ridge) is attached to the stump.
  • the cuff attached to the common carotid artery of the recipient is inserted into the aorta of Dona heart, ligated, and the external jugular vein of the recipient and the pulmonary artery of the donor are similarly anastomosed. After stabilization of the pulsation, the skin is sutured to wrap the transplanted heart and awaken.
  • test substance Administer orally, intravenously, or intravenously once a day from the model preparation to the end of the test.
  • Nomenclature Palpation of the subcutaneously transplanted heart and the survival rate are compared between the test substance-treated group and the non-treated group.
  • the test for rheumatoid arthritis can be performed according to the method described in reference 18.
  • Preparation of model Mouse (DBA / lJNCrj) was homogenized with FCA (Freund Complete Adjuvant) and collagen (Type II collagen K-41, containing 3 mg / ml of bone joint-derived collagen). (5 mg / ml) is injected into the tail of the mouse at 0.1 ml.
  • Test substance administration Model preparation Repeat oral administration once a day from 1 week to 9 weeks later.
  • Dragon's method Arthritis score ⁇ Once a week, for all finger joints of the limbs, 13 or 1 finger without arthritis score after hearing or 14 or 1 finger with mild viscera (Measured in accordance with 16. Fire score.
  • the number of days of onset is defined as the number of days in which the score becomes 1 or more at the beginning of the arthritis score observation day. The arthritis score and the number of days of onset are compared between the test substance administration group and the non-administration group.
  • Table 1 shows the effect tests for the target diseases other than the above.
  • Table 1 Classification of disease, disease name and test method Classification Target disease name Reference number Anti-inflammatory agent or cancer metastasis inhibitor Subcutaneous edema 1
  • SIRS Systemic inflammatory response syndrome
  • the activity of the present invention is not limited to various medicines, for example, hearing agents (pile carcinoma agents), SS «translocation inhibitors, unrn si rmnm ⁇ mt analgesics, quenching and / or immunosuppression. It can be used in combination with an agent, and they can be used without limitation as long as they have an advantageous function, and for example, can be selected from those known in the art.
  • Parenteral dosage forms may include topical, transdermal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, or intraepithelial administration, but can also be administered directly to the affected area, including: It is also suitable for if ⁇ .
  • parenteral eg, intracellular, intratissue, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intrafemoral, intrathoracic, intraspinal, intravenous, intravenous, intrarectal, intraocular, rectal, ear, eyedrop or To the nose, teeth, skin and mucous membranes.
  • parenteral eg, intracellular, intratissue, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, intrafemoral, intrathoracic, intraspinal, intravenous, intravenous, intrarectal, intraocular, rectal, ear, eyedrop or To the nose, teeth, skin and mucous membranes.
  • preparations include Nada preparations, dispersion preparations, semi-solid preparations, granular preparations, translators, leaching preparations, and the like.For example, tablets, coated tablets, sugar-coated preparations, Pills, troches, hard capsules
  • Soft capsules microcapsules, powders, powders, powders, granules, fine granules, tablets, liquids, elixirs, emulsions, irrigants, syrups, solutions, emulsions, suspensions , Liniments, lotions, aerosols, sprays, inhalants, sprays, ointments, plasters, patches, pastes, cataplasms, creams, oils, suppositories (eg wm ⁇ ), tinctures , Skin solutions, eye drops, nasal drops, ear drops, liniments, infusions, powders for sizing, etc., Gashiyoshi desiccant, gel preparations and the like.
  • compositions can be formulated according to conventional methods. For example, if necessary, a physiologically acceptable carrier, a pharmaceutically acceptable carrier, an adjuvant ij, an mM excipient, a diluent, a flavoring agent, a flavoring agent, a sweetening agent, a vehicle, a preservative, and a stabilizing agent.
  • Agents binders, pH regulators, buffers, surfactants, bases, solvents, fillers, extenders, welding aids, solubilizers, isotonic agents, emulsifiers, emulsifiers, suspending agents, Dispersants, thickeners, gelling agents, curing agents, absorbents, adhesives, elastic agents, plasticizers, disintegrants, propellants, preservatives, antioxidants, sunscreens, humectants, emollients, antistatic And soothing agents are used in combination with insects or threads, and at the same time, by admixing the tannos of the present invention, and the like, the monotonada nada required for the generally accepted practice of preparations is obtained. It can be manufactured in a state.
  • Formulations suitable for parenteral administration include sterile sickles of active ingredients with water or other pharmaceutically acceptable media, or suspensions, such as test agents.
  • a carrier such as distilled water, Ringer's solution and menstrual solution, a suitable dispersing agent or wetting agent and a suspending agent are used, and the mixture is prepared by a method known in the art. Night, suspension, emma It is prepared in a form that can be nada like Rejon.
  • aqueous solution for measurement examples include physiological fluids, isotonic solutions containing glucose and other auxiliary agents (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and pharmacologically.
  • Acceptable suitable solubilizers such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, polysorbate)
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, , A human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • a carrier eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • an antioxidant such as ascorbic acid, an absorption promoter and the like.
  • the prepared one-dimensional liquid is usually filled into an appropriate ampoule.
  • a sterile pharmaceutically acceptable liquid such as water, ethanol or oil.
  • a sterile pharmaceutically acceptable liquid such as water, ethanol or oil.
  • oily vehicles or solvents used in pharmaceuticals include natural, synthetic, or semi-synthetic mono- or di- or triglycerides, natural, semi-synthetic or synthetic rechargeables, and fatty acids.
  • vegetable oils such as peanut oil, corn oil, soybean oil, sesame oil and the like can be mentioned.
  • this medicament can be prepared so as to normally contain the compound of the present invention in an amount of 0.1 to 10% gram MS.
  • Formulations suitable for topical, e.g., oral, or rectal use include, for example, mouthwashes, dentifrices, oral [ ⁇ , inhalants, ointments, dental fillers, coatings, dental pastes, ⁇ . Mouthwashes and other dental agents are prepared by a conventional method using a pharmacologically acceptable carrier.
  • a pharmacologically acceptable carrier As an oral spray or an inhalant, the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable inert carrier may be used. It can be dissolved in a squeezer or nebulizer or administered as fine powder for inhalation to teeth.
  • Ointments are prepared by conventional methods by adding commonly used bases, for example, ointment bases (white serine, paraffin, orifice oil, macrogol 400, macrogol ointment, etc.).
  • Chemicals for topical application to teeth and skin can be formulated into sickles or suspensions of appropriately sterilized water or nonaqueous release agents, for example, sodium bisulfite or edetic acid.
  • Preservatives including disinfecting and antifungal agents, such as buffering agents, such as Ninadium; phenylmercuric acetate or silver benzoate, benzalkonium chloride or Closhexyl hexidine; and thickening agents, such as Hypromel Rose.
  • Suppositories are carriers well known in the art, preferably non-irritating suitable excipients, such as polyethylene glycols, lanolin, lactic acid, fatty acid triglycerides, etc., preferably solid at room temperature.
  • the force field tube is prepared by a conventional method using a liquid that melts in a gas stream and releases the drug, etc., and is prepared by a conventional method.
  • the compound of the present invention is contained in an amount of about 0.1 to 95 dragon%. Is prepared.
  • the drug can be suspended or dissolved in the MJIU.
  • Formulations suitable for oral use include, for example, solid compositions such as tablets, pills, capsules, powders, granules, troches, and solutions such as solutions, syrups, and suspensions.
  • a formulation auxiliary known in the art and the like are used. Locks and pills can also be manufactured with enteric coating.
  • the preparation When the preparation is in the form of a capsule, it may further contain a liquid carrier such as a fat or oil in addition to the above-mentioned type of material.
  • a liquid carrier such as a fat or oil in addition to the above-mentioned type of material.
  • it is particularly useful to bind tanno, polyisocyanate Ji ⁇ , and polyethylene glycol (PEG), whose activities are extremely low in mammals, because their toxicity is extremely low. .
  • the binding of PEG has the effect of effectively reducing the heterogeneous compound's immunogenicity.
  • the compound may be provided in a microforced device.
  • Polymers such as PEG have amino terminal -Amino group of amino acid, ⁇ -amino group of lysine side chain, carboxyl group of aspartic acid or glutamic acid side chain, -carboxy group of carboxy terminal amino acid, or some residual asparagine, serine or threonine It can be easily attached to an activated primer of glycosino attached to the group.
  • PEG useful for reacting with an amino group of a protein include carboxylic acid, an active ester called carbonate, and in particular, a leaving group having N-hydroxysuccinimide, p-ditropanol, imidazole, or the like. Or trihydroxy-2-nitrobenzene benzene-4-sulfonate.
  • PEG containing an aminohydrazine or hydrazide group is useful for the reaction with aldehydes formed by periodate in proteins.
  • the nucleic acid such as the DNA of the present invention is used as a therapeutic and / or prophylactic agent as described above: ⁇ , the nucleic acid can be used in insects or used in the genetic and recombination techniques as described above. It can be used by binding it to an appropriate vector such as a retrovirus-derived vector such as a virus-derived vector.
  • the nucleic acid such as DMA of the present invention can be administered by a commonly known method, and may be used as it is or together with a suitable auxiliary agent or a physiologically acceptable carrier, for example, so as to promote intracellular penetration.
  • Pharmaceutical thread that can be formulated and used powerfully as described above! It can be administered as a product or a pharmaceutical preparation. Also, a method known as gene therapy can be applied.
  • the dose of the pirates of the present invention can be selected and administered over a wide range of doses.
  • the strength, the number of doses, and the number of doses are determined according to the treatment subject's Slj, age, body weight, general health condition, diet, administration time, and administration.
  • the method, release rate, drug combination, and the patient's treatment at that time may be determined according to the condition of the disease and other factors.
  • their additives and preparation methods are described in, for example, the Japanese Pharmacopoeia Committee, edited by the Japanese Pharmacopoeia, No. 14 IE, published on August 27, 2001. Shikikai-net: ⁇ Kawasho Shoten; Takashi Ichigase et al.
  • the activity of the present invention has a biological activity that controls (promotes or inhibits or inhibits) the interaction activity (eg, biological activity such as binding activity) between the P30 and Rapl.
  • the active ingredient of the present invention includes, for example, (a) the modified p30 protein, a mutant polypeptide thereof, a partial peptide thereof, a salt thereof, or the like; (b) DNA encoding the protein; (C) an antibody of the present invention, a partial fragment thereof (including a monoclonal antibody) or an inducer thereof, and (d) an antibody between the p30 and Rapl.
  • a compound or a salt thereof which has an advantageous effect on biological activity when controlling (promoting or suppressing or inhibiting) the interaction with a biological component resulting from the interaction of the compound is included.
  • the activity of the present invention is expected to be useful for controlling (promoting, inhibiting, and harming) changes in various tissues or cells caused by the interaction between the P30 and Rapl.
  • the active component is useful for controlling the expression of the ⁇ 30 or activated Rapl activity, and further controlling (promoting or inhibiting) inhibition of p30-Rapl binding.
  • Prevention of abnormalities and / or diseases is useful for treatment. It is also expected to be useful for, for example, controlling, for example, controlling, for example, migration, invasion, migration, and / or metastasis of S-severe cells associated with p30-Rapl binding.
  • the activity of the present invention is, for example, p30-Rapl binding blocking U is useful as an agent for treating inflammatory diseases, autoimmune diseases, suppression of rejection during organ transplantation, cancer, etc.
  • inflammatory diseases for example, gastric ulcer, duodenal ulcer, sudden sputum, bronchitis, ARDS (acute respiratory distress syndrome), C0PD (chronic obstruction 'city disease'), septic shock, M0F (multi-organ failure), SI
  • RS systemic inflammatory response disease
  • systemic lupus erythematosus mixed-type conjunctivitis
  • rheumatoid arthritis sigmoid disease
  • rheumatic fever Goodpastia's disease
  • Graves' disease Hashimoto's disease
  • Addison's disease autoimmune hemolytic anemia
  • idiopathic Transplant to treat purpura, myasthenia gravis, ulcerous large ⁇ , Crohn's disease, exchangeable ophthalmitis, multiple sclerosis, psoriasis, allergic rhinitis, asthma, etc. It is expected that it can be used for pretreatment, post-transplant administration, and further for suppressing carcinogenesis and metastasis.
  • the dose of the compound or a salt thereof (for example, the compound of the formula (D) or the like) which promotes or inhibits the interaction and / or binding between Rapl and p30 of the present invention depends on the target disease, target of administration, administration route and the like.
  • Ji ⁇ administered orally is administered at 10 g to 10 g / kg, preferably 100 zg to lg / kg, more preferably lmg to 100 mg / kg.
  • lg to lg / kg Preferably, it is administered at 10 ⁇ g to 100 mg / kg, more preferably at 100 g to 10 mg / kg, administered within the space: ⁇ is l / g to 10 g / kg, preferably 10 ⁇ g to lg / kg, More preferably, the dose is 100 to 100 mg / kg.
  • GST-Rapl a protein in which the N-terminal side of Rapl was fused with GSH (glutathione-S-transferase) was produced in Escherichia coli, and purified using a gnoretathion binding force ram. Further, a Myc-p30 gene having a Myc peptide added to the N-terminal side of p30 cDNA was transfected into COS cells to express p30; thus, a solubilized product was prepared.
  • GST-Rapl Since apl becomes activated when bound to GTP and becomes inactivated when bound to GDP, GST-Rapl is bound to GTPgS and GDPbS, respectively, and activated and inactivated types are prepared. It was mixed with a COS cell lysate containing p30. After inverting and mixing at 4 ° C for 2 hours, daltathione Itoyoshigo beads were added to recover GST-Rapl. Detection of myc-p30 bound to Rapl was performed by using an expanded yc mouse IgG2a antibody (Cell Signaling) as the primary antibody and HRP-labeled anti-mouse IgG (Sigma) as the secondary antibody.
  • IgG2a antibody Cell Signaling
  • HRP-labeled anti-mouse IgG Sigma
  • p30 specifically binds to activated Rapl. From the property of binding to activated Rapl, p30 was considered to be a molecule that functions with the activation of Rapl. Difficult case 2
  • RNA is extracted from brain, heart, lung, liver, kidney, and spleen, cDNA is synthesized, and p30 (P) and Norel (N) cDNA are synthesized by PCR Detected ( Figure 3A).
  • Glucose triphosphate flfcR enzyme G3PDH was used as a control for mRNA amount.
  • G3PDH Glucose triphosphate flfcR enzyme
  • p30 was found to be myeloid (HL60, U937), T lymphocyte (Jurkat, Molt4), and B lymphocyte (BaF3, A20, Nalm6), but not in melanocytic cells (B16).
  • Norel was not expressed in these cells, and expression was confirmed in melanoma cells (B16).
  • the undifferentiated myeloid cell line HL60 was also confirmed to have the ability to differentiate into neutrophils by retinoic acid treatment.
  • a monoclonal antibody was prepared to examine the expression of the P30 protein.
  • Mouse p30 cDNA was subcloned into pGEX vector (Amersham Pharmacia), and after introduction of E. coli (BL21), GST-mp30 in which GST was fused to the N-terminal of mp30 was produced. Guiding the off to BL21 LB ⁇ land 40 (grown at 30 ° C, IPTG and (0. 2 mM, Amersham Pharmacia) was added at which point 0D 6 .. 0. 5, and further 4 hours i ⁇ . Precipitate the precipitate by spinning 6 000 times, wash once with PBS, suspend with 5 ml of PBS, and output with an ultrasonic crusher (Tomisei, UD-200) 6, 4 times for 15 seconds.
  • the supernatant was bound to a glutathione column (Amersham Pharmacia), washed with 100 ml of PBS, eluted with glutathione (5 mM), and dialyzed against PBS to obtain a purified antigen.
  • MBP-hp30 fused with MBP maltose-binding protein was produced and purified in E. coli and used.
  • human p30 cDNA was subcloned into a pMAL vector (New England Biolabs) to prepare a fusion protein with maltose binding protein (pML Protein Fusion and Purification System, New England Biolabs).
  • MBP-hp30 (0.2 mg / 0.2 ml / well) was immobilized on a 96-well plate, and the antibody in the culture supernatant was detected by the sandwich method.
  • FIG. 3B shows the results of Western plots using anti-p30-specific antibody Ell. 2 against blood, immune system cell lines, and T lymphocytes and B lymphocytes purified from lymph nodes (FIG. 3B).
  • HL60 cells treated with retinoic acid and separated into neutrophils HL60 RA
  • cells differentiated into macrophages by stimulation with vitamin D3 (ImM) and TPA (10 ng / ml) HL60 D3 + In T
  • ImM vitamin D3
  • TPA 10 ng / ml
  • p30 is activated Rapl (RaplV12) ⁇ ⁇ ⁇
  • Rapl Rapl
  • ProB cell line expressing human LFA-1 BAF cells expressing both p30, Rap1V12, and RaplV12 and p30 were prepared, and cell migration on ICAM-1 was measured. did.
  • a protein in which a human ICAM-1 extracellular region was fused with a human immunoglobulin Fc region (hICAM-Fc) was used as a ⁇ ICAM-l.
  • hICAM-Fc human immunoglobulin Fc region
  • BAF cells prepared by immobilizing ICAM-I (0.1 mg / ml) on a temperature control plate having a diameter of 6 cni were added thereto, and videotaped at 37 ° C for 20 minutes.
  • the distance traveled was measured for 20 cells and the average velocity was calculated.
  • RaplV12 increased the cell migration rate on ICAM-1, and P30 further enhanced its effect (Fig. 4).
  • p30RBDm the RBD domain mutant of p30 ( p30RBDm).
  • p30RBDm is a mutant in which the seven amino acids conserved in the RBD domain, i.e., lysine 123, 124 arginine, 135 lysine, 154 lysine, 155 lysine, 160 aspartic acid, and 161 asparagine, are substituted with alanine It is.
  • This p30RBDm is expressed in the same way as the wild type, but cannot bind to GTP 'Rapl, unlike Yongzong.
  • RaplV12 and p3 ORBDm were expressed in BAF cells, and the migration speed on ICAM-1 was measured. As a result, no enhancement effect was observed. Therefore, the effect of p30 on promoting cell migration by RaplV12 was required to bind to Rapl.
  • the cells were labeled with a fluorescent dye using BCECF-AM (Molecular Probe), and incubated at 37 ° C for 30 minutes on a plate on which IC layer-1 (0.1 mg / ml) was immobilized.
  • the number of input cells and the number of cells remaining after washing the plate at least 3 times) were measured with a fluorescence reader (Cytofluor 4000, Persepetive Biosystems), and the ratio of the number of input cells to the number of input cells was measured.
  • Adhesive activity As a result, it was evident that gFA activity of LFA-1 against ICAM-1 increased depending on the level of p30 expression in 3A9T cells.
  • LFA-1 / ICAM-13 ⁇ 4 induced by TCR stimulation is evident from the activation of Rapl and the complete inhibition of Rapl-specific expression of Spa-1. I have. Therefore, if p30 is involved in ⁇ downstream of Rapl, LFA-1 / ICAM-13 ⁇ 4 »is expected to be suppressed. Therefore, a mutant of p30 was created, and a mutant (deltaNp30) that functions as a dominantly suppressed type was created. dletaNp30 was prepared by deleting 100 amino acids from the N-terminus of p30. After transfection into 3A9T cells, TCR-stimulated LFA-1 / ICAM-13 ⁇ 43 ⁇ 4 was examined. As a result, as shown in FIG. 6C, it was determined that deltaNp30 was able to inhibit the adhesion of LFA-1 to ICAM-1 by TCR stimulation in a ⁇
  • PGEX-3X (Amersh am Pharmacia Biotech) was used as a plasmid for production of fusion protein of GST-Rapl.
  • the coding sequence of Rapl represented by the rooster sequence number: 1 was inserted between the BamHI and EcoRI restriction enzyme sites of the vector.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 was inserted so that a 5-base pair CC was inserted before the terminal ATG.
  • the link between the BamHI site of the vector and Ra Pi was 5 ′ ⁇ -GGATCCCCATG- ⁇ 3 '.
  • the obtained plasmid for producing fusion protein of GST-Rapl was transfected into E. coli.
  • Glutathione Sepharose 4B beads (Amersham) were added to the supernatant obtained by centrifugation of the pool, and the mixture was reacted at 4 ° C for 1 hour to prepare GST_Rapl beads.
  • Plasmid p30-Myc tag was introduced into 70% confluent 293T cells by electroporation. The transfected cells were cultured for 2 days and collected by centrifugation. The collected cells were lysed with Lysis buffer, and the supernatant was collected after centrifugation to obtain p30 Lysate.
  • the hydrate (compound 1) was added. After the reaction, the beads were washed four times with a Lysis buffer, and 25 L of a normal sample buffer was added to the beads precipitated by centrifugation to prepare a sample for SDS-PAGE. This sample was subjected to stamp lotting by SDS-PAGE.
  • a film for chemiluminescence (Amersham) was performed by ECL chemiluminescence method. Exposure was detected.
  • the band obtained by exposing the film was converted using image analysis software (win Roof, Mitani Shoji). That is, the band of P30 to be compared was extracted by the binarization process, and the volume of the category of luminance X area was compared.
  • the activity can be screened using various diaminotrifluoromethylpyridine derivatives disclosed in, for example, JP-A-6-263735.
  • Example 7
  • the gene for human p30 was introduced into 3A9T cells.
  • 3A9T cells and cells transfected with p30 (3A9 / p30) were fixed with 3.3% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature, and then mounted on a slide coated with poly-J-gin. After washing with PBS, PBS / 0.2% ⁇ -100 supplemented with 2 mM MgCl 2 was added, and the mixture was incubated for 5 minutes. After washing with PBS, the cells were blocked with 5% goat serum for 20 minutes. Thereafter, a mouse anti-tubulin antibody (diluted 1: 500 with 1% BSA) was added, and the mixture was incubated for 1 hour.
  • ⁇ cells and ⁇ 3 ⁇ 41 presenting cells is an important adhesion that allows 3 ⁇ 43 ⁇ 43 ⁇ 4 cells to be recognized, but this leakage is through the LFA-1 / IC layer-1. Therefore, the localization of # 30 and LFA-1 in this bond was examined.
  • HEL hen egg lysozyme
  • CH27 cells were used as APC.
  • CH27 cells (lxlO 5 / ml) were added with HEL in (100 ⁇ g) and cultured for 16 hours. Then, the same number of 3A9 T cells and CH27 cells (lxlO 5 / ml) were mixed and incubated at 37 ° C for 30 minutes. 3.
  • the plate was mounted on a slide coated with polylysine. After washing with PBS, PBS / 0.2% ⁇ -100 supplemented with 2 mM MgCl 2 was added and incubated for 3 minutes. After washing with PBS, the cells were blocked with 5% goat serum for 20 minutes. Rat anti- ⁇ 30 antibody (10 g / ml) (Ell.2) was added and incubated for 1 hour.o After washing 4 times with PBS / 0.1%, Alexa-546 conjugated rat anti-mouse IgG (5% with 1% BSA) A 1: 0 dilution, Molecular Probe) was added and incubated for 1 hour.
  • Transgenic mice are produced by an improved method of the method of Gordon et al. (1980. Proc. Nalt. Acad. Sci. 77: 7380-7384).
  • mice C57BL / 6N Crj (Nippon-chirurisuribai) were subjected to excess willow-induced treatment (administration of 5 IU of pregnant horse serum serum glutin-stimulating hormone, and 48 IU of human placental hypostimulus hormone after 48 hours). ), And mating with the same strain of male mice.
  • the oviduct is removed from the female mouse with Nagina vagina, and the pronuclear stage fertilized egg is collected. Inject the prepared DNA fragment sickle (prepared to a few ng / fil with TE buffer). Cultured in implantation process after 2 3 hours ⁇ 2 Inkyubeta.
  • a morphologically normal embryo is selected and transplanted into the oviduct of ffiffl pseudopregnant female mouse (Jcl: MCHC ICR) (CLEA Japan).
  • Jcl MCHC ICR
  • Embryo transfer to the fallopian tube is performed by incising the back of an anesthetized female mouse, removing the ovaries, making a partial incision between the fallopian tube and the magnum of the fallopian tube. This is done by injecting the filled embryo-containing culture medium, empty S, and culture medium in this order.
  • the female mouse that has been sutured is placed in a vinyl isolator for isolation and breeding, spontaneously delivered, and weaned until weaning.
  • no birth is observed by the afternoon of the expected birth date: ⁇ indicates that the neonate has been excised by hysterectomy, and the obtained neonate has been prepared in another isolator in advance. : Nursing on SPF).
  • 3 ⁇ 4 or foster parents are used to carry out a physical examination, and the offspring whose parent's SPF is confirmed are introduced into the SPF breeding room, and gene loaf is carried out. After genetic analysis, the offspring having the introduced gene will be used to confirm the identity of the transgene to the next generation.
  • Tail Fiber is cut from the tip at about 10 to 15 mm from the tip with a special scissor, which has been dry-heat sterilized in advance, and put into a sterilized Etpendorf tube. store. DNA is extracted from the cryopreserved tail yarn fiber by a protease treatment method (Amangam Bioscience: cord; 27-2537-01).
  • the extracted DNA was designed side '3 immediately downstream of the vector portion and the 5' side of the p30 gene in the template the flop Lima one [each EitijieishiCGTGGACAGCAGCATGAGCAGCGGG (Rooster himself column number 1 1) and 1 ⁇ TGTGAGCCAGGGCAnGGCCACACCA (Rooster himself Using column No. 12), a mouse having the gene fragment introduced by PCR is identified. By introducing a 1144 bp fragment into this PCR, the introduction of the gene is confirmed.
  • my c-tag sequence containing a start codon to enable detection of antibodies against k myc produced as a protein in cells
  • the present invention provides a technique that utilizes the knowledge that the interaction between p30 and Rapl controls cell activation and lt3 ⁇ 4 transmission.
  • p30-Rapl interaction control substances such as compounds that inhibit the p30-RaPi binding, and to develop screens and the like used therefor.
  • Inhibitors and other p30-Rapl binding regulators can be expected as pharmaceuticals, and can be used as anti-inflammatory drugs, immunosuppressants, transplantation immunosuppressants, anticancer drugs, and the like.
  • modified P30-related peptides and nucleic acids, as well as anti-p30 antibodies and the like are highly useful, for example, those that function in a predominantly suppressed form in cells and those that function to inhibit 30-Rapl binding. Utilizing this technology and knowledge, it is also possible to develop ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • SEQ ID NO: 12 Description of Artificial Sequence: Ol igonucleotide to act as a primer for PCR
  • SEQ ID NO: 14 Description of Artificial Sequence: Ol igonucleotide to act as a primer for PCR

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Abstract

インテグリン接着制御分子としてのRap1の機能破綻は免疫病である炎症、アレルギー、自己免疫疾患、癌免疫、移植免疫等の病態と密接に関連していると考えられるが、Rap1によるインテグリン接着制御のメカニズムを解明することはこれらの免疫病の病態理解や治療法を開発することにつながる。Rap1によるインテグリン接着性制御に関与する分子として、p30が同定されてきているが、該p30はRap1と結合して、その機能を制御していることが見出された。この知見を利用することにより、p30とRap1との結合阻害剤などが開発でき、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、癌免疫、移植免疫等の治療薬の開発、さらには制御機構の解明が可能となる。

Description

RA Pい R a p 1相互作用制
技術分野 , 明
本発明は、 P^) (即ち、 RAPL) と田相互作用することにより誘導される生物活性 を制御することに関する。本発明は、 Raplと p30との結合を制御、 例えば阻害あ るいは促進する技術並びにその利用技術に関する。 背.
低^ ί量 G蛋白質 Raplは i»H- Rasのァンタゴニストとしての機能が報告され ていたが、 最近、 ■分子インテグリンの細胞内制御^ ^であることカ《明らかに なった。免疫系においては Raplは免 細胞で発現している LFA-1などの b2ィンテ ダリンの婦性を正に調節し、 白血球と血管内皮細胞との纖ゃ糸纖での遊走や 局在、 及び抗原提示細胞との »に重要な影響を与えている。 このようなインテ グリン¾#制御分子としての Raplの機能磁定は免疫病である炎症、 アレルギー、 自己免疫疾患、 癌免疫、 移植免疫等の病態と密接に関連してくると予想される。 また、 Raplによるインテグリン ¾«性制御に関与する として、 p30を同定 したとの報告もある （#特許文献 1 ) 。
【非特許文献 1】
第 3 1回日本免疫学 術集会（開催日時 2001年 12月 11日 （火） 〜13日 （木 )、 大阪国!^議場）及び同予稿集（2001年 10月 31日発行） 発明の開示
Raplによるィンテグリン接着制御のメ力二ズムを解明することはこれらの免疫 病の病態理解や治療法を開発することにつながる。 本発明者らは、 鋭意検討の結果、 P30 (即ち、 RAPL) 力 Raplエフェクター分子 として機能し、 LAF- 1による ¾¾、 遊走を正に制御する^?であることを明らか にすることに成功した。 この知見に基づき、 さらなる研究の結果、 本発明に至つ た。 以下の記載にお 、て p 30とは RAPLのことを指す。
本発明は、
〔 1〕 (1) (a) 配列番号 :2で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のァミノ酸配列を含有する活性型のポリぺプチド、 その部分べプチドまた はその塩、 及び、 酉 番号: 2で表されるアミノ酸配列の 12番目のグリシン力バリ ンであるァミノ酸酉己列もしくは該点変異したァミノ酸酸配列と実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する活'醒のポリべプチドからなる群から選択される一つのポ リぺプチド、
Figure imgf000004_0001
ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のァミノ酸酉 リを含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその 塩からなる群から選択される一つのポリべプチド、 及び (c)試験試料とを接触さ せる工程、
(2)前記 (a)群から選択される一つのポリぺプチドと前記 (b)群から選択さ れる一つのポリぺプチドとの相互作用及び Zまたは結合の形成を検出する工程 を含む、 Raplと p30との相互作用及び/または結合を促進あるいは阻害する ィ匕合物またはその塩のスクリ一ニング方法；
〔2〕 （1) (a) 群から選択される一つのポリペプチド、 （b)群から選択さ れる一つのポリぺプチド及び試験試料とを接触させる工程、
(2) (a)群から選択される一つのポリべプチドと（b)群から選択される一つ のポリペプチドとの相互作用及び Zまたは結合の形成を検出する工程、
(3) これらのポリべプチドの相互作用及び Zまたは結合を促進あるいは阻害 する化合物を選択する工程
を含む上記 〔 1〕 に言己載のスクリ一ニング方法；
〔3〕 （a)群から選択される一つのポリべプチド及び/または )群から 選択される一つのポリペプチドが、 他のペプチドと融合している上記 〔1〕 また は 〔 2〕 に記載のスクリ一ニング方法；
〔4〕 （a)群から選択される一つのポリぺプチド及び Zまたは (b)群から 選択される一つのポリべプチドが標識され、 該標識を検出または測定することに より該ポリペプチドの結合の形 ^ぴダまたは相互作用を検出する上記 〔i〕 〜 〔3〕 のいずれか一に記載のスクリーニング方法；
〔 5〕 （a)群から選択される一つのポリぺプチドに結合した (b)群から選 択される一つのポリぺプチドを該 (b)群のポリぺプチドに対する一次抗体または 該 (b)のポリべプチドと融合した他のぺプチドに対する一次抗体を用いて検出ま たは測定することにより、 これらのポリぺプチドの相互作用及び Zまたは結合の 形成を検出する上記 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれか一に記載のスクリーニング方法；
〔6〕 （b)群から選択される一つのポリべプチドに結合した (a)群から選 択される一つのポリぺプチドを該 (a)群のポリぺプチドに対する一次抗体または 該 (a)のポリべプチドと融合した他のぺプチドに対する一次抗体を用いて検出ま たは測定することにより、 これらのポリぺプチドの結合の形成及び Zまたは相互 作用を検出する上記 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれか一に記載のスクリーニング方法；
〔7〕 （a)群から選択される一つのポリべプチドに結合した )群から選 択される一つのポリぺプチドを該 (b)群のポリぺプチドに対する一次抗体または 該 (b)のポリべプチドと融合した他のぺプチドに対する一次抗体及び該ー次抗体 に対する二次抗体を用いて検出または測定することにより、 これらのポリぺプチ ドの結合の形颇び Zまたは相互作用を検出する上記 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれ力、 一に記載のスクリ一ニング方法；
〔 8〕 （a)群のポリぺプチドが、 配列番号: 2で表されるァミノ酸配列を有 するポリぺプチドの N-末端側にグノレタチォン- S-トランスフヱラ一ゼを融合させ たポリべプチドもしくは配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の 12番目のグリシン 力《バリンであるァミノ酸配列を有するポリべプチドの N-末端側にグルタチオン -S -トランスフヱラ一ゼを融合させたポリぺプチドの活性型ポリぺプチドまたはそ の塩のいずれかであり、 （b)群のポリペプチドが、 配列番号: 4で表されるァミノ 酸配列を有するポリぺプチドの N-末端側に Mycェピト一プを融合させたポリぺプ チドまたはその塩である上記 〔1〕 〜 〔3〕 のいずれか一に記載のスクリーニング 方法；
〔9〕 (a) 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチド、 その部分べプチドまたはその塩、 及 び、 配列番号： 2で表されるァミノ酸酉己列の 12番目のグリシンカノ リンであるアミ ノ酸配列もしくは該点変異したァミノ酸酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を 含有するポリぺプチドからなる群から選択される一つのポリぺプチドと（b) 配列 番号: 4で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含 有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩からなる群から選択 される一つのポリべプチドとを含有してなる、 Raplと p30との相互作用及び Zま たは結合を促進あるいは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット
〔10〕 （a)群から選択される一つのポリぺプチド及び/または (b)群から 選択される一つのポリペプチドが、 他のペプチドと融合している上記 〔9〕 に記 載のスクリーニング用キット ；
〔11〕 （a)群から選択される一つのポリぺプチド及び/または (b)群から 選択される一つのポリペプチドが標識されている上記 〔9〕 に記載のスクリー二 ング用キット；
〔12〕 （a)群のポリぺプチドが、 配列番号: 2で表されるァミノ酸配列を有 するポリべプチドの N-末端側にグルタチオン- S-トランスフヱラ一ゼを融合させ たポリべプチドもしくは配列番号: 2で表されるァミノ酸酉己列の 12番目のグリシン 力くバリンであるァミノ酸配列を有するポリベプチドの N-末端側にグルタチオン - S -トランスフヱラ一ゼを融合させたポリぺプチドまたはその塩の 、ずれかであり 、 （b)群のポリペプチドが、 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列を有するポリべ プチドの N- 5 ^耑側に Mycェピト一プを融合させたポリべプチドまたはその塩であ る上記 〔9〕 に記載のスクリーニング用キット ；
〔13〕 上記 〔1〕 に記載のスクリーニング方法または上記 〔9〕 に記載の スクリ一ニング用キットを用いて得られる Raplと p30との相互作用及び /または 結合を促進あるいは阻害する化合物またはその塩；
〔14〕 Raplと p30との相互作用及び/または結合を阻害する上記 〔13〕 に 記載の化合物またはその塩；
〔15〕 上記 〔13〕 に記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物 〔16〕 上記 〔14〕 に記載のィ匕合物またはその塩を含有してなる g¾組成物
〔17〕 治療または予防の対象が、
(a) 炎症疾患
(b) 免疫疾患
(c) 臓器移植時の拒絶反応、 及び
(d) 癌
からなる群から選択されるものである上記 〔15〕 または 〔16〕 に記載の医薬糸！^ 物；
〔18〕 配列番号: 4で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の 了ミノ酸配列を含有するポリぺプチドを認、識するモノクローナル抗体；
〔19〕 上記 〔18〕 に記載のモノクロ一ナル抗体を用いることを特徵とする 診断方法；
〔20〕 上記 〔18〕 に記載のモノクローナル抗体を含有する診断用キット； 〔21〕 配列番号: 4で表されるァミノ酸酉 リと同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリぺプチドに対して細胞内で優性抑制型に機能するポ リペプチドまたはその塩；
〔22〕 上記 〔21〕 に記載のポリペプチドまたはその塩を含有する、
(a) 炎症疾患
(b) 免疫疾患
(c) 臓器移植時の拒絶反応、 及び
(d) 癌
力、らなる群から選択されるものを治療または予防するための組成物；
〔23〕 上記 〔21〕 に記載のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド； 〔24〕 上記 〔23〕 に記載のポリヌクレオチドを含有する、
(a) 炎症疾患
(b) 免疫疾患
(c) 臓器移植時の拒絶反応、 及び (d) 癌
からなる群カヽら選ばれたのものを治療または予防するための組成物；
〔25〕 配列番号: 10で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するポリべプチドの発現が調節されたトランスジヱニック 動物；
〔26〕 .配列番号: 10で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの発現が過剰となる上記 〔25〕 に記載の トランスジエニック動物；
〔27〕 トランスジエニック動物がマウスである上記 〔25〕 または 〔26〕 に 記載のトランスジエニック動物；
〔28〕 式 （ I )
Figure imgf000008_0001
〔式中、 Xが— CT^ R 1基又は— C (^W1) W2 R2基であり、 R 1がアル キル基、 ハロアルキル基、 アルコキシカルボニルアルキル基、 アルケニル基、 ロアルケニル基、 チェニル基で置換されたアルケニル基、 シクロアルキル基、 口ゲン原子で置換されたシクロアルキル基、 フヱニル基、 ハロゲン原子で置換さ れたフェニル基、 アルキル基若しくはハロアルキル基で置換されたフェニル基、 アルコキシ しくはハロアルコキシ基で置換されたフヱニル基、 テトラヒドロ ナフチル基、 インダニル基、 フラニル基又はチェニル基であり、 R2がアルキル 基又はハロアルキル基であり、 及び はそれぞ ¾οϊして、 酸素原子又は 硫黄原子であり、 Υがー S〇2 R 9基であり、 R 9がアルキル基、 ハロアルキル 基、 フヱニル基、 ハロゲン原子で置換されたフヱニル基、 アルキル S¾しくはハ 口アルキル基で置換されたフェニル基又はアルコキシ¾¾しくはハロアルコキシ 基で置換されたフエニル基である〕 で表される化合物又はその塩を有効成分とす ることを特徴とする Raplと p30の結合阻 ；
〔29〕 上記 〔28〕 において、 Xがアルコキシカルボニルアルキルカルボ二 ノレ基、 アルケニルカルボニル基、 チェニル基で置換されたアルケニルカルボニル 基、 シクロアルキルカルボニル基、 インダニルカルボニル基、 フランカルボニル 基、 チオフヱンカルボニル基、 テトラヒドロナフチルカルボニル基又はハロゲン 原子若しくはノヽロアルキル基で置換されてもよいべンゾィノレ基であり、 Yがアル キルスルホニル基であることを特徵とする上記 〔28〕 記載の Raplと p30 との結合 阻害剤；
〔30〕 上記 〔28〕 において、 Xがシクロアルキルカルボニル基、 フランカ ルポニル基又はノヽ口ゲンで置換されてもよいベンゾィノレ基であり、 Yがァルキル スルホニル基であることを特徴とする上記 〔28〕 記載の Raplと p30 との結合阻害 剤；
〔31〕 上記 〔28〕 において化合物力く、 N- ( 2—ェチルスルホニルァミノ — 5—トリフルォロメチルー 3—ピリジノレ） シク口へキサンカルボキサミ ド、 N - ( 2ーメチルスルホニルァミノー 5—トリフルォロメチルー 3—ピリジル） 一 4—フルォロベンズアミ ド、 N— ( 2—イソプロピルスルホニルアミノー 5—ト リフルォロメチルー 3—ピリジル) —3—フルォロベンズアミ ド、 N— （2—メ チルスルホニルァミノー 5—トリフルォロメチル一 3—ピリジル） 一 2—フラン カルボキサミ ド又は N— （2—ィソプロピルスルホニルァミノー 5—トリフルォ ロメチルー 3—ピリジル）シクロペンタンカルボキサミ ドから成る群から選ばれ たものであることを ϋとする上記 〔28〕 記載の Raplと ρ30 との結合阻害剤；及 び
〔32〕 Ν— （2—ェチルスルホニルァミノ一 5—トリフルォロメチルー 3 一ピリジル） シク口へキサンカルボキサミ ドまたはその塩が有効成分であること を特徴とする Raplと ρ30 との結合阻^^を樹共する。 別の態様では、 本発明は、
〔33〕 ρ30 と Raplとの相互作用を阻害する活性を有する化合物をスクリ一 ニングする方法及び該スクリ一ニング |¾；
〔34〕 p30 の発現により制御される生物活性を調節する活性を有する化合 物をスクリ一ニングする方法及び該スクリ一ニング ；
〔35〕 p30 の発現により制御される生物活性が、
(a) 微小管系の あるいは微小管系の ¾1誘導、
(b) leading edge及び/又は uropodの形成誘導、
(c) LFA-1 の鶴活性の上昇、
(d) ケモカイン刺激による T cell の遊走活性の上昇、
(e) 細胞鶴の上昇、
(f) 細胞遊走の鼠
(g) CXCR4及び/又は CD44の redistributionの誘起、
(h) TCR あるいはケモカインによる極性形成、
(i) LFA-1 ©leading edgeでの clustering、
(j) . LFA-1 の極性化、
(1 微小管系への p30の局在化、 '
(1) leading edgeでの LFA - 1 の clusteringと p30の共局在化、
(m) 抗原依存性の T cell- APC間の con jugate形成による接着面への LFA - 1 及び P30の共蓄積、
(n) インテグリン依存性の遊走能促進、
(0) T cel lの極 tt 成、 及び
(p) T cellの SMAC形成
力、ら成る群から遷ま'れたものであることを特徵とする上記 〔34〕 記載のスクリ一 ニングする方法及び該スクリ一ニング ；
〔36〕 p30発現細胞あるいはそれから誘導された p30含有物の存在下であ つて、
(0 Rapl活性化剤 下にスクリ一ニング対象物を接触せしめること、
(i i) Rapl活性化剤非存在下にスクリーニング対象物を接触せしめること
(i i i) 上言己 (i) の試験結果と上言己 (i i)の試.驗結果とを上匕較することを特徴 とする上記 〔33〕 又は 〔34〕 記載のスクリーニング方法；
〔37〕 p30 と共に Raplが共発現しているものであることを 敫とする上記 〔36〕 記載のスクリ一ニング方法；
〔38〕 活' Raplの存在下にスクリ一ニングを行うことを特徵とする上記 〔36〕 又は 〔37〕 記載のスクリーニング方法；
〔39〕 p30 と Raplとの相互作用を阻害する活性を有する化合物を有効成分 として含有することを特徵とする医薬；
〔40〕 (a) 微小管系の発達あるし、は微小管系の発達誘導、
(b) leading edge及び/又は uropodの形成誘導、
(c) LFA-1の 活性の上昇、
(d) ケモカイン刺激による T cell の遊走活性の上昇、
(e) 細胞鶴の上昇、
(f) 細胞遊走の鼠
(g) CXCR4及び Z又は CD44の redistributionの誘起、
(h) TCRあるいはケモカインによる極 f4¾成、
u) LFA-1 ©leading edgeでの clustering、
(j) LFA-1 の極 ί生化、 . (k) 微小管系への p30の局在化、
(1) leading edgeでの LFA- 1 の clusteringと p30 の共局在化、
(m) 抗原依存性の T cell- APC間の con jugate形成による接着面への LFA - 1 及び P30 の共蓄積、
(n) インテグリン依存性の遊走能促進、
(0) T cellの極性形成、及び
(p) T cellの SMAC形成
から成る群から選ばれた生物活性を阻害する活性を有する化合物を有効成分とし て含有することを とする上記 〔39〕 記載の医薬；
〔41〕 P30 の生物活性を制御することを特徴とする p30制御剤；
〔42〕 p30の Raplとの相互作用を介した活性を制御することを特徴とする 上記 〔41〕 記載の p30制御剤； 〔43〕 上記 〔41〕 又は 〔42〕 記載の p30制御剤を有効成分として含有する ことを 4寺徵とする医薬；
〔44〕 p30の生物活性を阻害することを特徴とする P30阻害剤；
〔45〕 p30の Raplとの相互作用を介した活性を阻害することを特徴とする 上記 〔44〕 記載の p30阻害剤；
〔46〕 上記 [44] 又は 〔45〕 記載の p30 P且害剤を有効成分として含有する ことを特徵とする医薬；
〔47〕 p30の生物活性を促進することを特徽とする p30活性化剤；
〔48〕 p30の Raplとの相互作用を介した活性を促進することを特徵とする 上記 〔47〕 記載の p30活性化剤；
〔49〕 上記 [47] 又は 〔48〕 記載の p30活性化剤を有効成分として含有す ることを特徴とする医薬；
〔50〕 p30を使用することを特徼とするスクリ一ニング方法及び該スクリ —ニング ；及び
〔51〕 医薬品のスクリ一二ングを行うことを特徴とする上記 〔50〕 記載の スクリ一ニング方法及び該スクリ一ニング¾¾を樹共する。 発明の効果
本発明で、 p30- Rapl間の相互作用により細胞の活性化及び If 制御がなさ れていることを見出すこと力でき、 該知見を利用する技術が開発でき、 本技術を 利用して、 P30- Rapl間の結合を阻害する化合物などの p30- Rapl間の相互作用制御 物質をスクリーニングしたり、 それに利用される！^などが開発でき、 さらに同 定された阻害剤などの P30- Rapl結合制御剤を g¾として開発可能とするし、 また 、 抗炎症薬、 免疫抑制斉 I 移植免疫抑制剤、 抗癌剤などが開発できる。 さらに、 改変 P30関連ペプチドや核酸、 さらには抗 p30抗体など、例えば細胞内で優勢抑 制型に機能するもの、 p30- Rapl間結合阻害の働きをもつものなどを樹共し、 利用 すること力河能である。本発明の技術 ·知識を利用して生体機能斷のための試 薬、 アツセィ法なども開発できる。 本発明のその他の目的、 特徴、 優秀性及びその有する観点は、 以下の記載より 当業者にとっては明白であろう。 しカヽしな力くら、 以下の記 i¾び具体的な ¾5¾例 等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、 説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示 した本発明の意図及び範囲内で、 種々の変化及び Z又は改変 （あるいは修飾） を なすことは、 以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、 当業者 には容易に明らかであろう。本明細書で弓 I用されて 、る全ての特許文南扱び参考 文献は、 説明の目的で弓 I用されてレ、るもので、 それらは本明細書の"^としてそ の内容はここに含めて解釈されるべきものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 p30のァミノ酸配列及びその遺伝子構造を示す。 同時に Norelのァミ ノ酸配列も示す。
図 2は、 p30と Raplの会合についての籠結果を示す。 BCLィヒ学発光法で化学 フィルムを感光させた写真である。
図 3は、 （A) RT- PCR法による p30の組! 現分布の結果を示す電気泳動写真で ある。 (B)各種細胞につき抗 p30特異抗体を用いたウェスタンブロッ卜の結果を 示す電気泳動写真である。
図 4は、 野 型の p30あるいは p30の RBDドメインの変異体と Raplとを共に発 現させた； if^の細胞遊走に及ぼす影響を調べた結果を示す。右側は、 ウェスタン プロットの結果を示す電気泳動写真である。
図 5は、 ケモカインによる細胞遊走に与える p30の効果を示す。
図 6は、 （A) p30による LFA-1 制御効果を示す。 (B)変異体 p30による LF A - 1據制御効果を示す。 p30に結合活性を残す E37Gでのみ、 LFA- 1の ICAM- 1へ の婦の上昇が認められた。 （C) del taNp30は発糧依存性に、 TCR刺激による LFA- 1の ICAM- 1への接着を抑制する結果を示す。下の図は、 del taNp30の発現を 示す電気泳動写真である。
図 7は、 ィ匕合物 1の Raplと p30 との結合に及ぼす作用について試験した結果を しめす。 図 8は、 P30による微小管の の f好を共焦点レーザー顕«で観察した結 果を示す顕微鏡写真である。
図 9は、 T細胞と抗原提示細胞との における p30 と LFA- 1の局在共焦点レ —ザ一顕編で観察した結果を示す顕微鏡写真である。 発明を^するための最良の形態
本発明において、 配列番号: 4で表されるポリペプチド ρ 30と、 配列番号: 2で表 されるポリペプチド Rapl、 特には、 活 の Raplとの相互作用及び/又は結合に より、 例えば Raplの下流で細胞鶴などの生物活性発現に重要な関与が認められ たので、 こうした現象を利用した技術が樹共される。 p 30力《関与する前言胜物活 性としては、 微小管系の あるいは微小管系の 誘導、 リーディング エツ ジ （leading edge)及び/又はゥロポッド （uropod) の形成誘導、 LFA- 1の 活性の上昇、 ケモカイン刺激による T cellの遊走活' f生の上昇、細胞 の上昇、 細胞遊走の誘起、 CXCR 4及び/又は CD44のリディストリビューション （redistri but ion) 抗体による T cel lレセプタ一 （TCR)複合体のクロスリンク （ cross - l inking) あるいはケモカイン等の朿 ij激による細胞の極 ί 成、 LFA-1 のリーディング エッジでのクラスタリング（clustering)、 LFA- 1の極性化、 微小管系へ P30の局在化、 リーデイング ェッジでの LFA- 1のクラスタリングと P30共局在化、 抗原依存性の T cel l-APC(antigen-presenting cell) 間のコン ジュゲート （conjugate)形成による■面への LFA- 1及び p30の共蓄積、 イン テグリン依存性の遊走能促進、 T cel lの極性形成、 T cellの SMA形成などが挙げ れる。 それゆ 、 刖'記 p30は RAPL (regulator for cell adhesion and polari zation enriched in lymphoid tissues)と命名された (Koko Katagiriら、 Natu re Immunol ogys 2003年 8月 4日（8) : 741-748)。本発明において、 p30と RAPLは同一のポリぺプチドであり、酉 J番号： 4で表されるァミノ酸配列を有す る。以下の記載にぉ 、て p30とは MPLのことを指す。
前述の p30が関与する生物活性のレ、ずれかを検出又は測定することによつても P30と活'醒 Raplとの相互作用を検出または測定すること力何能である。該技術 を利用すれば、 30と活醒 Raplとの相互作用及び Z又は結合の阻鶴 ijあるいは 促進剤をスクリーニングでき、 同定された該阻害剤あるいは促進剤を利用して医 薬品開発も可能である。 また本技術に従えば、 P30と活性型 Raplとの結合を調節 したり、 それらの相互作用を制御することも可能となり、 言劾吉合の調節ゃ該制御 に関与する化合物などをスクリ一ニングでき、 様々な生理現象 ·生物活性現象を 研究可能となり、 それに関与する医薬品開発が可能である。
I¾S術により、 本発明では、 配列番号： 2で表されるポリペプチド Rap lの活 tt ポリぺプチドと配列番号： 4で表されるポリぺプチド p30との相互作用及び /又は結合を阻害あるいは促進する化合物をスクリ一二ングする方法が提供され る。 該スクリーニング方法は、 （a)配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する活 f«のポリぺプチド、 その部 分べプチドまたはその塩、 配列番号： 2で表されるァミノ酸配列の 12番目のグリ シンがバリンであるアミノ酸配列もしくは該点変異したアミノ酸酸配列と実質的 に同一のァミノ酸配列を含有する活性型のポリぺプチドからなる群から選択され る一つのポリベプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩からなる群から選 択される一つのポリぺプチドと )酉 番号： 4で表されるァミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分 ぺプチドまたはその塩からなる群から選択される一つのポリべプチドとの存在下 、 スクリーニングの試験試料を共存させることによりなされる。典型的には、 前 記 (a)群のポリぺプチドまたは前記 (b)群のポリぺプチドとしては遺伝 且換え 技術でリコンピナント蛋白質として得られたものを使用するが、 これらのポリぺ プチドを共発現してし、る細胞ある 、はその抽出物を用いることも可能である。 本発明において前記 (a)群の活 ft のポリぺプチドとは p30と糸吉合することが できるポリぺプチドのことを指す。 このような活性型の (a)群のポリぺプチドは 、 細 に取り出されたポリペプチド等である^は、 緩衝液中で GTPまたは G TP J S、 GppNHpなどの GTPアナ口グを用いて 4〜 3 7 °Cで 1 0分力、ら 1時間処理 することにより活 '¾ にすること力くできる。 GTP y S、 GppNHpなどの GTPアナ口 グによる活性化が好ましく、 GTP y Sによる活性化がより好ましい。 また、 （a) 群のポリぺプチドが細胞内で発現してレ、る: ^は、 該細胞を抗体による T cell レセプタ一 （TCR) 複合体のクロスリンク （cross - l inking) ゃケモカインに より朿 (撒することにより該ポリべプチドを活 '園にすること力河能である。 抗体 による TCR複合体のクロスリンクによる朿 IJ激としては、 例えば抗 CD3モノクロ一 ナル抗体による処理が挙げられ、 抗体 2 C11 (10 zg/mlの濃度） の存在下で 3 7 °Cで 1 0分間〜 1時間、 細胞をィンキュベー卜することにより該ポリぺプチド を活' にすること力くできる。 ケモカインによる朿 IJ激としては、 SLC (secondar y lymphoid tissue chemokine)、 CCL21 (chemokine cc motif l igand 21) 、 SDF-1 (stromal cel l-derived factor- 1)などによる処理があげられ、 これらの物 質 （100 nM) の存在下で 3 7 °Cで 1 0分間〜 1時間、 細胞をインキュベート処理 することにより該ポリぺプチドを活性型にすることができる。
該スクリ一二ング方法にぉ 、ては、 様々な手法で試験試料に対してスクリ一二 ングを行うことができる力 例えば (l)(a) 酉己列番号: 2で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する活 のポリぺプチドも しくはその部分べプチドまたはその塩、 配列番号: 2で表されるァミノ酸配列の 12 番目のダリシンがバリンであるアミノ酸配列もしくは該点変異したァミノ酸酸配 列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有する活 ¾ のポリぺプチドからなる群カヽ ら選択される一つのポリべプチド、 （b)配列番号: 4で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部 分べプチドまたはその塩からなる群から選択される一つのポリぺプチド、 及び試 験試料とを接触させる工程、 （2) 前記 (a)群から選択される一つのポリペプチド と前記 (b)群から選択される一つのポリぺプチドとの相互作用及び Zまたは結合 の形成を検出する工程が含まれるものであってよい。 本発明において、 前記 (a) 群のポリぺプチド、 前記 (b)群のポリぺプチド及び試験試料を共存させる方法と しては、 3者を同時に接触させる方法、 試験試料を予め (a)のポリペプチドまた は (b)のポリべプチドと接触させておく方法などが考えられる。 これらのポリべ プチドを共発現している細胞を用いる: にも、 それぞれのポリべプチドの発現 時期の調節、 試験試料と IT細胞との接触時期の調節を行うことによりこれらの方 法を選択することが可能である。
本発明において 「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは、 元となるアミノ酸配列 と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上、 最も 好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を指す。 例えば、 「配列 番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」 の 、 元と なるアミノ酸配列とは配列番号： 4で表されるアミノ酸配列のことである。 また
「ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチド」 とは、 前記の 「実質的に同一のアミノ酸配列」 を含有し、 元となるアミノ酸配列を有す るポリべプチドと実質的に同等なポリべプチドなどが好ましい。 本発明において
「実質的に同等」 とは蛋白質の活性、 例えば、 結合活性、 生理的な活性、 生物学 的な活性が実質的に同じであることを意味する。 さらにまた、 その用語の意味の 中には、 実質的に同質の活性を有する も包含していてよ 該実質的に同質 の活性としては細胞の ¾¾、 細胞の移動、 細胞の分極などの制御などを挙げるこ と力できる。 該実質的に同質の活性とは、 それらの活性が性質的に同質であるこ とを示す。 例えば、 結合活性などの活性が、 同等 （例えば約 0. 001〜約 1000倍、 好ましくは約 0. 01〜約 100倍、 より好ましくは約 0. 1倍〜約 20倍、 さらに好まし くは約 0. 5倍〜約 2倍） であること力好ましいが、 これらの活性の程度、 蛋白質 の分子量など量的な要素は異なつていてもよい。
本発明の前記 (a) 群または前記 (b) 群のポリぺプチドとしては、 了ミノ酸の置 換、 欠失、 挿入、 付加など、 好ましい変化を有するものであってもよく、 生理的 な特性や化学的な特性に変ィ匕を生じたものであってもよい。 該置換、 欠失、 挿入 あるいは付加を施されたポリペプチドは、 そうした置換、 欠失、 挿入あるいは付 加のされていないものと実質的に同一であるとされるものであることもできる。 該ァミノ酸配列中のァミノ酸の実質的に同一な置換体としては、 そのァミノ酸が 属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶこと力くできうる。 例えば 、 @性 （疎水性） アミノ酸としては、 ァラニン、 フエ二ルァラニン、 ロイシン 、 イソロイシン、 バリン、 プロリン、 トリブトファン、 メチォニンなどが挙げら れ、 極性 （中性） アミノ酸としては、 グリシン、 セリン、 スレオニン、 システィ ン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなどが挙げられ、 陽電荷をもつアミノ 酸 （塩基性アミノ酸） としては、 アルギニン、 リジン、 ヒスチジンなどが挙げら れ、 陰電荷をもつアミノ酸 （酸性アミノ酸） としては、 ァスパラギン酸、 グルタ ミン酸などが挙げられる。 によっては、 システィンをセリンに、 グリシンを ァラニンやロイシンに、 あるいはロイシンをァラニン、 イソロイシン、 ノ《リンな どに置き換えてもよい。 本発明のポリペプチドは、 ィヒ学的な手法でその含有され るァミノ酸残基を修飾することもできるし、 ぺプチダ一ゼ、 例えばぺプシン、 キ モトリプシン、 パパイン、 ブロメライン、 ェンドぺプチダ一ゼ、 ェキソぺプチダ —ゼなどの酵素を用いて修飾したり、 部分分解したりしてその誘壞本などにする こと力 きる。 文像ペプチドあるいはポリペプチド （又はタンパク質） は、 1個以上のァミノ 酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、 1個以上の了ミノ酸残基の位置 力く天然のものと異なるものであってもよい。 Raplまたは p30 タンパク質に な 了ミノ酸残基が 1個以上 （例えば、 1〜80個、 好ましくは 1〜60個、 さらに好ま しくは 1〜40個、 さらに好ましくは 1〜20個、 特には 1〜10個など） 欠けている 欠^！縁体、 特有のァミノ酸残基の 1個以上 （例えば、 1〜80個、 好ましくは 1 〜60個、 さらに好ましくは 1〜40個、 さらに好ましくは 1〜20個、 特には 1〜10 個など） 力く他のアミノ酸残基で置換されている置擬頁縁体、 1個以上 （例えば、 1〜80個、 好ましくは 1〜60個、 さらに好ましくは 1〜40個、 さらに好ましくは 1〜20個、 特には 1〜10個など） のァミノ酸残基が付加されている付加類縁体、 及び 1個以上 （例えば、 1〜80個、 好ましくは 1〜60個、 さらに好ましくは 1〜 40個、 さらに好ましくは 1〜20個、 特には 1〜10個など） のアミノ酸残基が揷人 されている挿入類縁体も本発明のポリぺプチドに含まれる。 上記のようにアミノ 酸配列力挿入、 欠失または置換されている^、 その揷人、 欠失または置換の位 置としては、 特に限定されない。
天然のタンパク質の特徴であるドメィン構造あるいは基質結合能が維持されて いれば、 上記変異体は、 全て本発明に包含される。 また天然のタンパク質と実質 的に同等の一次構造コンフオメーションあるいはその一部を有しているものも含 まれてよいと考えられ、 さらに天然のものと実質的に同等の生物学的活性を有し ているものも含まれてよいと考えられる。 さらに天然に生ずる変異体の一つであ ること ¾でさる。 本発明にぉ ヽては、 Raplと p30の相互作用としての生物活性ではなく、 Raplと p30との結合阻害に基づき試験試料をスクリ一ニングすることもできる。 このよ うな: tf^に使用される前記 (a)群のポリべプチドとしては、 野生型の p 30に結合 する活性を有してさえいれば特に制限はない。 ap 1の生物学的活性を失ってい るものであってもよく。 野頻 p30に結合する活性を有してさえいれば、 配列番 号： 2で表されるアミノ酸配列において、 前記のようなアミノ酸残基の置換、 欠 び Z又は付加により修飾されたァミノ酸配列を有するポリぺプチドであつて よい。 また、 このような^に i^fflされる（b)群のポリぺプチドとしては、 野生 型の Raplに結合する活性を有してさえいれば特に制限はない。 p30の生物学的活 性を失っているものであってもよい。 試験試料としては、 例えばタンパク質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 植物抽出物、 動物などのき熾抽出物、 細胞抽出物などが挙 げられる。 試験試料に使用される試験化合物の例には、 好ましくは抗 p30抗体、 酵素阻害剤、 サイト力イン、 各種インヒビタ一活性を有する化合物、 特には合成 化合物などを含んでし、てよい。 これら化合物は、 新規な化合物であつてもよいし 、 公知の化合物であってもよい。 代表的な化合物としては、 例えば特開平 6- 2637 35号公報に開示の各種ジァミノ トリフルォロメチルピリジン誘 などが挙げら れる。 該スクリーニングは、 通常の結合活性あるいは生物活性の測定法に準じて feすること力《できる。
〔スクリーニング方法〕
本発明のスクリーニング方法の一つの態様は、 前記 (a)群のいずれかの活'醒 のポリぺプチド、 前記 (b)群の 、ずれかのポリぺプチド及び試験試料を接触させ 、 次レ、で p30が関与する生物活性を検出又は測定することで両群のポリぺプチド の相互作用を検出し、 謝目互作用を促進あるいは阻害する化合物を選択すること により実施される。精製された化合物等をスクリーニングする: t ^は、 選択のェ 程は省略されても良い。
P30が関与する前言胜物活性としては、 微小管系の発達あるいは微小管系の発 達誘導、 リーディング エッジ （leading edge) 及び/又はゥロポッド （uropod ) の形 )β導、 LFA-1 の ¾#活生の上昇、 ケモカイン刺激による T cellの遊走活 '性の上昇、 細胞接着の上昇、 細胞遊走の誘起、— CX— CR 4 び/又は CD44のリデイス トリビューシヨン （redistribution) の 、 抗体による T cel lレセプ夕一 （ TCR) 複合体のクロスリンク （cross- l inking) あるいはケモカイン等の剌激に よる細胞の極 ¾^成、 LFA-1 のリーディング エッジでのクラスタリング （clus tering)、 LFA- 1の極性化、 微小管系へ p30の局在化、 リーディング エッジで の LFA- 1のクラスタリングと p30共局在化、 抗原依存性の T cell-APC (at i en- presenting cell)間のコンジユゲート（conjugate)形成による 面への LFA- 1 及び p30の共蓄積、 インテグリン依存性の遊走能促進、 T cel lの極性形成、 T ce 11の SMA形成などが挙げられる （Koko Katagiriら、 Nature Immunology, (8)： 741-748) o
本発明のスクリ一ニング方法の別の態様は、 前記 (a)群のいずれかの活 #Sの ポリぺプチド、 前記 )群の 、ずれかのポリぺプチド及び試験試料を接触させ、 次いで両群のポリべプチドの結合の形成を検出し、 1¾吉合の形成を促進あるいは 阻害する化合物を選択することにより実施される。 精製された化合物等をスクリ —ニングする： ff^は、 選択の工程は省略されても良い。 （a)群のポリペプチドの 活性化が必要な は、 前述のように GT P誘 本を用いて活性化する。 該ポリ ペプチドの固相化を行う場合は、 活性化を固相化の前に行っても良いし、 固相化 の後に行っても良いが、 固相化後がより好ましい。
本発明に されるポリぺプチドは、 支謝本に結合させて用いること力《できる 。 はじめに精製された又は粗精製された前記 (a)群のポリペプチド、 前記 (b)群 のポリペプチドの組合せにおいて、 いずれか一方を支謝本に結合させる。 該ポリ ぺプチドを支謝本に結合させるには、 標準的な方法で該ポリべプチドを支 本に 固相化すればよい。 ポリペプチドを結合させる支 本としては、 例えば不溶性の 多糖類、 例えばァガロース、 デキストラン、 セルロース、 合成樹脂、 例えばポリ スチレン、 ポリアクリルァミ ド、 シリコン等が挙げられる。 より具体的にはそれ らを原料として製造される市販のビーズ、 プレートカ佣いられる。 ビーズの if^ 、 これら力く充塡されたカラム等を用いてもよい。 プレートのお、 マルチウエル プレート (96穴マルチウヱルプレー卜等) やバイオセンサ一チップ力く挙げられる o
ポリペプチドと^本を結合させるには、 ィ匕学結合、 物理的な吸着等を利用す る、 通常用いられる方法を用いればよい。 また、 ポリペプチドを特異的に認識す る抗体を予め支樹本に結合せしめ、 この抗体とポリべプチドとを結合させること もできる。 さらに、 アビジン/ピオチンを介して結合させること力くできる。 前記 (a)群のポリぺプチドと前記 (b)群のポリぺプチドとの結合は、 通常緩衝液 中で行われる。 緩衝液としては、 例えばリン酸緩衝液、 Tris緩衝液等が^ fflされ る。 また、 インキュベートの条件としては、 すでによく用いられている条件、 例 えば 4 °C〜室温にて 1秒〜 3時間、 好ましくは 3秒〜 2時間、 より好ましくは 10 秒から 30分間のィンキュベ一シヨン力く挙げられる。 ィンキュベ一ト後の洗浄は、 蛋白質の結合を妨げないものであれば何でもよく、 例えば界面活性剤を含む緩衝 液が使用される。 界面活性剤としては、 例えば 0. 05% Tween20力く使用される。 目的の化合物を選択するには、 前記 (a)群のポリぺプチドと前記 (b)群のポリ ぺプチド及び試験試料を適切な条件下でィンキュベートし、 次いで洗浄すること により、 特異的な結合と 晴異的な結合を分離すること力できる。 そして、 前記 (a)群のポリぺプチドと前記 (b)群のポリぺプチドとの結合状態を謂面すればよ い。
目的の化合物を選択する際に、 支衛本に結合させるポリべプチドは前記 (a)群 のポリぺプチドまたは前記 (b)群のポリぺプチドのいずれでもよい。 すなわち、 前記 (a)群のポリぺプチドを支謝本に結合させる: l ^には、 前記 (a)群のポリぺ プチドを固相化後、 前言己 (b)群のポリぺプチドと試験試料をあらかじめ混合した もの、 または試験試料添加後に前記 (b)群のポリペプチドを添加しても良い。 ま た、 前記 (b)群のポリペプチドを支 本に固相化する齢には、 同様に前記 (a) 群のポリぺプチドと試験試料とをあらかじめ混合したもの、 または試験試料添加 後に前記 (a)群のポリべプチドを添加しても良い。 以上の順序で添加した前記 (a )群のポリぺプチド、 前記 (b)群のポリぺプチド及び試験試料を適切な条件下で ィンキュベ一シヨンし、 前記 (a)群のポリぺプチドと前記 (b)群のポリぺプチド との結合状態を言¾5すること力くできる。 本発明のスクリ一二ング方法において、 試験試料をポリぺプチドに接触させる 群と共にコントロール群を設置してもよい。 コントローノレ群としては、 試験試料 を含まない陰性コントロ一ル群又は陽性コントロ一ル群あるいはその両群をおく こと力 きる。
本発明において結合したポリべプチドを検出又は測定する際、 単に結合したポ リベプチドを検出するだけでもよいし、 又は結合したポリべプチドを定量的に測 定してもよい。 これらの ii^、 試験試料を含まない陰性コントロール群で得られ た結果、 試験 を含む群で得られた結果及び Z又は隨生コントロール群で得ら れた結果を比較することにより、 目的の化合物を検出すること力 ?きる。
また、 これらの結果を数値として得、 それらの数値を比較することにより、 目 的の化合物の活性を 的に測定することもできる。 的に測定する:^、 試 験試料を含まない陰' f生コントロール群で得られた数値と試験試料を適用した群で 得られた数値を比較することにより、 目的の化合物を検出すること力くできる。 陰 ' 才照と比較して、 得られた数値が増大あるいは減少していれば、 試験試料が目 的のィ匕^を含むと判定することができる。
また、 的に測定する;^、 前記 (a)群のポリペプチドと編己 (b)群のポリ ぺプチドとの結合を阻害すること力くわかっている化合物を既知量含む隠生コント ロール群で得られた数値により作成された標準曲線を元に することができる 。 結合したポリぺプチドが多い齢、 ポリぺプチドの結合を阻害する化合物の活 性が低く、 一方結合したポリぺプチドが少な 、 そのポリぺプチドの結合を
P且害する化合物の結合阻害活性が強いこと力推測される。
本発明において、 結合したポリぺプチドを検出又は測定する手段として表面プ ラズモン共鳴現象を利用した くィォセンサ一を使用することができる。 表面ブラ ズモン共鳴現象を利用した くィォセンサ一はポリぺプチド間の相互作用を の ポリぺプチドを用 ヽてカヽっ標識することなく、 表面ブラズモン共鳴シグナルとし てリアルタイムに観察することが可能である （例えば BIAcore Pharn cia製） 。 したがって、 BIAcore等のバイオセンサ一を用いることにより本発明で iffflさ れるポリペプチドの結合を言 面すること力河能である。 すなわち、 前記 (a)群の ポリべプチドと前記 (b)群のポリべプチドとの組み合わせの一方を固定化したセ ンサーチップに、 組み合わせのもう一方のポリぺプチドを接触させ、 固定ィヒした 一方のポリぺプチドに結合するポリぺプチドを共鳴シグナルの変化として検出し ようとするものである。
具体的には以下のように行えばよい。 初めにセンサーチップ CM5 (Biosensor 製） を活性化して前記 ω群のポリぺプチドと前記 (b)群のポリぺプチドとの組 み合わせの一方をセンサ一チップ上に固定化する。 すなわち、 EDC/NHS水溶液 (2 OOmM BDC (N-ethyl-N' -(3-dimethylaminopropyl) carbonate hydrochloride), 50 mM NHS (N- hydroxysuccinimi de))によりセンサ一チップを活性ィ匕した後、 HBSバ ッファ一（lOmM HEPES pH7. 4， 150mM NaCl, 3. 4mM EDTA, 0. 05% Tween20)により センサーチップを洗浄する。 次に HBSバッファ一に溶解した適量の相互作用を有 するポリぺプチドをセンサーチップに接触させ、 固定化する。 HBSバッファ一に よりセンサーチップを洗浄後、 エタノ一ルァミン溶液（1M ethanolamine hydroch loride, pH8. 5)によりセンサーチップ上の残存活'¾¾をプロックする。再び HBSバ ッファーによりセンサーチップを洗浄し結合 Wjffiに用いる。 次に HBSノ ッファー に溶解した適量のポリぺプチドを注入する。 このときにセンサーチップに固定化 されたポリぺプチドに結合する相互作用を有するポリぺプチドの量は共鳴シグナ ル値の増加として観察される。
さらに、 上記結合言¥¼系において、 一方のポリペプチドに相互作用を有するも う一方のポリぺプチドに弓 Iき続 、て試験試料を注入する。 また試験試料を注入す る群と共に、 コントロール群を設置してもよい。 コント口一ノレ群としては試験試 料を含まない陰'性コントロール群又は陽 f生コントロール群あるいはその両群をお くことができる。
結合したポリぺプチドは共鳴シグナル値の変ィ として 的に測定すること 力できる。 この: ti^、 試験試料を含まない陰生コントロ一ル群で得られた結果、 試験試料を含む群で得られた結果及び/又は陽 f生コントロール群で得られた結果 を比較することにより、 目的の化合物を検出、 決定すること力できる。 本発明に ぉ 、て、 結合したポリぺプチドを検出又は測定する手段として、 I、ずれかのポリ ペプチドを標識し、 結合したポリペプチドの標識を利用すること力くできる。 例え ば、 前述のスクリ一ニング方法にお 、て、 試験試料とともに一方のポリぺプチド に接触させるもう一方のポリぺプチドをぁらカヽじめ標識しておき、 試験試料とと もにィンキュベ一トした後、 洗浄して結合しているポリべプチドをその標識によ り検出又は測定する。 すなわち、 好ましくは支 本に結合させた一方のポリぺプ チドに試験試料と標識したもう一方のポリべプチドを接触させる。 ィンキュベ一 トした後、 洗浄して、 結合しているポリペプチドの標識を検出又は測定すればよ い。
本発明で使用されるポリぺプチドは、 通常知られる方法により標識されること 力できる。 標識物質としては、 例えば放射性同ィ4¾素、 酵素、 蛍光物質、 ビォチ ン /ァビジン等が挙げられる。 これらの標識物質は市販の標識物質を使用するこ と力できる。 放射性同位元素しては、 例えば3 2 P， 3 3P, 1 3 1 1, 1 2 5 I, 3H, 1 4C， 3 5Sが挙げられる。 酵素としては、 例えばアルカリフォスファタ一ゼ、 ホース ラディッシュパ一ォキシダ一ゼ (HRP)、 3 _ガラクトシダ一ゼ、 /3—グルコシダ —ゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、 例えばフロォロセインイソチオシァネ —ト（FITC)、 ローダミン力《挙げられる。 これらは巿販のものを入手すること力で き、 公知の方法によって標識される。 具体的には、 次のようにして行うことがで きる。 すなわち、 いずれかのポリペプチドを含む激夜をプレートに加え、 一夜放 置する。 プレートを洗浄の後、 ポリペプチドの 寺異的な結合を防ぐため例えば BSAでブロッキングする。 再び洗浄し、 試験試料ともう一方の標識されたポリべ プチドをプレートに加える。 同時に試験試料を含まない陰性コントロール群及び Z又は陽 f生コントロール群を置き、 これらをインキュベートする。 インキュべ一 卜の後、 洗浄し結合したポリべプチドを検出又は測定する。 検出又は測定には、 放射性同 素の: ^液体シンチレ一シヨンにより検出又は測定する。 酵素の場 合その基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出又は測 定する。蛍光物質の: ^蛍光 計により検出又は測定する。 これらの結果を、 コントロール群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を決定することができ る。
本発明において、 結合したポリペプチドを検出又は測定する手段として、 前記 (a)群のポリぺプチドと前記 (b)群のポリぺプチドとの組み合わせにて、 一方の ポリペプチドを特異的に認識する一次抗体を用いること力くできる。 例えば、 一方 のポリべプチドに試験試料とともにもう一方のポリべプチドを接触させ、 試験試 料とともにィンキュベ一トした後、 洗浄して結合しているポリべプチドをそのポ リペプチドを特異的に認識する一次抗体により検出又は測定する。 すなわち、 好 ましくは支樹本に結合させた一方のポリぺプチドに試験試料ともう一方のポリぺ プチドを接触させる。 インキュベートした後、 洗浄して、 結合しているポリぺプ チドをそのポリぺプチドを特異的に認識する一次抗体により検出又は測定すれば よい。 一次抗体は、 好ましくは標識物質により標識されている。 具体的には、 次 のようにして行うことができる。 すなわち、 ヽずれかのポリぺプチドを含む激夜 をプレートに加え、一 置する。 プレートを洗浄の後、 ポリペプチドの非特異 的な結合を防ぐため例えば B S Aでブロッキングする。 再び洗浄し、 試験試料と もう一方のポリべプチドをプレー卜に加える。 同時に試験試料を含まない陰性コ ントロール群及び Z又は陽 f生コントロール群を置き、 これらをィンキュベ一卜す る。 ィンキュベ一卜の後、 洗浄し試験試料と共に加えたポリべプチドに対する抗 体を加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄しそのポリぺプチ ドを特異的に認識する一次抗体によりポリぺプチドを検出又は測定する。 検出又 は測定には、 ¾寸性同位元素の^、 液体シンチレ一シヨンにより検出又は測定 する。酵素の場合その基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計に より検出又は測定する。 蛍光物質の 蛍光光度計より検出又は測定する。 これ らの結果を、 コントロール群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を決定す ること力できる。
本発明において、 結合したポリペプチドを検出又は測定する手段として、 本発 明に使用されるポリべプチドと融合した他のぺプチドを特異的に認識する一次抗 体を用いることができる。 例えば、 前述のスクリ一ニング方法にお 、て、 、ずれ かのポリべプチドに試験 |¾斗とともにもう一方のポリべプチドを接触させ、 試験 とともにィンキュベートした後、 洗浄して結合しているポリべプチドをその ポリべプチドと融合した他のぺプチドを特異的に認識する一次抗体により検出又 は測定する。 すなわち、 好ましくは^本に結合させた一方のポリぺプチドに試 験 斗ともう一方のポリぺプチドを接角虫させる。 ィンキュベ一トした後、 洗浄し て、 結合して 、るポリぺプチドをそのポリぺプチドと融合した他のぺプチドを特 異的に認識する一次抗体により検出又は測定すればよい。 一次抗体は、 好ましく は標識物質により標識されている。 具体的には、 次のようにして行うこと力くでき る。 すなわち、 いずれかのポリペプチドを含む溜夜をプレートに加え、 一夜放置 する。 プレートを洗浄の後、 ポリペプチドの 異的な結合を防ぐため例えば B
S Aでブロッキングする。再び洗浄し、 試験^ と他のペプチドと融合したもう 一方のポリべプチドをプレー卜に加える。 同時に試験試料を含まない陰性コント ロール群及び Z又は陽性コントロールを置き、 これらをィンキュベー卜する。 ィ ンキュベートの後、 洗浄し試験試料と共に加えたポリべプチドと融合した他のぺ プチドに対する抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを洗浄 しそのポリべプチドと融合した他のぺプチドを特異的に認識する一次抗体により ポリペプチドを検出又は測定する。 検出又は測定には、 方 id寸性同 素の: ^液 体シンチレ一シヨンにより検出又は測定する。酵素の その基質を加え、 基質 の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出又は測定する。 蛍光物質の場合 蛍光光度計により検出又は測定する。 これらの結果を、 コントロール群で得られ た数値と比較すれば目的の化合物を決定することができる。
本発明において、 結合したポリペプチドを検出又は測定する手段として、 本発 明で iffflされるポリペプチドを特異的に認識する一次抗体及び該一次抗体を特異 的に認識する二次抗体を用いること力できる。 例えば、 いずれかのポリペプチド に試験試料とともにもう一方のポリぺプチドを接触させ、 試験試料とともにイン キュベ一トした後、 洗浄して結合しているポリぺプチドをそのポリぺプチドを特 異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又 は測定する。 すなわち、 好ましくは 本に結合させたいずれかのポリぺプチド に試 料ともう一方のポリペプチドを接触させる。 インキュベートした後、 洗 浄して、 結合して 、るポリぺプチドをそのポリぺプチドを特異的に認識する一次 抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定すればよい。 二次抗体は、 好ましくは標識物質により標識されている。 具体的には、 次のよう にして行うことができる。 すなわち、 レヽずれかのポリぺプチドを含む溜夜をプレ —卜に加え、 一夜放置する。 プレートを洗浄の後、 ポリペプチドの #寺異的な結 合を防ぐため例えば B S Aでプロッキングする。 再び洗浄し、 試験試料ともう一 方のポリぺプチドをプレートに加える。 同時に試験試料を含まない陰性コントロ —ル群及び Z又は陽 ί生コントロール群を置き、 これらをインキュベートする。 ィ ンキュベートの後、 洗浄し試験試料と共に加えたポリべプチドと融合した他のぺ プチドに対する一次抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 プレートを 洗浄し、 次いで一次抗体を特異的に認識する二次抗体を加える。 適度なインキュ ベ一シヨンの後、 洗浄して、 そのポリペプチドを特異的に認識する一次抗体を特 異的に認識する二次抗体によりポリぺプチドを検出又は測定する。 検出又は測定 には、 ¾寸性同ィ4¾素の^、 液体シンチレ一シヨンにより検出又は測定する。 酵素の場合その基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検 出又は測定する。 蛍光物質の齢、 蛍光體計により検出又は測定する。 これら の結果を、 コントロール群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を選択する こと力 きる。
本発明において、 結合したポリペプチドを検出又は測定する手段として、 ポリ ぺプチドと融合した他のぺプチドを特異的に認識する一次抗体及び一次抗体を特 異的に認識する二次抗体を用いること力くできる。 例えば、 前述のスクリーニング 方法にぉレ、て、 、ずれかのポリぺプチドに試験試料とともにもう一方のポリぺプ チドを接虫させ、 試験 1^ とともにインキュベートした後、 洗浄して結合してい 一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定する。 す なわち、 好ましくは細本に結合させた一方のポリぺプチドに試験試料ともう一 方のポリペプチドを接触させる。 インキュベートした後、 洗浄して、 結合してい 一次抗体及び一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出又は測定すればよ い。 二次抗体は、 好ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、 次のようにして行うこと力くできる。 すなわち、 いずれかのポリぺプ チドを含む激夜をプレートに加え、 ー¾¾置する。 プレートを洗浄の後、 ポリべ プチドの 寺異的な結合を防ぐため例えば B S Aでプロッキングする。再び洗浄 し、 試験試料と他のぺプチドと融合したもう一方のポリべプチドをプレー卜に加 える。 同時に試験試料を含まない陰性コントロール群及び/又は隠生コントロ一 ノレ群を置き、 これらをィンキュベー卜する。 ィンキュベ一卜の後、 洗浄し試験試 料と共に加えたポリべプチドと融合した他のぺプチドに対する一次抗体を加える 。 適度なインキュべ一ションの後、 プレートを洗浄し、 次 、で一次抗体を特異的 に認識する二次抗体を加える。 適度なインキュベーションの後、 洗浄して、 その ポリべプチドと融合した他のぺプチドを特異的に認識する一次抗体を特異的に認 識する二次抗体によりポリペプチドを検出又は測定する。 検出又は測定には、 放 射性同位元素の ¾^液体シンチレ一シヨンにより検出又は測定する。 酵素の その基質を加え、 基質の酵素的変化、 例えば発色を吸光度計により検出又は測定 する。 蛍光物質の齢蛍光楚計により検出又は測定する。 これらの結果を、 コ ントロ一ル群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を決定することができる より詳しくは、 本発明は特に好ましくは EL ISA (Enzyme- l inked Immunosorbent Assay) により次のようにして行うこと力《できる。 すなわち、 他のペプチド、 例 えば 6 xHisと融合した前記 (a)群のポリペプチドを固相化バッファ一 (0. 1M Na HC03, 0. 02% NaN3, PH9. 6)により希釈する。 96穴のィムノプレート（Nunc製 ) の各穴に希釈したこの水溜夜を 口え 4 °Cでー晚ィンキュベー卜する。 洗浄バッファー (PBSに 0. 05% Tween20となるよう調製したもの） で 3回各穴を洗 浄後、 PBS に溶解した 5% BSA (SIGMA®)溜夜 200 〃1をカロえ、 4 °Cで一晚ブロ ッキングする。 次に洗浄バッファ一で 3回各穴を洗浄し、 希釈バッファー (1% BS A, 0. 5%Tween20, PBS) で希釈した他のペプチド、 例えば FLAGと融合した前記 (b )群のポリぺプチドと試験試料を適働 Πえ、 4 °C〜室温で 1秒〜 3時間、 好まし くは 3秒〜 2時間、 より好ましくは 10秒〜 30分間インキュベートする。 洗浄バッ ファーで各穴を 3回洗浄し、 希釈バッファーで 3 /g/mlに希釈したマウス抗 FLAG M2抗体 (IBI製） を 100 l各穴に加え、 室温で 1時間インキュベートする。 洗 浄バッファーで各穴を 3回洗浄し、 希釈バッファーで 1000倍に希釈したアル力リ フォスファタ一ゼ標識ャギ抗マウス IgG抗体 (ZYMED製） を 100 n 1各穴に加え、 室温で 1時間インキュベートする。 洗浄バッファ一で 5回各穴を洗浄し、 発色溶 液 （基質バッファー； 50m NaHC03， 10m MgCl 2, pH9. 8 に lmg/mlの濃度に溶 解した P-フエニルフォスフェート； SIGMA製） を 100〃1各穴に加え、 室温で反 応させた後に 405nmでの吸 をマイクロプレートリ一ダー (Model 3550, BIO - R AD製） を用いて測定する。 これらの糸吉果を、 陰性コントロール群及び Z又は陽性 コントロール群で得られた数値と比較すれば目的の化合物を決定することができ る。 なお、 本発明の抗体を利用した検出または測定においては、 二次抗体に代え てプロテイン Gやプロテイン Aを用いることも可能である。
本発明のスクリーニング方法は、 High Throughput Screening (HTS)を使用す ること力くできる。 具体的には、 プロッキングまでを手作業で行しゝ、 その後の反応 はロボッ卜によって行うことでオートメーション化し、 High Throughput screen in を実現すること力くできる。 すなわち、 他のペプチド、 例えば 6 xHisと融合 した前記 (a)群のポリぺプチドを固相化バッファー (0. 1M NaHC03, 0. 02% NaN PH9. 6)により希釈する。 96穴のィムノプレート（Nunc製） の各穴に希釈した この水溜夜を適 fttaえ 4 °Cでー晚ィンキュベ一卜する。 洗浄バッファ一 (PBSに 0. 05¾ Tween20となるよう調製したもの） で 3回各穴を洗浄後、 PBSに溶解した 5% BSA (SIGMA製） 溜夜 200 z lを加え、 4 °Cで一晩ブロッキングする。 次に、 例 えば Biomek 2000 HTS system (Beckman製） にブロッキング済みのィムノブレ一 トをセットしてシステムのコントロールプログラムを実行する。 この際、 分注機 としては Biomek 2000分注機 (Beckman製） あるいは Mul tipipette 96穴同時分注 器 (Sagian製） を用いることでィムノブレ一ト各穴への溜夜の分注や溜夜の除去 をτうこと力くできる。 また、 ィムノプレートの各穴の洗浄には EL404マイクロプ レートウォッシャー (Bio Tek製） を用いること力くできる。 また、 吸 の測定に は SPECTRA max 250 プレートリーダ一 (Molecular Devices製） を用いることがで きる。 プログラムは以下の操作をおこなうよう設定する。 すなわち洗浄バッファ —で 3回各穴を洗浄し、 試験試料と希釈バッファ一（1% BSA, 0. 5¾ Tween20, PBS ) で希釈した他のペプチド、 例えば MB P (マルト一ス結合ポリペプチド） と融 合した前記 )群のポリペプチドを適動口える。 同時に試隠料を含まない陰性 コント口ール群及び陽 f生コントロ一ルを置き、 これらを 4 °C〜室温で 1秒〜 3時 間、 好ましくは 3秒〜 2時間、 より好ましくは 10秒〜 30分間ィンキュベ一卜する 。 洗浄くッファ一で各穴を 3回洗浄し、 希釈 ファ一で 5000倍に希釈したゥサ ギ抗 MB P抗血清 (New England Biolabs製） を 100〃 1各穴に加え、 室温で 1時 間インキュベートする。 洗浄バッファ一で各穴を 3回洗浄し、 希釈バッファ一で 5000倍に希釈したアル力リフォスファタ一ゼ標識ャギ抗ゥサギ IgG抗体 (TAG0製 ) を 100〃 1各穴に加え、 室温で 1時間インキュベートする。 洗浄バッファ一で 5回各穴を洗浄し、 発色離 （基質バッファ一； 50mM NaHC03， 10mM MgCh, PH9. 8に lmg/mlの濃度に溶解した p-ニトロフエニルフォスフェート； SIGMA製） を 100 a 1各穴に加え、 室 で反応させた後に 405nmでの吸光度をマイクロプレ —トリ一ダー、 Biomekプレ一トリ一ダ一 (Beckman/Molecular Devices製) 用い て測定する。 これらの結果を、 コントロール群で得られた数値と比較すれば目的 の化合物を同定することができる。
本発明においてィ ffflされる抗体として、 市販の抗体や市販のキットに含まれる 抗体を用いることもできるし、 公知の手段を用いて得られるモノクロ一ナル抗体 またはポリクローナル抗体を用いることもできる。 モノクローナル抗体は、 所望 の感作抗原を iffflして、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免 細胞を通常の細胞融合法によって公知の親钿胞と融合させ、 通常のスクリー二 ング法により、 モノクローナル抗体産生钿胞をスクリーニングすることによって 作製できる。 本発明において、 結合したポリペプチドを検出又は測定する手段として、 前記 (a)群のポリぺプチドと前記 (b)群のポリぺプチドとの組み合わせにて、 両方の ポリぺプチドをそれぞ ^定の蛍光夕ンパク質との融合ポリぺプチドとすること で、 蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動 （FRET、 f luorescent resonan ce energy transferリ を用いること力くできる (A. Miyawaki et al. Nature vo 1. 388 :882-887, 1997 ; N. Mochizuki et al. Nature vol. 411 : 1065- 1068 ;宫脇敦 GFPとバイオイメージング 羊土社） 。 近接した蛍光タンパク分子間でお こる蛍光共鳴エネルギー移動の測定により、 （a)群と（b)群のポリぺプチドの結 合を検出するものである。 例えば、 （a)群のポリペプチドと黄色蛍光タンパク質 (YFP) との融合ポリぺプチドの活性型、 （b)群のポリぺプチドと藍色蛍光タン ノ、。ク質 （CFP) との融合ポリペプチドとを接触させる。 両群のポリペプチドが結 合すればこれらに融合しいる YFPおよび CFPは近接した状態となる。 このような 状況下で CFPの励起波長である 433nmで励起すると、 そのエネルギーが ΎΙ に移 る蛍光共鳴エネルギー移動の結果、 YFPの放射波長である 527nmの放射が測定さ れる。 従って、 （a)群と (b)群のポリペプチドの結合を阻害するような化合物を 含む試験試料の 下で、 これらの融合ポリペプチドを接触させると、 蛍光共鳴 エネルギー移動が減少し、 527nmの放射が減少するので、 試験試料の存在下、 非 下での放射の強度を比較することで、 （a)群と (b)群のポリぺプチドの結合 を調節する化合物等がスクリーニングされる。 蛍光共鳴エネルギー移動は、 前記 のような 2分子システムのほか、 1分子中に (a)群のポリぺプチドと黄色堂光タ ンパク質 （YFP) との融合ポリぺプチドと )群のポリぺプチドと^ 蛍光タン パク質 （CFP) 力くスぺ一サ一を挟んで存在するような分子内でもおこり、 この場 合の検出感度はスぺ一サ一の長さを調節することで可能である。 さらに、 いずれ 力、一方または両方の群のポリぺプチドがこれらの蛍光タンパク質との融合ポリぺ プチドではなく、 それぞれの群のポリぺプチドに対する抗体が YFP、 CFPでそれ ぞ 識されている でも、 蛍光共鳴エネルギー移動は観察されるので、 これ らの形態のものも本発明のスクリ一ニング方法に使用できる。
また、 前記の蛍光タンパク質との融合ポリペプチドは細胞内で発現する （2分 子システムの は共発現） 細胞を本発明のスクリーニングに用いること力でき る。 この i¾、 （a)群と（b)群のポリペプチドの結合の検出または測定と、 p 30 力《関与する生物活性の検出または測定とを同時に行うこと力できる。 例えば1 N. M ochizuki et al. Nature vol. 411 : 1065 - 1068ゃ宮脇敦史編 GFPとバイオィメ一 ジング 羊土社に記載の方法に準じて行うこと力くでき、 スクリ一ニングに用 、る 細胞を試験試料の^ ¾下または非存在下で培養することにより上記の検出または 測定が可能である。 本発明では、 「遺伝 且換え技術」 を利用して所定の核酸を単離 ·配列決定し たり、 組換え体を作製したり、 所定のペプチドを得ること力くできる。 本明細書中 使用できる遺^ a換え技術としては、 当該分野で知られたもの力挙げられ、 例 えば J. Sambrook, B. F. Fri tsch k T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Lab oratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) ; D. M. Glover et al. ed. , "DNA Cloning",
2nd ed. , Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxfor d Universi ty Press (1995)；日本生化学会編、 「続生化学実験講座 1、 遺伝子研 究法 I I」 、 東京化学同人（1986) ;日本生化学会編、 「新生化学実験講座 2ヽ 核酸
I I I (組換え DNA技術） 」 、 東京化学同人（1992) ; "Methods in Enzymology" シリーズ， Academic Press, New York [列えは、 R. Wu ed.， "Methods in Enzymol ogy", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980)； R. Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) k 101 (Recombinant DNA, Part C)， Academic Press, New York (1983) ; R. Wu et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D)，
154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F)， Academic
Press, New York (1987)； J. H. Mi l ler ed. , "Methods in Bnzymology", Vol.
204, Academic Press, New York (1991)； R. Wu ed.， "Methods in Enzymology ，，， Vol. 216 (Recombinant DNA, Part G)， Academic Press, New York (1992)； R. Wu ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 217 (Recom inant DNA, Part H) k
218 (Recombinant DNA, Part I), Academic Press, New York (1993)； G. M. A ttardi et al. ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 260 (Mi tochondrial Biog enesis and Genetics, Part A), Academic Press, New York (1995)； J. L. Cam pbel l ed.， "Methods in Enzymology", Vol. 262 (DNA Repl ication), Academi c
Press, New York (1995)； G. M. Attardi et al. ed. , "Methods in Bnzymolog y", Vol. 264 (Mi tochondrial Biogenesis and Genetics, Part B)， Academic P ress, New York (1996)； P. M. Conn ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 302
(Green Fluorescent Protein), Academic Press, New York (1999)； S. Weissm an ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 303 (cDNA Preparation and Characte rization), Academic Press, New York (1999) ; J. C. Glorioso et al. ed. , " Methods in Bnzymology", Vol. 306 (Expression of Recombinant Genes in Buk aryotic Systems), Academic Press, New York (1999) ; M. Ian Phi l l ips ed.， "Methods in Enzymology", Vol. 313 (Ant i sense Technology, Part A: General
Methods, Methods of Del ivery and RNA Studies) & 314 (Ant i sense Techno lo gy, Part B: Appl ications), Academic Press, New York (1999)； J. Thorner e t al. ed.， "Methods in Bnzymology", Vol. 326 (Appl ications of Chimeric G enes and Hybrid Proteins, Part A: Gene Expression and Protein Purif icati on), 327 (Ap l ications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part B: Ce 11 Biology and Physiology) & 328 (Appl ications of Chimeric Genes and Hyb rid Proteins, Part C: Protein-Protein Interactions and Genomics), Academ ic Press, New York (2000) などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記 載の方法ある 、はそれらと実質的に同様な方法や改変法が挙げられる （それらの 中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる） 。 本明細書で用いる用語 「ポリペプチド」 としては、 以下に記載するような如何 なるポリぺプチドを指すものであつてもよい。 ポリぺプチドの基本的な構造は周 知であり、 当該技術分野にぉレ、て非常に数多くの参考書及びその他の刊行物に記 載がある。 こうしたことに鑑み、 本明細書で用いる用語 「ポリペプチド」 は、 ぺ プチド結合又は修飾したべプチド結合により互レ、に結合してレ、るような 2個又は それ以上のァミノ酸を含む任意のぺプチド又は任意のタンパク質を意味する。 本 明細書で用いる用語 「ポリペプチド」 としては、 当該分野において、 例えばぺプ チド、 ォリゴぺプチドあるいはべプチドォリゴマ一とも称せられる短い鎖のもの 、 及びタンパク質と一般的に言われ、 多くの形態のもの力く知られている長い鎖の ものの両方を通常意味してよい。 ポリペプチドは、 しばしば、 通常、 天然型アミ ノ酸 （^然に しているアミノ酸： あるいは遺伝子でコードされるアミノ酸） と称されるァミノ酸以外のァミノ酸を含有して 、てもよい。 ポリぺプチドは、 ま た末端ァミノ酸残基を含めて、 その多くのァミノ酸残基が翻訳された後にプロセ ッシング及びその他の改変 （あるいは修飾） されるといつた天然の工程によるの みならず、 当業者に周知の化学的改変技術によっても、 上記のポリペプチドはそ れが改変 （修飾） できることは理解されよう。 該ポリペプチドに加えられる改変
(修飾） については、 多くの形態のものカ¾1られており、 それらは当該分野の基 礎的な参考書及びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記載されて おり、 これらは当業者に周知である。 幾つ力、のとりわけ常套的な改変.修飾とし ては、 例えばアルキル化、 ァシル化、 エステル化、 アミ ド化、 グリコシル化、 脂 質結合、 硫酸化、 リン酸化、 グルタミン酸残基のァ一カルボキシル化、 水酸化及 び ADP-リボシル化等力挙げられ、 例えば T. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, Second Edi tion, W. H. Freeman and Company, New
York, (1993)； B. C. Johnson (Ed. ), Posttranslational Covalent Modif icatio n of Proteins, Academic Press, New York, (1983) (Wold, F. , "Posttranslat ional Protein Modif ications: Perspective and Prospects", pp. 1-12)； Seif t er et al. , "Analysis for Protein Modif ications and nonprotein cofactors" ， Methods in Bnzymology, 182: 626-646 (1990)； Rattan et al. , "Protein Sy nthesis : Posttranslational Modif ication and Aging", Ann. N. Y. Acad. Sci.
663 : p. 48-62 (1992)等の記載を参照できる。 本発明の代表的な P30 タンパク質としては、 図 1のポリぺプチドのァミノ酸酉己 列またはそれと実質的に同等なァミノ酸配列を有するポリベプチドが挙げられ、 例えば、 該アミノ酸配列のうちの少なくとも 5〜213個の 続したアミノ酸残基 を有し且つ Rapl結合活 ttXは優勢抑制型機能ある 、は同等の抗原性などといった 実質的に同等の生物学的活性を含めた生物学的活性を有するもの、 あるいはそれ らの特徵を有し且つ図 1の各ドメィンの 、ずれか一つと少なくとも 50%より高い 相同性、 あるいは少なくとも 60% より高 、相同性、 あるいは少なくとも 70% より 高い相同' f生、 あるいは少なくとも 80%より高い相同性、 あるいは少なくとも 90% より高い相同性、 あるいは少なくとも 95%以上の相同性、 あるいは少なくとも 98 %以上の相同性を有するものなどで、 新規なもの力挙げられる。
本発明のヒト p30関連ポリぺプチドとしては、 図 1のアミノ酸配列の全部又は 一部を含む連镜したァミノ酸残基、 あるいは該図 1のァミノ酸配列のうちの連続 したアミノ酸残基 5個以上、 好ましくは 10個以上、 また好ましくは 20個以上、 さ らに好ましくは 30個以上、 より好ましくは 40個以上、 また好ましくは 50個以上、 さらに好ましくは 60個以上、 もっと好ましくは 70個以上、 また好ましくは 80個以 丄 さらに好ましくは 90個以上、 もっとも好ましくは 100個以上、 また好ましく は 110個以上を有するものが挙げられる。 本発明の p30関連ポ 11 は、 図 1のアミノ酸配列の一部または^ ¾を有していてもよい （開始コドンに対 応する Metを欠いていてもよい） 。 こうした配列を有するものはすべて包含され てよい。 本発明で扱うもの及び当該 P30 夕ンパク質又はポリぺプチドをコ一ドする核酸 は、 代表的には図 1で表されるぺプチド及びその一部の連続したァミノ酸配列を コ一ドする塩基配列を含有するもの、 あるいは当該塩基配列の少なくともべプチ ドコード H域により構成される塩基配列を含有するもの （各特徵的なドメィンの みをコ一ドするものも包含する） 、 コ一ド配列に開始コドン （Met をコ一ドする コドン） 及び終止コドンを 口したもの、 また、 該塩基配列がコ一ドするタンパ ク質と少なくとも 50%の相同性を有するアミノ酸配列を持ち且つ図 1などのァミ ノ酸配列のうちの少なくとも特徵的な速繞したァミノ酸残基を有し、 尚且つ Rapl 結合活 ttXは優勢抑制型機能ある 、は同等の ¾¾¾性などのそれと実質的に同等の 生物学的活性を含めた生物学的活性を有するぺプチドをコ一ドするといつたそれ と同効の塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。
当該タンパク質をコードする核酸は、 一本鎖 DM、
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、 RNA、 DNA:RNA ハイプリッド、 合成 DNAなどの核酸であり、 またヒトゲノム DNA、 ヒトゲノミツ ク DNA ライブラリ一、 ヒト紙織'細胞由来の cDNA、 合成 DNAのいずれであっても よい。 該当該タンパク質をコードする核酸の塩基配列は、 修飾 （例えば、 付加、 除去、 置換など） されることもでき、 そうした修飾されたものも包含されてよい
0 さらには、 以下説明するように、 本発明の核酸は、 本発明のペプチドあるいは その一部をコードするものであってよく、 好ましいものとしては DNA力《挙げられ る。 また上記 「同効の塩基配列」 とは、 例えばストリンジヱン卜な条件で当該塩 基配列のうちの遮続した 5個以上の塩基配列、 好ましくは 10個以上の塩基配列、 より好ましくは 15個以上の 配列、 さらに好ましくは 20個以上の塩基配列とハ イブリダイズし、 当該タンパク質と実質的に同等のァミノ酸配列をコードするも. のなどが挙げられる。 機能的に同等なタンパク質を取得 ·単離する方法の一つの態様としては、 タン パク質中のアミノ酸に変異を導人する方法が当業者によく知られている。 即ち、 当業者であれば、 公知の方法により、 天然型のタンパク質 （例えば、 図 1に記載 の P30 タンパク質） 中のアミノ酸を適宜置換、 欠失、 付加などして、 これと同等 の機能を有する改変タンパク質を調製すること力可能である。 また、 アミノ酸の 変異は自然界において生じることもある。 本発明のタンパク質には、 このように 天然型のタンパク質のァミノ酸配列において 1もしくは複数のァミノ酸が置換、 欠失もしくは付加したァミノ酸配列を有し、 天然型のタンパク質と同等の機能を 有するタンパク質も含まれる。 タンパク質におけるアミノ酸の改変は、 通常、 全 アミノ酸の 50アミノ酸以内であり、 好ましくは 30アミノ酸以内であり、 さらに好 ましくは 10アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 3アミノ酸以内である。 アミ ノ酸の改変は、 例えば、 変異や置換であれば 「Transformer Si te-directed uta genesis Ki t J や 「ExSi te PGR- Based Si te-directed Mutagenesis Ki tj (CI on tech社製） を用いて行うこと力く可能であり、 また、 欠失であれば 「Qimntum leap Nested Deletion Ki tj (Clontech¾ ) などを用いて行うこと力く可能である。 変異.変換.修飾法としては、 日本生化学会編、 「 化学実験講座 1、 遺伝 子研究法 I I 」、 P105 (広瀬進） 、 東京化学同人 (1986) ; 日本生化学会編、 「新 生化学実験講座 2、 核酸 I I I (組換え DNA技術） 」 、 p233 OS瀬進） 、 東京化学 同人（1992) ; R. Wu， L. Grossman, ed.， "Methods in Enzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367， Academic Press, New York (1987)； R. Wu， L. Grossman, ed .， "Methods in Enzymology", Vol. 100， p. 457 & p. 468, Academic Press, N ew York (1983) ; J. A. Wells et al. , Gene, 34: 315, 1985; T. Grundstroem et al. , Nucleic Acids Res. , 13 : 3305, 1985; J. Taylor et al. , Nucleic A cids Res. , 13: 8765, 1985; R. Wu ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987)； A. R. Ol iphant et al. , Gene, 44: 177, 1986 などに記載の方法が挙げられる。 例えば合成オリゴヌクレオチド などを利用する位置指定変異導入法 （部位特異的変異導入法） (Zol ler et al. , Nucl. Acids Res. , 10: 6487, 1987; Carter et al. , ucl. Acids Res. , 13: 4 331, 1986)， カセッ ト変異導入法 (cassette mutagenesis: Wells et al. , Gene ， 34: 315， 1985), 制限部ィ i¾択変 入法 (restriction selection mutagene sis : Wells et al.， Phi los. Trans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986), ァラニン .スキャンニンク、'法 （Cunningham & Wel ls, Science, 244: 1081-1085， 1989), PCR変異導入法， Kunkel法， dNTP[ S]法 （Eckstein)，亜硫酸や亜硝酸 などを用レ、る領 旨定変^ »入法等の方法が挙げられる。 本明細書において、 「実質的に同等」 あるいは 「実質的に同一」 とはタンパク 質の活性、 例えば、 結合活性、 生理的な活性、 生物学的な活性が実質的に同じで あることを意味する。 さらにまた、 その用語の意味の中には、 実質的に同質の活 性を有する を包含していてよく、 該実質的に同質の活性としては、 細胞接着 •移動の制御などを挙げること力くできる。 該実質的に同質の活性とは、 それらの 活性が性質的に同質であることを示し、 例えば、 生理的に、 薬理学的に、 あるい は生物学的に同質であることを示す。 例えば、 結合活性などの活性が、 同等 （例 えば、 約 0. 001〜約 1000倍、 好ましくは約 0. 01〜約 100倍、 より好ましくは約 0 . 1〜約 20倍、 さらに好ましくは約 0. 5〜約 2倍） であること力く好ましい力く、 これ らの活性の禾 Mg、 タンパク質の分子量などの量的な要素は異なつていてもよい。 当該ペプチド （Xはポリペプチド） は、 それが遊离醒のものとして得られた場 合には、 それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で塩に変換すること力くで き、 またそれらは塩として得られた齢には、 それ自体公知の方法あるいはそれ に準じた方法で遊醒のものあるいは他の塩に変換することができる。
当該ペプチド （又はポリペプチド） の塩としては、 生理的に許容されるものあ るいは医薬として許容されるものカ 子ましいが、 これらに限定されない。 こうし た塩としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 硝酸、 リン酸などの無機酸との 塩、 例えは！ ¾、 ギ 、 マレイン酸、 フマール酸、 コハク酸、 クェン酸、 酒石酸 、 リンゴ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 P-トルエンスルホン酸、 ベンゼンス ルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。 さらに該塩としては、 アンモニ ゥム塩、 例えばェチルァミン、 ジメチルァミン、 トリメチルァミン、 ヒドロキシ ェチルァミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。 また遺伝 且換え法で製造する時に融合夕ンパク質として発現させ、 生体内あ る 、は生体外で天然の所定の本発明のタンパク質と実質的に同等の生物学的活性 を有しているものに変換 ·加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生 法を用いること力できる力、 こうした融合タンパク質はその融^^を利用してァ フィニテイク口マトグラフィ一などで精製することも可能である。 こうした融合 タンパク質としては、 ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、 あるいは、 β - ガラクトシダ一ゼ （/3- gal) 、 マルト一ス結合タンパク （MBP)， グルタチオン- S -トランスフェラ一ゼ （GST)、 チォレドキシン （TRX)又は Cre Recombinaseのァ ミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられる。 同様に、 ポリペプチドは 、 ヘテロジーニアスなェピトープのタグを付加され、 該ェピトープに特異的に結 合する抗体を用いてのィムノアフィニティ ·クロマトグラフィーによる精製をな し得るようにすることもできる。 より適した ¾1態様においては、 該ェピトープ タグとしては、 例えば AU5， c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu -Glu, HA, Ha. 11, KT3, FLAG (registered trademark, Sigma-Aldrich), Omni-p robe, S - probe, T7, Lex A, V5， VP16, GAL4, VSV-Gなどが挙げられる。 (Field et al. , Molecular and Cellular Biology, 8: pp. 2159-2165 (1988) ; Evan et al. , Molecular and Cellular Biology, 5: pp. 3610-3616 (1985)； Paborsky e t al. , Protein Engineering, 3(6) : pp. 547-553 (1990)； Hopp et al. , BioTec hnology, 6: pp. 1204-1210 (1988)； Martin et al.， Science, 255: pp. 192-194
(1992)； Skinner et al.， J. Biol. Chem. , 266: pp. 15163-15166 (1991)； Lut z-Freyermuth et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: pp. 6393-6397 (1990) など） 。 酵母を利用した two- hybrid法も利用できる。 さらに融合タンパク質としては、 検出可能なタンパク質となるような標識を付 されたものであることもできる。 より好適な難態様においては、 該検出可能な 標識は、 ピオチン Zストレプトアビジン系の Biotin Avi Tag, 螢光を発する物質 などであってよい。 該螢光を発する物質としては、 ォワンクラゲ （Aequorea vie torea)などの発光クラゲ由来の糸 ife螢光タンパク質 (green f luorescent protein ： GFP), それを改変した変異体 (GFPバリアント）、例えば、 EGFP (Enhanced- hum anized GFP), rsGFP (red-shift GFP), 黄色螢光タンパク質 （yellow fluoresce nt protein: YFP), 螢光タンパク質 (green fluorescent protein: GFP)，藍 色螢光タンパク質 （cyan fluorescent protein: CFP), Wfe螢光タンパク質 （bl ue f luorescent protein: BFP), ゥミシィタケ (Reni lla reniformis) 由来の GF P などが挙げられる （宫脇敦史編、 実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座 3 -GFP とノくィオイ一ジング、 羊土社（2000年))。 また、 上記融合タグを特異的に 認識する抗体 （モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む） を使用して検 出を行うこともできる。 タンパク質及びその一部のぺプチドの合成には、 当該べプチド合成分野で知ら れた方法、 例えば液相合成法、 固相合成法などの化学合成法を使用すること力で きる。 こうした方法では、 例えばタンパク質あるいはペプチド合細棚旨を用い 、 適当に保護したァミノ酸を、 それ自体公知の各種縮合方法により所望のァミノ 酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。 '縮合反応には、 好ましくはそれ自体公 知の各種活性化 を用いる力、 そうした としては、 例えばジシクロへキシ ルカルポジイミ ドなどカルポジイミ ド類を好ましく使用できる。 生成物力保護基 を有する には、 適宜保護基を除去することにより目的のものを得ること力くで さる。 ，
タンパク質は、 当業者に公知の方法により、 天然のタンパク質としての他、 遺 イ^且換え技術を利用して調製した組換えタンパク質として調製することができ る。 天然のタンパク質は、 例えば、 調製された組換えタンパク質をマウス、 ゥサ ギなどの小動物に免疫して得た抗体を適当な吸着体 （CNBr活性化ァガロースやト シル活性化ァガロース） に結合させてカラムを作製し、 得られたカラムを利用し て細胞のタンパク質抽出液を精製することにより調製すること力河能である。一 方、 組換えタンパク質は、 常法、 例えば、 当該タンパク質をコードする DNAを適 当な発現ベクターに揷人し、 該ベクタ一を適当な細胞に導入し、 該形質転換細胞 から精製することにより調製すること力く可能である。 ' 組換えタンパク質を生産するために用いられる細胞としては、 例えば、 植物細 胞、 大腸菌、 酵母などの «物細胞、 動物細胞、 昆虫細胞などが挙げられる。 ま た、 細胞内で組換えタンパク質を発現させるためのベクタ一としては、 例えば、 植物、 酵母細胞用にはプラスミ ド 「pBI121」 や 「pBI101」 (Clontech¾t ) 、 大 腸菌用にはプラスミ ド 「pET Expression system 」 （Stratageneネ ±M) や 「GST gene fusion Vectors 」 （Pharmacia社製） 、 ほ乳类攝田胞用にはプラスミ ド 「pM 眉」 （Clontechネ： h^) 、 昆虫細胞用にはプラスミ ド 「pBacPAK8. 9」 （Clontech社 製） などが挙げられる。 ベクタ一への DNAの揷人は、 常法、 例えば、 Molecular Cloning (Maniatis et al. , Cold Spring harbor Laboratry Press) に記載の方 法により行うこと力くできる。 また、 宿主钿胞へのべクタ一の導入は、 常法により 宿主細胞に応じてェレクトロボレ一ション法、 マイクロインジヱクション法、 ノ —テイクルガン法などの方法でfうことが可能である。 得られた形質転換細胞からの所望の組換えタンパク質の精製は、 タンパク質の 性質に応じ、 塩析ゃ有機溶媒による沈殿、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフ ィニティ一クロマトグラフィー、 免疫吸着体によるカラムクロマトグラフィ一、 ゲルろ過、 SDS電気泳動、 等電点電気泳動などを適: i¾aみ合わせて行うことカ坷 能である。 また、 当該組換えタンパク質をグルタチオン S-トランスフヱラーゼな どの標識との融合夕ンパク質として発現させた には、 該標識に対するァフィ 二ティークロマトグラフィーなどにより精製することも可能である。
また、 本発明は、 p30-Rapl結合の制御'結合の角? ί斤などに関連して利用される タンパク質などをコードする DNAを l共する。 該 DNA は、 本発明にしたがった所 定のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、 ゲノム DNA 、 cDNA 、 ィ匕学合成 DNAなどが含まれる。 ゲノム DNA は、 当該分野で知られた方法に従つ て調製したゲノム DMを铸型として、 所定の DNAの塩基配列 （例えば、 図 1に記 載の塩基配列） を基に作製したプライマ一を用いてポリメラーゼ'チヱイン · リ アクション（polymerase chain reaction; PCR)を行うことにより調製することが 可能である。 また、 cDNAであれば、 常法 (Maniatis et al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratry Press) により細胞から mRNAを調製し、 逆転写反 03 013937
3 9 応を行い、 上記と同様のプライマ一を用いて PCRを行うことにより調製すること 力く可能である。 また、 ゲノム DNAや cDNAは、 常法によりゲノム DNA ライブラリ一 または cDNAラィブラリ一を作製し、 このライブラリ一に対し、 例えば当該 DNAの 塩基配列 （例えば、 図 1に記載の塩基配列） を基に合成したプローブを用いてス クリーニングすることによっても調製することが可能である。 本明細書中、 PCR とは、 一般的に、 Saiki et aし Science, 239 :487(1988) ; 米国特許第 4， 683， 195号明細書などに記載されたような方法を指し、 例えば、 所 望のヌクレオチド配列をィンビト口で酵素的に増幅するための方法を指している 。 一般に、 PCR は、 铸型核酸と優先的にハイブリダィズすることのできる 2個の ォリゴヌクレオチドプラィマーを翻して、 ブラィマ一伸長合成を行うようなサ イクルを繰り返し亍うことを含むものである。典型的には、 PCR法で用いられる プライマ一は、 ■内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプ ライマ一を侧すること力くでき、 例えば、 該増幅されるべきヌクレオチド配列と その両端にぉ 、て相補的であるか、 あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列 に,しているものを好ましく^ fflすること力できる。 代表的な ¾^には、 5，端 側のプライマ一としては、 少なくとも開始コドンを含有する力、、 あるいは該開始 コドンを含めて増幅できるように選択し、 また 3'端側のブライマ一としては、 少 なくともストップコドンを含有する力、、 あるいは該ストップコドンを含めて増幅 できるように選択すること力 子ましい。 プライマ一は、 好ましくは 5個以上の塩 基、 さらに好ましくは 10個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、 より好まし くは 18〜35個の塩基からなるォリゴヌクレオチドが挙げられる。
PCR は、 当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法に より行うこと力くできる力く、 例えば 上記文献の他、 R. Saiki, et al.， Science, 230 : 1350, 1985 ; H. A. Brl ich ed. , PCR Technology, Stockton Press, 1989 ； D. M. Glover et al. ed. , "DNA Cloning", 2nd ed. , Vol. 1, (The Practica 1 Approach Series), IRL Press, Oxford Universi ty Press (1995)； M. A. Inn is et al. ed. , "PCR Protocols : a guide to methods and appl ications", Aca demic Press, New York (1990)) ; M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Tayl or (Ed. ), PGR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991) ; . A. Fro hman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85， 8998-9002 (1988) などに記載 された方法あるいはそれを修市したり、 改変した方法に従って行うこと力できる 。 また、 PCR は、 それに適した市販のキットを用いて行うことができ、.キット製 造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実 施することもできる。
PCR は、 代表的な; Ifi^には、 例えば铸型 （例えば、 mRNAを铸型にして合成され た DNA; 1st strand DNAなど） と該遺^ 1に基づいてデザインされたプライマ一 とを、 10 X反応緩衝液 (Taq DNAポリメラ一ゼに添付されている） 、 dNTPs (デォ キシヌクレオシド三リン酸 dATP， dGTP, dCTP, (ΠΤΡの混合物） 、 Taq DNA ポリメ ラ一ゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。 混合物を、 例えば、 GeneAmp 2400 PCR s ystem, Perkin-Elmer/Cetus などの自動サ一マルサイクラ一を用いて一般的な PC Rサイクノレ条件下にそのサイクルを 25〜60回繰り返すが、 増幅のためのサイクル 数は適宜目的に応じて適当な回数とすること力できる。 PCRサイクル条件として は、 例えば、 変性 90〜95°C 5〜100秒、 ァニ一リング 40〜60°C 5〜150秒、 伸長 65〜75°C 30 -300秒のサイクル、 好ましくは変性 94 。C 15秒、 ァニ一リング 58 。C 15秒、 伸長 72 °C 45秒のサイクノレが挙げられる力く、 ァニ一リングの反 応 及び時間は璧実験によって適当な値を選択できるし、 変性反応及び伸長 の時間も、 予想される PCR産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。 ァニ —リングの反応 は、 通常プライマーと錶型 DNA とのハイプリッドの Tm値に応 じて変えること力 子ましい。 伸長反応の時間は、 通常 lOOObpの鎖長当たり 1 分程 度がおおよその目安であるが、 より短い時間を選択することも ^により可能で ある。 得られた DNA の塩基配列は、 例えば 「シークェンサ一 Model310」 （ABI 社 製） を利用することにより額に決定することカ坷能である。 本明細書中、 「ォリゴヌクレオチド」 とは、 比較的短レ、一本鎖又は 鎖のポ リヌクレオチドで、 好ましくはポリデォキシヌクレオチドが挙げられ、 Angew. C hem. Int. Ed. Engl. , Vol. 28, p. 716-734 (1989) に記載されているような鹏ロ の方法、 例えば、 フォスフォトリエステル法、 フォスフォジエステノレ法、 フォス ファイ ト法、 フォスフォアミダイト法、 フォスフォネート法などの方法によりィ匕 学合成されることができる。 通常合成は、 修飾された固体支 本上で合成を便利 に行うことができること力く知られており、 例えば、 自動化された合成装置を用い て行うこと力くでき、 該装置は市販されている。該ォリゴヌクレオチドは、 又 はそれ以上の修飾された を含有して 、てよく、 例えば、 イノシンなどの天然 においては普通でない塩基あるいはトリチノレ化された塩基などを含有していてよ いし、 によっては、 力一の付された塩基を含有していてよい。 所定の核酸を同定したりするには、 ィブリダイゼーション技術を禾翻するこ と力くできる。 該ハイブリダィゼーシヨンは、 上記 「遺伝 且換え技術」 を開示す る文献記載の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことが できる。 例えば、 ハイブリダィゼ一シヨンは、 DNAなどの核酸を含有しているサ ンプルをナイロンフィルターなどの膜を含めた担体に転写せしめ、 必要に応じ変 成処理、 固定化処理、 洗浄処理などを施した後、 その担体 （例えば、 膜など） に 転写せしめられたものを、 必要に応じ変成させた標識プローブ DNA断片と、 ィ プリダイゼーション用緩衝液中で反応させて行われる。
ハイブリダイゼ一ション処理は、 普通約 35〜約 80°C、 より好適には約 50〜約 65 でで、 約 15分間〜約 36時間、 より好適には約 1〜約 24時間行われる力、 ¾ 最適 な条件を選択して行うことができる。 例えば、 ィブリダイゼ一ション処理は、 約 55°Cで約 18時間行われる。 ィブリダイゼーション用緩衝液としては、 当該分 野で普通に使用されるものの中から選んで用いること力くでき、 例えば、 Rapid hy bridization buffer (Amersham社） などを用いること力くできる。 転写した担体 ( 例えば、 膜など） の変成処理としては、 アルカリ変性液を細する方法が挙げら れ、 その処理後中和液や緩衝液で処理するの力好ましい。 また担体 （例えば、 膜 など） の固定化処理としては、 普通約 40〜約 100°C、 より好適には約 70〜約 90°C で、 約 15分間〜約 24時間、 より好適には約 1〜約 4時間べ一キングすることによ り行われる力、 子ましい条件を選択して行うことができる。 例えば、 フィル タ一などの担体を約 80°Cで約 2時間べ一キングすることにより固定化が行われる 。 転写した担体 （例えば、 膜など） の洗浄処理としては、 当該分野で普通に使用 される洗浄液、 例えば 1M NaCl 、 lmM EDTAおよび 0· 1% sodium dodecyl sulfat e (SDS) 含有 50mM Tris - HC1緩衝液， H8. 0 などで洗うことにより行うこと力くで きる。 ナイロンフィルターなどの膜を含めた担体としては、 当該分野で普通に使 用されるものの中から選んで用いること力できる。 上記アルカリ変性液、 中和液、 緩衝液としては、 当該分野で普通に使用される ものの中から選んで用いることができ、 アルカリ変性液としては、 例えば、 0. 5M NaOHおよび 1. 5M NaCl を含有する液などを挙げることができ、 中和液としては 、 例えば、 1. 5M NaCl 含有 0. 5M Tris-HCl 緩衝液， H8. 0 などを挙げることが でき、 緩衝液としては、 例えば、 XSSPE (0. 36M NaCU 20mM NaH2P04および 2πι M EDTA) などを挙げること力くできる。 またハイブリダィゼ一シヨン処理に ち 、 異的なハイブリダィゼ一シヨン反応を防ぐために、 必要に応じて転写した 担体 （例えば、 膜など） はプレハイブリダイゼ一ション処理すること力く好ましい 。 このプレハイブリダイゼ一ション処理は、 例えば、 プレハイブリダイゼーショ ン溜夜 [50% formamide. 5 XDenhardt， s溜夜 (0. 2 %ゥシ血清アルブミン、 0. 2 % polyvinyl pyrrol i done) 、 5 XSSPEヽ 0. 1 % SDSヽ 100 zg/ml 熱変性サ ケ精子 DM ] などに浸し、 約 35〜約 50°C、 好ましくは約 42°Cで、 約 4〜約 24時間 、 好ましくは約 6〜約 8時間反応させることにより行うこと力くできる力 こうし た条件は当業者であれば驢実験を繰り返し、 より好ましい条件を決めることが できる。 ノ、イブリダィゼ一シヨンに用いる標識プローブ DNA断片の変性は、 例え ば、 約 70〜約 100 °C、 好ましくは約 100 °Cで、 約 1〜約 60分間、 好ましくは約 5 分間加熱するなどして行うこと力《できる。 なお、 ハイブリダィゼ一シヨンは、 そ れ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で行うことができる力 本明細書で ストリンジェン卜な条件とは、 例えばナトリゥム濃度に関し、 約 15〜約 50mM、 好 ましくは約 19〜約 40 、 より好ましくは約 19〜約 20mMで、 については約 35〜 約 85°C、 好ましくは約 50〜約 70°C、 より好ましくは約 60〜約 65°Cの条件を示す。
ノ、ィブリダイゼ一ション完了後、 フィルターなどの担体を十分に洗浄処理し、 特 的なハイブリダイゼ一ション反応をした標識プローブ DNA断片以外の標識プ ローブを取り除くなどしてから検出処理をすること力くできる。 フィルターなどの 担体の洗浄処理は、 当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用いて行う こと力くでき、 例えば、 0. 1 % SDS含有 0. 5 XSSC ( 0. 15M NaCl、 15mM クェン酸 ) 溜夜などで洗うことにより実施できる。 ハイプリダイズした核酸は、 代表的にはオートラジオグラフィ一により検出す ることができるが、 当該分野で用いられる方法の中から ¾!：選択して検出に用い ることもできる。 検出したシグナルに相当する核酸バンドを、 適切な緩衝液、 例 えば、 SM溶液 (lOOmM NaCl および 10mM MgS04含有 50mM Tris-HCl 緩衝液、 H7. 5 ) などに懸濁し、 ついでこの懸濁液を適度に希釈して、 所定の核酸を単離'精製 、 そしてさらなる增幅処理にかけることができる。
ノ、ィブリダイゼーション処理により遺伝子ラィブラリ一や cDNAラィブラリ一な どを含めた核酸サンプルから目的核酸をスクリーニングする処理は、 繰り返して 行うこと力くできる。 クロ一ニングされているヒト由来の cDNAライブラリ一、 例え ば種々のヒト由来の紙織あるいは培養細胞 （特には、 ヒトの腎臓、 脳、 松果体、 下垂体後葉、 神総田胞、 網膜、 網馳管細胞、 網膜神鏺田胞、 胸腺、 血管、 内皮 細胞、 血管平滑筋細胞、 血¾田胞、 マクロファージ、 リンパ球、 精巣、 卵巣、 子 宫、 腸、 心臓、 肝臓、 脖臓、 小腸、 大腸、 歯肉関連細胞、 皮膚関連細胞、 糸球体 細胞、 尿細管細胞、 結合糸織細胞などの糸織.細胞、 さらには各種 UK糸！織、 ガ ン細胞等） cDNAラィブラリ一を使用できる。 さらに铸型などとして用いる cDNAラ ィブラリ一は、 市販の種々の糸纖由来 cDNAラィブラリ一を直雖用することもで き、 例えば Stratagene社， Inv rogen社， Clontech社などから市販された cDNAラ イブラリーを用いること力くできる。 典型的な例では、 ヒト糸織'細胞から調製し た遺伝子ライブラリー、 例えばヒト PI arti f icial chromosome ゲノミックライ ブラリ一(Human Genome Mapping Resource Center)^ ヒ卜組織 cDNAライブラリ― (例えば、 Clontech社などから入手可能） を用いること力くできる。 種々のヒト組 織あるいは培養細胞等から構築されたヒトゲノミック DNAライブラリーあるいは ヒト由来 cDNAラィブラリ一をプローブを^してスクリ一ニングできる。 プロ一 ブなどを放射性同位体などによって標識するには、 市販の標識キット、 例えばラ ンダムプライム DNAラベリングキット （Boehringer Mannheim社） などを使用し て亍うこと力できる。 例えば、 random- primingキット （Pharmacia LKB社， Upps ala)などを使用して、 プローブ用 DNAを [ -3 2 P〕dCTP (Amersham社)などで標 識し、 放射活性を持つプローブを得ることができる。
—戸 J†定の核酸を保有する、 ファージ粒子、 組換えプラスミ ド、 糸且換えベクターな どは、 当該分野で普通に使用される方法でそれを精製分離すること力でき、 例え ば、 グリセ口一ルグラジェント超遠心分離法 (Molecular Cloning, a laborator y manual, ed. T. Maniati s, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 19 89) 、 電気泳動法などにより精製すること力くできる。 ファージ粒子などからは、 当該分野で普通に使用される方法で DNAを精製分離することができ、 例えば、 得 られたファージなどを TM鎌 (10mM MgS04含有 50mM Tris - HC1 緩衝液、 H7. 8 ) などに懸濁し、 DNase I および RNase Aなどで処理後、 20mM EDTA 、 50 zg/ml P roteinase K及び 0. 5 %SDS混合液などを加え、 約 65°C、 約 1 時間保温した後、 これをフェノール抽出ジェチノレエ一テノレ抽出後、 エタノ一ル沈殿により DNAを沈 殿させ、 次に得られた DNAを 70%エタノールで洗浄後乾燥し、 TE溜夜 (lOmM EDT A含有 lOmM Tris-HCl緩衝液、 H8. 0 ) に溶解するなどして得られる。 また、 目 的としている DNA は、 サブクロ一ニングなどにより に得ることも可能であり 、 例えばサブクロ一ニングは、 宿主として 昜菌を用いプラスミ ドベクターなど を用いて行うこと力くできる。 こうしたサブクローニングにより得られた DNA も、 上記と同様にして遠心分離、 フエノール抽出、 エタノール沈殿などの方法により 精製分離できる。 本明細書で 「高い相同性」 といった齢当觀象配列の長さにもよる力 例え ば 50%以上、 さらには 60%以上、 好ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 80%以 上、 そして特定の には 95%以上で、 特に好ましくは 97%以上であってよい。 該 「同効の塩基配列」 とは、 例えばストリンジヱントな条件で問題の配列を有す るものに 、ィブリダイズするものであつてよく、 例えば当該塩基配列のうちの連 続した 5個以上の塩基配列、 好ましくは 10個以上の塩基配列、 より好ましくは 15 個以上の塩基配列、 さらに好ましくは 20個以上の塩基配列とノヽィブリダイズし、 当該ポリべプチドと実質的に同等のアミノ酸配列をコ一ドするものなどが挙げら れる。 核酸は、 ィ匕学合成によって得ることも可能である。 その; 断片を化学合 成し、 それらを酵素により結合することによつてもよい。 本明細書において、 得られた PCR産物などの核酸 (DNAを含む)は、 通常 1〜¾ ァガロースゲル電気泳動にかけて、 特異なバンドとしてゲルから切り出し、 例 えば、 ene clean ki t (Bio 101)などの市販の抽出キットを用いて抽出する。 抽 出された DNA は適当な制限酵素で切断し、 必要に応じ精製処理したり、 さらには 必要に応じ 5'末端を T4ポリヌクレオチドキナーゼなどによりリン酸化した後、 pU C18 などの pUC系べクタ一といった適当なプラスミ ドベクタ一にライゲ一シヨン し、 適当なコンビテント細胞を形質転換する。 クローニングされた PCR産物はそ の塩基配列を解析される。 PCR産物のクロ一ニングには、 例えば、 p- Direct (C1 ontech社)， pCR- Script™ SK(+) (Stratagene社)， GEM-T (Promega社)， pAmp ™ (Gibco- BRL社） などの市販のプラスミ ドベクタ一を用いることが出来る。 宿 主細胞の形質転換をするには、 例えばファージベクタ一を使用したり、 カルシゥ ム法、 ルビジウム/カルシウム法、 カルシウム/マンガン法、 TFB高効 去、 FS B凍結コンビテント細胞法、 迅速コロニー法、 エレクトロポレーシヨンなど当該 分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができる （D. Hanahan, J. Mol. Biol. , 166 : 557， 1983 など） 。 目的とする DNAを単離する ためには、 ¾ife-¥PCR (polymerase chain reaction coupled reverse transcrip tion; RT-PCR) 、 RACE (rapid ampl if ication of cDNA ends) を適用することが 出来る。 MCEは、 例えば、 M, A. Innis et al. ed. , "PCR Protocols" (M. A. F rohman, "a guide to methods and appl ications"), pp. 28-38, Academic Press ， New York (1990) などに記載された方法に従って行うこと力くできる。
DNA は、 必要に応じてクローニングでき、 例えば、 プラスミ ド、 スファ一ジ、 コスミ ド、 P1ファージ、 F因子、 YAC などが利用できる。 好ましくはスファージ 由来のベクタ一力く挙げら 例えば Charon 4A、 Charon 21A、 A gtlO, gtl DASHI K ス FIXI I 、 A EMBL3、 λ ΖΑΡΙ Ι ™ (Stratagene社） などが利用できる 。 また、 得られた DNAを、 下記で詳しく説明するような適当なベクタ一、 例えば 、 プラスミ ド pEX、 pMAMneo、 pKG5などのベクタ一に, ffi! み、 下記で詳しく説明 するような適当な宿主钿胞、 例えば、 大腸菌、 酵母、 CH0細胞、 COS細胞などで 発現させること力できる。 また、 該 DNA断片は、 そのままあるいは適当な制御配 列を付加した DNA断片として、 または適当なベクタ一に糸!^み、 そして動物に導 入して、 所定の遺伝子を発現するトランスジヱニック動物を作成すること力でき る。 動物としては、 哺乳動物力く挙げられ、 例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 モ ルモット、 ゥシなどが挙げられる。好ましくは、 マウスなどの動物の受精卵に該 DNA断片を導入して、 トランスジェニック動物を作成することができる。 所定の 遺伝子産物の確認を、 当該外 伝子をトランスフヱクシヨンした、 293T細胞、 COS- 1細胞などのそれに適した動物細包などを用 ヽて ί亍ぅことができる。
外 ¾1伝子を哺乳動物などの動物細胞に導入する方法としては当該分野で知ら れた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うこと力でき、 例えばリン酸カ ノレシゥム法 （例えば、 F. L. Graham et al. , Virology, 52 : 456, 1973など） 、 DEAE-デキストラン法 （例えば、 D. Warden et al. , J. Gen. Virol. , 3: 371, 1968など） 、 エレクトロポレーシヨン法 （例えば、 E. Neumann et al. , Ε ΒΟ J， 1 : 841, 1982など） 、 マイクロインジヱクシヨン法、 リボソーム法、 ウィルス 感染法、 ファージ粒子法などが挙げられる。 こうして所定の遺ィ 5^をトランスフ ェクションされた動物細胞の産生する遺伝子産物は、 それを解析することもでき る。 所定の遺5?など （本発明で得られた DNAなど） を糸！ ^むプラスミ ドとしては 遺ィ 5?工学的に常用される宿主钿胞 （例えば、 昜菌、 枯草菌等の原核細胞宿主 、 酵母、 293T細胞、 CH0細胞、 COS細胞等の真核細胞宿主、 Sf21等の昆虫細胞宿 主） 中で該 DNA力発現できるプラスミ ドであればどのようなブラスミ ドでもよい 。 もちろん、 市販のキットゃ,に添付のものから選んで使用することもできる o こうした配列内には、 例えば選択した宿 ±田胞で発現するのに好適に修飾され たコドン力含まれていることができるし、 制限酵素部位が設けられていることも できるし、 目的とする遺伝子の発現を容易にするための制御配列、 促進配列など 、 目的とする遺ィ 5?を結合するのに つリンカ一、アダプタ一など、 さらには 物質耐性などを制御したり、 代謝を制御したりし、 選別などに有用な配列 （ ハイプリ ドタンパク質や融合タンパク質をコードするものも含む） 等を含んでい ること力くできる。 好ましくは、 適当なプロモータ一、 例えば大腸菌を宿主とする プラスミ ドでは、 トリプトファンプロモーター（trp) 、 ラクト一スプロモータ一 (lac) 、 トリプトフアン'ラクト一スプロモーター（tac) 、 リポプロテインプロ モータ一（lpp) 、 スファージ PL プロモータ一等を、 動物細胞を宿主とするブラ スミ ドでは、 SV40レートプロモーター、 MMTV LTRプロモーター、 RSV LTR プロモ 一ター、 CMVプロモータ一、 SRaプロモーター等を、 酵母を宿主とするプラスミ ドでは、 GALK GAL10 プロモータ一等を使用し得る。 さらに CYC1， HIS3, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TP1, A0X1等の制御系を使用 することもできる。 所望ポリぺプチドをコ一ドする DNAのトランスクリプションを促進するためェ ンハンサ—をべクタ一に挿入することができ、 そうしたェンハンサ一としてはプ 口モーターに働いてトランスクリプションを促進する作用を持つ、 通常約 10〜10 0 bpの cis作用を持つエレメントのもの力く挙げられる。 多くのェンハンサ一力 グロビン、 エラスターゼ、 アルブミン、 a - フエトプロテイン、 インシュリンな どの哺乳動物遺伝子から知られている。 代表的には、 細胞感染性ウィルスか ら得られるェンハンサ一カ 子適に でき、 例えばレブリケ一ションォリジンの レート領域にある SV40ェンハンサ一 （100-270 bp), サイトメガロウィルスの初 期プロモータ一のェンハンサ一， ポリオ一マのレプリケ一シヨンオリジンのレー ト令貝域にあるェンハンサ一， アデノウィルスのェンハンサ一などの例力く挙げられ る。 また、 必要に応じて、 宿主にあったシグナル酉 B^ijを付加することもでき、 そ れらは当業者によく知られているものを できる。 大腸菌を宿主とするプラスミ ドとしては、 例えば pBR322、 PUC18, pUC19， pUCl 18, pUC119, pSP64, pSP65, pTZ- 18R/- 18U， pTZ-19R/-19U, pGE -3, pGEM-4, pG BM-3Z, pGEM-4Z, pGEM- 5Zf ( -)， pBluescript KS™ (Stratagene社） などが挙げ られる。 大腸菌での発現に適したプラスミ ドベクターとしては、 例えば pAS， pI(K 223 (Pharmacia社)， pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET-B (Invi trogen社） なども 挙げられる。 動物細胞を宿主とするプラスミ ドとしては、 例えば SV40ベクタ一、 ポリオ一マ .ウィルスベクタ一、 ワクシニア ·ウィルスベクター、 レトロウィル スベクタ—などが挙げられ、 具体的には pcD， pcD-SR a, CDM8, pCBV4, p B18S, PBC12BI, pSG5 (Stratagene社） などが挙げられる。 酵母を宿主とするプラスミ ドとしては、 Yip型べクタ一、 YEp型べクタ一、 YRp型べクタ一、 YCp型べクタ —などが挙げられ、 例えば pGPD- 2などが挙げられる。 宿主細胞としては、 宿主钿 胞が 昜菌の 、 例えば:^昜菌 K12株に由来するもの力挙げられ、 例えは 53 3， XLl-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5 ， DH10B, 腿 01， MC1061, JM109, STBL2, B834株由来としては、 BL21(DE3)pLysSなどが挙げられる。 宿 ϋ田 胞が酵母の ¾·^\ 例えば Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pro mbe, Pichia pas tori s, Kluyveromyces株， Candida, Tri choderma reesia, そ の他の酵 などが挙げられる。 宿 ±1田胞が動物細胞の i§^、 例えばアフリカミ ドリザル線锥芽細胞由来の COS - 7細胞、 COS - 1細胞、 CV- 1細胞、 ヒト腎細胞由来 293細胞、 ヒト表 細胞由 *A4 31細胞、 ヒト結腸由来 205細胞、 マウス綠锥芽細胞由来の COP細胞、 MOP細胞、 W0P細胞、 チャイニーズ'ハムスター細胞由来の CH0細胞、 CH0 DHFR-細胞、 ヒ ト HeLa細胞、 マウス細胞由来 C127細胞、 マウス細胞由来 NIH 3T3細胞、 マウス L 細胞、 9BHK, HL-60 、 U937、 HaK、 Jurkat細胞、 その他の形質転換されて得られ たセルライン、通常の二倍体細胞、 インビト口の一次培養紙織から誘導された細 胞株などが挙げられる。 昆虫細胞としては、 カイコ核多角体病ウィルス （Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) 、 それに由来するものあるいはその他の適 切なものをべクタ一とし、 Spodoptera frugiperda (caterpi l lar), Aedes aegyp ti (mosqui to), Aedes albopictus (mosqui to), Drosophi la melangaster (frui tf ly), カイコ幼虫あるいはカイコ培養細胞、 例えば BM-N細胞などを用いること が挙げられる (例えば、 Luckow et al , Bio/Technology, 6， 47-55 (1988)； Se tlow, J. K. et al. (eds. ), Genetic Engineering, Vol. 8, pp. 277-279, PI en urn Publishing, 1986; Maeda et al. , Nature, 315, pp. 592-594 (1985))。 Agr obacterium tumefaciensなどを利用して、 植物細胞を宿主钿胞として使用するこ とも可能であり、 それに適するベクタ一と共に、 それらは当該分野で広く知られ ている。 本発明の遺伝子工学的手法においては、 当該分野で知られたあるいは汎 用されている制限酵素、 逆転 素、 DNA断片をクローン化するのに適した構造 に修飾したりあるいは変換するための酵素である DNA修飾 ·分解酵素、 DNA ポリ メラ一ゼ、 末端ヌクレオチジルトランスフェラ一ゼ、 DNA リガ一ゼなどを用い ¾ こと力く出来る。 制限酵素としては、 例えば、 R. J. Roberts, Nucleic Acids Res . , 13: rl65, 1985 ; S. Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Har bor Lab. , Cold Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. Mace l is, Nucleic Acids Res. , 19: Suppl. 2077, 1991などに記載のものが挙げられる。 本発明に従い、 ポリペプチド （又はタンパク質） をコードする核酸を含有する 発現べクタ一で形質転換された形質転換体は、 必要に応じて適当な選択マーカー を用い、 繰り返しクロ一ニングを行うことにより、 高い発現能を安定して有する 細胞株を得ること力できる。 例えば、 宿 ±田胞として動物細胞を用いた形質転換 体において、 dhfr遺好を選択マーカーとして禾,した:^、 TX濃度を徐々に 上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 本発明のポリペプチドをコードす る DMを増幅させ、 より高い発現を得られる細胞株を得ること力できる。 本発明 の形質転換体は、 本発明のポリぺプチドをコ一ドする核酸が発現可能な条件下で 培養し、 目的物を生成、 蓄積せしめること力くできる。 該形質転換体は、 当該分野 で汎用されている培地中で培養すること力《できる。 例えば、 昜菌、 枯草菌等の 原核細胞宿主、 酵母などを宿主としている形質転換体は、 液体培地を好適に使用 すること力できる。 培地中には、 該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無棚その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 たとえばグルコース、 デキ ストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 たとえばアンモニゥム塩 類、 硝酸：^、 コーンスチープ' リカ一、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 麦芽 エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有難質、 無難としては ， 例えば、 塩化カノレシゥム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウム、 炭酸 カルシウムなどが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 カザミノ酸、 生長促進 因子などを添加してもよい。 また、 必要によりプロモーターを効率よく働力、せる ために、 例えば、 3 /3—インドリノレ ァクリノレ酸のような薬剤を加えること力で きる。 ±咅地の pHは約 5〜約 8力 ましい。 培養は、 例えば大腸菌では通常約 15〜約 45°Cで約 3〜約 75時間行い、 必要によ り、 通気や攪拌を加えることもできる。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養 する際、 培地としては、 たとえば約 5〜約 20%の胎児牛血清を含む MEM培地、 PR 1640±咅地、 DMEM培地などが用いられる。 pHは約 6〜約 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜約 40°Cで約 15〜約 72時間行 必要に応じて通気や攪拌を加え る。 所定の遺 産物を発現してレ、る形質転換体はそのまま利用可能であるが、 その細胞ホモジュネートとしても利用できるが、 所定の遺伝子産物を単離して用 いることもできる。 上記培養細胞から抽出するに際しては、 ±咅養後、 公知の方法 で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチーム および/または凍結融解などによつて菌体ぁるいは細胞を破壊したのち、 遠心分 離やろ過により粗抽出液を得る方法などを; ffi用いることができる。 緩衝液の中 には尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリ トン X - 100 (商品名
) 、 ッウイーン- 20 (商品名） などの界面活性剤を加えてあってもよい。 培養液 中に目的生成物力分泌される には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体 あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる目的^^物は 、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせてその精製を行なうこと力でき、 例えば硫酸ァンモニゥム沈殿法などの塩析、 セフアデックスなどによるゲルろ過 法、 例えばジェチルァミノェチル基あるレ、はカルボキシメチル基などを持つ担体 などを用いたィォン交換ク口マトグラフィ一法、 例えばブチル基、 ォクチル基、 フェニル基など疎水 ¾Sを持つ担体などを用 こ棘水性ク口マトグラフィ一法、 色素ゲルクロマトグラフィー法、 電気泳動法、 透析、 限外ろ過法、 ァフィ二ティ 'クロマトグラフィ一法、 高速液体ク口マトグラフィ一法などにより精製して得 ること力くできる。 好ましくは、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 リガンドなど を固定化したァフィニティ一'クロマトグラフィ一などで処理し精製分離処理で きる。 例えば、 ゼラチン一ァガロース 'ァフィ二ティ一 ·クロマトグラフィー、 へパリンーァガロース ·クロマトグラフィーなどが挙げられる。 得られたタンパ ク質 （ぺプチドあるいはポリぺプチドを包含して 、てよし、) は、 それを酵素免疫 測定法など知られた手法で、 適当な担体あるいは固相に結合せしめて固相化する こと力くできる。 固相化タンパク質、 固相化ペプチドは、 便利に結合アツセィゃ物 質のスクリ一二ングに^ fflできる。 本明細書中で開示した関連したタンパク質、 そのフラグメント、 さらには DN Aを含めた核酸 (mRNAゃォリゴヌクレオチドを含む） は、 それらを網虫あるいは 有機的に使用し、 更にはアンチセンス技術、 モノクローナル抗体を含めた抗体、 トランスジヱニク動物などとも 組合わせて、 ゲノミックス及びプロテオミッ クス技術に応用できる。 また、 鎖 RNA (dsRNA) を使用しての RNAi (RNA inte rference) 技術への応用の途もある。 カヽくして、 一塩基多型 (SNP; single nucle otide polymorphisms)を中心とした遺伝子多型角晰、 核酸アレイ、 タンパク質ァ レイを使用した遺伝？ ¾現餅斤、 遺ィ 5?機能解析、 タンパク質間相互作用解析、 関連遺伝子角科斤、 農薬角？！斤をすること力く可能となる。 例えば、 核酸アレイ技術で は、 cDNAライブラリーを使用したり、 PCR技術で得た DNAを基 にスポッティ ング装置で高密度に酉己置して、 ハイブリダィゼ一シヨンを利用して試料の解析が 行われる。 該アレイ化は、 針あるいはピンを使用して、 あるいはインクジエトプリ ング技術などでもって、 スライドガラス、 シリコン板、 プラスチックプレートな どの基板のそれぞれ固有の位置に DNA力く付着せしめられることによりそれを すること力できる。 該核酸アレイ上でのハイブリダィゼ一シヨンの結果得られる シグナルを観察してデータを取得する。 該シグナルは、 螢光色素などの標識 （例 えば、 Cy3, Cy5， BODIPY, FITC, Alexa Fluor dyes (商品名)， Texas red (商品 名） など） より得られるものであってよい。 検知にはレーザ一スキャナ一などを 利用することもでき、 得られたデータは適当なァルゴリズムに従ったプログラム を備えたコンピュータ一システムで処理されてよい。 また、 タンハ°ク質アレイ技 術では、 タグを付された組換え発現タンパク質産物を利用してよく、 二次元電気 泳動 (2 - DE)、 酵素消化フラグメントを含めての質量分析 （MS) (これにはエレクト ロスプレーイオン化法（electrospray ionization: ESI), マトリックス支援レ一 ザ—^^隹イオンィ匕法 (matrix- assisted laser desorption/ionization: MALDI)な どの技術が含ま^ MALDI -T0F分析計、 ESI-3連四重極分析計、 ESトイオントラ ップ分析計などを使用してよい） 、 染色技術、 同位体標識及び解析、 画像処理技 術などが利用されること力《できる。 したがって、 本発明には上記 p30及びその関 連類縁体'誘 本など及びそれに対する抗体に関連したソフトウエア、 データべ —スなども含まれてよい。 所定の DNA (例えば、 p30あるいは Raplをコードする DNA)を対象動物に転移さ せるにあたっては、 それを DNA断片としてあるいは該 DNAを動物細胞で発現させ うるプロモーターの下流に結合して用いるのカ一般に有利である。 たとえば、 マ ウスに当該 DNAを導入する：^、 これと相同性が高い動物由来の当該 DNAを動物 細胞で発現させうる各種プロモータ一の下流に結合した遺伝子コンストラクトを 、 対象動物の受精卵、 たとえばマゥス受精卵へマイクロインジヱクシヨンするこ とによってそのタンパク質を高産生する遺伝子導入 （トランスジヱニック） マウ スを作出できる。 マウスとしては、 特に純系のマウスに限定されないが、 例えば 、 C57BL/6、 Balb/C、 C3H、
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(BDF,)などが挙げられる。 この プロモータ一としては、 例えばウィルス由来プロモータ一、 メタ口チォネイン等 のュビキタスな発現プロモータ一などが好ましく使用しうる。 また該 DNAを導入 する：^、 組換えレトロウィルスに組み換えて、 それを用いて行うこともできる ο好適には文橡 DNAを導入されたマウス受精卵は、 例えば、 ICR のような仮親の マウスを して生育せしめること力できる。
受精卵細胞段階における当該 DNA (例えば、 p30あるいは Raplをコードする DN A)の転移は、 対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保され る。 DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において当該タンパク質をコ一ドする DNA 力《存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに該 タンパク質をコードする DNAを有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの 種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てにおいて、 該タンパク質を発 現できる可能性を有している。 該 DNA導入動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、 該 DN A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うこと力《できる。 さらに、 目的 DNAを保有する) *雄の動物を交配することにより、 導入遺 feiを相同染色体の両 方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この此纖の動物を交配することによりす ベての子孫が該 DNAを有するように繁殖継代すること力くできる。該 DNA力く導人さ れた動物は、 該タンノ、°ク質が高発現させられて ヽるので、 該タンノ、°ク質に対する (インヒビタ一） のスクリーニング用の動物などとして有用である。 また 当該遺伝子の発現を阻害することのできるァンチセンス ォリゴヌクレオチド、 例えば、 アンチセンス DNAなどのスクリーニング用の動物などとして有用である o
この遺 β?導入動物を、 糸織培養のための細胞源として使用することもできる
。 例えば、 遺伝子導入マウスの組織中の DNA もしくは RNAを直接分析するかある いは遺伝子により発現されたタンパク質 ·糸 を分析することにより、 例えば ρ3 0 に関連したタンパク質について分析すること力できる。 該タンパク質を産生す る糸纖の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを删して、 たとえば脳 、 胸腺、 血管内 細胞などの血管細胞、 血 細胞、 精巣、 脳、 腸、 腎臓やその他 の糸！ <織由来の細胞につ 、てその機能を研究することができる。 また、 その細胞を 用いることにより、 たとえば各種 1¾織の機能を高めるような医薬開発に資するこ とも可能である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 当該タンパク質を単 離精製することも可能である。 トランスジエニック マウスなどに関連した技称 ΐ は、 例えば、 Brinster, R. L.， et al. ,； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 44 38, 1985 ; Costantini, F. & Jaenisch, R. (eds. ) : Geneti c manipulation of the early mammal ian embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985などの文 献に記載の方法あるいはそこに引用された文献に記載の方法、 さらにはそれらの 改変法により行うことができる。 本明細書中、 「抗体」 との用語は、 広義の意味で使用されるものであってよ く、 戸 J†望の P30 タンパク質、 その構成ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対す るモノクロ一ナル抗体の単一のものや各種ェピト一プに対する特異性を持つ抗体 組成物であってよく、 また 1価抗体または多価抗体並びにポリクロ一ナル抗体及 びモノク口一ナノレ抗体を含むものであり、 さらに天然型（intact)分子並びにそれ らのフラグメント及び誘 本も表すものであり、 F(ab' ) 2， Fab' 及び Fab といつ たフラグメントを包含し、 さらに少なくとも二つの抗原又はェピトープ （epi top e)結^^位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、 又は、 例えば、 クヮドローム (quadrome), トリオーム（triome)などの二重特異性組換え抗体、 種間雑種抗体ヽ 抗ィディオタイブ抗体、 さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの 誘割本と考えられるもの、 公知の細胞融合又はハイプリ ド一マ技術や抗体工学を 適用したり、 合成あるいは半合 術を使用して得られた抗体、 抗体^ ¾の観点 力、ら公知である従来技術を適用したり、 DNA組換え技術を用いて調製される抗体 、 本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的ェピト一プに関して 中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含してレ、てよ 、。 特 に好ましい本発明の抗体は、 P30 の N末端側の領域から選択されたポリべプチド を特異的に調 IJできるもの力挙げられる。 抗原物質に対して作製されるモノクロ一ナル抗体は、 ±咅養中の一連のセルライ ンにより抗体分子の産生を樹共することのできる任意の方法を用いて産生される 。 修食 吾 「モノクローナル」 とは、 実質上均質な抗体の集団から得られていると 、うその抗体の性格を示すものであって、 何ら力、の特定の方法によりその抗体が 産生される必要があるとみなしてはならない。 個々のモノク口一ナル抗体は、 自 然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという 以外は、 同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。 モノクローナノレ 抗体は、 高い特異性を持ち、 それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられ て 、るものである。 異なつた抗原決定基 （ェピト一プ） に対して向けられた種々 の抗体を典型的には含んでいる通常の （ポリクロ一ナル） 抗体調製物と対比する と、 それぞれのモノクローナル抗体は当言雄原上の単一の抗原決定基に対して向 けられているものである。 その特異性に加えて、 モノクローナル抗体は、 ノ、イブ リ ドーマ i咅養により合成され、 他のィムノグロブリン類の 3¾1がないあるいは少 ない点でも優れている。 モノクローナル抗体は、 ハイブリツド抗体及びリコンビ ナント抗体を含むものである。 それらは、 所望の生物活性を示す限り、 その由来 やィムノグロブリンクラスゃサブクラスの に関わりなく、 可変領域ドメイン を定常領域ドメインで置き換えたり、 あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、 ある 種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、 あるいはヘテロジーニアスなタンパ ク質と融合せしめたりして得ること力くできる （例えば、 米国特許第 4816567号； Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97, Ma reel Dekker, Inc. , New York, 1987など） 。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、 ハイプリ ドーマ法 (G. K ohler and C. Mi lstein, Nature, 256, pp. 95-497 (1975)) ; ヒト B細胞ハイブ リドーマ法 (Kozbor et al.， Immunology Today, 4, pp. 72-79 (1983)； Kozbor,
J. Immunol. , 133， pp. 3001 (1984)； Brodeur et al.， Monoclonal Antibody P roduction Techniques and Appl ications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc. , Ne w York (1987)；トリオ一マ法； EBV-ハイブリ ドーマ法 （Cole et al. , Monoclona 1 Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. , pp. 77-96 (1985)) (ヒ トモノクローナル抗体を産生するための方法）;米国特許第 4946778号 （単鎖抗体 の産生のための技術） 力 <挙げられる他、 抗体に関して以下の文献が挙げられる： S. Biocca et al. , EMBO J, 9， pp. 101-108 (1990)； R. E. Bird et al. , Scienc e, 242, pp. 423-426 (1988) ; M. A. Boss et al. , Nucl. Acids Res. , 12, pp. 37 91-3806 (1984)； J. Bukovsky et al. , Hybridoma, 6， pp. 219-228 (1987)； M. DAIN0 et al. , Anal. Biochem. , 166， pp. 223-229 (1987)； J. S. Huston et al. , Pro atl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5879-5883 (1988)； P. T. Jones et al. , Nature, 321, pp. 522-525 (1986)； J. J. Langone et al. (ed. )， "Methods in Bnzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I： Hybridoma Tec hnology and Monoclonal Antibodies), Academic Press, New York (1986)； S. Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-6855 (1984)； V. T. Oi et al. , BioTechniques, 4, pp. 214-221 (1986) ; L. Riechmann et al. , Nature, 332， pp. 323-327 (1988) ; A. Tramontano et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 6736-6740 (1986) ; C. Wood et al. , Nature, 314, pp. 446-4 49 (1985)； Nature, 314, pp. 452-454 (1985) あるいはそこで弓 I用された文献 ( それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる ) 。 本発明の抗体は、 当該遺伝？ ¾現物の解析、 検知などに利用できる他、 様々 な利用力可能である。 例えば、 当該モノクローナル抗体は、 それら力く所望の生物活性を示す限り、 重 鎖及び Z又は軽鎖の一部力《特定の種から誘導される又は特定の抗体クラス若しく はサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又はホモ口一ガスである力 一方、 鎖の残部は、 別の種から誘導される又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属 する抗体の対応配列と同一又はホモ口一ガスである、 「キメラ」 抗体 （免疫グロ ブリン） を特に包含する （米国特許第 4816567号明細書； Morrison et al. , Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p. 6851-6855 (1984)) 。
以下、 モノクローナル抗体を例に挙げて、 抗体の作製につき詳しく説明する。 本発明のモノクロ一ナル抗体は、 ミエ口一マ細胞を用 、ての細胞融合技術 （例 えば、 G. Kohler and C. Mi lstein, Nature, 256， pp. 495-497 (1975))など） を 利用して得られたモノクローナル抗体であってよく、 例えば次のような工程で作 製できる。
1 . 免麵生抗原の調製
2 . 免;^性抗原による動物の免疫
3 . ミエローマ細胞 （骨髄腿田胞） の調製
4 . 抗体産生細胞とミエ口一マ細胞との細包融合
5 . ハイブリ ドーマ （融合細胞） の選 $ ¾びモノクローン化
6 . モノクローナル抗体の製造 1 . 免麵性抗原の調製
抗原としては、 上記で記載してあるように、 当該 P30 ポリペプチド又はそれか ら誘導された断片を単離したものを用いることもできる力、 決定された当該 p30 夕ンパク質のァミノ酸配列 を基に、 適当なォリゴぺプチドを化学合成しそれ を抗原として利用すること力《できる。 代表的には図 1に存在するアミノ酸残基の うちの違続した少なくとも 5個のァミノ酸を有するぺプチドが挙げられる。 例え ば特徵的な配列、 例えは 末端側などのァミノ酸配列から適当な部分を選ぶこと も挙げられる。
抗原は、 そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用でき る力く、 免；^性コンジュゲートなどにしてもよい。 例えば、 免疫原として用いる 抗原は、 当該タンパク質を断片ィ匕したもの、 あるいはそのアミノ酸配列に基づき 特徴的な配列領域を選び、 ポリぺプチドをデザィンして化学合成して得られた合 成ポリペプチド断片であってもよい。 また、 その断片を適当な縮合剤を介して種 々の担体タンパク質類と結合させて ヽプテン一タンパク質の如き免疫原性コンジ ュゲ一トとし、 これを用 、て特定の配列のみと反応できる （あるいは特定の配列 のみを認識できる） モノクロ一ナル抗体をデザィンするのに用いることもできる 。 デザインされるポリペプチドには予めシスティン残基などを付加し、 免疫原性 コンジユゲートの調製を額にできるようにしておくことができる。 担体夕ンパ ク質類と結合させるにあたっては、 担体タンパク質類はまず活性化されることが できる。 こうした活性化にあたり活性化結合基を導入すること力《挙げられる。 活性化結合基としては、 （1) 活性化エステルあるいは活性化カルボキシル基、 例えばニトロフヱニルエステル基、 ペンタフルオロフヱニルエステノレ基、 卜ベン ゾトリアゾ一ルエステル基、 N-スクシンイミ ドエステル基など、 (2) 活性化ジチ ォ基、 例えば 2-ピリジルジチォ基などが挙げられる。 担体タンパク質類としては 、 キ一ホール' リンペット 'へモシァニン （KLH：)、 牛血清アルブミン （BSA)、 卵 白アルブミン、 グロプリン、 ポリリジンなどのポリぺプタイド、 細菌菌体成分、 例えば BCGなどが挙げられる。 2 . 免^ 'ί生抗原による動物の免疫
免疫は、 当業者に知られた方法により行うこと力くでき、 例えば村松繁、 他編、 実験生物^!纏 14、 免 物学、 丸善株式会社、 昭和 60年、 日本生化学会編、 続生 実験講座 5ヽ 免胜化 究法ヽ 東京化学同人、 1986年、 日本生化学会 編、 新生化学実験講座 12、 好免疫学 I I I、 抗原.抗体 ·補体、 東京化学同人 、 1992年などに記載の方法に準じて行うこと力くできる。免疫化剤を （必要に応じ アジュバントと共に）一回又はそれ以上の回数哺乳動物に測することにより免 疫化される。代表的には、該免疫化剤及び Ζ又はアジュバントを哺乳動物に複数 回皮下腿あるいは腿空内溯寸することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原 ぺプチドあるいはその関連べプチド断片を含むもの力挙げられる。免疫化剤は、 免疫処理される哺乳動物において免颜性であることの知られているタンパク質
(例えば上記担体タンパク質類など） とコンジユゲートを形成せしめて使用して もよい。 アジュバントとしては、 例えばフロイント完全アジュバント、 リビ (Rib i)アジュバント、 百日咳ワクチン、 BCG、 リピッ KA、 リポソ一ム、 水酸化アル ミニゥム、 シリカなどが挙げられる。免疫は、 例えば BALB/cなどのマウス、 ハム スター、 その他の適当な動物を使用して行われる。抗原の投与量は、 例えばマウ スに対して約 1〜約 400 〃g/動物で、 一般には宿主動物の駟空内や皮下に測し 、 以後 1〜4週間おきに、好ましくは 1〜2週間ごとに翻空内、 皮下、静脈内あ るいは筋肉内に追加免疫を 2 ~10回禾號反復して行う。免疫用のマウスとしては BALB/c系マウスの他、 BALB/c系マウスと他系マウスとの F1マウスなどを用いるこ ともできる。必要に応じ、 抗体価測定系を調製し、 抗体価を測定して動物免疫の 禾體を確認できる。本発明の抗体は、 こうして得られ免疫された動物から得られ たものであってよく、 例えば、 清、 ポリクロ一ナル抗体等を包含する。
3 . ミエ口一マ細胞（骨髄腫細胞） の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株 （®Κ細胞株） としては免疫グロブリン を産生しない細胞株から選ぶことができ、 例えば P3- NS-1- Ag4- 1 (NS-1, Eur. J. Immunol. , 6 : 511-519, 1976)、 SP - 2/0 - Agl4 (SP-2, Nature, 276 : 269〜27 0, 1978 )、 マウスミエローマ MOPC- 21セルライン由来の P3- X63- Ag8- Ul (P3U1, C urr. topics Microbiol. Immunol. , 81 : 1-7， 1978 )、 P3-X63-Ag8 (X63, Natur e， 256: 495-497, 1975 ) 、 P3-X63-Ag8-653 (653, J. Immunol. , 123: 1548-15 50, 1979) などを用いること力くできる。 8-ァザグァニン耐性のマウスミエローマ 細胞株はダルベッコ MEM ±咅地（DMEM培地） 、 RPMI-1640培地などの細胞 ±咅地に、 例えばペニシリン、 アミカシンなどの ½物質、 牛胎児血清 (FCS) などを加え、 さらに 8—ァザグァニン （例えば 5 -45 zg/ml) を加えた培地で継代されるカ^ 細胞融合の 2〜 5日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意すること力くで きる。 また使用細胞株は、 ？東桔保存株を約 37°Cで完全に解凍したのち RPMI- 1640 培地などの正常培地で 3回以上洗浄後、 正常培地で培養して所要数の細胞株を用 意したものであってもよい。
4 . 抗体産^田胞とミエローマ細胞との細胞融合
上記 2 . の工程に従い免疫された動物、 例えばマウスは最終免疫後、 2〜5日 後にその脾臓が摘出さ^ それから脾細胞懸濁液を得る。 脾細胞の他、 生体各所 のリンパ節細胞を得て、 それを細胞融合にィ¾¾することもできる。 こうして得ら れた脾細胞懸濁液と上記 3 . の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、 例えば 最小必須培地 (MEM± :1) 、 DMEM培地、 RPMI-1640培地などの細胞培地中に置き、 細胞融合剤、 例えばポリエチレングリコ一ノレを添加する。 細胞融合剤としては、 この他各種当該分野で知られたものを用いること力《でき、 この様なものとしては 不活性化したセンダイウィルス（HVJ : Hemagglutinating Virus of Japan)なども 挙げられる。好ましくは、 例えば 30〜60%のポリエチレングリコールを 0. 5〜 2 ml加えることができ、 分子量が 1，000〜8，000のポリエチレングリコールを用い ること力くでき、 さらに分子量が 1, 000-4, 000のポリエチレングリコ一ノレがより 好ましく ί¾¾できる。 融合培地中でのポリェチレングリコ一ルの濃度は、 例えば 30〜60%となるようにすること力く好ましい。 必要に応じ、 例えばジメチルスルホ キシドなどを少、 fttaえ、 融合を促進することもできる。 融合に翻する脾細胞 ( リンパ球） ： ミエローマ細胞株の割合は、 例えば 1 : 1〜20 : 1とすること力《挙げら れる力、 より好ましくは 4: 1〜7 : 1 とすること力《できる。
B虫合反応を 1〜10分間行い、 次に RPMI-1640培地などの細胞培地を加える。 融 合反応処理は複数回行うこともできる。 融合反応処理後、 遠心などにより細胞を 分離した後選 iRffl培地に移す。
5. ハイプリ ドーマ （融合細胞） の選 i ^びモノクロ一ンィ匕
選択用 ί咅地としては、 例えばヒポキサンチン、 アミノプテリン及びチミジンを 含む、 FCS含有 MEM培地、 RPMI-1640培地などの培地、 所謂 HAT±咅地が挙げられ る。 選択培地交換の方法は、 一般的には培養プレートに分注した容量と等容量を 翌日加え、 その後 1〜 3日ごとに HAT±咅地で半量ずつ交換するというように処理 すること力できる力 «：これに変更を加えて行うこともできる。 また融合後 8 〜16日目には、 ァミノプテリンを除レ、ナ 所謂 HT培地で 1〜 4日ごとに培地交換 をすること力くできる。 フィーダ一として、 例えばマウス胸腺細胞を使用すること もでき、 それが好ましい: ^がある。
ハイプリ ドーマの増殖のさ力、んな培養ゥヱルの培養上清を、 例えば放射免疫分 折 (RIA) 、 酵素免疫分析 (ELISA) 、 蛍光免疫分析 (FIA) などの測定系、 あるいは 蛍光惹起細胞分离隹装置 (FACS)などで、 所定の断片べプチドを抗原として用いたり 、 あるいは標識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、 スクリ一二 ングしたりする。
目的抗体を産生しているハイプリドーマをクローニングする。 クローニングは 、 寒天培地中でコロニーをピック 'アップする力、、 あるいは限界希釈法によりな されうる。 限界希釈法でより好ましく行うこと力できる。 クロ一ニングは複数回 ί亍うこと力 子ましい。
6. モノクローナル抗体の製造
得られたハイブリ ドーマ株は、 FCS含有 MEM培地、 RPMI-1640 ±咅地などの適当 な増殖用培地中で培養し、 その培： ¾±清から所望のモノク口一ナル抗体を得るこ と力く出来る。 の抗体を得るためには、 ハイプリ ドーマを腹水化すること力零 げられる。 この ミエ口一マ細胞由来の動物と同系の糸!/織適合性動物の翻空内 に各ハイプリドーマを移植し、 ±曽殖させる力、、 あるいは例えばヌード ·マウスな どに各ハイプリ ドーマを移植し、 ±曽殖させ、 1¾1カ物の腹水中に産生されたモノク 口一ナル抗体を回収して得ることが出来る。 動物はハイプリ ドーマの移植に ち、 プリスタン （2， 6， 10, 14-テトラメチルペンタデカン） などの鉱物油を翻空内 投与しておくこと力《でき、 その処理後、 ハイプリ ドーマを増殖させ、 腹水を採取 することもできる。 腹水液はそのまま、 あるいは従来公知の方法、 例えば硫酸ァ ンモニゥム沈殿法などの塩折、 セフアデックスなどによるゲルろ過法、 イオン交 換クロマトグラフィー法、 電気泳動法、 透析、 限外ろ過法、 ァフィ二ティ 'クロ マトグラフィ一法、 高速液体ク口マトグラフィ一法などにより精製してモノク口 —ナル抗体として用いること力《できる。 好ましくは、 モノクローナル抗体を含有 する腹水は、 硫安分画した後、 DEAE—セファロースの如き、 陰イオン交換ゲル及 びプロティン Αカラムの如きァフィニティ 'カラムなどで処理し精製分離処理で きる。 特に好ましくは抗原又は抗原断片 （例えば合成べプチド、 組換え抗原タン パク質あるいはペプチド、 抗体が特異的に認識する部位など） を固定化したァフ ィニティ 'クロマトグラフィー、 プロテイン Aを固定ィヒしたァフィ二ティ 'クロ マトグラフィ一、 ヒドロキシアパタイト 'クロマトダラフィ一などが挙げられる
また、 トランスジエニックマウス又はその他の生物、 .例えば、 その他の哺乳動 物は、 本発明の免麵ポリペプチド産物に対するヒト化抗体等の抗体を発現する のに用いること力できる。
またこうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、 ハイプリ ドーマ株から 得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、 遺 fe¾fl換え技術により抗体を 作製することも可能である。 当該モノクローナル抗体をコ一ドする核酸は、 例え ばマウス抗体の重鎮や軽鎖をコ一ドしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴ ヌクレオチドプローブを するなどの慣用の手法で単離し酉 B^(J決定することが できる。 一旦単離された DNA は、 上記したようにして発現ベクターに入れ、 CH0,
COSなどの宿主細胞に入れることができる。 該 DNA は、 例えばホモジーニアスな マゥスの配列に代えて、 ヒトの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコ一ドする配列 に置換するなどして修飾すること力可能である （Morrison et al. , Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81 : 6581, 1984)。 力、くして所望の結合特異性を有するキメラ 抗体ゃハイブリツド抗体も調製することが可能である。 また、 抗体は、 下記する ような縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク質合 j«術を適用して、 キ メラ抗体やハイプリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。 ヒト化抗体は、 当該分野で知られた技術により行うことカ坷能である （例えば
、 Jones et al. , Nature, 321 : pp. 522-525 (1986)； Riechmann et al. , Nature 332: pp. 323-327 (1988)； Verhoeyen et al. , Science, 239: pp. 1534-1536 ( 1988))。 ヒトモノクローナル抗体も、 当該分野で知られた技術により行うことが 可能で、 ヒトモノクロ一ナル抗体を生産するためのヒトミエロ一マ細胞ゃヒト · マウスへテロミエ口一マ細胞は当該分野で知られている （Kozbor, J. Immunol. , 133, pp. 3001 (1984)； Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Tec hniques and Appl ications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc. , New York (1987) イスぺシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知られている （Mi l l stein et al. , Nature, 305: pp. 537-539 (1983)； W093/08829; Traunecker et al. , BMB0 J. , 10: pp. 3655-3659 (1991) ; Suresh et al. , "Methods in Bnzymo logy", Vol. 121, pp. 210 (1986)) さらにこれら抗体をトリプシン、 、 、。ィン、 ぺプシンなどの酵素により処理し て、 ； if^により還元して得られる Fab、 Fab\ F(ab' )2 といった抗体フラグメン トにして使用してもよい。
抗体は、 既知の任意の ί餘法、 例えば競合的結合検定、 直接及び間接サンドィ ツチ検定、 及び免疫沈 食定にィ¾¾すること力くできる （Zola, Monoclonal Antib odies : A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. , 1987) 抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジユゲー卜するには、 当分野で知られ る任意の方法を使用することができ、 例えば、 David et al. , Biochemistry, 13 巻, 1014-1021 頁 (1974)； Pain et al, J. Immunol. Meth. , 40: pp. 219-231 ( 1981) ;及び "Methods in Enzymology", Vol. 184 pp. 138-163 (1990) により記 載の方法が挙げられる。 標識物を付与する抗体としては、 IgG画分、 更にはぺプ シン消ィ匕後還元して得られる特異的結^^ Fab'を用いること力くできる。 これらの ¾ ^の標識物の例としては、 下記するように酵素 （ペルォキシダーゼ、 アルカリ ホスファタ一ゼあるいは yS- D- ガラクトシダーゼなど） 、 ィ匕学物質、 蛍光物質あ る 、は放射性同位元素などがある。 本発明での検知 ·測定は、 ィムノ染色、 例えば糸纖ぁるレ、は細胞染色、 アツセィ、 例えば競合型ィムノアツセィまたは非競合型ィムノアツセィで行うこ と力くでき、 ラジオィムノアツセィ、 ELISAなどを用いること力くでき、 B - F分離を 行ってもよいし、 あるいは行わないでその測定を行うこと力くできる。 好ましくは 放射免疫測定法や酵素免疫測定法であり、 さらにサンドィッチ型ァッセイカく挙げ られる。 例えばサンドイッチ型アツセィでは、 一方を本発明の当該タンパク質及 びその関連べプチド断片に対する抗体とし、 ィ を当該タンパク質の N-末端側残 基に対する抗体とし、 そして一方を検出可能に標識化する。 同じ抗原を認識でき る他の抗体を固相に固定化する。 検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ 順次反応させるためインキュベーション処理し、 ここで非結合抗体を分離後、 標 識物を測定する。 測定された標識の量は抗原、 すなわち当該ポリペプチド断片抗 原の量と比例する。 このアツセィでは、 不溶化抗体や、 標識化抗体の添加の順序 に応じて同時サンドイッチ型アツセィ、 フォワード （forward)サンドイッチ型ァ ッセィあるいは逆サンドイッチ型アツセィなどと呼ばれる。 例えば洗浄、 ί游、 震盪、 ろ過あるいは抗原の予備抽出等は、 特定の状況のもとでそれら測 ¾ 程の 中で ¾S採用される。 特定の ¾¾、 緩衝液等の濃度、 あるいはインキュべ一 シヨン処理時間などのその他の測 ¾ ^件は、 検体中の抗原の濃度、 検体試料の性 質等の要素に従 、変えることができる。 当業者は通常の実験法を用いながら各測 定に対して有効な最適の条件を適: il定して測定を行うこと力出来る。 抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、 本発明ではそれ らから適宜選んで用いること力できる。 担体としては、 ί¾ 抗体反応などに <M されるもの力種々知られており、 本発明においても勿論これらの公知のものの中 から選んで使用できる。 特に好適に使用されるものとしては、 例えばガラス、 例 えば活' f生ィヒガラス、 多孔質ガラス、 シリカゲル、 シリカ一アルミナ、 アルミナ、 磁化鉄、 磁ィ匕合金などの無機材料、 ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリ塩化ビ ニル、 ポリフッ化ビ二リデン、 ポリ酢酸ビニル、 ポリメタクリレ一ト、 ポリスチ レス スチレン一ブタジェン共重合体、 ポリアクリルァミ ド、 架橋ポリアクリル アミ ド、 スチレン一メタクリレート共重合体、 ポリグリシジルメタクリレート、 ァクロレインーエチレングリコ一ノレジメタクリレート共重合体など、 架橋化アル ブミン、 コラーゲン、 ゼラチン、 デキストラン、 了ガロース、 架橋ァガロース、 セルロース、 微結晶セルロース、 カルボキシメチルセルロース、 セルロースァセ テートなどの天然または変成セルロース、 架橋デキストラン、 ナイロンなどのポ リアミ ド、 ポリウレタン、 ポリエポキシ樹脂などの有機高 質、 さらにそれ らを乳化重合して得られたもの、 細胞、 赤血球などで、 必要に応じ、 シランカツ プリング剤などで官能性基を導入してあるもの力挙げられる。
さらに、 ろ紙、 ビーズ、 試験容器の内壁、 例えば試験管、 タイタ一プレート、 タイタ一ゥヱル、 ガラスセル、 合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセル、 ガ ラス棒、 合成材料からなる棒、 末端を太くしたりあるいは細くしたりした棒、 末 端に丸 、突起をつけたりあるいは偏平な突起をつけた棒、 謝反状にした棒などの 固体物質 （物体） の表面などが挙げられる。 これら担体へは、 抗体を結合させること力でき、 好ましくは本発明で得られる に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を結合させること力できる。 担 体とこれら抗原抗体反応に関与するものとの結合は、 吸着などの物理的な手法、 あるいは縮合剤などを用いたり、 活性化されたものなどを用いたりする化学的な 方法、 さらには相互の化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出 来る。
標識としては、 酵素、 酵素基質、 酵素インヒビター、 補欠 ¾、 補酵素、 酵 素前駆体、 アポ酵素、 蛍光物質、 色素物質、 化学ルミネッセンス化合物、 発光物 質、 発色物質、 磁気物質、 金属粒子、 例えば金コロイドなど、 放射性物質などを 挙げることができる。 酵素としては、 SfeK素酵素、 還元酵素、 酸化酵素などの酸 化還元酵素、 例えばアミノ基、 カルボキシル基、 メチル基、 ァシル基、 リン酸基 などを転移するのを i某する転移酵素、 例えばエステノ 吉合、 グリコシド結合、 エーテル結合、 ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵素、 リア一ゼ、 イソ メラ一ゼ、 リガ一ゼなどを挙げること力できる。 酵素は複数の酵素を複合的に用 、て検知に利用することもできる。 例えば博素的サイクリングを利用することも できる。 代表的な方 M寸性物質の標 ϋ)¾同位体元素としては、 [3 2Ρ], [1 2 5 ΐ], [1 3 , ΐ],
[3H]， [1 4 C]， [3 5S] などが挙げられる。
代表的な酵素標識としては、 西洋ヮサビペルォキシダ一ゼなどのペルォキシダ
—ゼ、 大腸菌 3- D-ガラクトシダ一ゼなどのガラクトシダ一ゼ、 マレエート ·デ ヒドロゲナ一ゼ、 グルコース- 6-フォスフエ一ト ·デヒドロゲナ一ゼ、 ダルコ一 スォキシダ一ゼ、 グルコアミラーゼ、 アセチルコリンエステラーゼ、 カタラーゼ 、 ゥシ小腸アル力リホスファタ一ゼ、 大腸菌アル力リホスファタ一ゼなどのァノレ カリフォスファターゼなどが挙げられる。
アル力リホスファタ一ゼを用いた： lf^、 4-メチルゥンベリフヱリルフォスフヱ ―トなどのゥンべリフエ口ン誘 ¾j本、 二トロフエニルホスフヱ一トなどのリン酸 化フェノ一ル誘 本、 NADPを利用した酵素的サイクリング系、 ルシフェリン誘導 体、 ジォキセタン誘 本などの基質を使用したりして、 生ずる堂光、 発光などに より測定できる。 ノレシフェリン、 ルシフヱラ一ゼ系を利用したりすることもでき る。 力タラ一ゼを用いた^、 過酸化水素と反応して酸素を生成するので、 その 酸素を電極などでネ 口することもできる。 電極としてはガラス電極、 難溶性御莫 を用いるイオン電極、 謹型電極、 高分子膜電極などであることもできる。 酵素標識は、 ピオチン標識体と酵素標識アビジン （ストレプトアビジン） に置 き換えることも可能である。 標識は、 複数の異なった觀の標識を删すること もできる。 こうした 、 複数の測定を纖的に、 'あるいは非連镜的に、 そして 同時にあるいは別々に行うことを可能にすることもできる。 本発明にぉ ヽては、 信号の形成に 4-ヒドロキシフエニル酢酸、 1, 2-フヱニレン ジァミン、 テトラメチノレべンジジンなどと西洋ヮサビ ·ペルォキシダ一ゼ、 ゥン ベリフェリルガラクトシド、 ニトロフェニルガラクトシドなどと /S- D-ガラクト シダ一ゼ、 グルコース- 6-リン酸 ·デヒドロゲナーゼなどの酵素！^の組合わせ も利用でき、 ヒドロキノン、 ヒドロキシベンゾキノン、 ヒドロキシアントラキノ ンなどのキノ一ル化合物、 リポ酸、 ダルタチオンなどのチオールィ匕合物、 フヱノ —ル誘 本、 フエロセン誘 本などを酵素などの働きで形成しうるもの力使用で さ
蛍光物質あるいは化学ルミネッセンスィ匕合物としては、 フルォレセィンィソチ オシァネ一ト、 例えばローダミン Bイソチオシァネ一ト、 テトラメチル口一ダミ ンイソチオシァネートなどのローダミン誘 本、 ダンシルク口リ ド、 ダンシルフ ノレオリ,,ド、 フル才レス力ミン、 フィコビリプロテイン、 ァクリジニゥム塩、 ルミ フヱリン、 ノレシフェラ一ゼ、 ェクオリンなどのルミノール、 イミダゾ一ル、 シュ ゥ酸エステル、希 ±11キレート化合物、 クマリン誘稱などが挙げられる。 標識するには、 チオール基とマレイミ ド基の反応、 ピリジルジスルフィ ド基と チオール基の反応、 了ミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うこと力で き、 公知の方法あるいは当該分野の当業者力く容易になしうる方法、 さらにはそれ らを修飾した方法の中から適: il択して適用できる。 また上記免 ¾ ^性複合体作 製にィ されることのできる縮合剤、 担体との結合に使用されることのできる縮 合剤などを用いることができる。 縮合剤としては、 例えばホルムアルデヒド、 グルタルアルデヒド、 へキサメチ レンジイソシァネート、 へキサメチレンジイソチオシァネート、 Ν, Ν' -ポリメチ レンビスョ一ドアセトアミ ド、 Ν， Ν' -エチレンビスマレイミ ド、 エチレングリコ —ルビススクシ二ミジルスクシネート、 ビスジァゾベンジジン、 卜ェチル -3 -（3 - ジメチルァミノプロピル） カルボジィミ ド、 スクシンィミジル 3- (2-ピリジル ジチォ） プロビオネ一ト（SPDP)、 N-スクシンィミジル 4- (N-マレイミ ドメチル ) シクロへキサン- 1- カルボキシレート（SMCC)、 N-スルホスクシンィミジル 4 - (N-マレイミ ドメチル） シクロへキサン-卜カルボキシレート、 N-スクシンイミ ジル （4-ョ一ドアセチル） ァミノべンゾエート、 N-スクシンィミジル 4- (卜 マレイミ ドフヱ二ノレ） ブチレート、 Ν- ( ε—マレイミ ドカプロイノレオキシ） コハ ク酸ィミ ド (EMCS), ィミノチオラン、 S-ァセチルメルカプトコハク酸無水物、 メ チル- 3- (4' -ジチオビリジル） プロピオンィミデ一ト、 メチル -4-メルカプトブ チリルイミデート、 メチル -3 -メルカプトプロピオンイミデート、 N-スクシンィ ミジノレ- S-ァセチルメルカプトァセテ一トなど力挙げられる。 本発明の測定法によれば、 測定すべき物質を酵素などで標識したモノクロ一ナ ノレ抗体などの標識抗体 と、 担体に結合された抗体とを順次反応させることが できるし、 同時に反応させることもできる。 を加える川 imま選ばれた担体系 の型により異なる。 感作されたプラスチックなどのビーズを用いた には、 酵 素などで標識したモノクロ一ナル抗体などの標識抗体 を測定すべき物質を含 む検体蘭と共に最初適当な試験管中に一緒に人れ、 その後該感作されたブラス チックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
本発明の定量法においては、 免疫学的測定法が用いられる力 その際の固相担 体としては、 抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、 ポリカーボネ イト製、 ポリプロピレン製あるいはポリビニル製のボール、 マイクロプレート、 スティック、 微粒子あるいは試験管などの種々の材料および形態を任意に選択し 、 删すること力できる。
測定にあたつては至適 pH、 例えば pH約 4〜約 9に保つように適当な緩衝液系中 で行うこと力《できる。 特に適切な緩衝剤としては、 例えばアセテート緩衝剤、 ク ェン酸塩锾衝剤、 フォスフェート緩衝剤、 トリス緩衝剤、 トリエタノールァミン 緩衝剤、 ボレート緩衝剤、 グリシン緩衝剤、 炭酸塩緩衝剤、 Tris- HC1緩衝剤など 力く挙げられる。 緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いること力できる。 抗原 抗体反応は約 0〜約 60°Cの間の i¾gで亍ぅことカ 子ましい。
酵素などで標識されたモノクロ一ナル抗体などの抗体 及び '担体に結合せし められた抗体觀、 さらには測定すべき物質のィンキュベ一ション処理は、 に達するまで行うことができる力 抗原抗体反応の ¥fiが達成されるよりもずつ と早 ヽ時点で固相と液相とを分離して限定されたィンキュベ一ション処理の後に 反応を止めること力でき、 液相又は固相のいずれかにおける酵素などの標識の存 在の禾體を測ること力くできる。 測定操作は、 自動化された測錢置を用いて行う こと力く可能であり、 ルミネセンス ·ディテクタ一、 ホト ·ディテクターなどを使 用して基質か ¾素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定するこ ともできる。 抗原抗体反応においては、 それぞれ用いられる！^、 測定すべき物質、 さらに は酵素などの標識を安定ィ匕したり、 抗原抗体反応自体を安定化するように適切な 手段を講ずること力《できる。 さらに、 異的な反応を除去し、 P且害的に働く影 響を減らしたり、 あるいは測定反応を活性化したりするため、 タンパク質、 安定 ィ匕剤、 界面活性化剤、 キレート化剤などをインキュベーション激夜中に加えるこ ともできる。 キレート化剤としては、 エチレンジァミン四酢酸塩 (EDTA) 力 り 好ましい。
当該分野で普通に採用されていたりあるいは当業者に知られた 寺異的結合反 応を防ぐためのブロッキング処理を施してもよく、 例えば、 哺乳動物などの正常 血清タンパク質、 アルブミン、 スキムミルク、 乳発酵物質、 コラーゲン、 ゼラチ ンなどで処理すること力くできる。 4寺異的結合反応を防ぐ目的である限り、 それ らの方法は特に限定されず用いること力く出来る。
本発明の測定方法で測定される試料としては、 あらゆる形態の溜夜やコロイド 離、 剕充体試料などが使用しうるが、 好ましくは生物由来の試料、 例えば胸腺 、 睾丸、 腸、 腎臓、 脳、 乳癌、 卵巣癌、 結腸 ·劃 癌、 血液、 血清、 血漿、 関節 液、 脳脊髄液、 脖液、 胆汁液、 唾液、 羊水、 尿、 その他の体液、 細胞培養液、 組 織培養液、 糸且織ホモジュネート、 生検試料、 組織、 細胞などが挙げられる。 これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析 . 法を本発明の測定方法 に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞ れの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、 本 発明の当！ 象物質ある 、はそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した 測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照すること 力くできる 〔例えば、 入江 寬褊， 「ラジオィムノアツセィ」 ， 講談社， 昭和 49年 発行；入江 寬褊， 「続ラジオイムノアツセィ」 ， 講談社， 昭和 54年発行；石川 栄治ら編， 「酵素免疫測定法」 ， 医学書院， 昭和 53年発行；石川栄治ら編， 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） ， 医学書院， 昭和 57年発行；石川栄治ら編， 「酵素免 疫測定法」 （第 3版） ， 医学書院， 昭和 62年 行； H. V. Vunakis et al. (ed. ) ， "Methods in Enzymology", Vol. 70 (Immunochemical Techniques, Part A), Academic Press, New York (1980)； J. J. Langone et al. (ed. ), 'Methods in
Enzymology", Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B), Academic Pres s， New York (1981)； J. J. Langone et al. (ed. )， "Methods in Enzymology，
Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C)， Academic Press, New York ( 1981) ; J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 84 (Imm 画 chemical Techniques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vo 1. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and Gene ral Immunoassay Methods), Academic Press, New York (1983)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniq ues, Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies), Academic P ress, New York (1986)； J. J. Langone et al. (ed. )， "Methods in Enzymolog y", Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Pre ss， New York (1989) ; M. Wi lchek et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", V ol. 184 (Avidin-Biotin Technology), Academic Press, New York (1990)； J. J. Langone et al. (ed. ), "Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular De si n and Model ing: Concepts and Appl ications, Part B: Anibodies and Anti gens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New Yo rk (1991) などあるいはそこで引用された文献 （それらの中にある記載はそれを 参照することにより本明細書の開示に含められる） 〕 。 本発明の抗 p30抗体 （抗ヒト p30抗体、 抗マウス p30抗体など） 、 特にモノク 口一ナル抗体を用いて、 ェピトープマッビングを行うこともでき、 各ェピト一プ を認識する抗体を用いれば当該タンパク質及びその関連べプチド断片などの検知 ，測定を行うこと力できる。
当該タンパク質及びその関連べプチド断片に対する抗体は、 当該タンパク質に よる細胞接着、 活性化型 Raplとの結合、 それに起因する様々な生理現象、 生物活 性の制御あるいは促進または抑制などの現象の検出及び Z又は測定、 さらには当 該 P30 タンパク質などの過剰あるいは減少により生ずる各種の生理活性物質ある いは生理現象又は生物現象の検出及び/又は測定、 また、 当該 p30- Rap 目互作用 を制御する因子や機構の研究'開発などに有用である。該抗体、 特にモノクロ一. ナル抗体は、 （0 当該 p30- Raplの相互作用に起因する細裁あるいは細胞が関連す る障害、 異常及び/又は疾患を検出したり、 （i i)当該 p30- Raplの相互作用に起因 する細胞の 3S¾化、 細胞の移動、 浸潤、遊走及び/又は転移あるいはその可能性 を検出したり、 （i i i) 当該 p30- Raplの相互作用の関与する細胞 あるいは細胞 の遊走に関連して生ずる障害、 異常及び Z又は疾患あるいはその可能性を検出し たり、 （iv)当該 p30 タンパク質の発 を測定したり、 （V)活性化された Raplと P30 との結合の変化を検出'及び Z又は測定したり、 （vi)当該 p30- Rapl結合などを 制御する化合物などの探索をしたり、 及び Z又は (vi i)該当該 p30 タンパク質産 生を制御する化合物の活性の検知及び Z又は測定をしたりなどするのに有用であ る。免 答、 炎症、 血管新生、 血液凝固、 倉 i磨治癒、 再生プロセス、 癌化、 癌 細胞の浸潤、 転移、 自己免疫におけるプロセス、 血液学的なプロセス、 細胞の異 常、 組織の異常、 力くんの移動性、 浸潤性、 走化'隨び/又は転移性の程度を知る のに使用できると期 ί寺される。
本発明に従えば、 当該 p30- Rapl間の結合による様々な生理活性あるいは生物活 性による現象 ·作用の促進活性あるいは抑制 ·阻害活性を検出及び/又は測定し 、 纖の疾患予防 ·治歸1】、 抗炎症剤、 抗がん剤、 力くん転移阻害剤、 動脈硬化症 ^m 関節破壊治歸 iJ、 抗アレルギー剤及び/又は免疫抑制剤の効果判定モニ ターとして使用すること力可能となる。
また、 本発明では、 当該タンパク質による組織 ·細胞あるいはタンパク質の異 常化現象の検出及び Z又は測定方法やそのための が樹共できる。 本発明のスクリーニング方法により見出される化合物は、 細胞歸抑制、 細胞 遊走抑制、 免疫抑制、 サイトカイン産生抑制、 アポトーシス発生抑制、 細胞増殖 抑制等の作用を有する。従って、 それらの化合物は、 抗炎症剤、 免疫疾患治;^ IJ 、 癌転移抑制剤として删すること力河能である。 それらの化合物の効果は以下 に示す方法により確認すること力くできる。 これらは、 本願で開示する発明の範囲 を制限したり、 あるいは制限することを示すものではない。
〔1〕 急性ヽ 慢闘化管潰瘍
急性モデルとしては、 Shy潰瘍 （幽門結紮潰瘍）、 水浸拘束潰瘍、 インドメタ シン潰瘍、 システアミン十二指腸潰瘍、 E性物質による潰瘍に対する効果を検 討する。慢性モデノレとしては酢酸潰瘍に対する効果を検討する。
( 1 ) 幽門結紮潰瘍
幽門結紮潰瘍の試験は 文献 3の第 249頁の記載に従し、行うことができる。 モデルの作製：ラット （140〜200 g) を 48時間または 72時間絶食（但し、 自 由飲水）後、 ヱ一テル麻酔下で開腹し、 幽門部を結紮する。 閉腹の後、 絶食 下に置く。被験物質の投与：幽門結紮直後に職空内または十二指腸内に投与する。 割面の方法： 13〜17時間後麻酔下に致死させ、 摘出した胃を 10 %中 锾衝ホ ルマリン水鎌で固定する。 固定標本の粘膜面を水洗し、 3 %酢酸水纖に 5分 、 1 %ァルシアンブル一 （3 %酢酸水溜夜に溶解）液中 20分浸潰して染色した後 、 3 %酢酸水激夜で洗浄する。 アルシアンブノレ一により染色された濃能部位の 面積を画像解機置 （汎用画像処理 "Win ROOF" ) を用いて測定、 潰瘍面積とす. る。被験物質投与群と非投与群間で潰瘍面積を比較する。
( 2 ) 7浸拘束潰瘍
水浸拘束潰瘍の試験は参考文献 3の第 249頁の記載に従 、行うことができる。 モデルの作製：ラッ卜の四肢を金網に緊縛し、 立位で胸骨下縁まで冷水 （23土
0. 2°C) に 10〜12時間浸す。
被験物質の投与：水浸拘束 10分前に細空内または経口投与する。
言 ¥1面の方法：水浸拘束終了後麻酔下に致死させ、 前記 〔 1〕 （1 ) の Hffiの方 法と同様に行う。
( 3 ) インドメタシン濱痕 インドメタシン潰瘍の試験は 文献 3の第 250頁の記載に従い行うこと力くで きる。
モデルの作製：ラット （22〜230 g) を 24時間絶食後、 indomethacin (Sigma) 30 mg/kgを皮下投与する。
被験物質の投与：インドメタシン投与 10分前に翻空内または経口投与する。 言 面の方法：インドメタシン投与 8時間後に麻酔下で致死させ、 前記 〔 1〕 ( 1 ) の 面の方法と同様に行う。
( 4 ) システアミン十二 ί旨昜潰瘍
システアミン十二指腸潰瘍の試験は参考文献 3の第 250頁の記載に従って行う こと力くできる。
モデルの作製：ラット （Wis tar雄性） を 24時間絶食後、 Cysteamine 300-400 mg/kgを皮下投与する。
被験物質の投与：ィンドメタシン投与 10分前に翻空内または経口投与する。 言 面の方法： システアミン投与 18時間後に麻酔下で致死させ、 前記 〔 1〕 ( 1
) の諮 ffiの方法と同様に行う。
( 5 ) 性物質による潰瘍
性物質による潰瘍の試験は参考文献 3の第 251頁に記載の方法に従って行 うこと力くできる。
モデルの作製：ラットを 24時間絶食 · ¾7k後、 純エタノール、 0. 6N HCU 25 % NaCl、 80 mMSt性夕ゥロコ一ル酸または高 を経口投与する。
被験物質の投与：舰性物質投与 30分前に駟空内または経口投与する。
諮面の方法： «性物質投与直後に麻酔下で致死させ、 前記 〔 1〕 （1 ) の評 価の方法と同様に行う。
( 6 ) 酢酸潰瘍
酢酸潰瘍の試験は 文献 3の第 251頁にモデルの作製に記載の方法に従って 行うことができる。 動物モデノレ：ラットをェ一テル麻酔下で開腹し、 20 %酢酸液 0. 04〜0. 06 mlを前 胃と腺胃部境界の粘膜下に注人する。
被験物質の投与：酢酸注入翌日から 14日間反复柽口投与する。
言¾5の方法：被験物質最終投与翌日に麻酔下で致死させ、 前記 〔 1〕 （ 1 ) の評 価の方法と同様に行う。
〔2〕 潰瘍性大腸炎
潰瘍性大 の試験は 文献 5の記載の方法に従って行うことができる。 モデルの作製：ラットに 3 % DSS (デキストラン石荒酸ナトリウム）水溶液を 11日 間自由飲水させた後、 引き続き、 1 % DSS水溶液を 14日間自由飲水させる。
被験物質の投与： 1 % DSS水鎌投与期間に 1日 1回、 14日間反復経口投与する o
fflの方法： 13〜17時間後麻酔下に致死させ、 摘出した大腸を 10肿性緩衝ホル マリン水溜夜で固定する。 固定標本の粘膜面を水洗し、 3 %酢酸水溜夜に 5分、 1 ¾ 'アルシアンカレ一 ( 3 %酢酸水溜夜に溶解）液中 20分浸漬して染色した後、 3 %酢酸水激夜で洗浄する。 アルシアンブノレ一により染色された濃青色部位の面 積を画像解ネ jf¾置 （汎用画像処理 "Win ROOF" ) を用いて測定、 糜爛面積とする
0被験物質投与群と非投与群間で糜爛面積を比較する。
〔3〕 クロ一ン病
クローン病の試験は 文献 6に記載の方法に従って行うことができる。
モデルの作製：ラットに TNBS (160 mg/kg in 50% ethanol) を回腸末端より注入 し小i^を作製する。
被験物質の投与：小腸炎作製後に 1日 1回、 7日間反復経口投与する。
謝面の方法：小腸炎作製 7日後麻酔下で致死させ、 病理解剖学的検査 （肉眼観察 ) を行う。 また、 ホルマリン固定御 E染色 熾標本を作製（参考文献 44、 第 10頁 ) し、 病理¾熾学的驢 （顕微鏡観察） を行う。両^ ¾で認められた各病変毎に 、認めず： 0、軽微： 0. 5、 軽度： 1. 0、 中等度： 2. 0、 高度： 3. 0の 5段階に 禾號を分類し、 数値化の後、 群毎に数値を集計し、被験物質投与群と非投与群間 で比較する。
〔4〕 慢 f生閉塞倒巿疾患 (C0PD)
慢性閉塞倒巿疾患 (C0PD) の試験は 文献 7に記載の方法に従って行うこと ができる。
モデルの作製：モルモットに煙草主 置（INH06—CIGR01 (株） . I. P. S) を用いて市販の煙草の主 垔を 30分/日、 5日/週で、 4週間曝露する。
被験物質の投与： 4週間の煙草煙曝露期間中 1日 1回反復経口投与する。
ffiの方法：投与期間終了後麻酔下で致死させ、 肺について病理解剖学的検査 ( 肉眼観察） を行う。 また、 ホルマリン固定 itHE染色紙織標本を作製 （参考文献 19 第 10頁） し、 病理¾¾織学的検査 （顕微鏡観察） を行う。両検査で認められた各病 変毎に、 認めず： 0、 軽微： 0. 5、 軽度： 1. 0、 中等度： 2. 0、 高度： 3. 0の 5 段階に禾雖を分類し、 数値化の後、群毎に数値を集計し、被験物質投与群と非投 与群間で比較する。
〔5〕 癌転移 （参考文献 13)
癌転移の試験は参考文献 13の記載に従って行うことができる。
モデルの作製：マウス （C57BL/6N, 早）尾静脈に、 5 X 104個 /0. 2 mlの B16マ ウスメラノ一マ培養細胞懸凝液を投与する。
被験物質の投与： B16細胞投与日から 21日後迄、 反復経口または翻空内投与する o
諮面の方法： B16細胞投与 21日後に麻酔下で致死させ、 摘出した肺を 10 ¾中' 锾 衝ホルマリン水溜夜で固定する。 固定標本をスライスし、 B16細胞の転移巣の数 を肉眼で数える。被験物質投与群と非投与群間で転移巣数を比較する。
〔6〕 アトピー性皮膚炎
了トピ一性皮膚炎の試験は参考文献 14の記載に従って行うこと力くできる。
モデルの作製：マウス （BALB/C) を DNP— OVA + Alum (Dini trop enol -Ovalbu min + Aluminium hydroxide gel) を S 空内投与して能動感作する。 感作 14日後 に耳介に DNFB (Dini trofluorobenzene) を塗布して惹起する。
被験物質の投与：感作から惹起迄、 惹起から検査迄または感作から検査までの 3 通りの期間で、 反復経口または翻空内投与する。
言 ¥iffiの方法：惹起 1時間後、 24時間後および 8日後に耳介の厚さを測定する。被 験物質投与群と非投与群間で耳介の厚さを比較する。
〔7〕 アレルギー性鼻炎
了レルギ一性鼻炎の試験は 文献 2第 225頁の記載に従って行うことができ る。
モルモッ卜に 5 % ovalbumin 0. 7 mlを筋注し感作する。感作 14日後に麻酔下で気 管を切開し、 圧縮空気ボンベにより、 500 ml/minの流速で 37〜40°Cにカロ温した空 気を鼻腔側気管から鼻腔 巟出させ、 鼻腔内圧を測定する。被験物質 0. 3 mlを鼻 腔内に流入させた後、 1 % ovalbumin 0. 3 mlを気管より鼻腔内に;^ Λさせて惹起 する。変化する鼻腔内圧を圧力トランスジューサーで測定し、被験物質投与群と 非投与群間で比較する。
〔8〕 喘息
喘息の試験は参考文献 16の記載に従 、行うことができる。
モデルの作製：モルモット （Hartley系） に 0. 5ml OVA+Alum (10 i OVA+lOmgAlu m) を Daylおよび Dayl4に翻空内投与して感作する。
被験物質の投与：最終感作 14日後に被験物質を経口投与する。
諮 ffiの方法：被験物質投与 30分後に、 10mg/kgピリラミン （ヒスタミン 拮抗 剤） を、 臓空内投与する。 その 30分後に 10mg/mlの OVA PBS (―)溶液を 10分間吸 入させて惹起する。 0VA惹起 4時間後に 400 / g/mlのメサコリンを 1分間吸人さ せた後、 無拘束呼吸機能角浙システムを用いて^ I抵抗パラメータとして Penhを 計測し、 被験物質投与群と非投与群間で比較する。
〔9〕 移植後拒艳症
( 1 )異所性心臓移植 異所性心藤植の試験は参考文献 17の第 44頁に記載の方法に従って行うこと力くで さる。
モデルの作製： ドナ一ラットをエーテル麻酔下で開胸し、下大静脈を結紮、 大動 脈、 Ml力脈を切離、 大動脈から乳酸リンゲル（へパリン加、 4°C、 5 ml) を注入 し l力脈から排出させ灌流、 上大静脈および肺静脈を纏めて結紮して心臓を摘出 し、 乳酸リンゲル中に保存する。 レシピエントラットをエーテル麻酔下で移植部 になる右頸部皮膚を切開、 右外頸静脈を切離して断端にカフ （ώΐ管吻合用チュー ブ、体部 1. 8 讓， ¾#¾1. 2 腿， 0/D 1. 34 謹） を装着、 右総頸動脈を切離して 断端にカフ （体部 1. 8 腿， 讓， 0/D 0. 99 讓） を装着する。 レシピエ ントの総頸動脈に装着したカフをドナ一心臓の大動脈に挿入 ·結紮、 レシピエン 卜の外頸静脈とドナーの肺動脈も同様に吻合する。拍動安定後に移植心臓を包む 様に皮膚を縫合し、 覚醒させる。
被験物質の投与：モデル作製後から試験終了まで 1日 1回、 経口、 駟空内または 静脈内投与する。
言 面の方法：皮下の移植心臓の触診、生存率を被験物質投与群と非投与群間で比 較する。
〔1 0〕 関節リウマチ
関節リゥマチの試験は参考文献 18に記載の方法に従って行うことができる。 モデルの作製：マウス （DBA/lJNCrj) にコラーゲン （Type I I collagen K— 41、 ゥシ関節由来コラーゲン 3 mg/ml含有）と等量の FCA (Freund Complete Adjuva nt) の均質なェマルジヨン（コラーゲン 1. 5 mg/ml)をマウス尾根部皮内に 0. 1 ml 投与する。
被験物質の投与：モデル作製 1週間後から 9週間後まで 1日 1回反復経口投与す る。
龍の方法：関節炎スコア {1週間に 1回、 四肢の全指関節について、 関節炎ス コア聽後化なしが 13、 1指もしくは謹旨におよぶ軽度の臓長が 14、 1指も しくは 旨におよぶ中等度の腿長が 15、 足全体におよぶ強度の H長あるいは関 節の 強直を含む)を 1 6 ) に従って採点し、 点数を合計して各動物の関節 炎スコアとする。発症日数は関節炎スコァ観察日のスコァ力く最初に 1以上となつ た日数を発症日数とする。被験物質投与群と非投与群間で関節炎スコアおよび発 症日数を比較する。
〔1 1〕 その他の対象疾患と効果試験法
前記以外の対象疾患に対する効果試験を表 1に示す。 表 1 疾患の分類と疾患名およびその試験方法 分類 対象疾患名 参考文献番号 抗炎症剤や癌転移抑制剤 皮下浮腫 1
ベーチェッ卜病 1
(細胞接着抑制、 細胞遊走
胸膜炎 1
抑制、 サイトカイン産生抑
腹膜炎 1
制、 アポトーシス発生抑制
肺気腫 3
で効果が期待出来る疾患）
肺水腫 3
脳梗塞 8
結節性動脈周囲炎 4
敗血症性ショック 9
ARDS 10
多臓器不全 (M0F) 1 1
全身性炎症反応症候群 （S I RS) 12
免疫疾患治療剤 自然発症全身性進行性皮虡硬化症 2
アレルギー性結膜炎 15
(免疫抑制で効果が期待 自己免疫性葡萄膜炎 2
出来る疾患） 糸球体腎炎 3
間質性腎炎 3
急性腎不全 3
悽性腎不全 3
全: 性エリテマ卜一デス 2
アレルギー性性脳脊髄炎 2
多発性硬化症 2
重症筋無力症 2
シエーグレン症候群 2
全身性自己免疫疾患 2 〔参考文献〕
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19 ： 「染色法の全て」 、 月刊 Medical Technology編、 医歯薬出版株式会社、 昭和 55年 3月 15日第 1版第 1刷発行 本発明の活性成分 〔例えば、 （a) 当該 p30 関連ポリペプチド、 その一部のぺプ チドまたはそれらの塩、 変異 p30 ペプチドやそれに関連するペプチド等、 (b) 該 当該 p30や Raplタンパク質あるいは当該ポリぺプチドをコードする DNAなどの核 酸等、 （c) 本発明の抗体、 その一部断片 （モノクロ一ナル抗体を包含する） また はその誘導体、 （d) 当該 p30 と Raplとの間の相互作用、 例えば結合など、 を制御 する化合物 （当言劾吉合を促進したりあるいは抑制 · Ρ且害するなどの現象、 あるい は紙織あるいはタンパク質の変質 ·過剰生産ある 、は分角觀象といつた生物学的 活性を促進あるいは抑制及び Ζ又は阻害する化合物） またはその塩、 当該 ρ30 タ ンパク質産生を制御する化合物またはその塩、 （e) 本発明で課題とする DNAなど の核酸に対するァンチセンス 'オリゴヌクレオチドなど、 (f) 本発明を使用して 見出された活性物質など〕 を医薬として用いる 、 例えば当該 p30 と Raplとの 間の結合阻割【ほたはそれらの塩等は、 通常 虫或いは薬理的に許容される各種 製剤補助剤と混合して、 医 組成物又は医薬調製物などとして投与すること力で きる。好ましくは、 経口投与、 局所投与、 または非経口投与等の使用に適した製 剤調製物の形態で投与され、 目的に応じていずれの投与形態 （吸入法、 あるいは 劃昜投与も包含される） によってもよい。
また、 本発明の活¾)¾分は、 各種医薬、 例えば掘聽剤 （杭がん剤） 、 SS«移 転阻害剤、 unrn s i rmnm^mt 鎮痛剤、 消 ^^及び/又は免疫抑 制剤と配合して使用することもでき、 それらは、 有利な働きを持つものであれば 制限なく使用でき、 例えば当該分野で知られたものの中から選択することができ る。 そして、 非経口的な投与形態としては、 局所、 経皮、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内もしくは翻空内投与を包含し得るが、 患部への直接投与も可能であり、 また ある: if^には好適でもある。 好ましくはヒトを含む哺乳動物に経口的に、 あるい は非経口的 （例、 細胞内、 組織内、静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内、 腿空内、.胸腔 内、 脊髄腔内、 点滴法、 昜、経直腸、 点耳、 点眼や点鼻、 歯、 皮膚や粘膜への 塗布など） に投与すること力くできる。具体的な製剤調製物の形態としては、 灘 製剤、 分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、 成翻剤、 浸出製剤などが挙げられ 、 例えば、 錠剤、被覆錠剤、 糖衣を施した剤、 丸剤、 トローチ剤、 硬カプセル剤
、 軟カプセル剤、 マイクロカプセル剤、 ¾Λ剤、 粉末剤、散剤、顆粒剤、 細粒剤 、 ¾寸剤、 液剤、 エリキシル剤、 ェマルジヨン剤、 灌注剤、 シロップ剤、 水剤、 乳剤、 懸濁剤、 リニメント剤、 ローション剤、 エアゾール剤、 スプレー剤、 吸入 剤、 噴霧剤、 軟膏製剤、 硬膏製剤、 貼付剤、 パスタ剤、 パップ剤、 クリーム剤、 油剤、 坐剤 （例えば、 wm \) 、 チンキ剤、 皮膚用水剤、 点眼剤、 点鼻剤、 点 耳剤、塗布剤、 輸液剤、 寸用液剤などのための粉末剤、 猶吉乾 剤、 ゲル調 製品等が挙げられる。
医薬用の組成物は通常の方法に従って製剤化すること力くできる。例えば、 適宜 必要に応じて、 生理学的に認められる担体、 医薬として許容される担体、 アジュ バント斉 ij、 mM 補形剤、 希釈剤、 香味剤、 香料、 甘味剤、 べヒクル、 防腐剤 、 安定化剤、結合剤、 P H調節剤、 緩衝剤、 界面活性剤、 基剤、 溶剤、 充塡剤ヽ 増量剤、 溶編助剤、可溶化剤、 等張化剤、 乳化剤、 懸濁化剤、 分散剤、 増粘剤 、 ゲル化剤、硬化剤、 吸収剤、粘着剤、 弾性剤、 可塑剤、崩壊剤、 噴射剤、 保存 剤、 抗酸化剤、 遮光剤、 保湿剤、 緩和剤、 帯電防止剤、 無痛化剤などを 虫もし くは糸且合わせて用い、 それとともに本発明のタンノ、°ク質等を混和することによつ て、 一般に認められた製剤実施に要求される単翻灘態にして製造することが できる。
非経口的删に適した製剤としては、 活' M;分と、水もしくはそれ以外の薬学 的に許容し得る媒体との無菌性鎌、.または懸濁液剤など、 例えば測剤等が挙 げられる。一般的には、水、 デキストローズ水皿、 その他関連した糖 の、職、 エタノール、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一ルなどのグ リコール類が好ましい ¾1寸剤用液体担体として挙げられる。測剤を調製する際 は、 蒸留水、 リンゲル液、 生理雄液のような担体、 適当な分散化剤または湿ィ匕 剤及び懸濁化剤などを して当該分野で知られた方法で、 激夜、 懸濁液、 エマ ルジョンのごとき灘しうる形に調製する。 測用の水性液としては、 例えば生理 液、 ブドウ糖やその他の補助薬 （例 えば、 D -ソルビトール、 D -マンニト一ノレ、 塩化ナトリウムなど） を含む等張液な どが挙げられ、 薬理的に許容される適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （た とえばエタノールなど） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポ リエチレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート
80™, HC0- 50など） などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油な どが挙げられ、 溶麟甫助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと 併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝 液など） 又は浸透圧調節のための難、 無痛化剤 （例えば、 塩化べンザルコニゥ ム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレ ングリコールなど） 、 保 (例えば、 ベンジルアルコール、 フヱノールなど） 、 ァスコルビン酸などの酸ィ匕防止剤、 吸収促進剤などと配合してもよい。 調製さ れた ¾1寸液は通常、 適当なアンプルに充塡される。 非経口投与には、 界面活性剤及びその他の薬学的に許容される助剤を加えるか 、 あるいは加えずに、 水、 エタノール又は油のような無菌の薬学的に許容される 液体中の灘ぁるいは懸濁液の形態に製剤化される。 製剤に删される油性べヒ クノレあるいは溶剤としては、 天然ある 、は合成ある 、は半合成のモノあるいはジ あるいはトリグリセリ ド類、 天然、 半合成あるいは合成の涵旨類あるいは脂肪酸 類が挙げられ、 例えばピーナッツ油、 トウモロコシ油、 大豆油、 ゴマ油などの植 物油が挙げられる。 例えば、 この ¾寸剤は、 通常本発明化合物を 0. 1 〜10 % 禾 MS含有するように調製されることができる。
局所的、 例えば口腔、 又は直腸的使用に適した製剤としては、 例えば洗口剤、 歯磨き剤、 口腔 [^剤、 吸入剤、 軟膏剤、 歯科充塡剤、 «コーティング剤、 歯 科ペースト剤、 嘮が挙げられる。 洗口剤、 その他歯科用剤としては、 薬理的 に許容される担体を用いて慣用の方法により調製される。 口腔噴霧剤、 吸入剤と しては、 本発明化合物自体又は薬理的に許容される不活性担体とともにエアゾー ノレ又はネブライザ一用の に溶解させるかあるいは、 吸入用微粉末として歯な どへ投与できる。 軟膏剤は、 通常使用される基剤、 例えば、 軟膏基剤 （白色ヮセ リン、 パラフィン、 オリ一フ"油、 マクロゴール 400、 マクロゴール軟膏など） 等 を添加し、 慣用の方法により調製される。 歯、 皮膚への局所塗布用の薬品は、 適切に殺菌した水または非水貝離剤の鎌 または懸濁液に調剤すること力できる。 添加剤としては、 例えば亜硫酸水素ナト リゥムまたはェデト酸ニナトリゥムのような緩衝剤；酢酸または硝酸フェニル水 銀、 塩化ベンザルコニゥムまたはクロ口へキシジンのような殺菌および抗真菌剤 を含む防腐剤およびヒプロメル.ローズのような濃厚剤が挙げられる。
坐剤は、 当該分野において周知の担体、 好ましくは非刺激性の適当な補形剤、 例えばポリエチレングリコ一ル類、 ラノリン、 力力ォ脂、 脂肪酸トリグリセライ ド等の、 好ましくは常温では固体である力場管の では液体で劃昜内で融解し 薬物を放出するものなどを删して、 慣用の方法により調製されるが、 通常本発 明化合物を 0. 1 〜95龍％程度含有するように調製される。 使用する!!離剤およ び濃度によって薬品は、 MJI Uに懸濁させるかまたは溶解させることができる。 局部麻瞄 |J、 防腐剤および緩衝剤のような補助薬は、 5F剤に溶解可能である。 経口的使用に適した製剤としては、 例えば錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 粉末剤、 顆粒剤、 トローチのような固形組成物や、 液剤、 シロップ剤、 懸濁剤のような液
^¾且成物等が挙げられる。 製剤調製する際は、 当該分野で知られた製剤補助剤な どを用いる。 鍵剤及び丸剤はさらにェンテリックコ一ティングされて製造される こともできる。 調剤単 ί 態がカプセルである: には、 前記タイプの材料にさ らに油脂のような液状担体を含有することができる。 また、 活' 分がタンノ、°ク質ゃポリぺプチドである Ji^、 ポリエチレングリコ —ル （PEG)は、 哺乳動物中で極めて毒性が低いことから、 それを結合させること は特に有用である。 また、 PEGを結合せしめると、 異種性化合物の免 ¾J^f4¾び 抗原性を効果的に減少せしめること力くできる^^がある。該化合物は、 マイクロ 力プセノ 置の中に入れて与えてもよい。 PEGのようなポリマーは、 ァミノ末端 のァミノ酸の -ァミノ基、 リジン側鎖の ε -アミノ基、 ァスパラギン酸又はグ ルタミン酸側鎖のカルボキシル基、 カルボキシ末端のァミノ酸の -カルボキシ ル基、 又はある種のァスパラギン、 セリン又はトレオニン残基に付着したグリコ シノ の活性化された誘 本に、 簡便に付着させることができる。
タンパク質との直接的な反応に適した多くの活性化された形態の PEG力《知られ ている。 タンパク質のァミノ基と反応させるのに有用な PEG としては、 カル ボン酸、 カルボネート誘稱の活性エステル、 特に、 脱離基が N-ヒドロキシスク シンィミ ド、 p -二トロフヱノ一ル、 ィミダゾ一ル、 又は卜ヒドロキシ- 2 -二ト口 ベンゼン- 4-スルフォネートであるもの力挙げられる。 同様に、 ァミノヒドラジ ン又はヒドラジド基を含有する PEG觀は、 タンパク質中の過ヨウ素酸酸ィ匕によ つて生成したアルデヒドとの反応に有用である。 さらに、 本発明の DNAなどの核酸を上記したような治療及び/又は予防剤とし て用いる:^、 該核酸はそれを 虫で用いることもできるし、 あるいは上記した ような遺伝 且換え技術で使用される適当なべクタ一、例えばレトロウイルス由 来べクタ—などゥィルス由来のベクタ一などに結合させるなどして用いることが できる。 本発明の DMAなどの核酸は通常の知られた方法で投与でき、 そのままで 、 あるいは、 例えば細胞内への嫩が促進されるように、 適当な補助剤あるいは 生理的に許容される担体などと共に、 製剤化されて用いること力くでき、 上記した ような、 医薬糸！^物又は医薬調製物などとして投与することができる。 また遺伝 子治療として知られた方法を適用することもできる。
本発明の活賊分は、 その投与量を広範囲にわたって選択して投与でき ¾力、 その投与 び投与回数などは、 処置患者の ¾Slj、 年齢、 体重、 一般的健康状態 、 食事、 投与時間、 投与方法、 お離速度、 薬物の組み合わせ、 患者のその時に治 療を行なつて 、る病状の^ に応じ、 それらあるいはその他の要因を考慮して決 められる。 医薬品製造にあたっては、 その添加剤等や調製法などは、 例えば日本薬局方解 委員会編、 第十四 ¾IE 日本薬局方解説書、 平成 13年 δ月 27日発行、 株 式会ネ： ^川書店；一番ケ瀬 尚 他編 医薬品の開発 12巻（製剤素剤 〔I〕 ）、 平成 2年 10月 15日発行、 株式会擴川書店；同、 医薬品の開発 12巻（製剤素材 〔 I I〕 )平成 2年 10月 28日発行、 株式会ネ 川書店などの記載を にしてそれら のうちから必要に応じて適宜選択して適用すること力できる。
本発明の活 分は、 当該 P30 と Raplとの間の相互作用活性（例えば、 結合活 性などの生物活性など） を制御 （促進あるいは抑制'阻害） するといつた生物学 的活性をもつものであれば特に限定されないが、 好ましくは有利な作用を持つも のが挙げられる。本発明め活性成分は、 例えば、 （a) 当該改変 p30 タンパク質、 その変異体ポリペプチド、 その一部のペプチドまたはそれらの塩等、 (b)該当該 タンパク質をコ一ドする DNA、 当該タンパク質変異体ポリぺプチドをコ一ドする DNAなどの核酸等、 （c)本発明の抗体、 その一部断片 （モノクローナル抗体を包 含する） またはその誘 本、 （d) 当該 p30 と Raplとの間の相互作用に起因する生 体成分との間の相互作用を制御 （促進あるいは抑制'阻害） するといつた生物学 的活性に有利な作用をもつ化合物またはその塩などが包含される。 本発明の活' M;分は、 当該 P30 と Raplとの間の相互作用に起因する各種組織あ るいは細胞における変化を制御 （促進あるいは抑制 · Ρ且害） するのに有用と期待 される。 また、該活'賊分は、 当該 Ρ30あるいは活性化型 Raplの活性発現の制御 、 さらには p30- Rapl結合の制御 （促進あるいは抑制'阻害） に有用であり、 当該 相互作用に起因する障害、 異常及び/又は疾患の予防ある 、は治療に有用である 。 また、 当該 p30- Rapl結合が関与する S重瘍細胞などの、 例えば移動、 浸潤、 遊走 及び/又は転移の制御、 例えば抑制に有用であると期待される。
本発明の活' f誠分は、 例えば p30- Rapl結合阻割 Uは、炎症疾患、 自己免疫疾患 、 臓器移植時の拒铯反応の抑制、 癌などを処置するための薬剤として有用であり 、 例えば胃潰瘍、十二指腸潰瘍、 急'幽萃炎、 気管支炎、 ARDS (急性呼吸窮迫症候 群） 、 C0PD (慢性閉塞 ' 市疾患）、 敗血症性ショック、 M0F (多臓器不全） 、 SI
RS (全身性炎症反応症麟）、 全身性エリテマト一デス、 混合型結^ a織病、 慢 性関節リウマチ、 シヱ一グレン症麟、 リウマチ熱、 グッドパスチヤ一症観、 バセドウ病、 橋本病、 アジソン病、 自己免疫性溶血性貧血、 特発 'ί她小板 性 紫斑病、重症筋無力症、 潰瘍性大 ^、 クローン病、 交換性眼炎、 多発性硬化症 、 乾癬、 アレルギー性鼻炎、 喘息などを処置するため、 臓器移植時の拒絶反応の 抑制のため移植前処理、 移植後投与のため、 さらには発癌抑制、 転移抑制などの ためにィ¾¾できると期待される。 本発明の Raplと p30との相互作用及び/又は結合を促進あるいは阻害する化合 物またはその塩（例えば、 式 (Dの化合物など） の投与量は、 対象疾患、 投与対 象、 投与ルートなどにより差異はあるが、経口投与する Ji^、 10 g〜10g/kg、 好ましくは 100 zg〜lg/kg、 より好ましくは lmg〜100mg/kg投与する。点滴 静注する齢は、 0. Ol g lg/kg/hr xehr、 好ましくは 0. l g〜100mg/kg/h r X6hr、 より好ましくは l〃g〜10mg/kg/hr X6hr投与する。単回静注する場 合は、 l g〜lg/kg、好ましくは 10〃g〜100mg/kg、 より好ましくは 100 g 〜10mg/kg投与する。翻空内に投与する: ^は、 l /g〜10g/kg、 好ましくは 10 〃g〜lg/kg、 より好ましくは 100 zg〜100mg/kg投与する。 麵列
以下に実施例を掲げ、 本発明を具体的に説明するが、 この鍾例は単に本発明 の説明のため、 その具体的な態様の参考のために提供されているものである。 こ れらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、 本願 で開示する発明の範囲を限定したり、 あるいは制限することを表すものではない 本発明では、 本明細書の思想に基づく様々な 形態力河能であることは理解 されるべきである。
なお、 DNAの切断、 i¾結、 昜菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、 ハイブ リダィゼ—シヨン等一般の遺伝 且換えに必要な方法は、 各操作に使用する市販 の ¾¾、 機械装置等に添付されている説明書や、 実験書（例えば 「Molecular cl oning (Maniatis T. et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press) 」 ) に基 本的に従った。全ての実施例は、 他に詳細に記載するもの以外は、 標準的な技術 を用いて実施したもの、 又は実施することのできるものであり、 これは当業者に とり周知で慣用的なものである。 細列 1
(Rapl会合分子 P30の単離）
Raplに会合する分子を同定するため、 Raplの活性化型変異体 RaplV12を bai tに 酵母 Two-hybr i d法によつてヒト白血球 cDNAラィブラリをスクリーニングした。 そ の結果、 Ras/Rap結合ドメィン (RBD)をもつ分子量 3万の蛋白質をコ―ドする分 子を単離し、 p30と命名した （図 1 ) 。 データベースの検索により p30は Norel と RBDドメインを含んで C末端側までアミノ酸が一致していた （図 1 ) 。 ヒトゲ ノムデータベースの角 斤力、ら、 p30は Norelの alternative splicing productで あること力くわかった。 RT - PCR法によりマウス p30cDNAも単離した。
p30が Raplに結合するかどう力、検討した。 そのため Raplの N-末端側を GSH (gl utathione-S- transferase)と融合させた蛋白質 (GST- Rapl) を大腸菌で産生させ 、 グノレタチォン結合力ラム 用 ヽて精製した。 また p30cDNAの N -末端側に Mycェ ピト一プを付加した Myc- p30遺伝子を COS細胞にトランスフヱクシヨンして p30 を; ¾に発現して 、る可溶化物を作成した。 aplは GTPと結合すると活性化型に なり、 GDPと結合すると不活化型になるので、 GST- Raplを GTPgS、 GDPbSとそれ ぞれ結合させ、 活性化型と不活化型を用意し、 Myc- p30を含む COS細胞可溶化物 と混合した。 その後 4 °Cで 2時間転倒混和後、 ダルタチオン糸吉合ビーズを加えて GST- Raplを回収した。 Raplに結合した myc- p30の検出は、 一次抗体に擴 ycマウ ス IgG2a抗体 (Cell Signal ing)を用い、 二次抗体に HRP標識の抗マウス IgG (Sig ma) を用いて、 ECLィヒ学発光法で化学発光用フィルム (Amer sham)を感光させて検 出した （図 2 ) 。 その結果、 p30は活性化型 Rapl特異的に結合することが明らか になった。活性化型 Raplに結合する性質から、 p30は Raplの活性化に伴って機能 する分子であることが考えられた。 難例 2
(RT- PCR法による p30の糸 現分布）
p30の各組織での発現をみるため、 RT- PCR法によって p30mRNAの発現を調べた 。 また類似肝 Norelの発現も比較検討した。 脳、 心臓、 肺、 肝臓、 腎臓、 脾臓 から RNAを抽出し、 cDNAを合成後、 PCR法によって p30 (P)と Norel (N) cDNAを 検出した （図 3 A) 。 mRNA量のコントロールとしてグルコース 3リン酸 flfcR素酵 素 (G3PDH)を用いた。 その結果、 p30は脾臓と肺で強く発現がみられた。 それに 対して Norelは脳で主に発現していた。 さらに種々の血液、 免 細胞株等での発 現を同様の手法で調べたところ、 p30は骨髄系 (HL60， U937)、 Tリンパ球 (Jurka t, Mol t4)、 Bリンパ球系 (BaF3， A20, Nalm6)の細胞株に発現し、 メラノ一マ細 胞 (B16)では発現していなかった。 それに対して、 Norelはこれらの細胞で発現 はみられず、 メラノ一マ細胞 (B16)で発現が確認された。 また未分化骨髄系細胞 HL60はレチノィン酸処理によつて好中球に分化する力 RT - PCR法により、 p30mRN Aの発現力 曽強した (HL60RA)こと力確認された。 実施例 3
(p30に対するモノクロ一ナル抗体の作成）
P30蛋白質の発現を調べるためモノクロ一ナル抗体の作成を行った。
マウス p30cDNAを pGEXベクタ一 （Amersham Pharmacia) に subcloningし、 大腸 菌 (BL21)導入後、 mp30の N末端側に GSTを融合させた GST- mp30を産生させた。 導 入した BL21を LB± 地 40( 、 30°Cで増殖させ、 0D6。。 0. 5に達した時点で IPTG ( 0. 2mM, Amersham Pharmacia) を加え、 さらに 4時間 i咅養した。 8し21を6 000回 転で沈殿させ、 PBSで一回洗浄後、 PBS 5mlで懸濁後、 超音波破砕装置 （トミ一 精ェ、 UD- 200)で出力 6、 15秒間 4回の条件で破枠する。 9000回転で遠心後、 上 清をグルタチオンカラム (Amersham Pharmacia)に結合させ、 100mlの PBSで洗浄 後、 グルタチオン （5mM) で溶出し、 PBSに対して透析し精製抗原とした。
精製 GST - humanp30と完全アジュバント （Difco)を混合し、 ラット （WKY/NCrj、 雌 8週齢， ォリェンタルバイォサ一ビス） の足底皮内に 0. 2mg/0. 1ml測した。 1週間後、 不完全アジュバント （Difco)と混合した GST- mp30(0. 1mg/0. 1ml)を再 び足底に ¾寸した。 5日後、 S昜骨リンハ。節を採取し、 ミエローマ細胞株 Sp2/0と ポリエチレングリコ一ルを用いた細胞融合を行 \ HAT培地 (GibcoBRL)にてノ、ィ プリ ドーマの ±咅養を; ί亍つた （モノクローナル抗体作製マニュアル、 多田伸彦著、 学 画、 1995年)。 12日後、 培 ¾±清を回収し、 ρ30に対する抗体を ELISA法 によって測定した。 ELISAに用いる抗原として MBP maltose - binding protein)と融合した MBP-hp30 を大腸菌で産生させ精製したものを使用した。 MBP- hp30は、 human p30 cDNAを pM ALベクター (New England Biolabs) に subcloningし、 マルト一ス結合蛋白質と の融合蛋白質を作製した (pML Protein Fusion and Purif iciation System, New England Biolabs)。 MBP-hp30 (0. 2mg/0. 2ml/wel l)を 96穴プレートに固相化し 、 サンドイッチ法にて培養上清中の抗体を検出した （モノクローナル抗体作製マ ニュアル、 多田伸彦著、 学際企画、 1995年） 。 陽性であった上清について human p30 cDNAを卜ランスフヱク卜した COS細胞を用いたウェスタンブロット法、 及び 免 色によって検定した。 これらのアツセィで陽性であった 6個のハイプリド —マについて限界希釈し、 クローン化した。 ェピト一プマッピングするため、 p3 0の N末端欠失 (RBDドメィン以降を含む）、 C末端欠失（N末端と RBDドメィ ンを含む） 、 RBDドメイン欠失（N末端と C末端のみ含む）変異体を COS細胞に 発現させ、 ウェスタン法にて検定したところ、 N末端を認識するもの 4つ （B1. 2 , E3. 7, E11. 2, G7. 3) と、 C を認識するもの 2つ ·（B4. 1， H10. 5) であつ た。 C末端を認識する抗体は Norelにも反応したが、 N末端を認識する抗体 4つ すべて Norelに反応せず、 p30特異的抗体であること力くわかった。血液、 免疫系 細胞株、 及び、 リンパ節から精製した Tリンパ球、 Bリンパ球に対する、 抗 p 3 0特異抗体 Ell. 2を用いたウェスタンプロッ卜の結果を示す（図 3 B)。 HL60を レチノイン酸で処理して好中球に分ィ匕させた細胞 (HL60 RA)、 vi taminD3 (ImM) と TPA (10 ng/ml)で刺激してマクロファージに分化させた細胞 (HL60 D3+T)では HL60と比較して p30の発現が増加していた。 Nalm6 (Bリンパ球系)、 Mol t4、 Ju rkat (Tリンパ球系)、 Κ562(赤芽球系)、 TF-1 (骨髄系） で発現が認められた 。 （図 3 Β) 麵列 4
(細胞遊走に与える Ρ30の効果）
(1) 野 βの Ρ30と Raplとを共に発現させた齢の細胞遊走
p30が活性化型 Rapl (RaplV12) ゃケモカィンによる細胞遊走にどのような影 響をあたえるか調べるため、 ヒト LFA- 1を発現させた proB細胞株 BAFに p30， Rap 1V12, RaplV12と p30の両方を発現させた BAF細胞を作成し、 ICAM-1上での細胞 遊走を測定した。 用 ^ ICAM-lとしてヒト ICAM- 1細胞外領域をヒト免疫グロブリ ン Fc領域と融合させた蛋白質 (hICAM -卜 Fc)を用いた。 細胞遊走は Bioptechs社の AT Cul ture Dishシステム（ΔΤ Cul ture Dish system, Biotechs, Inc)を用い た。 径 6cniの温度制御プレート上に ICAM- l(0. 1mg/ml) を固相化し作成した BAF 細胞を加え、 20分間 37°Cでビデオ撮影した。 それぞれの実験で移動距離を細胞 20 個について測定し、 平均速度を計算した。 その結果、 RaplV12は ICAM- 1上での細 胞移動速度を増加させ、 P30はさらにその効果を増強させた （図 4 )。
(2) p30の RBDドメインの変異体を Raplとを共に発現させた の細胞遊走 この系において p30の増強効果が Raplと結合することによって起こるのかどう 力、調べるため、 p30の RBDドメイン変異体 (p30RBDm) を作成した。 p30RBDmは RBDドメィンで保存されいる 7つのァミノ酸、 すなわち 123番リジン、 124番ァ ルギニン、 135番リジン、 154番リジン、 155番リジン、 160番ァスパラギン酸 、 161番ァスパラギンをァラニンに置換した変異体である。 この p30RBDmは野生 型同様に発現するが、 野鍾と異なり GTP ' Raplに結合できない。 RaplV12と p3 ORBDmを BAF細胞に発現させ、 ICAM- 1上での移動速度を測定したところ、 増強効 果はみられなかった。 従って、 p30の RaplV12による細胞移動を促進する効果は Raplと結合することが必要であること力わかった。
次にケモカインによる細胞遊走への効果を検定した。 ヒト LFA-1を発現させた BAF細胞に p30と p30RBDmを導人し、 ICAM- 1上での細胞移動を SDF- 1(CXCL12) (20 nM) 存在下に上記の方法で測定した。 その結果、 P30は SDF- 1刺激による細胞遊 走を約 2倍に冗進した。一方、 p30RBDmにはその効果がみられなかった。 以上の こと力ヽら、 p30は Raplに結合してケモカインによる細胞遊走を亢進させる作用が あることが明らかになつた (図 5 )0 実施例 5
(p30による LFA-1¾#制御） p30が Raplの下流エフヱクタ一^?として、 上昇作用に関与する可能性を 探るため、 p30を 3A9T細胞へ過剰発現させ、 3A9T細胞の LFA- 1を介する ICAM- 1へ の接着活性への影響を adhesion assayにより検討した。 すなわち、 マウス ICAM - 1 の細胞外領域をヒト免疫グロプリン Fc領域に融合させ、 2量体にしたキメラ蛋白 質を作成し、 プレート上に固相ィ匕し、 細胞の IC眉- 1への鐘活性を測定した。 細 胞は BCECF- AM (Molecular Probe)で蛍光色素でラベルし、 IC層- 1 (0. 1 mg/ml) を固相化したプレート上で、 37°Cで 30分ィンキュベ一トした。 Input細胞数、 お よびプレートを 3回以上洗った後に残った細胞数 した細胞数） を蛍光リー ダ一（Cytof luor 4000, Persepetive Biosystems)で測定し、 input細胞に対する した細胞の割合をその細胞の接着活性とした。 その結果、 3A9T細胞での p30 の発現量に応じて、 LFA- 1の ICAM- 1に対する g¾活性が上昇すること力わかつた
(図 6 A)。 また p30が Raplの下流で、 鐘に関与して 、るとすれば、 p30への結合活性を 失った Raplの mutantでは、 接着の上昇は認められないはずである。 Raplの effect or領域と呼ばれるアミノ酸配列力く、 p30を始めとする、 Raplの下流 effector^? 力く結合する領域であること力、 半 IJ明している。 そこで活', RaplV12のこの領域 に point mutationを導入した。 Raplの 35番スレオニンをグルタミン酸 (T35E：)、 37 番グルタミン酸をグリシン (E37G)、 38番ァスパラギン酸をグノレタミン酸 (D38B) 、 40番チ口シンをシスティン （Y40C) に置換した変異体を作製した。 Rapl V12と の会合から E37Gは p30への結合活性を残している力く、 T35E, D38E, Y40Cは p30に 結合できないこと力わかった。 そこでこれらの変異体を 3A9T細胞へ導入した。 そ の結果、 p30に結合活性を残す E37Gでのみ、 LFA- 1の ICA -1への接着の上昇が認 められた （図 6 B) 。 このことから、 P30は Raplの下流で 上昇に関与してい る可能性が示唆された。
TCR刺激によって誘導される LFA- 1/ICAM- 1¾«は、 Raplの活性化を介すること 、 Raplの特異的阻^? Spa- 1を発現させると完全に抑制されることから、 明 かとなつている。 従って、 p30は Raplの下流で■に関与するとしたら、 TCRを 介する LFA- 1/ICAM-1¾»を抑制すると予想される。 そこで、 p30の変異体を作成 し、 優勢抑制型に機能する変異体 (del taNp30)を作製した。 dletaNp30は p30の N末端から 100 アミノ酸欠失させて作製した。 3A9T細胞へ導入し、 TCR刺激によ る LFA- 1/ICAM - 1¾¾を検討した。 その結果、 図 6 Cに示すように、 deltaNp30 は発 ξ|*依存性に、 TCR刺激による LFA - 1の ICAM - 1への接着を抑制すること力'判 明した。
以上の結果より、 ρ30は Raplの下流で、 LFA- 1/ICAM- 1を介した細胞接着に重 要な役割を果たしてレ、ること力 明かとなつた。 実施例 6
(Raplと p30との結合に及ぼす N— (2—ェチルスルホニルァミノ一5—トリフル ォロメチルー 3—ピリジル）シク口へキサンカルボキサミ ド ·一ナトリウム塩 · ~7_K和物 （化合物 1 ) の影響）
(l)GST— Raplビーズの作成
GST— Raplのフユ一ジョンタンパクの産生用プラスミ ドとして pGEX— 3X (Amersh am Pharmacia Biotech) を i^fflした。 酉己列番号: 1で表される Raplのコ一ディング 配列を該ベクタ一の BamHI、 EcoRIの制限酵素サイ卜の間に揷人した。 その際、 フレームを合わせるため、 配列番号: 1で表される塩基配列の 5，末端 ATGの前に 2塩基対 CCが 口されるようにした。 その結果、 該ベクタ一の BamHIサイトと Ra Piの連結は 5 ' ·· -GGATCCCCATG- · 3 'となった。 得られた GST- Raplのフュ一ジョ ンタンパクの産生用プラスミ ドを、 昜菌に遺伝子導入した。 プラスミ ドの組み 込まれた大腸菌を培養し、 0. 2mM IPTG (イソプロピルチオガラクトビラノシド） にて夕ンパク産生誘導をかけて (30°C、 2時間) 昜菌内に GST-Rapl夕ンパク質 を産生させた。 昜菌を遠心分離にて回収は ys is buffer (lOOmM NaCl, 50mM T ris-HCl(pH7. 5), 1% Tri ton X100, 2mM MgCh, 0. 1 TlU/ml Aprotinin)で溶解 し、 ソニケ一シヨンにて 昜菌膜を破壊した。 その溜夜を遠心分離し得られた上 清に Glutathione Sepharose 4Bビーズ (Amersham)を加え 4 °Cで 1時間反応させ 、 GST_Raplビーズを作成した。 (2) p30可溶化物の調製
70%コンフルェントの 293T細胞に p30- Myc tagのプラスミ ドをエレクトロポレ —シヨン法で導人した。導入した細胞を 2日間培養し、 遠心分離にて回収した。 回収した細胞を Lysis bufferで溶解し、 遠心分離の後に上清を回収し p30 Lysate とした。
(3) 結合阻害試験
GST-Raplビーズ 25 Lを Loading buffer(25inM Tris-HCl (pH7. 5), 2mM BDTA, 2. 5mM MgCh, lni DT )で洗浄し、 2mM GTP r s(si ma)を加えて 37°C 15分 ィンキュベ一トし Raplを活性化した。 ここに 250 zLの p30 Lysateを加えて 4°C で 30秒間反応させた。 この 30秒の反応直前に終濃度 1 /Mとなるように N- (2-ェ チルスルホニルァミノ- 5-トリフルォ口メチル- 3 -ピリジノレ）シク口へキサンカ ルポキサミ ド '一ナトリウム塩'一水和物 （化合物 1 ) を加えた。 反応後 Lysis bufferで 4回洗净し、 遠心で沈殿したビーズに 25〃Lの通常のサンプルバッファ —を加えて SDS- PAGEのサンプルとした。 このサンプルを SDS- PAGEにかけてゥェ スタンプロッテイングを行った。 P30の検出は一次抗体に ycマウス IgG2a抗 体 (Cell Signal ing)を用い、 二次抗体に HRP標識の抗マウス IgG(Sigma)を用いて 、 ECL化学発光法で化学発光用フィルム (Amersham)を感光させて検出した。
ィ匕学発:) ^フィルムを感光させて得られたバンドを画像解析ソフト （win Roof 、 三谷商事） を用いて 化した。 即ち、 比較すべき P30のバンドを二値化処理 により抽出し、 輝度 X面積のカテゴリ一の体積を比較した。
ィ匕合物 1の 1 //M処理区にお 、て、 この値は、 無添加区に比し著しく低 、値と なった （図 7 ) 。 このことから化合物 1は Raplと p 30との糸吉合を阻害すると考え りれ ·έ>ο
前記方法によれば、 Raplと ρ30 との結合を阻害する有用な化合物のスクリー二 ングを行なうこと力河能と考えられる。
同様にして、 例えば特開平 6- 263735号公報に開示の各種ジァミノトリフルォロ メチルピリジン誘 本を使用してその活性をスクリ一ニングできる。 実施例 7
(1) p30による微小管の発達
p30の微小管細胞骨格への影響をみるために 3A9T細胞にヒト p30の遺伝子を導 入した。 3A9T細胞と p30を導入した細胞 (3A9/p30) を 3. 3%パラホルムアルデヒド で 1 5分、室温で固定後、 ポリい Jジンをコートしたスライドにマウントした。 PBSで洗浄後、 2mM MgCl 2 を添加した PBS/0. 2% Τχ-100を加え、 5分間インキュ ベ一卜した。 PBSで洗浄後、 5 %ャギ血清で 2 0分間ブロッキングした。 その後 、 マウス抗チュ一ブリン抗体 ( 1 %BSAで 5 0 0倍希釈） を加え、 1時間インキ ュべ一トした。 4回 PBS/0. 1%BSAで洗浄後、 400倍希釈 Alexa488ラベルャギ抗マ ウス IgG (Molecular Probe) を加え、 1時間インキュベートした後、 4回 PBS/0. 1%BSAで洗浄、 共焦点レーザー顕微鏡で観察した （図 8 ) 。 その結果、 p30を導 人すると細胞の形態が変形し、 微小管の鍵が著しく ϊΐ進していることが明らか なった。 このことから ρ30 は微小管を発達させる作用があることがわかった。
(2) Τ細胞と抗原提示細胞との據における ρ30 と LFA- 1の局在
Τ細胞と ί¾1提示細胞 (APC) との ^成は Τ細胞の ¾¾¾認識を可能にする重 要な接着であるが、 この漏には LFA- 1/IC層- 1を介する。 そこでこの接着におけ る Ρ30 と LFA- 1の局在を調べた。 T細胞として HEL (hen egg lysozyme)特異的 3A 9 T細胞、 APC として CH27細胞を用いて検討した。 CH27細胞 (lxlO5 /ml)を HEL in (100 〃g)を加えて 1 6時間培養した。 その後、 同数の 3A9 T細胞と CH27細 胞（lxlO5 /ml)を混ぜ、 3 7度で 3 0分インキュベートした。 3. 3%パラホルムァ ルデヒドで 1 5分、室温で固定後、 ポリいリジンをコートしたスライドにマウン 卜した。 PBSで洗浄後、 2mM MgCl 2 を添加した PBS/0. 2% Τχ-100を加え、 3分間 インキュベートした。 PBSで洗浄後、 5 %ャギ血清で 2 0分間ブロッキングした 。 ラット抗 ρ30抗体 (10 g/ml) (Ell. 2) 、 を加え、 1時間インキュベートした o 4回 PBS/0. 1%で洗浄後、 Alexa- 546結合ラット抗マウス IgG( 1 %BSAで 5 0 0 倍希釈、 Molecular Probe)を加え、 1時間ィンキュベ一トした。 ピオチン化マウ ス抗 LFA- 1抗体 ( 1 %BSAで 1 0 0倍希釈 Pharmingen )。 4回 PBS/0. 1%で洗浄 後、 1 %BSAで 1 0 0倍希釈した FITC- ラベル抗ビォチン抗体 (Jackson Labora tory) を加え、 1時間インキュベートした。 4回 PBS/0. 1%で洗浄後、 共焦点レ一 ザ一顕微鏡で観察した （図 9 ：右下の p30の は白黒表示では黒くて判別がつ かないが、 カラ一表示では赤いシグナルが中心部に観察できる、 また LFA-ではグ リーンのシグナルが確認される） 。 その結果、 LFA-1 と p30 は T- APCの據面に 集積し、 両者は共局在した （merge)。 これは p30 による LFA- 1制御の機能とよく 合致した局在と考えられる。 麵列 8
p30高発現トランスジエニックマウスの作製
(1)トランスジヱニックマウスの作製に用レ、る DNA断片の調製
ライブラリ一よりクロ一ニングされた p30マウス対応遺伝子 （酉己列番号： 9 ) の両端に、 EcoRIサイトを有するスぺ一サー配列を形成した DNA断片を作製し、 CMVェンハンサ一配列及び CAGプロモータ配列を有するベクタ一 PCNX2 (京都大 庶謝受より分譲） を EcoRI (タカラバイオネ: tK) で開裂したものに挿入した 。 次に該プラスミ ドを Sal I - Hindl l lで切開することにより、 顕微注入に用いる DNA断片 (3075bp) 、 即ち CMVェンハンサ一配列及び CAGプロモータ配列の下流 に P30遺伝子が発現可能な状態で連桔されたものを調製した。
(2)マゥスへの遺伝子導入
トランスジエニックマウス作製は、 Gordon らの方法 (1980. Proc. Nal t. Acad. Sci. 77 : 7380-7384) の改良法で歸 feする。
先ず雌マウス C57BL/6N Crj (日本チヤ一ルスリバ一） に対して過剰 柳誘起処 理 （妊馬血清性糊泉刺激ホルモン 5 IUの投与とその 48後のヒト胎盤性倒泉刺激ホ ルモン 5 IUの投与による） を行った後、 同系統の雄マウスと同居させ交配する。 翌朝、 膣娜成の見られる雌マウスから卵管を摘出し、 前核期受精卵を採取する この受精卵の雄性前核に対して、 遺 em入用マイクロキヤビラリ一を用い、 上記で調製した DNA断片の鎌 （TE緩衝液にて数 ng/fi l に調製） を顕微注入す る。注入処理後 2〜 3時間∞2ィンキュベータ内で培養する。 培謝麦、 形態的に正常な胚を選び、胚移 ffifflの擬似妊娠雌マウス {Jcl ： MCHC ICR) (日本クレア）） の卵管に移植する。 この擬似妊娠雌マウスとしては、 発情 期にある雌を輸精管結さつ雄マゥスと一晩同居させ、 翌朝膣鄉成が見られたも のを使用する。卵管への胚移植は、麻酔した雌マウスの背部を切開し、 卵巣を摘 み上げ、卵管采と卵管膨大部の間を一部切開し、 胚移植用のパスツールピぺット 先端に充塡された、 胚を含んだ培養液、 空 S、 培養液をこの順に注入すること で行う。
移植後、 縫合措置をした雌マウス Of 复） を隔離飼育用ビニールアイソレータ 内 入し、 自然分娩させ、 離乳まで, »する。但し、 出産予定日の午後までに 出産が認められない：^は、 子宮切断術による新生仔の摘出を実施し、 得られた 新生仔を予め別のアイソレータに準備した里親 (特定病原体を保持しない： SPF) に付けて哺育させる。離乳時に 复または里親を用 ヽて¾物学的検査を実施し 、親の SPFが確認された産仔を SPF飼育室に導入し、遺伝子角? |斤を実施する。遺 解析後、導入遺 を有する産仔を用 、て次世代への導入遺伝子の錢を確 認する。
(3)導入された遺伝子の餅斤
SPF飼育室へ導入後（離乳. SPF確認後） 、 得られた産仔の断尾を行う。尾部 糸纖の採材は予め乾熱滅菌した専用ノ、サミで尾を先端より約 10〜15mmの位置で切 断し、 滅菌済エツペンドルフチューブに入れ、麟斤時まで- 80°Cで保管する。 凍結保管された前記尾部糸纖からプロテア一ゼ ¾処理法（アマンャムバイォサ ィエンス： cord ;27- 2537- 01) により DNAを抽出する。抽出された DNAをテンプ レートにして p30遺伝子の 5'側とすぐ下流のベクタ一部分の 3'側に設計されたプ ライマ一 [それぞれ ATGACCGTGGACAGCAGCATGAGCAGCGGG (酉己列番号 1 1 )及び1 ΤΑΠ TGTGAGCCAGGGCAnGGCCACACCA (酉己列番号 1 2 )を用い、 PCRにより導入された前 記遺伝子断片を有するマウスを確認する。 この PCRにおレて 1144bpの遺好断片 力 曽幅されることにより、 前記遺伝子の導入が確認される。更に、導入遺好の 5'側に存在する CMV promoterに対する PCR [プライマーとして ATCA TACGGGGTCA AG (配列番号 1 3 )及び TGTACTGCCAAGTAGGMAG (配列番号 1 4 ) を使用]により 、 導入遺伝子の確認を行う。 この PCRにおいて 320bpの遺伝子断片力せ曽幅される ことで前記遺ィ 5?の導入が確認される。 以下に本明細書で使用して 、る DNA塩基配列につ 、て説明及び開示する。
(1) my c- tag (細胞の中でタンパク質として作ら k myc に対する抗体でも検 出できるようにするための配列で開始コドンを含む）
ATGGAACAGAAACTCATATCGGAGGAGGATCTA 〔配列番号： 7〕
(2) 野^の p30 の塩基配列 （上言 Smyc- tagをつける： ^は、 開始コドン ATG と 入れ替える）
ATGACCGTGG ACAGCAGCAT GAGCAGTGGG TACTGCAGCC TGGACGAGGA ACTGGAAGAC TGCTTCTTCA CTGCTAAGAC TACCTTTTTC AGAAATGCGC AGAGCAAACA TCTTTCMAG AATGTCTGTA AACCTGTGGA GGAAACACAG CGCCCGCCCA CACTGCAGGA GATCAAGCAG AAGATCGACA GCTACAACAC GCGAGAGAAG MCTGCCTGG GCATGAMCT GAGTGAAGAC GGCACCTACA CGGGT TCAT CAAAGTGCAT CTGAAACTCC GGCGGCCTGT GACGGTGCCT GCTGGGATCC GGCCCCAGTC CATCTATGAT GCCATCAAGG AGGTGAACCT GGCGGCTACC ACGGACAAGC GGACATCCH CTACCTGCCC CTAGATGCCA TCAAGCAGCT GCACATCAGC AGCACCACCA CCGTCAGTGA GGTCATCCAG GGGCTGCTCA AGMGTTCAT GGTTGTGGAC AATCCCCAGA AGTTTGCACT TTTTAAGCGG ATACACAAGG ACGGACAAGT GCTCTTCCAG AAACTCTCCA HGCTGACCG CCCCCTCTAC CTGCGCCTGC HGCTGGGCC TGACACGGAG GTCCTCAGCT HGTGCTAM GGAGMTGAA ACTGGAGAGG TAGAGTGGGA TGCCTTCTCC ATCCCTGAAC TTCAGMCTT CCTAACAATC CTGGAAA G AGGAGCAGGA CAAMTCC CAAGTGCAAA AGMGTATGA CAAGTTTAGG CAGAMCTGG AGGAGGCCTT MGAGAATCC CAGGGCAAAC CTGGGTAA 〔配列番号: 3〕
(3) p30 の優勢抑制型 ( 末 101番目ァラニンの前に開始コドン。 ただし、 図 6 Cでィ されている deltaNp30 には前言 Bmyc- tag力ついており、 開始コドンと入 れ替つている）
ATGGCTGGGATCC GGCCCCAGTC CATCTATGAT GCCATCAAGG AGGTGAACCT GGCGGCTACC ACGGACAAGC GGACATCCH CTACCTGCCC CTAGATGCCA TCAAGCAGCT GCACATCAGC AGCACCACCA CCGTCAGTGA GGTCATCCAG GGGCTGCTCA AGAAGHCAT GGHGTGGAC AATCCCCAGA AGTTTGCACT TTTTMGCGG ATACACAAGG ACGGACAAGT GCTCTTCCAG AMCTCTCCA HGCTGACCG CCCCCTCTAC CTGCGCCTGC GCTGGGCC TGACACGGAG GTCCTCAGCT HGTGCTAAA GGAGAATGAA ACTGGAGAGG TAGAGTGGGA TGCCTTCTCC ATCCCTGMC TTCAGMCTT CCTAACAATC CTGGAAAAAG AGGAGCAGGA CAAAATCCAA CAAGTGCAAA AGMGTATGA CAAGTTTAGG CAGAAACTGG AGGAGGCCH AAGAGMTCC CAGGGCAAAC CTGGGTM C配列番号: 5に対応〕 産社の利用可能性
本発明は、 p30- Rapl間の相互作用により細胞の活性化及び lt¾伝達制御がなさ れているとの知見を利用する技術を提供している。本技術を利用すれば、 p30-Ra Pi間の結合を阻害する化合物などの p30- Rapl間の相互作用制御物質をスクリ一二 ングしたり、 それに利用される簾なども開発でき、 さらに同定された阻害剤な どの p30- Rapl結合制御剤は医薬として期待でき、 抗炎症薬、 免疫抑制剤、 移植免 疫抑制剤、 抗癌剤などとして利用できる。 さらに、 改変 P30関連ペプチドや核酸 、 さらには抗 p30抗体などは、 例えば細胞内で優勢抑制型に機能するもの、 30- Rapl間結合阻害の働きをもつものなどその有用性が高い。本技術 ·知識を利用し て生 ί«能麟斤のための ¾、 了ッセィ法なども開発可能である。
本発明は、 前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、 実行できることは明 らカヽである。上述の教示に鑑みて、 本発明の多くの改^ ¾び変形が可能であり、 従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【酉 表フリーテキスト】
SEQ ID NO: 1, Human Rapl
SEQ ID NO: 3, Human RAPL (or Human p30)
SEQ ID NO: 5， Dominant-Negative Human RAPL
SEQ ID NO: 7, Nucleotide Sequence for Myc-tag
SEQ ID NO: 8， Peptide Sequence for Myc-tag
SEQ ID NO: 9， House Mouse RAPL (Region 104 to 901 of mRNA)
SEQ ID NO: 11, Description of Artif icial Sequence: Ol igonucleotide to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 12, Description of Artif icial Sequence: Ol igonucleotide to ac t as a primer for PCR
SBQ ID NO: 13， Description of Artificial Sequence: Ol igonucleotide to ac t as a primer for PCR
SEQ ID NO: 14, Description of Artif icial Sequence: Ol igonucleotide to ac t as a primer for PCR

Claims

請 求 の 範 囲
1 . (1) (a) 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有する活性型のポリぺプチド、 その部分べプチドまたは その塩、 及び、 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列の 12番目のグリシン力くバリン であるァミノ酸配列もしくは該点変異したァミノ酸酸配列と実質的に同一のァミ ノ酸配列を含有する活' βのポリぺプチドからなる群から選択される一つのポリ ぺプチド、 （b)配列番号: 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩 からなる群から選択される一つのポリべプチド、 及び (c)試験試料とを接触させ る工程、
(2)前記 (a)群から選択される一つのポリぺプチドと前記 (b)群から選択さ れる一つのポリぺプチドとの相互作用及び Zまたは結合の形成を検出する工程 を含む、 Raplと P30との相互作用及び/または結合を促進ある 、は阻害する ィ匕合物またはその塩のスクリーニング方法。
2. (1) (a) 群から選択される一つのポリペプチド、 （b)群から選択され る一つのポリぺプチド及び試験試料とを接触させる工程、
(2) (a)群から選択される一つのポリぺプチドと（b)群から選択される一つ のポリぺプチドとの相互作用及び Zまたは結合の形成を検出する工程、
(3) これらのポリぺプチドの相互作用及び/または結合を促進あるいは阻害 する化合物を選択する工程
を含む請求項 1に記載のスクリ一ニング方法。
3. (a)群から選択される一つのポリぺプチド及び/または )群から選 択される一つのポリぺプチドが、 他のぺプチドと融合している請求項 1または 2 に記載のスクリーニング方法。
4. (a)群から選択される一つのポリべプチド及ぴンまたは (b)群から選 択される一つのポリべプチドが標識さ; T 該標識を検出または測定することによ り該ポリぺプチドの結合の形成及び Zまたは相互作用を検出する請求項 1〜 3の いずれか一に記載のスクリ一ニング方法。
5. (a)群から選択される一つのポリべプチドに結合した (b)群から選択 される一つのポリぺプチドを該 (b)群のポリぺプチドに対する一次抗体または該 (b)のポリべプチドと融合した他のぺプチドに対する一次抗体を用いて検出また は測定することにより、 これらのポリべプチドの相互作用及び/または結合の形 成を検出する請求項 1〜 3の 、ずれか一に記載のスクリ一二ング方法。
6. (b)群から選択される一つのポリベプチドに結合した (a)群から選択 される一つのポリぺプチドを該 (a)群のポリぺプチドに対する一次抗体または該
(a)のポリべプチドと融合した他のぺプチドに対する一次抗体を用いて検出また は測定することにより、 これらのポリぺプチドの結合の形] «び/または相互作 用を検出する請求項 1〜 3のレ、ずれか一に記載のスクリ一ニング方法。
7. (a)群から選択される一つのポリべプチドに結合した )群から選択 される一つのポリぺプチドを該 (b)群のポリぺプチドに対する一次抗体または該
(b)のポリべプチドと融合した他のぺプチドに対する一次抗体及び該一次抗体に 対する二次抗体を用いて検出または測定することにより、 これらのポリペプチド の結合の形成及び/または相互作用を検出する請求項 1〜 3のいずれか一に記載 のスクリーニング方法。
8. (a)群のポリぺプチドが、 配列番号: 2で表されるァミノ酸配列を有す るポリぺプチドの N-末端側にグルタチオン- S-トランスフヱラ一ゼを融合させた ポリぺプチドもしくは配列番号: 2で表されるァミノ酸配列の 12番目のグリシンが バリンであるアミノ酸配列を有するポリべプチドの N-末端側にグノレタチオン - S- トランスフヱラ一ゼを融合させたポリぺプチドの活 ポリぺプチドまたはその 塩のいずれかであり、 （b)群のポリペプチドが、 配列番号: 4で表されるアミノ酸 配列を有するポリぺプチドの N-末端側に Mycェピト一プを融合させたポリぺプチ ドまたはその塩である請求項 1〜 3のいずれか一に記載のスクリ一ニング方法。
9. (a) 配列番号: 2で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸酉 を含有するポリぺプチド、 その部分べプチドまたはその塩、 及び 、 配列番号: 2で表されるァミノ酸配列の 12番目のグリシンがバリンであるァミノ 酸配列もしくは該点変異したァミノ酸酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含 有するポリべプチドからなる群から選択される一つのポリべプチドと（b) 配列番 号: 4で表されるァミノ酸配列と同一もしくほ実質的に同一のァミノ酸配列を含有 するポリべプチドもしくはその部分べプチドまたはその塩からなる群から選択さ れる一つのポリぺプチドとを含有してなる、 Raplと p30との相互作用及び/また は結合を促進あるいは阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニング用キット。
10. (a)群カヽら選択される一つのポリぺプチド及び/または (b)群から選 択される一つのポリぺプチドが、 他のぺプチドと融合している請求項 9に記載の スクリ一ニング用キット。
11. (a)群から選択される一つのポリぺプチド及び/または (b)群から選 択される一つのポリべプチドが標識されている請求項 9に記載のスクリーニング 用キット。
12. (a)群のポリぺプチドが、 配列番号: 2で表されるァミノ酸配列を有す るポリぺプチドの N-末端側にグルタチォン- S-トランスフェラ一ゼを融合させた ポリベプチドもしくは配列番号: 2で表されるァミノ酸配列の 12番目のグリシンが ノ リンであるァミノ酸配列を有するポリぺプチドの N -末端側にグノレ夕チォン - S- トランスフヱラーゼを融合させたポリぺプチドまたはその塩のいずれかであり、 )群のポリぺプチドが、 配列番号： 4で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプ チドの N-末端側に Mycェピトープを融合させたポリベプチドまたはその塩である 請求項 9に記載のスクリ一ニング用キット。
13. 請求項 1に記載のスクリ—ニング方法または請求項 9に記載のスクリ —ニング用キッ 卜を用いて得られる Raplと p30との相互作用及び Zまたは結合を 促進あるいは阻害する化合物またはその塩。
14. Raplと p30との相互作用及び/または結合を阻害する請求項 13に記載 の化合物またはその塩。
15. 請求項 13に記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物。
16. 請求項 14に記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物。
17. 治療または予防の対象が、
(a) 炎症疾患
(b) 免藤患 (C) 臓器移植時の拒絶反応、 及び
(d) 癌
からなる群カヽら選択されるものである請求項 15または 16に記載の医薬組成物。
18. 配列番号: 4で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリべプチドを認、識するモノクローナル抗体。
19. 請求項 18に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする診断 方法。
20. 請求項 18に記載のモノクロ一ナル抗体を含有する診断用キット。
21. 配列番号： 4で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドに対して細胞内で優性抑制型に機能するポリ ぺプチドまたはその塩。
22. 請求項 21に記載のポリぺプチドまたはその塩を含有する、
(a) 炎症疾患
(b) 免疫疾患
(c) 臓器移植時の拒絶反応、 及び
(d) 癌
力ヽらなる群力、ら選択されるものを治療または予防するための組成物。
23. 請求項 21に記載のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド。
24. 請求項 23に記載のポリヌクレオチドを含有する、
(a) 炎症疾患
(b) 免疫疾患
(c) 臓器移植時の拒絶反応、 及び
(d) 癌
からなる群から選ばれたのものを治療または予防するための組成物。
25. 配列番号: 10で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリぺプチドの発現が調節されたトランスジヱニック動 物。
26. 配列番号: 10で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリぺプチドの発現が ii¾となる請求項 25に記載のトラ ンスジヱニック動物。
27. トランスジェニック動物がマウスである請求項 25または 26に記載のト ランスジエニック動物。
28. 式 （ I )
Figure imgf000106_0001
〔式中、 Xが— CW' R1基又は— C (-W1) W2 R2基であり、 R1がアル キノレ基、 ハロアルキノレ基、 アルコキシカルボニルアルキノレ基、 アルケニノレ基、 ハ ロアルケニル基、 チェニル基で置換されたアルケニル基、 シクロアルキル基、 口ゲン原子で置換されたシクロアルキル基、 フヱニル基、 ハロゲン原子で置換さ れたフェニル基、 アルキル S¾しくはハロアルキル基で置換されたフェニル基、 アルコキシ S¾しくは アルコキシ基で置換されたフエニル基、 テトラヒドロ ナフチル基、 インダニル基、 フラニル基又はチェニル基であり、 R2がアルキル 基又はハロアルキル基であり、 w1及 mv2はそれぞ 虫立して、 酸素原子又は 硫黄原子であり、 Yが— S 02R9基であり、 R 9がアルキル基、 口アルキル 基、 フエニル基、 ハロゲン原子で置換されたフェニル基、 アルキル基若しくはハ 口アルキル基で置換されたフェニル基又はアルコキシ¾^しくは アルコキシ 基で置換されたフェニル基である〕 で表される化合物又はその塩を有効成分とす ることを特徴とする Raplと p30の結合阻豁 ij
29. 請求項 28において、 Xがアルコキシカルボニルアルキルカルボニル基 、 アルケニルカルボニル基、 チェニル基で置換されたアルケニルカルボニル基、 シクロアルキル力ルボニル基、 ィンダニルカルボニル基、 フランカルボニル基、 チオフヱンカルボ二ノレ基、 テトラヒドロナフチルカルボニル基又はハロゲン原子 若しくはハロアルキル基で置換されてもよいべンゾィノレ基であり、 Yがアルキル スルホニル基であることを樹敫とする請求項 28に記載の Raplと p30との結合阻害 剤。
30. 請求項 28において、 Xがシクロアルキルカルボニル基、 フランカルボ ニル基又はノヽ口ゲンで置換されてもよいベンゾィル基であり、 Yがアルキルスル ホニル基であることを特徽とする請求項 28に記載の Raplと p30との結合阻害剤。
31. 請求項 28において化合物力く、 N- ( 2—ェチルスルホニルアミノー 5 一トリフルォロメチルー 3—ピリジノレ） シクロへキサンカルボキサミ ド、 N— ( 2—メチルスルホニルァミノ一 5—トリフノレオロメチルー 3—ピリジノレ） 一 4— フルォ口べンズァミ ド、 N— ( 2—ィソプロピルスルホニルァミノー 5—トリフ ルォロメチルー 3—ピリジル） 一 3—フルォロベンズアミ ド、 N— （2—メチル スノレホニルァミノー 5—トリフルォロメチルー 3—ピリジノレ） 一 2—フランカル ボキサミ ド又は N— （ 2—イソプロピルスルホニルァミノー 5—トリフルォロメ チル一 3—ピリジル）シクロペンタンカルボキサミ ドからなる群から選ばれたも のであることを特徵とする請求項 28に記載の Raplと p30との結合阻害剤。
32. N- ( 2—ェチルスルホニルァミノー 5—トリフルォロメチルー 3一 ピリジル） シクロへキサンカルボキサミ ドまたはその塩が有効成分であることを 特徴とする Raplと p30とめ結合阻割 ij。
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