JPH0284181A - 癌抑制遺伝子、その単離法、それがコードするペプチド、及び抗体 - Google Patents
癌抑制遺伝子、その単離法、それがコードするペプチド、及び抗体Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、癌抑制遺伝子、その単離法、それがコードす
るペプチド及びそのペプチドに対する抗体に関する。
るペプチド及びそのペプチドに対する抗体に関する。
癌がある種の細胞機能の欠損によって起こるらしいとい
うことは古くから知られている。例えば癌細胞と正常細
胞を融合させると、癌としての性質が消えることがしば
しば観察される。また、遺伝性の癌においては、特定の
遺伝子の欠落が原因となっているものが知られている。
うことは古くから知られている。例えば癌細胞と正常細
胞を融合させると、癌としての性質が消えることがしば
しば観察される。また、遺伝性の癌においては、特定の
遺伝子の欠落が原因となっているものが知られている。
つまり、正常細胞の中には、癌の性質を抑える遺伝子(
「癌抑制遺伝子」)が存在し、その“不活性化″が発癌
に結びつくと考えられる。
「癌抑制遺伝子」)が存在し、その“不活性化″が発癌
に結びつくと考えられる。
一方、1980年代前半に発見されはじめ、現在も活発
に研究が進められているいわゆる「癌遺伝子」は、これ
らとは逆に“活性化”した時に細胞に癌の性質を与える
ものであるが、上述のような情況証拠から、これらの遺
伝子だけでは癌を説明しつくすことはできないという事
が分かる。しかし、「癌抑制遺伝子」の実体については
、主に技術的な困難さ一活発に増えている細胞集団の中
から増え方の遅いまれな細胞を取り出すことの困難さ−
からその解明が遅れており、これまでにわずか2〜3の
候補が単離されているに過ぎない。
に研究が進められているいわゆる「癌遺伝子」は、これ
らとは逆に“活性化”した時に細胞に癌の性質を与える
ものであるが、上述のような情況証拠から、これらの遺
伝子だけでは癌を説明しつくすことはできないという事
が分かる。しかし、「癌抑制遺伝子」の実体については
、主に技術的な困難さ一活発に増えている細胞集団の中
から増え方の遅いまれな細胞を取り出すことの困難さ−
からその解明が遅れており、これまでにわずか2〜3の
候補が単離されているに過ぎない。
本発明者は、癌遺伝子の1つ“ras”を与えると、著
しい形態変化を起こし、完全に癌化(トランスフォーム
)してしまうNIH/3T3というマウス細胞を材料と
して用い、この癌化細胞にDNA感染法(トランスフェ
クション)で遺伝子を導入した時に、形態の正常化した
細胞(フラット・リバータント)が出現するかどうか(
第1図)という検出法により、癌抑制作用を持つような
遺伝子の探索を試みた(第2図)。
しい形態変化を起こし、完全に癌化(トランスフォーム
)してしまうNIH/3T3というマウス細胞を材料と
して用い、この癌化細胞にDNA感染法(トランスフェ
クション)で遺伝子を導入した時に、形態の正常化した
細胞(フラット・リバータント)が出現するかどうか(
第1図)という検出法により、癌抑制作用を持つような
遺伝子の探索を試みた(第2図)。
その結果、ヒ)[k芽細胞の中で働いている全遺伝子の
中から、癌抑制作用を持つ一つの新しい遺伝子(Kre
v −1)を単離することに成功し、本発明を完成する
に至ったものである。
中から、癌抑制作用を持つ一つの新しい遺伝子(Kre
v −1)を単離することに成功し、本発明を完成する
に至ったものである。
本発明の第1の目的は、癌抑制遺伝子およびその単離法
を提供することである。
を提供することである。
本発明の第2の目的は、癌抑制遺伝子がコードするペプ
チドを提供することである。
チドを提供することである。
本発明の第3の目的は、癌抑制遺伝子がコードするペプ
チドに対する抗体を提供することである。
チドに対する抗体を提供することである。
本発明の癌抑制遺伝子は、下記のアミノ酸配列(I)〜
(XII)から成る群から選ばれるアミノ酸配列で表さ
れるペプチドをコードする遺伝子である。
(XII)から成る群から選ばれるアミノ酸配列で表さ
れるペプチドをコードする遺伝子である。
KYDPTIEDSY
RKQVEVDCOQ
C)札EILDTAG
リジン
アスパラギン酸
グリシン
システィン
チロシン
アラニン
イソロイシン
メチオニン
アルギニン
グルタミン酸
アスパラギン
セリン
V: バリン
P; プロリン
W: トリプトファン
H:
ヒスチジン
Q: グルタミン
T: スレオニン
(X■)7ミ/酸配列(I) !、:オイrG12、Q
+ 3、A S 9またはT”を任意のアミノ酸(以
下に示す20種類のアミノ酸)と置換したもの。
+ 3、A S 9またはT”を任意のアミノ酸(以
下に示す20種類のアミノ酸)と置換したもの。
本願明細書中、アミノ酸は以下の略記号を用いて表示す
る。
る。
ロイシン
フェニルアラニン
本発明は、また、上記アミノ酸配列(I)〜(XI[)
から成る群から選ばれるアミノ酸配列で表わされるペプ
チド、およびこのペプチドに対する抗体を提供するもの
である。
から成る群から選ばれるアミノ酸配列で表わされるペプ
チド、およびこのペプチドに対する抗体を提供するもの
である。
上記アミノ酸配列(I)〜(XI[)で表されるペプチ
ドをコードする癌抑制遺伝子は、たとえば次の工程A〜
Dを含む方法により単離することができる。
ドをコードする癌抑制遺伝子は、たとえば次の工程A〜
Dを含む方法により単離することができる。
A、腫瘍細胞又はトランスフォーム細胞に動物細胞選択
マーカーを持ったcDNA発現ライブラIJ−DNA7
’ラスミドヲトランスフエクシヨン又はそれに準ずる方
法により導入する工程。
マーカーを持ったcDNA発現ライブラIJ−DNA7
’ラスミドヲトランスフエクシヨン又はそれに準ずる方
法により導入する工程。
B、 選択マーカーを用いて、cDNAプラスミドを取
込んだ細胞を選別する工程。
込んだ細胞を選別する工程。
欧 腫瘍細胞としての性質の失われた細胞クローンを単
離する工程。
離する工程。
D、 工程Cで得られた細胞より、cDNAを抽出し、
これを含むプラスミドを構築し、このプラスミドを大腸
菌体内に導入してクローニングし、癌抑制活性を有する
クローンを選別する工程。
これを含むプラスミドを構築し、このプラスミドを大腸
菌体内に導入してクローニングし、癌抑制活性を有する
クローンを選別する工程。
上記工程は、ASB、CSDの順、またはA1C5BS
Dの順に行われる。
Dの順に行われる。
工程Cの、腫瘍細胞としての性質が失われた細胞クロー
ンを単離する方法としては、たとえば次のような方法が
ある。
ンを単離する方法としては、たとえば次のような方法が
ある。
(イ)培養器壁(プラスチック!りへの付着性の増加し
たものを選ぶ。
たものを選ぶ。
(0)低濃度血清下で、細胞傷害性薬剤(たとえば、ブ
ロモデオキシウリジン、フロロデオキシウリジン、コル
ヒチン等)を作用させる。
ロモデオキシウリジン、フロロデオキシウリジン、コル
ヒチン等)を作用させる。
(ハ)浮遊培養下で、上記の薬剤を作用させる。
(ニ)腫瘍細胞を選択的に凝集させるレクチン(たとえ
ば、コンカナバリンA)を作用させる。
ば、コンカナバリンA)を作用させる。
(ネ)グルタミン類似体くたとえばDON (6−ジア
シー5−オキソノルロイシン))を作用させる。
シー5−オキソノルロイシン))を作用させる。
(へ)温熱処理をする。
()))!Jプシン等の蛋白分解酵素にて長時間処理す
る。
る。
(チ)ウアバインで処理する。
上記方法のうち(イ)が最も好ましい。
ペプチド(1) は、活性化ras遺伝子により癌化し
た細胞の悪性な形質を抑制する遺伝子の産物として本発
明者が同定したものである。この蛋白はras蛋白と部
分的に相同性を持つため、その類似性が癌抑制効果に寄
与していると考えられる。
た細胞の悪性な形質を抑制する遺伝子の産物として本発
明者が同定したものである。この蛋白はras蛋白と部
分的に相同性を持つため、その類似性が癌抑制効果に寄
与していると考えられる。
ペプチド(I[I)、(■)は、ras蛋白においてG
TPのリン酸基と、ペプチド(VI)、(■)、(IX
)はras蛋白においてGTPのグアニンと、ペプチド
(V)はras蛋白において標的蛋白と結合する部位に
それぞれ相当する。ペプチド(VI)、(X)は、ra
s蛋白において蛋白の活性化に関係し、ペプチド(XI
)は、このペプチド(I) において、ras蛋白と比
べ最も違いの大きい部分である。
TPのリン酸基と、ペプチド(VI)、(■)、(IX
)はras蛋白においてGTPのグアニンと、ペプチド
(V)はras蛋白において標的蛋白と結合する部位に
それぞれ相当する。ペプチド(VI)、(X)は、ra
s蛋白において蛋白の活性化に関係し、ペプチド(XI
)は、このペプチド(I) において、ras蛋白と比
べ最も違いの大きい部分である。
従って、これらのペプチド断片は、それぞれペプチド(
1)全体の持つ癌抑制活性の一部又は全部を担っている
可能性が有る。こうした、ペプチドは、合成することも
可能であるが、DNAを用いて組換えDNA技術により
生産することもできる。また、これらのペプチドに対す
る抗体は、診断や、類似の癌抑制蛋白の発現に有用であ
ると予想される。
1)全体の持つ癌抑制活性の一部又は全部を担っている
可能性が有る。こうした、ペプチドは、合成することも
可能であるが、DNAを用いて組換えDNA技術により
生産することもできる。また、これらのペプチドに対す
る抗体は、診断や、類似の癌抑制蛋白の発現に有用であ
ると予想される。
本発明の癌抑制遺伝子Krev −1のDNA配列を第
7図に示す。
7図に示す。
この癌抑制遺伝子)(rev−1について、以下、実施
例を示し更に詳細に説明する。
例を示し更に詳細に説明する。
実施例1
癌抑制遺伝子(K匹−1)の単離
(1)フラット・リバータントの取得
動物細胞用選択マーカーを含むpCD2ベクター系(文
献1)を用いて常法どおり作製したヒト正常線維芽細胞
cDNA発現ライブラリーDNAプラスミドを5μg/
106細胞の比率で、カーステン(Kirsten)マ
ウス肉腫ウィルスでトランスフォームしたNIH/3T
3細胞(第1図(a)参照)にリン酸カルシウムによる
トランスフェクション法(文献2)にて導入した。
献1)を用いて常法どおり作製したヒト正常線維芽細胞
cDNA発現ライブラリーDNAプラスミドを5μg/
106細胞の比率で、カーステン(Kirsten)マ
ウス肉腫ウィルスでトランスフォームしたNIH/3T
3細胞(第1図(a)参照)にリン酸カルシウムによる
トランスフェクション法(文献2)にて導入した。
この細胞を、約1週間、1 mg/ m1!のG418
(ゲンタマイシン)ヲ含ムタルベツコMEM培養液(1
0%仔牛血清を含む)中で培養し、DNAプラスミドを
取込んだ細胞を選択した。その後プラスチック製ペトリ
皿の底面に付着性の強くなった細胞を選別するために、
培養液をピペットにて、細胞コロニーにふきつけ、容易
に底面より脱離するものを生理食塩水又は培養液で数回
ベトリ皿で洗う事によって除去し1.上記0418を含
む培養液中にてさらに3日間培養を続けた。
(ゲンタマイシン)ヲ含ムタルベツコMEM培養液(1
0%仔牛血清を含む)中で培養し、DNAプラスミドを
取込んだ細胞を選択した。その後プラスチック製ペトリ
皿の底面に付着性の強くなった細胞を選別するために、
培養液をピペットにて、細胞コロニーにふきつけ、容易
に底面より脱離するものを生理食塩水又は培養液で数回
ベトリ皿で洗う事によって除去し1.上記0418を含
む培養液中にてさらに3日間培養を続けた。
上記処理後にミ生育してきたコロニーを顕微鏡下で観察
し、形態的に正常に近くなった(扁平で付着性の強くな
った)細胞のコロニーをクローニング・シリンダーにて
単離した。その後、数回の再クローニングを繰返し、純
粋な単一クローン細■包、すなわちフラット・リバーラ
ントR16株(第1図ら)参照)を得た。
し、形態的に正常に近くなった(扁平で付着性の強くな
った)細胞のコロニーをクローニング・シリンダーにて
単離した。その後、数回の再クローニングを繰返し、純
粋な単一クローン細■包、すなわちフラット・リバーラ
ントR16株(第1図ら)参照)を得た。
(2)フラット・リバーラントR16株からのcDNA
の回収 フラット・リバーラントR16株より、常法(文献3)
に従って全D N Aを抽出し、制限酵素Sal I
によって完全に切断し、0.5〜2μg1500μlの
D N A濃度において、リガーゼ処理する事により、
DNA断片を環状化させた。
の回収 フラット・リバーラントR16株より、常法(文献3)
に従って全D N Aを抽出し、制限酵素Sal I
によって完全に切断し、0.5〜2μg1500μlの
D N A濃度において、リガーゼ処理する事により、
DNA断片を環状化させた。
このDNAプラスミド混合物を、大腸菌(AG−1株)
(Strategene社)にハナハン(Hanah
an)の方法(文献4)に従ってトランスフォームし、
100μg/mlアンピシリンに耐性な大腸菌クローン
を選択した。これらのクローン中より、カナマイシン(
12,5μg /mり耐性のクローンをさらに選び(8
クローン)、それらの大腸菌クローンよりプラスミドD
NAを常法(アルカリ法、文献3)により抽出した。プ
ラスミドDNAは種々の制限酵素による切断地図を作る
事により各クローン間の大まかな構造の異同を検討し、
代表的な6クローンについて以下の活性検定を行った。
(Strategene社)にハナハン(Hanah
an)の方法(文献4)に従ってトランスフォームし、
100μg/mlアンピシリンに耐性な大腸菌クローン
を選択した。これらのクローン中より、カナマイシン(
12,5μg /mり耐性のクローンをさらに選び(8
クローン)、それらの大腸菌クローンよりプラスミドD
NAを常法(アルカリ法、文献3)により抽出した。プ
ラスミドDNAは種々の制限酵素による切断地図を作る
事により各クローン間の大まかな構造の異同を検討し、
代表的な6クローンについて以下の活性検定を行った。
その結果、これらのうちの1つのクローンが腫瘍細胞を
フラット・リバータントにする能力を有することを見出
した。このプラスミドをpKrev−1と命名した。こ
れを含有する大腸菌AG−1<pKrev−1)は昭和
63年9月20日工業技術院微生物工業技術研究所にA
G−1(pKrev−1)として寄託され、その微生物
受託番号は微工菌寄第10289号(FERMP−10
289)である。
フラット・リバータントにする能力を有することを見出
した。このプラスミドをpKrev−1と命名した。こ
れを含有する大腸菌AG−1<pKrev−1)は昭和
63年9月20日工業技術院微生物工業技術研究所にA
G−1(pKrev−1)として寄託され、その微生物
受託番号は微工菌寄第10289号(FERMP−10
289)である。
上記工程(1)、(2)の概略を第2図に示す。
(3)活性検定
カーステン肉腫ウィルス・トランスフォームNIH/3
T3細胞(DT株)5X10’をコラーゲン・コートし
た60mmペトリ皿にプレートシ、翌日、5μgの各プ
ラスミド・クローンDNAをリン酸カルシウム法(文献
2)にて、トランスフェクトする。16〜24時間後に
、25%グリセロールを含む培養液で1゛分間、細胞を
処理し、さらに約24時間培養を続ける。
T3細胞(DT株)5X10’をコラーゲン・コートし
た60mmペトリ皿にプレートシ、翌日、5μgの各プ
ラスミド・クローンDNAをリン酸カルシウム法(文献
2)にて、トランスフェクトする。16〜24時間後に
、25%グリセロールを含む培養液で1゛分間、細胞を
処理し、さらに約24時間培養を続ける。
この後、細胞をトリプシン処理により、ペトリ皿より、
はがし1 mg/ m10418を含む培養液15−を
含む100叩ぺ) IJ皿にプレートしなおす。
はがし1 mg/ m10418を含む培養液15−を
含む100叩ぺ) IJ皿にプレートしなおす。
約24時間後、及び3〜4日後に同じ組成の培地で大検
えをし、その後毎日細胞コロニーの形態を観察する。
えをし、その後毎日細胞コロニーの形態を観察する。
pKrev−1プラスミドでトランスフェクトしたもの
の場合、全コロニーの4〜10%が、扁平な形態を示し
、他のコロニーも増殖がやや遅く、皿の底面への付着性
が、コントロールに比べ一般に増していた。
の場合、全コロニーの4〜10%が、扁平な形態を示し
、他のコロニーも増殖がやや遅く、皿の底面への付着性
が、コントロールに比べ一般に増していた。
扁平なコロニーをクローン化し、その性質を調べると、
正常な細胞の性質に近くなっており、Krev −1遺
伝子の発現量も高い事が見出された(表1、第3図参照
)。
正常な細胞の性質に近くなっており、Krev −1遺
伝子の発現量も高い事が見出された(表1、第3図参照
)。
表1 トランスフェクト細胞の生育特性NIHne。
DTne。
pKrev I
I
I
T/Fl
扁平 19
癌化 10
扁平 23
によりトランスフ
扁平 18
扁平 17
癌化 15
癌化 15
一部扁平 16
0.5
?2 10−30
0.9 4−10
エクトしたちの
5.4 4−10
4.8 4−10
17.3 6−8
15.8 5−10
5゜8 7−9
*増殖能を有する細胞の数に対する軟寒天培地中のコロ
ニーの数の比率 木*1個の細胞(はぼ球形)の直径を1単位としたとき
のコロニーの直径の大きさ トランスフォーム(癌化)した細胞(DTneo”)は
、増殖速度が速く (倍化時間(10時間)が短い)、
軟寒天培地中でコロニー形成能を持っている(72%)
。これに対してフラット・リバータフトR16株は、正
常細胞(N I Hneo”)と同様に、増殖速度は遅
く(倍化時間23時間)、軟寒天培地中でコロニーは、
はとんど形成しない(0,9%)。F1〜T/F1は、
Krev −ICDNAをDT細胞にトランスフェクト
して得られた細胞クローンであるが、形態が正常に近い
もの(Fl、F2)では、トランスフォーム細胞(DT
細胞)の性質が著しく抑制されている。この実験は2回
繰り返したが、同様の結果が得られた。なおNIH/3
T3、DT細胞のいずれにもneo遺伝子(G418耐
性遺伝子)を導入し、それぞれN I Hneo”5D
TneoRとしてコントロールとした。
ニーの数の比率 木*1個の細胞(はぼ球形)の直径を1単位としたとき
のコロニーの直径の大きさ トランスフォーム(癌化)した細胞(DTneo”)は
、増殖速度が速く (倍化時間(10時間)が短い)、
軟寒天培地中でコロニー形成能を持っている(72%)
。これに対してフラット・リバータフトR16株は、正
常細胞(N I Hneo”)と同様に、増殖速度は遅
く(倍化時間23時間)、軟寒天培地中でコロニーは、
はとんど形成しない(0,9%)。F1〜T/F1は、
Krev −ICDNAをDT細胞にトランスフェクト
して得られた細胞クローンであるが、形態が正常に近い
もの(Fl、F2)では、トランスフォーム細胞(DT
細胞)の性質が著しく抑制されている。この実験は2回
繰り返したが、同様の結果が得られた。なおNIH/3
T3、DT細胞のいずれにもneo遺伝子(G418耐
性遺伝子)を導入し、それぞれN I Hneo”5D
TneoRとしてコントロールとした。
第3図は、表1で述べたKrev −1)ランスフェク
ト細胞りローン内での)(rev −1遺伝子のコピー
数(左パネル)及びmRNA!(中央パネル)を調べた
結果を示したものである。右パネルは、実験に用いた全
RNA量が一定である事を示すコントロール実験である
。表1の結果と合わせると癌形質の抑制とKrev −
1遺伝子の発現との間に相関性がある事が判る。
ト細胞りローン内での)(rev −1遺伝子のコピー
数(左パネル)及びmRNA!(中央パネル)を調べた
結果を示したものである。右パネルは、実験に用いた全
RNA量が一定である事を示すコントロール実験である
。表1の結果と合わせると癌形質の抑制とKrev −
1遺伝子の発現との間に相関性がある事が判る。
すなわち、Aは、各細胞のDNA20μgを、制限酵素
BanHIで切断し、0.6%アガロース電気泳劾後、
DNAを変性させ、ニトロセルロース膜に吸着させ、3
2pでラベルした)(rev −1cDNAと常法(文
献3)に従ってハイブリダイズ(2本鎖形成)し、その
後、X線フィルムに感光させたものである。またBは、
各細胞の全RNAl0μgを、ホルムアルデヒドを含む
アガロースゲル(文献3)で電気泳動した後、ニトロセ
ルロースにRNAを吸着させ、Aと同様の処理をしたも
のである。β−ACTINは、電気泳動に使ったRNA
の量及び質をチエツクするために、そのコントロールと
して上で使ったニトロセルロース膜を洗浄後、再び32
pでラベルしたβ−ACTIN cDNAとハイブリ
ダイズさせたものである。
BanHIで切断し、0.6%アガロース電気泳劾後、
DNAを変性させ、ニトロセルロース膜に吸着させ、3
2pでラベルした)(rev −1cDNAと常法(文
献3)に従ってハイブリダイズ(2本鎖形成)し、その
後、X線フィルムに感光させたものである。またBは、
各細胞の全RNAl0μgを、ホルムアルデヒドを含む
アガロースゲル(文献3)で電気泳動した後、ニトロセ
ルロースにRNAを吸着させ、Aと同様の処理をしたも
のである。β−ACTINは、電気泳動に使ったRNA
の量及び質をチエツクするために、そのコントロールと
して上で使ったニトロセルロース膜を洗浄後、再び32
pでラベルしたβ−ACTIN cDNAとハイブリ
ダイズさせたものである。
(4)構造決定
Krev −1c DNAを、Bluescrtptベ
クター(Strategene社、TOYOBO:]−
ド番号212201〜212204)にサブ・クローニ
ングし、常法に従って塩基配列を決定した(Strat
egene社、カタログ参照)。この塩基配列を第7図
に示す。反応は5equenase (U S 8社)
を用いて行った。
クター(Strategene社、TOYOBO:]−
ド番号212201〜212204)にサブ・クローニ
ングし、常法に従って塩基配列を決定した(Strat
egene社、カタログ参照)。この塩基配列を第7図
に示す。反応は5equenase (U S 8社)
を用いて行った。
Krev −1cDNAには唯一の、長いオーブン・リ
ーディング・フレームが有り、そのアミノ酸配列と、c
−Ha−rasl蛋白のアミノ酸配列とを比較して第4
図に示した。
ーディング・フレームが有り、そのアミノ酸配列と、c
−Ha−rasl蛋白のアミノ酸配列とを比較して第4
図に示した。
実施例2
Krev−1蛋白(ペプチド(I))の大腸菌を用いた
発現 pAR2106ベクターにKrev −1cDNAのR
sa I −Rsa I断片(1,25Kb) (第
7図の矢印で示す)を組込み、大腸菌BL21株内でI
PTG (イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノ
シド)処理により、発現させた(文献5)。プラスミド
の構築の際、天然Krev −1蛋白の内N−末端の4
個のアミノ酸が失なわれ、その代りに14個の新たなア
ミノ酸が加わるような構造の遺伝子に改変されたく第5
図参照)。
発現 pAR2106ベクターにKrev −1cDNAのR
sa I −Rsa I断片(1,25Kb) (第
7図の矢印で示す)を組込み、大腸菌BL21株内でI
PTG (イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノ
シド)処理により、発現させた(文献5)。プラスミド
の構築の際、天然Krev −1蛋白の内N−末端の4
個のアミノ酸が失なわれ、その代りに14個の新たなア
ミノ酸が加わるような構造の遺伝子に改変されたく第5
図参照)。
実施例3
Kreシー1蛋白に対する抗体
Krev −1蛋白アミノ酸配列(第4図)の内、C末
端より16個のアミノ酸(Tlli9〜L”’)に対応
するオリゴペプチドを常法により合成し、(アプライド
・バイオシステム社製ペプチド合成機使用)、ヘモシア
ニンを担体として、ウサギに免疫し、抗血清を得た。こ
の抗血清は、ウェスタン・ブ0−/ト(Western
blot)分析法にて、K rev−1cDNAの構
造から予想される分子量(約21.000)の蛋白を検
出できる(第6図)。
端より16個のアミノ酸(Tlli9〜L”’)に対応
するオリゴペプチドを常法により合成し、(アプライド
・バイオシステム社製ペプチド合成機使用)、ヘモシア
ニンを担体として、ウサギに免疫し、抗血清を得た。こ
の抗血清は、ウェスタン・ブ0−/ト(Western
blot)分析法にて、K rev−1cDNAの構
造から予想される分子量(約21.000)の蛋白を検
出できる(第6図)。
三角印のバンドがペプチドによる吸収や、抗血清の希釈
によって、消える事から、この抗体はKrev −1蛋
白に特異的な反応性を持つ事が判る。
によって、消える事から、この抗体はKrev −1蛋
白に特異的な反応性を持つ事が判る。
文献
1) C,Chen & HoOkayama : M
ol、 Ce11.Biol、 7 。
ol、 Ce11.Biol、 7 。
2745−2752.1987゜
2) M、 Wigler et al、 : Pro
c、 Natl、 Acad、5ciUSA 76、1
373−1376、1979゜3) T、 Mania
tis et al、 : in !Jolecul
ar Cloning(New York : Co1
d Spring Harbor Lab、)、 19
g2゜4) D、 Hanahan : JoMol、
Biol、166 、557−580゜1983゜ 5) F、W、 5tudier & B、 A、 M
offatt : J、 !、(ol。
c、 Natl、 Acad、5ciUSA 76、1
373−1376、1979゜3) T、 Mania
tis et al、 : in !Jolecul
ar Cloning(New York : Co1
d Spring Harbor Lab、)、 19
g2゜4) D、 Hanahan : JoMol、
Biol、166 、557−580゜1983゜ 5) F、W、 5tudier & B、 A、 M
offatt : J、 !、(ol。
Biol、189.113−130.1986゜6)
W、N、 Burnette : Ann、Bioch
em、112.195−203、1981゜ 〔発明の効果・有用性〕 本発明の癌抑制遺伝子は、腫瘍細胞を正常細胞に復帰さ
せる能力がある。また、)(rev −1遺伝子の作る
蛋白質には、癌遺伝子rasの作る蛋白質と構造上一部
似た部分があり、進化共通の祖先から由来したものであ
る可能性が示されたく第4図)つまり、「癌抑制遺伝子
」のうちの少なくとも−部は、癌遺伝子と良く似たもの
であることがはじめて示唆されたので、癌化の分子機構
を解明する上で重要な知見と考えられる。また、本発明
の癌抑制遺伝子の単離法は今後さらに別の「がん抑制遺
伝子」の単離にも適用することができる。
W、N、 Burnette : Ann、Bioch
em、112.195−203、1981゜ 〔発明の効果・有用性〕 本発明の癌抑制遺伝子は、腫瘍細胞を正常細胞に復帰さ
せる能力がある。また、)(rev −1遺伝子の作る
蛋白質には、癌遺伝子rasの作る蛋白質と構造上一部
似た部分があり、進化共通の祖先から由来したものであ
る可能性が示されたく第4図)つまり、「癌抑制遺伝子
」のうちの少なくとも−部は、癌遺伝子と良く似たもの
であることがはじめて示唆されたので、癌化の分子機構
を解明する上で重要な知見と考えられる。また、本発明
の癌抑制遺伝子の単離法は今後さらに別の「がん抑制遺
伝子」の単離にも適用することができる。
本発明のペプチド(I)は正常細胞内に存在する蛋白で
あるが、癌細胞中では量的又は質的に変化している可能
性が有る。従って、そうした変化を調べるための試薬と
して、ペプチド(I)〜(XI)に対する抗体は有用で
あると予想される。また、これらの抗体を用いて、さら
に新しい関連癌抑制蛋白を見出せる可能性が有る。
あるが、癌細胞中では量的又は質的に変化している可能
性が有る。従って、そうした変化を調べるための試薬と
して、ペプチド(I)〜(XI)に対する抗体は有用で
あると予想される。また、これらの抗体を用いて、さら
に新しい関連癌抑制蛋白を見出せる可能性が有る。
第1図は、NIH/3T3細胞(a)とフラット・リバ
ータントラ)を示す写真である。 第2図は、cDNA発現ライブラリーのトランスフェク
ションによるフラット・リバータントの単離法の概略を
示す図面である。 第3図は、)(rev −1)ランスフエクト細胞りロ
ーン内でのKrev−1遺伝子のコピー数(左パネル)
及びmRNA量(中央パネル)を調べた結果を示す電気
泳動図である。 第4図は、Krev −1蛋白(ペプチド(I))とc
−Ha−rasl蛋白のアミノ酸配列を比較して示すも
のである。Krev −1蛋白のアミノ酸配列中の(−
)は、c−Ha−ras1蛋白のアミノ酸と同一である
ことを示す。 第5図は、大腸菌体内で発現させるために修飾されたK
rev −1蛋白のN−末端のアミノ酸配列を示すもの
である。 第6図は、Krev −1蛋白のC−末端16個の合成
オリゴペプチドに対する抗血清の反応性を示す電気泳動
図である。 第7図はKrev −1遺伝子のDNA配列を示す図面
である。矢印はRsaiによる切断部位を示す。 7面の浄書(内容に変更なし) 第1図 (b) 第2図 NLH/373細胞 トランスフォーム細胞 フラット・リバータント cDNAの回収 (″−″′″N虜讐訂肯蒜:*79つ 正常後Il!lll1lK(フラット・リパータント)
1′″−)へ′: A C)でO〜 ア0
C4) ぐρ (刀Δ ω σ第 図 MASMTGGQQMGRDflKLVVVG−−−一
組換え Krev−1蛋白MTBYKLVVVG−−
−−天 然 Krev−1蛋白第 c−Ha−rasl Kr+ぴ−1 ■ MTBYKLVVVG AGGVGKSALT I
QLICINftFVD BYDPTIBDSY
RKQVVIDGBTR−−−−−−L−5−−−−−
−−−−V−FV−Gl−B K−−一−−−−−−−
−−−−BV−CGQc−Ha−rasl Krev−1 CLLDILDTAG QBBYSAMRDQ Y
MRTGBGFLCVFAINNTにSF BDIH
QYREOI−M−8−−−−−−T−OFT−−−−
L−KN−C1−AL −YS−TAQST−N−L
QDL−−−−c−Ha−1且l Krev−1 KRVKDSDDVP MVLVGNKCDL AA
RTVBSRQ AQDLAR5Y G IPYIBT
SAKTし一−−−TB−−− −I−−−−−−−−
BDB−V−GKB−G−N−−一〇WCN CAFL
−3−−−3c−Ha−LLIl 149 R
GGVBDAFYT LνRBI RQHK L
RKLNPPDBS SGPGCMSCK CVL
SにU泣−1151KIN−N!l!I−D−一−Q−
N−にTP VεKKKPにKKS CL
LL正常血清 ′IO ?憂、5 種、4
ータントラ)を示す写真である。 第2図は、cDNA発現ライブラリーのトランスフェク
ションによるフラット・リバータントの単離法の概略を
示す図面である。 第3図は、)(rev −1)ランスフエクト細胞りロ
ーン内でのKrev−1遺伝子のコピー数(左パネル)
及びmRNA量(中央パネル)を調べた結果を示す電気
泳動図である。 第4図は、Krev −1蛋白(ペプチド(I))とc
−Ha−rasl蛋白のアミノ酸配列を比較して示すも
のである。Krev −1蛋白のアミノ酸配列中の(−
)は、c−Ha−ras1蛋白のアミノ酸と同一である
ことを示す。 第5図は、大腸菌体内で発現させるために修飾されたK
rev −1蛋白のN−末端のアミノ酸配列を示すもの
である。 第6図は、Krev −1蛋白のC−末端16個の合成
オリゴペプチドに対する抗血清の反応性を示す電気泳動
図である。 第7図はKrev −1遺伝子のDNA配列を示す図面
である。矢印はRsaiによる切断部位を示す。 7面の浄書(内容に変更なし) 第1図 (b) 第2図 NLH/373細胞 トランスフォーム細胞 フラット・リバータント cDNAの回収 (″−″′″N虜讐訂肯蒜:*79つ 正常後Il!lll1lK(フラット・リパータント)
1′″−)へ′: A C)でO〜 ア0
C4) ぐρ (刀Δ ω σ第 図 MASMTGGQQMGRDflKLVVVG−−−一
組換え Krev−1蛋白MTBYKLVVVG−−
−−天 然 Krev−1蛋白第 c−Ha−rasl Kr+ぴ−1 ■ MTBYKLVVVG AGGVGKSALT I
QLICINftFVD BYDPTIBDSY
RKQVVIDGBTR−−−−−−L−5−−−−−
−−−−V−FV−Gl−B K−−一−−−−−−−
−−−−BV−CGQc−Ha−rasl Krev−1 CLLDILDTAG QBBYSAMRDQ Y
MRTGBGFLCVFAINNTにSF BDIH
QYREOI−M−8−−−−−−T−OFT−−−−
L−KN−C1−AL −YS−TAQST−N−L
QDL−−−−c−Ha−1且l Krev−1 KRVKDSDDVP MVLVGNKCDL AA
RTVBSRQ AQDLAR5Y G IPYIBT
SAKTし一−−−TB−−− −I−−−−−−−−
BDB−V−GKB−G−N−−一〇WCN CAFL
−3−−−3c−Ha−LLIl 149 R
GGVBDAFYT LνRBI RQHK L
RKLNPPDBS SGPGCMSCK CVL
SにU泣−1151KIN−N!l!I−D−一−Q−
N−にTP VεKKKPにKKS CL
LL正常血清 ′IO ?憂、5 種、4
Claims (4)
- (1)下記のアミノ酸配列( I )〜(XII)から成る
群から選ばれるアミノ酸配列で表されるペプチドをコー
ドする癌抑制遺伝子。 ( I )【遺伝子配列があります】 (II)【遺伝子配列があります】 (III)【遺伝子配列があります】 (IV)【遺伝子配列があります】 (V)【遺伝子配列があります】 (VI)【遺伝子配列があります】 (VII)【遺伝子配列があります】 (VIII)【遺伝子配列があります】 (IX)【遺伝子配列があります】 (X)【遺伝子配列があります】 (X I )【遺伝子配列があります】 (XII)アミノ酸配列( I )においてG^1^2、G
^1^3、A^5^9またはT^6^1を任意のアミノ
酸と置換したもの。 - (2)請求項(1)記載のアミノ酸配列( I )〜(X
II)から成る群から選ばれるアミノ酸配列で表わされる
ペプチド。 - (3)請求項(2)記載のペプチドに対する抗体。
- (4)下記の工程A〜Dを、A、B、C、DまたはA、
C、B、Dの順に連結してなる請求項(1)記載の癌抑
制遺伝子の単離法。 A、腫瘍細胞又はトランスフォーム細胞に、動物細胞用
選択マーカーを持ったcDNA発現ライブラリーDNA
プラスミドをトランスフェクション又はそれに準ずる方
法により導入する工程。 B、選択マーカーを用いて、cDNAプラスミドを取込
んだ細胞を選別する工程。 C、腫瘍細胞としての性質が失われた細胞クローンを単
離する工程。 D、工程Cで得られた細胞より、cDNAを抽出し、こ
れを含むプラスミドを構築し、大腸菌体内に導入してク
ローニングし、癌抑制活性を有するクローンを選別する
工程。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23573788A JPH0284181A (ja) | 1988-09-20 | 1988-09-20 | 癌抑制遺伝子、その単離法、それがコードするペプチド、及び抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23573788A JPH0284181A (ja) | 1988-09-20 | 1988-09-20 | 癌抑制遺伝子、その単離法、それがコードするペプチド、及び抗体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0284181A true JPH0284181A (ja) | 1990-03-26 |
Family
ID=16990476
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23573788A Pending JPH0284181A (ja) | 1988-09-20 | 1988-09-20 | 癌抑制遺伝子、その単離法、それがコードするペプチド、及び抗体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0284181A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004040302A1 (ja) * | 2002-10-30 | 2004-05-13 | Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. | RAPL・Rap1相互作用制御 |
US8256317B2 (en) | 2007-01-19 | 2012-09-04 | Aisin Seiki Kabushiki Kaisha | Transmission device and power seat slide device for vehicle |
-
1988
- 1988-09-20 JP JP23573788A patent/JPH0284181A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004040302A1 (ja) * | 2002-10-30 | 2004-05-13 | Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. | RAPL・Rap1相互作用制御 |
US8256317B2 (en) | 2007-01-19 | 2012-09-04 | Aisin Seiki Kabushiki Kaisha | Transmission device and power seat slide device for vehicle |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031201 |