JPH0284181A - 癌抑制遺伝子、その単離法、それがコードするペプチド、及び抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、癌抑制遺伝子、その単離法、それがコードす
るペプチド及びそのペプチドに対する抗体に関する。

〔発明の背景〕

癌がある種の細胞機能の欠損によって起こるらしいとい
うことは古くから知られている。例えば癌細胞と正常細
胞を融合させると、癌としての性質が消えることがしば
しば観察される。また、遺伝性の癌においては、特定の
遺伝子の欠落が原因となっているものが知られている。

つまり、正常細胞の中には、癌の性質を抑える遺伝子（
「癌抑制遺伝子」）が存在し、その“不活性化″が発癌
に結びつくと考えられる。

一方、１９８０年代前半に発見されはじめ、現在も活発
に研究が進められているいわゆる「癌遺伝子」は、これ
らとは逆に“活性化”した時に細胞に癌の性質を与える
ものであるが、上述のような情況証拠から、これらの遺
伝子だけでは癌を説明しつくすことはできないという事
が分かる。しかし、「癌抑制遺伝子」の実体については
、主に技術的な困難さ一活発に増えている細胞集団の中
から増え方の遅いまれな細胞を取り出すことの困難さ−
からその解明が遅れており、これまでにわずか２〜３の
候補が単離されているに過ぎない。

本発明者は、癌遺伝子の１つ“ｒａｓ”を与えると、著
しい形態変化を起こし、完全に癌化（トランスフォーム
）してしまうＮＩＨ／３Ｔ３というマウス細胞を材料と
して用い、この癌化細胞にＤＮＡ感染法（トランスフェ
クション）で遺伝子を導入した時に、形態の正常化した
細胞（フラット・リバータント）が出現するかどうか（
第１図）という検出法により、癌抑制作用を持つような
遺伝子の探索を試みた（第２図）。

その結果、ヒ）［ｋ芽細胞の中で働いている全遺伝子の
中から、癌抑制作用を持つ一つの新しい遺伝子（Ｋｒｅ
ｖ　−１）を単離することに成功し、本発明を完成する
に至ったものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の第１の目的は、癌抑制遺伝子およびその単離法
を提供することである。

本発明の第２の目的は、癌抑制遺伝子がコードするペプ
チドを提供することである。

本発明の第３の目的は、癌抑制遺伝子がコードするペプ
チドに対する抗体を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の癌抑制遺伝子は、下記のアミノ酸配列（Ｉ）〜
（ＸＩＩ）から成る群から選ばれるアミノ酸配列で表さ
れるペプチドをコードする遺伝子である。

ＫＹＤＰＴＩＥＤＳＹ ＲＫＱＶＥＶＤＣＯＱ Ｃ）札ＥＩＬＤＴＡＧ リジン アスパラギン酸 グリシン システィン チロシン アラニン イソロイシン メチオニン アルギニン グルタミン酸 アスパラギン セリン Ｖ：　バリン Ｐ；　プロリン Ｗ：　トリプトファン Ｈ： ヒスチジン Ｑ：　グルタミン Ｔ：　スレオニン （Ｘ■）７ミ／酸配列（Ｉ）　！、：オイｒＧ１２、Ｑ
　＋　３、Ａ　Ｓ　９またはＴ”を任意のアミノ酸（以
下に示す２０種類のアミノ酸）と置換したもの。

本願明細書中、アミノ酸は以下の略記号を用いて表示す
る。

ロイシン フェニルアラニン 本発明は、また、上記アミノ酸配列（Ｉ）〜（ＸＩ［）
から成る群から選ばれるアミノ酸配列で表わされるペプ
チド、およびこのペプチドに対する抗体を提供するもの
である。

上記アミノ酸配列（Ｉ）〜（ＸＩ［）で表されるペプチ
ドをコードする癌抑制遺伝子は、たとえば次の工程Ａ〜
Ｄを含む方法により単離することができる。

Ａ、腫瘍細胞又はトランスフォーム細胞に動物細胞選択
マーカーを持ったｃＤＮＡ発現ライブラＩＪ−ＤＮＡ７
’ラスミドヲトランスフエクシヨン又はそれに準ずる方
法により導入する工程。

Ｂ、　選択マーカーを用いて、ｃＤＮＡプラスミドを取
込んだ細胞を選別する工程。

欧　腫瘍細胞としての性質の失われた細胞クローンを単
離する工程。

Ｄ、　工程Ｃで得られた細胞より、ｃＤＮＡを抽出し、
これを含むプラスミドを構築し、このプラスミドを大腸
菌体内に導入してクローニングし、癌抑制活性を有する
クローンを選別する工程。

上記工程は、ＡＳＢ、ＣＳＤの順、またはＡ１Ｃ５ＢＳ
Ｄの順に行われる。

工程Ｃの、腫瘍細胞としての性質が失われた細胞クロー
ンを単離する方法としては、たとえば次のような方法が
ある。

（イ）培養器壁（プラスチック！りへの付着性の増加し
たものを選ぶ。

（０）低濃度血清下で、細胞傷害性薬剤（たとえば、ブ
ロモデオキシウリジン、フロロデオキシウリジン、コル
ヒチン等）を作用させる。

（ハ）浮遊培養下で、上記の薬剤を作用させる。

（ニ）腫瘍細胞を選択的に凝集させるレクチン（たとえ
ば、コンカナバリンＡ）を作用させる。

（ネ）グルタミン類似体くたとえばＤＯＮ　（６−ジア
シー５−オキソノルロイシン））を作用させる。

（へ）温熱処理をする。

（）））！Ｊプシン等の蛋白分解酵素にて長時間処理す
る。

（チ）ウアバインで処理する。

上記方法のうち（イ）が最も好ましい。

ペプチド（１）　は、活性化ｒａｓ遺伝子により癌化し
た細胞の悪性な形質を抑制する遺伝子の産物として本発
明者が同定したものである。この蛋白はｒａｓ蛋白と部
分的に相同性を持つため、その類似性が癌抑制効果に寄
与していると考えられる。

ペプチド（Ｉ［Ｉ）、（■）は、ｒａｓ蛋白においてＧ
ＴＰのリン酸基と、ペプチド（ＶＩ）、（■）、（ＩＸ
）はｒａｓ蛋白においてＧＴＰのグアニンと、ペプチド
（Ｖ）はｒａｓ蛋白において標的蛋白と結合する部位に
それぞれ相当する。ペプチド（ＶＩ）、（Ｘ）は、ｒａ
ｓ蛋白において蛋白の活性化に関係し、ペプチド（ＸＩ
）は、このペプチド（Ｉ）　において、ｒａｓ蛋白と比
べ最も違いの大きい部分である。

従って、これらのペプチド断片は、それぞれペプチド（
１）全体の持つ癌抑制活性の一部又は全部を担っている
可能性が有る。こうした、ペプチドは、合成することも
可能であるが、ＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術により
生産することもできる。また、これらのペプチドに対す
る抗体は、診断や、類似の癌抑制蛋白の発現に有用であ
ると予想される。

本発明の癌抑制遺伝子Ｋｒｅｖ　−１のＤＮＡ配列を第
７図に示す。

この癌抑制遺伝子）（ｒｅｖ−１について、以下、実施
例を示し更に詳細に説明する。

実施例１ 癌抑制遺伝子（Ｋ匹−１）の単離 （１）フラット・リバータントの取得 動物細胞用選択マーカーを含むｐＣＤ２ベクター系（文
献１）を用いて常法どおり作製したヒト正常線維芽細胞
ｃＤＮＡ発現ライブラリーＤＮＡプラスミドを５μｇ／
１０６細胞の比率で、カーステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）マ
ウス肉腫ウィルスでトランスフォームしたＮＩＨ／３Ｔ
３細胞（第１図（ａ）参照）にリン酸カルシウムによる
トランスフェクション法（文献２）にて導入した。

この細胞を、約１週間、１　ｍｇ／　ｍ１！のＧ４１８
（ゲンタマイシン）ヲ含ムタルベツコＭＥＭ培養液（１
０％仔牛血清を含む）中で培養し、ＤＮＡプラスミドを
取込んだ細胞を選択した。その後プラスチック製ペトリ
皿の底面に付着性の強くなった細胞を選別するために、
培養液をピペットにて、細胞コロニーにふきつけ、容易
に底面より脱離するものを生理食塩水又は培養液で数回
ベトリ皿で洗う事によって除去し１．上記０４１８を含
む培養液中にてさらに３日間培養を続けた。

上記処理後にミ生育してきたコロニーを顕微鏡下で観察
し、形態的に正常に近くなった（扁平で付着性の強くな
った）細胞のコロニーをクローニング・シリンダーにて
単離した。その後、数回の再クローニングを繰返し、純
粋な単一クローン細■包、すなわちフラット・リバーラ
ントＲ１６株（第１図ら）参照）を得た。

（２）フラット・リバーラントＲ１６株からのｃＤＮＡ
の回収 フラット・リバーラントＲ１６株より、常法（文献３）
に従って全Ｄ　Ｎ　Ａを抽出し、制限酵素Ｓａｌ　　Ｉ
によって完全に切断し、０．５〜２μｇ１５００μｌの
Ｄ　Ｎ　Ａ濃度において、リガーゼ処理する事により、
ＤＮＡ断片を環状化させた。

このＤＮＡプラスミド混合物を、大腸菌（ＡＧ−１株）
　（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）にハナハン（Ｈａｎａｈ
ａｎ）の方法（文献４）に従ってトランスフォームし、
１００μｇ／ｍｌアンピシリンに耐性な大腸菌クローン
を選択した。これらのクローン中より、カナマイシン（
１２，５μｇ　／ｍり耐性のクローンをさらに選び（８
クローン）、それらの大腸菌クローンよりプラスミドＤ
ＮＡを常法（アルカリ法、文献３）により抽出した。プ
ラスミドＤＮＡは種々の制限酵素による切断地図を作る
事により各クローン間の大まかな構造の異同を検討し、
代表的な６クローンについて以下の活性検定を行った。

その結果、これらのうちの１つのクローンが腫瘍細胞を
フラット・リバータントにする能力を有することを見出
した。このプラスミドをｐＫｒｅｖ−１と命名した。こ
れを含有する大腸菌ＡＧ−１＜ｐＫｒｅｖ−１）は昭和
６３年９月２０日工業技術院微生物工業技術研究所にＡ
Ｇ−１（ｐＫｒｅｖ−１）として寄託され、その微生物
受託番号は微工菌寄第１０２８９号（ＦＥＲＭＰ−１０
２８９）である。

上記工程（１）、（２）の概略を第２図に示す。

（３）活性検定 カーステン肉腫ウィルス・トランスフォームＮＩＨ／３
Ｔ３細胞（ＤＴ株）５Ｘ１０’をコラーゲン・コートし
た６０ｍｍペトリ皿にプレートシ、翌日、５μｇの各プ
ラスミド・クローンＤＮＡをリン酸カルシウム法（文献
２）にて、トランスフェクトする。１６〜２４時間後に
、２５％グリセロールを含む培養液で１゛分間、細胞を
処理し、さらに約２４時間培養を続ける。

この後、細胞をトリプシン処理により、ペトリ皿より、
はがし１　ｍｇ／　ｍ１０４１８を含む培養液１５−を
含む１００叩ぺ）　ＩＪ皿にプレートしなおす。

約２４時間後、及び３〜４日後に同じ組成の培地で大検
えをし、その後毎日細胞コロニーの形態を観察する。

ｐＫｒｅｖ−１プラスミドでトランスフェクトしたもの
の場合、全コロニーの４〜１０％が、扁平な形態を示し
、他のコロニーも増殖がやや遅く、皿の底面への付着性
が、コントロールに比べ一般に増していた。

扁平なコロニーをクローン化し、その性質を調べると、
正常な細胞の性質に近くなっており、Ｋｒｅｖ　−１遺
伝子の発現量も高い事が見出された（表１、第３図参照
）。

表１　トランスフェクト細胞の生育特性ＮＩＨｎｅ。

ＤＴｎｅ。

ｐＫｒｅｖ　Ｉ Ｉ Ｉ Ｔ／Ｆｌ 扁平　１９ 癌化　１０ 扁平　２３ によりトランスフ 扁平　１８ 扁平　１７ 癌化　１５ 癌化　１５ 一部扁平　　１６ ０．５ ？２　　　　　１０−３０ ０．９　　　　４−１０ エクトしたちの ５．４　　　　４−１０ ４．８　　　　４−１０ １７．３　　　　６−８ １５．８　　　　５−１０ ５゜８　　　７−９ ＊増殖能を有する細胞の数に対する軟寒天培地中のコロ
ニーの数の比率 木＊１個の細胞（はぼ球形）の直径を１単位としたとき
のコロニーの直径の大きさ トランスフォーム（癌化）した細胞（ＤＴｎｅｏ”）は
、増殖速度が速く　（倍化時間（１０時間）が短い）、
軟寒天培地中でコロニー形成能を持っている（７２％）
。これに対してフラット・リバータフトＲ１６株は、正
常細胞（Ｎ　Ｉ　Ｈｎｅｏ”）と同様に、増殖速度は遅
く（倍化時間２３時間）、軟寒天培地中でコロニーは、
はとんど形成しない（０，９％）。Ｆ１〜Ｔ／Ｆ１は、
Ｋｒｅｖ　−ＩＣＤＮＡをＤＴ細胞にトランスフェクト
して得られた細胞クローンであるが、形態が正常に近い
もの（Ｆｌ、Ｆ２）では、トランスフォーム細胞（ＤＴ
細胞）の性質が著しく抑制されている。この実験は２回
繰り返したが、同様の結果が得られた。なおＮＩＨ／３
Ｔ３、ＤＴ細胞のいずれにもｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８耐
性遺伝子）を導入し、それぞれＮ　Ｉ　Ｈｎｅｏ”５Ｄ
ＴｎｅｏＲとしてコントロールとした。

第３図は、表１で述べたＫｒｅｖ　−１）ランスフェク
ト細胞りローン内での）（ｒｅｖ　−１遺伝子のコピー
数（左パネル）及びｍＲＮＡ！（中央パネル）を調べた
結果を示したものである。右パネルは、実験に用いた全
ＲＮＡ量が一定である事を示すコントロール実験である
。表１の結果と合わせると癌形質の抑制とＫｒｅｖ　−
１遺伝子の発現との間に相関性がある事が判る。

すなわち、Ａは、各細胞のＤＮＡ２０μｇを、制限酵素
ＢａｎＨＩで切断し、０．６％アガロース電気泳劾後、
ＤＮＡを変性させ、ニトロセルロース膜に吸着させ、３
２ｐでラベルした）（ｒｅｖ　−１ｃＤＮＡと常法（文
献３）に従ってハイブリダイズ（２本鎖形成）し、その
後、Ｘ線フィルムに感光させたものである。またＢは、
各細胞の全ＲＮＡｌ０μｇを、ホルムアルデヒドを含む
アガロースゲル（文献３）で電気泳動した後、ニトロセ
ルロースにＲＮＡを吸着させ、Ａと同様の処理をしたも
のである。β−ＡＣＴＩＮは、電気泳動に使ったＲＮＡ
の量及び質をチエツクするために、そのコントロールと
して上で使ったニトロセルロース膜を洗浄後、再び３２
ｐでラベルしたβ−ＡＣＴＩＮ　　ｃＤＮＡとハイブリ
ダイズさせたものである。

（４）構造決定 Ｋｒｅｖ　−１ｃ　ＤＮＡを、Ｂｌｕｅｓｃｒｔｐｔベ
クター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、ＴＯＹＯＢＯ：］−
ド番号２１２２０１〜２１２２０４）にサブ・クローニ
ングし、常法に従って塩基配列を決定した（Ｓｔｒａｔ
ｅｇｅｎｅ社、カタログ参照）。この塩基配列を第７図
に示す。反応は５ｅｑｕｅｎａｓｅ　（Ｕ　Ｓ　８社）
を用いて行った。

Ｋｒｅｖ　−１ｃＤＮＡには唯一の、長いオーブン・リ
ーディング・フレームが有り、そのアミノ酸配列と、ｃ
−Ｈａ−ｒａｓｌ蛋白のアミノ酸配列とを比較して第４
図に示した。

実施例２ Ｋｒｅｖ−１蛋白（ペプチド（Ｉ））の大腸菌を用いた
発現 ｐＡＲ２１０６ベクターにＫｒｅｖ　−１ｃＤＮＡのＲ
ｓａ　Ｉ　−Ｒｓａ　Ｉ断片（１，２５Ｋｂ）　　（第
７図の矢印で示す）を組込み、大腸菌ＢＬ２１株内でＩ
ＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド）処理により、発現させた（文献５）。プラスミド
の構築の際、天然Ｋｒｅｖ　−１蛋白の内Ｎ−末端の４
個のアミノ酸が失なわれ、その代りに１４個の新たなア
ミノ酸が加わるような構造の遺伝子に改変されたく第５
図参照）。

実施例３ Ｋｒｅシー１蛋白に対する抗体 Ｋｒｅｖ　−１蛋白アミノ酸配列（第４図）の内、Ｃ末
端より１６個のアミノ酸（Ｔｌｌｉ９〜Ｌ”’）に対応
するオリゴペプチドを常法により合成し、（アプライド
・バイオシステム社製ペプチド合成機使用）、ヘモシア
ニンを担体として、ウサギに免疫し、抗血清を得た。こ
の抗血清は、ウェスタン・ブ０−／ト（Ｗｅｓｔｅｒｎ
　ｂｌｏｔ）分析法にて、Ｋ　ｒｅｖ−１ｃＤＮＡの構
造から予想される分子量（約２１．０００）の蛋白を検
出できる（第６図）。

三角印のバンドがペプチドによる吸収や、抗血清の希釈
によって、消える事から、この抗体はＫｒｅｖ　−１蛋
白に特異的な反応性を持つ事が判る。

文献 １）　Ｃ，Ｃｈｅｎ　＆　ＨｏＯｋａｙａｍａ　：　Ｍ
ｏｌ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７　。

２７４５−２７５２．１９８７゜ ２）　Ｍ、　Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　：　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、５ｃｉＵＳＡ　７６、１
３７３−１３７６、１９７９゜３）　Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　　：　ｉｎ　！Ｊｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　Ｃｏ１
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、）、　１９
ｇ２゜４）　Ｄ、　Ｈａｎａｈａｎ　：　ＪｏＭｏｌ、
　Ｂｉｏｌ、１６６　、５５７−５８０゜１９８３゜ ５）　Ｆ、Ｗ、　５ｔｕｄｉｅｒ　＆　Ｂ、　Ａ、　Ｍ
ｏｆｆａｔｔ　：　Ｊ、　！、（ｏｌ。

Ｂｉｏｌ、１８９．１１３−１３０．１９８６゜６）　
Ｗ、Ｎ、　Ｂｕｒｎｅｔｔｅ　：　Ａｎｎ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、１１２．１９５−２０３、１９８１゜ 〔発明の効果・有用性〕 本発明の癌抑制遺伝子は、腫瘍細胞を正常細胞に復帰さ
せる能力がある。また、）（ｒｅｖ　−１遺伝子の作る
蛋白質には、癌遺伝子ｒａｓの作る蛋白質と構造上一部
似た部分があり、進化共通の祖先から由来したものであ
る可能性が示されたく第４図）つまり、「癌抑制遺伝子
」のうちの少なくとも−部は、癌遺伝子と良く似たもの
であることがはじめて示唆されたので、癌化の分子機構
を解明する上で重要な知見と考えられる。また、本発明
の癌抑制遺伝子の単離法は今後さらに別の「がん抑制遺
伝子」の単離にも適用することができる。

本発明のペプチド（Ｉ）は正常細胞内に存在する蛋白で
あるが、癌細胞中では量的又は質的に変化している可能
性が有る。従って、そうした変化を調べるための試薬と
して、ペプチド（Ｉ）〜（ＸＩ）に対する抗体は有用で
あると予想される。また、これらの抗体を用いて、さら
に新しい関連癌抑制蛋白を見出せる可能性が有る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ａ）とフラット・リバ
ータントラ）を示す写真である。 第２図は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーのトランスフェク
ションによるフラット・リバータントの単離法の概略を
示す図面である。 第３図は、）（ｒｅｖ　−１）ランスフエクト細胞りロ
ーン内でのＫｒｅｖ−１遺伝子のコピー数（左パネル）
及びｍＲＮＡ量（中央パネル）を調べた結果を示す電気
泳動図である。 第４図は、Ｋｒｅｖ　−１蛋白（ペプチド（Ｉ））とｃ
−Ｈａ−ｒａｓｌ蛋白のアミノ酸配列を比較して示すも
のである。Ｋｒｅｖ　−１蛋白のアミノ酸配列中の（−
）は、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ１蛋白のアミノ酸と同一である
ことを示す。 第５図は、大腸菌体内で発現させるために修飾されたＫ
ｒｅｖ　−１蛋白のＮ−末端のアミノ酸配列を示すもの
である。 第６図は、Ｋｒｅｖ　−１蛋白のＣ−末端１６個の合成
オリゴペプチドに対する抗血清の反応性を示す電気泳動
図である。 第７図はＫｒｅｖ　−１遺伝子のＤＮＡ配列を示す図面
である。矢印はＲｓａｉによる切断部位を示す。 ７面の浄書（内容に変更なし） 第１図 （ｂ） 第２図 ＮＬＨ／３７３細胞 トランスフォーム細胞 フラット・リバータント ｃＤＮＡの回収 （″−″′″Ｎ虜讐訂肯蒜：＊７９つ 正常後Ｉｌ！ｌｌｌ１ｌＫ（フラット・リパータント）
１′″−）へ′：　　　　Ａ　　Ｃ）でＯ〜　　　ア０
Ｃ４）　　　　ぐρ　（刀Δ　ω　　σ第 図 ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤｆｌＫＬＶＶＶＧ−−−一
　組換え　Ｋｒｅｖ−１蛋白ＭＴＢＹＫＬＶＶＶＧ−−
−−天　　然　Ｋｒｅｖ−１蛋白第 ｃ−Ｈａ−ｒａｓｌ Ｋｒ＋ぴ−１ ■ ＭＴＢＹＫＬＶＶＶＧ　　ＡＧＧＶＧＫＳＡＬＴ　　Ｉ
ＱＬＩＣＩＮｆｔＦＶＤ　　ＢＹＤＰＴＩＢＤＳＹ　　
ＲＫＱＶＶＩＤＧＢＴＲ−−−−−−Ｌ−５−−−−−
−−−−Ｖ−ＦＶ−Ｇｌ−Ｂ　Ｋ−−一−−−−−−−
−−−−ＢＶ−ＣＧＱｃ−Ｈａ−ｒａｓｌ Ｋｒｅｖ−１ ＣＬＬＤＩＬＤＴＡＧ　　ＱＢＢＹＳＡＭＲＤＱ　　Ｙ
ＭＲＴＧＢＧＦＬＣＶＦＡＩＮＮＴにＳＦ　　ＢＤＩＨ
ＱＹＲＥＯＩ−Ｍ−８−−−−−−Ｔ−ＯＦＴ−−−−
Ｌ−ＫＮ−Ｃ１−ＡＬ　　−ＹＳ−ＴＡＱＳＴ−Ｎ−Ｌ
ＱＤＬ−−−−ｃ−Ｈａ−１且ｌ Ｋｒｅｖ−１ ＫＲＶＫＤＳＤＤＶＰ　ＭＶＬＶＧＮＫＣＤＬ　ＡＡ　
ＲＴＶＢＳＲＱ　ＡＱＤＬＡＲ５Ｙ　Ｇ　ＩＰＹＩＢＴ
ＳＡＫＴし一−−−ＴＢ−−−　−Ｉ−−−−−−−−
ＢＤＢ−Ｖ−ＧＫＢ−Ｇ−Ｎ−−一〇ＷＣＮ　ＣＡＦＬ
−３−−−３ｃ−Ｈａ−ＬＬＩｌ　　　１４９　　　Ｒ
ＧＧＶＢＤＡＦＹＴ　　ＬνＲＢＩ　　ＲＱＨＫ　　Ｌ
ＲＫＬＮＰＰＤＢＳ　　ＳＧＰＧＣＭＳＣＫ　　ＣＶＬ
ＳにＵ泣−１１５１ＫＩＮ−Ｎ！ｌ！Ｉ−Ｄ−一−Ｑ−
Ｎ−にＴＰ　ＶεＫＫＫＰにＫＫＳ　　　　　　　ＣＬ
ＬＬ正常血清 ′ＩＯ ？憂、５ 種、４

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記のアミノ酸配列（ I ）〜（ＸII）から成る
   群から選ばれるアミノ酸配列で表されるペプチドをコー
   ドする癌抑制遺伝子。 （ I ）【遺伝子配列があります】 （II）【遺伝子配列があります】 （III）【遺伝子配列があります】 （IV）【遺伝子配列があります】 （Ｖ）【遺伝子配列があります】 （VI）【遺伝子配列があります】 （VII）【遺伝子配列があります】 （VIII）【遺伝子配列があります】 （IX）【遺伝子配列があります】 （Ｘ）【遺伝子配列があります】 （Ｘ I ）【遺伝子配列があります】 （ＸII）アミノ酸配列（ I ）においてＧ＾１＾２、Ｇ
   ＾１＾３、Ａ＾５＾９またはＴ＾６＾１を任意のアミノ
   酸と置換したもの。
2. （２）請求項（１）記載のアミノ酸配列（ I ）〜（Ｘ
   II）から成る群から選ばれるアミノ酸配列で表わされる
   ペプチド。
3. （３）請求項（２）記載のペプチドに対する抗体。
4. （４）下記の工程Ａ〜Ｄを、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＡ、
   Ｃ、Ｂ、Ｄの順に連結してなる請求項（１）記載の癌抑
   制遺伝子の単離法。 Ａ、腫瘍細胞又はトランスフォーム細胞に、動物細胞用
   選択マーカーを持ったｃＤＮＡ発現ライブラリーＤＮＡ
   プラスミドをトランスフェクション又はそれに準ずる方
   法により導入する工程。 Ｂ、選択マーカーを用いて、ｃＤＮＡプラスミドを取込
   んだ細胞を選別する工程。 Ｃ、腫瘍細胞としての性質が失われた細胞クローンを単
   離する工程。 Ｄ、工程Ｃで得られた細胞より、ｃＤＮＡを抽出し、こ
   れを含むプラスミドを構築し、大腸菌体内に導入してク
   ローニングし、癌抑制活性を有するクローンを選別する
   工程。