WO2004033616A1 - Einrichtung zur kultivierung von zellen, insbesondere menschlicher oder tierischer zellen - Google Patents

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WO2004033616A1
WO2004033616A1 PCT/EP2002/010358 EP0210358W WO2004033616A1 WO 2004033616 A1 WO2004033616 A1 WO 2004033616A1 EP 0210358 W EP0210358 W EP 0210358W WO 2004033616 A1 WO2004033616 A1 WO 2004033616A1
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cell culture
culture chamber
cells
chamber
cell
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Josef Seidl
Wilhelm Scherze
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Pan-Biotech Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature

Definitions

  • the invention relates to a device for cultivating cells of the most varied types, in particular human or animal cells, cells of at least one specific type being used in each case in a defined environment and cells of the culture in question having associated liquid nutrient media, growth factors, gases or the like are supplied.
  • Cultures of the abovementioned type are generally prepared from individual cells which originate either from tissue parts, from primary cultures, from Zeil lines or Zeil strains through enzymatic, mechanical or chemical division.
  • culture vessels made of plastic are generally used to prepare the cultures and are incubated in CO 2 incubators. These guarantee a constant temperature (eg 37 ° C) and buffering of the medium through 5% - 10% C0 gassing. Oxygen is supplied by simple diffusion. In the known methods and devices for the cultivation of cells, co-cultivation and freely variable incubation conditions are generally not possible.
  • the culture vessels have to be removed from the respective incubator, whereby the incubation is interrupted, the cells cool down and the test conditions are therefore not constant.
  • the previously known methods and devices for culturing cells no longer meet the requirements of modern cell culture technology.
  • the prior art includes, for example, multivalent cell culture systems (see, for example, DE 199 15 178 AI), problem-adapted cell culture systems for specific tasks (see, for example WO 98/17822) or methods for replication of cell cultures are known (cf. for example WO 97/37001).
  • a method for mixing a varicella-infected cell culture in roller bottles is known from WO 99/23206, for example.
  • EP 0 999 266 A1 discloses a method and a device for taking up a cell culture, as a result of which conditions which are as homogeneous as possible are to be created for the molecular biological or genetic testing of cells.
  • the present invention is based on the object of creating a new, improved device for cultivating cells of all kinds, in particular human or animal cells, this device having the disadvantages known to date Systems and equipment for cell cultivation eliminated and, in particular, the possibility of simulating highly complex, biological processes in real time and under almost in-vivo conditions (ie as in the living organism) with optimally adapted living and growth conditions of the cells.
  • the object as defined above is achieved according to the invention in that the device has cell cultivation and incubation means which are designed in such a way that it is in at least one cell culture chamber the device sown cells is enabled to adjust itself to the living and growth conditions required in the individual case.
  • the device according to the invention preferably has the combination of the following features:
  • c) means for the regulated or controlled heating of the at least one cell culture chamber in such a way that a constant temperature is guaranteed therein for the duration of an experiment;
  • the relevant cell culture parameters are in particular pH, glucose, lactate, oxygen, electropotential and the like.
  • a predetermined number of cell culture chambers is preferably provided, which can either be connected in series or in parallel, a corresponding number of cell cultures preferably being located simultaneously within this predetermined number of cell culture chambers.
  • the device according to the invention for the cultivation of cells it is ensured above all that the cells of all cultures are continuously supplied with liquid nutrient media, growth factors, gases or the like, without the cells having to be removed from a culture from their familiar, defined environment, while at the same time all cell cultures can be permanently observed microscopically without interrupting the fumigation.
  • means are provided in order to vary the amount of liquid media and / or their flow directions and / or their distribution and / or their flow rates during the duration of an experiment.
  • means can also be provided to vary the type of gases and / or their flow directions and / or their distribution and / or the fumigation concentrations during the duration of an experiment.
  • the device preferably has means for permanently measuring the temperatures prevailing in the individual cell cultures and as actual temperature values Enter the appropriate temperature control or temperature control circuit so that the heating of the respective cell culture chamber is regulated or controlled accordingly.
  • each individual cell culture chamber has its own heating for this purpose, while an infrared temperature meter is arranged above the cell culture chamber in question, which measures the temperature prevailing in the cell culture in question and this temperature measurement value to a monitoring device - and control system reports. If the initially predetermined temperature changes in the at least one cell culture chamber, then the temperature control or control circuit causes the heating power of the respective cell culture chamber heating to be reduced or increased.
  • the temperature measurement can also be carried out with the help of other temperature sensors.
  • the temperatures in the individual cell culture chambers can be freely adjusted and changed by the monitoring and control system during the entire test period.
  • Another particularly advantageous embodiment of the device according to the invention is that it has at least one Has cell culture chamber in which a gas-permeable membrane is arranged in such a way that a cell culture of different types can be used on both sides of this membrane for the purpose of direct co-cultivation of both cell cultures, means for initiating a first media flow to one side of the membrane , ie the apical side with the first cell culture, and a second media flow which is different from the first media flow. to the other side of the membrane, ie the basolateral side with the second cell culture.
  • the device according to the invention can also be used with particular advantage for indirect co-cultivation, with different biological systems (tissue / cell types) being connected in series in corresponding cell culture chambers. In this way, entire organ systems can be rebuilt and the corresponding metabolic processes examined.
  • tissue / cell types tissue / cell types
  • the liver cells convert the substance into breakdown products, which can be toxic under certain circumstances.
  • a video-assisted microscopic observation system for observing the at least one cell culture in the at least one cell culture chamber, as will be explained in more detail below.
  • a further advantageous embodiment of the device according to the invention is that it has a computer-controlled monitoring and control system, for which all the data obtained by
  • the feedback control means are, in particular, control algorithms that are contained in a data processing system of the computer-controlled monitoring and control system.
  • a software-supported measuring system is provided for the permanent measurement of the relevant cell culture parameters.
  • a continuous measurement of cell culture parameters can preferably be carried out using special probes or sensors, for example for pH value, lactate, electropotential and the like, it being possible for these measurements to be evaluated and displayed using appropriate software.
  • This type of measurement provides more precise results than conventional methods, which means that certain questions can be analyzed that cannot be carried out with the measurement methods used previously.
  • the device for culturing cells according to the invention offers the following advantages in particular: 1. Possibility of a parallel connection of a predetermined number of cell culture chambers within the device for comparison measurements.
  • Figure 1 is a schematic view of a device for culturing cells of various types, in particular human or animal cells; and FIG. 2 shows a schematic representation of a cell culture chamber grouping arranged on the basis of the device according to FIG. 1, to which a predetermined number of individual cell culture chambers are combined.
  • FIG. 1 schematically shows a device 30 for cultivating cells of the most varied types, cells of at least one specific type being used in each case in a defined environment within an assigned cell culture chamber and the cells of the culture in question having preselected, liquid nutrient media, growth factors, gases and the like are supplied.
  • this device 30 is designed in such a way that it has cell cultivation and incubation means which are designed in such a way that the cells sown in the cell culture chambers of the device 30 are able to adjust themselves to the living and growth conditions required in the individual case , ie especially with the aim of optimizing these living and growing conditions.
  • the base 21 forms a heating system E for the incubation, which ensures the device 30 constant temperatures within each of the cell culture chambers 20 during the operating time.
  • Electrical heating of the respective cell culture chamber 20 is preferably carried out with the aid of this heating system E, which enables very precise temperature control.
  • This heating system E is designed in particular in such a way that each individual cell culture chamber 20 of the cell culture chamber group A has its own heating, which is integrated in the base 21.
  • the heating system E can be controlled with particular advantage by means of an associated software.
  • a system of infrared temperature meters 25 is installed above the cell culture group A, in such a way that a corresponding infrared temperature meter 25 is assigned to each individual cell culture chamber 20.
  • the respective infrared temperature meter 25 senses the prevailing temperature in the cell culture chamber 20 and reports the corresponding measurement result permanently to a computer-controlled monitoring and control system G, which essentially consists of a data processing system 37 and an associated monitor 36.
  • the individual infrared temperature meters 25 are connected to the monitoring and control system G via a common connecting line 45. If the initially specified temperatures in the cell culture chambers 20 of the cell culture chamber group A change, the heating system E is automatically controlled or regulated by the monitoring and control system G, ie the temperature prevailing in the individual cell culture chamber 20 is permanently at a constant Temperature adjusted.
  • the temperature measurement in the individual cell culture chamber 20 could also be carried out with the aid of other temperature sensors.
  • the software contained in the monitoring and control system G can make it possible for the temperatures in the individual cell culture chambers 20 of the cell culture chamber group A to be freely adjustable and selectable during the entire duration of the experiment, should this be necessary for certain reasons.
  • a video system B with a correspondingly assigned microscope system is provided for the purpose of permanent, video-assisted microscopic observation of the interior of the respective cell culture chamber 20. This video system B is explained in more detail below.
  • a video camera 22 with a microscope attachment 22 ' is arranged on a mechanically adjustable travel table 23, thus a total of six video cameras
  • the video system B is preferably also controlled via the software contained in the monitoring and control system G.
  • each individual video camera 22 is controlled with a microscope attachment 22 '. This takes place in particular in such a way that images of the respective cell culture are recorded in the cell culture chamber 20 at freely selectable time intervals (for example every minute), one at the time of such a recording above the respective cell culture chamber 20 arranged light source 24 illuminates the corresponding cell culture, so that sufficient illumination inside the cell culture chamber 20 is ensured for the video recordings.
  • the controller turns off the respective light source 24 until the next video recording is made.
  • the light beam or light cone emanating from each light source 24 and entering the interior of a respective cell culture chamber 20 through a corresponding glass pane (not shown) is designated in FIG. 1 by 24 '.
  • All light sources 24 are connected to the monitoring and control system G via a common connecting line 46.
  • the respective cell culture contained in the cell culture chamber 20 is illuminated area-wide by each individual light beam or light cone 24. It is a fluoroscopic method.
  • the video system B is likewise connected to the monitoring and control system G via a line 47, the line 47 leading from this to a node 48 to which the individual video cameras 22 are connected via correspondingly assigned lines.
  • the video system B with microscope system as explained above represents only one possible embodiment.
  • Re embodiment of such a system for permanent observation of the interior of the cell culture chambers is that a single observation system, consisting of a video camera and microscope attachment, is installed on a travel table and that this travel table travels the six cell culture chambers 20 of the cell culture chamber group A at freely selectable intervals.
  • the adjustment of the observation system for the individual cell culture takes place at the start of the experiment, i.e. preferably after meaningful areas become apparent in the respective cell culture, by means of the corresponding software contained in the monitoring and control system G, i.e., by the corresponding computer program, the six starting positions are Programmed travel table on which the observation system is mounted.
  • the light sources for illuminating the cells contained in the individual cell culture chamber 20 can be attached directly to the respectively assigned video camera 22 or to the microscope attachment 22 'respectively assigned , The device 30 shown in FIG.
  • a metering system C for liquids for example liquid nutrient media and the like
  • liquids for example liquid nutrient media and the like
  • this line bundle 32 is connected to a pump system 29, by means of which the various cell culture chambers 20 of the cell culture chamber group A are supplied with freely selectable liquids which are contained in the liquid storage containers 31.
  • the pump system 29 is in turn connected to a multi-valve module 30 'via a line 33.
  • the liquids are supplied to the cell culture chamber grouping A from the multi-valve module 30 'via sterile hose line systems 27 and 28, these liquids being flexibly passed on from the individual cell culture chambers 20, i.e. from one cell culture chamber to the next, as will be explained in more detail below with reference to FIG. 2.
  • Both the liquid supply and the liquid transfer take place via sterile hose systems, which are installed with standard hose connector elements and distributors at the start of the experiment, i.e. are connected to corresponding supply channels of a respective cell culture chamber 20.
  • the connection of the standard tube elements (not shown in detail in the drawings) with the assigned supply channels of the respective cell culture chamber 20 is coordinated with one another in such a way that sterility is ensured.
  • the type of liquids and / or the flow directions and / or the distribution of the liquids and / or their flow rates during the Suchs are changed or controlled, such a control preferably being carried out by the computer-controlled monitoring and control system G.
  • the pump system 29 are connected to the monitoring and control system G by means of a connecting line 38 and the multi-valve module 30 'via a connecting line 40.
  • the dosing system C of the device 30 thus allows the cell culture chamber group A to be very different. Supply liquids.
  • the device 30 also has a gassing system D for a wide variety of gases.
  • This gassing system D serves to gas the different cell culture chambers 20 of the cell culture chamber group A with different gases, for example air, 0 2 , N 2 , C0 2 .
  • the gas is supplied to the cell culture chamber group A by means of a sterile hose line 26.
  • the gases can be passed on flexibly from the various cell culture chambers 20 using correspondingly assigned supply channels, ie from one cell culture chamber to the next (see FIG. 2). ,
  • Gas supply and gas transmission are carried out via sterile hoses, which are installed using standard hose connector elements and distributors at the start of the experiment.
  • the connections of the hose connector elements with the correspondingly assigned supply channels of a respective cell culture chamber 20 are coordinated with one another in such a way that sterility is ensured.
  • the type of gases and / or the flow directions and / or the gas distribution and / or the gassing concentration can be changed or controlled during the experiment for reasons of flexibility.
  • the gassing system D is in turn connected to the computer-controlled monitoring and control system via a connecting line 39
  • Control system G connected, which contains the corresponding software for controlling the gassing system D.
  • the device 30 for the cultivation of cells also has a monitoring system F with predetermined sensor modules 34.
  • the relevant parameters in the respective cell culture chamber 20 of the cell culture chamber group A can be measured, in particular permanently, measured during the entire duration of the experiment, with these parameters being e.g. is pH, glucose, lactate, oxygen, electropotential, etc.
  • the monitoring system F is connected to the sensors on the individual cell culture chambers 20 of the cell culture chamber group A of the device 30 via a line 41, via a node 42 and from there via further lines 43 and 44 and correspondingly assigned branch lines.
  • the parameters measured by the sensors are forwarded by the monitoring system F via a line 35 to the computer-controlled monitoring and control system G for further processing and subsequent application of the feedback control means.
  • Each cell culture chamber 20 has corresponding sensor connection channels, as will be explained in more detail below, the sensors and the respectively assigned channels being matched to one another in such a way that sterility is ensured.
  • the monitoring system F in conjunction with the computer-controlled monitoring and control system G, is designed with particular preference in such a way that the permanent measurement of the relevant cell culture parameters with the aid of a software-supported th measurement method can take place (as already explained above).
  • FIG. 2 shows the cell culture chamber grouping A of the device 30 according to FIG. 1 in a schematic plan view.
  • the cell culture chamber grouping A arranged on the base 21 a total of six cell culture chambers 20 are connected in series, so that both the liquid media and the gases from one cell culture chamber 20 to another, i.e. can be continuously forwarded to the cell culture chamber 20 arranged subsequently.
  • At least one cell culture to be examined is located in each of the six cell culture chambers 20, but in the present exemplary embodiment, for the sake of simplicity, we speak of six cell cultures, the respective cells of which are to be supplied with defined liquid nutrient media, growth factors, gases and the like.
  • a flow of freely selectable, defined, liquid media and, on the other hand, a flow of different gases with freely selectable concentrations are started in the six cell culture chambers 20 of the cell culture chamber group A, the supply of the liquids to the, as already explained above Cell culture chamber grouping A takes place primarily from the multi-valve module 30 'according to FIG. 1 via the sterile hose line systems 27 and 28, while at the same time the gas supply to the cell culture chamber grouping A takes place from the gassing system D according to FIG. 1 by means of the sterile hose line 26.
  • the six cell culture chambers 20 connected in series are identified by I, II, III, IV, V and VI.
  • the hose line systems 27 and 28 for liquids and the hose line 26 for gases are connected directly to the first cell culture chamber I in such a way that the hose line 26 opens directly into a gas channel 50 inside this first cell culture chamber I, whereas the hose line system 27 into a corresponding liquid channel 51 and the hose line system 28 opens into a liquid channel 52 in the interior of this first cell culture chamber I.
  • the cell culture contained in the first cell culture chamber I is initially supplied with liquid media and gases, whereupon the subsequent cell culture chambers II to VI are successively supplied with liquid media and gases in a corresponding manner.
  • the cell culture chamber I is connected to the second cell culture chamber II via liquid hose lines 27A and 28A and via a gas hose line 26A, which in turn is connected to the third cell culture chamber III via liquid hose lines 27B and 28B and a gas hose line 26B in turn is in turn connected to the fourth cell culture chamber IV via liquid hose lines 27C and 28C and a gas hose line 26C, while this in turn is connected to the fifth cell culture chamber V via liquid hose lines 27D and 28D and via a gas hose line 26D, and finally the latter is connected to the sixth cell culture chamber VI via liquid hose lines 27E and 28E and via a gas hose line 26E.
  • each liquid hose line 28A or 28B or 28C or 28D or 28E opens into a liquid channel 52 inside each cell culture chamber
  • each liquid hose line 27A or 27B or 27C or 27D or 27E opens into a corresponding liquid channel 51 in the interior of each cell culture chamber
  • each gas hose line 26A or 26B or 26C or 26D or 26E opens into a corresponding gas channel 50 of each cell culture chamber.
  • FIG. 2 only one of many possible flow directions for liquids and gases is shown.
  • the above-described flexible hose line systems for liquids and gases can also be used to control cell culture chamber combinations other than that shown in FIG. 2.
  • the cell culture chamber group A is permanently connected to the monitoring system F according to FIG. 1, so that all relevant parameters can be measured in the respective cell culture chamber 20 by means of correspondingly assigned sensors during the entire duration of the test.
  • Each of the six cell culture chambers 20 is therefore equipped in its interior with a corresponding channel 53 for the sensor connection.
  • the first cell culture chamber I is connected via a line 44A, the second cell culture chamber II via a line 44B and the third cell culture chamber III via a line 44C to a line 44
  • the fourth cell culture chamber IV via a line 43A, the fifth cell culture chamber V via a line 43B and the sixth cell culture chamber VI via a line 43C a line 43 is connected.
  • the lines 43 and 44 lead to a node 42, which is connected via a line 41 to the monitoring system F according to FIG. 1.
  • each cell culture chamber 20 in the present exemplary embodiment, chambers I to VI
  • the respective measured values then being monitored via the monitoring System F can be forwarded to the computer-controlled monitoring and control system G according to FIG. 1 for the corresponding further processing and subsequent loading of the feedback control means also contained in the monitoring and control system G.
  • each cell culture chamber 20 of the cell culture chamber group A has on its top a round window 20A with a glass pane, through which a comprehensive illumination of the cell culture contained in the respective cell culture chamber 20 is made possible, as already described above with reference to FIG individual explained.
  • the cell culture chamber as such forms the subject of a German patent application by the same applicant with the name "cell culture chamber for a cell culture system” (official file number) -
  • the device according to the invention can be used with particular advantage above all for researching cell functions, for investigating the effectiveness of medications, for developing medicines, for CO cultivation of various cell types and tissue parts, for organ-typical studies, for the observation of tumor cells in a typical environment or toxicological studies.
  • the device according to the invention can be modified in such a way that the feedback control mechanism explained above (control means, control algorithms) is not put into operation, which means in practical terms that the cell cultivation process is self leaves without influencing the incubation conditions through the feedback control mechanism.
  • the cell culture parameters are set a priori, but are not changed during the cell cultivation process, although they are also permanently measured in the last-mentioned operating variant.

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Abstract

Bei einer Einrichtung (30) zur Kultivierung von Zellen verschiedenster Art, insbesondere menschlicher oder tierischer Zellen, wobei von Zellen wenigstens einer bestimmten Art jeweils eine Kultur in einer definierten Umgebung angesetzt wird und wobei die Zellen der betreffenden Kultur mit zugeordneten, flüssigen Nährmedien, Wachstumsfaktoren, Gasen und dergleichen versorgt werden, sind Zellkultivierung- und Inkubationsmittel vorgesehen, die in der Weise ausgebildet sind, dass es den in wenigstens einer Zellkulturkammer (20) der Einrichtung (30) ausgesäten Zellen ermöglicht ist, sich ihre im individuellen Falle erforderlichen Lebens- und Wachstumsbedingungen in gleichsam optimaler Weise selbst einzustellen.

Description

Einrichtung zur Kultivierung von Zellen, insbesondere menschlicher oder tierischer Zellen
Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Kultivierung von Zellen verschiedenster Art, insbesondere menschlicher oder tierischer Zellen, wobei von Zellen wenigstens einer bestimmten Art jeweils eine Kultur in einer definierten Umgebung angesetzt wird und wobei die Zellen der betreffenden Kultur mit zugeordneten, flüssigen Nährmedien, Wachstumsfaktoren, Gasen oder dergleichen versorgt werden.
Kulturen der vorgenannten Art werden im allgemeinen von einzelnen Zellen angesetzt, die entweder von Gewebeteilen, von primären Kulturen, von Zeil-Linien oder Zeil-Stämmen durch enzymati- sche, mechanische oder chemische Zerteilung herrühren.
Bei bisher bekannten Einrichtungen zur Zellkultivierung werden zum Ansetzen der Kulturen in der Regel aus Kunststoff bestehende Kulturgefäße verwendet, die in C02-Brutschränken inkubiert werden. Diese garantieren eine konstante Temperatur (z.B. 37 °C) und eine Pufferung des Mediums durch eine 5 % - 10 %ige C0- Begasung. Die SauerstoffVersorgung erfolgt durch einfache Diffusion. Bei den bekannten Verfahren und Einrichtungen zur Kultivierung von Zellen sind Co-Kultivierung und frei veränderliche Inkubationsbedingungen in der Regel nicht möglich.
Zur mikroskopischen Beobachtung oder zu speziellen Untersuchungen müssen die Kulturgefäße aus dem jeweiligen Brutschrank entnommen werden, wobei die Inkubation unterbrochen wird, die Zellen sich abkühlen und somit die Versuchsbedingungen nicht konstant sind. Die bisher bekannten Verfahren und Einrichtungen zur Kultivierung von Zellen werden jedoch den Anforderungen der modernen Zellkulturtechnologie nicht mehr gerecht.
Insbesondere im Hinblick auf aktuelle Forschungsschwerpunkte in der Pharmaindustrie, die in den Bereichen Entzündung (Rheuma) , Krebsbekämpfung, Herz/Kreislauf-Erkrankungen, Aids, Apoptose (programmierter Zelltod) und Blutgerinnung liegen, ist die Entwicklung und Erprobung entsprechender neuer Wirkstoffe und Medikamente mit Hilfe einer wesentlich verbesserten Einrichtung zur Kultivierung von Zellen unabdingbar, wobei eine solche Einrichtung dazu befähigt sein muß, die Substanz- und Wirkungs- testung unter. nahezu in-vivo-Bedingungen, d.h. mit nahezu perfekter Abbildung komplexer biologischer Systeme, vor Übertritt in die klinischen Phasen (Testung an Probanten) durchzuführen.
Mit Rücksicht auf die wie oben geschilderte Situation besteht die Forderung nach einer Möglichkeit der Simulation von Reaktionsabläufen innerhalb eines oder mehrerer Organsysteme (z.B. durch Serienschaltung von Zellkulturkammern mit Hepatozyten und anderen Zellarten, Untersuchung auf Abbauprodukte und Metaboli- te) , damit zum einen die Zeiträume zwischen Substanzwirkungserkennung und Arzneimittelzulassung erheblich minimiert werden und zum anderen vσr dem Eintritt in die klinische Testphase die notwendigen Erkenntnisse über den Wirkungsmechanismus der Substanz innerhalb eines komplexen biologischen Systems erlangt werden können.
Eine ähnliche Situation liegt beispielsweise auch im Bereich der Kosmetikindustrie vor.
Im Stand der Technik sind beispielsweise multivalente Zellkultursysteme (vgl. z.B. DE 199 15 178 AI), problemadaptierte ZellkulturSysteme für spezifische Aufgabenstellungen (vgl. z.B. WO 98/17822) oder Verfahren zur Replikation von Zellkulturen bekannt (vgl. z.B. WO 97/37001).
Ferner ist beispielsweise aus der WO 99/23206 ein Verfahren zum Mischen einer varizella-infizierten Zellkultur in Rollflaschen bekannt .
Schließlich sind aus der EP 0 999 266 AI ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Aufnahme einer Zellkultur bekannt, wodurch möglichst homogene Bedingungen für die molekularbiologische oder gentechnische Untersuchung von Zellen geschaffen werden sollen.
Mit Rücksicht auf die im Vorangehenden geschilderte Situation auf dem Gebiet der modernen Zellkulturtechnologie liegt der vorliegenden Erfindung nunmehr die Aufgabe zugrunde, eine neue, verbesserte Einrichtung zur Kultivierung von Zellen verschiedenster Art, insbesondere menschlicher oder tierischer Zellen zu schaffen, wobei diese Einrichtung die Nachteile bisher bekannter Systeme und Einrichtungen zur Zellkultivierung beseitigt und insbesondere die Möglichkeit bietet, hochkomplexe, biologische Vorgänge in Echtzeit und unter nahezu in-vivo- Bedingungen (d.h. wie im lebenden Organismus) bei gleichsam optimal angepaßten Lebens- und Wachstumsbedingungen der Zellen zu simulieren.
Ausgehend von einer Einrichtung zur Kultivierung von Zellen verschiedenster Art, insbesondere menschlicher oder tierischer Zellen, wobei von Zellen wenigstens einer bestimmten Art jeweils eine Kultur in einer definierten Umgebung angesetzt wird und die Zellen der betreffenden Kultur mit zugeordneten, flüssigen Nährmedien, Wachstumsfaktoren, Gasen und dergleichen versorgt werden, wird die wie vorstehend definierte Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Einrichtung Zellkultivie- rungs- und Inkubationsmittel aufweist, die in der Weise ausgebildet sind, daß es den in wenigstens einer Zellkulturkammer der Einrichtung ausgesäten Zellen ermöglicht ist, sich ihre im individuellen Falle erforderlichen Lebens- und Wachstumsbedingungen selbst einzustellen.
Die erfindungsgemäße Einrichtung weist hierbei vorzugsweise die Kombination folgender Merkmale auf:
a) Mittel zum Ingangsetzen eines Flusses frei wählbarer, definierter, flüssiger Medien in die wenigstens eine Zellkulturkammer zur kontinuierlichen Versorgung der dort ausgesäten Zellen;
b) Mittel zum Ingangsetzen eines Stromes unterschiedlicher Gase mit frei wählbaren Konzentrationen in die wenigstens eine Zellkulturkammer zur konstanten, kontinuierlichen Begasung der dort ausgesäten Zellen;
c) Mittel zum geregelten bzw. gesteuerten Beheizen der wenigstens einen Zellkulturkammer in der Art und Weise, daß hierin eine konstante Temperatur während der Dauer eines Versuches gewährleistet ist;
d) Mittel zum permanenten mikroskopischen Beobachten der innerhalb der wenigstens einen Zellkulturkam er ausgesäten Zellen, ohne während der Dauer eines Versuches Proben der Zellkultur zu entnehmen;
e) Mittel zum permanenten Messen sämtlicher relevanten Zellkulturparameter mittels entsprechender, in die wenigstens eine Zellkulturkammer integrierter Sensoren; und
f) der wenigstens einen Zellkulturkammer zugeordnete Feedback-Regelungsmittel zur Optimierung von Inkubationsbedingungen in der wenigstens einen Zellkulturkammer. Bei den relevanten Zellkulturparametern handelt es sich insbesondere um pH-Wert, Glucose, Lactat, Sauerstoff, Elektropoten- tial und dergleichen mehr.
Bei der erfindungsgemäßen Einrichtung ist in bevorzugter Weise eine vorgegebene Anzahl von Zellkulturkammern vorgesehen, die entweder in Reihe oder parallel geschaltet sein können, wobei innerhalb dieser vorgegebenen Anzahl von Zellkulturkammern vorzugsweise eine entsprechende Anzahl von Zellkulturen gleichzeitig angesiedelt wird.
Bei der erfindungsgemäßen Einrichtung zur Kultivierung von Zellen ist vor allem gewährleistet, daß die Zellen sämtlicher Kulturen mit flüssigen Nährmedien, Wachstumsfaktoren, Gasen oder dergleichen kontinuierlich versorgt werden, ohne daß die Zellen einer Kultur ihrer gewohnten, definierten Umgebung entnommen werden müssen, während gleichzeitig sämtliche Zellkulturen ohne Unterbrechung der Begasung permanent mikroskopisch beobachtet werden können.
Gemäß weiterer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Einrichtung sind Mittel vorgesehen, um während der Dauer eines Versuchs die ÄrJ der flüssigen Medien und/oder deren Strömungsrichtungen und/oder deren Verteilung und/oder deren Durchflußmengen zu variieren. Darüberhinaus können aber auch Mittel vorgesehen sein, um während der Dauer eines Versuchs die Art der Gase und/oder deren Strömungsrichtungen und/oder deren Verteilung und/oder die Begasungskonzentrationen zu variieren.
Die vorgenannten Variationsmöglichkeiten gewährleisten eine außerordentlich flexible Funktionsweise der erfindungsgemäßen Einrichtung.
Im Falle von in Reihe geschalteten Zellkulturkammern der erfindungsgemäßen Einrichtung können beispielsweise die flüssigen Medien und/oder die Gase von Zellkulturkammer zu Zellkulturkammer kontinuierlich weitergeleitet werden..
Um bei der erfindungsgemäßen Einrichtung zur Zellkultivierung während der Dauer eines Versuchs in den einzelnen Zellkultur- ka mern konstante Temperaturen zu gewährleisten, weist die Einrichtung in bevorzugter Weise Mittel auf, um die in den einzelnen Zellkulturen herrschenden Temperaturen permanent zu messen und als Temperatur-Istwerte einem entsprechenden Temperaturregel- bzw. Temperatursteuerkreis einzugeben, so daß die Beheizung der jeweiligen Zellkulturkammer entsprechend geregelt bzw. gesteuert wird.
Wie weiter unten im einzelnen noch näher erläutert wird, weist zu diesem Zweck jede einzelne Zellkulturkammer eine eigene Heizung auf, während oberhalb der betreffenden Zellkulturkammer jeweils ein Infrarot-Temperaturmesser angeordnet ist, der die in der betreffenden Zellkultur herrschende Temperatur mißt und diesen Temperaturmeßwert an ein Uberwachungs- und Steuerungssystem meldet. Ändert sich die anfangs vorgegebene Temperatur in der wenigstens einen Zellkulturkammer, dann wird durch den Temperaturregel- bzw. Steuerkreis bewirkt, daß die Heizleistung der jeweiligen Zellkulturkammerbeheizung vermindert bzw. erhöht wird.
Die Temperat.urmessung kann aber auch mit Hilfe anderer Temperatursensoren erfolgen.
Wie ebenfalls weiter unten noch näher erläutert wird, sind aus Flexibilitätsgründen die Temperaturen in den einzelnen Zellkulturkammern durch das Uberwachungs- und Steuerungssystem während der gesamten Versuchsdauer frei einstellbar und veränderbar.
Eine weitere, besonders vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Einrichtung besteht darin, daß sie wenigstens eine Zellkulturkammer aufweist, in der eine gasdurchlässige Membran in der Weise angeordnet ist, daß zu beiden Seiten dieser Membran je eine Zellkultur unterschiedlicher Art zum Zwecke einer direkten Co-Kultivierung beider Zellkulturen ansetzbar ist, wobei Mittel zum Ingangsetzen eines ersten Medienflusses zu der einen Seite der Membran, d.h. der apikalen Seite mit der ersten Zellkultur, und -eines gegenüber dem ersten Medienfluß unterschiedlichen, zweiten Medienflusses .zu der anderen Seite der Membran, d.h. der basolateralen Seite mit der zweiten Zellkultur, vorgesehen sind.
Somit funktionieren, ie auf der apikalen Seite. wachsenden Zellen als Deckschicht, während die Zellen auf der basolateralen Seite als Innenzellen funktionieren. Die Zellen der ersten Zellkultur und die Zellen der zweiten Zellkultur weisen hierbei durch die Membran einen recht engen Kontakt zueinander auf, so daß die Möglichkeit besteht, Austauschvorgänge innerhalb der Schichten auf der apikalen Seite und der basolateralen Seite zu untersuchen.
Darüberhinaus besteht noch die Möglichkeit, daß dann, wenn bei der erfindungsgemäßen Einrichtung gasdurchlässige Membranen mit unterschiedlichen, wählbaren Porengrößen eingesetzt werden, ein möglicher Austausch von wirksamen bioaktiven Molekülen (z.B.' Wachstumsfaktoren, Hormonen, usw.) im Zuge einer derartigen Co- Kultivierung untersucht werden kann. Solche Untersuchungsmöglichkeiten sind insbesondere bei Gewebeteilen wichtig, die aus verschiedenen Zellarten aufgebaut sind, beispielsweise Übergang Endothelzellen-Fibroblasten (Adern) oder Schleimhautzellen- Fibroblasten (Darm, Magen) .
Die erfindungsgemäße Einrichtung kann im übrigen mit besonderem Vorteil zur indirekten Co-Kultivierung Anwendung finden, wobei verschiedene biologische Systeme (Gewebe-/Zellarten) in entsprechenden Zellkulturkammern hintereinander geschaltet werden. Auf diese Weise lassen sich ganze Organsysteme gleichsam nachbauen und die entsprechenden StoffWechselvorgänge untersuchen. Diese Maßnahmen lassen sich durch ein Beispiel näher erläutern: ein an sich ungiftiger Stoff wird über den Verdauungstrakt aufgenommen und gelangt über den Blutstrom in die Leber. Die Leberzellen bauen den Stoff in Abbauprodukte um, die unter Umständen toxisch wirken können. Um dies zu überprüfen, wird die "verdächtige" Substanz in eine Inkubationskammer eingegeben, die mit Hepatozyten (Leberzellen) besiedelt ist. Über eine definierte Nährmedienversorgung (Medienfluß = "Ader") gelangen eventuell toxische Abbauprodukte in eine sich anschließende Zellkulturkammer, so daß dort z.'B. aus absterbenden Nervenzellen auf eine neurotoxische Substanz geschlossen werden kann.
Gemäß einer weiteren, außerordentlich vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Einrichtung ist ein videounterstütztes mikroskopisches Beobachtungssystem zum Beobachten der wenigstens einen Zellkultur in der wenigstens einen Zellkulturkammer vorgesehen, wie dies weiter unten noch im einzelnen erläutert wird.
Schließlich besteht noch eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Einrichtung darin, daß sie computergesteuertes Uberwachungs- und Steuerungssystem aufweist, zu dem sämtliche Daten, die gewonnen werden durch
permanentes mikroskopisches Beobachten der wenigstens einen Zellkultur innerhalb der wenigstens einen Zellkulturkammer und/oder
permanentes Messen der relevanten Zellkulturparameter und/oder permanentes Messen der in der wenigstens einen Zellkultur innerhalb der wenigstens einen Zellkulturkammer herrschenden Temperatur,
zur dortigen Weiterverarbeitung und entsprechenden Beaufschlagung der Feedback-Regelungsmittel übertragbar sind.
Bei den Feedback-Regelungsmitteln handelt es sich insbesondere um Regelungsalgorithmen, die in einer Datenverarbeitungsanlage des computergesteuerten Uberwachungs- und Steuerungssystems enthalten sind.
In diesem Zusammenhang ist zum permanenten Messen der relevanten Zellkulturparameter ein software-unterstütztes Meßsystem vorgesehen.
Eine kontinuierliche Messung von Zellkulturparametern läßt sich vorzugsweise durch spezielle Sonden bzw. Sensoren, beispielsweise für pH-Wert, Lactat, Elektropotential und dergleichen mehr, durchführen, wobei diese Messungen durch eine entsprechende Software ausgewertet und dargestellt werden können. Diese Art der Messung liefert gegenüber herkömmlichen Methoden exaktere Ergebnisse, wodurch bestimmte Fragestellungen analysiert werden können, die mit bisher verwendeten Meßverfahren nichtdurchführbar sind.
Mit Hilfe eines bei der erfindungsgemäßen Einrichtung zum Einsatz gelangenden, so tware-unterstützten Meßsystems lassen sich beispielsweise bestimmte Tierversuche in der präklinischen Phase größtenteils ersetzen.
Zusammenfassend bietet die erfindungsgemäße Einrichtung zur Kultivierung von Zellen insbesondere die folgenden Vorteile: 1. Möglichkeit einer Parallelschaltung einer vorgegebenen Anzahl von Zellkulturkammern innerhalb der Einrichtung für Vergleichsmessungen.
2. Möglichkeit einer seriellen Schaltung einer vorgegebenen Anzahl von Zellkulturkammern innerhalb der Einrichtung für Organsimulation.
3. Möglichkeit einer variablen Temperaturregelung bzw. - Steuerung.
4. Möglichkeit einer variablen Begasung der einzelnen Zellkulturkammern.
5. Möglichkeit einer individuellen Versorgung der Zellkulturen mit Nährsubstanzen bzw. Wirkstoffen.
6. Möglichkeit einer permanenten mikroskopischen Beobachtung des Inneren der einzelnen Zellkulturkammern und einer entsprechenden Videoaufzeichnung ohne Unterbrechung des Zell- kultivierungsprozesses .
Möglichkeit einer permanenten Messung verschiedener Zell- kulturparameter mittels integrierter Sensorik.
8. Bereitstellung eines hochwertigen Mehrwegsystems, d.h.
Verarbeitung von Edelstahl und Quarzglas von voll autokla- vierbarer Struktur zur Reduzierung von Abfall.
Die Erfindung wird nunmehr nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, wobei zeigen:
Figur 1 eine schematische Ansicht einer Einrichtung zur Kultivierung von Zellen verschiedenster Art, insbesondere menschlicher oder tierischer Zellen; und Figur 2 eine schematische Darstellung einer auf einer Basis der Einrichtung nach Figur 1 angeordneten Zellkulturkammergruppie- rung, zu der eine vorgegebene Anzahl von einzelnen Zellkulturkammern zusammengefaßt ist.
Figur 1 zeigt schematisch eine Einrichtung 30 zur Kultivierung von Zellen verschiedenster Art, wobei von Zellen wenigstens einer bestimmten Art jeweils eine Kultur in einer definierten Umgebung innerhalb einer zugeordneten Zellkulturkammer angesetzt wird und wobei die Zellen der betreffenden Kultur mit vorgewählten, flüssigen Nährmedien, Wachstumsfaktoren, Gasen und dergleichen versorgt werden.
Diese Einrichtung 30 ist insgesamt betrachtet so konzipiert, daß sie Zellkultivierungs- und Inkubationsmittel aufweist, die in der Weise ausgebildet sind, daß es den in den Zellkulturkammern der Einrichtung 30 ausgesäten Zellen ermöglicht ist, sich ihre im individuellen Falle erforderlichen Lebens- und Wachstumsbedingungen selbst einzustellen, d.h. insbesondere mit dem Ziel, daß diese Lebens- und Wachstumsbedingungen gleichsam optimiert werden.
Bei der in Figur 1 dargestellten Einrichtung 30 sind beispielsweise sechs Zellkulturkammern 20 in Form einer Zellkulturkammer gruppierung A auf einer entsprechend zugeordneten Basis 21 plaziert. Insbesondere bildet die Basis 21 ein Heizsystem E für die Inkubierung, das während der Betriebszeit die Einrichtung 30 konstante Temperaturen innerhalb jeder der Zellkulturkammern 20 gewährleistet.
Vorzugsweise erfolgt mit Hilfe dieses Heizsystems E eine elektrische Beheizung der jeweiligen Zellkulturkammer 20, wodurch eine sehr genaue Temperaturregelung ermöglicht ist. Dieses Heizsystem E ist insbesondere in der Weise ausgelegt, daß jede einzelne Zellkulturkammer 20 der Zellkulturkammergruppierung A über ihre eigene Heizung verfügt, die in der Basis 21 integriert ist.
Mit besonderem Vorteil ist das Heizsystem E mittels einer zugeordneten Software steuerbar. Zu diesem Zweck ist oberhalb der Zeilkulturkammergruppierung A ein System aus Infrarot-Temperaturmessern 25 installiert, in der Art, daß jeder einzelnen Zellkulturkammer 20 ein entsprechender Infrarot-Temperaturmesser 25 zugeordnet ist. Der jeweilige Infrarot-Temperaturmesser 25 fühlt in der jeweiligen Zellkulturkammer 20 die in der Zellkultur vorherrschende Temperatur ab und meldet das entsprechende Meßergebnis permanent an ein computergesteuertes Uberwachungs- und Steuerungssystem G, das im wesentlichen aus einer Datenverarbeitungsanlage 37 und einem zugehörigen Monitor 36 besteht. Die einzelnen Infrarot-Temperaturmesser 25 sind über eine gemeinsame Verbindungsleitung 45 an das Uberwachungs- und Steuerungssystem G angeschlossen. Wenn sich die Anfangs vorgegebenen Temperaturen in den Zellkulturkammern 20 der Zellkul- turkammergruppierung A ändern, erfolgt automatisch über das Uberwachungs- und Steuerungssystem G eine Steuerung bzw. Regelung des Heizsystems E, d.h., die in der einzelnen Zellkulturkammer 20 herrschende Temperatur wird permanent auf einer konstante Temperatur eingeregelt.
Anstatt mittels Infrarot-Temperaturmessern könnte die Temperaturmessung in der einzelnen Zellkulturkammer 20 aber auch mit Hilfe anderer Temperatursensoren durchgeführt werden.
Darüberhinaus kann mit Hilfe der in dem Uberwachungs- und Steuerungssystem G enthaltenen Software ermöglicht werden, daß die Temperaturen in den einzelnen Zellkulturkammern 20 der Zeilkulturkammergruppierung A während der gesamten Versuchsdauer frei einstellbar und wählbar sind, falls dies aus bestimmten Gründen erforderlich sein sollte. Zum Zwecke einer permanenten, videogestützten mikroskopischen Beobachtung des Inneren der jeweiligen Zellkulturkammer 20 ist ein Videosystem B mit einem entsprechend zugeordneten Mikroskopsystem vorgesehen. Dieses Videosystem B wird im folgenden näher erläutert.
Unterhalb jeder einzelnen Zellkulturkammer 20 der Zellkultur- kammergruppierung A, die im vorliegenden Ausführungsbeispiel insgesamt sechs Zellkulturkammern aufweist, ist eine Videokamera 22 mit Mikroskopaufsatz 22' auf einem mechanisch einstellbaren Fahrtisch 23 angeordnet, somit insgesamt sechs Videokameras
22 mit zugehörigem Mikroskopaufsatz 22'. Infolgedessen beobachtet je eine Videokamera 22 mit Mikroskopaufsatz 22' je eine Zellkulturkammer 20. Nach Versuchsstart und nachdem sich aussagekräftige Bereiche in der jeweiligen in der Zellkulturkammer 20 enthaltenen Zellkultur abzeichnen, wird ein Beobachtungssektor in der Zellkulturkammer 20 festgelegt. Dieser Beobachtungssektor wird sodann durch den mechanisch einstellbaren Fahrtisch
23 mittels (nicht dargestellter) Einstellschrauben angefahren, sodann wird der Fahrtisch arretiert und das Videosystem B bleibt infolgedessen während der gesamten Versuchsdauer in der gleichen Position. Ferner wird bei Versuchsstart die Schärfe der Einstellung am jeweiligen Mikroskopaufsatz 22' einjustiert. Dieser Justiervorgang am jeweiligen Mikroskopaufsatz 22' erfolgt für sämtliche sechs Zellkulturkammern 20 und bleibt sodann unverändert bis zum Versuchsende.
Vorzugsweise wird auch das Videosystem B über die im Uberwachungs- und Steuerungssystem G enthaltene Software gesteuert. Hierbei wird jede einzelne Videokamera 22 mit Mikroskopaufsatz 22' gesteuert. Dies erfolgt insbesondere in der Art, daß in frei wählbaren Zeitintervallen (beispielsweise im Minutentakt) Bilder von der jeweiligen Zellkultur in der Zellkulturkammer 20 aufgenommen werden, wobei zu dem jeweiligen Zeitpunkt einer solchen Aufnahme eine oberhalb der jeweiligen Zellkulturkammer 20 angeordnete Lichtquelle 24 die entsprechende Zellkultur beleuchtet, so daß eine ausreichende Ausleuchtung im Inneren der Zellkulturkammer 20 für die Videoaufnahmen gewährleistet ist. Wenn die Videoaufnahme beendet ist, schaltet die Steuerung die jeweilige Lichtquelle 24 aus, bis die nächste Videoaufnahme gemacht wird. Der von einer jeden Lichtquelle 24 ausgehende Lichtstrahl bzw. Lichtkegel, der in das Innere einer jeweiligen Zellkulturkammer 20 durch eine entsprechende (nicht dargestellte) Glasscheibe eintritt, ist in Figur 1 mit 24' bezeichnet.
Sämtliche Lichtquellen 24 sind über eine gemeinsame Verbindungsleitung 46 an das Uberwachungs- und Steuerungssystem G angeschlossen.
Durch jeden einzelnen Lichtstrahl bzw. Lichtkegel 24 wird die jeweilige, in der Zellkulturkammer 20 enthaltene Zellkultur flächendeckend ausgeleuchtet. Es handelt sich hierbei um eine Durchleuchtungsmethode .
Anstelle einer solchen Durchleuchtungsmethode könnte aber vorgesehen sein, daß die Lichtquellen zur Ausleuchtung der in der jeweiligen Zellkulturkammer 20 enthaltenen Zellkultur unmittelbar an der jeweils zugeordneten Videokamera 22 bzw. dem jeweils
Ϊ zugeordneten Mikroskopaufsatz 22' angebracht sind, so daß in- einem solchen Falle die Durchleuchtuηgsmethode durch eine Draufsichtmethode ersetzt ist.
Das Videosystem B ist ebenfalls über eine Leitung 47 an das Uberwachungs- und Steuerungssystem G angeschlossen, wobei von diesem aus die Leitung 47 zu einem Knotenpunkt 48 führt, mit dem die einzelnen Videokameras 22 über entsprechend zugeordnete Leitungen verbunden sind.
Das wie oben erläuterte Videosystem B mit Mikroskopsystem stellt nur eine Ausführungsmöglichkeit dar. Eine mögliche ande- re Ausführungsform eines solchen Systems zur permanenten Beobachtung des Inneren der Zellkulturkammern besteht darin, daß ein einziges Beobachtungssystem, bestehend aus Videokamera und Mikroskopaufsatz, auf einem Fahrtisch installiert wird und daß dieser Fahrtisch die sechs Zellkulturkammern 20 der Zeilkulturkammergruppierung A in frei wählbaren Intervallen abfährt. Die Justierung des Beobachtungssystems erfolgt für die einzelne Zellkultur bei Versuchsstart, d.h. vorzugsweise dann, nachdem sich aussagekräftige Bereiche in der jeweiligen Zellkultur abzeichnen, durch die entsprechende, im Uberwachungs- und Steuerungssystem G enthaltene Software, d.h., durch das entsprechende Computerprogramm sind die sechs Anfahrpositionen des Fahrtisches, auf dem das Beobachtungssystem montiert ist, programmiert. Wegen der mechanischen Toleranzen des Fahrtisches muß jedoch ein größerer als der zu beobachtende Bereich innerhalb der einzelnen Zellkulturkammer 20 aufgenommen werden. Innerhalb dieses größeren Bereichs wird nun mittels der Software der zu beobachtende Bereich definiert. Die Software ist in der Lage, Konturen zu speichern und wiederzuerkennen, d.h., beim erneuten Anfahren einer Zellkulturkammer werden die Kultur und die Anordnung der Zellen erkannt und ein anfänglich definierter Beobachtungsbereich gespeichert.
Dieses zuletzt erläuterte Beobachtungssystem ist in den Zeichnungen im einzelnen nicht dargestellt, jedoch erfolgt die Ausleuchtung der einzelnen Zellkulturkammer 20 ebenfalls mit Hilfe der Lichtquellen 24, wie bereits weiter oben im einzelnen erläutert.
Auch in diesem Falle besteht die Möglichkeit, die Durchleuchtungsmethode durch die Draufsichtmethode zu ersetzen, d.h., die Lichtquellen zur Ausleuchtung der in der einzelnen Zellkulturkammer 20 enthaltenen Zellen können unmittelbar an der jeweils zugeordneten Videokamera 22 bzw. an dem.jeweils zugeordneten Mikroskopaufsatz 22' angebracht sein. Die in Figur 1 dargestellte Einrichtung 30 weist ferner noch ein Dosiersystem C für Flüssigkeiten (z.B. flüssige Nährmedien und dergleichen) auf, welche z.B. vier Flüssigkeitsvorratsbehälter 31 mit einer jeweils zugeordneten Flüssigkeitsentnahmeleitung 31' aufweist, wobei sodann aus diesen Flüssigkeitsentnahmeleitungen 31' ein Leitungsbündel 32 gebildet ist. Dieses Leitungsbündel 32 ist andererseits mit einem Pumpensystem 29 verbunden, durch welches die verschiedenen Zellkulturkammern 20 der Zeilkulturkammergruppierung A mit frei wählbaren Flüssigkeiten, die in den Flüssigkeitsvorratsbehältern 31 enthalten sind, versorgt werden.
Das Pumpensystem 29 ist seinerseits über eine Leitung 33 an ein Multiventilmodul 30' angeschlossen. Die Zuführung der Flüssigkeiten zu der Zellkulturkammergruppierung A erfolgt von dem Multiventilmodul 30' aus über sterile Schlauchleitungssysteme 27 und 28, wobei diese Flüssigkeiten von den einzelnen Zellkulturkammern 20 flexibel weitergeleitet werden, d.h. von einer Zellkulturkammer zur nächsten, wie dies noch weiter unten anhand der Figur 2 näher erläutert wird.
Sowohl die Flüssigkei szuführung als auch die Flüssigkeitsweiterleitung erfolgen über sterile Schlauchsysteme, die mit Standard-Schlauchverbinderelementen und Verteilern bei Versuchs— start installiert werden, d.h., mit entsprechenden Versorgungskanälen einer jeweiligen Zellkulturkammer 20 verbunden werden. Hierbei wird die Verbindung der Standard-Schlauchelemente (in den Zeichnungen im einzelnen nicht dargestellt) mit den zugeordneten Versorgungskanälen der jeweiligen Zellkulturkammer 20 so aufeinander abgestimmt, daß die Sterilität gewährleistet ist.
Aus Gründen der Flexibilität können die Art der Flüssigkeiten und/oder die Strömungsrichtungen und/oder die Verteilung der Flüssigkeiten und/oder deren Durchflußmengen während des Ver- suchs geändert bzw. gesteuert werden, wobei eine derartige Steuerung vorzugsweise durch das computergesteuerte Uberwachungs- und Steuerungssystem G erfolgt. Zu diesem Zweck sind das Pumpensystem 29 mittels einer Verbindungsleitung 38 und das Multiventilmodul 30' über eine Verbindungsleitung 40 an das Uberwachungs- und Steuerungssystem G angeschlossen.
Das Dosiersystem C der Einrichtung 30 erlaubt es somit, der Zellkulturkammergruppierung A unterschiedlichste . Flüssigkeiten zuzuführen.
Die Einrichtung 30 weist darüberhinaus ein Begasungssystem D für unterschiedlichste Gase auf. Dieses Begasungssystem D dient dazu, die verschiedenen Zellkulturkammern 20 der Zellkulturkammergruppierung A mit unterschiedlichen Gasen, z.B. Luft, 02, N2, C02, zu begasen. Von dem Begasungssystem D aus erfolgt die Gaszuführung zu der Zellkulturkammergruppierung A mittels einer sterilen Schlauchleitung 26. Auch hierbei können die Gase von den verschiedenen Zellkulturkammern 20 unter Verwendung entsprechend zugeordneter Versorgungskanäle flexibel weitergeleitet werden, d.h., von einer Zellkulturkammer zur nächsten (vgl. Figur 2) .
Gaszuführung und Gasweiterleitung erfolgen insgesamt über sterile Schläuche, die mittels Standard-Schlauchverbinderelementen und Verteilern bei Versuchsstart installiert werden. Die Verbindungen der Schlauchverbinderelemente mit den entsprechend zugeordneten Versorgungskanälen einer jeweiligen Zellkulturkammer 20 sind so aufeinander abgestimmt, daß die Sterilität gewährleistet ist. Auch bei dem Begasungssystem D können aus Flexibilitätsgründen die Art der Gase und/oder die Strömungsrichtungen und/oder die Gasverteilung und/oder die Begasungskonzentration während des Versuchs geändert bzw. gesteuert werden. Zu diesem Zweck ist wiederum das Begasungssystem D über eine Verbindungsleitung 39 an das computergesteuerte Uberwachungs- und Steuerungssystem G angeschlossen, das die entsprechende Software für die Steuerung des Begasungssystems D enthält.
Schließlich weist die Einrichtung 30 zur Kultivierung von Zellen noch ein Monitoring-System F mit vorgegebenen Sensormodulen 34 auf. Mit Hilfe des Monitoring-Systems F können während der gesamten Versuchsdauer die relevanten Parameter in der jeweiligen Zellkulturkammer 20 der Zellkulturkammergruppierung A mittels entsprechend zugeordneter Sensoren gemessen, insbesondere permanent gemessen werden, wobei es sich bei diesen Parametern z.B. um pH-Wert, Glucose, Lactat, Sauerstoff, Elektropotential usw. handelt. Zu diesem Zweck steht das Monitoring-System F über eine Leitung 41, über einen Knotenpunkt 42 und von dort aus über weitere Leitungen 43 und 44 und entsprechend zugeordnete Abzweigleitungen mit den Sensoren an den einzelnen Zellkulturkammern 20 der Zellkulturkammergruppierung A der Einrichtung 30 in Verbindung.
Die von den (nicht gezeigten) Sensoren gemessenen Parameter werden von dem Monitoring-System F über eine Leitung 35 an das computergesteuerte Uberwachungs- und Steuerungssystem G zur entsprechenden Weiterverarbeitung und nachfolgenden Beaufschlagung der Feedback-Regelungsmittel weitergeleitet.
Jede Zellkulturkammer 20 weist entsprechende Sensorikanschluß- kanäle auf, wie dies weiter unten noch im einzelnen erläutert wird, wobei die Sensoren und die jeweils zugeordneten Kanäle so aufeinander abgestimmt sind, daß die Sterilität gewährleistet ist .
Mit besonderem Vorzug ist das Monitoring-System F in Verbindung mit dem computergesteuerten Uberwachungs- und Steuerungssystem G in der Weise ausgelegt, daß das permanente Messen der relevanten Zellkulturparameter mit Hilfe eines software-unterstütz- ten Meßverfahrens erfolgen kann (wie bereits weiter oben erläutert) .
Aus Figur 2 ist die Zellkulturkammergruppierung A der Einrichtung 30 gemäß Figur 1 in schematischer Draufsicht zu ersehen. Bei der auf der Basis 21 angeordneten Zellkulturkammergruppierung A sind insgesamt sechs Zellkulturkammern 20 gleichsam in Reihe geschaltet, derart, daß sowohl die flüssigen Medien als auch die Gase von einer Zellkulturkammer 20 zur anderen, d.h. zur jeweils nachfolgend angeordneten Zellkulturkammer 20 kontinuierlich weitergeleitet werden können.
In jeder der sechs Zellkulturkammern 20 wird mindestens eine zu untersuchende Zellkultur angesiedelt, wobei jedoch im vorliegenden Ausführungsbeispiel der Einfachheit halber von sechs Zellkulturen gesprochen wird, deren jeweiligen Zellen mit definierten flüssigen Nährmedien, Wachstumsfaktoren, Gasen und dergleichen mehr zu versorgen sind.
Zu diesem Zweck wird einerseits ein Fluß frei wählbarer, definierter, flüssiger Medien und andererseits ein Strom unterschiedlicher Gase mit frei wählbaren Konzentrationen in die sechs Zellkulturkammern 20 der Zellkulturkammergruppierung A in Gang gesetzt, wobei, wie bereits weiter oben erläutert, die Zuführung der Flüssigkeiten zu der Zellkulturkammergruppierung A primär von dem Multiventilmodul 30' gemäß Figur 1 aus über die sterilen Schlauchleitungssysteme 27 und 28 erfolgt, während gleichzeitig die Gaszuführung zu der Zellkulturkammergruppierung A von dem Begasungssystem D gemäß Figur 1 aus mittels der sterilen Schlauchleitung 26 erfolgt.
Zur Erleichterung der Übersicht sind die sechs aufeinanderfolgend in Reihe geschalteten Zellkulturkammern 20 mit I, II, III, IV, V und VI gekennzeichnet. Die Schlauchleitungssysteme 27 und 28 für Flüssigkeiten und die Schlauchleitung 26 für Gase sind unmittelbar mit der ersten Zellkulturkammer I verbunden, derart, daß die Schlauchleitung 26 unmittelbar in einen Gaskanal 50 im Inneren dieser ersten Zellkulturkammer I mündet, wohingegen das Schlauchleitungssystem 27 in einen entsprechenden Flüssigkeitskanal 51 und das Schlauchleitungssystem 28 in einen Flüssigkeitskanal 52 jeweils im Inneren dieser ersten Zellkulturkammer I einmünden. Somit wird zunächst die in der ersten Zellkulturkammer I enthaltene Zellkultur mit flüssigen Medien und Gasen versorgt, woraufhin sukzessive die nachfolgenden Zellkulturkammern II bis VI in entsprechender Weise mit flüssigen Medien und Gasen versorgt werden. Im einzelnen ist die Zellkulturkammer I über Flüssigkeits-Schlauchleitungen 27A und 28A und über eine Gas-Schlauchleitung 26A mit der zweiten Zellkulturkammer II verbunden, diese wiederum über Flüssigkeits-Schlauchleitungen 27B und 28B und eine Gas-Schlauchleitung 26B mit der dritten Zellkulturkammer III verbunden, die ihrerseits wiederum über Flüssigkeits- Schlauchleitungen 27C und 28C und eine Gas-Schlauchleitung 26C mit der vierten Zellkulturkammer IV verbunden ist, während diese wiederum über Flüssigkeits-Schlauchleitungen 27D und 28D sowie über eine Gas-Schlauchleitung 26D mit der fünften Zellkulturkammer V verbunden ist, und schließlich ist die letztere über Flüssigkeits-Schlauchleitungen 27E und 28E und über eine Gas-Schlauchleitung 26E mit der sechsten Zellkulturkammer VI verbunden.
Aufgrund dieser Hintereinanderschaltung der sechs Zellkulturkammern 20, d.h. der Kammern I bis VI, mündet jede Flüssigkeits-Schlauchleitung 28A bzw. 28B bzw. 28C bzw. 28D bzw. 28E jeweils in einen Flüssigkeitskanal 52 im Inneren jeder Zellkulturkammer, jede Flüssigkeits-Schlauchleitung 27A bzw. 27B bzw. 27C bzw. 27D bzw.. 27E mündet in einen entsprechenden Flüssigkeitskanal 51 im Inneren jeder Zellkulturkammer, wohingegen jede Gas-Schlauchleitung 26A bzw. 26B bzw. 26C bzw. 26D bzw. 26E in einen entsprechenden Gas-Kanal 50 jeder Zellkulturkammer einmündet .
Von der sechsten Zellkulturkammer VI aus gehen Flüssigkeits- Ausgangsleitungen 27F und 28F und eine Gas-Ausgangsleitung 26F ab.
Infolgedessen wird ermöglicht, daß sämtliche Zellkulturen in den sechs Zellkulturkammern I bis VI sowohl mit frei wählbaren, definierten, flüssigen Medien kontinuierlich versorgt werden als auch einer konstanten, kontinuierlichen Begasung durch das Begasungssystem D gemäß Figur 1 unterworfen werden, wie im ein- zelnen bereits weiter oben erläutert.
Es wird darauf hingewiesen, daß in Figur 2 lediglich eine von vielen Flußrichtungsmöglichkeiten für Flüssigkeiten und Gase dargestellt ist. Durch die oben erläuterten, flexiblen Schlauchleitungssysteme für Flüssigkeiten und Gase können auch andere Zellkulturkammer-Kombinationen als die in Figur 2 gezeigte angesteuert werden.
Von ganz besonderer Bedeutung ist noch, daß die Zellkulturkammergruppierung A insgesamt permanent an das Monitoring-System F gemäß Figur 1 angeschlossen ist, damit während der gesamten ' Versuchsdauer alle relevanten Parameter in der jeweiligen Zellkulturkammer 20 mittels entsprechend zugeordneter Sensoren gemessen werden können. Jede der sechs Zellkulturkammern 20 ist daher in ihrem Innern mit einem entsprechenden Kanal 53 für den Sensorikanschluß ausgerüstet. Im einzelnen ist hierbei die erste Zellkulturkammer I über eine Leitung 44A, die zweite Zellkulturkammer II über eine Leitung 44B und die dritte Zellkulturkammer III über eine Leitung 44C mit einer Leitung 44 verbunden, während die vierte Zellkulturkammer IV über eine Leitung 43A, die fünfte Zellkulturkammer V über eine Leitung 43B und die sechste Zellkulturkammer VI über eine Leitung 43C mit einer Leitung 43 verbunden ist. Die Leitungen 43 und 44 führen zu einem Knotenpunkt 42, der über eine Leitung 41 mit dem Monitoring-System F gemäß Figur 1 verbunden ist.
Mit Hilfe der im Inneren einer jeden Zellkulturkammer 20 (im vorliegenden Ausführungsbeispiel die Kammern I bis VI) angeordneten Sensoren, die hier im einzelnen nicht dargestellt sind, ist es möglich, die relevanten Parameter permanent zu messen, wobei sodann die jeweiligen Meßwerte über das Monitoring-System F an das computergesteuerte Uberwachungs- und Steuerungssystem G gemäß Figur 1 zur entsprechenden Weiterverarbeitung und anschließenden Beaufschlagung der ebenfalls in dem Überwachungsund Steuerungssystem G enthaltenen Feedback-Regelungsmittel weitergeleitet werden.
Aus Figur 2 ist noch ersichtlich, daß jede Zellkulturkammer 20 der Zellkulturkammergruppierung A an ihrer Oberseite ein rundes Fenster 20A mit Glasscheibe aufweist, durch das eine flächendeckende Ausleuchtung der in der jeweiligen Zellkulturkammer 20 enthaltenen Zellkultur ermöglicht ist, wie bereits weiter oben anhand der Figur 1 im einzelnen erläutert.
Die Zellkulturkammer als solche bildet im übrigen den Gegen- stand einer deutschen Patentanmeldung der gleichen Anmelderin mit der Bezeichnung "Zellkulturkammer für ein Zellkultursystem" (amtliches Aktenzeichen ) -
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Einrichtung zur Kultivierung von Zellen können hochkomplexe biologische Vorgänge in Echtzeit und nahezu unter in-vivo-Bedingungen simuliert werden.
Mit ganz besonderem Vorteil kann die erfindungsgemäße Einrichtung vor allem zur Erforschung von Zellfunktionen, zur Wirksamkeitsuntersuchung von Medikamenten, zur Arzneimittelentwicklung, zur CO-Kultivierung verschiedener Zelltypen und Gewebe- teile, zu organtypischen Studien, zur Beobachtung von Tumorzellen in typischer Umgebung oder toxikologischen Studien angewendet werden.
Der Vollständigkeit halber wird noch darauf hingewiesen, daß sich die erfindungsgemäße Einrichtung in der Weise abwandeln läßt, daß der oben erläuterte Feedback-Regelungsmechanismus (Regelungsmittel, Regelungsalgorithmen) nicht in Funktion gesetzt wird, was also praktisch bedeutet, daß man den Zellkulti- vierungsvorgang sich selbst überläßt, ohne die Inkubationsbedingungen durch den Feedback-Regelungsmechanismus zu beeinflussen.
Bei dieser Betriebsvariante der erfindungsgemäßen Einrichtung zur Kultivierung von Zellen werden die Zellkulturparameter a priori eingestellt, aber während des Zellkultivierungsvorgangs nicht verändert, obwohl sie auch bei der zuletzt erläuterten Betriebsvariante permanent gemessen werden.

Claims

Patentansprüche
Einrichtung zur Kultivierung von Zellen verschiedenster Art, insbesondere menschlicher oder tierischer Zellen, wobei von Zellen wenigstens einer bestimmten Art jeweils eine Kultur in einer definierten Umgebung angesetzt wird und wobei die Zellen der betreffenden Kultur mit zugeordneten, flüssigen Nährmedien, Wachstumsfaktoren, Gasen und der- gleichen versorgt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (30) Zellkultivierungs- und Inkubationsmittel aufweist, die in der Weise ausgebildet sind, daß es den in wenigstens einer Zellkulturkammer (20) der Einrichtung (30) ausgesäten Zellen ermöglicht ist, sich ihre im individuellen Fall erforderlichen Lebens- und Wachstumsbedingungen selbst einzustellen.
Einrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Merkmale:
a) Mittel (C) zum Ingangsetzen eines Flusses frei wählbarer, definierter, flüssiger Medien in die wenigstens eine Zellkulturkammer (20) zur kontinuierlichen Versorgung der dort ausgesäten Zellen;
b) Mittel (D) zum Ingangsetzen eines Stromes unterschiedlicher Gase mit frei wählbaren Konzentrationen in die wenigstens eine Zellkulturkammer (20) zur konstanten, kontinuierlichen Begasung der dort ausgesäten Zellen; c) Mittel (E) zum geregelten bzw. gesteuerten Beheizen der wenigstens einen Zellkulturkammer (20) in der Art und Weise, daß hierin eine konstante Temperatur während der Dauer eines Versuches gewährleistet ist;
d) Mittel (B) zum permanenten mikroskopischen Beobachten der innerhalb der wenigstens einen Zellkulturkammer (20) ausgesäten Zellen, ohne während der Dauer eines
Versuches Proben dieser Zellkultur zu entnehmen;
e) Mittel (F) zum permanenten Messen sämtlicher relevanten Zellkulturparameter mittels entsprechender, in die wenigstens eine Zellkulturkammer (20) integrierter Sensoren; und
f) der wenigstens einen Zellkulturkammer (20) zugeordnete Feedback-Regelungsmittel zur Optimierung von Inkubationsbedingungen in der Zellkulturkammer (20) .
3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (30) eine vorgegebene Anzahl von Zellkulturkammern (20) aufweist, die in Reihe geschaltet sind.
4. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (30) eine vorgegebene Anzahl von Zellkulturkammern (20) aufweist, die parallel geschaltet sind.
5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, gekennzeichnet durch Mittel, um während der Dauer eines Versuchs die Art der flüssigen Medien und/oder deren Strömungsrichtungen und/oder deren Verteilung und/oder deren Durchflußmengen zu variieren.
6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, gekennzeichnet durch Mittel, um während der Dauer eines Versuches die Art der Gase und/oder deren Strömungsrichtungen und/oder Verteilung und/oder die Begasungskonzentrationen zu variieren.
7. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch Mittel (25) , um die in der wenigstens einen Zellkultur innerhalb der wenigstens einen Zellkulturkammer (20) herrschende Temperatur permanent zu messen und als Temperatur-Istwert einem entsprechenden Temperaturregelbzw. Steuerkreis einzugeben, so daß die Beheizung der Zellkulturkammer (20) entsprechend geregelt bzw. gesteuert wird.
8. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch wenigstens eine Zellkulturkammer (20) , in der eine gasdurchlässige Membran in der Weise angeordnet ist, daß zu beiden Seiten dieser Membran je eine Zellkultur unterschiedlicher Art zum Zwecke einer direkten Co- Kultivierung beider Zellkulturen ansetzbar ist, wobei Mittel zum Ingangsetzen eines ersten Medienflusses zu der einen Seite der Membran, d.h. der apikalen Seite mit der ersten Zellkultur, und eines gegenüber dem ersten Medienfluß unterschiedlichen, zweiten Medienflusses zu der anderen Seite der Membran, d.h. der basolateralen Seite mit der zweiten Zellkultur, vorgesehen sind.
9. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 8, gekennzeichnet durch ein videounterstütztes mikroskopisches Beobachtungssystem (B) zum Beobachten der wenigstens einen Zellkultur in der wenigstens einen Zellkulturkammer (20) .
10. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, gekennzeichnet durch ein computergesteuertes Überwachtungs- und Steuerungssystem (G) , zu dem sämtliche Daten, die gewonnen werden durch permanentes mikroskopisches Beobachten der wenigstens einen Zellkultur innerhalb der wenigstens einen Zellkulturkammer (20) und/oder
permanentes Messen der relevanten Zellkulturparameter und/oder
- permanentes Messen der in der wenigstens einen Zellkultur innerhalb der wenigstens einen Zellkulturkammer (20) herrschenden Temperatur,
zur dortigen Weiterverarbeitung und nachfolgenden entsprechenden Beaufschlagung der Feedback-Regelungsmittel übertragbar sind.
11. Einrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, gekennzeichnet durch ein software-unterstütztes Meßsystem zum permanenten Messen der relevanten Zellkulturparameter.
12. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturkammern (20) zu einer geschlossenen Zellkammergruppierung (A) zusammengefaßt sind, die auf einer Basis (21) angeordnet ist, die ein Heizsystem (E) für die Inkubierung bildet.
13. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die Anwendung der Einrichtung zur indirekten Co-Kultivierung, wobei verschiedene biologische Systeme (d.h. Gewebe-/Zellarten) in entsprechenden Zellkulturkammern (20) hintereinandergeschaltet werden.
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